JPS6289632A - グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法 - Google Patents
グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法Info
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- JPS6289632A JPS6289632A JP61180233A JP18023386A JPS6289632A JP S6289632 A JPS6289632 A JP S6289632A JP 61180233 A JP61180233 A JP 61180233A JP 18023386 A JP18023386 A JP 18023386A JP S6289632 A JPS6289632 A JP S6289632A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の対象はダラム陰性菌による感染に対する、特に
緑膿菌及び大腸菌による感染に対すに使用する高度免疫
血清の製造に使用する方法である。
緑膿菌及び大腸菌による感染に対すに使用する高度免疫
血清の製造に使用する方法である。
緑膿菌又は大腸菌による感染は特に免疫抑制剤で処置さ
れた入院患者、火傷の犠牲者及び癌ムnnal[1工n
ternal Medicine 82 :
819−851(1975)、)この様な感染の発生率
は抗生物質の広汎な使用と平行して過去30年で著しく
増加している。
れた入院患者、火傷の犠牲者及び癌ムnnal[1工n
ternal Medicine 82 :
819−851(1975)、)この様な感染の発生率
は抗生物質の広汎な使用と平行して過去30年で著しく
増加している。
緑膿菌及び大腸菌はしばしば尿路感染、耳炎、々、エキ
ソトキシンAトキソイドを用いる能動免疫によってマウ
スに於いて実験上の緑膿菌感染に対する防御、工nfe
ction工mmunity 32 :681−689
(1981) ) K対する抗体は動物実験で有効な
感染防御剤であることが明白である。
ソトキシンAトキソイドを用いる能動免疫によってマウ
スに於いて実験上の緑膿菌感染に対する防御、工nfe
ction工mmunity 32 :681−689
(1981) ) K対する抗体は動物実験で有効な
感染防御剤であることが明白である。
トキシンムは緑膿菌(Pl、)の最も毒性の物質代謝生
成物である。これは真核生物性たん白金酸を阻害する。
成物である。これは真核生物性たん白金酸を阻害する。
特異的なトキシンムー欠損を有するP、a、の突然変異
株はその母株に比してよシトキシンム及びエラスターゼ
突然変異株を用いてマウスに於げる月膜感果、J、↓n
feotiou8デイズージス Diseases 142: 547−555 (19
80))。受身的投与又は能動的接糧によって産出され
るアンチトキシンA−抗体は実験上生じたP、a、感染
に対し工mmunity 18 : 596−602
(1977)参照)。その他の試験はアンチトキシン−
抗体の含有量とP、a、−菌血症にかかった患者の生き
延びる度合とo直接tv関係を示す(M、 S、 Po
1lack等、人間に於てP、a、敗血症の徴候でエキ
ソトキシンA火傷によって外傷を起こさせたマウスに於
て類−分子の存在に依存する( S、J、 Cryz等
・工nfeetion工mmunity 44 : 5
08−515 (1984) )。
株はその母株に比してよシトキシンム及びエラスターゼ
突然変異株を用いてマウスに於げる月膜感果、J、↓n
feotiou8デイズージス Diseases 142: 547−555 (19
80))。受身的投与又は能動的接糧によって産出され
るアンチトキシンA−抗体は実験上生じたP、a、感染
に対し工mmunity 18 : 596−602
(1977)参照)。その他の試験はアンチトキシン−
抗体の含有量とP、a、−菌血症にかかった患者の生き
延びる度合とo直接tv関係を示す(M、 S、 Po
1lack等、人間に於てP、a、敗血症の徴候でエキ
ソトキシンA火傷によって外傷を起こさせたマウスに於
て類−分子の存在に依存する( S、J、 Cryz等
・工nfeetion工mmunity 44 : 5
08−515 (1984) )。
実験上のp、 a、−感染に対する血清型−特異性工m
munity 43 : 795−799(1984)
参照)。
munity 43 : 795−799(1984)
参照)。
高められた抗−リボ多糖類−抗体−力価はを明らかに増
加する( A、S、 Cross等、J。
加する( A、S、 Cross等、J。
工nfectious Diseases 142 :
538−546 (1980) )、p、a、−リボ
多糖類−ベースを基体とするワクチ130 (8upp
1. ):第152−158頁(1974) )、P、
a、Jポ多糖類(LPS )が防御性血清型−特異性抗
原−デテルミナントを含有するのにかかわらず、実際の
使用にあたう、ヒトに対してそのあまシにも高い毒性の
ゆえに非経口ワクチンとして使用することができない(
J、L(8uppl−) :第159−162頁(19
74) : M、D。
538−546 (1980) )、p、a、−リボ
多糖類−ベースを基体とするワクチ130 (8upp
1. ):第152−158頁(1974) )、P、
a、Jポ多糖類(LPS )が防御性血清型−特異性抗
原−デテルミナントを含有するのにかかわらず、実際の
使用にあたう、ヒトに対してそのあまシにも高い毒性の
ゆえに非経口ワクチンとして使用することができない(
J、L(8uppl−) :第159−162頁(19
74) : M、D。
Haghbin等、C!ancer 32 : 761
−762 (1973)、p、 a、の血清型−特異性
抗原−デテルミナントをLPE!分子の〇−多糖類(p
s )一部分に適応させる。多糖類(ps)をリボ多糖
類(LPS)の毒性リピツドーA半分から分離し、単離
する。psが抗原−デテルミナントを含有するにもかか
わらず、PSはワクチンとして使用することができなる
( G、 B、 Pier等、工nfection工m
munity 22 :第19−925 (197B)
)、 今日までP、a、−感染及び同様なダラム陰性菌、たと
えば大腸菌(Lc、)による感染の予防に有効なワクチ
ンは存在しない。
−762 (1973)、p、 a、の血清型−特異性
抗原−デテルミナントをLPE!分子の〇−多糖類(p
s )一部分に適応させる。多糖類(ps)をリボ多糖
類(LPS)の毒性リピツドーA半分から分離し、単離
する。psが抗原−デテルミナントを含有するにもかか
わらず、PSはワクチンとして使用することができなる
( G、 B、 Pier等、工nfection工m
munity 22 :第19−925 (197B)
)、 今日までP、a、−感染及び同様なダラム陰性菌、たと
えば大腸菌(Lc、)による感染の予防に有効なワクチ
ンは存在しない。
P、a、又はM 、 c、による感染の相対的発生率及
びその危険性に直面してこれは著しい欠陥である。
びその危険性に直面してこれは著しい欠陥である。
この様な感染に対する能動免疫に有効なワクチンを調製
する必然性を別として、特異性高度免疫血清−これはダ
ラム陰性菌、特にp、a、及びE、Q、に対して高い抗
体−力価を含有するーから成る、免疫グロブリンへの切
迫した要求がある。
する必然性を別として、特異性高度免疫血清−これはダ
ラム陰性菌、特にp、a、及びE、Q、に対して高い抗
体−力価を含有するーから成る、免疫グロブリンへの切
迫した要求がある。
この様な血清又は免疫グロブリン単独で菌血症又は敗血
症の場合に救うことができる。
症の場合に救うことができる。
抗生物質は耐細菌性のゆえにしばしば役に立たない。本
発明の目的は伝染病の医学的処置に於けるこの重要な欠
陥金補うことである。これは明らかに接合ワクチンでの
み可能である。
発明の目的は伝染病の医学的処置に於けるこの重要な欠
陥金補うことである。これは明らかに接合ワクチンでの
み可能である。
