JP2014515757A - 真菌感染症のペプチド及び結合型ワクチン - Google Patents
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Abstract
カンジダ症及び他の真菌疾患に対するワクチンとしての有効性を示す幾つかの新しいペプチドを開発した。破傷風毒素に結合された真菌ペプチドに結合されたβ−マンノトリオースの新しい結合型ワクチンが、アジュバントを使用して又は使用せずにワクチンとして有効であることを示した。加えて、カンジダ感染に対する防御を提供するモノクローナル抗体を特定した。
Description
米国法典第35編第119条(e)及び各国の該当する条約及び協定に基づき、2011年4月1日に出願された米国特許仮出願第61/477,738号の出願日の利益を主張する。
本発明は、NIH−NIAIDプログラム助成金PO1 AI061537に基づく国立衛生研究所からの国庫補助でなされたものである。米国政府は、本発明にある権利を有する。
本発明は、真菌感染症及び真菌性疾患に対する持続性免疫学的防御を誘導するための新しいペプチド及びペプチド結合型ワクチン、及び真菌感染症に対する迅速だが短期的防御を提供するための新しいモノクローナル抗体に関する。
多形性真菌カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)は、大多数の健常ヒトの胃腸管、膣、及び幾つかの皮膚領域に生息する共生生物である。しかしながら、この真菌は、ある条件下において、粘膜性カンジダ症から重篤な侵襲性カンジダ症に及ぶ様々な感染症を引き起こす場合がある(非特許文献1)。C.アルビカンス(C.albicans)は、種々の形態のカンジダ症の最も一般的な原因であり続けているが(非特許文献2、非特許文献3)、他の幾つかのカンジダ種も重要な因子である。侵襲性疾患には、毎年数十億ドルの医療費、及び約40%と推定される死亡率が伴う(非特許文献4、非特許文献5)。抗真菌剤の数が限られていること及びその毒性、並びに最も重要なことには、適切な抗真菌療法で治療されたカンジダ血症患者数のほとんど半数の予後が不良であることは、恐らくは能動及び受動免疫戦略による疾患予防に有利に作用する(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8)。
カンジダに対する抗体の防御的役割には議論の余地があるが、この様式の防御を支持する証拠は増加しつつある。防御抗体の特異性は、C.アルビカンス細胞壁ポリサッカライド、タンパク質、及びペプチドに対してである(非特許文献9、非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13)。予防戦略として、疾患からの防御は、ワクチン接種及び事前に形成されたモノクローナル抗体の転移により、それぞれ能動的に又は受動的に獲得することができる。治療的処置の場合、実験的証拠は、事前に形成された抗体が、抗真菌剤の有効性を増強することができることを示している(非特許文献14、非特許文献15)。
C.アルビカンスに対する最初の完全合成グリコペプチドワクチンは、マウスにおいて播種性カンジダ症に対する防御を誘導した(非特許文献16)。C.アルビカンス細胞壁タンパク質に見出される6つの推定上のT細胞ペプチドは、防御的なβ−1,2−マンノトリオース[β−(Man)3]グリカンエピトープと結合されて、グリコペプチド結合体を生成する。括弧の中に表示されているペプチドが、ヒトカンジダ症中に発現され、細胞壁に結合することにより誘導される6つのタンパク質には、以下のものが含まれる:フルクトース−二リン酸アルドラーゼ(Fba)(YGKDVKDLDYAQE;配列番号1);メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(Met6)(PRIGGQRELKKITE;配列番号2);菌糸壁タンパク質−1(Hwp1)(QGETEEALIQKRSY;配列番号3);エノラーゼ(Enol)(DSRGNPTVEVDFTT;配列番号4);グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gap1)(NRSPSTGEQKSSGI;配列番号5);及びホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk1)(VPLDGKTITNNQRI;配列番号6)(非特許文献16)。この研究の目的は、上記ペプチドが、T細胞エピトープとしての役割を果たし、グリコペプチド結合体のグリカン部分に対する防御抗体応答を促進するだろうということだった。したがって、免疫プロトコールは、細胞媒介性免疫(CMI)応答ではなく、抗体に有利になるように設計され、抗体は、種々の結合体のグリカン部分及びペプチド部分の両方に対して産生された。すなわち、抗体産生を促進するDCに基づく免疫プロトコールにより、3つの複合糖質β−(Man)3−Fba、β−(Man)3−Met6、及びβ−(Man)3−Hwp1は、マウス生存及び低腎臓真菌量により明らかなように、真菌による血行負荷に対する防御を誘導した(非特許文献16)。β−(Man)3−Eno1及びβ−(Man)3−Gap1は、中程度の防御をもたらし、β−(Man)3−Pgk1は、疾患をわずかに増強した。β−(Man)3−Fba結合体の場合、防御は、グリカン及びFbaペプチドに対する免疫により特異的に獲得された。天然タンパク質フルクトース1,6−二リン酸アルドラーゼ(Fba1p)は、フルクトース−1,6−ビスホスファートの、ジヒドロキシアセトンホスファート及びグリセルアルデヒド3−ホスファートへの可逆的切断を触媒し、幾つかの理由で、魅力的な抗真菌性標的となっている。第1に、この重要な酵素は、発酵性及び非発酵性炭素源の両方での増殖に必要とされており、したがって、C.アルビカンス及び他の病原性真菌の生存能にとって不可欠である(非特許文献16)。第2に、真菌フルクトース−1,6−二リン酸アルドラーゼは、ヒトフルクトース−1,6−二リン酸アルドラーゼとは異なる。C.アルビカンスFba1pは、主に真菌及び原核生物に見出されるII型アルドラーゼのファミリーに属する(非特許文献17)。対照的に、ヒト酵素は、I型アルドラーゼに属しており、ヒトアルドラーゼの配列は、真菌アルドラーゼの配列とは著しく異なる(非特許文献17)。したがって真菌酵素にのみ特異的な免疫学的応答を達成することが可能であり得ると予想することは合理的である。実際、Fba14量体ペプチド配列(YGKDVKDLFDYAQE;配列番号1)は、C.アルビカンスに特有である(非特許文献12)。
特許文献1には、破傷風トキソイド又はP.エルギノーサ(P.aeruginosa)毒素Aのいずれかに結合されたシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)リポポリサッカライドに由来するポリサッカライドを使用して合成されたポリサッカライドタンパク質結合型ワクチンが開示されている。
特許文献2、特許文献3、及び特許文献4には、β−1,2−結合トリ−マンノース残基を含む、C.アルビカンスの単離ホスホマンノタンパク質(phosphomannoprotein)細胞壁複合体に基づくカンジダ・アルビカンスのワクチンが開示されている。
特許文献5、特許文献6、特許文献7、及び特許文献8には、ホスホルマンナ(phosphormanna)エピトープを模倣するペプチド又はペプチドミモトープをコードするポリヌクレオチドに基づくワクチンが開示されており、カンジダ・アルビカンスの感染に対する受動免疫のための、MAb B6.1を含むモノクローナル抗体が開示されている。
特許文献9、特許文献10、特許文献11、特許文献12、特許文献13、及び特許文献14には、タンパク質担体破傷風トキソイドを含むタンパク質担体に結合されたβ−(1−2)−β−D−マンノピロース−トリオース(β−(Man)3又はβ−(1,2)−マンノトリオースとも呼ばれる)を含む天然O連結及びS連結オリゴ糖を含む免疫原性オリゴ糖組成物に基づく、カンジダ種に対するワクチンが開示されている。
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本発明者らは、カンジダ症に対する、及び幾つかのペプチドの場合は、潜在的な他の真菌疾患に対するワクチン開発として効力を示すカンジダ細胞壁タンパク質に基づく幾つかの新しいペプチドを設計した。これらペプチドワクチンの防御能力を、ヒトで認可されているアジュバントと共に製剤化されているか、又は防御抗体の産生を促進するDCに基づく免疫手法によるかに関わらず、ヒト播種性カンジダ症のマウスモデルにおいて評価した。ワクチンは、防御を付与した。加えて、Fbaペプチド(配列番号1)を使用して、本発明者らは、ワクチン防御が、免疫マウスの血清中での抗Fbaペプチド抗体の産生と関連していたことを示した。重要なことには、Fbaペプチドは、ヒトにおいて免疫原性であると予想することができる。Fbaペプチドに特異的なモノクローナル抗体(MAb E2−9)が、Fba免疫マウスの脾細胞から単離され、受動転移実験のカンジダ症に対して防御性であることが示された。このモノクローナル抗体は、カンジダ症に対する短期的防御に使用することができる。また、本発明者らは、より一般的な真菌ワクチンであると考えられるFba又はMet6(Fba3(配列番号8);Fba4(配列番号9);及びMet6−2(配列番号10)に基づくペプチドワクチンを設計し、これらのペプチドがワクチンとして効力を有することを示した。加えて、本発明者らは、様々な位置のアミノ酸をメチル化することにより(配列番号11〜19)、又は2つのシステイン残基を付加することにより(配列番号20)Fba配列を修飾した。これら修飾Fbaは、ワクチンとしてある程度の有効性を示した。
加えて、本発明者らは、それを破傷風トキソイド(TT)に結合させることによりβ−(Man)3−Fba結合体を修飾して免疫原性を向上させ、ヒト使用に好適なアジュバントの使用を可能にすることにより、新しいワクチン結合体を開発した。修飾β−(Man)3−Fba−TTは、単独で又はミョウバン若しくはモノホスホリルリピドA(MPL)アジュバントとの混合物としてのいずれかで、皮下(s.c.)経路によりマウスに投与された。アジュバントを用いてワクチン接種したマウス、又は驚くべくことにアジュバントを用いずにワクチン接種したマウスは、ロバストな抗体応答を起こすことにより良好に応答した。免疫群は、攻撃投与(チャレンジ)前にアジュバントのみ又はDPBS緩衝液を受容した対照群と比較して、生存期間が延長され、腎臓真菌量が低減したことにより明らかなように、C.アルビカンスによる致死用量のチャレンジに対して高度な防御を示した。誘導された抗体が防御性であることを確認するために、β−(Man)3−Fba−TT結合体に対して免疫されたマウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御を未感作マウスに転移させたが、C.アルビカンス吸収免疫血清は、転移しなかった。β−(Man)3−Fba−TTワクチンにより誘導された同様の抗体応答及び防御が、近交系BALB/c及び非近交系Swiss Websterマウスで観察された。TTをグリコペプチド結合体に付加すると、追加のアジュバントを必要とせずにロバストな抗体応答を促進する新しい自己アジュバント性ワクチンがもたらされた。これは、播種性カンジダ症に対するワクチン設計にとって大きな利点である。
以前に、本発明者らは、播種性カンジダ症に対するカンジダ・アルビカンス防御マウスの細胞表面に、グリカンβ−1,2−マンノトリオース[β−(Man)3]に特異的な抗体があることを示した。更に、免疫原性グリコペプチド結合体を生成する試みにおいて、C.アルビカンス細胞壁タンパク質のN末端部分内にある6つの14量体ペプチドをグリカンに結合させた。樹状細胞(DC)に基づく免疫手法によって、全てが免疫原性だった。6つの結合体のうちの3つは、マウスに高度な防護を誘導した。興味深いことには、その後に免疫するためのDCパルス処理に単独で使用すると、6つのペプチドは全て抗体応答を誘導したが、3つのペプチドが防御を誘導し、1つペプチド、特にFba(フルクトース−二リン酸アルドラーゼ由来)は、ロバストな防御応答を誘導し、本研究の焦点だった。本発明者らは、本明細書において、Fbaペプチドは、下述のように様々なH−2ハプロタイプのマウス及びウサギに抗Fba抗体を誘導したため、II型MHCに限定されないことを示した。更に、このペプチドは、様々なC.アルビカンス株により引き起こされる疾患に対する防御を誘導した。Fba免疫のためにDCではなくミョウバンを使用すると、部分的な防御が達成された。Fbaワクチン接種マウスに由来する免疫血清の受動転移は、未感作マウスに防御を付与したが、真菌細胞で事前に吸収された免疫血清の受動転移は、防御を付与しなかった。また、本発明者らは、Fbaペプチドに特異的なモノクローナル抗体E2−9(IgM)は、マウスをカンジダ症から防御し、カンジダ感染症からの短期的防御を提供することができたことを示している。このモノクローナル抗体、又は他の新しいペプチドから単離されたモノクローナル抗体は、カンジダ感染症に対する防御をもたらす他の抗真菌性化合物と共に使用することができた。
また、本発明者らは、Fba及びMet6に基づいて、更なる真菌性疾患に対して使用するためのワクチンを設計し、それらペプチドを、Fba2(配列番号7)、Fba3(配列番号8)、Fba4(配列番号9)、及びMet6−2(配列番号10)と命名した。これらは全てワクチンとしてある程度の効率性を示したが、Fba2は、いくぶん他よりも効果的ではなかった。その後、本発明者らは、下記の表1に示されているように、様々な位置のアミノ酸をメチル化することにより(配列番号11〜19)、又は2つのシステイン残基を付加することにより(配列番号20)Fbaの配列を修飾した。これら修飾Fbaペプチドも、ワクチンとしての有効性を示した。また、これらペプチドは、タンパク質担体、例えば破傷風トキソイド、又はアジュバントと共に投与して、ワクチンとしての有効性を増加させることができる。ストレプトコッカス(Streptococcus)及びコレラ(Cholera)由来のペプチドを含む幾つかのペプチドワクチンは、破傷風毒素(63、64、65)又は破傷風THエピトープ(例えば、米国特許出願公開第2004/0101534号)に共有結合で結合されている。
また、本発明者らは、免疫原性を向上させ、ヒト使用に好適なアジュバントの使用を可能にするために、破傷風トキソイド(TT)に結合させることにより、以前に報告されているβ−(Man)3−Fba結合体(53)を修飾した。ヒト使用に完全に適合する新しい免疫手順により、修飾β−(Man)3−Fba−TTを、単独で又はミョウバン若しくはモノホスホリルリピドA(MPL)アジュバントとの混合物のいずれかで投与し、皮下(s.c.)経路によりマウスに投与した。アジュバントを用いてワクチン接種したマウス、又は驚くべきことにアジュバントを用いずにワクチン接種したマウスは、ロバストな抗体応答を起こすことにより、良好に応答した。下記に示されているように、免疫群は、チャレンジ前にアジュバントのみ又はDPBS緩衝液を受容した対照群と比較して、生存期間が延長され、腎臓真菌量が低減することにより明らかなように、C.アルビカンスによる致死的チャレンジに対する高度な防御を示した。誘導された抗体が防御性であることを確認するために、β−(Man)3−Fba−TT結合体に対して免疫されたマウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御を未感作マウスに転移させたが、C.アルビカンス吸収免疫血清は、転移させなかった。β−(Man)3−Fba−TTワクチンより誘導された同様の抗体応答及び防御が、近交系BALB/c及び非近交系Swiss Websterマウスで観察された。TTをグリコペプチド結合体に付加すると、追加のアジュバントを必要とせずにロバストな抗体応答を促進する新しい自己アジュバント性ワクチンがもたらされた。これは、播種性カンジダ症に対するワクチン設計にとって大きな前進である。本発明者らは、β−(Man)3及びTTを上記で考察した他のペプチドに付加することに基づく結合体は、真菌感染症又は疾患に対する抗体応答及び防御を促進することになる自己アジュバント性ワクチンになるだろう。
その他
用語「ワクチン」は、哺乳動物に免疫応答を刺激し、したがって、免疫系が以前に遭遇した抗原を記憶する能力を含む、その哺乳動物の疾患又は感染症に対する抵抗性を付与するために使用される組成物又は化合物(抗原)を指す。抗体は、抗原に対する初回曝露の結果として生成され、その後の暴露に備えて保存される。
用語「ワクチン」は、哺乳動物に免疫応答を刺激し、したがって、免疫系が以前に遭遇した抗原を記憶する能力を含む、その哺乳動物の疾患又は感染症に対する抵抗性を付与するために使用される組成物又は化合物(抗原)を指す。抗体は、抗原に対する初回曝露の結果として生成され、その後の暴露に備えて保存される。
用語「アジュバント」は、抗原と組み合わせると、抗体形成細胞の局所的な流入に結び付く炎症性又は他の不定型応答を誘導することにより抗体産生を増強する非抗原性物質(水酸化アルミニウム及びモノホスホリルリピドA等)を指す。アジュバントは、少量の抗原に対する抗体の産生を増加させ、抗体産生の期間を延長し、記憶細胞応答を誘導する傾向があるため、ワクチン調製に治療的に使用される。
用語「免疫応答」は、外来性又は潜在的に危険な物質(抗原)、特に疾患性微生物に対する身体の反応を指す。この応答は、特殊白血球細胞(リンパ球)が、抗体として知られているタンパク質を産生することを含む。抗体は、抗原と反応して抗原を無害化する。抗体−抗原反応は、高度に特異的である。また、ワクチンは免疫応答を刺激する。
用語「免疫学的有効量」は、有効なワクチンに必要な免疫記憶を誘導するために求められる免疫応答誘導性物質の量を指す。
本発明の医薬組成物には、注射可能な組成物の形態で投与されるという利点がある。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、NaClを含有するリン酸緩衝液中のヒト血清アルブミンを含有していてもよい。他の薬学的に許容される担体には、塩、保存剤、緩衝剤等を含む水溶液、無毒性賦形剤が含まれる(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、15版、Easton編、Mack Publishing Co.社、1405〜1412頁及び1461〜1487頁(1975年)及びTHE NATIONAL FORMULARY XIV、14版、American Pharmaceutical Association、ワシントンD.C.(1975年)。これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール/水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウム等の非経口媒体、リンゲルデキストロース等が含まれる。静脈内媒体には、液体及び栄養補充液が含まれる。医薬組成物の種々の成分のpH及び正確な濃度は、当技術分野の日常的な技術により調整される。Goodman及びGilman、THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS(7版)。
本発明の医薬組成物には、注射可能な組成物の形態で投与されるという利点がある。そのような目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物は、NaClを含有するリン酸緩衝液中のヒト血清アルブミンを含有していてもよい。他の薬学的に許容される担体には、塩、保存剤、緩衝剤等を含む水溶液、無毒性賦形剤が含まれる(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、15版、Easton編、Mack Publishing Co.社、1405〜1412頁及び1461〜1487頁(1975年)及びTHE NATIONAL FORMULARY XIV、14版、American Pharmaceutical Association、ワシントンD.C.(1975年)。これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール/水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウム等の非経口媒体、リンゲルデキストロース等が含まれる。静脈内媒体には、液体及び栄養補充液が含まれる。医薬組成物の種々の成分のpH及び正確な濃度は、当技術分野の日常的な技術により調整される。Goodman及びGilman、THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS(7版)。
典型的には、そのようなワクチンは、液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。注射前に液体中の溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態を調製することもできる。また、製剤は、乳化されていてもよい。活性免疫原性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノール等、及びそれらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、又はワクチンの有効性を増強する免疫強化物質等の少量の補助物質を含有していてもよい。
