JPS6289632A - グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の対象はダラム陰性菌による感染に対する、特に
緑膿菌及び大腸菌による感染に対すに使用する高度免疫
血清の製造に使用する方法である。

緑膿菌又は大腸菌による感染は特に免疫抑制剤で処置さ
れた入院患者、火傷の犠牲者及び癌ムｎｎａｌ［１工ｎ
ｔｅｒｎａｌ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　　８２　　：　　
８１９−８５１（１９７５）、）この様な感染の発生率
は抗生物質の広汎な使用と平行して過去３０年で著しく
増加している。

緑膿菌及び大腸菌はしばしば尿路感染、耳炎、々、エキ
ソトキシンＡトキソイドを用いる能動免疫によってマウ
スに於いて実験上の緑膿菌感染に対する防御、工ｎｆｅ
ｃｔｉｏｎ工ｍｍｕｎｉｔｙ　３２　：６８１−６８９
　（１９８１）　）　Ｋ対する抗体は動物実験で有効な
感染防御剤であることが明白である。

トキシンムは緑膿菌（Ｐｌ、）の最も毒性の物質代謝生
成物である。これは真核生物性たん白金酸を阻害する。

特異的なトキシンムー欠損を有するＰ、ａ、の突然変異
株はその母株に比してよシトキシンム及びエラスターゼ
突然変異株を用いてマウスに於げる月膜感果、Ｊ、↓ｎ
ｆｅｏｔｉｏｕ８デイズージス Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１４２：　５４７−５５５　（１９
８０））。受身的投与又は能動的接糧によって産出され
るアンチトキシンＡ−抗体は実験上生じたＰ、ａ、感染
に対し工ｍｍｕｎｉｔｙ　１８　：　５９６−６０２　
（１９７７）参照）。その他の試験はアンチトキシン−
抗体の含有量とＰ、ａ、−菌血症にかかった患者の生き
延びる度合とｏ直接ｔｖ関係を示す（Ｍ、　Ｓ、　Ｐｏ
１ｌａｃｋ等、人間に於てＰ、ａ、敗血症の徴候でエキ
ソトキシンＡ火傷によって外傷を起こさせたマウスに於
て類−分子の存在に依存する（　Ｓ、Ｊ、　Ｃｒｙｚ等
・工ｎｆｅｅｔｉｏｎ工ｍｍｕｎｉｔｙ　４４　：　５
０８−５１５　（１９８４）　）。

実験上のｐ、　ａ、−感染に対する血清型−特異性工ｍ
ｍｕｎｉｔｙ　４３　：　７９５−７９９（１９８４）
参照）。

高められた抗−リボ多糖類−抗体−力価はを明らかに増
加する（　Ａ、Ｓ、　Ｃｒｏｓｓ等、Ｊ。

工ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１４２　：
　５３８−５４６　（１９８０）　）、ｐ、ａ、−リボ
多糖類−ベースを基体とするワクチ１３０　（８ｕｐｐ
１．　）：第１５２−１５８頁（１９７４）　）、Ｐ、
ａ、Ｊポ多糖類（ＬＰＳ　）が防御性血清型−特異性抗
原−デテルミナントを含有するのにかかわらず、実際の
使用にあたう、ヒトに対してそのあまシにも高い毒性の
ゆえに非経口ワクチンとして使用することができない（
Ｊ、Ｌ（８ｕｐｐｌ−）　：第１５９−１６２頁（１９
７４）　：　Ｍ、Ｄ。

Ｈａｇｈｂｉｎ等、Ｃ！ａｎｃｅｒ　３２　：　７６１
−７６２　（１９７３）、ｐ、　ａ、の血清型−特異性
抗原−デテルミナントをＬＰＥ！分子の〇−多糖類（ｐ
ｓ　）一部分に適応させる。多糖類（ｐｓ）をリボ多糖
類（ＬＰＳ）の毒性リピツドーＡ半分から分離し、単離
する。ｐｓが抗原−デテルミナントを含有するにもかか
わらず、ＰＳはワクチンとして使用することができなる
（　Ｇ、　Ｂ、　Ｐｉｅｒ等、工ｎｆｅｃｔｉｏｎ工ｍ
ｍｕｎｉｔｙ　２２　：第１９−９２５　（１９７Ｂ）
　）、 今日までＰ、ａ、−感染及び同様なダラム陰性菌、たと
えば大腸菌（Ｌｃ、）による感染の予防に有効なワクチ
ンは存在しない。

Ｐ、ａ、又はＭ　、　ｃ、による感染の相対的発生率及
びその危険性に直面してこれは著しい欠陥である。

この様な感染に対する能動免疫に有効なワクチンを調製
する必然性を別として、特異性高度免疫血清−これはダ
ラム陰性菌、特にｐ、ａ、及びＥ、Ｑ、に対して高い抗
体−力価を含有するーから成る、免疫グロブリンへの切
迫した要求がある。

この様な血清又は免疫グロブリン単独で菌血症又は敗血
症の場合に救うことができる。

抗生物質は耐細菌性のゆえにしばしば役に立たない。本
発明の目的は伝染病の医学的処置に於けるこの重要な欠
陥金補うことである。これは明らかに接合ワクチンでの
み可能である。

特にリボ多糖類とヒトの血清アルブミンとの共有結合に
よって得られる接合ワクチンはたとえば米国特許第４１
８５．０９０号明細書から公知である。

種特異性多糖類と種特異性たん白との共有結合に関する
方法は十分に公知でちゃ、普及している。

ヨーロッパ特許公開筒１１８，８５１号明細書にダラム
陰性菌に対する免疫組成物が記載されている。これは同
一の菌種の解毒されたエンドプロティンと解毒された多
ａＩ類との共有カップリングによって得られる。