特にリボ多糖類とヒトの血清アルブミンとの共有結合に
よって得られる接合ワクチンはたとえば米国特許第41
85.090号明細書から公知である。
よって得られる接合ワクチンはたとえば米国特許第41
85.090号明細書から公知である。
種特異性多糖類と種特異性たん白との共有結合に関する
方法は十分に公知でちゃ、普及している。
方法は十分に公知でちゃ、普及している。
ヨーロッパ特許公開筒118,851号明細書にダラム
陰性菌に対する免疫組成物が記載されている。これは同
一の菌種の解毒されたエンドプロティンと解毒された多
aI類との共有カップリングによって得られる。
陰性菌に対する免疫組成物が記載されている。これは同
一の菌種の解毒されたエンドプロティンと解毒された多
aI類との共有カップリングによって得られる。
以前公知の接合ワクチンの有効性は記載されているが、
臨床的に試験されていない。
臨床的に試験されていない。
今や本発明者はP、a、から単離されたLPSを円に変
え、p、 a、)キシンムから、破傷風トキソイドから
又はジフテリアトキソイドから成るエキソプロティンと
共有カップリングした場合、非毒性及び同時に高度に有
効な接合ワクチンが得られることを見い出した。得られ
たPS −トキシンA、PS−破傷風トキソイド及びp
s−ジフテリアトキソイド接合ワクチンは非毒性及び免
疫原である。これは実験上のpla、−感染に対して有
効な防御を生じる。
え、p、 a、)キシンムから、破傷風トキソイドから
又はジフテリアトキソイドから成るエキソプロティンと
共有カップリングした場合、非毒性及び同時に高度に有
効な接合ワクチンが得られることを見い出した。得られ
たPS −トキシンA、PS−破傷風トキソイド及びp
s−ジフテリアトキソイド接合ワクチンは非毒性及び免
疫原である。これは実験上のpla、−感染に対して有
効な防御を生じる。
更に本発明者はPSとエキソプロティンとの共有カップ
リングの新しい原則は一般化され、それと共にその他の
ダラム陰性菌による感染、特に大腸菌(E、 Q、 )
−感染に対するワクチンの製造にも利用されることを見
い出した。
リングの新しい原則は一般化され、それと共にその他の
ダラム陰性菌による感染、特に大腸菌(E、 Q、 )
−感染に対するワクチンの製造にも利用されることを見
い出した。
したがって本発明の対象は相互に共有結合するたん白と
種特異性多糖類から成るダラム陰性菌による感染に対す
る非毒性接合ワクチンに於て、多糖類は菌のエンドトキ
シンから由来し、たん白はエキソプロティンであること
を特徴とする前記ワクチンである。
種特異性多糖類から成るダラム陰性菌による感染に対す
る非毒性接合ワクチンに於て、多糖類は菌のエンドトキ
シンから由来し、たん白はエキソプロティンであること
を特徴とする前記ワクチンである。
本発明によるワクチンは特に緑膿菌又は大腸菌による感
染に対するワクチンである。
染に対するワクチンである。
エキソプロティンは特にエンドキシン又はエキントキン
イドでちゃ、好ましくは緑膿菌からのトキシンA又はし
かも破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイドである
。
イドでちゃ、好ましくは緑膿菌からのトキシンA又はし
かも破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイドである
。
ダラム陰性菌による感染に対する新規接合ワクチンの製
造法は細菌のエンドトキシンから成る対応する多糖類と
エキソプロティンとを共有結合することを特徴とする。
造法は細菌のエンドトキシンから成る対応する多糖類と
エキソプロティンとを共有結合することを特徴とする。
しかし本発明の対象は3−15の接合体の混合物から成
る接合ワクチンでもあ夛、その多糖類は同一菌種の3−
15の種々の血清型から得られる。
る接合ワクチンでもあ夛、その多糖類は同一菌種の3−
15の種々の血清型から得られる。
もう一つの本発明の対象は接合ワクチンの混合物から成
る多価ワクチンであシ、その個々の成分は夫々特定の菌
種に対する抗体を産出する。
る多価ワクチンであシ、その個々の成分は夫々特定の菌
種に対する抗体を産出する。
またもう一つの本発明の対象は高度免疫血清可能な免疫
グロブリンの製造に使用する。
グロブリンの製造に使用する。
緑膿菌−ワクチンの例でワクチン収得を述べる。
エンドトキシン(Pa)の収得:
p、aeに対する本発明によるワクチンの製造KP。
a、の極めて特定の血清屋をエンドトキシンの収得に関
する源として使用する。その細菌からリボ多糖類(LP
S)がたとえばフェノール−水抽出Naturfora
chung : 148−155 (1952)に従っ
て〕得られる。得られたLPSは1重量%よシ少ないた
ん白及び核酸を含有する。〇−多糖類(PEI)をマイ
クロバイオ−ジー MicroMoxogy 78: 305−318 (
197+) 。不溶性毒性リピツドム一部分を遠心分離
によって分離する。上液みをクロロホルム/メタノール
−溶液で抽出し、リピッドAの残部を除去する。
する源として使用する。その細菌からリボ多糖類(LP
S)がたとえばフェノール−水抽出Naturfora
chung : 148−155 (1952)に従っ
て〕得られる。得られたLPSは1重量%よシ少ないた
ん白及び核酸を含有する。〇−多糖類(PEI)をマイ
クロバイオ−ジー MicroMoxogy 78: 305−318 (
197+) 。不溶性毒性リピツドム一部分を遠心分離
によって分離する。上液みをクロロホルム/メタノール
−溶液で抽出し、リピッドAの残部を除去する。
PS i含有する水性層を減圧で濃縮し、次いでクロマ
トグラフィー精製する。この場合分子量10000〜7
5000の多糖類を集め、凍結乾燥する。
トグラフィー精製する。この場合分子量10000〜7
5000の多糖類を集め、凍結乾燥する。
psの酸化:
得られた多糖類を水中で過ヨウ素威ナトリウムの添加に
よって室温で酸化する。この場合カップリング性アルデ
ヒド基を生じる。エチレングリコールの添加後、物質を
透析によって精製し、その後凍結乾燥する。
よって室温で酸化する。この場合カップリング性アルデ
ヒド基を生じる。エチレングリコールの添加後、物質を
透析によって精製し、その後凍結乾燥する。
エキソプロティン(トキシンA)の収得:95%よシ多
い含有量を有するトキシンAが特に多くのトキシンムを
生じる緑膿菌株からS、J。
い含有量を有するトキシンAが特に多くのトキシンムを
生じる緑膿菌株からS、J。
クリソ
0r7ff等、Infection工mmunity
43: 795−799(1984)の方法に従って得
られる。
43: 795−799(1984)の方法に従って得
られる。
トキシンムーカップリング物質の合成:希釈されたトキ
シンムに脂肪族ジカルボン酸ジヒドラジド及びカルボジ
イミド、たとえば1−エチル−3−(3−ジメチルアミ
ノプロビル)−カルボジイミドを加える。この操作によ
ってトキシンムの遊離カルボキシル基とジカルボン酸
ジヒドラジドとを結合する。得られ九生成物はほぼ次式
によって表わされる: (トキシンA)−Co−NH−NH−Co(CH2)、
、、、−00−NH−HE2緑膿菌−多糖類−トキシン
A−接合体の合成:得られたトキシンA−カップリング
物質を酸化された、アルデヒド基を有するpsと結合す
る。
シンムに脂肪族ジカルボン酸ジヒドラジド及びカルボジ
イミド、たとえば1−エチル−3−(3−ジメチルアミ
ノプロビル)−カルボジイミドを加える。この操作によ
ってトキシンムの遊離カルボキシル基とジカルボン酸
ジヒドラジドとを結合する。得られ九生成物はほぼ次式
によって表わされる: (トキシンA)−Co−NH−NH−Co(CH2)、
、、、−00−NH−HE2緑膿菌−多糖類−トキシン
A−接合体の合成:得られたトキシンA−カップリング
物質を酸化された、アルデヒド基を有するpsと結合す
る。
ソノ際トキシンへ−カツブリング物質と酸化されたps
の当量を混合し、得られたシップ塩基(ヒドラゾンl硼
化水素アルカリ、たとえばN!LBH4又はNaBHs
ONで還元する。
の当量を混合し、得られたシップ塩基(ヒドラゾンl硼