アジュバントは、免疫防御抗体価又は細胞性免疫応答を増加させることができる。そのようなアジュバントには、これらに限定されないが、以下のものが含まれ得る:フロインド完全アジュバント、フロインド不完全フジュバント、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Adjuvax(Alpha−Beta Technology社)、Imject Alum(Pierce社)、モノホスホリルリピドA(Ribi Immunochem Research社)、MPL+TDM(Ribi Immunochem Research社)、Titermax(CytRx社)、毒素、トキソイド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、細菌細胞壁、サブユニット(細菌性又はウイルス性)、炭水化物部分(モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、オリゴ−、及びポリサッカライド)、種々のリポソーム製剤、又はサポニン。ミョウバンは、現在、ヒト患者に使用されるアジュバントである。種々のアジュバントの組合せを結合体と共に使用して、免疫原製剤を調製することができる。
ワクチンは、従来通り、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、経口、経鼻、非経口、又は粘膜免疫を刺激するために尿生殖路に直接、好ましくは局所的に投与される。更なる製剤が、他の投与方法に好適であり、それらには、経口製剤が含まれる。経口製剤には、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウム等の典型的な賦形剤が含まれる。組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤の形態をとり、10%〜95%、好ましくは25〜70%の有効成分を含有する。
投与される用量は、必要とされる希釈剤、つまり担体又は媒体、及び特定の治療計画に伴う所望の治療効果をもたらすことが計算される活性物質の所定量に依存する。投与される量は、治療の回数及び量の両方に従って、治療しようとする対象、抗体を合成する対象の免疫系の能力、及びどの程度の防護が所望であるかに依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体によって様々である。しかしながら、好適な用量範囲は、個々の一対象当たり約1〜数百マイクログラムの活性成分である。また、初回投与及び追加免疫注射の好適な投与計画は様々であるが、典型的には、初回投与した後、1週間又は2週間の間隔で、1回又は複数回の追加注射又は投与を行う。防御を継続的させるために、年1回の追加免疫を行ってもよい。
抗真菌性化合物は、当技術分野で周知であり、幾つかの群に分類することができる:ポリエン抗真菌剤、アゾール、アリルアミン、エキノキャンディン、及び他の抗真菌性化合物。ポリエン抗真菌剤(複数の共役二重結合を有する化合物)の例には、アムホテリシンB、カンジシジン、ナイスタチン、ナタマイシン、及びリモシジンが含まれる。一般的に用いられるアゾール(5員有機環を有する化合物)の例には、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、及びクロトリマゾールが含まれる。アリアミン(allyamine)(スクアレン合成を阻害することによりエルゴステロール合成を阻害する化合物)の例には、ナフチフィン、テルビナフィン、及びアモロルフィンが含まれる。エキノキャンディン(細胞壁のグルカンの合成を阻害する化合物)には、アニデュラファンギン、カスポファンギン、及びミカファンギンが含まれる。他の一般的に使用される抗真菌性化合物には、グリセオフルビン及び5−フルオロサイトシンが含まれる。
セクションA:ペプチドワクチン
(実施例1)
物質及び方法
カンジダ株及び培養条件。C.アルビカンス3153A及びSC5314、C.クルセイ(C.krusei)(ATCC 6258)、C.グラブラタ(C.glabrata)(ATCC 2001)、及びサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(ATCC 9463)は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC;マナッサス、バージニア州)から取得し、グルコース−酵母抽出物−ペプトンブロス中で静止期の酵母細胞として37℃で増殖させ、ダルベッコPBS(DPBS;Sigma−Aldrich社製、セントルイス、ミズーリ州)で洗浄及び懸濁して、適切な細胞濃度(5×106/ml)にし、それを使用して、以前に記述されているように(25、29)マウスを静脈内(i.v.)感染させた。また、C.アルビカンス株3153Aを、血清抗体吸収、免疫蛍光染色、及びフローサイトメトリー分析に使用した。別様の指定がない限り、C.アルビカンス株3153Aを、下記実施例でマウスのチャレンジに使用した。
(実施例1)
物質及び方法
カンジダ株及び培養条件。C.アルビカンス3153A及びSC5314、C.クルセイ(C.krusei)(ATCC 6258)、C.グラブラタ(C.glabrata)(ATCC 2001)、及びサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(ATCC 9463)は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC;マナッサス、バージニア州)から取得し、グルコース−酵母抽出物−ペプトンブロス中で静止期の酵母細胞として37℃で増殖させ、ダルベッコPBS(DPBS;Sigma−Aldrich社製、セントルイス、ミズーリ州)で洗浄及び懸濁して、適切な細胞濃度(5×106/ml)にし、それを使用して、以前に記述されているように(25、29)マウスを静脈内(i.v.)感染させた。また、C.アルビカンス株3153Aを、血清抗体吸収、免疫蛍光染色、及びフローサイトメトリー分析に使用した。別様の指定がない限り、C.アルビカンス株3153Aを、下記実施例でマウスのチャレンジに使用した。
マウス。5〜7週齢のBALB/c及びC57BL/6雌マウス(National Cancer Institute Animal Production Program、フレデリック、メリーランド州)を全体にわたって使用した。マウスは、動物設備で飼育され、動物実験は全て、Children’s Hospital Research Institute in New Orleansの院内実験動物委員会(IACUC、Institutional Animal Care and Use committee)により承認されたプロトコールに従って実施した。別様の指定がない限り、下記では、BALB/cマウスを実験に使用した。
マウス骨髄からの樹状細胞(DC)の分離及び培養。樹状細胞(DC)を、以前に記述されている方法に従って(49、53)、マウス骨髄から生成した。手短に言えば、供与体マウスをCO2窒息により安楽死させ、それらの長骨及び脛骨を無菌的に取り出した。数mlのRPMI−1640を強制的に注入することにより骨髄を硬骨から洗い出し、無菌70−mm細胞ストレーナーで穏やかにピペット操作することにより、集塊を除去又は分散した。赤血球細胞を4分間細胞溶解し(ACK細胞溶解緩衝液、0.15M NH4Cl、1.0mM KHCO3、0.1mM EDTA)、残留骨髄細胞を、完全培地[CM、10%FBS(FBS)、2mM L−グルタミン、1%非必須アミノ酸、及び100単位/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンで補完されたRPMI−1640]に懸濁し、2×105細胞/mlに調整し、5ml/ウェルで6ウェルプレートに配置し、40ng/mlのrmGM−CSF及びrmIL−4(R&D Systems社)の存在下で、37℃、5%CO2にて最長9日間培養した。培養の4日目及び7日目に、同量の新しいGM−CSF及びIL−4をウェルに添加した。別様の記載がない限り、試薬は全て、Sigma−Aldrich社から商業的に購入した。
ペプチドでパルス処理した樹状細胞による免疫。以前に記述されているように(53)、マウス樹状細胞(DC)を、in vitroにて候補ペプチドワクチン抗原でパルス処理した。手短に言えば、6日目に、培養中のDCをペプチド抗原(1μM)でパルス処理した。7日目に、PGE2(10−7M)を、LPS(2μg/ml、Sigma−Aldrich社)と共に、24時間添加した。9日目に、抗原パルス処理DCをよく洗浄し、200μlのDPBS中5×105個を、初回刺激用量としてマウスに腹腔内投与(i.p.)した。14日目に、マウスを、新しい抗原パルス処理DCでi.p.追加免役し、28日目に、完全フロインドアジュバント(CFA)中の乳化された抗原(10μg)を皮下(s.c.)投与して、2回目の追加免疫を行った。
ヒト認可アジュバント中のペプチドFbaによる免疫。Fbaペプチドを、アジュバントとしてのミョウバン(水酸化アルミニウムゲル、Sigma−Aldrich社)又はMPL(リピドA、モノホスホリル、Sigma−Aldrich社)との混合物のいずれかとして投与した。1日目、21日目、及び42日目に、50μgミョウバン又は10μgMPLのいずれかと共に、100μlの2.5μgFbaペプチドをs.c.注射することにより、マウスを免疫した。DPBS緩衝液又はアジュバントのみを投与したマウス群に由来する血清を、陰性対照として使用した。
血清学的アッセイ。血清の抗体価をELISAで分析した。DCに基づく免疫の場合、対照群は、初回刺激及び最初の追加免疫の際にDCのみが投与され、その後2回目の追加免疫の際にCFAのみが投与されたか、又は3回の注射全てでDPBSのみが投与されたマウスで構成されていた。Fbaペプチドがミョウバン又はMPLと共に投与された場合、対照群は、アジュバントのみ又はDPBS緩衝液が投与されたマウスだった。Fbaペプチドを、そのリジンコアが、Fbaペプチドエピトープのおよそ8個のコピーを提示した複数の抗原性ペプチド(MAP)に結合させた。合成Fba−MAP(GenScript社)を、5μg/mlの濃度でPBS(pH7.4)に溶解し、それを使用して96ウェルELISAプレートをコーティングし、各免疫血清及び対照血清の試料の連続2倍希釈物を重複して試験した。各ウェルの発色は、二次抗体(ヤギ抗マウス多価Ig−HRP)及び基質(O−フェニレンジアミン及びH2O2)により達成され、492nmのODを測定した。
モノクローナル抗体(MAb)。MAb E2−9(IgM)を産生するハイブリドーマクローンを、以前に記述されるように(53)、Fba−DC調製物でワクチン接種したマウスから生成した。手短に言えば、BALB/cマウスを、合成Fbaペプチドでパルス処理したDCを注射することにより免疫して、上述のFbaペプチドに対する抗体の産生を刺激した。2回目の追加免疫の10日後に、各動物から血清を採取して、後に犠牲し、脾臓を取り出し、単個細胞浮遊液を調製するために、最も高い抗Fba力価を有する動物を決定した。標準的プロトコールにより、脾臓細胞とSP2/0−AG14ミエローマ細胞系の融合をポリエチレングリコールで促進することによって、ハイブリドーマクローンを確立した。ハイブリドーマクローンを、ELISAにより特異的抗Fba抗体の産生についてスクリーニングし、力価が最も高く、最も迅速に成長するクローンのみを選択し、その後、限界希釈法により3回以上のクローニングを行った。MAb E2−9と命名したMAbを産生するクローンE2−9は、下述の方法により合成Fbaペプチドを用いたELISA阻害により決定したところ、Fbaペプチドと反応性だった。
ハイブリドーマ細胞系を、まず、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen社)及び2mM L−グルタミン(Sigma社)で補完された無抗生物質のRPMI 1640培地(Sigma社)中で、37℃にて5%CO2の存在下で増殖させた。抗体産生の場合、ハイブリドーマクローンを、無抗生物質のBD細胞MAb無血清培地(しかし、1.1mgウシ血清アルブミン/mlを含有している)を用いてCELLineデバイス(BD社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)で増殖させ、遠心ろ過デバイス(Centricon Plus−80;Millipore Corporation社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)を使用して濃縮した。MAb濃度は、試料の280nmの吸光度(A280)を測定することにより決定し、純度は、10〜12.5% SDS−PAGEゲルでの分析により評価した。
阻害ELISA。Fbaペプチドに対するMAb E2−9の特異性は、以前に記述されているように(52、53)、阻害ELISAにより決定した。手短に言えば、Fba−MAPを、DPBS(5μg/ml)に溶解し、その溶液を使用して、96ウェルELISAプレートをコーティングした(100μl、4℃で一晩)。ウェルを、PBST(Tween20、0.05%[容積/容積]を含有するPBS)で5回洗浄し、1%ウシ血清アルブミン−PBSTでブロッキングした。上述のように産生されたMAb E2−9を、ELISA測定用に10,000まで連続希釈した。別様の記載がない限り、血清を、DPBSで1:100希釈に希釈して、ELISAにより抗体の含有量を決定した。MAb E2−9を、Fbaペプチド(阻害剤)(0.1μM〜1mMの濃度でPBSTに溶解)と混合し、その結果生じた各濃度の溶液を、Fba−MAPでコーティングしたマイクロタイターウェル(固相)に三重反復で添加し、21〜23℃で2時間インキュベートした。別様の記載がない限り、ウェルをコーティングするのに使用した試験抗原の濃度は、約5〜10μg/mlだった。ウェルを、PBSTで3回洗浄し、IgMに特異的なヤギ抗マウス重鎖をHRPに結合し(PBSTで1:10,000希釈)(Sigma社)、100μlを、対応するウェルに添加し、21〜23℃で1時間インキュベートした。ウェルを、PBSTで5回洗浄し、その後、100μlの基質溶液(25mlの0.05Mリン酸−クエン酸緩衝液[pH5.0]、200μlの50mg/mlO−フェニレンジアミン水溶液の[Sigma社]、及び10μlの30%H2O2)を添加した。10分間発色させ、100μlの2M H2SO4を添加することにより発色を停止させ、492nmで測定を行った(マイクロタイタープレートリーダ、モデル450;Bio−Rad社、リッチモンド、カリフォルニア州)。阻害率は、阻害剤を含まない抗体を含有するウェルに対して算出した。
SDS−PAGE。MAb E2−9を、還元(β−メルカプトエタノール)条件下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)(12.5%ポリアクリルアミド)分析により評価して、抗体の重鎖及び軽鎖のサイズを決定した。E2−9がIgM五量体であることを、非還元SDS−PAGE(2.5%アクリルアミド/ビス及び0.5%アガロース)条件下のSDS−PAGEゲルのウエスタンブロットで示した。SDS−PAGEで分離した後、タンパク質を、PVDF膜(Bio−Rad社)に転写した。PBST(pH7.4)に溶解された5%脱脂乳で、膜を2時間ブロッキングした。膜をPBST(pH7.4)で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次Absでプローブした。陽性シグナルを、ECLシステム(Perkin Elmer社)を使用して視覚化した。
免疫蛍光法及びフローサイトメトリー分析。Fbaペプチドエピトープの酵母細胞での分布を、間接免疫蛍光法により決定した。200マイクロリットルのMAb E2−9(1mlのDPBS当たり16μgのAbタンパク質)を、DPBSで予め3回洗浄したC.アルビカンス酵母細胞(5×106)のペレットに添加した。酵母細胞を、抗体調製物に懸濁し、回転振とうしながら室温(RT、22〜24℃)で1〜2時間インキュベートした。インキュベーション後、酵母細胞を、DPBSで3回洗浄し、200μlのフルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgM(u−鎖特異的;Sigma社)(原液、1mg/ml;作業用溶液、1ml DPBS当たり20μg)に懸濁し、上述のようにRTで0.5時間インキュベートした。酵母細胞を、DPBSで3回洗浄し、200μlのDPBSに懸濁した。細胞を、共焦点顕微鏡(LSM510、Zeiss社)で観察した。酵母細胞表面におけるFbaペプチドエピトープの分布を、MAb B6.1エピトープの検出用に蛍光染色された酵母細胞で得られた分布と比較した。陰性対照には、無関係なアイソタイプ対照IgM MAb S−9(45)の試験及びフルオレセイン標識ヤギ抗マウス二次抗体のみの使用が含まれていた。フローサイトメトリー分析の場合、最後のインキュベーション後、細胞を上述のように洗浄し、500μlのDPBS緩衝液に懸濁した。フローサイトメトリーは、488nmでのアルゴンレーザー励起を装備したBD Biosciences社製FACSVantage SEを使用して実施した。各試料中の細胞を10,000個分析した(CellQuest Proソフトウェア)。
真菌チャレンジ及び防御の評価。2回目の追加免疫の2週間後、免疫マウス及び対照マウスを、上述のように及び以前に記述されているように(53)調製された致死用量の生菌C.アルビカンス酵母細胞(0.1mlのDPBS中5×105個)で静脈内(i.v.)感染させた。受動免疫されたマウス(以下)も、同じチャレンジ用量を受容した。防御は、動物生存を80〜100日間モニターすることにより評価した。マウスが瀕死状態になったかどうかを1日2〜3回モニターした。瀕死状態は、活力が低下し、餌又は水に無関心であり、指で触っても反応がないことと定義した。瀕死であるとみなした時点でマウスを犠牲にし、マウスの腎臓(幾つかの実験では、脳)を、DPBSでホモジナイズし、栄養寒天上に播種して、コロニー形成単位(CFU)を決定した。80〜100日後に実験を終了させ、その時点で生存していたマウスを全て犠牲にし、腎臓のCFUを以前と同じように評価した。CFUアッセイの最低検出限度は、腎臓一対当たり50CFUだった。
ポリクローナル抗体(PAb)の受動転移。ワクチン接種マウスに由来する血清中の抗体が、能動免疫により誘導された防御の少なくとも部分的な原因であったか否かを決定するために、ワクチン接種マウスからポリクローナル抗血清(PAb)を得て、貯留した。Fbaパルス処理DCで免疫したマウスに由来する免疫血清の貯留を、上述のようにELISAで力価測定した。PAb貯留を、−20℃で保存するか、又はC.アルビカンス酵母細胞で吸収させて保存した。ウサギ抗Fba血清の転移の場合、免疫前ウサギ血清を受容した1マウス群を、追加対照として使用した。試験の場合、マウスは、0.5mlの完全に強力な免疫血清又は対照血清をi.p.で受容した。4時間後に、全てのマウスにC.アルビカンス(5×105酵母細胞)をi.v.でチャレンジした。動物は全て、最初の投与の24時間後に、第2の用量(100〜200l)の血清又は緩衝液をi.p.で受容した。
腹腔内(i.p.)経路によるMAbの受動転移。MAb E2−9の予防効果は、上記のPAbでの実験と同じ注射スケジュールにより試験した。対照マウスは、同容積のDPBS希釈剤を受容した。濃縮MAb E2−9調製物をDPBSで希釈し、Fba−MAPでコーティングしたマイクロタイタープレートに対して、ELISA力価を10,000とした。これは、16μg/mlの抗体とほぼ等しい。マウスに注射する前に、抗体溶液を15,000×gで15分間遠心して、考え得る抗体凝集体を除去した。マウスでの試験の陰性対照物質は、C.アルビカンス酵母細胞で吸収されたMAb及びDPBSだった。各条件について、6〜8週齢の雌BALB/cマウス(Jackson Laboratories社)には、0.5mlの試験MAb又は対照物質を腹腔内投与し、その4時間後、1ミリリットルのDPBS当たり5×106個の酵母細胞を含有する0.1mlの懸濁液を静脈内に投与した。
統計分析。生存期間中央値を、Kaplan−Meier法で統計的に評価した(GraphPad Prism、バージョン4)。全ての分析で、1群当たりのマウスは5匹であり(n=5)、両側t検定を使用し、ほとんど全ての実験は、少なくとも2度繰り返した。
(実施例2)
3つの合成ペプチドによるワクチン接種は、マウスの播種性カンジダ症に対する抗体産生及び防御を誘導した。
3つの合成ペプチドによるワクチン接種は、マウスの播種性カンジダ症に対する抗体産生及び防御を誘導した。
C.アルビカンス担体ペプチドを、ヒト播種性カンジダ症の発病中に発現される細胞壁タンパク質から選択した(11、46、53)。本発明者らは、6つの候補担体を選択した。その各々は、真菌の細胞壁に位置すると推定される、それぞれの完全タンパク質のN末端付近に位置する14個アミノ酸で構成されていた(46、53)。括弧の中に示されているこの6つの候補担体ペプチドは、タンパク質フルクトース二リン酸アルドラーゼ(Fba);メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタマート(Met6);菌糸壁タンパク質−1(Hwp1);エノラーゼ(Enol);グリセリンアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gap1);及びホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk1)に由来していた。各合成ペプチドを、合成グリカンβ−(Man)3に化学的に結合させて、免疫原性を試験するための6つのグリコペプチドワクチン構築体を生成した。これらグリコペプチド結合体のうちの3つ、β−(Man)3−Fba、β−(Man)3−Met6、及びβ−(Man)3−Hwp1は、致死用量のC.アルビカンスでチャレンジした後、生存及び低腎臓真菌量により明らかなように高度な防御を誘導した(53)。これら以前の結果により、本発明者らは、担体ペプチドに対する応答もまた防御に寄与したか否かを検討するに至った。以前に記述されているような(49、53)、抗体の産生を促進する抗原パルス処理樹状細胞(DC)に基づくワクチン戦略により、6つのペプチド全てを試験した。結果は図1Aに示されている。