以前公知の接合ワクチンの有効性は記載されているが、
臨床的に試験されていない。

今や本発明者はＰ、ａ、から単離されたＬＰＳを円に変
え、ｐ、　ａ、）キシンムから、破傷風トキソイドから
又はジフテリアトキソイドから成るエキソプロティンと
共有カップリングした場合、非毒性及び同時に高度に有
効な接合ワクチンが得られることを見い出した。得られ
たＰＳ　−トキシンＡ、ＰＳ−破傷風トキソイド及びｐ
ｓ−ジフテリアトキソイド接合ワクチンは非毒性及び免
疫原である。これは実験上のｐｌａ、−感染に対して有
効な防御を生じる。

更に本発明者はＰＳとエキソプロティンとの共有カップ
リングの新しい原則は一般化され、それと共にその他の
ダラム陰性菌による感染、特に大腸菌（Ｅ、　Ｑ、　）
−感染に対するワクチンの製造にも利用されることを見
い出した。

したがって本発明の対象は相互に共有結合するたん白と
種特異性多糖類から成るダラム陰性菌による感染に対す
る非毒性接合ワクチンに於て、多糖類は菌のエンドトキ
シンから由来し、たん白はエキソプロティンであること
を特徴とする前記ワクチンである。

本発明によるワクチンは特に緑膿菌又は大腸菌による感
染に対するワクチンである。

エキソプロティンは特にエンドキシン又はエキントキン
イドでちゃ、好ましくは緑膿菌からのトキシンＡ又はし
かも破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイドである
。

ダラム陰性菌による感染に対する新規接合ワクチンの製
造法は細菌のエンドトキシンから成る対応する多糖類と
エキソプロティンとを共有結合することを特徴とする。

しかし本発明の対象は３−１５の接合体の混合物から成
る接合ワクチンでもあ夛、その多糖類は同一菌種の３−
１５の種々の血清型から得られる。

もう一つの本発明の対象は接合ワクチンの混合物から成
る多価ワクチンであシ、その個々の成分は夫々特定の菌
種に対する抗体を産出する。

またもう一つの本発明の対象は高度免疫血清可能な免疫
グロブリンの製造に使用する。

緑膿菌−ワクチンの例でワクチン収得を述べる。

エンドトキシン（Ｐａ）の収得： ｐ、ａｅに対する本発明によるワクチンの製造ＫＰ。

ａ、の極めて特定の血清屋をエンドトキシンの収得に関
する源として使用する。その細菌からリボ多糖類（ＬＰ
Ｓ）がたとえばフェノール−水抽出Ｎａｔｕｒｆｏｒａ
ｃｈｕｎｇ　：　１４８−１５５　（１９５２）に従っ
て〕得られる。得られたＬＰＳは１重量％よシ少ないた
ん白及び核酸を含有する。〇−多糖類（ＰＥＩ）をマイ
クロバイオ−ジー ＭｉｃｒｏＭｏｘｏｇｙ　７８：　３０５−３１８　（
１９７＋）　。不溶性毒性リピツドム一部分を遠心分離
によって分離する。上液みをクロロホルム／メタノール
−溶液で抽出し、リピッドＡの残部を除去する。

ＰＳ　ｉ含有する水性層を減圧で濃縮し、次いでクロマ
トグラフィー精製する。この場合分子量１００００〜７
５０００の多糖類を集め、凍結乾燥する。

ｐｓの酸化： 得られた多糖類を水中で過ヨウ素威ナトリウムの添加に
よって室温で酸化する。この場合カップリング性アルデ
ヒド基を生じる。エチレングリコールの添加後、物質を
透析によって精製し、その後凍結乾燥する。

エキソプロティン（トキシンＡ）の収得：９５％よシ多
い含有量を有するトキシンＡが特に多くのトキシンムを
生じる緑膿菌株からＳ、Ｊ。

クリソ ０ｒ７ｆｆ等、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ工ｍｍｕｎｉｔｙ　
４３：　７９５−７９９（１９８４）の方法に従って得
られる。

トキシンムーカップリング物質の合成：希釈されたトキ
シンムに脂肪族ジカルボン酸ジヒドラジド及びカルボジ
イミド、たとえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロビル）−カルボジイミドを加える。この操作によ
ってトキシンムの遊離カルボキシル基とジカルボン酸　
ジヒドラジドとを結合する。得られ九生成物はほぼ次式
によって表わされる： （トキシンＡ）−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃｏ（ＣＨ２）、
、、、−００−ＮＨ−ＨＥ２緑膿菌−多糖類−トキシン
Ａ−接合体の合成：得られたトキシンＡ−カップリング
物質を酸化された、アルデヒド基を有するｐｓと結合す
る。

ソノ際トキシンへ−カツブリング物質と酸化されたｐｓ
の当量を混合し、得られたシップ塩基（ヒドラゾンｌ硼
化水素アルカリ、たとえばＮ！ＬＢＨ４又はＮａＢＨｓ
　ＯＮで還元する。

その際安定な接合体が生じる。その解明されていない構
造を殊に図式的に次の様に示すことができる： （トキシンＡ　）　−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−００−（ＯＨ
２）、＝−００−ＮＨ−ＮＨ−（多糖類） 接合体を透析して精製し、不溶性物質を遠心分離して分
離し、得られた混合物をアガロースでクロマトグラフィ
ーによって分離する。３５００００より多い分子量を有
する物質−これはＰＳ及びトキシンムとの分子量を明ら
かに超え、Ｐｆｌ−）キシンＡ−接合体である−を分離
し、凍結乾燥する。