化水素アルカリ、たとえばN!LBH4又はNaBHs
ONで還元する。
その際安定な接合体が生じる。その解明されていない構
造を殊に図式的に次の様に示すことができる: (トキシンA ) −CO−NH−NH−00−(OH
2)、=−00−NH−NH−(多糖類) 接合体を透析して精製し、不溶性物質を遠心分離して分
離し、得られた混合物をアガロースでクロマトグラフィ
ーによって分離する。350000より多い分子量を有
する物質−これはPS及びトキシンムとの分子量を明ら
かに超え、Pfl−)キシンA−接合体である−を分離
し、凍結乾燥する。
造を殊に図式的に次の様に示すことができる: (トキシンA ) −CO−NH−NH−00−(OH
2)、=−00−NH−NH−(多糖類) 接合体を透析して精製し、不溶性物質を遠心分離して分
離し、得られた混合物をアガロースでクロマトグラフィ
ーによって分離する。350000より多い分子量を有
する物質−これはPS及びトキシンムとの分子量を明ら
かに超え、Pfl−)キシンA−接合体である−を分離
し、凍結乾燥する。
多糖類−破傷風トキンイドー接合体の合成破傷風トキソ
イド ヒトに使用することに特定された破傷風トキソイド−た
とえばスイスの血清−及びワクチン研突所のTEアナト
キシン(6)−を90%までが破傷風トキソイドから成
る様にセルロースでイオン交換−クロマトグラフィーに
より及びアガルロースでゲル濾過して精製する。
イド ヒトに使用することに特定された破傷風トキソイド−た
とえばスイスの血清−及びワクチン研突所のTEアナト
キシン(6)−を90%までが破傷風トキソイドから成
る様にセルロースでイオン交換−クロマトグラフィーに
より及びアガルロースでゲル濾過して精製する。
これはこの場合たとえばJerker Porath、
酵素学法、第34巻、第21頁以下参照の一般法に従っ
て行われる。LPSから加水分解によって得られる多糖
類(PS)をこのカップリングに関して酸化するのでは
なく、水性溶液の形で公知方法でアルカリ媒体中で室温
でシアン化臭素と反応させる。その際シアン化臭素(B
r0N )は下記の図式的に(PS)−0Hで表わされ
る多糖類の遊離−OH基と反応する。得られた活性化さ
れた多糖類はアルキレンジカルボン酸ジヒドラジド(た
とえばH2皿11iCO((H2) l−6−0ONH
−NH2)と、たとえばアジピン酸ジヒドラジド(AD
H)と反応する。
酵素学法、第34巻、第21頁以下参照の一般法に従っ
て行われる。LPSから加水分解によって得られる多糖
類(PS)をこのカップリングに関して酸化するのでは
なく、水性溶液の形で公知方法でアルカリ媒体中で室温
でシアン化臭素と反応させる。その際シアン化臭素(B
r0N )は下記の図式的に(PS)−0Hで表わされ
る多糖類の遊離−OH基と反応する。得られた活性化さ
れた多糖類はアルキレンジカルボン酸ジヒドラジド(た
とえばH2皿11iCO((H2) l−6−0ONH
−NH2)と、たとえばアジピン酸ジヒドラジド(AD
H)と反応する。
その際ジヒドラジドは多糖類と共有結合する。
結合にあた)生じる反応は特に次の様に表わすことがで
きる: (PS)−OH十BrCN→ (PS)−0−0mN+H2N−NHCO−(CH2)
、−、−Co−NH−NH2−’p(PS)−〇−C(
NH)−NH−NH−C!O(C!H2)、−6−Co
−NH−NH2+ H2O−+(PS)−0−CH0−
Nfi−NH−00−(CH2)、、−GO−NH−N
H2その際得られるps−ジヒドラジド−接合体を強力
な透析によって精製する。希鉱酸の添加によって溶液を
弱く酸性化し、破傷風トキソイドとカルボジイミドとの
当量を加え、2〜3時間室温で撹拌する。カルボジイミ
ドの存在下トキソイド(HOC!O−()キソイド)と
して図式的に表わされる)との反応によって、−但しト
キソイドの遊離カルボキシル基金P8−ジヒドラジド−
接合体の遊離ヒドラジド−基で縮合する一1所望のps
−ジヒドラジド−トキソイド−接合体を産出する。その
鮮明されていない構造を図式%式%: 得られた混合物をリン酸塩緩衝液で透析し、アガロース
−カラムを介してクロマトグー7フイー分離する。出発
成分の分子量を明らかに超えている350000以上の
分子量を有する物質を分離し、凍結乾燥する。
きる: (PS)−OH十BrCN→ (PS)−0−0mN+H2N−NHCO−(CH2)
、−、−Co−NH−NH2−’p(PS)−〇−C(
NH)−NH−NH−C!O(C!H2)、−6−Co
−NH−NH2+ H2O−+(PS)−0−CH0−
Nfi−NH−00−(CH2)、、−GO−NH−N
H2その際得られるps−ジヒドラジド−接合体を強力
な透析によって精製する。希鉱酸の添加によって溶液を
弱く酸性化し、破傷風トキソイドとカルボジイミドとの
当量を加え、2〜3時間室温で撹拌する。カルボジイミ
ドの存在下トキソイド(HOC!O−()キソイド)と
して図式的に表わされる)との反応によって、−但しト
キソイドの遊離カルボキシル基金P8−ジヒドラジド−
接合体の遊離ヒドラジド−基で縮合する一1所望のps
−ジヒドラジド−トキソイド−接合体を産出する。その
鮮明されていない構造を図式%式%: 得られた混合物をリン酸塩緩衝液で透析し、アガロース
−カラムを介してクロマトグー7フイー分離する。出発
成分の分子量を明らかに超えている350000以上の
分子量を有する物質を分離し、凍結乾燥する。
前記合成に於て破傷風トキソイドをジフテリアトキソイ
ドに代えることもできる。
ドに代えることもできる。
上述と同様な方法でその他のダラム陰性菌、たとえば大
腸菌による感染に対するワクチンも産出することができ
る。
腸菌による感染に対するワクチンも産出することができ
る。
本発明による接合ワクチンの安全性及び有効性の証明
本発明による緑膿菌(PS−)キシンム)−1(Pg−
破傷風トキソイド)−及び(PS−ジフテリアトキソイ
ド)−接合体の性質: 表1のデータから接合体は350000!j)多い分子
量を有し、それと同時に出発物質の分子量ははるかに超
えていることが明らかである。
破傷風トキソイド)−及び(PS−ジフテリアトキソイ
ド)−接合体の性質: 表1のデータから接合体は350000!j)多い分子
量を有し、それと同時に出発物質の分子量ははるかに超
えていることが明らかである。
トキシンAの共有結合によってこの高毒性物質を解毒す
る。その際致死量は0.2μt/マクスの少なくとも1
000倍はど200μt/マウス以上に増加する。発熱
原性はその接合体に於て自然の緑膿菌PA 220 L
PS (0,7at/rd/kg体重)Kよる接合体と
比較して実質上消滅している。
る。その際致死量は0.2μt/マクスの少なくとも1
000倍はど200μt/マウス以上に増加する。発熱
原性はその接合体に於て自然の緑膿菌PA 220 L
PS (0,7at/rd/kg体重)Kよる接合体と
比較して実質上消滅している。
接合体は多糖類に対して及びたん白−担体く対しても、
すなわちトキシンムに対して、破傷風−トキシンに対し
て又はジフテリア−トキシンに対して特異性抗体一応答
を誘発する。トキシンムと多糖類との共有結合によって
トキシン゛At−完全に解毒化し、その際その免疫原性
活性を失うことはない。
すなわちトキシンムに対して、破傷風−トキシンに対し
て又はジフテリア−トキシンに対して特異性抗体一応答
を誘発する。トキシンムと多糖類との共有結合によって
トキシン゛At−完全に解毒化し、その際その免疫原性
活性を失うことはない。
精製されたトキシンAで致命的な毒害を受けたマウスに
対する( PS−トキシンム)−接合体:(Pa−トキ
シンム)−接合ワクチンの防御能力をたとえば次の様に
証明する: マウスのグループに実験の開始時及び実験の14日目に
(Pa −)キシンA)−接合体の対応する量の形で1
0μtたん白を又は緩衝剤(コントロールグループ)を
筋内内投与する。実験の28日目に段階的に増加するト
キシンムの薬用量を投与する。コントロール動物に対す
る平均致死量は0.2μtである。一方(Pa−)キシ
ンA)−接合体で前処理にされた動物の平均致死量は4
.7μf/マウスである。
対する( PS−トキシンム)−接合体:(Pa−トキ