図1A〜1Cには、ペプチドパルス処理DCワクチンに対するBALB/cマウスにおける抗体応答が示されている。初回刺激及び最初の追加免疫の場合の、樹状細胞(DC)に提示された6つの合成ペプチド担体で免疫したマウスに由来する血清を、2回目の追加免疫の場合には、完全フロインドアジュバント(CFA)中で乳化し、ELISAで試験して、ペプチドに対する抗体応答を調べた。対照群は、ペプチドが使用されなかったか(DC+CFA)又はDPBSのみが各注射時点で使用されたという点を除いて、初回刺激及び追加免疫と同じ投与計画が行われたマウスで構成されていた。図1Aには、2回目の追加免疫の14日後に、ワクチン接種動物の1群当たり5匹のマウスの各々及び2つの対照群の5匹のマウスの各々から採取し、1:100希釈し、ELISAで試験した血清試料の結果が示されている。ペプチドは全て、マウスに抗体応答を誘導することができた。図1Bには、3つのペプチドワクチンが、播種性カンジダ症に対する防御応答をマウスに誘導したことが示されている。致死用量の生菌C.アルビカンスでチャレンジした後、ペプチドFba、Hwp1、及びMet6をワクチン接種したマウスは、いずれの対照群よりも有意に長い期間生存した(P<0.05)。図1Cには、Fba、Hwp1、及びMet6で免疫したマウスは、いずれの対照群と比較しても、大幅に低減されたか又は検出不能な(ND)腎臓一対当たりの生真菌コロニー形成単位(CFU)を示したことが示されている(p<0.001)。Pgk1で免疫したマウスも、対照と比較して、低減されたか又は検出不能な腎臓のCFUを示した。各パネルのバーは、各群の腎臓一対当たりのCFUの平均を示す。CFUアッセイの最低検出限度は、腎臓一対当たり50CFUだった。
6つのペプチドは全て、各々に特異的な抗体の力価が高いことにより示されたように、それ自体が免疫原性であった(図1A)。無作為配列の対照ペプチドを使用した。それらは、検出可能な特異的抗体応答を全く誘導しなかった(データ非表示)。加えて、種々の免疫−血清の各々とそれぞれの無関連ペプチドとの交差反応性の試験は、陰性だった(データ非表示)。また、6つの抗血清の各々は、間接免疫蛍光顕微鏡法により明らかなように、酵母型及び菌糸型の真菌と直接反応したが、陰性対照血清は、反応しなかった(データ非表示)。
興味深いことには、3つの担体ペプチドFba(配列番号1)、Met6(配列番号2)、及びHwp1(配列番号3)は、真菌でチャレンジしたマウスの生存及び低腎臓真菌量により明らかなように、高度な防御を誘導した(図1B及び1C)。Fba、Met6、又はHwp1ペプチドワクチンを受容した免疫群は、80日間にわたるチャレンジ後の観察期間中に40〜80%の生存を示し、致死用量の生菌真菌細胞をi.v.チャレンジした後、DPBS及びアジュバントのみの対照と比較して、有意により長い期間生存した。この結論は、2つの他のペプチドGap1又はEno1はいずれも、播種性カンジダ症に対する防御を誘導しなかったという長期観察により更に強化される(図1B)。重要なことには、Fba、Met6、及びHwp1に対して免疫された群の生存マウスは、死亡した動物と比較して(p<0.001)、播種性カンジダ症の標的器官である腎臓中で、低いか又は検出不能でさえある生真菌単位(コロニー形成単位、CFU)を示した(図1C)。Gap1又はEnol1のみで免疫されたマウスでは、腎臓の真菌量は、非免疫マウスと比較してわずかに少なかったが、その差は有意ではなかった。驚くべきことに、Pgk1も単独で、ある程度の防御を誘導した。また免疫マウスは、対照と比較して低いか又は検出不能な肝臓CFUを示した。これは、β−(Man)3−Pgk1免疫が実際には疾患を増強していたため(53)、予想外だった。
(実施例3)
Fbaペプチドは、MHCII限定のエピトープではない。
Fbaペプチドを、C57BL/6マウスで試験した。このマウスは、別の一般的近交系マウス系であるが、BALB/cマウスとは異なるMHCハプロタイプ及び免疫表現型を有する(35)。これら2つの系統は、実験的播種性カンジダ症に対する抵抗性又は感受性が異なる(2〜4)。Th1(C57BL/6)又はTh2(BALB/c)バイアスに関するマウス系統差に加えて、これら系統は、活性化されるマクロファージの能力が異なる(6)。上述のようなBALB/cマウスに使用した同じDCに基づく免疫手法により、C57BL/6マウスを、DPBS緩衝液又はDC+CFAを注射したマウスの対照群と比較して、単独で又は複合糖質として投与したFbaペプチドを用いて試験した。結果は、図2に示されている。
Fbaペプチドは、MHCII限定のエピトープではない。
Fbaペプチドを、C57BL/6マウスで試験した。このマウスは、別の一般的近交系マウス系であるが、BALB/cマウスとは異なるMHCハプロタイプ及び免疫表現型を有する(35)。これら2つの系統は、実験的播種性カンジダ症に対する抵抗性又は感受性が異なる(2〜4)。Th1(C57BL/6)又はTh2(BALB/c)バイアスに関するマウス系統差に加えて、これら系統は、活性化されるマクロファージの能力が異なる(6)。上述のようなBALB/cマウスに使用した同じDCに基づく免疫手法により、C57BL/6マウスを、DPBS緩衝液又はDC+CFAを注射したマウスの対照群と比較して、単独で又は複合糖質として投与したFbaペプチドを用いて試験した。結果は、図2に示されている。
図2には、C57BL/6マウスにおける、Fbaペプチドワクチン又は対照に対する抗体応答が示されている。2回目の追加免疫の14日後に、免疫血清を、ELISAにより試験して、Fbaペプチドに対する抗体応答を調べた。ELISA力価は、合成ペプチドFba−MAPでコーティングされたプレートで測定したところ、2つの対照群と比較して、ペプチドに対して比較的強力な特異的抗体応答を示した。最初の追加免疫の後で、IgMからIgGへのFba特異的抗体のアイソタイプスイッチが、免疫マウスに由来する血清で観察された(データ非表示)。
受動転移実験用に十分な抗血清を得るために、及びFbaペプチドが免疫学的に他の動物種に限定されるか否かを決定するために、本発明者らは、商業的業者(Genscript社)から、このペプチドに対するウサギ抗血清を得た。ウサギ免疫の前に、Fbaを、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)に結合させた。2匹のウサギの各々に由来する、力価が512,000の抗Fbaペプチド免疫血清を得た。これは、FbaペプチドがMHC限定エピトープではなく、ヒトを含む他の哺乳動物で免疫原性であり得るという追加の証拠を示す(データ非表示)。
(実施例4)
Fba−DCワクチン接種は、様々なC.アルビカンス株でチャレンジしたマウスを防御する。
Fba−DCワクチン接種は、様々なC.アルビカンス株でチャレンジしたマウスを防御する。
Fbaペプチドパルス処理DCによるワクチン接種が、異なるC.アルビカンス株でチャレンジしたマウスを防御するか否かを試験するために、本発明者らは、C.アルビカンスの最も一般に使用されている研究用の臨床分離株であるC.アルビカンス株SC5314(ATCC)で免疫マウスをチャレンジした。陽性対照として、同時に免疫した第2群のマウスを、C.アルビカンス株3153Aでチャレンジした。結果は、図3A〜3Dに示されている。
図3A〜3Dには、Fbaペプチドワクチンが、BALB/cマウスに、様々なC.アルビカンス株により引き起こされた播種性カンジダ症に対する防御応答を誘導したことが示されている。樹状細胞手法によるFbaペプチドでのワクチン接種は、真菌株に関わらず、対照群と比較して、実験的播種性カンジダ症に対する有意な防御をマウスに誘導した。図3Aでは、致死用量のC.アルビカンス原型株(SC5314)でチャレンジしたワクチン接種マウスは、DC+CFA又はDPBSを受容した対照マウスと比較して、生存期間の有意な延長を示した(P<0.01)。生存データと一致して、免疫マウスは、対照マウスと比較して(P<0.01)、腎臓のCFUが大幅に低減されたか又は検出不能だった(図3B)。免疫マウスをC.アルビカンス株3153Aでチャレンジすると、同様の結果が得られた(図3C、生存曲線;及び図3D、腎臓のCFU)。
(実施例5)
BALB/c及びC57BL/6マウスのワクチン効力:抗体価及び生存研究。
上記に示されているように(図2)、Fbaペプチドも、C57BL/6マウスに強力な抗体応答を誘導した。C57BL/6マウスは、Th1応答を起こしやすい傾向があり、Th2、及びしたがって抗体応答を起こしやすい傾向のあるBALB/cマウスよりも、播種性カンジダ症に対してより抵抗性であると推定される。したがって、Fbaワクチンの一般的な効力を決定するために、免疫C57BL/6マウスが、播種性カンジダ症から防御されていた否かを試験した。結果は、図4A〜4Cに示されている。
BALB/c及びC57BL/6マウスのワクチン効力:抗体価及び生存研究。
上記に示されているように(図2)、Fbaペプチドも、C57BL/6マウスに強力な抗体応答を誘導した。C57BL/6マウスは、Th1応答を起こしやすい傾向があり、Th2、及びしたがって抗体応答を起こしやすい傾向のあるBALB/cマウスよりも、播種性カンジダ症に対してより抵抗性であると推定される。したがって、Fbaワクチンの一般的な効力を決定するために、免疫C57BL/6マウスが、播種性カンジダ症から防御されていた否かを試験した。結果は、図4A〜4Cに示されている。
図4A〜4Cには、Fbaペプチド−DCワクチン又はβ−(Man)3−Fbaパルス処理DCのいずれかに対してマウスを免疫した際の、実験的播種性カンジダ症に対するC57BL/6マウスの防御応答が示されている。図4Aは、ペプチドで免役したマウスが、DPBS及びDC+CFA対照マウスよりも、有意に長い期間生存した(P<0.01)ことを示す。図4B及び4Cには、実験を生き残った免疫マウスが、対照と比較して、腎臓(P<0.01)(図4B)及び脳(P<0.001)(図4C)で、大幅に低減されたか又は検出不能な50CFU/gを超える生菌CFUを示すことが見出されたことが示されている。図4B及び4Cの各パネルのバーは、各群のCFUの平均を示す。CFUの各値は、各個々のマウスを表わす。β−(Man)3−Fba処理DC(3番目の欄)のデータポイントは、これらワクチン接種マウスのCFU数が、50CFU/g未満だったため示されていない。Fba−DCの場合、1匹のマウスが、50CFU/gを超える脳CFU示し、したがって、単一のデータ点が示されている。残りの4匹のマウスは、組織1g当たり50未満のCFUを示した。
BALB/cマウスで観察されたように(53)、Fbaペプチドパルス処理DCによるワクチン接種は、このマウス株に実験的播種性カンジダ症に対する防御を誘導した(図4A)。具体的には、Fbaペプチドワクチン接種は、DPBS対照又はアジュバントのみのワクチン接種の生存期間と比較して、BALB/c(53)及びC57BL/6マウスの両方の生存期間延長をもたらした。生存データと一致して、観察期間を生き残った免疫マウスは、真菌でi.v.チャレンジ後に瀕死状態になった際に犠牲にされた対照と比較して、大幅に低減されたか又は検出不能な腎臓及び脳の生真菌単位CFUを示した(図4B及び4C)。
(実施例6)
抗Fbaペプチド免疫血清は、未感作マウスに受動防護をもたらす。
誘導された抗Fba抗体応答が、少なくとも部分的に防御の原因であるか否かという問いに答えるため、致死用量のC.アルビカンスをi.v.でチャレンジする4時間前に、免疫マウスから抗血清を採取し、未感作マウスにi.p.で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌C.アルビカンス酵母細胞で吸収された免疫血清又はDPBS緩衝液のいずれかを投与した。Fbaペプチドパルス処理DCで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。
抗Fbaペプチド免疫血清は、未感作マウスに受動防護をもたらす。
誘導された抗Fba抗体応答が、少なくとも部分的に防御の原因であるか否かという問いに答えるため、致死用量のC.アルビカンスをi.v.でチャレンジする4時間前に、免疫マウスから抗血清を採取し、未感作マウスにi.p.で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌C.アルビカンス酵母細胞で吸収された免疫血清又はDPBS緩衝液のいずれかを投与した。Fbaペプチドパルス処理DCで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。
図5A〜5Cに示されているように、免疫マウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御の原因だった。免疫した14日後に、樹状細胞手法によりFbaペプチドに対して免疫されたマウスから血清を採取した。免疫血清を貯留し、上記の実施例1に記載のように、実験的播種性カンジダ症に対する未感作マウスの受動防護を試験した。図5Aには、生存曲線が示されており、Fbaペプチドで免疫したマウスに由来する血清を受容したマウスでは、対照物質を受容した動物と比較して、播種性C.アルビカンス感染症に対する防御の増強が観察されたことが示されている。防御の陽性対照として使用した供与体マウスは、免疫血清を受容した未感作マウスと同様の生存曲線を示したことに留意されたい。転移前のC.アルビカンスでの吸収が、免疫血清の防御価値を取り去ったということも重要である。図5Bには、免疫マウス及び抗血清を受容したマウスは、DPBS緩衝液又はC.アルビカンス酵母細胞で事前に吸収されていた同じ血清を受容した対照群と比較して、有意に少数(P<0.0001)の真菌計数又は検出不能な腎臓CFUを示したことが示されている。図5Cには、特異的な抗Fbaポリクローナル抗体(PAb)を含有するウサギ免疫血清も、播種性カンジダ症に対するある程度の防御をマウスにもたらしたことが示されている。ウサギ免疫血清処理群は、吸収されたウサギ血清、又はウサギ免疫前血清、又はDPBS緩衝液を受容した対照群と比較して、生存期間の延長を示した。
チャレンジ後、免疫マウス及び抗血清で処置したマウスは、2つの対照群と比較して生存期間の延長を示し(図5A)、それと一致して、抗血清を受容したマウスは、腎臓の真菌計数を有意に低減させた(図5B)。このデータは、抗Fbaペプチド抗体が、完全にとまではいかなくとも、少なくとも部分的に、真菌での致死的チャレンジに対する防御の原因であることを強く支持している。
市販のウサギ抗Fba血清の場合、抗Fba免疫血清及び免疫前血清の両方を、マウス脾細胞に吸収させて、ウサギ天然抗マウス細胞障害性抗体の可能性を除去した。陰性対照として、脾細胞吸収後、ウサギ抗Fba免疫血清を、今度は生菌C.アルビカンス酵母細胞に再び吸収させて、Fba特異的抗体を除去した。抗Fba抗体価を、真菌細胞での吸着前後にELISAにより試験した。Fba抗体は、吸着後には、もはや検出可能ではなかった(データ非表示)。ウサギ抗血清で処置したマウスは、対照群と比較して、実験の終了時に40%の生存率及び全生存期間の延長を示した(図5C)。これも、抗Fba抗体がカンジダ症に対する防御に役割を果たしていることを支持する。ウサギ免疫血清による防御が、マウス抗Fba血清と比較して比較的弱い理由は判明していないが、ウサギ抗体のFcRエフェクター機能の効力がマウス系内ではより低いためであると考えることは十分に可能である(1)。
(実施例7)
ミョウバンと共に投与したFbaペプチドは、カンジダ症に対する中程度の防御を誘導する。
ミョウバンと共に投与したFbaペプチドは、カンジダ症に対する中程度の防御を誘導する。
ワクチンをヒト使用により適切にするために、Fbaペプチドを、2つのアジュバント:ミョウバン(水酸化アルミニウムゲル、Sigma社)又はMPL(リピドA、モノホスホリル、Sigma社)の1つとの混合物として投与した。1、21、及び42日目に、50μgミョウバン又は10μg MPLのいずれかと混合した2.5μgのFbaペプチドを含有する0.2mlを皮下(s.c.)注射することにより、マウスを免疫した。陰性対照群のマウスには、同様の容積のDPBS緩衝液又はアジュバントのみを投与した。血清試料を、免疫14日後に採取し、1:100に希釈し、合成Fba−MAPペプチドでコーティングされたプレートでのELISAで試験した。結果は、図6A〜6Cに示されている。
図6A〜6Cには、ヒト用に認可されているミョウバンと共に投与したFbaペプチドワクチンで、播種性カンジダ症に対して免疫したマウスの応答が示されている。図6Aには、免疫14日後に採取し、1:100に希釈した血清試料を使用してELISAで試験し、合成Fba−MAPでコーティングされたプレートでELISAにより試験したFba抗体の量が示されている。最初の追加免疫後、ミョウバン又はMPLのいずれかで調製したFbaペプチドで免疫したマウスに由来する免疫血清は、Fbaペプチドに対する抗体応答が、DPBS又はアジュバントのみを受容した群に由来する血清の抗体応答よりも5〜8倍高いことを示した。図6Bには、マウスの生存率が示されおり、DPBS又はアジュバント非免疫対照と比較して、ミョウバンがアジュバントとして使用された場合は、中程度の防御免疫がFbaペプチドにより誘導され、MPLがアジュバントとして使用された場合は、わずかな防御が観察されたことが示されている。また、ミョウバン又はMPLのみを受容したマウスでは、DPBSと比較して、生存期間がわずかに延長されたが、その差は、統計的に有意ではなかった。図6Cには、Fba−ミョウバン又はFba−MPLのいずれかで免疫したマウスは、DPBS対照群又はアジュバント単独群と比較して、有意に低減された腎臓一対当たりの生真菌単位(CFU)が示されている(P<0.01)。
最初の追加免疫後、ミョウバン又はMPLのいずれかで調製したFbaペプチドで免疫したマウスに由来する免疫血清は、いずれの調製物に対する抗体応答も、DPBS又はアジュバントのみを受容したマウスから得たバックグラウンド血清よりも5〜8倍高いことを示した。2回目の追加免疫の後、IgMからIgGへのFba特異的抗体のアイソタイプスイッチが、免疫マウスに由来する血清で観察された(データ非表示)。これは、免疫記憶応答の誘導を示唆した。加えて、ワクチン接種群は、致死用量のC.アルビカンス細胞でチャレンジした後、2つの対照群と比較して、生存期間の延長を示したが(図6B)、防御は、DC+CFA手法により誘導されたものほど強力ではなかった。ミョウバンと共に投与したFbaペプチドで免疫したマウスは、40%の生存率を示したが、MPLのみを有するFbaは、対照群と比較して、わずかな防御を誘導したに過ぎなかった。生存期間の延長に加えて、免疫マウスは、予想通り、腎臓の生真菌細胞を低減させた(図6C)。
(実施例8)
Fbaモノクローナル抗体(MAb)は、真菌細胞表面に結合する。
Fbaペプチドに特異的なMAbを、標準的ハイブリドーマ技術を使用することにより得た。細胞融合の後、特異的抗体を生成するハイブリドーマを、限界希釈法により4回クローニングし、そのうち48個の抗Fba IgMクローン及び12個の抗Fba IgGクローンを選択した。アイソタイプがイムノグロブリンM(IgM)と決定されたモノクローナル抗体(MAb)E2−9、B7−18、及びB7−22を産生したクローンを、BD無血清培地中で選択及び増殖させた。
Fbaモノクローナル抗体(MAb)は、真菌細胞表面に結合する。
Fbaペプチドに特異的なMAbを、標準的ハイブリドーマ技術を使用することにより得た。細胞融合の後、特異的抗体を生成するハイブリドーマを、限界希釈法により4回クローニングし、そのうち48個の抗Fba IgMクローン及び12個の抗Fba IgGクローンを選択した。アイソタイプがイムノグロブリンM(IgM)と決定されたモノクローナル抗体(MAb)E2−9、B7−18、及びB7−22を産生したクローンを、BD無血清培地中で選択及び増殖させた。
図7A〜7Cには、MAbがSDS−PAGEにより検出され、MAb E2−9とのFba反応の特異性が、阻害ELISAにより決定されたことが示されている。図7Aでは、IgM MAb(E2−9、B7−18、及びB7−22)を産生するクローンが、BD無血清培養中で選択及び増殖された。対応するサイズを有するE2−9及びB7−18の重鎖及び軽鎖が、還元条件下の12.5%SDS−PAGEゲルで示された。図7Bでは、E2−9、B7−18、及びB7−22のアイソタイプが、IgM分子と一致する全分子サイズを示すSDS−PAGEにより示されているように、IgMであることが確認されている。図7Bには、非還元条件下で実施された10%SDS−PAGEゲルのウエスタンブロットにより観察したところ、IgM五量体が推定され、精製された抗Fba IgM MAb(E2−9)の分子量が、900kDと推定されたことが示されている。図7Cには、抗FbaペプチドMAb E2−9のELISA阻害データが示されている。合成Fbaペプチドを阻害剤として使用して、MAb E2−9とFbaペプチドとの反応及び結合親和性を決定した。各点は、3回の測定の平均であり、全て実験は、同様の結果をもたらしたが、示されているデータは、4回の独立実験のうちの典型的な実験のものである。50%阻害濃度を達成するのに必要な阻害剤(Fbaペプチド)の濃度は、約10μg/mlだった。還元条件下及びヤギ抗マウスIgGAM(H+L)−HRP抗体で発色させたウエスタンブロットによるポリペプチド鎖の確認では、E2−9及びB7−18の重鎖及び軽鎖は、それぞれ50KDa及び25KDaの正しい対応サイズを示した(図7A)。MAbのIgM五量体(約900KDa)が、非還元SDSゲルから、ヤギ抗マウスIgGMA HRP抗体で発色させたウエスタンブロット分析により検出された(図7B)。クローンE2−9は、十分に増殖し、クローンB7−18及びB7−22と比較してより速く増殖し、高い力価の抗Fba抗体を一貫して高度に産生した。したがって、E2−9を更なる研究に使用した。Fbaペプチドに対するE2−9の反応は、ELISA阻害アッセイにより決定した(図7C)。このアッセイでは、可溶性合成ペプチドFbaは、MAb E2−9と固相Fbaとの反応性を効果的に阻害した。