多糖類−破傷風トキンイドー接合体の合成破傷風トキソ
イド ヒトに使用することに特定された破傷風トキソイド−た
とえばスイスの血清−及びワクチン研突所のＴＥアナト
キシン（６）−を９０％までが破傷風トキソイドから成
る様にセルロースでイオン交換−クロマトグラフィーに
より及びアガルロースでゲル濾過して精製する。

これはこの場合たとえばＪｅｒｋｅｒ　Ｐｏｒａｔｈ、
酵素学法、第３４巻、第２１頁以下参照の一般法に従っ
て行われる。ＬＰＳから加水分解によって得られる多糖
類（ＰＳ）をこのカップリングに関して酸化するのでは
なく、水性溶液の形で公知方法でアルカリ媒体中で室温
でシアン化臭素と反応させる。その際シアン化臭素（Ｂ
ｒ０Ｎ　）は下記の図式的に（ＰＳ）−０Ｈで表わされ
る多糖類の遊離−ＯＨ基と反応する。得られた活性化さ
れた多糖類はアルキレンジカルボン酸ジヒドラジド（た
とえばＨ２皿１１ｉＣＯ（（Ｈ２）　ｌ−６−０ＯＮＨ
−ＮＨ２）と、たとえばアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤ
Ｈ）と反応する。

その際ジヒドラジドは多糖類と共有結合する。

結合にあた）生じる反応は特に次の様に表わすことがで
きる： （ＰＳ）−ＯＨ十ＢｒＣＮ→ （ＰＳ）−０−０ｍＮ＋Ｈ２Ｎ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）
、−、−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ２−’ｐ（ＰＳ）−〇−Ｃ（
ＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ！Ｏ（Ｃ！Ｈ２）、−６−Ｃｏ
−ＮＨ−ＮＨ２＋　Ｈ２Ｏ−＋（ＰＳ）−０−ＣＨ０−
Ｎｆｉ−ＮＨ−００−（ＣＨ２）、、−ＧＯ−ＮＨ−Ｎ
Ｈ２その際得られるｐｓ−ジヒドラジド−接合体を強力
な透析によって精製する。希鉱酸の添加によって溶液を
弱く酸性化し、破傷風トキソイドとカルボジイミドとの
当量を加え、２〜３時間室温で撹拌する。カルボジイミ
ドの存在下トキソイド（ＨＯＣ！Ｏ−（）キソイド）と
して図式的に表わされる）との反応によって、−但しト
キソイドの遊離カルボキシル基金Ｐ８−ジヒドラジド−
接合体の遊離ヒドラジド−基で縮合する一１所望のｐｓ
−ジヒドラジド−トキソイド−接合体を産出する。その
鮮明されていない構造を図式％式％： 得られた混合物をリン酸塩緩衝液で透析し、アガロース
−カラムを介してクロマトグー７フイー分離する。出発
成分の分子量を明らかに超えている３５００００以上の
分子量を有する物質を分離し、凍結乾燥する。

前記合成に於て破傷風トキソイドをジフテリアトキソイ
ドに代えることもできる。

上述と同様な方法でその他のダラム陰性菌、たとえば大
腸菌による感染に対するワクチンも産出することができ
る。

本発明による接合ワクチンの安全性及び有効性の証明 本発明による緑膿菌（ＰＳ−）キシンム）−１（Ｐｇ−
破傷風トキソイド）−及び（ＰＳ−ジフテリアトキソイ
ド）−接合体の性質： 表１のデータから接合体は３５００００！ｊ）多い分子
量を有し、それと同時に出発物質の分子量ははるかに超
えていることが明らかである。

トキシンＡの共有結合によってこの高毒性物質を解毒す
る。その際致死量は０．２μｔ／マクスの少なくとも１
０００倍はど２００μｔ／マウス以上に増加する。発熱
原性はその接合体に於て自然の緑膿菌ＰＡ　２２０　Ｌ
ＰＳ　（０，７ａｔ／ｒｄ／ｋｇ体重）Ｋよる接合体と
比較して実質上消滅している。

接合体は多糖類に対して及びたん白−担体く対しても、
すなわちトキシンムに対して、破傷風−トキシンに対し
て又はジフテリア−トキシンに対して特異性抗体一応答
を誘発する。トキシンムと多糖類との共有結合によって
トキシン゛Ａｔ−完全に解毒化し、その際その免疫原性
活性を失うことはない。

精製されたトキシンＡで致命的な毒害を受けたマウスに
対する（　ＰＳ−トキシンム）−接合体：（Ｐａ−トキ
シンム）−接合ワクチンの防御能力をたとえば次の様に
証明する： マウスのグループに実験の開始時及び実験の１４日目に
（Ｐａ　−）キシンＡ）−接合体の対応する量の形で１
０μｔたん白を又は緩衝剤（コントロールグループ）を
筋内内投与する。実験の２８日目に段階的に増加するト
キシンムの薬用量を投与する。コントロール動物に対す
る平均致死量は０．２μｔである。一方（Ｐａ−）キシ
ンＡ）−接合体で前処理にされた動物の平均致死量は４
．７μｆ／マウスである。

ワクチンとして（Ｐａ−破傷風トキソイド）−及び（Ｐ
Ｓ−）キシンム）−接合体の有効性。

実験上引き起こされた緑膿菌−火傷側御敗血症の実験動
物に対する天然のリポ多糖類（緑膿菌からのＬＰ８　）
、（ＰＳ−破傷風トキソイド）−接合体及び（ＰＳ−ト
キシンム）−接合体の防御能力を表２に示す。