シンム)−接合ワクチンの防御能力をたとえば次の様に
証明する: マウスのグループに実験の開始時及び実験の14日目に
(Pa −)キシンA)−接合体の対応する量の形で1
0μtたん白を又は緩衝剤(コントロールグループ)を
筋内内投与する。実験の28日目に段階的に増加するト
キシンムの薬用量を投与する。コントロール動物に対す
る平均致死量は0.2μtである。一方(Pa−)キシ
ンA)−接合体で前処理にされた動物の平均致死量は4
.7μf/マウスである。
ワクチンとして(Pa−破傷風トキソイド)−及び(P
S−)キシンム)−接合体の有効性。
S−)キシンム)−接合体の有効性。
実験上引き起こされた緑膿菌−火傷側御敗血症の実験動
物に対する天然のリポ多糖類(緑膿菌からのLP8 )
、(PS−破傷風トキソイド)−接合体及び(PS−ト
キシンム)−接合体の防御能力を表2に示す。
物に対する天然のリポ多糖類(緑膿菌からのLP8 )
、(PS−破傷風トキソイド)−接合体及び(PS−ト
キシンム)−接合体の防御能力を表2に示す。
表 2
緑膿菌PA220で致命的に誘発された火傷側−敗血症
に対してPA220のLPS 、 (Pa−破傷風トキ
ソイド)−接合体及び(ps−トキシンム)−接合体で
免疫化による防御。
に対してPA220のLPS 、 (Pa−破傷風トキ
ソイド)−接合体及び(ps−トキシンム)−接合体で
免疫化による防御。
免疫@(11IJI) (2)
無しくコントロール) 20LP日
106Pト破傷風トキソイド−接合体
106P8−)キシンムー接合体 106(
1)マウスに実験前及び実験の14日目に1μ2筋肉内
注射する。次いでこれに火傷創傷させ(方法:工、A。
106Pト破傷風トキソイド−接合体
106P8−)キシンムー接合体 106(
1)マウスに実験前及び実験の14日目に1μ2筋肉内
注射する。次いでこれに火傷創傷させ(方法:工、A。
インフエクシlン イミエニテイ
ホルダー等々、工nfection工mmunity
35.276−280 (1982)、28日目に緑膿
菌PA220の増加薬用量を与える。
35.276−280 (1982)、28日目に緑膿
菌PA220の増加薬用量を与える。
493−497 (193B)の方法に従って算出され
る。
る。
このデータからLPS、(ps−破傷風トキソイド)−
接合体及び(Pa −)キシンA)−接合体での免疫化
は致命的なp、a0敗血症に対してほぼ同一の著しい防
御作用を生じることが認められる。これによって緑膿菌
PA220に対する致死量は免疫されていないコントロ
ールグループに比して約50.000倍増加する。
接合体及び(Pa −)キシンA)−接合体での免疫化
は致命的なp、a0敗血症に対してほぼ同一の著しい防
御作用を生じることが認められる。これによって緑膿菌
PA220に対する致死量は免疫されていないコントロ
ールグループに比して約50.000倍増加する。
(Pa−破傷風トキソイド)−接合ワクチンの安全性及
び免疫原性。
び免疫原性。
男女の健康な16〜59才の成人志頭者に実験の開始及
び14日後に上腕に0.5d皮下注射で接合ワクチン1
00μfを投与する。
び14日後に上腕に0.5d皮下注射で接合ワクチン1
00μfを投与する。
試験者のすべての反応を記録する。副反応はまれで、弱
くかつ一過性である。
くかつ一過性である。
静脈血液試料を実験の開始及び接種後14及び28日目
に採取する。血液試料から得られた血清を集め、−20
℃で保存する。免疫グロブリンG(工tG)−抗体力価
を測定する。
に採取する。血液試料から得られた血清を集め、−20
℃で保存する。免疫グロブリンG(工tG)−抗体力価
を測定する。
(ps−破傷風トキソイド)−接合体での免疫化は出発
力価に比較して接種から14及び28日後平均抗−PA
220 LPS IfG−力価の重要な増加を導く(表
3参照)。
力価に比較して接種から14及び28日後平均抗−PA
220 LPS IfG−力価の重要な増加を導く(表
3参照)。
試、検者の80チ以上がその4倍又はそれ以上はどく高
められた抗体力価で反応する。この接合ワクチンでの免
疫化は破傷風トキシンを中和する抗−破傷風−抗体一力
価も導く。
められた抗体力価で反応する。この接合ワクチンでの免
疫化は破傷風トキシンを中和する抗−破傷風−抗体一力
価も導く。
血清−集団が実験開始(前−免疫−集団)及び28日後
(免疫−集団)で夫々の試験者の等量の血清組合せくよ
って得られる。
(免疫−集団)で夫々の試験者の等量の血清組合せくよ
って得られる。
前−免疫−集団はdあたシ2.7破傷風トキシン中和国
際単位を有し、一方免疫集団は6.2単位/ゴを有する
。
際単位を有し、一方免疫集団は6.2単位/ゴを有する
。
ヒトに本発明による(ps−破傷風トキソイド)−接合
体を接種することによって産出される抗−PA220−
LPS−工ta−抗体社やっかいな実験上緑膿菌によ
って引き起こされた敗血症に対して高い有効性を示す。
体を接種することによって産出される抗−PA220−
LPS−工ta−抗体社やっかいな実験上緑膿菌によ
って引き起こされた敗血症に対して高い有効性を示す。
受身伝達された後−免疫一工yaは死亡の予防に関して
受身伝達された前−免疫−工yGに比して明らかに有効
である。測定された防御値は工ya−調製物の抗−PA
220−LPEI−l7G−力価で修正する(表4参
照〕。
受身伝達された前−免疫−工yGに比して明らかに有効
である。測定された防御値は工ya−調製物の抗−PA
220−LPEI−l7G−力価で修正する(表4参
照〕。
したがって(ps−破傷風トキソイド)−接合体はヒト
に危険なく使用でき、接種された人の80チ以上で明ら
かに高められた抗−PA220−T、+PS−工yG−
力価を生じるワクチンである。この方法でヒトに生じた
抗−Pム220−’LP8−免疫グロブリンはやっかい
な緑膿菌−敗血症に対して高い有効性を示す。
に危険なく使用でき、接種された人の80チ以上で明ら
かに高められた抗−PA220−T、+PS−工yG−
力価を生じるワクチンである。この方法でヒトに生じた
抗−Pム220−’LP8−免疫グロブリンはやっかい
な緑膿菌−敗血症に対して高い有効性を示す。
同様な結果が本発明による
P、a、+P8) −トキシンム−2
P、a、(PEi)−ジフテリアトキソイド−2B、c
、(PB)−トキシンA−。
、(PB)−トキシンA−。
M、c、(PB)−破傷風トキソイド−及び。
E、c−(PS)−ジフテリアトキソイド−接合ワクチ
ンを生じる。
ンを生じる。
表 4
やっかいな緑膿菌PA220−火傷創−敗血症に対する
受身伝達された工yG−rf)ス の防御可能性。
受身伝達された工yG−rf)ス の防御可能性。
無し” 1.3X10’前
−免疫(3)731.3×105 後−免疫(’l 1065 6.7X
105劫 (1)夫々の!ウスは緑膿菌PA 220で負荷24時
間前に0.2d中に約1.6μtヒトエfGを静注する
。
−免疫(3)731.3×105 後−免疫(’l 1065 6.7X
105劫 (1)夫々の!ウスは緑膿菌PA 220で負荷24時
間前に0.2d中に約1.6μtヒトエfGを静注する
。
(2)コントロールは0.24無菌塩溶液を有する。
(51免疫の前にナベての志願した試験者の血清の一定
部分から製造。
部分から製造。
(4)免疫28日後すべての志願者の血清の一定部分か
ら製造。
ら製造。
(Pa−破傷風トキソイド)−1(ps−ジフテリアト
キソイド)−及び(PS−)キシンム)−接合ワクチン この接合体は多数のテストで非毒性、非発熱性及び高度
に有効なワクチンであることが明らかである。この様な
ワクチンは従来公知でない。
キソイド)−及び(PS−)キシンム)−接合ワクチン この接合体は多数のテストで非毒性、非発熱性及び高度
に有効なワクチンであることが明らかである。この様な
ワクチンは従来公知でない。
実際の使用に関し緑膿菌の種々の血清型による感染に対
して広く区分された作用を発揮するワクチンを提供する
ことが望まれている。
して広く区分された作用を発揮するワクチンを提供する
ことが望まれている。
本発明者は(ps−破傷風トキソイド)−1(1’S−
ジフテリアトキソイド)−又は(ps−トキシンA)−