また、MAb E2−9は、C.アルビカンスの細胞表面のFbaペプチドとのその特異的反応性を確認するための間接免疫蛍光抗体検査により検出された。図8Aには、MAb E2−9を使用して共焦点顕微鏡鏡分析で検出したところ、新しいC.アルビカンス酵母細胞及び菌糸並びにホルムアルデヒドで固定したC.アルビカンス酵母細胞及び菌糸の両方でFbaペプチドが示された。図8Aに示されているように、ペプチドFbaは、真菌表面で発現され、E2−9は、酵母型及び菌糸型の真菌の両方に結合した。β−(Man)3に特異的であるMAb B6.1を、陽性対照として使用した。図8Bでは、C.アルビカンス細胞表面に発現されたFbaペプチドとMAb E2−9との結合を、フローサイトメトリー分析を使用することにより更に確認した。C.アルビカンス細胞表面エピトープβ−トリマンノースに特異的なMAb B6.1と比較して、生菌C.アルビカンス細胞とのMAb E2−9の反応性は、比較的わずかだった。図8Cでは、重要な追加の陰性対照により、MAb E2−9及びB6.1の結合が、Fba又はβ−トリマンノースエピトープをいずれも発現するはずではない生菌サッカロマイセス・セレビシエで生じるか否かが試験された。いずれのMAbも、S.セレビシエの細胞表面に結合しなかった。
豊富に発現される細胞表面エピトープ、β−1,2−マンノトリオースに結合し、播種性カンジダ症からマウスを防御する(25、28)MAb B6.1を、真菌細胞表面に結合するIgM抗体の陽性対照として使用した。MAb E2−9を他のカンジダ種に対して試験しても、交差反応性は検出されなかった(データ非表示)。これは、Fba14量体アミノ酸ペプチドは、以前に報告されているように(53)、C.アルビカンスに特有であるはずであるため、予想通りであった。また、C.アルビカンスの細胞表面とのMAb E2−9の反応性を、フローサイトメトリー分析により実証した(図8B)。また、MAb B6.1を、C.アルビカンス酵母細胞表面に結合する抗体の陽性対照として使用した。MAb E2−9は、野生型C.アルビカンス3153Aと反応したが、予想通り、この抗体は、他のカンジダ種(C.グラブラタ及びC.クルセイ;データ非表示)又はS.セレビシエの単離株を標識しなかった(図8C)。
(実施例9)
IgM MAb(E2−9)は、受動転移実験で、全身性カンジダ症に対する防御の増強を付与した。
IgM MAb(E2−9)は、受動転移実験で、全身性カンジダ症に対する防御の増強を付与した。
上記の例では、Fba−DCワクチン手法又はミョウバンアジュバントに懸濁したペプチドでの免疫のいずれかにより誘導された抗Fba抗体の防御能力が示された。Fbaペプチドに特異的なモノクローナル抗体の発生は、in vivoで応用するための防御抗体の無制限供給をもたらす可能性を提供する。MAb E2−9を研究用に選択し、上述のように受動転移実験で試験し、ポリクローナル抗血清による防御を示した。結果は、図9A〜9Bに示されている。
図9A及び9Bは、抗Fba IgM MAb(E2−9)が、播種性カンジダ症からマウスを防御したことを示した。細胞培養により産生されたMAb E2−9が、実験的播種性カンジダ症からマウスを防御することができたことを確認するために、MAb E2−9(16μg/ml、0.5ml)を、C.アルビカンスのi.v.チャレンジの4時間前に未感作マウスに投与し、更に0.2mlのMAb E2−9を初回投与の24時間後に投与した。β−(Man)3−Fba結合体で免疫したマウスを、生存の陽性対照として使用し、DPBS及びC.アルビカンス酵母細胞により吸収されたMAb E2−9を、陰性対照として未感作マウスに投与した。図9Aに示されているように、MAb E2−9を受容したマウスは、DPBS又は吸収されたMAb E−9陰性対照群と比較して(P<0.001)、β−(Man)3−Fbaで能動的に免疫した陽性対照群と同様の生存期間の延長を示した。加えて、未感作マウスへのMAb E2−9の受動転移は、DPBS又は吸収されたMAb E2−9を投与したマウスの真菌量と比較して(P<0.001)、腎臓真菌量を、能動的に免疫した生存マウスと同様のレベルに低減させた(図9B)。したがって、MAb E2−9のi.p.投与を受容したマウスは、対照動物と比較して、生存期間の延長を示し、腎臓の真菌量を低減させた。重要なことには、受動防護は、転移の前にカンジダ細胞で吸収することによりMAbを除去することにより妨げられた。これは、防御がMAb E2−9によることを証明する強力な追加証拠を提供した。
したがって上記の例を要約すると、6つの誘導ペプチドは全て(配列番号1〜6)は、その後の免疫用にDCをパルス処理するために単独で使用した際に、抗体応答を誘導し、3つのペプチドFba(配列番号1)、Hwp1(配列番号3)、及びMet6(配列番号2)は、真菌でチャレンジしたマウスの生存及び低腎臓真菌量により明らかなように高度な防御を誘導した。ワクチン接種を受けたマウスは、非生存対照と比較して、明らかにより少ない腎臓真菌量を示した。実際、CFU量は、3つのペプチドに対してワクチン接種したマウスの幾つかの腎臓では検出可能ではなかったが、これは、対照群では全く起こらなかった。生存期間の延長と、腎臓CFUの有意な低減又はクリアランスとの組み合わせは、ワクチンにより誘導された防御を示す強力な証拠を提供した。ロバストな抗体反応及び3つの防御性ペプチドの中で最も良好な防御を誘導した1つの特定のペプチドFbaを、新規ワクチン候補として更に研究した。Fbaペプチドエピトープのみは、異なる系統のマウス及びウサギでの特異的抗体産生により示されるように免疫原性であるため、MHC II限定的ではない。過免疫された動物は、抗体のIgM及びIgGクラスを両方とも産生し、記憶細胞の産生及び長期間の免疫学的応答性の可能性を示唆した。
また、本発明者らは、ミョウバンをアジュバントとして使用して、ヒト使用により許容される製剤を用いて、播種性カンジダ症に対する防御を提供する有効なワクチン組成物を示した。Fbaペプチド及びミョウバンの組み合わせで免疫したマウスは、非免疫対照と比較してより低い腎臓CFU及び生存の増加という点で統計的に有意だった、播種性カンジダ症に対する防御を示した。Fbaペプチドに特異的な抗体活性は、未感作マウスに防御を付与した全免疫血清の受動転移に関する実験により実証されたように、抗カンジダ防御の少なくとも部分的な原因であると考えられる。そのような防御は、対照出血前正常マウス血清によっては付与されず、免疫血清が、受動転移防御試験の前に真菌細胞により事前に吸収されていた場合には、防御は抑制された。また、Fbaエピトープに特異的なMAb E2−9の、播種性カンジダ症に対する防御能力を、in vivoで実証した。また、本発明者らは、Fbaペプチドエピトープが、真菌細胞表面に発現され、抗体により接近可能であることを示した。したがって、付着の妨害は、調査すべき合理的な機序である。
Fba1pは、発酵性及び非発酵性炭素源の両方での増殖に必要とされる重要な酵素であり、したがって、この酵素は、C.アルビカンス及び他のカンジダ種の生存能にとって不可欠である(48)。しかしながら、Fba1pは、野生型レベルの5%未満に枯渇しなければ、増殖を妨害することはない(48)。Fba1p枯渇は、C.アルビカンスに対して殺滅効果ではなく静的効果を発揮すると考えられる。したがって、たとえ細胞表面でのFba1pの役割が未知であっても、Fba1pに対する抗体が、患者に感染するC.アルビカンスの増殖を予防し得ることは考えられることである。したがって、ペプチド特異的なMAb E2−9は、単独で又は他の抗真菌薬物と組み合わせて、播種性カンジダ症に対する免疫療法として使用される能力を示すことができる。免疫抑制された患者でワクチンを使用する場合の考え得る制限は、これら患者が、必ずしも防御応答を開始しない場合があるということであるが、防御抗体での受動免疫は、迅速で有効な予防手段又は治療手段でさえあり得る。この免疫学的予防の効力は、侵襲性カンジダ症の患者でMycograb及びアムホテリシンB(AmpB)を使用して示されているように、従来の抗真菌療法と組み合わせて使用すると増大させることができる(44)。また、MAb B6.1は、AmpBの治療効力を増強することが示された。これは、治療に必要な抗真菌剤の量を無毒レベルに低減することに結び付く場合がある(24)。E2−9は、菌糸細胞表面に結合することが示された。これは、機能的なFbaエピトープが菌糸細胞表面の抗体に接近可能であることを示しているが、本発明者らの最近のデータは、免疫血清及びMAb E2−9はいずれも、カンジダ酵母又は菌糸増殖の著しい阻害性を発揮しないことをin vitroで示した(データ非表示)。本発明者らは、MAb B6−1及びE2−9の組み合わせが、マウスの防御免疫性を相乗効果的に誘導することができると考える。MAb B6.1抗体は、感染前に投与されると防御活性を示し、感染後に投与されると、わずかな治療活性を示した(25)。MAb B6.1は、C.アルビカンスのホスホマンナン複合体の酸不安定成分であるβ−1,2−結合マンノトリオースに特異的である。このエピトープは、免疫蛍光法により明らかにされたコンフルエント分布パターンにより示されるように、主要な表面マーカーであると考えられる。播種性カンジダ症に対するMAb E2−9の予防(preventive)又は予防(prophylactic)活性は、MAb B6.1の予防活性と比較されなかった。生存期間中央値に基づくと、両抗体は、同様の防御活性を示した。本発明者らは、これら2つの異なるMAbは、防御の機序が異なる可能性があるため、相乗効果を発揮し、一緒に作用して強固な防御を実現することになると考える。
(実施例10)
より一般的な真菌ワクチンの開発及び試験
ペプチド設計。上述のように、ヒトカンジダ症の発病中に細胞壁位置で発現することが知られていることに基づいて、6つの細胞壁タンパク質を考え得る担体として選択した。それらには、以下のものが含まれていた:菌糸壁タンパク質−1(Hwp−1);エノラーゼ(Enol);ホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk1);グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gap−1);フルクトース二リン酸アルドラーゼ(Fba);及びメチルテトラヒドロプテロイルトリグルタマート(Met6)。エピトープ発見用アルゴリズム(http://www.genscript.com/cgibin/tools/antigenic_prediction.pl)を応用することにより、以下の14量体ペプチドを選択して合成した。それらの全ては各タンパク質群のN末端付近に位置する:Hwp1、QGETEEALIQKRSY(配列番号3);Eno1、DSRGNPTVEVDFTT(配列番号4);Pgk1、VPLDGKTITNNQRI(配列番号6);Gap1、NRSPSTGEQKSSGI(配列番号5);Fba、YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1);及びMet6、PRIGGQRELKKITE(配列番号2)。合成ペプチドは、商業的に生成されたか(GenScript社)又は自動ペプチド合成機の使用により合成されて、β−マンナントリサッカライドエピトープに結合され、これら結合体に基づくワクチンの効力が報告された(53)。
より一般的な真菌ワクチンの開発及び試験
ペプチド設計。上述のように、ヒトカンジダ症の発病中に細胞壁位置で発現することが知られていることに基づいて、6つの細胞壁タンパク質を考え得る担体として選択した。それらには、以下のものが含まれていた:菌糸壁タンパク質−1(Hwp−1);エノラーゼ(Enol);ホスホグリセリン酸キナーゼ(Pgk1);グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gap−1);フルクトース二リン酸アルドラーゼ(Fba);及びメチルテトラヒドロプテロイルトリグルタマート(Met6)。エピトープ発見用アルゴリズム(http://www.genscript.com/cgibin/tools/antigenic_prediction.pl)を応用することにより、以下の14量体ペプチドを選択して合成した。それらの全ては各タンパク質群のN末端付近に位置する:Hwp1、QGETEEALIQKRSY(配列番号3);Eno1、DSRGNPTVEVDFTT(配列番号4);Pgk1、VPLDGKTITNNQRI(配列番号6);Gap1、NRSPSTGEQKSSGI(配列番号5);Fba、YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1);及びMet6、PRIGGQRELKKITE(配列番号2)。合成ペプチドは、商業的に生成されたか(GenScript社)又は自動ペプチド合成機の使用により合成されて、β−マンナントリサッカライドエピトープに結合され、これら結合体に基づくワクチンの効力が報告された(53)。
新しいペプチドは、C.アルビカンス、C.グラブラタ、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、A.ニガー(A.niger)、A.ニデュランス(A.nidulans)、ピキア・スチピチス(Pichia stipitis)、P.ギリエルモンジィ(P.guilliermondii)、及びS.セレビシエを含む、より幅広い真菌種に対して、ワクチンを有効にするために設計した。考え得る普遍的なエピトープを捜して、Fbaタンパク質のN末端領域の更なる探索を実施した。複数の真菌種で発現されたFbaに基づく14個アミノ酸のペプチドを特定した。これらペプチドの1つを「Fba2」(FAIPAINVTSSSTV)(配列番号7)と命名し、複数の真菌種により発現されることを見出した。
下記に示されているように、Fba2を用いた初期研究は、防御の提供に関してはやや期待外れだった。したがって、より良好なエピトープを製作するために、フランキング配列をFba2に付加して、Fba2の末端に5個の追加アミノ酸を含む19個アミノ酸ペプチドであるFba3を製作した。Fba3の配列は、FAIPAINVTSSSTVVAALE(配列番号8)である。加えて、より短い9個アミノ酸ペプチドであるFba4を製作した。Fba4の配列は、SSSTVVAAL(配列番号9)である。加えて、Met6に基づく新しいペプチドを、多数の真菌種での発現に基づいて設計し、Met6−2と命名した。Met6−2の配列は、YDQVLDLSLLFNAIP(配列番号10)である。これら4つの新しいペプチド、Fba2、Fba3、Fba4、及びMet6−2を、実施例1に上述されている方法により、ワクチンとしての有効性に関して試験した。
ワクチンとしてのFba2、Fba3、Fba4、及びMet−6−2の効力:上記のペプチドが、抗体をBALB/cマウスに誘導し、播種性カンジダ症に対する防御を提供する能力を、実施例1に記載の方法により試験した。上述のように多少の変更を加えて、骨髄からDCを生成した。手短かに言えば、安楽死させたマウスの長骨からRPMI−1640で洗い流した骨髄を、穏やかにピペットし、70−mm細胞ストレーナーでろ過して、細胞塊を解離させた。赤血球細胞を細胞溶解し(ACK細胞溶解緩衝液、0.15M NH4Cl、1.0mM KHCO3、0.1mM EDTA)、残留骨髄細胞を、完全培地[「CM」、10%FBS(FBS)、2mM L−グルタミン、1%非必須アミノ酸、及び100単位/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンで補完されたRPMI−1640]に懸濁し、2×105細胞/mlに調整し、5ml/ウェルで6ウェルプレートに配置し、40ng/mlのrmGM−CSF及びrmIL−4(R&D Systems社)の存在下で、37℃、5%CO2にて最長9日間培養した。培養の4日目及び7日目に、同量の新しいGM−CSF及びIL−4をウェルに添加した。
DC集団を単離するために、細胞を、2〜4mlの暖かいCMに懸濁し、CM中の同容積の14.5%(w/v)Nycodenz(Sigma社)に上乗せし、1200×gで20分間22℃にて遠心分離した。遠心分離した後、界面の細胞を収集し、CMで3回洗浄し、表現型分析及び機能分析にかけた。フローサイトメトリー分析、及びCD11c、CD11b、CD19、及びCD3e(eBioscience社)に特異的なMAbの使用により、細胞の80%超がDCだったことが示された。
免疫原及び免疫。DCを、上述のようにin vitroでワクチンを用いてパルス処理した。手短かに言えば、6日目に、培養中のDCを、目的の抗原(1μM)でパルス処理した。7日目に、PGE2(10−7〜10−9M)を、LPS(2μg/ml、Sigma社)と共に、24時間添加した。9日目に、抗原パルス処理DCをよく洗浄し、200μl DPBS中の5×105個を、マウスに腹腔内投与(i.p.)した。14日目に、マウスを、新しい抗原パルス処理DCで追加免役し、28日目に、完全フロインドアジュバント(CFA)中で乳化された抗原(10μg)で、2回目の追加免疫を行った。
免疫マウスに由来する免疫血清中の抗基本ペプチド抗体価の血清学アッセイ:血清の抗体価を、ELISA分析した。対照群は、初回刺激及び最初の追加免疫時にDCのみを投与し、その後2回目の追加免疫時にDPBSを投与したマウス、初回刺激及び最初の追加免疫時にDPBS及び2回目の追加免疫時にCFAのみを投与したマウス、3回の注射全てでDPBSのみを投与したマウス、又は初回刺激及び最初の追加免疫時にDCのみを投与し、その後2回目の追加免疫時にCFAのみを投与したマウスで構成されていた。手短かに言えば、合成ペプチドを、10μg/mlでPBS(pH7.4)に溶解した。各々を使用して、96ウェルELISAプレートをコーティングし、各免疫血清及び対照血清の試料の連続2倍希釈物を重複して試験した。各ウェルの発色は、二次抗体(ヤギ抗マウス多価イムノグロブリン−HRP、Sigma社)及び基質(O−フェニレンジアミン及びH2O2)により達成し、光学密度(OD)を492nmで決定した。
真菌チャレンジ及び防御の評価。2回目の追加免疫の2週間後、免疫マウス及び対照マウスを、致死用量の生菌C.アルビカンス酵母細胞(0.1mlのDPBS中5×105個)でi.v.感染させた。受動免疫されたマウスも、同じチャレンジ用量を受容した。防御は、最長120日間動物生存をモニターすることにより、及び腎臓一対当たりのCFU数(平均±SE)を定量化することにより評価した。生存期間中央値(MST)を、Kaplan−Meier法で統計的に評価した(GraphPad Prism、バージョン4)。全ての分析で、1群当たりのマウスは5匹であり(n=5)、両側t検定を使用した。
ワクチンとしてのFba2:Fba2を使用して、上述のようにin vitroでDCをパルス処理し、Fba−DCを陽性対照として使用した。血清試料を各注射後に試験した。陽性対照として、抗Fba応答も試験した。図10Aに示されているように、Fba2は、良好で特異的な抗体応答をBALB/cマウスに誘導することができた。陽性対照として、抗Fba応答も試験した。その結果は、図10Bに示されている。
しかしながら、マウスに防御を提供する能力を試験すると、Fba2ペプチドは、図11に示されているように良好な防御を誘導しなかった。Fba2で免疫したマウスは、DC+CFAのみを注射した対照群と比較して、生存期間に有意差を示さなかった。
他の合成ペプチド。また、他の基本ペプチドが抗体応答を誘導する能力を試験した。図12に示されているように、Fba3、Fba4、及びMet6−2は、ELISAにより試験すると、BALB/cマウスに抗体応答を誘導することができた。しかし、抗Fba応答と比較して、これら3つのペプチドに対する抗体応答は、それほど著しくはなかった。しかしながら、このより低い結果は、ELISAによる抗Fba応答の試験では、リジンコアがFbaペプチドエピトープの8つのコピーを担持する複数の抗原性ペプチド(MAP)に結合されたFbaペプチドでコーティングされたマイクロタイタープレートが使用されたことを反映している可能性がある。基本ペプチドで実施したように、プレートをコーティングするためにペプチドのみを使用する場合、抗体検出の感度がより低い場合がある。
C.アルビカンス細胞表面に発現される基本ペプチドに対する、免疫血清中の抗体の結合を特異的に試験するために、フローサイトメトリー分析法を使用した。生真菌細胞を免疫血清と反応させ、その後、ヤギ抗マウスFITC結合二次抗体と反応させた。陰性対照は、正常マウス血清と反応させた細胞で構成されていた。陽性対照は、豊富に及び均一に発現される細胞表面エピトープであるβ−マンノトリオースに特異的なモノクローナル抗体であるMAb B6.1だった。これらのデータは、ペプチドFba、Fba3、Fba4、及びMet6−2が、真菌表面で発現され、免疫血清中の抗体に接近可能であることを示す。したがって、Fba3、Fba4、Fba、及びMet6−2に対する抗体は、真菌細胞表面ペプチドに直接結合することができる。
また、基本ペプチドが、播種性カンジダ症に対する防御をマウスに誘導する能力を、上述のように試験した。Fba3及びMet6−2で免疫したマウスは、DC+CFAのみを注射した対照群と比較して、非常に良好な生存率を示した(図14)。実験は、チャレンジ後80日の時点で終了させた。Fba3及びMet6−2ペプチドは、高度な防御を誘導し、生存率は80%であり、Fba4は、中程度の防御を誘導し、生存率は60%だった。Fba2を除く基本ペプチド(つまり、Fba3、Fba4、及びMet6−2)で免疫した動物は全て、対照と比較して生存期間の有意な延長を示した。陽性対照は、播種性カンジダ症に対する最も高度な防御を誘導したFba−DCだった。
免疫マウスを犠牲にし、腎臓を収集して、上述のように真菌感染を測定した。図15に示されるように、ペプチドで免疫したマウスは、DPBS対照群及びDC+CFA対照群と比較して(P<0.05)、腎臓一対当たりの生真菌単位(コロニー形成単位、CFU)の低減を示した。
したがって、より多くの真菌種により発現されるペプチドの少なくとも3つは、C.アルビカンスチャレンジに対する、マウスでの有効なワクチンであることが示された。それらは、同じペプチドを発現する他の真菌種に対しても同様に有効である可能性が予想される。また、これらペプチドは、下述の方法によりβ−(Man)3グリカン及び/又は破傷風トキソイドに結合させて、ワクチンの有効性を増加させることができる。
(実施例11)
メチル化Fbaペプチドの設計及び使用