表　　２ 緑膿菌ＰＡ２２０で致命的に誘発された火傷側−敗血症
に対してＰＡ２２０のＬＰＳ　、　（Ｐａ−破傷風トキ
ソイド）−接合体及び（ｐｓ−トキシンム）−接合体で
免疫化による防御。

免疫＠（１１ＩＪＩ）　（２） 無しくコントロール）　　　　　　　　２０ＬＰ日　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０６Ｐト破傷風トキソイド−接合体　　　　
１０６Ｐ８−）キシンムー接合体　　　　　　１０６（
１）マウスに実験前及び実験の１４日目に１μ２筋肉内
注射する。次いでこれに火傷創傷させ（方法：工、Ａ。

インフエクシｌン　　イミエニテイ ホルダー等々、工ｎｆｅｃｔｉｏｎ工ｍｍｕｎｉｔｙ　
３５．２７６−２８０　（１９８２）、２８日目に緑膿
菌ＰＡ２２０の増加薬用量を与える。

４９３−４９７　（１９３Ｂ）の方法に従って算出され
る。

このデータからＬＰＳ、（ｐｓ−破傷風トキソイド）−
接合体及び（Ｐａ　−）キシンＡ）−接合体での免疫化
は致命的なｐ、ａ０敗血症に対してほぼ同一の著しい防
御作用を生じることが認められる。これによって緑膿菌
ＰＡ２２０に対する致死量は免疫されていないコントロ
ールグループに比して約５０．０００倍増加する。

（Ｐａ−破傷風トキソイド）−接合ワクチンの安全性及
び免疫原性。

男女の健康な１６〜５９才の成人志頭者に実験の開始及
び１４日後に上腕に０．５ｄ皮下注射で接合ワクチン１
００μｆを投与する。

試験者のすべての反応を記録する。副反応はまれで、弱
くかつ一過性である。

静脈血液試料を実験の開始及び接種後１４及び２８日目
に採取する。血液試料から得られた血清を集め、−２０
℃で保存する。免疫グロブリンＧ（工ｔＧ）−抗体力価
を測定する。

（ｐｓ−破傷風トキソイド）−接合体での免疫化は出発
力価に比較して接種から１４及び２８日後平均抗−ＰＡ
２２０　ＬＰＳ　ＩｆＧ−力価の重要な増加を導く（表
３参照）。

試、検者の８０チ以上がその４倍又はそれ以上はどく高
められた抗体力価で反応する。この接合ワクチンでの免
疫化は破傷風トキシンを中和する抗−破傷風−抗体一力
価も導く。

血清−集団が実験開始（前−免疫−集団）及び２８日後
（免疫−集団）で夫々の試験者の等量の血清組合せくよ
って得られる。

前−免疫−集団はｄあたシ２．７破傷風トキシン中和国
際単位を有し、一方免疫集団は６．２単位／ゴを有する
。

ヒトに本発明による（ｐｓ−破傷風トキソイド）−接合
体を接種することによって産出される抗−ＰＡ２２０−
　ＬＰＳ−工ｔａ−抗体社やっかいな実験上緑膿菌によ
って引き起こされた敗血症に対して高い有効性を示す。

受身伝達された後−免疫一工ｙａは死亡の予防に関して
受身伝達された前−免疫−工ｙＧに比して明らかに有効
である。測定された防御値は工ｙａ−調製物の抗−ＰＡ
　２２０−ＬＰＥＩ−ｌ７Ｇ−力価で修正する（表４参
照〕。

したがって（ｐｓ−破傷風トキソイド）−接合体はヒト
に危険なく使用でき、接種された人の８０チ以上で明ら
かに高められた抗−ＰＡ２２０−Ｔ、＋ＰＳ−工ｙＧ−
力価を生じるワクチンである。この方法でヒトに生じた
抗−Ｐム２２０−’ＬＰ８−免疫グロブリンはやっかい
な緑膿菌−敗血症に対して高い有効性を示す。

同様な結果が本発明による Ｐ、ａ、＋Ｐ８）　−トキシンム−２ Ｐ、ａ、（ＰＥｉ）−ジフテリアトキソイド−２Ｂ、ｃ
、（ＰＢ）−トキシンＡ−。

Ｍ、ｃ、（ＰＢ）−破傷風トキソイド−及び。

Ｅ、ｃ−（ＰＳ）−ジフテリアトキソイド−接合ワクチ
ンを生じる。

表　　４ やっかいな緑膿菌ＰＡ２２０−火傷創−敗血症に対する
受身伝達された工ｙＧ−ｒｆ）ス　の防御可能性。

無し”　　　　　　　　　　　　　　１．３Ｘ１０’前
−免疫（３）７３１．３×１０５ 後−免疫（’ｌ　　　　１０６５　　　　　　６．７Ｘ
１０５劫 （１）夫々の！ウスは緑膿菌ＰＡ　２２０で負荷２４時
間前に０．２ｄ中に約１．６μｔヒトエｆＧを静注する
。

（２）コントロールは０．２４無菌塩溶液を有する。

（５１免疫の前にナベての志願した試験者の血清の一定
部分から製造。

（４）免疫２８日後すべての志願者の血清の一定部分か
ら製造。

（Ｐａ−破傷風トキソイド）−１（ｐｓ−ジフテリアト
キソイド）−及び（ＰＳ−）キシンム）−接合ワクチン この接合体は多数のテストで非毒性、非発熱性及び高度
に有効なワクチンであることが明らかである。この様な
ワクチンは従来公知でない。

