CZ20003054A3 - Antigeny streptokoků skupiny B - Google Patents

Antigeny streptokoků skupiny B Download PDF

Info

Publication number
CZ20003054A3
CZ20003054A3 CZ20003054A CZ20003054A CZ20003054A3 CZ 20003054 A3 CZ20003054 A3 CZ 20003054A3 CZ 20003054 A CZ20003054 A CZ 20003054A CZ 20003054 A CZ20003054 A CZ 20003054A CZ 20003054 A3 CZ20003054 A3 CZ 20003054A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
polynucleotide
polypeptide
gbs
therapeutic
Prior art date
Application number
CZ20003054A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301056B6 (cs
Inventor
Denis Martin
Bernard R. Brodeur
Clément Rioux
Martine Boyer
Isabelle Charlebois
Josée Hamel
Original Assignee
Biochem Pharma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biochem Pharma Inc. filed Critical Biochem Pharma Inc.
Publication of CZ20003054A3 publication Critical patent/CZ20003054A3/cs
Publication of CZ301056B6 publication Critical patent/CZ301056B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Antigeny streptokoků skupiny B
Oblast vynálezu
Vynález se vztahuje k antigenům, zvláště k proteinovým antigenům bakteriálního patogenu streptokoků skupiny B (GBS), které je možné použít jako vakcinační komponenty pro terapii a/nebo profylaxi.
Dosavadní stav techniky
Streptococcus jsou gram pozitivní bakterie, které se rozdělují do skupin podle specifických sacharidových antigenů A až 0, které se nacházejí na povrchu buňky. Streptokokové skupiny se dále dělí podle typově specifických kapsulárních poiysacharidových antigenů. V případě streptokoků skupiny B (GBS) se identifikovalo několik sérotypů: la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII a VIII. GBS také obsahuje antigenní proteiny, známé jako „C-proteiny (alfa, beta, gama a delta), z nichž některé byly klonovány.
Ačkoli GBS je běžný organizmus normální lidské vaginální flory, tento patogen byl po dlouhou dobu považován za hlavního původce neonatálních sepsí a meningitid, pozdně nastupujících meningitid u kojenců, poporodní endometritidy, stejně jako mastitidy u mléčných stád. Těhotné ženy, které přijdou do kontaktu s GBS, jsou vystaveny riziku poporodní infekce a mohou přenést infekci na své dítě, když dítě prochází porodními cestami. Ačkoli organizmus je citlivý na antibiotika, rychlý nástup infekce a vývoj sepse u novorozenců a meningitidy u kojenců vede k vysoké nemocnosti a úmrtnosti.
Za účelem získání vakcíny, která chrání jedince před infekcí GBS, se výzkum začal zabývat typově specifickými antigeny. Naneštěstí se ukázalo, že tyto polysacharidy jsou u lidí málo imunogenní a jsou omezeny na určitý sérotyp, ze kterého polysacharid pochází. Dále kapsulární polysacharid • · · · ··· ♦ · * · · • · · · « ·· · · • ··· ······ ·· vyvolává odezvu závislou na T buňkách, to znamená, že nedochází k produkci IgG. Kapsulární antigenové polysacharidy nejsou vhodné jako složka vakcíny sloužící k ochraně proti infekci GBC.
Dále se pozornost zaměřila na C-proteinový antigen beta, který demonstruje imunogenní vlastnosti u myší a králičích modelů. Zjistilo se, že tento protein není vhodný jako lidská vakcína, protože reaguje s vysokou afinitou a neimunogenním způsobem s oblastí Fc lidského IgA. C-proteinový antigen alfa se řídce vyskytuje u sérotypu III GBS, což je sérotyp odpovědný za většinu stavů způsobených GBS a proto nachází malé využití jako komponent vakcíny.
Je proto nutné získat antigeny GBS, které se mohou použít jako komponenty vakcíny v případě profylaxe a/nebo terapie infekce GBS.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje izolovaný polynukleotid kódující
polypeptid, který vykazuj e alespoň 70 % : shodu s druhým
polypeptidem obsahujícím sekvenci vybranou ze skupiny
obsahuj ící SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:
19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:
29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:
34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:
39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 44 nebo j ej ich
fragmenty, analogy a deriváty.