元のFbaワクチンをヒト使用により許容される製剤に移行させる試みでは、Fbaペプチドに変更を加えた。第1に、Fbaペプチドを、そのリジンコアがFbaペプチドエピトープの8個のコピーを担持する複数の抗原性ペプチド(MAP)に結合させた。第2に、Fbaアミノ酸の部分的なN−メチルスキャニング、及びシステイン残基の挿入を適用した。この理論により束縛されることは望まないが、本発明者らは、これら修飾が、Fbaペプチドのin vivo半減期及び免疫原性を増加させることになると考える。MAP実験は、期待外れだった(データ非表示)。Fba誘導体の場合、ミョウバン及び/又はMPLのいずれかをアジュバントとして使用した結果は、より有望だった。合成ペプチドは全て、GenScript Company社により商業的に製作された。
メチル化Fbaペプチドの設計及び使用
元のFbaワクチンをヒト使用により許容される製剤に移行させる試みでは、Fbaペプチドに変更を加えた。第1に、Fbaペプチドを、そのリジンコアがFbaペプチドエピトープの8個のコピーを担持する複数の抗原性ペプチド(MAP)に結合させた。第2に、Fbaアミノ酸の部分的なN−メチルスキャニング、及びシステイン残基の挿入を適用した。この理論により束縛されることは望まないが、本発明者らは、これら修飾が、Fbaペプチドのin vivo半減期及び免疫原性を増加させることになると考える。MAP実験は、期待外れだった(データ非表示)。Fba誘導体の場合、ミョウバン及び/又はMPLのいずれかをアジュバントとして使用した結果は、より有望だった。合成ペプチドは全て、GenScript Company社により商業的に製作された。
N−メチルスキャニングを使用して、システイン残基をFbaの14個アミノ酸ペプチドに導入して、in vivo半減期及び免疫原性の増加を期待することができる部位を選択した。図16及び下記の表1に示されているように、11個のペプチドを商業的に合成した。ペプチド1は、元のFbaペプチド(配列番号1)である。ペプチド2〜9(配列番号11〜18)は各々、元のアミノ酸の1つがメチル化されていたが、表1に記載のように、その位置は様々であった。ペプチド10は、2つのアミノ酸がメチル化されていた(配列番号19)。ペプチド11(配列番号20)には、5位に1つ及び8位に1つと、2つの追加システインが挿入されていた。
ELISA阻害アッセイにより決定されるような、修飾Fbaペプチドに対する免疫血清中の抗Fba抗体の特異性を試験した。Fbaペプチドでの同じ試験の結果は、図17に示されている。阻害剤として使用した元のFbaであるペプチド1は、陽性対照として含まれていた。図17の阻害曲線は、他の修飾ペプチド2〜11での曲線との比較の役目を果たす。図18A、18B、18C、及び18Dは、それぞれペプチド2、ペプチド3、ペプチド4、及びペプチド5のELISA阻害アッセイの結果を示す。各メチル化ペプチドを、指定のアッセイで阻害剤として使用した。図18A〜18Dに示されているように、図17と比較して、1、2、3、又は5位のメチル化は、ペプチド−抗体結合にほとんど効果を示さないと考えられる。各群の反応は、用量依存的であり、免疫血清中の抗Fba抗体が、修飾ペプチドに特異的だったことを示す。同様に、図18E、18F、18G、及び18Hに示されているように、それぞれ6、7、8、又は9位でのFbaペプチドのメチル化は、ペプチドに対する抗体の結合に著しい効果を示さなかった。最後に、図18I及び18Jに示されているように、それぞれペプチド10(1位及び8位がメチル化)及びペプチド11(5位及び8位に2つのシステインが挿入)は、良好に抗体と結合した。ペプチド11の結合は、2つの追加システインを有しており、抗体とのFbaの結合部位が、ペプチドのカルボキシル部分に位置することを示している可能性がある。
修飾ペプチドで免疫したマウス血清のELISAを使用して測定される抗体応答を試験するため、ペプチド1〜11の11群の1群当たり2匹のマウスを使用した。50μgミョウバンと混合した15μgペプチドをマウスに3回i.p.注射し、各注射は3週間の間隔をおいて行った。図19に示されているように、修飾Fbaペプチドは全て、抗体応答を誘導することができたが、応答は、Fbaペプチド1ほど強力ではなかった。
修飾Fbaペプチドは全て、異なる免疫経路(腹腔内(i.p.)又は皮下(s.c.))及びヒトで許容されるアジュバントの異なる組合せ(ミョウバンのみ又はミョウバン+MPL)を使用して、マウスで試験した。各実験は、1群当たり2匹のマウスを使用して行われ、どのペプチドが、ロバスト抗Fba抗体応答を動物に誘導したかを試験するために実施した。図20Aには、ミョウバン中のペプチドを使用してi.p.注射により、Fba誘導体で免疫したマウスの抗Fba抗体応答が示されている。図20Bには、ミョウバン及びMPL中のペプチドを使用してi.p.注射により、Fba誘導体で免疫したマウスの抗Fba抗体応答が示されている。図20Cには、ミョウバン中のペプチドを使用してs.c.注射により、Fba誘導体で免疫したマウスの抗Fba抗体応答が示されている。図20Dには、ミョウバン及びMPL中のペプチドを使用してs.c.注射により、Fba誘導体で免疫したマウスの抗Fba抗体応答が示されている。図20A〜20Dに示されているように、修飾Fbaペプチドは全て、抗体応答を誘導することができたが、応答は、元のFbaペプチドほど強力ではなかった。皮下の免疫経路及びミョウバン及びMPLの組合せが、最も高い抗体応答を誘導した。幾つかのペプチドの場合、実際の抗体価を得るために血清を連続希釈した場合に、より良好な抗体応答が観察された。これら修飾ペプチドは、カンジダ症のワクチンとして使用することができる。また、これら修飾ペプチドは、下述の方法により、β−(Man)3グリカン及び/又は破傷風トキソイドに結合させて、ワクチンの有効性を増加させることができる。
セクションB:結合型ワクチン
(実施例12)
物質及び方法
カンジダ・アルビカンス株。C.アルビカンス3153A及びSC5314(ATCC)を、グルコース−酵母抽出物−ペプトンブロス中で静止期酵母細胞として37℃にて増殖させ、ダルベッコのPBS(DPBS;Sigma社)で洗浄及び懸濁して適切な菌体濃度(5×106/ml)にし、それを使用して、記載のように[25、29]、マウスを静脈内(i.v.)感染させた。また、C.アルビカンス株3153Aを、血清抗体吸収、免疫蛍光染色、及びフローサイトメトリー分析に使用した。
(実施例12)
物質及び方法
カンジダ・アルビカンス株。C.アルビカンス3153A及びSC5314(ATCC)を、グルコース−酵母抽出物−ペプトンブロス中で静止期酵母細胞として37℃にて増殖させ、ダルベッコのPBS(DPBS;Sigma社)で洗浄及び懸濁して適切な菌体濃度(5×106/ml)にし、それを使用して、記載のように[25、29]、マウスを静脈内(i.v.)感染させた。また、C.アルビカンス株3153Aを、血清抗体吸収、免疫蛍光染色、及びフローサイトメトリー分析に使用した。
マウス系統。5〜7週齢の近交系統BALB/c及びC57BL/6並びに非近交系Swiss Webster(ND4)の雌マウス(NCI Animal Production Program又はHarlan社)を使用した。マウスは、Children’s Hospital Research Institute in New Orleansの院内実験動物委員会(IACUC、Institutional Animal Care and Use committee)により承認されたプロトコールに従って飼育及び処理された。
結合型ワクチンの合成。複合糖質ワクチン(GV)及びマンノトリオース成分を欠如する対照ワクチン(PV)を、図29に要約されているように、先進的ビルディングブロックから合成した。図29の化合物は、図30A〜30Eに示されているより詳細な合成での付番化合物と一致するように付番されている。トリエチレングリコールスペーサ(化合物3)で誘導体化されたβ−1,2マンノトリオースを、以前に記述されているように合成した[62]。T細胞14量体ペプチド(Fba)をペプチド合成機で構築し、トリエチレングリコールテザーをC末端に導入し、その後チオ酢酸残基によりその側鎖を誘導体化した単一リジン残基を導入した。これにより、ビルディングブロック2a又は2bを得た。ブロモアセタート基を、破傷風トキソイド(国立血清学研究所、コペンハーゲン)に存在するおよそ20個のリジン残基に導入して、化合物5を得た。3を2aと反応させ、その後、この産物を5と結合させることにより、GVを構築した。2bを5と結合させることにより、PVを調製した。この合成のより詳細な説明は、下記の実施例21に示されている。
マウスの免疫。結合体β−(Man)3−Fba又はβ−(Man)3−Fba−TTを、頸部の項部の皮下(s.c.)位置に投与した。結合体は、単独で又はミョウバン(水酸化アルミニウムゲル、Sigma社)若しくはMPL(リピドA、モノホスホリル、Sigma社)のいずれかとの混合物として又は両アジュバントの組合せとして投与した。陰性対照群のマウスには、DPBS緩衝液又はアジュバントのみを投与した。免疫用量及びスケジュールは、1、21、及び62日目に、100μlの2.5μg又は10μgのいずれかの結合体のみ、又は50μgのミョウバン若しくは10μgのMPLと共にいずれかの結合体を含有する混合物としてだった。幾つかの実験では、2つのアジュバントを併用し、初回刺激及び追加免疫用の抗原と混合した。血清試料を、各免疫の14日後に採取し、ELISAにより試験した。
血清学的アッセイ。免疫血清の抗体価を、下述のように、各免疫後に分析した。力価は、各投与後に増加したが、最も重大な変化は、通常、最初の追加免疫の後に観察された。これは、種々の群間のワクチン応答の比較を示すために選択された結果である。
DC/CFAに基づく免疫の場合、上述のように及び以前に記述されているように[53]、β−(Man)3−Fbaワクチンを用いてin vitroでDCをパルス処理した。マウスに初回刺激用量を投与し、14日目に新しい抗原パルス処理DCで追加免役し、28日目に、完全フロインドアジュバント(CFA)中で乳化した抗原(2.5μg)を皮下(s.c.)投与して2回目の追加免疫を行った。対照群は、初回刺激及び追加免疫時に、DPBS、DC、又はDC+CFAのみを投与したマウスで構成されていた。単独で又はミョウバン若しくはMPLと共に投与したβ−(Man)3−Fba、Fba−TT、又はβ−(Man)3−Fba−TTの場合、対照群には、アジュバントのみ又はDPBS緩衝液を投与した血清試料を、各免疫の14日後に採取し、1:100に希釈し、以前に記述されているように[53]、C.アルビカンスに由来する細胞壁マンナン抽出物、又はFba−MAPペプチド(GenScript社)、又はβ−(Man)3−BSAでコーティングされたプレートでのELISAにより試験した。手短に言えば、主にマンナンで構成されているC.アルビカンスマンナン抽出物、又はBSAに結合された合成β−(Man)3を、炭酸塩緩衝液(pH9.6)に4μg/mlで溶解し、Fba−MAP(GenScript社)を、炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.5)に10μg/mlで溶解した。各々を使用して、96ウェルELISAプレートをコーティングし、各免疫血清及び対照血清の試料の連続2倍1:100希釈物を重複して試験した。各ウェルの発色は、二次抗体であるヤギ抗マウス多価イムノグロブリン(IgG、IgA、IgM)ペルオキシダーゼ結合抗体(PBSTで1:10,000希釈)(Sigma社)及び基質(O−フェニレンジアミン及びH2O2)で達成し、OD測定は、492nmで決定した。希釈エンドポイントELISA力価を決定するために、血清をブロッキング緩衝液で連続2倍希釈したものを調製した。エンドポイントELISA力価は、陰性対照試料の平均OD+標準偏差の2倍よりも少なくとも2倍大きなOD測定値を示した最終血清希釈の逆数とした。
抗体アイソタイプ及びサブクラスを決定するために、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス重鎖特異的IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3(Rockland社、ペンシルバニア州)を、ブロッキング緩衝液で1:10,000希釈し、適切なウェルに添加し、その後、以前と同様にO−フェニレンジアミン基質及びH2O2を発色及び吸光度用に添加した。
真菌チャレンジ及び防御の評価。2回目の追加免疫の2週間後、免疫マウス及び対照マウスを、上述のように及び以前に記載されているように[53]調製された致死用量の生菌C.アルビカンス酵母細胞(0.1mlのDPBS中5×105個)でi.v.感染させた。受動免疫されたマウス(以下)も、同じチャレンジ用量を受容した。防御は、動物生存を、実験に依存して50〜120日間モニターすることにより評価した。マウスが瀕死状態になったかどうかをモニターした。瀕死状態は、活力が低下し、餌又は水に無関心であり、指で触っても反応がないことと定義した。瀕死であるとみなした時点でマウスを犠牲にし、マウスの腎臓を、DPBS中でホモジナイズし、栄養寒天上に播種して、真菌細胞のコロニー形成単位(CFU)を決定した。50〜120日後に実験を終了させ、その時点で生存していたマウスを全て犠牲にし、腎臓のCFUを以前と同じように評価した。CFUアッセイの検出最低限度は、腎臓一対当たり50CFUだった。
免疫血清の受動転移。免疫血清を、ワクチン接種マウスから得て、貯留し、−20℃で保存するか、又は凍結する前に、上述のように又は以前に記述されているように[53、25]C.アルビカンス3153A酵母細胞で吸収させた。酵母で事前に吸収された免疫血清又はDBPS緩衝液を、受動転移陰性対照として使用した。事前に吸収された免疫血清を試験し、β−(Man)3及びFbaペプチドの両方に対する抗体に陰性であることを、上述のようにELISAで見出した。未感作BALB/cマウスは、0.5mlの完全に強力な免疫血清又は対照血清又はDBPS緩衝液を、腹腔内(i.p.)位置に受容した。4時間後、全てのマウスを、C.アルビカンス(5×105酵母細胞)でi.v.チャレンジした。動物は全て、初回投与の24時後に、第2の用量(200μl)の血清又は陰性対照物質をi.p.で受容した。感染マウスを、瀕死状態になった時点で犠牲にし、腎臓のCFUを上記のように評価した。
フローサイトメトリー分析及び免疫蛍光顕微鏡法。酵母細胞上におけるβ−(Man)3及びFbaペプチドエピトープの分布を、免疫血清を使用してフローサイトメトリー分析及び間接免疫蛍光法で決定した。100マイクロリットルの免疫血清(1%BSA/DPBSで1:100希釈)を、DPBSで予め3回洗浄したC.アルビカンス酵母細胞(5×106)のペレットに添加した。酵母細胞を、免疫血清[β−(Man)3−Fba−TT免疫マウスに由来]調製物に懸濁し、室温(RT、22〜24℃)で回転振とうさせながら1〜2時間インキュベートした。インキュベーション後、酵母細胞を、DPBSで3回洗浄し、200μlのフルオレセイン標識ヤギ抗マウスIgM(μ−鎖特異的;Sigma社)(原液、1mg/ml;作業用溶液、1mlのDPBS当たり20μg)に懸濁し、上述のようにRTで0.5時間インキュベートした。酵母細胞を、DPBSで3回洗浄し、500μlのDPBSに懸濁した。フローサイトメトリーは、488nmでのアルゴンレーザー励起を装備したBD Biosciences社製FACSVantage SEを使用して実施した。各試料中の細胞を10,000個分析した(CellQuest Proソフトウェア)。
免疫蛍光アッセイの場合、真菌細胞を上述のように免疫染色及び洗浄し、200μlのDPBS緩衝液に懸濁した。細胞を、共焦点顕微鏡(LSM510、Zeiss社)で観察した。酵母細胞表面におけるβ−(Man)3及びFbaペプチドエピトープの分布を、MAb B6.1エピトープを検出するために蛍光染色した酵母細胞で得られた分布と比較した。陰性対照には、無関係なアイソタイプ対照IgM MAb S−9[45]が非反応性を示すこと(データ非表示)及びフルオレセイン標識ヤギ抗マウス二次抗体のみの使用が含まれていた。追加の対照として、上述のように調製した事前に吸収された免疫血清の、C.アルビカンス細胞表面への結合反応性を試験した。
統計分析。データは、GraphPad Prism 4ソフトウェアで分析した(GraphPad社)。ELISAデータの統計的有意差は、カーブフィティング分析により評価した。C.アルビカンスチャレンジマウスの生存期間中央値及び生存率の差を、それぞれノンパラメトリック両側マン−ホイットニーU検定又はフィッシャー直接検定により分析した。生存曲線の差を、ログランク検定により評価した。in vitro及びin vivo実験の両方でのCFU計数のデータを、両側スチューデントt検定により分析した。分散分析(一元配置ANOVA)の後でニューマン−クールズ事後検定を行うことにより、多重比較を実施した。
(実施例13)
異なるマウス系統での更なるC.アルビカンス株に対するβ−(Man)3−Fba結合ワクチンの防御効力
以前に記述されているように、β−(Man)3−Fba結合ワクチンは、H−2d MHCハプロタイプを発現し、Th−2免疫学的バイアスを示す[3]BALB/cマウス[53]に、強力な抗体応答及び防御免疫を誘導した。C57BL/6マウスは、H−2d MHCハプロタイプを発現し、Th1応答を起こしやすい傾向があり、BALB/cマウスよりも、播種性カンジダ症に対してより抵抗性であると推定される[3]。Fbaペプチドを使用して実施例5に上述されているように、免疫応答は、両マウス系統:BALB/c及びC57BL/6で類似していた。樹状細胞を、上述のように及び以前に記述されているように[53]in vitroで導き出し、C57BL/6マウスに対して、BALB/cマウスで使用されたもの[53]と同じ免疫DC/CFA戦略を使用した。この戦略は、初回刺激投与し、その後2回の追加免疫行うことを含み、最後の追加免疫は、CFA中で乳化されたワクチンを含んでいた。C57BL/6マウスは、2つのワクチンエピトープ、つまりβ−(Man)3及びFbaペプチドの各々に対する特異的抗体を産生することにより、ワクチンに応答した(データ非表示)。最初の追加免疫後、各エピトープに応答したIgMからIgGへのアイソタイプスイッチが生じた。免疫C57BL/6マウスは、チャレンジ後120日間までに80%の生存率を示し、DPBS緩衝液、DC、又はDC+CFAを投与した対照群のマウスと比較して、有意により長い期間生存した(p<0.001)(図21A)。生存データは、腎臓ホモジネートのコロニー形成単位(CFU)の傾向と一致していた。すなわち、免疫C57BL/6マウスは、真菌でのi.v.チャレンジ後に瀕死状態になった時点で犠牲にした対照と比較して、大幅に低減されたか又は検出不能な腎臓CFUを示した(図21B)。実際、C57BL/6マウスにおける防御は、本発明者らがBALB/cマウスで観察した防御[53]と類似していた。
異なるマウス系統での更なるC.アルビカンス株に対するβ−(Man)3−Fba結合ワクチンの防御効力
以前に記述されているように、β−(Man)3−Fba結合ワクチンは、H−2d MHCハプロタイプを発現し、Th−2免疫学的バイアスを示す[3]BALB/cマウス[53]に、強力な抗体応答及び防御免疫を誘導した。C57BL/6マウスは、H−2d MHCハプロタイプを発現し、Th1応答を起こしやすい傾向があり、BALB/cマウスよりも、播種性カンジダ症に対してより抵抗性であると推定される[3]。Fbaペプチドを使用して実施例5に上述されているように、免疫応答は、両マウス系統:BALB/c及びC57BL/6で類似していた。樹状細胞を、上述のように及び以前に記述されているように[53]in vitroで導き出し、C57BL/6マウスに対して、BALB/cマウスで使用されたもの[53]と同じ免疫DC/CFA戦略を使用した。この戦略は、初回刺激投与し、その後2回の追加免疫行うことを含み、最後の追加免疫は、CFA中で乳化されたワクチンを含んでいた。C57BL/6マウスは、2つのワクチンエピトープ、つまりβ−(Man)3及びFbaペプチドの各々に対する特異的抗体を産生することにより、ワクチンに応答した(データ非表示)。最初の追加免疫後、各エピトープに応答したIgMからIgGへのアイソタイプスイッチが生じた。免疫C57BL/6マウスは、チャレンジ後120日間までに80%の生存率を示し、DPBS緩衝液、DC、又はDC+CFAを投与した対照群のマウスと比較して、有意により長い期間生存した(p<0.001)(図21A)。生存データは、腎臓ホモジネートのコロニー形成単位(CFU)の傾向と一致していた。すなわち、免疫C57BL/6マウスは、真菌でのi.v.チャレンジ後に瀕死状態になった時点で犠牲にした対照と比較して、大幅に低減されたか又は検出不能な腎臓CFUを示した(図21B)。実際、C57BL/6マウスにおける防御は、本発明者らがBALB/cマウスで観察した防御[53]と類似していた。
抗体応答が防御の原因であったか否かという問いに答えるため、致死用量のC.アルビカンス株3153Aでi.v.チャレンジする4時間前に、別の群の免疫マウスから抗血清を採取し、未感作マウスにi.p.で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌C.アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はDPBS緩衝液のいずれかを投与した。DC/CFA法によりβ−(Man)3−Fbaで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。チャレンジ後、免疫マウス及び抗血清で処置したマウスは、2つの対照群と比較して、生存期間の延長を示し(p<0.05)(図21C)、抗血清を受容したマウスは、予想通り、腎臓の真菌数を有意に低減させた(p<0.05)(図21D)。これらデータは、抗体が、真菌での致死的チャレンジに対するC57BL/6マウスにおけるワクチン誘導性防御の少なくとも部分的な原因であるという強力な証拠を提供する。