実際の使用に関し緑膿菌の種々の血清型による感染に対
して広く区分された作用を発揮するワクチンを提供する
ことが望まれている。

本発明者は（ｐｓ−破傷風トキソイド）−１（１’Ｓ−
ジフテリアトキソイド）−又は（ｐｓ−トキシンＡ）−
接合体から成る組成物を使用した場合、この広く区分さ
れ次作用を達成することができることを見い出した。そ
のＰＳ　（多糖類）一部分は感染で主に生じる緑膿菌（
Ｐ、ａ、）の多くの血清型から由来する。更に緑膿菌の
約３−１５の異なる血清型は不可欠である。

ＰＳ−たん白−接合体に対する種々の血清型の多糖類（
Ｐａ）の結合は使用可能な調製物を得るために個々に行
わねばならない。これはＰ、ａ、の３−１５の純粋な株
から夫々個々のＬＰ８　ｔ−単離し、これからｐｓ及び
個々のＰＥ？を別々にたん白部分（トキシンＡ１破傷風
トキソイド又はジフテリアトキソイド）と共有結合し、
得られた接合体はその相容性及び有効性をテストし、最
後に３−１５の単一接合体を一緒に混合して完成された
組合せ調製物となすことを意味する。

同一の処理はその他のダラム陰性菌による感染に対する
組合せワクチンの製造にも適用される。種々のダラム陰
性菌種による感染に対して有効なワクチン。

たった１回の接種によって種々のダラム陰性菌種に対す
る抗体を産出することが極めて望まれている。抗体を収
得し、ダラム陰性菌による感染に対して特異的に有効な
免疫グロブリンへ加工しなければならない場合にこれは
特に重要である。

本発明者はある菌種に対する特異性接合ワクチンをその
他の菌種に対する特異性接合ワクチン１又は数種と混合
した場合、この目的を達成することができることを見い
出した。

特異性免疫グロブリンの製造に本発明による接合ワクチ
ンを使用する。

更にその上本発明による接合ワクチンはヒトに於て当該
菌種に対して特異性抗体の形成を生じせしめることが認
められた。この方法で産出される抗体力価は任意の予防
接種を受けたヒトの血清中でこの血清を出発物質として
特異性免疫グロブリンの製造に使用できる程高い。した
がって医師は対応する画面症にかかった、予防接種され
ていない患者を効果的に処置し、助けることができる剤
を所持している。

例 例１ 緑膿菌ワクチン：ＰＳ−）キシンＡ　−接合体１ｅｓグ
リセリンを含有する３　％　Ｔｙｐｔｉｃａｓｅ−アン
ド・カンパニー、アメリカ）　５００１ｎｌに緑膿菌（
工Ｔ−５＝Ｈａｂｓ　１０　）の凍結乾燥された培養液
を植菌し、３７℃及び１５０　ＲＰＭで培養する。この
前培養液を１％グリセリンを含有する３％ＴＳＢ培地５
ｏｚｔに植菌し、発酵基中で１６時間３７℃で培養する
。細胞を濾過遠心分離（友とえばウェスト７アリアのも
の）して収得し、２回トリス−ＮａＯｌ−緩衝液ｐＨ９
で洗滌する。次いで細胞をトリス−Ｎａ（！を一緩ラス
ピーズ（ダイノーミル、Ｗ、Ａ、　ＢａＣｈｈＯｆｅｒ
社、バーゼル、スイス）１！−用いて砕く。細胞壁を遠
心分離によって廃棄する細胞質から分離する。細胞壁を
支度トリスーＮａＯｌ−緩衝液中に浸潤させ、冷遠心分
離機で２５５００．９で３０分間沈降させる。次いで細
胞壁を水１２８０ｊＩ７を加える。方法：　Ｏ，Ｗｅｓ
ｔｐｈａｌ。

Ｚ、　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓａｈ、　７　：　１４８−１
５５ｄ混合物ｔ−６８〜７０℃に加温し、５分間この温
度で撹拌する。その後抽出混合物を水浴中で４−１０℃
に冷却し、次いで相分離のために１５分間２３５００、
！ｉ’で冷遠心分離機で遠心分離する。

上相は水相に相当し、リボ多糖類（ＬＰＳ）を含有する
。これを支度蒸留水１ｔを加えたフェノール相から注ｉ
深く分離し、全体を再び６Ｂ−７０℃で５分間撹拌する
。再び水浴中で４−１０℃に冷却し、相を上述の様に分
離する。

水性相を一緒にし、水でフェノールがなくなるまで透析
する。フェノール相を捨てる。次いで水相を超遠心分離
機でＬＰＢの沈降のために、１０００００Ｉｉで３時間
遠心分離する。

沈降物を０．０５　Ｍ　トリス−緩衝液（ｐＨ７，２，
０，０５Ｍ　ＮａＣｌ　ｆ含有）中に溶解し、ＲＮＡ、
ｅ、ＤＮＡ８．及びプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ　）　
（ペーリンガー、マンハイム、西ドイツ）で次の様に処
理する。ＲＮＡ８．　ｉ最終濃度２０μｔ／ｍｌ　Ｉｃ
まで加え、３時間３７℃で培養する。次いでＤＮＡ、θ
を最終濃度２０μｔ／ａｔまで及びＭｔＢＯ４を最終濃
度０．１Ｍまで加え、同様に３時間３７℃で培養する。

次いでプロナーゼを濃度２００μｆ／ｄまで加え、２−
３時間３７℃で培養し、次いで４℃で一晩水で透析する
。ＬＰＢ　ｉ　２回遠心分離して更に精製し、次いで凍
結乾燥する。