接合体から成る組成物を使用した場合、この広く区分さ
れ次作用を達成することができることを見い出した。そ
のPS (多糖類)一部分は感染で主に生じる緑膿菌(
P、a、)の多くの血清型から由来する。更に緑膿菌の
約3−15の異なる血清型は不可欠である。
ジフテリアトキソイド)−又は(ps−トキシンA)−
接合体から成る組成物を使用した場合、この広く区分さ
れ次作用を達成することができることを見い出した。そ
のPS (多糖類)一部分は感染で主に生じる緑膿菌(
P、a、)の多くの血清型から由来する。更に緑膿菌の
約3−15の異なる血清型は不可欠である。
PS−たん白−接合体に対する種々の血清型の多糖類(
Pa)の結合は使用可能な調製物を得るために個々に行
わねばならない。これはP、a、の3−15の純粋な株
から夫々個々のLP8 t−単離し、これからps及び
個々のPE?を別々にたん白部分(トキシンA1破傷風
トキソイド又はジフテリアトキソイド)と共有結合し、
得られた接合体はその相容性及び有効性をテストし、最
後に3−15の単一接合体を一緒に混合して完成された
組合せ調製物となすことを意味する。
Pa)の結合は使用可能な調製物を得るために個々に行
わねばならない。これはP、a、の3−15の純粋な株
から夫々個々のLP8 t−単離し、これからps及び
個々のPE?を別々にたん白部分(トキシンA1破傷風
トキソイド又はジフテリアトキソイド)と共有結合し、
得られた接合体はその相容性及び有効性をテストし、最
後に3−15の単一接合体を一緒に混合して完成された
組合せ調製物となすことを意味する。
同一の処理はその他のダラム陰性菌による感染に対する
組合せワクチンの製造にも適用される。種々のダラム陰
性菌種による感染に対して有効なワクチン。
組合せワクチンの製造にも適用される。種々のダラム陰
性菌種による感染に対して有効なワクチン。
たった1回の接種によって種々のダラム陰性菌種に対す
る抗体を産出することが極めて望まれている。抗体を収
得し、ダラム陰性菌による感染に対して特異的に有効な
免疫グロブリンへ加工しなければならない場合にこれは
特に重要である。
る抗体を産出することが極めて望まれている。抗体を収
得し、ダラム陰性菌による感染に対して特異的に有効な
免疫グロブリンへ加工しなければならない場合にこれは
特に重要である。
本発明者はある菌種に対する特異性接合ワクチンをその
他の菌種に対する特異性接合ワクチン1又は数種と混合
した場合、この目的を達成することができることを見い
出した。
他の菌種に対する特異性接合ワクチン1又は数種と混合
した場合、この目的を達成することができることを見い
出した。
特異性免疫グロブリンの製造に本発明による接合ワクチ
ンを使用する。
ンを使用する。
更にその上本発明による接合ワクチンはヒトに於て当該
菌種に対して特異性抗体の形成を生じせしめることが認
められた。この方法で産出される抗体力価は任意の予防
接種を受けたヒトの血清中でこの血清を出発物質として
特異性免疫グロブリンの製造に使用できる程高い。した
がって医師は対応する画面症にかかった、予防接種され
ていない患者を効果的に処置し、助けることができる剤
を所持している。
菌種に対して特異性抗体の形成を生じせしめることが認
められた。この方法で産出される抗体力価は任意の予防
接種を受けたヒトの血清中でこの血清を出発物質として
特異性免疫グロブリンの製造に使用できる程高い。した
がって医師は対応する画面症にかかった、予防接種され
ていない患者を効果的に処置し、助けることができる剤
を所持している。
例
例1
緑膿菌ワクチン:PS−)キシンA −接合体1esグ
リセリンを含有する3 % Typticase−アン
ド・カンパニー、アメリカ) 5001nlに緑膿菌(
工T−5=Habs 10 )の凍結乾燥された培養液
を植菌し、37℃及び150 RPMで培養する。この
前培養液を1%グリセリンを含有する3%TSB培地5
oztに植菌し、発酵基中で16時間37℃で培養する
。細胞を濾過遠心分離(友とえばウェスト7アリアのも
の)して収得し、2回トリス−NaOl−緩衝液pH9
で洗滌する。次いで細胞をトリス−Na(!を一緩ラス
ピーズ(ダイノーミル、W、A、 BaChhOfer
社、バーゼル、スイス)1!−用いて砕く。細胞壁を遠
心分離によって廃棄する細胞質から分離する。細胞壁を
支度トリスーNaOl−緩衝液中に浸潤させ、冷遠心分
離機で25500.9で30分間沈降させる。次いで細
胞壁を水1280jI7を加える。方法: O,Wes
tphal。
リセリンを含有する3 % Typticase−アン
ド・カンパニー、アメリカ) 5001nlに緑膿菌(
工T−5=Habs 10 )の凍結乾燥された培養液
を植菌し、37℃及び150 RPMで培養する。この
前培養液を1%グリセリンを含有する3%TSB培地5
oztに植菌し、発酵基中で16時間37℃で培養する
。細胞を濾過遠心分離(友とえばウェスト7アリアのも
の)して収得し、2回トリス−NaOl−緩衝液pH9
で洗滌する。次いで細胞をトリス−Na(!を一緩ラス
ピーズ(ダイノーミル、W、A、 BaChhOfer
社、バーゼル、スイス)1!−用いて砕く。細胞壁を遠
心分離によって廃棄する細胞質から分離する。細胞壁を
支度トリスーNaOl−緩衝液中に浸潤させ、冷遠心分
離機で25500.9で30分間沈降させる。次いで細
胞壁を水1280jI7を加える。方法: O,Wes
tphal。
Z、 Naturforsah、 7 : 148−1
55d混合物t−68〜70℃に加温し、5分間この温
度で撹拌する。その後抽出混合物を水浴中で4−10℃
に冷却し、次いで相分離のために15分間23500、
!i’で冷遠心分離機で遠心分離する。
55d混合物t−68〜70℃に加温し、5分間この温
度で撹拌する。その後抽出混合物を水浴中で4−10℃
に冷却し、次いで相分離のために15分間23500、
!i’で冷遠心分離機で遠心分離する。
上相は水相に相当し、リボ多糖類(LPS)を含有する
。これを支度蒸留水1tを加えたフェノール相から注i
深く分離し、全体を再び6B−70℃で5分間撹拌する
。再び水浴中で4−10℃に冷却し、相を上述の様に分
離する。
。これを支度蒸留水1tを加えたフェノール相から注i
深く分離し、全体を再び6B−70℃で5分間撹拌する
。再び水浴中で4−10℃に冷却し、相を上述の様に分
離する。
水性相を一緒にし、水でフェノールがなくなるまで透析
する。フェノール相を捨てる。次いで水相を超遠心分離
機でLPBの沈降のために、100000Iiで3時間
遠心分離する。
する。フェノール相を捨てる。次いで水相を超遠心分離
機でLPBの沈降のために、100000Iiで3時間
遠心分離する。
沈降物を0.05 M トリス−緩衝液(pH7,2,
0,05M NaCl f含有)中に溶解し、RNA、
e、DNA8.及びプロナーゼ(Pronase )
(ペーリンガー、マンハイム、西ドイツ)で次の様に処
理する。RNA8. i最終濃度20μt/ml Ic
まで加え、3時間37℃で培養する。次いでDNA、θ
を最終濃度20μt/atまで及びMtBO4を最終濃
度0.1Mまで加え、同様に3時間37℃で培養する。
0,05M NaCl f含有)中に溶解し、RNA、
e、DNA8.及びプロナーゼ(Pronase )
(ペーリンガー、マンハイム、西ドイツ)で次の様に処
理する。RNA8. i最終濃度20μt/ml Ic
まで加え、3時間37℃で培養する。次いでDNA、θ
を最終濃度20μt/atまで及びMtBO4を最終濃
度0.1Mまで加え、同様に3時間37℃で培養する。
次いでプロナーゼを濃度200μf/dまで加え、2−
3時間37℃で培養し、次いで4℃で一晩水で透析する
。LPB i 2回遠心分離して更に精製し、次いで凍
結乾燥する。
3時間37℃で培養し、次いで4℃で一晩水で透析する
。LPB i 2回遠心分離して更に精製し、次いで凍
結乾燥する。
nI製されたI、PSは不純物としてヌクレイン酸及び
たん白を1%よ〕少なく含有する。
たん白を1%よ〕少なく含有する。
N製されたLPBをlfi酢酸゛3岬/dの鯛物10:
501−510 (1969)、この処理で多糖類部