C.アルビカンス株3153Aは、本発明者らの以前の研究[7、17、19]で使用されていた。β−(Man)3−Fbaを用いたDC/CFAワクチン接種が、Fbaペプチドの場合の実施例4と同様に、別のC.アルビカンス株でチャレンジしたC57BL/6マウスを防御するか否かを試験するために、本発明者らは、研究用に一般的に使用される臨床分離株であるC.アルビカンス株SC5314で免疫マウスをチャレンジした。陽性対照として、免疫マウスの群を3153A株でチャレンジした。同様の防御パターンが、チャレンジ株に関わらず、両群のマウスで観察された(図21E)。生存期間の延長に加えて、免疫群は、非免疫マウスと比較して、低減されたか又は検出不能な腎臓CFUを示した(データ非表示)。これらの結果は、Fbaペプチド及びβ−(Man)3−Fba結合体の両方に類似しており、3153A株でチャレンジしたBALB/cマウスで本発明者らが観察したものと類似していた[53、52]。上記の実験並びに実施例4及び5は、ワクチン誘導性抗体防御が、動物又は真菌株依存性でないことを示すため重要である。
(実施例14)
ミョウバン又はMPLと混合したβ−(Man)3−Fbaでの免疫は、中程度の抗体応答及びわずかな防御を誘導した。
ミョウバン又はMPLと混合したβ−(Man)3−Fbaでの免疫は、中程度の抗体応答及びわずかな防御を誘導した。
DC/CFAに基づく免疫手法は、播種性カンジダ症からのマウスの防御に成功したが、DC及び完全フロインドアジュバントの使用は、ヒト使用には不適当である。ヒト使用に好適な新しいアジュバントを試験するために、β−(Man)3−Fba結合体を、ミョウバン又はMPLアジュバントのいずれかとの混合物として、BALB/cマウスに投与した。血清試料を、免疫の14日後に採取し、1:100に希釈し、合成β−(Man)3又はFba−MAPでコーティングされたプレートでのELISAで試験した。最初の追加免疫後、ワクチン接種を受けたマウスに由来する免疫血清は、Fbaペプチドに対して中程度の抗体応答(1/100血清稀釈物のOD値:0.7〜0.9)を示し(図22A)、β−(Man)3エピトープに対して比較的弱い抗体応答(1/100血清稀釈物のOD値:0.45〜0.55)を示した(図22B)。図22Cに示されているように、生存も、MPL中のβ−(Man)3−Fbaを受容したマウスでわずかに延長され、ミョウバンをアジュバントとして使用した場合、DPBS又はアジュバント非免疫対照と比較して、わずかな防御が観察された。
2回目の追加免疫後、β−(Man)3又はFba特異的抗体のいずれでも、IgMからIgGへのアイソタイプスイッチは、免疫血清では低いか無視できる程度であった(データ非表示、結果は表2に要約)。これは、免疫記憶応答が生じなかったことを示唆した。加えて、β−(Man)3−Fbaワクチン接種群は、致死用量のC.アルビカンス細胞でチャレンジした後、2つの非免疫対照群と比較して、より長期の生存期間を示したが、それは有意ではなかった(p=0.77)(図22C)。
抗Fbaペプチド(図23A)及び抗β−(Man)3(図23B)のレベルは、β−(Man)3−Fba+DC/CFAで免疫した対照動物に由来する血清中の抗体レベル(1/100血清稀釈物のOD値:1.7〜1.9)よりも顕著により低かった。同様に、エンドポイント希釈で力価を評価すると、陽性対照群に由来する免疫血清は、両エピトープに対して有意により大きな抗体応答を示した(表3、下記)。興味深いことには、たとえ10マイクログラム用量に応答した両エピトープに対する抗体価が、2.5μg用量に対する応答よりも大きかったとしても、疾患防御は、DC/CFA免疫手法により誘導された防御の程度ほどは観察されなかった(図23C)。要約すると、最も大きな抗体応答は、β−(Man)3−Fba+DC/CFAを受容したマウスに生じた。また、その動物は、IgM−IgGシフト(表3、下記)及び最も高度な防御[7]の証拠を示した。
ワクチン、β−(Man)3−Fba−TTに破傷風トキソイド(TT)を付加することにより、ミョウバン又はMPLの存在下での両エピトープに対する抗体応答が顕著に増強された。
ヒト使用に好適なアジュバントの存在下でグリコペプチドワクチンの免疫原性を向上させる試みでは、β−(Man)3−Fba結合体を、破傷風トキソイドに結合させることにより修飾し、それをβ−(Man)3−Fba−TTと命名し、ペプチド結合Fba−TTと共に試験した。両結合体を、ミョウバン又はMPLとの混合物として投与した。陰性対照群には、アジュバントのみ及びDPBS緩衝液のみが含まれていた。図24A及び25Bには、ミョウバン又はMPLのいずれか中のβ−(Man)3−Fba−TTによるワクチン接種が、対照と比較して、感作マウスにおけるβ−(Man)3及びFbaペプチド特異的抗体力価を両方とも顕著に増加させたことが示されている。血清試料を、免疫の14日後に採取し、1:100に希釈し、細胞壁マンナン又はペプチドでコーティングされたプレートでのELISAで試験した。β−(Man)3及びFbaに特異的なMAb B6.1及びE2−9を、それぞれ陽性対照として使用した。
最初の追加免疫後、ミョウバン又はMPLのいずれかで調製されたβ−(Man)3−Fba−TTで免疫したマウスは、Fbaペプチド(図24A)及びβ−(Man)3エピトープ(図24B)の両方に対してロバストな抗体応答を生成した。それらの力価は、Fba−TTを受容した群に由来する血清の力価よりも100倍大きかった(p<0.001)(表3、上記)。後者は、TTを有していないミョウバン中のFbaを受容した動物とほぼ同じ応答を示した(図24A)。最初の追加免疫後、両エピトープに対するIgM及びIgG抗体が、ミョウバン又はMPLアジュバントが添加されたβ−(Man)3−Fba−TTで免疫したマウスの血清で検出されたが(表2)、非常に低レベルの抗Fba IgM及びIgG抗体が、アジュバント中のFba又はFba−TTを受容したマウスの血清で検出された。エピトープに対する抗体は、陰性(つまり、アジュバント又はDPBSマウス)対照血清のいずれにおいても検出可能ではなかった(データ非表示)。実施例21に記載の方法により結合されたFba−TTは、良好な応答をもたらさなかったが、これは、Fba及びTT用に、わずか1つのタイプのリンカーを使用した初期実験に過ぎなかった。当技術分野で公知の他の方法(63、64、65)による破傷風トキソイドの結合又は破傷風THエピトープとの結合(例えば、米国特許出願公開第2004/0101534号)は、より強力な応答をもたらす可能性のあるペプチド結合体を生成することができると考えられる。
(実施例16)
β−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンは、アジュバントの非存在下でさえ高い抗体応答及び防御を誘導した。
β−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンは、アジュバントの非存在下でさえ高い抗体応答及び防御を誘導した。
β−(Man)3−Fba−TTワクチンの免疫原性が、追加のアジュバントに依存していたか否かを決定するために、β−(Man)3−Fba−TTを単独で投与し、それらマウスの応答を、ミョウバン又はMPLとの混合物としてワクチンを受容したマウスと比較した。図25A〜Dには、播種性カンジダ症に対する抗体価及び防御により顕著に分析された、アジュバントを用いて又はアジュバントを用いずにβ−(Man)3−Fba−TT結合体を使用した結果が示されている。ミョウバン又はMPLのいずれかで又はアジュバントを用いずに調製されたβ−(Man)3−Fba−TTで免疫したマウスは、Fbaペプチド(図25A)及びβ−(Man)3エピトープ(図25B)の両方に対してロバストな抗体応答を発生させた。図25Cには、ミョウバン又はMPLのいずれかをアジュバントとして使用した場合、β−(Man)3−Fba−TTにより防御免疫が誘導されたことが示されている。防御は、アジュバントを使用しなかった場合でさえ、DPBS又はアジュバント単独対照と比較して、ほとんど同じだった(P<0.01)。図25Dには、免疫マウスは、対照群と比較して、低減されたか又は検出不能な腎臓一対当たりのCFUを示したことが示された(P<0.001)。
したがって、いずれかのアジュバントで調製されたワクチンを受容したマウスは、ロバストな抗体応答により予想通りに応答した。驚くべきことに、アジュバントを有していないβ−(Man)3−Fba−TTを受容したマウスは、ワクチン+アジュバントを受容したマウスよりもほんのわずかに弱い応答を示したが、有意ではなかった(図25A及び25B)。重要なことには、追加アジュバントを有する又は有していないβ−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンでワクチン接種したマウスの3群は全て、C.アルビカンスでの致死的チャレンジに対する高度な防御を示した(図25C)。誘導された防御免疫は、チャレンジの前にアジュバント又はDPBS緩衝液のみを受容した対照群と比較して有意に延長された生存期間(p<0.005)及び有意に低減された腎臓真菌量(p<0.001)により明らかであった(図25D)。これらの結果は、β−(Man)3−Fba−TTワクチンの自己アジュバント活性の効力を示した。
(実施例17)
非DC/CFA系の免疫手法により誘導された抗β−(Man)3−Fba−TT免疫血清は、受動防護をもたらした。
非DC/CFA系の免疫手法により誘導された抗β−(Man)3−Fba−TT免疫血清は、受動防護をもたらした。
受動転移実験は、DC/CFAに基づく免疫手法により誘導された抗体が、播種性カンジダ症に対する防御の原因であることを示した。ワクチン誘導性抗体が、樹状細胞の使用に関わらず防御性であることを確認するために、β−(Man)3−Fba−TT(ミョウバン又はMPLアジュバントを有する又は有していない)で免疫したマウスから免疫血清を採取及び貯留し、致死用量のC.アルビカンスでi.v.チャレンジする4時間前に、未感作マウスにi.p.で転移した。対照群には、チャレンジ前に、生菌C.アルビカンス酵母細胞で事前に吸収された免疫血清又はDPBS緩衝液のいずれかを投与した。β−(Man)3及びFbaエピトープに対する抗体を、酵母細胞での吸収前後で試験した。β−(Man)3−Fba−TT結合体ワクチンで免疫した免疫血清供与体を、防御の陽性対照として使用した。チャレンジ後、免疫陽性対照マウス及び抗血清で処置したマウスは、2つの陰性対照群と比較して生存期間の延長を示し(p<0.01)(図26A)、誘導された抗体が防御性であり、それらの誘導は、免疫中の樹状細胞又はCFAの使用に依存しなかったことが確認された。それと一致して、抗血清を受容したマウスは、チャレンジ前にDPBS又は事前に吸収された血清を投与したマウスの感染量と比較して、有意により少数の腎臓真菌計数を示した(p<0.001)(図26B)。
(実施例18)
免疫は、ワクチン結合体中のいずれかの真菌エピトープに特異的な抗体のIgMからIgGへのアイソタイプスイッチを誘導した。
免疫は、ワクチン結合体中のいずれかの真菌エピトープに特異的な抗体のIgMからIgGへのアイソタイプスイッチを誘導した。
ミョウバン又はMPLと共に投与されたか又は単独で投与された場合のβ−(Man)3−Fba−TT修飾結合体により生成された抗体アイソタイプ応答に対して、DC/CFAに基づく免疫手法が使用された場合の抗体アイソタイプ応答を、β−(Man)3−Fba結合体により誘導されたグリカン及びペプチドエピトープの両方と比較した(表2、上記)。β−(Man)3−Fba+DC/CFA及びβ−(Man)3−Fba−TTで免疫したマウスは、β−(Man)3エピトープ及びFbaペプチドの両方に対する抗体を産生し、アイソタイプ分析は、両エピトープに対するIgM及びIgGサブクラスが免疫血清中に豊富にあることを明らかにし、これはT細胞依存性記憶免疫応答の誘導と一致している。
真菌エピトープに特異的な抗体のアイソタイプ分布は、アジュバント系に依存して異なっていた(表2)。β−(Man)3に対するIgM及びIgG1応答は、アジュバントの存在に関わらず誘導され、グリカンエピトープに対するIgG2a応答は、ミョウバン又はMPLを使用して又は使用せずにβ−(Man)3−Fba−TTにより誘導されたが、IgG1は、DC/CFA手法により免疫されたマウスにおいて検出可能だった唯一のサブクラスだった。MPLと混合したβ−(Man)3−Fba−TTで免疫したマウスのみが、グリカンエピトープに対するIgG2b応答をもたらした。Fbaペプチドに対する抗体IgM及びIgG1アイソタイプ応答は、アジュバント系に関わらず、β−(Man)3−Fbaで免疫したマウスに類似していたが、ペプチドエピトープに特異的なIgG2aは、ミョウバンを有するβ−(Man)3−Fba−TTによってのみ、又はアジュバントが使用されなかった場合に誘導された。MPLが試験アジュバントだった場合、ペプチドに対するIgG2aアイソタイプは検出されなかった。播種性カンジダ症に対して観察された防御レベルは、DC/CFA手法でグリカン−ペプチド結合体を用いて免疫したマウス、又はミョウバン若しくはMPLを有する若しくは有していないグリカン−ペプチド−TTで免疫したマウスでは類似していた。これにより、防御抗体が、主にIgM及びIgG1アイソタイプである可能性が高いことが示された。
(実施例19)
グリコペプチド−TT結合体は、非近交系マウスの播種性カンジダ症に対して免疫原性及び防御性である。
グリコペプチド−TT結合体は、非近交系マウスの播種性カンジダ症に対して免疫原性及び防御性である。
播種性カンジダ症に対するβ−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンの効力を、非近交系マウスでも実証した。MPL及びミョウバンの組合せは、抗原提示細胞(APC)の至適活性化に結び付く局所的なサイトカイン応答を迅速に引き起こすことにより、ワクチン応答を増強することができるため、Swiss Websterマウスを、β−(Man)3−Fba−TT結合体のみ又はミョウバン及びMPLの両方との混合物で免疫した。陰性対照マウスを、アジュバントの組合せ又はDPBSのみで免疫した。非近交系Swiss Webster(01S60)マウスを、β−(Man)3−Fba−TT結合体のみ、又はアジュバントミョウバン及びMPLと混合したβ−(Man)3−Fba−TT結合体で免疫し、対照マウスを、アジュバント(ミョウバン+MPL)のみ又はDPBS緩衝液で免疫した。
アジュバントを有する又は有していないβ−(Man)3−Fba−TTは、免疫された非近交系マウスに、β−(Man)3(図27A)及びFbaエピトープ(図27B)の両方に対してロバストで一貫した抗体応答を誘導した。最終追加免疫の14日後、免疫マウスを、上述のように、尾静脈を介して致死用量のC.アルビカンス3153Aで感染させた。BALB/cマウスでの知見と同様に、単独で又はミョウバン及びMPLと共に投与すると、β−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンでワクチン接種した非近交系マウスは、感染マウス生存を顕著に改善した(図27C)。DPBS又はアジュバントのみを受容した対照マウスと比較して生存期間が延長されたことから分かるように(P<0.01)、アジュバントを有する又は有していないβ−(Man)3−Fba−TTにより、防御免疫が誘導された。それと一致して、陰性対照と比較して、免疫マウスは、有意により低い腎臓生真菌細胞を示した(p<0.001)(図27D)。
(実施例20)
免疫血清中の抗体は、酵母型及び菌糸型のC.アルビカンスに結合する。
β−(Man)3−Fba−TT結合体で免疫した動物に由来する免疫血清は、フローサイトメトリー分析により示されたように、酵母型の細胞表面と特異的に反応する抗体を含有していた。β−(Man)3−Fba−TTワクチン接種マウスに由来する免疫血清は、フローサイトメトリーにより示されたように、C.アルビカンスの表面にワクチンエピトープの存在を検出した。図28Aには、免疫血清中の抗体が、C.アルビカンス細胞表面に表現された両エピトープに結合し、C.アルビカンス細胞表面エピトープβ−(Man)3に特異的なMAb B6.1の反応性に対する、免疫血清と生菌C.アルビカンス細胞との反応性が示されている。対照血清は、アジュバントのみを受容したマウスに由来する非免疫血清だった。図28Bには、事前に吸収されたMAb B6.1及び事前に吸収された免疫血清は、真菌細胞表面と反応しなかったことが示されている。図28Cは、共焦点顕微鏡分析の顕微鏡写真であり、免疫血清中の抗体は、酵母型の表面にワクチンエピトープを検出したが、菌糸型のC.アルビカンスの表面とも反応したことが確認される。エピトープ提示は、β−(Man)3に特異的であり、陽性免疫蛍光対照として使用されたMAb B6.1との真菌反応性によるものと類似していた。追加の陰性対照として、C.アルビカンス3153A酵母細胞で事前に吸収された免疫血清は、C.アルビカンスの酵母型又は菌糸型のいずれとも反応しなかった。
免疫血清中の抗体は、酵母型及び菌糸型のC.アルビカンスに結合する。
β−(Man)3−Fba−TT結合体で免疫した動物に由来する免疫血清は、フローサイトメトリー分析により示されたように、酵母型の細胞表面と特異的に反応する抗体を含有していた。β−(Man)3−Fba−TTワクチン接種マウスに由来する免疫血清は、フローサイトメトリーにより示されたように、C.アルビカンスの表面にワクチンエピトープの存在を検出した。図28Aには、免疫血清中の抗体が、C.アルビカンス細胞表面に表現された両エピトープに結合し、C.アルビカンス細胞表面エピトープβ−(Man)3に特異的なMAb B6.1の反応性に対する、免疫血清と生菌C.アルビカンス細胞との反応性が示されている。対照血清は、アジュバントのみを受容したマウスに由来する非免疫血清だった。図28Bには、事前に吸収されたMAb B6.1及び事前に吸収された免疫血清は、真菌細胞表面と反応しなかったことが示されている。図28Cは、共焦点顕微鏡分析の顕微鏡写真であり、免疫血清中の抗体は、酵母型の表面にワクチンエピトープを検出したが、菌糸型のC.アルビカンスの表面とも反応したことが確認される。エピトープ提示は、β−(Man)3に特異的であり、陽性免疫蛍光対照として使用されたMAb B6.1との真菌反応性によるものと類似していた。追加の陰性対照として、C.アルビカンス3153A酵母細胞で事前に吸収された免疫血清は、C.アルビカンスの酵母型又は菌糸型のいずれとも反応しなかった。
したがって、対照抗体MAb B6.1と規模が類似した蛍光シフトが、免疫血清の試験で観察された(図28A)。免疫血清のこの反応性は、C.アルビカンス酵母型での事前吸収により除去された(図28B)。結合パターンは、β−(Man)3−Fba−TTのみで又はミョウバン若しくはMPLのいずれかと混合してワクチン接種したマウスから採取した免疫血清と類似していた(データ非表示)。
抗β−(Man)3−Fba−TT結合体免疫血清での免疫蛍光染色後の顕微鏡観察は、C.アルビカンス株3153Aの酵母型及び糸状型の両方との反応性を示した(図28C)。顕微鏡分析は、フローサイトメトリー結果を確認し、この観察を、菌糸型の真菌の包含に拡張した。特異的抗体反応性は、酵母型の真菌で事前に吸収された免疫血清による蛍光が存在しないことにより再び確認された(図28C)。フローサイトメトリー分析のように、免疫血清の陽性反応は、グリカンエピトープに特異的であるMAb B6.1の反応性と比較して優れていた[26]。更に、極めて重要なことには、同じパターンのC.アルビカンス蛍光が、β−(Man)3−Fba−TTのみで又はミョウバン/MPLと混合してワクチン接種したマウスに由来する免疫血清で観察された。真菌との反応性は、アジュバントのみを投与したマウスに由来する血清又は未処置正常マウスに由来する貯留血清を試験しても観察されなかった。これらの知見に加えて、β−(Man)3−Fba−TT結合体で免疫したマウスに由来する血清は、別のC.アルビカンス単離株(SC5314株)とも同様に反応した(データ非表示)。
上記を要約すると、ワクチンの有効性は、BALB/cマウスと比較して、Th1応答の傾向が強く、播種性カンジダ症により抵抗性であるC57BL/6マウスを含むことが示されている。防御抗体の産生を促進した同じDC/CFAに基づく免疫プロトコールにより、β−(Man)3−Fba結合体は、BALB/c動物に見出されたのと同様のレベルの防御をC57BL/6マウスに誘導した。更に、防御は、C.アルビカンスのチャレンジ株に関わらず観察された。BALB/cマウスと同様に、2つの真菌エピトープに対する抗体を、C57BL/6未感作マウスに受動転移すると、これら動物は、播種性カンジダ症から防御された。
ヒト使用に許容される免疫手法を使用する場合に、β−(Man)3−Fba結合体の免疫原性を増加させるため、結合体を破傷風トキソイド(TT)に結合させる効果を試験した。新しいグリコペプチドワクチン結合体であるβ−(Man)3−Fba−TTは、アジュバントとしてミョウバン又はMPLのいずれかと共に投与すると、ロバストな抗体反応を誘導したため、高度に免疫原性であることが証明された。更に、2回目の追加免疫投与の前に、β−(Man)3及びFbaペプチドエピトープの両方に対して、IgMからIgG抗体へのアイソタイプスイッチが生じた。この結果は、記憶細胞応答を示し、長期的な免疫を誘導することができるワクチンであることを示した。最も重要なことには、ミョウバン又はMPLのいずれかと共に投与したβ−(Man)3−Fba−TT結合体は、元のDC/CFA免疫手法[7]で観察された高レベルの防御と同等の播種性カンジダ症に対する防御を誘導した。
また、β−(Man)3−Fba−TTを単独で投与し、ミョウバン又はMPLのいずれかとの混合物としての結合体の投与と比較した。いずれかのアジュバントで調製されたβ−(Man)3−Fba−TT結合体を受容したマウスは、ロバストな抗体応答を示ことにより予想通りに応答した。驚くべきことに、一切のアジュバントを有してないβ−(Man)3−Fba−TTを受容したマウスも、良好に応答した。ワクチン接種マウスの3群は全て、有意に増加した生存期間及び有意に低減されたか又は検出不能な犠牲時の腎臓真菌量により明らかなように、チャレンジの前にアジュバント又はDPBS緩衝液のみを受容した対照群と比較して、C.アルビカンスでの致死的チャレンジに対する高レベルの防御を示した。更に、β−(Man)3−Fba−TT結合体に対して免疫したマウスに由来する血清は、播種性カンジダ症に対する防御を未感作マウスに転移させたが、C.アルビカンスで事前に吸収された免疫血清は、転移させなかった。これにより、誘導された抗体が防御性だったことが確認された。これらの結果は、TTをワクチン結合体に付加することにより、追加のアジュバントを必要とせずに十分な自己アジュバント活性がもたらされたことを示しており、自己アジュバント性グリコペプチドをワクチンとして使用することが支持されている。