ｎＩ製されたＩ、ＰＳは不純物としてヌクレイン酸及び
たん白を１％よ〕少なく含有する。

Ｎ製されたＬＰＢをｌｆｉ酢酸゛３岬／ｄの鯛物１０：
　５０１−５１０　（１９６９）、この処理で多糖類部
分を毒性リピツド部分（リピツドＡ）から分離する。リ
ピッドＡは不溶性であ夛、遠心分離によって可溶性多糖
類を除去する。水性多糖類溶液を少量のリピツドＡＯ除
去のために３回同一容量のクロロホルム−メタノール（
３：１）で抽出し、水流ポンプ減圧で蒸発する。濃縮さ
れたＰＳ−溶液をアガロース−ゲル、たとえばＡＯＡ３
４−ゲル（Ｉ、ＫＢ−グロダクターＡＢ　、プロマ、ス
ウェーデン）でクロマトグラフィー分離する（カラム５
　ｃＩＪＬ　Ｘ　４０　Ｃ２１１ｓ展開速度１．７ｍｌ
／分、分画の大きさ１７ｄ）、多糖類を個々の分画で測
定する。分子量１００００〜７５０００を有するｐｓを
含有する分画を集め、凍結乾燥する。

０、　ＰＳの酸化 凍結乾燥されたＰａを蒸留水中に５η／ｄの濃度で溶解
する。これＫ　Ｎａｚｏ４（過ヨウ素酸ナトリウム）ｔ
−加え０．１Ｍの濃度となす。この溶液を２時間、室温
で暗所に放置する。過剰の酸化剤を０．２Ｍ（１１度ま
でエチレングリコールを加えて不活性化する。酸化され
たｐｓ６徹底的に水で透析し、凍結乾燥する。

Ｄ、）キシンＡ ストックホルム、スウェーデンから得られる。）次の公
知方法に従って単離する：限外濾過、ＤＢＡＩ−セルロ
ース−クロマトグラフィー、ヒ単離され念トキシンＡの
純度は９５チよシ大きい。

ＡＤＨは６スペーサー”分子として及び反応性アミノ基
の導入のためにトキシンＡと次の様に共有結合する： 純粋なトキシンＡを０．０５　Ｎ　Ｎａ−リン酸塩−緩
衝液（ｐＨ７，２）中でｓ　ｍｙ／ｍｌに調製する。こ
れにＡＤＨ（アジピン酸ジヒドラジド）及び１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
を固形で加え夫々１０１ｎ９／ｄの濃度となす。ｐＨを
希塩酸で４．８に調整する。溶液を慎重に２時間２２℃
で撹拌し、更に１Ｎ塩酸の添加によって４．８で一定に
保つ。

反応の終了後、混合物を徹底的に０．０ＭＮａ−リン酸
塩−緩衝液（ｐＨ８，０）で４℃で透析する。不溶性材
料を遠心分離して除去する。トキシンＡ−ムＤＨ−溶液
を濃度５ｍｇ／ゴに調整する。

トキシンＡ　−ＡＤＨ−溶液を２時間室温で０．５Ｍ　
Ｎａ　−Ｉ）ン酸塩−緩衝液で透析し、トキシンＡ　−
ＡＤＨ−溶液を５　ｑ／　ｒｒｄｌに調整する。この溶
液に同様に０．５　Ｍ　Ｎａ　−リン酸塩−緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶解された酸化されたＰＳ　５η／ゴの溶
液の同一容量を加える。この溶液を６時間室温で放置し
、次いで１０倍に濃縮された（　０．５　Ｍ　）溶液か
ら０．０５　Ｍ濃度までのＮａＢＨ３０Ｎ　ｆ加える。

混合物を５−７日間室温で放置する。次いで徹底的に０
．０２　％メルチオラートを含有する所７．４のリン酸
塩緩衝液（ＰＢＸ　）で透析する。

不溶性材料を遠心分離して除去し、溶解された反応混合
物をアガロースゲル、たとえばＡｃＡ　３４−ゲルを介
してクロマトグラフィー分離する。分画から吸収を２８
０及び２２０　ｎｍで測定する。空容量（ｖ０〕で溶出
し、従って３５００００以上の分子量を有するーこれは
反応成分のモル重量をはるかに超えている一物質を集め
、無菌濾過する。物質ｔ−ｏ、ｓゴはヒトの薬用量に相
当し、最終溶液は５０％ＰＢＳ及び０．０１　％メルチ
オラート中に５チ乳糖ｋ　含有する様に希釈し、次いで
凍結乾燥するＯ ワクチンについて次の試験を実施する：試験　　　　　
方法 下で７エノールー硫酸ま たん白含有ｉｔ標準として牛血清アルブミンの使用下で
ローリ−等２ 無　　　菌 発熱原性　　家ウサギ 相容性　　２つのヒトの薬用ｉｔ夫々２匹のモルモット
に及び１つのヒトの薬用量 を夫々５匹のマウスに腹腔内投与。

毒　　性　　　６匹のマウスに２００μ？（たん白）ｔ
−０，５ｒｄ腹腹腔膜投 与果は表１を参照。

’Ｍ、ＤｕｂＯ１ａ等、砂糖及びこれに関連する物質の
測定に関する比色法、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　２８　
：３５０−３５５、 ”　ＯｏＨｌＬｏｗｒｙ等、ホリン−フェノール試薬を
用いるたん白測定。Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１
９３　：２６５−２７５　　（１９５１）、 例２ 例ＩＡ／’Ｂによシ製造されたＰＳｌ　００η饋留水９
．２ｄ中に溶解する。これに慎重にシアン化臭素の溶液
０．４４′ｌｌ１ｉ加える。ｐＨｉ　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ
で６分間ｐＨ１０，５に保つ。その後ｐＨを固形ＮａＨ
ＣＯ３の添加によって８．６に下げる。アジピン酸ジヒ
ドラジド（ＡＤＨ）　０．４１を加え、溶液を慎重な撹
拌下１６時間４℃で放置する。水で徹底的に透析後たと
えばイオン交換体及びゲル−クロマトグラフィーで精製
され又は凍結乾燥された破傷風トキソイド１００■及び
１−エチル−３−（５−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド−溶液（２０η／ｍ　）　５．５　ｖｒｌ
を加える。