分を毒性リピツド部分(リピツドA)から分離する。リ
ピッドAは不溶性であ夛、遠心分離によって可溶性多糖
類を除去する。水性多糖類溶液を少量のリピツドAO除
去のために3回同一容量のクロロホルム−メタノール(
3:1)で抽出し、水流ポンプ減圧で蒸発する。濃縮さ
れたPS−溶液をアガロース−ゲル、たとえばAOA3
4−ゲル(I、KB−グロダクターAB 、プロマ、ス
ウェーデン)でクロマトグラフィー分離する(カラム5
cIJL X 40 C211s展開速度1.7ml
/分、分画の大きさ17d)、多糖類を個々の分画で測
定する。分子量10000〜75000を有するpsを
含有する分画を集め、凍結乾燥する。
501−510 (1969)、この処理で多糖類部
分を毒性リピツド部分(リピツドA)から分離する。リ
ピッドAは不溶性であ夛、遠心分離によって可溶性多糖
類を除去する。水性多糖類溶液を少量のリピツドAO除
去のために3回同一容量のクロロホルム−メタノール(
3:1)で抽出し、水流ポンプ減圧で蒸発する。濃縮さ
れたPS−溶液をアガロース−ゲル、たとえばAOA3
4−ゲル(I、KB−グロダクターAB 、プロマ、ス
ウェーデン)でクロマトグラフィー分離する(カラム5
cIJL X 40 C211s展開速度1.7ml
/分、分画の大きさ17d)、多糖類を個々の分画で測
定する。分子量10000〜75000を有するpsを
含有する分画を集め、凍結乾燥する。
0、 PSの酸化
凍結乾燥されたPaを蒸留水中に5η/dの濃度で溶解
する。これK Nazo4(過ヨウ素酸ナトリウム)t
−加え0.1Mの濃度となす。この溶液を2時間、室温
で暗所に放置する。過剰の酸化剤を0.2M(11度ま
でエチレングリコールを加えて不活性化する。酸化され
たps6徹底的に水で透析し、凍結乾燥する。
する。これK Nazo4(過ヨウ素酸ナトリウム)t
−加え0.1Mの濃度となす。この溶液を2時間、室温
で暗所に放置する。過剰の酸化剤を0.2M(11度ま
でエチレングリコールを加えて不活性化する。酸化され
たps6徹底的に水で透析し、凍結乾燥する。
D、)キシンA
ストックホルム、スウェーデンから得られる。)次の公
知方法に従って単離する:限外濾過、DBAI−セルロ
ース−クロマトグラフィー、ヒ単離され念トキシンAの
純度は95チよシ大きい。
知方法に従って単離する:限外濾過、DBAI−セルロ
ース−クロマトグラフィー、ヒ単離され念トキシンAの
純度は95チよシ大きい。
ADHは6スペーサー”分子として及び反応性アミノ基
の導入のためにトキシンAと次の様に共有結合する: 純粋なトキシンAを0.05 N Na−リン酸塩−緩
衝液(pH7,2)中でs my/mlに調製する。こ
れにADH(アジピン酸ジヒドラジド)及び1−エチル
−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
を固形で加え夫々101n9/dの濃度となす。pHを
希塩酸で4.8に調整する。溶液を慎重に2時間22℃
で撹拌し、更に1N塩酸の添加によって4.8で一定に
保つ。
の導入のためにトキシンAと次の様に共有結合する: 純粋なトキシンAを0.05 N Na−リン酸塩−緩
衝液(pH7,2)中でs my/mlに調製する。こ
れにADH(アジピン酸ジヒドラジド)及び1−エチル
−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
を固形で加え夫々101n9/dの濃度となす。pHを
希塩酸で4.8に調整する。溶液を慎重に2時間22℃
で撹拌し、更に1N塩酸の添加によって4.8で一定に
保つ。
反応の終了後、混合物を徹底的に0.0MNa−リン酸
塩−緩衝液(pH8,0)で4℃で透析する。不溶性材
料を遠心分離して除去する。トキシンA−ムDH−溶液
を濃度5mg/ゴに調整する。
塩−緩衝液(pH8,0)で4℃で透析する。不溶性材
料を遠心分離して除去する。トキシンA−ムDH−溶液
を濃度5mg/ゴに調整する。
トキシンA −ADH−溶液を2時間室温で0.5M
Na −I)ン酸塩−緩衝液で透析し、トキシンA −
ADH−溶液を5 q/ rrdlに調整する。この溶
液に同様に0.5 M Na −リン酸塩−緩衝液(p
H8,0)に溶解された酸化されたPS 5η/ゴの溶
液の同一容量を加える。この溶液を6時間室温で放置し
、次いで10倍に濃縮された( 0.5 M )溶液か
ら0.05 M濃度までのNaBH30N f加える。
Na −I)ン酸塩−緩衝液で透析し、トキシンA −
ADH−溶液を5 q/ rrdlに調整する。この溶
液に同様に0.5 M Na −リン酸塩−緩衝液(p
H8,0)に溶解された酸化されたPS 5η/ゴの溶
液の同一容量を加える。この溶液を6時間室温で放置し
、次いで10倍に濃縮された( 0.5 M )溶液か
ら0.05 M濃度までのNaBH30N f加える。
混合物を5−7日間室温で放置する。次いで徹底的に0
.02 %メルチオラートを含有する所7.4のリン酸
塩緩衝液(PBX )で透析する。
.02 %メルチオラートを含有する所7.4のリン酸
塩緩衝液(PBX )で透析する。
不溶性材料を遠心分離して除去し、溶解された反応混合
物をアガロースゲル、たとえばAcA 34−ゲルを介
してクロマトグラフィー分離する。分画から吸収を28
0及び220 nmで測定する。空容量(v0〕で溶出
し、従って350000以上の分子量を有するーこれは
反応成分のモル重量をはるかに超えている一物質を集め
、無菌濾過する。物質t−o、sゴはヒトの薬用量に相
当し、最終溶液は50%PBS及び0.01 %メルチ
オラート中に5チ乳糖k 含有する様に希釈し、次いで
凍結乾燥するO ワクチンについて次の試験を実施する:試験
方法 下で7エノールー硫酸ま たん白含有it標準として牛血清アルブミンの使用下で
ローリ−等2 無 菌 発熱原性 家ウサギ 相容性 2つのヒトの薬用it夫々2匹のモルモット
に及び1つのヒトの薬用量 を夫々5匹のマウスに腹腔内投与。
物をアガロースゲル、たとえばAcA 34−ゲルを介
してクロマトグラフィー分離する。分画から吸収を28
0及び220 nmで測定する。空容量(v0〕で溶出
し、従って350000以上の分子量を有するーこれは
反応成分のモル重量をはるかに超えている一物質を集め
、無菌濾過する。物質t−o、sゴはヒトの薬用量に相
当し、最終溶液は50%PBS及び0.01 %メルチ
オラート中に5チ乳糖k 含有する様に希釈し、次いで
凍結乾燥するO ワクチンについて次の試験を実施する:試験
方法 下で7エノールー硫酸ま たん白含有it標準として牛血清アルブミンの使用下で
ローリ−等2 無 菌 発熱原性 家ウサギ 相容性 2つのヒトの薬用it夫々2匹のモルモット
に及び1つのヒトの薬用量 を夫々5匹のマウスに腹腔内投与。
毒 性 6匹のマウスに200μ?(たん白)t
−0,5rd腹腹腔膜投 与果は表1を参照。
−0,5rd腹腹腔膜投 与果は表1を参照。
’M、DubO1a等、砂糖及びこれに関連する物質の
測定に関する比色法、Anal、 Chem、 28
:350−355、 ” OoHlLowry等、ホリン−フェノール試薬を
用いるたん白測定。J、 Biol、 Chem、 1
93 :265−275 (1951)、 例2 例IA/’Bによシ製造されたPSl 00η饋留水9
.2d中に溶解する。これに慎重にシアン化臭素の溶液
0.44′ll1i加える。pHi I N NaOH
で6分間pH10,5に保つ。その後pHを固形NaH
CO3の添加によって8.6に下げる。アジピン酸ジヒ
ドラジド(ADH) 0.41を加え、溶液を慎重な撹
拌下16時間4℃で放置する。水で徹底的に透析後たと
えばイオン交換体及びゲル−クロマトグラフィーで精製
され又は凍結乾燥された破傷風トキソイド100■及び
1−エチル−3−(5−ジメチルアミノプロピル)−カ
ルボジイミド−溶液(20η/m ) 5.5 vrl
を加える。
測定に関する比色法、Anal、 Chem、 28
:350−355、 ” OoHlLowry等、ホリン−フェノール試薬を
用いるたん白測定。J、 Biol、 Chem、 1
93 :265−275 (1951)、 例2 例IA/’Bによシ製造されたPSl 00η饋留水9