また、C.アルビカンスで致死的チャレンジした後のマウスの生存延長に対するβ−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンの効力は、非近交系マウスで実証された。β−(Man)3−Fba−TT結合ワクチンは、アジュバントが存在していなくともSwiss Websterマウスで免疫原性であり、強力なグリカン及びペプチド特異的抗体を誘発し、カンジダ症に対する防御を誘導した。この非近交系マウスモデルでのワクチン媒介性防御は、腎臓のCFUレベルの低減と関連していた。まとめると、BALB/c及びC57BL/6マウスでのワクチン効力により明らかなように、防御がMHCバイアスを示したという証拠は見出されなかった。非近交系マウスでのワクチンの有効性は、この製剤がヒトでも同様に防御を誘導することができることを更に支持する。この理論により束縛されることは望まないが、本発明者らは、宿主が免疫学的に正常な場合、能動免疫の確立は、後の免疫不全事象の際にその宿主を防御することになると考える。
β−(Man)3−Fba−TTワクチンにより誘導された特異的抗体の検出は、プレートのウェルが、抗グリカン抗体及び抗ペプチド抗体を検出するために、それぞれウシ血清アルブミンに結合されたβ−(Man)3又はMAP結合体としてのFbaペプチドのいずれかでコーティングされたELISAにより決定した。グリカン及びペプチドエピトープの両方に対する応答の特異性を、遊離可溶性β−(Man)3又はFbaペプチドが、用量依存的な様式で免疫血清中の抗体結合を阻害した阻害ELISAにより確認した(データ非表示)。実際の真菌細胞表面との特異的抗体の結合は、フローサイトメトリー分析により確認した。これにより、C.アルビカンス酵母型に対する結合が示され、酵母型及び菌糸型との抗体反応性が間接免疫蛍光法顕微鏡法により示された。
ワクチンの一部としてグリカンを保持することの1つの利点は、以下の通りである:Fbaペプチドは、C.アルビカンスに特有であるが(上記で報告されている修飾Fbaを除く)、β−(Man)3に対する応答は、C.トロピカリス(C.tropicalis)[25]、C.ルシタニエ(C.lusitaniae)[59]、C.ギリエルモンジィ[60]、及び大多数のC.グラブラタ株[61]を含む、種々の他の臨床的に重要なカンジダ種による感染症に対する防御をもたらすと予想されるだろう。
(実施例21)
破傷風トキソイドに結合されたβ−manトリサッカライド−Fba及びFbaペプチドの合成
結合体6及び7の合成は、図29及び図30A〜30Eに示されている。トリサッカライドトリエチレングリコールリンカーを、S.Dziadekら、「A novel linker methodology for the synthesis of tailored conjugate vaccines composed of complex carbohydrate antigens and specific TH−cell peptide epitopes」、Eur.J.Chem.、14巻、5908〜5917頁(2008年)[62]の化合物5について記載されているように合成した。(明確にしておくが、Dziadekらの化合物5は、本開示では代わりに化合物3と指定されており、本開示の化合物5は、Dziadekらの化合物5とは異なることに留意されたい。)
Fbaペプチドを、まず固相ペプチド合成マトリックスにLysを結合させることにより合成した。α−アミノ基をFmocで保護し、ε−アミノ基をivDde(1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロ−ヘキシリデン)−3−メチルブチル)で保護した。その後、新しいリンカーを使用して、トリエチレングリコールスペーサを導入した。その後、Fbaペプチドを、この新しいリンカーのN末端に付加した。樹脂からの切断の前に、対照参照ペプチドを提供するために、N末端をN−アセチル化したか、又は化合物3と結合するためのチオールを提供するために、チオールプロピオン酸を付加したかのいずれかを行った。対照ペプチド及びグリコシル化ペプチドは両方とも、ivDde基を除去し、S−アセチルチオグリコール酸を、リジンのω−アミノ基に付加した。これにより、その後Fbaペプチド1又はMan3−Fbaペプチド4のいずれかを破傷風トキソイドに結合させることができる反応性C末端チオール基が提供された。破傷風トキソイドは、まずブロモアセタート基を、担体タンパク質の接近可能なリジン残基に導入し、その後それらを破傷風トキソイドペプチドと反応させることにより、結合用に活性化した。化合物1及び5を反応させることにより、対照結合体6を得た。グリコペプチド4を5と反応させることにより、ワクチン結合体7を得た。免疫及びチャレンジ実験に使用するための最終結合体は、化合物6及び7だった。
破傷風トキソイドに結合されたβ−manトリサッカライド−Fba及びFbaペプチドの合成
結合体6及び7の合成は、図29及び図30A〜30Eに示されている。トリサッカライドトリエチレングリコールリンカーを、S.Dziadekら、「A novel linker methodology for the synthesis of tailored conjugate vaccines composed of complex carbohydrate antigens and specific TH−cell peptide epitopes」、Eur.J.Chem.、14巻、5908〜5917頁(2008年)[62]の化合物5について記載されているように合成した。(明確にしておくが、Dziadekらの化合物5は、本開示では代わりに化合物3と指定されており、本開示の化合物5は、Dziadekらの化合物5とは異なることに留意されたい。)
Fbaペプチドを、まず固相ペプチド合成マトリックスにLysを結合させることにより合成した。α−アミノ基をFmocで保護し、ε−アミノ基をivDde(1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロ−ヘキシリデン)−3−メチルブチル)で保護した。その後、新しいリンカーを使用して、トリエチレングリコールスペーサを導入した。その後、Fbaペプチドを、この新しいリンカーのN末端に付加した。樹脂からの切断の前に、対照参照ペプチドを提供するために、N末端をN−アセチル化したか、又は化合物3と結合するためのチオールを提供するために、チオールプロピオン酸を付加したかのいずれかを行った。対照ペプチド及びグリコシル化ペプチドは両方とも、ivDde基を除去し、S−アセチルチオグリコール酸を、リジンのω−アミノ基に付加した。これにより、その後Fbaペプチド1又はMan3−Fbaペプチド4のいずれかを破傷風トキソイドに結合させることができる反応性C末端チオール基が提供された。破傷風トキソイドは、まずブロモアセタート基を、担体タンパク質の接近可能なリジン残基に導入し、その後それらを破傷風トキソイドペプチドと反応させることにより、結合用に活性化した。化合物1及び5を反応させることにより、対照結合体6を得た。グリコペプチド4を5と反応させることにより、ワクチン結合体7を得た。免疫及びチャレンジ実験に使用するための最終結合体は、化合物6及び7だった。
試薬及び基本方法
酢酸(AcOH)及びジクロロメタン(DCM)は、Fisher Scientific社から得た。HPLC用のN,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)、N−メチルピロリドン(NMP)、及びアセトニトリル(CH3CN)は、Caledon Labs社から得た。ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)及びO−ベンゾトリアゾール−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)は、Matrix Innovation社から得た。N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、4−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、トリフルオロ酢酸(TFA)、及びトリイソプロピルシラン(TIPS)は、Sigma−Aldrich社(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)から得た。Novasyn TGA樹脂及びNα−Fmocアミノ誘導体は、Nova Biochem社から得た。
酢酸(AcOH)及びジクロロメタン(DCM)は、Fisher Scientific社から得た。HPLC用のN,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)、N−メチルピロリドン(NMP)、及びアセトニトリル(CH3CN)は、Caledon Labs社から得た。ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)及びO−ベンゾトリアゾール−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)は、Matrix Innovation社から得た。N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、4−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、トリフルオロ酢酸(TFA)、及びトリイソプロピルシラン(TIPS)は、Sigma−Aldrich社(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)から得た。Novasyn TGA樹脂及びNα−Fmocアミノ誘導体は、Nova Biochem社から得た。
Fmoc保護トリエチレングリコールスペーサの合成は、Keil,C.Claus、W.Dippold、H.Kunz、Angew.Chem.2001年 113巻、379頁、及びAngew.Chem.Int.Ed.2001年、40巻、366頁[66]に記載の手順に従った。脱イオン水は、Millipore社製イオン交換デバイスで準備した。ペプチド合成前及び合成後の両固体支持体の手作業による処理は、最上部にメス45/50フィッティングを有し、底部にはフィルターフリットにより覆われている24/40オス真空フィティングを有する球状250mLペプチド合成反応器を用いて実施した(Schott社、ドイツ)。IKA Vibrax VRボルテックス装置を使用して、手作業処理中、樹脂懸濁液を穏やかに撹拌した。Fbaは、Applied BioSystems社のABI 433A自動ペプチド合成機で合成した。
Empower2ソフトウェア、Delta600溶媒送達システム、及びW2996フォトダイオードアレイ検出器を装備したWaters社製HPLCシステムを、HPLC分析及び精製に使用した。Phenomenex Luna社製C18(2)5μm HPLCカラムを、分析用及び調製用分離に使用した。分析用HPLC分離には、4.6mm×250mmカラムで1mL分−1の移動相流速を使用した。調製用HPLC分離には、21.5mm×250mmカラムで10mL分−1の流速を使用した。
212nmでのUV吸光度を使用して、分析用及び精製用に、ペプチド誘導化合物の溶出を決定した。マトリックスイオン化レーザ脱離イオン化(MALDI)−飛行時間型質量分析法(TOF MS)を使用して、所望のペプチド又はグリコ−ペプチド結合体を含有するUV活性HPLC画分を特定した。MALDI−TOFには、ステンレス鋼板でシナピン酸マトリックスを使用した。このマトリックスから、プロトン化されナトリウム付加されたイオンとして、成分がイオン化及び脱離して同定される。
Fmoc−Lys(ivDde)−NovasynTG
アルゴン雰囲気下で、NovaSyn TGA樹脂(0.5g、90μm、公称能力 0.26mmol/g)を、メリフィールド反応器中の乾燥DCM(5mL)で膨潤させた。2時間後、過剰DCMをろ過により除去し、乾燥DMF(2mL)を添加した。その後、樹脂を30分間消化した。これと並行して、154(7.7当量)DICを、乾燥DCM(15mL)中の1.150g(15.4当量)Fmoc−Lys(ivDde)−OHの冷却(0℃)溶液に、アルゴン下で滴加し、混合物を20分間撹拌した。混合物を、減圧下で濃縮し、その結果生じた対称無水物を、白色固形物として単離した。その後、乾燥DMF(2mL)を添加し、その結果生じた溶液を、手動ペプチド反応器に移した。その後、8mg(0.5当量)DMAPを添加して、樹脂のヒドロキシベンジル官能性に対する無水物の結合を触媒した。3時間後、樹脂を、1回10mLの乾燥DMFで5回洗浄し、その後1回10mLのDCMで5回洗浄した。樹脂の負荷量を、以前に記述されているように決定した[54](0.26mmol/g、100%)。レジンを減圧下で16時間乾燥した。残留乾燥樹脂の正味重量は、540mg(94%)だった。
アルゴン雰囲気下で、NovaSyn TGA樹脂(0.5g、90μm、公称能力 0.26mmol/g)を、メリフィールド反応器中の乾燥DCM(5mL)で膨潤させた。2時間後、過剰DCMをろ過により除去し、乾燥DMF(2mL)を添加した。その後、樹脂を30分間消化した。これと並行して、154(7.7当量)DICを、乾燥DCM(15mL)中の1.150g(15.4当量)Fmoc−Lys(ivDde)−OHの冷却(0℃)溶液に、アルゴン下で滴加し、混合物を20分間撹拌した。混合物を、減圧下で濃縮し、その結果生じた対称無水物を、白色固形物として単離した。その後、乾燥DMF(2mL)を添加し、その結果生じた溶液を、手動ペプチド反応器に移した。その後、8mg(0.5当量)DMAPを添加して、樹脂のヒドロキシベンジル官能性に対する無水物の結合を触媒した。3時間後、樹脂を、1回10mLの乾燥DMFで5回洗浄し、その後1回10mLのDCMで5回洗浄した。樹脂の負荷量を、以前に記述されているように決定した[54](0.26mmol/g、100%)。レジンを減圧下で16時間乾燥した。残留乾燥樹脂の正味重量は、540mg(94%)だった。
H−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(ivDde)−NovasynTG
側鎖が保護された樹脂と結合したペプチドを、540mgのFmoc−Lys−(ivDde)−NovaSynTGから出発して、標準的迅速Moc0.10mmolプロトコールの改良版を使用して、ABI 433A自動合成機で構築した。機械的ボルテックス装置に設置したテフロン(登録商標)反応容器で、アミノ酸残基を、15サイクルでC末端からN末端へと順次付加した。各サイクル中、先行するN末端Nα−Fmoc基を、DMF中のピペリジン(20%)溶液を使用した脱保護ステップでペプチド鎖から取り除き、その後結合ステップで、ペプチド鎖を1個アミノアシル残基分だけ伸長させた。未反応ペプチド鎖を、キャッピングステップでアセチル化し、試薬及び副産物を、次のサイクルを準備する洗浄ステップで取り除いた。Nα−Fmoc脱保護ステップの回数は、樹脂結合ペプチドをNMP中20%ピペリジンで最大4回初期処理した後の溶出液中のFmoc−ピペリジン付加物の検出に応じて、サイクル毎に異なっていた。各処理の後に形成されたFmoc−ピペリジン付加物の濃度は、メタノールで希釈した脱保護溶出液の分割量を使用して、Perkin Elmer社製シリーズ200UV検出器で測定した。2回目及び3回目の処理後、最初の処理後に測定した濃度の4.5%未満のシグナルが測定されると、終了が指示され、そのサイクルの脱保護が自動的に終了された。3回目の処理が、この条件を満たさなかった場合、合成機は、300単位以下のシグナルが測定されるまで、各々8分間の追加処理を実施した。
側鎖が保護された樹脂と結合したペプチドを、540mgのFmoc−Lys−(ivDde)−NovaSynTGから出発して、標準的迅速Moc0.10mmolプロトコールの改良版を使用して、ABI 433A自動合成機で構築した。機械的ボルテックス装置に設置したテフロン(登録商標)反応容器で、アミノ酸残基を、15サイクルでC末端からN末端へと順次付加した。各サイクル中、先行するN末端Nα−Fmoc基を、DMF中のピペリジン(20%)溶液を使用した脱保護ステップでペプチド鎖から取り除き、その後結合ステップで、ペプチド鎖を1個アミノアシル残基分だけ伸長させた。未反応ペプチド鎖を、キャッピングステップでアセチル化し、試薬及び副産物を、次のサイクルを準備する洗浄ステップで取り除いた。Nα−Fmoc脱保護ステップの回数は、樹脂結合ペプチドをNMP中20%ピペリジンで最大4回初期処理した後の溶出液中のFmoc−ピペリジン付加物の検出に応じて、サイクル毎に異なっていた。各処理の後に形成されたFmoc−ピペリジン付加物の濃度は、メタノールで希釈した脱保護溶出液の分割量を使用して、Perkin Elmer社製シリーズ200UV検出器で測定した。2回目及び3回目の処理後、最初の処理後に測定した濃度の4.5%未満のシグナルが測定されると、終了が指示され、そのサイクルの脱保護が自動的に終了された。3回目の処理が、この条件を満たさなかった場合、合成機は、300単位以下のシグナルが測定されるまで、各々8分間の追加処理を実施した。
次に、密封テフロン(登録商標)カートリッジに保持された、1mmolの対応するNα−Fmocアミノ酸誘導体を、3mLのNMPに溶解した。その後、0.9mmolのHBTUをカートリッジに添加して、1mmol HOBt及び2mmol DIPEAの存在下で、対応するアミノアシルHOBtエステルを生成した。窒素ガス圧力により、活性エステルをカートリッジから樹脂に移動させ、その反応容器中の樹脂を機械的にボルテックスすることにより、固体支持体の浸透を加速させ、迅速な反応を促進させた。0.5M無水酢酸、0.014M HOBt、及び0.129M DIPEAのキャッピング溶液での処理を使用して、未反応ペプチド鎖を不活性化し、欠失配列の合成を防止した。合成は、Nα−Fmoc基が、以前に記述されている脱保護ステップにより取り除かれた最終サイクルで終了し、樹脂結合ペプチドを、NMPで、その後DCMでよく洗浄した。手動ペプチド反応器中で、樹脂を10mL DCMで5回及び10mLメタノールで5回処理し、その後減圧下で乾燥した。樹脂及び樹脂結合保護ペプチドの質量は、708mg(粗質量による収率は80%)だった。
AcYGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEK−K(SATA)−OH(化合物1)
側鎖保護されたペプチドを保持する乾燥樹脂(320mg、44μmol)H−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(ivDde)−NovasynTGを、手動ペプチド反応器中の5mL乾燥DCMで穏やかにかき混ぜた。その後、120mLピリジン(1.5mmol、34当量)及び60μL Ac2O(636μmol、14当量)を添加し、混合物を2時間撹拌しながら、N末端アミンをアセチル化した。その後、液相を反応器から排出し、樹脂を、1回10mLのDCMで3回洗浄した。C末端リジン残基のivDde保護基を、3.3mLのDMF中5%(w/v)ヒドラジンで3回、各々5分間処理することにより取り除いた。1回10mLのDMFで5回洗浄した後、2mL乾燥DMF及び15μL(86μmol、2.0当量)DIPEAに溶解した40mg(173μmol、3.9当量)のN−ヒドロキシサクシニミジルS−アセチル−チオアセタート(SATA)を添加し、樹脂を1時間振とうした。溶液を反応容器から排出し、樹脂を、1回5mLのDMFで3回洗浄し、その後1回5mLのDCMで3回洗浄した。7mL TFA:450μL H2O:450μL TISの混合物で樹脂を2時間処理することにより、ペプチドを固体支持体から切離し、同時に側鎖保護基を取り除いた。溶液を、反応器から100mL丸底フラスコに排出し、樹脂を、1回10mLのTFAで2回すすいだ。ロータリーエバポレータにより、ほとんどのTFAを粗ペプチド溶液から除去した。室温、減圧下での揮発性化合物の除去を支援するために、1回5mLのトルエンを3回フラスコに添加した。
側鎖保護されたペプチドを保持する乾燥樹脂(320mg、44μmol)H−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(ivDde)−NovasynTGを、手動ペプチド反応器中の5mL乾燥DCMで穏やかにかき混ぜた。その後、120mLピリジン(1.5mmol、34当量)及び60μL Ac2O(636μmol、14当量)を添加し、混合物を2時間撹拌しながら、N末端アミンをアセチル化した。その後、液相を反応器から排出し、樹脂を、1回10mLのDCMで3回洗浄した。C末端リジン残基のivDde保護基を、3.3mLのDMF中5%(w/v)ヒドラジンで3回、各々5分間処理することにより取り除いた。1回10mLのDMFで5回洗浄した後、2mL乾燥DMF及び15μL(86μmol、2.0当量)DIPEAに溶解した40mg(173μmol、3.9当量)のN−ヒドロキシサクシニミジルS−アセチル−チオアセタート(SATA)を添加し、樹脂を1時間振とうした。溶液を反応容器から排出し、樹脂を、1回5mLのDMFで3回洗浄し、その後1回5mLのDCMで3回洗浄した。7mL TFA:450μL H2O:450μL TISの混合物で樹脂を2時間処理することにより、ペプチドを固体支持体から切離し、同時に側鎖保護基を取り除いた。溶液を、反応器から100mL丸底フラスコに排出し、樹脂を、1回10mLのTFAで2回すすいだ。ロータリーエバポレータにより、ほとんどのTFAを粗ペプチド溶液から除去した。室温、減圧下での揮発性化合物の除去を支援するために、1回5mLのトルエンを3回フラスコに添加した。