ｐｉ’＋を０．１Ｎ塩酸で４．８に調整し、４時間室温
で弱い撹拌下一定に保つ。次いで反応混合物を徹底的に
ＰＢＳ−メルテオラー）０．０２％で透析する。その後
混合物をアガロース−ゲル（カラム５ｃＪ！Ｌ×４０ｃ
ＩＩＬ、展開速度１．１ｍ／分）でＰＢＳ　−メルチオ
ラートー緩衝液を用いてクロマトグラフィー分離する。

１１ｍの分画を集め、たん白−及びｐｓ−含有量を測定
する。空容量でこれを溶出し、それに従って３５０００
０以上の分子量を有する材料を集め、例１０様に凍結乾
燥する。ｐｓ−破傷風一接合体とＦＢ−）キシンＡと同
様に接合体を試験する（例１参照）。

例３ 例２に記載した様に血清型特異性デテルミナンＩｅ含有
する多糖類を精製されかつ濃縮された又は凍結乾燥され
たジフテリアトキソイドと共有結合する。

得られたワクチンは非癲性であ夕、緑膿菌に対して血清
型特異性抗体並びにシフテリアトキンイドに対して抗毒
性抗体を産出する。

例４ 大腸菌−ＰＳ−トキシンＡ−接合ワクチン例１に記載し
た様に、血清型特異性デテルミナントを含有する多糖類
を大腸菌−発酵培養液のエンドトキシンから単離する。

例１！／ｃ記載した様Ｋ、多糖類を過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化し、トキシンＡと６スペサー”−分子アジピン
酸ジヒドラジドを用いて共有結合する。接合ワクチンを
凍結乾燥し、試験する。これは非毒性で、十分に相容性
であり１．大腸菌に対する血清型特異性抗体の形成を導
く。

例５ 大腸菌−ＰＳ−破傷風トキソイドー接合ワクチン血清型
特異性デテルミナントを含有する大腸菌−多糖類をシア
ン化ブロムで活性化し、例２と同様にスペーサー分子ア
ジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）と共有結合する。多糖
類−ＡＤＨを水溶性カルボジイミドを用いて破傷風トキ
ソイドのカルボキシル基と共有結合する。

得られたワクチンは非毒性で、十分に相容性であり、大
腸菌に対する血清型特異性抗体の形成並びに破傷風トキ
ソイドに対する抗毒性抗体の形成を導く。

例６−８ 新規血清型特異性単一接合体を薬用量あたシ夫々５０〜
１００μｆを混合して多価緑膿菌−接合ワクチンとなし
精製する。

処理：接合体の多糖類−成分を先ず個々に次の９つの緑
膿菌−株のエントドキシ／がら単離する： ＦＡ２２０（Ｈａｂａ血清型６ｄ）；　８５０５（Ｈａ
ｂｅ血清型３〕；６５１１　（Ｅｆａｂｓ血清型４）；
工Ｔ　−２（Ｈａｂｓ　血？［１１）　；Ｒ５７６（Ｈ
ａｂｅ血清型２ａｂ）　；　ＰＡ　５３　（Ｈａｂｓ血
清型１）；Ｗ　１　Ｂ　（Ｈａｂｓ血清型１ｏ）：工τ
２　（Ｈａ’ｂａ血清型１１）；工Ｔ　２　（Ｈａｂｓ
血清型１１）：工Ｔ　６　（Ｅｊａｂｓ血清凰８血清上
８後９つの種々のｐｓを個々に例１にょる緑膿菌のエキ
ソトキシンＡのたん白部分と共有結合し、最後に９つの
接合体を混合して９価のワクチンとなす。

得られた９−価のワクチンは次の性質を有する： （１）　　これは動物に対して非毒性であ）、家ウサギ
に対して発熱性ではない。

（２）　　その分子量は３５００００よル大きい。

（３）　　ワクチンは緑膿菌−感染の広いスペクトルに
対して防御する。

７．９−価緑膿菌一破傷風トキソイドーワクチン製造は
例６と同様に行われる。９つの種々Ｏｐｓを個々にヒト
の破傷風トキソイドト例２に従って共有−合し、その後
混合して多価ワクチンとなす。

得られたワクチンは緑膿菌に対する血清型特異性抗体の
形成並びに破傷風トキシンに対する抗毒性抗体の形成を
導く。

ａ９−　〇緑１−ジフテリアトキソイド−ワクチン ９つの例６で特異化されたｐｓを個々に例３によるジフ
テリアトキソイドと共有結合し、その後混合して多価ワ
クチンとなす。

得られたワクチンは緑膿菌に対する血清型特異性抗体の
形成並びにジフテリアトキシンに対する抗毒性抗体の形
成を導く。

例９−１３ １４、の単−接合体夫々５０−１００μｔ−その多糖類
部分は大腸菌の血清型１，２，４，６゜７．８，１１，
１６，１８，２２，２５，６２，７５のエンドトキシン
から由来し、そのたん白部分は緑ｍ菌（Ｐ、ａ、）のエ
キソトキシンから由来する−を混合する。