.2d中に溶解する。これに慎重にシアン化臭素の溶液
0.44′ll1i加える。pHi I N NaOH
で6分間pH10,5に保つ。その後pHを固形NaH
CO3の添加によって8.6に下げる。アジピン酸ジヒ
ドラジド(ADH) 0.41を加え、溶液を慎重な撹
拌下16時間4℃で放置する。水で徹底的に透析後たと
えばイオン交換体及びゲル−クロマトグラフィーで精製
され又は凍結乾燥された破傷風トキソイド100■及び
1−エチル−3−(5−ジメチルアミノプロピル)−カ
ルボジイミド−溶液(20η/m ) 5.5 vrl
を加える。
pi’+を0.1N塩酸で4.8に調整し、4時間室温
で弱い撹拌下一定に保つ。次いで反応混合物を徹底的に
PBS−メルテオラー)0.02%で透析する。その後
混合物をアガロース−ゲル(カラム5cJ!L×40c
IIL、展開速度1.1m/分)でPBS −メルチオ
ラートー緩衝液を用いてクロマトグラフィー分離する。
で弱い撹拌下一定に保つ。次いで反応混合物を徹底的に
PBS−メルテオラー)0.02%で透析する。その後
混合物をアガロース−ゲル(カラム5cJ!L×40c
IIL、展開速度1.1m/分)でPBS −メルチオ
ラートー緩衝液を用いてクロマトグラフィー分離する。
11mの分画を集め、たん白−及びps−含有量を測定
する。空容量でこれを溶出し、それに従って35000
0以上の分子量を有する材料を集め、例10様に凍結乾
燥する。ps−破傷風一接合体とFB−)キシンAと同
様に接合体を試験する(例1参照)。
する。空容量でこれを溶出し、それに従って35000
0以上の分子量を有する材料を集め、例10様に凍結乾
燥する。ps−破傷風一接合体とFB−)キシンAと同
様に接合体を試験する(例1参照)。
例3
例2に記載した様に血清型特異性デテルミナンIe含有
する多糖類を精製されかつ濃縮された又は凍結乾燥され
たジフテリアトキソイドと共有結合する。
する多糖類を精製されかつ濃縮された又は凍結乾燥され
たジフテリアトキソイドと共有結合する。
得られたワクチンは非癲性であ夕、緑膿菌に対して血清
型特異性抗体並びにシフテリアトキンイドに対して抗毒
性抗体を産出する。
型特異性抗体並びにシフテリアトキンイドに対して抗毒
性抗体を産出する。
例4
大腸菌−PS−トキシンA−接合ワクチン例1に記載し
た様に、血清型特異性デテルミナントを含有する多糖類
を大腸菌−発酵培養液のエンドトキシンから単離する。
た様に、血清型特異性デテルミナントを含有する多糖類
を大腸菌−発酵培養液のエンドトキシンから単離する。
例1!/c記載した様K、多糖類を過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化し、トキシンAと6スペサー”−分子アジピン
酸ジヒドラジドを用いて共有結合する。接合ワクチンを
凍結乾燥し、試験する。これは非毒性で、十分に相容性
であり1.大腸菌に対する血清型特異性抗体の形成を導
く。
ムで酸化し、トキシンAと6スペサー”−分子アジピン
酸ジヒドラジドを用いて共有結合する。接合ワクチンを
凍結乾燥し、試験する。これは非毒性で、十分に相容性
であり1.大腸菌に対する血清型特異性抗体の形成を導
く。
例5
大腸菌−PS−破傷風トキソイドー接合ワクチン血清型
特異性デテルミナントを含有する大腸菌−多糖類をシア
ン化ブロムで活性化し、例2と同様にスペーサー分子ア
ジピン酸ジヒドラジド(ADH)と共有結合する。多糖
類−ADHを水溶性カルボジイミドを用いて破傷風トキ
ソイドのカルボキシル基と共有結合する。
特異性デテルミナントを含有する大腸菌−多糖類をシア
ン化ブロムで活性化し、例2と同様にスペーサー分子ア
ジピン酸ジヒドラジド(ADH)と共有結合する。多糖
類−ADHを水溶性カルボジイミドを用いて破傷風トキ
ソイドのカルボキシル基と共有結合する。
得られたワクチンは非毒性で、十分に相容性であり、大
腸菌に対する血清型特異性抗体の形成並びに破傷風トキ
ソイドに対する抗毒性抗体の形成を導く。
腸菌に対する血清型特異性抗体の形成並びに破傷風トキ
ソイドに対する抗毒性抗体の形成を導く。
例6−8
新規血清型特異性単一接合体を薬用量あたシ夫々50〜
100μfを混合して多価緑膿菌−接合ワクチンとなし
精製する。
100μfを混合して多価緑膿菌−接合ワクチンとなし
精製する。
処理:接合体の多糖類−成分を先ず個々に次の9つの緑
膿菌−株のエントドキシ/がら単離する: FA220(Haba血清型6d); 8505(Ha
be血清型3〕;6511 (Efabs血清型4);
工T −2(Habs 血?[11) ;R576(H
abe血清型2ab) ; PA 53 (Habs血
清型1);W 1 B (Habs血清型1o):工τ
2 (Ha’ba血清型11);工T 2 (Habs
血清型11):工T 6 (Ejabs血清凰8血清上
8後9つの種々のpsを個々に例1にょる緑膿菌のエキ
ソトキシンAのたん白部分と共有結合し、最後に9つの
接合体を混合して9価のワクチンとなす。
膿菌−株のエントドキシ/がら単離する: FA220(Haba血清型6d); 8505(Ha
be血清型3〕;6511 (Efabs血清型4);
工T −2(Habs 血?[11) ;R576(H
abe血清型2ab) ; PA 53 (Habs血
清型1);W 1 B (Habs血清型1o):工τ
2 (Ha’ba血清型11);工T 2 (Habs
血清型11):工T 6 (Ejabs血清凰8血清上
8後9つの種々のpsを個々に例1にょる緑膿菌のエキ
ソトキシンAのたん白部分と共有結合し、最後に9つの
接合体を混合して9価のワクチンとなす。
得られた9−価のワクチンは次の性質を有する:
(1) これは動物に対して非毒性であ)、家ウサギ
に対して発熱性ではない。
に対して発熱性ではない。
(2) その分子量は350000よル大きい。
(3) ワクチンは緑膿菌−感染の広いスペクトルに
対して防御する。
対して防御する。
7.9−価緑膿菌一破傷風トキソイドーワクチン製造は
例6と同様に行われる。9つの種々Opsを個々にヒト
の破傷風トキソイドト例2に従って共有−合し、その後
混合して多価ワクチンとなす。
例6と同様に行われる。9つの種々Opsを個々にヒト
の破傷風トキソイドト例2に従って共有−合し、その後
混合して多価ワクチンとなす。
得られたワクチンは緑膿菌に対する血清型特異性抗体の
形成並びに破傷風トキシンに対する抗毒性抗体の形成を
導く。
形成並びに破傷風トキシンに対する抗毒性抗体の形成を
導く。
a9− 〇緑1−ジフテリアトキソイド−ワクチン
9つの例6で特異化されたpsを個々に例3によるジフ
テリアトキソイドと共有結合し、その後混合して多価ワ
クチンとなす。
テリアトキソイドと共有結合し、その後混合して多価ワ
クチンとなす。
得られたワクチンは緑膿菌に対する血清型特異性抗体の
形成並びにジフテリアトキシンに対する抗毒性抗体の形
成を導く。
形成並びにジフテリアトキシンに対する抗毒性抗体の形
成を導く。
例9−13
14、の単−接合体夫々50−100μt−その多糖類
部分は大腸菌の血清型1,2,4,6゜7.8,11,
16,18,22,25,62,75のエンドトキシン
から由来し、そのたん白部分は緑m菌(P、a、)のエ
キソトキシンから由来する−を混合する。
部分は大腸菌の血清型1,2,4,6゜7.8,11,
16,18,22,25,62,75のエンドトキシン
から由来し、そのたん白部分は緑m菌(P、a、)のエ
キソトキシンから由来する−を混合する。
得られたワクチンは大腸菌に対する血清型特異性抗体の
形成並びにPa1−)キシンに対する抗毒性抗体の形成
を導く。
形成並びにPa1−)キシンに対する抗毒性抗体の形成
を導く。
10.14−価大腸菌一破傷風トキソイドーワクチン大
腸菌及びヒトの破傷風トキソイドの例9に挙けたPSか
らなる14の単一接合体を例1−3と同様に製造し、例
6/7と同様に混合する。得られたワクチンは大腸菌に
対する特異性抗体の形成及び破傷風トキシンに対する抗
lI性抗体の形成を導ぐ。
腸菌及びヒトの破傷風トキソイドの例9に挙けたPSか
らなる14の単一接合体を例1−3と同様に製造し、例