15mLのジエチルエーテルを0℃で添加することにより、ペプチドを析出させた。析出したペプチドは、フラスコに付着した白色固形物として出現した。上清をパスツールピペットで取り除き、ペプチドを1回15mLのジエチルエーテルで2回洗浄して不純物を除去した。粗ペプチドを、減圧下で一晩十分に乾燥した。粗ペプチドの最終質量は、54mgだった。その後、粗ペプチドを、0.1%TFAを有する75%CH3CN及び25%H2Oの溶液に溶解し、50分間で75:25から60:40の0.1%TFAの調節剤を有するH2O:CH3CN勾配を用いて、逆相クロマトグラフィーにより精製した。溶出液を、25.8から27.2分まで収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、白色固形物、質量26mg(12μmol、27.1%)として化合物1を得た。
HS(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(SATA)−OH(化合物2)
433A合成機中で、335mg(46μmol)の樹脂結合側鎖保護ペプチドH−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(ivDde)−NovasynTGを、DCMで、その後NMPで膨潤させた。その後、遊離アミノ末端を、Fmoc−アミノ酸の標準的プロトコールに従って、1mmolの3−(S−トリチル)−チオプロパン酸でアシル化し、HBTU溶液により活性化して、保護された樹脂結合ペンタデカペプチドを得た。DMFで、その後DCMで洗浄して、反応副産物を除去した。その後、ペプチド樹脂を、手動ペプチド反応器に移した。3.3mLのDMF中5%(w/v)ヒドラジンで3回、各々5分間処理することにより、C末端リジン残基からivDde保護基を取り除いた。樹脂を、1回10mLのDMFで5回洗浄した。その後、2mL乾燥DMF及び15μL(86μmol、1.9当量)DIPEAに溶解した44mg(190μmol、4.1当量)のN−ヒドロキシサクシニミジルS−アセチル−チオアセタート(SATA)を添加し、樹脂を1時間振とうした。溶液を反応容器から排出し、樹脂を、1回5mLのDMFで3回洗浄し、その後1回5mLのDCMで3回洗浄した。8.3mL TFA:420μL H2O:420μL TIS:830μL EDTの混合物で固体支持体を2時間処理することにより、側鎖保護基を取り除き、ペプチドを樹脂から切り離した。溶液を、反応器から100mL丸底フラスコに排出し、樹脂を、1回10mLのTFAで2回すすいだ。ロータリーエバポレータを使用して、ほとんどのTFAを粗ペプチド溶液から除去した。室温、減圧下での揮発性化合物の除去を支援するために、1回5mLのトルエンを3回フラスコに添加した。15mLのジエチルエーテルを0℃で添加することにより、ペプチドを析出させた。ペプチド析出物は、フラスコに付着した白色固形物だった。上清をパスツールピペットで取り除き、ペプチドを1回15mLのジエチルエーテルで2回洗浄して不純物を除去した。粗ペプチドを、減圧下で一晩十分に乾燥した。粗ペプチドの最終質量は、40mg(18.3μmol、41%)だった。粗ペプチドを、0.1%TFAを有する75%CH3CN及び25%H2Oの溶液に溶解し、50分間で75:25から65:35の、0.1%TFAの調節剤を有するH2O:CH3CN勾配を用いて、逆相クロマトグラフィーにより精製した。溶出液を、34.0から35.2分まで収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、白色固形物、質量24mg(11μmol、24%)として化合物2を得た。
433A合成機中で、335mg(46μmol)の樹脂結合側鎖保護ペプチドH−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(ivDde)−NovasynTGを、DCMで、その後NMPで膨潤させた。その後、遊離アミノ末端を、Fmoc−アミノ酸の標準的プロトコールに従って、1mmolの3−(S−トリチル)−チオプロパン酸でアシル化し、HBTU溶液により活性化して、保護された樹脂結合ペンタデカペプチドを得た。DMFで、その後DCMで洗浄して、反応副産物を除去した。その後、ペプチド樹脂を、手動ペプチド反応器に移した。3.3mLのDMF中5%(w/v)ヒドラジンで3回、各々5分間処理することにより、C末端リジン残基からivDde保護基を取り除いた。樹脂を、1回10mLのDMFで5回洗浄した。その後、2mL乾燥DMF及び15μL(86μmol、1.9当量)DIPEAに溶解した44mg(190μmol、4.1当量)のN−ヒドロキシサクシニミジルS−アセチル−チオアセタート(SATA)を添加し、樹脂を1時間振とうした。溶液を反応容器から排出し、樹脂を、1回5mLのDMFで3回洗浄し、その後1回5mLのDCMで3回洗浄した。8.3mL TFA:420μL H2O:420μL TIS:830μL EDTの混合物で固体支持体を2時間処理することにより、側鎖保護基を取り除き、ペプチドを樹脂から切り離した。溶液を、反応器から100mL丸底フラスコに排出し、樹脂を、1回10mLのTFAで2回すすいだ。ロータリーエバポレータを使用して、ほとんどのTFAを粗ペプチド溶液から除去した。室温、減圧下での揮発性化合物の除去を支援するために、1回5mLのトルエンを3回フラスコに添加した。15mLのジエチルエーテルを0℃で添加することにより、ペプチドを析出させた。ペプチド析出物は、フラスコに付着した白色固形物だった。上清をパスツールピペットで取り除き、ペプチドを1回15mLのジエチルエーテルで2回洗浄して不純物を除去した。粗ペプチドを、減圧下で一晩十分に乾燥した。粗ペプチドの最終質量は、40mg(18.3μmol、41%)だった。粗ペプチドを、0.1%TFAを有する75%CH3CN及び25%H2Oの溶液に溶解し、50分間で75:25から65:35の、0.1%TFAの調節剤を有するH2O:CH3CN勾配を用いて、逆相クロマトグラフィーにより精製した。溶出液を、34.0から35.2分まで収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、白色固形物、質量24mg(11μmol、24%)として化合物2を得た。
βMan3−S(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(SATA)−OH(化合物4)
1mLの50mM Tris HCl緩衝液(pH8.9)及び250μLメタノールの混合物を、減圧下で10分間超音波処理することにより脱気し、その後アルゴンを拡散させた。脱気した緩衝溶液を使用して、2mL微量遠心バイアル中に、2.7mg(3.1μmol)β−マンノシドアクリラート(化合物3)及び8.7mg(3.9μmol、1.3当量)HS(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(SATA)−OH(化合物2)を溶解した。混合物を、短期間遠心分離して、依然として未溶解の物質がないかどうかを評価し、その後暗所に2時間置いて反応させた。混合物を10mm、0.2μmのPVDFフィルターでろ過し、未溶解の物質を除去し、その後混合物を、0.02%酢酸を含有する85:15から65:35のH2O:CH3CN勾配を使用して、HPLCにより直ちに精製した。グリコール−ペプチド結合体は、50.5〜52.3分で溶出された。この物質を収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、収量6.6mg(2.1μmol、69%)の表題化合物4を白色固形物として得た。
1mLの50mM Tris HCl緩衝液(pH8.9)及び250μLメタノールの混合物を、減圧下で10分間超音波処理することにより脱気し、その後アルゴンを拡散させた。脱気した緩衝溶液を使用して、2mL微量遠心バイアル中に、2.7mg(3.1μmol)β−マンノシドアクリラート(化合物3)及び8.7mg(3.9μmol、1.3当量)HS(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(SATA)−OH(化合物2)を溶解した。混合物を、短期間遠心分離して、依然として未溶解の物質がないかどうかを評価し、その後暗所に2時間置いて反応させた。混合物を10mm、0.2μmのPVDFフィルターでろ過し、未溶解の物質を除去し、その後混合物を、0.02%酢酸を含有する85:15から65:35のH2O:CH3CN勾配を使用して、HPLCにより直ちに精製した。グリコール−ペプチド結合体は、50.5〜52.3分で溶出された。この物質を収集し、瞬間冷凍し、凍結乾燥して、収量6.6mg(2.1μmol、69%)の表題化合物4を白色固形物として得た。
破傷風トキソイドに対するペプチドAcYGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(SATA)−OH及びβMan3−S(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE(配列番号1)−TEG−K(SATA)−OHの結合
磁気撹拌子を有する4mLガラスキンブルバイアルのPBS(1.3mL、pH7.4)中の単量体破傷風トキソイド(10mg)に、2mgのブロモ酢酸NHSエステルを添加した。バイアルを、アルミニウムホイルで包み、3時間磁気撹拌器に置いておいた。ブロモアセチル化破傷風トキソイド(化合物5)を、較正済みG25カラムを用いてPBSで精製した。収集画分を、Amicon Millipore社製遠心ろ過ユニット(10kDa)で約0.5mLに濃縮し、溶液を、2mLのEppendorf社製チューブに移した。Fbaペプチド(化合物1)(6.5mg)を、0.5Mヒドロキシルアミン及び25mM EDTAを含有する0.1M PBS(0.5mL、pH7.4)に溶解し、溶液を、ブロモアセチル化破傷風トキソイド、化合物5に添加した。チューブをアルミニウムホイルで包み、反転ミキサーに37℃で2日間置いておいた。その後、結合体を、0.1M Tris HCl(pH7.5)で平衡化されたSuperdex S200カラム(2×100cm)で精製した。結合体に対応する画分を収集し、PBSに対して透析し、濃縮した。
磁気撹拌子を有する4mLガラスキンブルバイアルのPBS(1.3mL、pH7.4)中の単量体破傷風トキソイド(10mg)に、2mgのブロモ酢酸NHSエステルを添加した。バイアルを、アルミニウムホイルで包み、3時間磁気撹拌器に置いておいた。ブロモアセチル化破傷風トキソイド(化合物5)を、較正済みG25カラムを用いてPBSで精製した。収集画分を、Amicon Millipore社製遠心ろ過ユニット(10kDa)で約0.5mLに濃縮し、溶液を、2mLのEppendorf社製チューブに移した。Fbaペプチド(化合物1)(6.5mg)を、0.5Mヒドロキシルアミン及び25mM EDTAを含有する0.1M PBS(0.5mL、pH7.4)に溶解し、溶液を、ブロモアセチル化破傷風トキソイド、化合物5に添加した。チューブをアルミニウムホイルで包み、反転ミキサーに37℃で2日間置いておいた。その後、結合体を、0.1M Tris HCl(pH7.5)で平衡化されたSuperdex S200カラム(2×100cm)で精製した。結合体に対応する画分を収集し、PBSに対して透析し、濃縮した。
グリコペプチドβMan3−Fba化合物4(3.9mg)を、同じ手順を使用して、ブロモアセチル化破傷風トキソイド化合物5(4.4mg)に結合させた。
送達の前に、各結合体を、水で平衡化されたG−25カラムで脱塩し、凍結乾燥した。
送達の前に、各結合体を、水で平衡化されたG−25カラムで脱塩し、凍結乾燥した。
Fba−破傷風トキソイド結合体化合物6をもたらすペプチドの組み込みをMALDIで推定すると、平均値が11.7であり、βMan3−Fba−破傷風トキソイド結合体化合物7の場合は、組み込み平均値は5.5と決定された。つまり、破傷風トキソイドの1分子当たりの結合されたペプチド又はグリコペプチド分子の平均数は、11.7(11〜12の範囲内にあるほとんどの値)又は5.5(5〜6の範囲内のほとんどの値)であると決定された。
文献リスト
本出願で引用された全ての参考文献の完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、以下の文献が参照により組み込まれる:(1)H.Xin、J.Cartmell、D.R.Bundle、及びJ.E.Culter、「New strategies to present an anti−Candidiasis synthetic glycopeptides vaccine acceptable for human use」、Gordon Conferenceでのポスター発表、2011年1月、ガルベストン、テキサス州;(2)H.Xin、J.Cartmell、D.R.Bundle、及びJ.E.Cutler、「Anti−candidasis synthetic glycopeptides vaccine with adjuvant can induce protective immunity in mice」、第111回General Meeting of the American Society of Microbiologyでの抄録、ニューオーリンズ、ルイジアナ州、2011年5月20〜24日;(3)H.Xinら、「Vaccine and monoclonal antibody that enhance mouse resistance to Candidiasis」、Clinical and Vaccine Immunoogy、18巻、1656〜1667頁(2011年8月10日に電子公開);及びH.Xinら、「Self−adjuvanting glycopeptide conjugate vaccine against disseminated Candidiasis」、PLoSに掲載決定、2012年。しかしながら、別様に相いれない矛盾がある場合には、本明細書が優先するものとする。
Claims (37)
- カンジダ症感染に対する防御用のワクチン組成物であって、PRIGGQRELKKITE(Met6;配列番号2)及びQGETEEALIQKRSY(Hwp1;配列番号3)からなる群から選択される免疫学的有効量のペプチドを含み、前記ペプチドが、β−1,2−マンノトリオース及び薬学的に許容される担体に結合されていないワクチン組成物。
- 1つ又は複数がアジュバントを更に含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
- ミョウバンを更に含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
- モノホスホリルリピドA(MPL)を更に含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 前記ペプチドが、タンパク質担体に結合されている、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 前記タンパク質担体が、破傷風トキソイド及び破傷風トキソイドのTHエピトープからなる群から選択される、請求項5に記載のワクチン組成物。
- カンジダ症感染に対する防御用の結合型ワクチンであって、カンジダ細胞壁タンパク質に由来する免疫学的有効量のT細胞ペプチドを含み、前記ペプチドが、β−1,2−マンノトリオース及びタンパク質担体に結合されている結合型ワクチン。
- 前記タンパク質担体が、破傷風トキソイド及び破傷風トキソイドのTHエピトープからなる群から選択される、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- 前記タンパク質担体が、破傷風トキソイドである、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- 前記T細胞ペプチドが、配列番号1〜3及び8〜20からなる群から選択されるペプチドである、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- 前記ペプチドが、配列番号1である、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- 1つ又は複数のアジュバントを更に含む、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- ミョウバンを更に含む、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- モノホスホリルリピドAを更に含む、請求項7に記載の結合型ワクチン。
- 侵襲性真菌疾患に対する防御用のペプチドワクチンであって、配列番号8〜20からなる群から選択される免疫学的有効量のペプチドを含むペプチドワクチン。
- 1つ又は複数のアジュバント更に含む、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- ミョウバンを更に含む、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- モノホスホリルリピドAを更に含む、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- 前記ペプチドが、タンパク質担体に結合されている、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- 前記タンパク質担体が、破傷風トキソイド及び破傷風トキソイドのTHエピトープからなる群から選択される、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- 前記タンパク質担体が、破傷風毒素である、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- 前記ペプチドが、β−1,2−マンノトリオースに結合されている、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- 前記ペプチドが、β−1,2−マンノトリオース及び破傷風トキソイドに結合されている、請求項15に記載のペプチドワクチン。
- カンジダ症に対する免疫の方法であって、そのような治療を必要性とする対象に請求項1〜23のいずれか一項に記載のワクチンを接種することを含む方法。
- カンジダ症を受動治療するための組成物であって、配列番号1〜3及び8〜20からなる群から選択されるカンジダ細胞壁ペプチドと結合する免疫学的有効量のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号1と結合する、請求項25に記載の組成物。
- 前記モノクローナル抗体が、E2−9である、請求項26に記載の組成物。
- 1つ又は複数の追加の抗真菌性化合物を更に含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記1つ又は複数の抗真菌性化合物が、ポリエン抗真菌剤、アゾール、アリルアミン、エキノキャンディン、アゾール、及びβ−(1,2)−マンノトリオースに特異的なモノクローナル抗体、及び配列番号1〜3及び8〜20に特異的なモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項25に記載の組成物。
- カンジダ症に対する受動免疫の方法であって、その必要性のある哺乳動物に、免疫学的有効量の請求項25〜29のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
- 組成物であって、
H−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(ivDde)−NovasynTG、
AcYGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OH、
HS(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OH、
βMan3−S(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OH、
破傷風トキソイドに結合されたAcYGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OH、及び
破傷風トキソイドに結合されたβMan3−S(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OH
からなる群から選択される化合物のうちの1つ又は複数を含む組成物。 - 前記組成物が、
H−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(ivDde)−NovasynTGを含む、請求項31に記載の組成物。 - 前記組成物が、
AcYGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OHを含む、請求項31に記載の組成物。 - 前記組成物が、
HS(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OHを含む、請求項31に記載の組成物。 - 前記組成物が、
βMan3−S(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OHを含む、請求項31に記載の組成物。 - 前記組成物が、
破傷風トキソイドに結合されたAcYGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OHを含む、請求項31に記載の組成物。 - 前記組成物が、
破傷風トキソイドに結合されたβMan3−S(CH2)2CO−YGKDVKDLFDYAQE−TEG−K(SATA)−OHを含む、請求項31に記載の組成物。
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