得られたワクチンは大腸菌に対する血清型特異性抗体の
形成並びにＰａ１−）キシンに対する抗毒性抗体の形成
を導く。

１０．１４−価大腸菌一破傷風トキソイドーワクチン大
腸菌及びヒトの破傷風トキソイドの例９に挙けたＰＳか
らなる１４の単一接合体を例１−３と同様に製造し、例
６／７と同様に混合する。得られたワクチンは大腸菌に
対する特異性抗体の形成及び破傷風トキシンに対する抗
ｌＩ性抗体の形成を導ぐ。

１１．１４−価大腸菌一ジフチリアトキソイドー接合ワ
クチン 大腸菌及びジフテリアトキソイドの例９に挙げたＰＢか
ら成る１４の単一接合体を例１−３と同様に製造し、例
いと同様に混合する。

得られたワクチンは大腸類に対する特異性抗体の形成及
びジフテリアトキシンに対する抗毒性抗体の形成を導く
。

１２．１０＝価大腸　−接合ワクチン １０の単−接合体夫々５０−１００μｆ／薬用量−その
多ｌｉ類部分は〇−血清型１゜２．４，６，７，８，１
８，２２，２５，７５のエンドトキシンから由来し、そ
のたん白部分は緑膿菌のエキソトキシンＡから又は人間
−破傷風トキソイドから由来する−を混合する。

１五３−価大腸菌一接合ワクチン ３つの単−接合体夫々５ｏ−１ｏａ１１ｔ／薬用量−そ
の多糖類部分は〇−血清Ｗ（ａＪｌ、（＃　２　及び（
ｃ）　４のエキソトキシンのエンドトキシンから及びそ
のたん白部分は（ａ）緑膿菌のエキソトキシンＡから、
（ｂ）ヒトの破傷風トキソイドから又は（Ｃ）ジフテリ
アトキソイドから由来する−を混合する。

例１４ チン このワクチンは９の単一接合体（５０−１００μｔ）−
七の多糖類部分は緑膿菌エンドトキシンから由来するー
、並びＶＣｌ２の単−接合体−その多糖類部分は大腸菌
のエンドトキシンから由来する−の混合ｒｃよって得ら
れる。単一接合体のたん白部分は緑膿菌のエンドトキシ
ンムから又はヒトー破傷風トキソイドから由来する。得
られたワクチンは緑膿菌に対する並びに大腸菌に対する
血清型特異性抗体を導くことができる。更にこのワクチ
ンはエキソトキシンＡに並びに破傷風トキシンに適合す
る抗毒性抗体をも導く。

例１５ 特異性免疫グロブリンの製造に多価接合ワクチンを使用 志願者に例１４による多価ワクチンを三角筋に予防接種
する。４週間後、三角筋に同一ワクチン及び同一処方で
ブースター接種を行う。−週間後、志願者に対して腕静
脈から血液試料を城ル、ワクチン中に含有される血清型
（緑膿菌及び大腸菌）に対する並びにエキソ）−Ｐシン
Ａ及び破傷風トキシンに対する抗体を測定する。

ナベて述べた抗原に対する力価増加が接種の結果として
４倍又はそれ以上である場合、接種を受けた人から約２
４０ｄの血液が提供される。

血清を集め、次の公知の工程を経て、たとえばヨーロッ
パ特許第８５７４７号明細書の方法に従って静脈内投与
用ｒ−グロブリンー′ＦＪ４製物を製造する：コーン法
による分画されたアルコール−沈殿、イオン交換−クロ
マトグラフィー限外濾過及び透析濾過。たん白金有量を
５優に調整し、安定化する媒体中で凍結乾燥する。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）相互に共有結合するたん白と種特異性多糖類から
   成るグラム陰性菌による感染に対する非毒性接合ワクチ
   ンに於て、多糖類は菌のエンドトキシンから由来し、た
   ん白はエキソプロテインであることを特徴とする前記ワ
   クチン。
2. （２）グラム陰性菌は緑膿菌である特許請求の範囲第１
   項記載のワクチン。
3. （３）グラム陰性菌は大腸菌である特許請求の範囲第１
   項記載のワクチン。
4. （４）エキソプロテインはエキソトキシン又はエキソト
   キソイドである特許請求の範囲第１項記載のワクチン。
5. （５）エキソトキシンは緑膿菌からのトキシンＡである
   特許請求の範囲第１項記載のワクチン。
6. （６）エキソトキソイドは破傷風トキソイド又はジフテ
   リアトキソイドである特許請求の範囲第１項記載のワク
   チン。
7. （７）３−１５の接合体の混合物から成り、その多糖類
   は同一菌種の３−１５の種々の血清蓋から得られる特許
   請求の範囲第１項記載のワクチン。
8. （８）ワクチンの混合物から成り、その個々の成分は夫
   々特定の菌種に対する抗体を産出する特許請求の範囲第
   １項記載の多価ワクチン。
9. （９）多糖類は菌のエンドトキシンから由来し、たん白
   はエキソプロテインである、相互に共有結合するたん白
   と種特異性多糖類から成るグラム陰性菌による感染に対
   する非毒性接合ワクチンに於て、対応する多糖類はエキ
   ソプロテインと共有結合することを特徴とする前記ワク
   チンの製造方法。
10. （１０）多糖類は菌のエンドトキシンから由来し、たん
    白はエキソプロテインである、相互に共有結合するたん
    白と種特異性多糖類から成るグラム陰性菌による感染に
    対する非毒性接合ワクチンをそれ自体静脈内又は筋肉内
    投与可能な免疫グロブリンの製造に使用する高度免疫血
    清の製造に使用する方法。