6/7と同様に混合する。得られたワクチンは大腸菌に
対する特異性抗体の形成及び破傷風トキシンに対する抗
lI性抗体の形成を導ぐ。
11.14−価大腸菌一ジフチリアトキソイドー接合ワ
クチン 大腸菌及びジフテリアトキソイドの例9に挙げたPBか
ら成る14の単一接合体を例1−3と同様に製造し、例
いと同様に混合する。
クチン 大腸菌及びジフテリアトキソイドの例9に挙げたPBか
ら成る14の単一接合体を例1−3と同様に製造し、例
いと同様に混合する。
得られたワクチンは大腸類に対する特異性抗体の形成及
びジフテリアトキシンに対する抗毒性抗体の形成を導く
。
びジフテリアトキシンに対する抗毒性抗体の形成を導く
。
12.10=価大腸 −接合ワクチン
10の単−接合体夫々50−100μf/薬用量−その
多li類部分は〇−血清型1゜2.4,6,7,8,1
8,22,25,75のエンドトキシンから由来し、そ
のたん白部分は緑膿菌のエキソトキシンAから又は人間
−破傷風トキソイドから由来する−を混合する。
多li類部分は〇−血清型1゜2.4,6,7,8,1
8,22,25,75のエンドトキシンから由来し、そ
のたん白部分は緑膿菌のエキソトキシンAから又は人間
−破傷風トキソイドから由来する−を混合する。
1五3−価大腸菌一接合ワクチン
3つの単−接合体夫々5o−1oa11t/薬用量−そ
の多糖類部分は〇−血清W(aJl、(# 2 及び(
c) 4のエキソトキシンのエンドトキシンから及びそ
のたん白部分は(a)緑膿菌のエキソトキシンAから、
(b)ヒトの破傷風トキソイドから又は(C)ジフテリ
アトキソイドから由来する−を混合する。
の多糖類部分は〇−血清W(aJl、(# 2 及び(
c) 4のエキソトキシンのエンドトキシンから及びそ
のたん白部分は(a)緑膿菌のエキソトキシンAから、
(b)ヒトの破傷風トキソイドから又は(C)ジフテリ
アトキソイドから由来する−を混合する。
例14
チン
このワクチンは9の単一接合体(50−100μt)−
七の多糖類部分は緑膿菌エンドトキシンから由来するー
、並びVCl2の単−接合体−その多糖類部分は大腸菌
のエンドトキシンから由来する−の混合rcよって得ら
れる。単一接合体のたん白部分は緑膿菌のエンドトキシ
ンムから又はヒトー破傷風トキソイドから由来する。得
られたワクチンは緑膿菌に対する並びに大腸菌に対する
血清型特異性抗体を導くことができる。更にこのワクチ
ンはエキソトキシンAに並びに破傷風トキシンに適合す
る抗毒性抗体をも導く。
七の多糖類部分は緑膿菌エンドトキシンから由来するー
、並びVCl2の単−接合体−その多糖類部分は大腸菌
のエンドトキシンから由来する−の混合rcよって得ら
れる。単一接合体のたん白部分は緑膿菌のエンドトキシ
ンムから又はヒトー破傷風トキソイドから由来する。得
られたワクチンは緑膿菌に対する並びに大腸菌に対する
血清型特異性抗体を導くことができる。更にこのワクチ
ンはエキソトキシンAに並びに破傷風トキシンに適合す
る抗毒性抗体をも導く。
例15
特異性免疫グロブリンの製造に多価接合ワクチンを使用
志願者に例14による多価ワクチンを三角筋に予防接種
する。4週間後、三角筋に同一ワクチン及び同一処方で
ブースター接種を行う。−週間後、志願者に対して腕静
脈から血液試料を城ル、ワクチン中に含有される血清型
(緑膿菌及び大腸菌)に対する並びにエキソ)−Pシン
A及び破傷風トキシンに対する抗体を測定する。
する。4週間後、三角筋に同一ワクチン及び同一処方で
ブースター接種を行う。−週間後、志願者に対して腕静
脈から血液試料を城ル、ワクチン中に含有される血清型
(緑膿菌及び大腸菌)に対する並びにエキソ)−Pシン
A及び破傷風トキシンに対する抗体を測定する。
ナベて述べた抗原に対する力価増加が接種の結果として
4倍又はそれ以上である場合、接種を受けた人から約2
40dの血液が提供される。
4倍又はそれ以上である場合、接種を受けた人から約2
40dの血液が提供される。
血清を集め、次の公知の工程を経て、たとえばヨーロッ
パ特許第85747号明細書の方法に従って静脈内投与
用r−グロブリンー′FJ4製物を製造する:コーン法
による分画されたアルコール−沈殿、イオン交換−クロ
マトグラフィー限外濾過及び透析濾過。たん白金有量を
5優に調整し、安定化する媒体中で凍結乾燥する。
パ特許第85747号明細書の方法に従って静脈内投与
用r−グロブリンー′FJ4製物を製造する:コーン法
による分画されたアルコール−沈殿、イオン交換−クロ
マトグラフィー限外濾過及び透析濾過。たん白金有量を
5優に調整し、安定化する媒体中で凍結乾燥する。
Claims (10)
- (1)相互に共有結合するたん白と種特異性多糖類から
成るグラム陰性菌による感染に対する非毒性接合ワクチ
ンに於て、多糖類は菌のエンドトキシンから由来し、た
ん白はエキソプロテインであることを特徴とする前記ワ
クチン。 - (2)グラム陰性菌は緑膿菌である特許請求の範囲第1
項記載のワクチン。 - (3)グラム陰性菌は大腸菌である特許請求の範囲第1
項記載のワクチン。 - (4)エキソプロテインはエキソトキシン又はエキソト
キソイドである特許請求の範囲第1項記載のワクチン。 - (5)エキソトキシンは緑膿菌からのトキシンAである
特許請求の範囲第1項記載のワクチン。 - (6)エキソトキソイドは破傷風トキソイド又はジフテ
リアトキソイドである特許請求の範囲第1項記載のワク
チン。 - (7)3−15の接合体の混合物から成り、その多糖類
は同一菌種の3−15の種々の血清蓋から得られる特許
請求の範囲第1項記載のワクチン。 - (8)ワクチンの混合物から成り、その個々の成分は夫
々特定の菌種に対する抗体を産出する特許請求の範囲第
1項記載の多価ワクチン。 - (9)多糖類は菌のエンドトキシンから由来し、たん白
はエキソプロテインである、相互に共有結合するたん白
と種特異性多糖類から成るグラム陰性菌による感染に対
する非毒性接合ワクチンに於て、対応する多糖類はエキ
ソプロテインと共有結合することを特徴とする前記ワク
チンの製造方法。 - (10)多糖類は菌のエンドトキシンから由来し、たん
白はエキソプロテインである、相互に共有結合するたん
白と種特異性多糖類から成るグラム陰性菌による感染に
対する非毒性接合ワクチンをそれ自体静脈内又は筋肉内
投与可能な免疫グロブリンの製造に使用する高度免疫血
清の製造に使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH4199/85-0 | 1985-09-27 | ||
CH419985 | 1985-09-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6289632A true JPS6289632A (ja) | 1987-04-24 |
JPH0662434B2 JPH0662434B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=4271640
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61180233A Expired - Fee Related JPH0662434B2 (ja) | 1985-09-27 | 1986-08-01 | グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4771127A (ja) |
EP (1) | EP0220387B1 (ja) |
JP (1) | JPH0662434B2 (ja) |
AT (1) | ATE56615T1 (ja) |
AU (1) | AU587865B2 (ja) |
CA (1) | CA1276552C (ja) |
DE (1) | DE3674328D1 (ja) |
DK (1) | DK163176C (ja) |
ES (1) | ES2000140A6 (ja) |
PT (1) | PT83096B (ja) |
ZA (1) | ZA866564B (ja) |
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