Dále se popisují vektory obsahující polynukleotidy podle vynálezu operativně spojené s oblastí řídící expresi, stejně jako hostitelské buňky transfekované uvedenými vektory a způsoby produkující polypeptidy, které zahrnují kultivaci • · • · · · ····· ·· · uvedených hostitelských buněk expresi.
Dále vynález popisuje polynukleotidy podle vynálezu.
za podmínek vhodných pro nové polypeptidy kódované
Vynález popisuje nové antigenní polypeptidy streptokoků skupiny B (GBS) charakterizované aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
SEQ
NO:
14,
18,
23,
28,
33,
38,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO:
nebo jejich fragmenty, analogy a deriváty.
Preferované provedení vynálezu zahrnuje sekvence SEQ ID
NO: 39 a SEQ ID NO: 44.
SEQ Dalším preferovaným ID NO: 39. provedením podle vynálezu je sekvence
SEQ Dalším preferovaným ID NO: 44. provedením podle vynálezu je sekvence
Termíny „fragmenty, „deriváty nebo „analogy polypeptidů
podle vynálezu zahrnují ty polypeptidy, ve kterých jeden nebo více aminokyselinových zbytků jsou nahrazeny konzervativním nebo nekonzervativním aminokyselinovým zbytkem (upřednostňuje se konzervativní j/^^může být přirozený nebo umělý.
Termíny „fragmenty, „deriváty nebo „analogy polypeptidů podle vynálezu také zahrnují polypeptidy podle vynálezu, které jsou upraveny adicí, delecí a substitucí aminokyselin, přičemž polypeptidy si uchovávají kapacitu vyvolat imunitní odezvu.
Termín „konzervativní aminokyselina znamená substituci jedné nebo více aminokyselin jinou aminokyselinou, ve které je • · · · polarity, substituce
Polární neutrální treonin, cystein, Pozitivně nabité (základní) antigenní determinanta (včetně její sekundární struktury a hydropatické povahy) daného antigenu je navzdory substituci zcela nebo částečně konzervativní.
Například jeden nebo více aminokyselinových zbytků v sekvenci se může substituovat jinou aminokyselinou podobné která působí jako funkční ekvivalent, a tato vede k tiché změně. Náhrada aminokyseliny v sekvenci se může vybrat z jiných členů třídy, do které aminokyselina patří. Například nepolární aminokyselina (hydrofobní) zahrnuje alanin, leucin, izoleucin, valin,_ prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin.
aminokyseliny zahrnují glycin, serin, tyrozin, asparagin a glutamin.
aminokyseliny zahrnují arginin, lyzin a histidin. Negativně nabité kyseliny (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a glutamovou.
Upřednostňuje se, aby deriváty a analogy polypeptidů podle vynálezu vykazovaly s těmito sekvencemi zobrazenými na obrázcích nebo s jejich fragmenty 70 % shodu. To znamená, že 70 % zbytků je stejných. Více se upřednostňuje, aby polypeptidy vykazovaly homologii vyšší než 95 %. V jiném preferovaném provedení vynálezu deriváty a analogy polypeptidů podle vynálezu vykazují substituce, úpravy nebo delece méně než 20 aminokyselinových zbytků. Více se upřednostňuje substituce, úpravy nebo delece méně než 10 aminokyselinových zbytků. Preferované substituce jsou ty, které jsou známy v oboru jako konzervativní. To znamená, že substituované zbytky_ sdílí fyzikální a chemické vlastnosti, jako je hydrofobicita, velikost, náboj nebo funkční skupiny.
V těch situacích, kde se zjistilo, že tyto aminokyselinové oblasti jsou polymorfní, může být žádoucí zaměnit jednu nebo více určitých aminokyselin, aby účinněji napodobovaly různé epitopy různých kmenů GBS.
·· · · ·· ··
Dále jsou zahrnuty polypeptidy, na nichž jsou nakondenzovány další sloučeniny, které mění biologické nebo farmakologické vlastnosti polypeptidů, tj. polyetylenglykol (PEG) pro zvýšení poločasu, vedoucí aminokyselinová sekvence nebo aminokyselinová sekvence řídící vylučování pro snadnou purifikaci, prepro- a pro-sekvence a (póly)sacharidy.
Polypeptidy podle vynálezu mohou být dále modifikovány acylcí terminální -NH2 (například acetylací nebo amidací thioglykolovou kyselinou, terminální karbosyamidací, například amoniakem nebo metylaminem) pro získání stability, zvýšené hydrofobity pro spojení nebo navázání na podklad nebo na jinou molekulu.
Také se uvažují hetero- nebo homopolypeptidové multimery polypeptidových fragmentů, analogů a derivátů. Tyto polymerní formy zahrnují například jeden nebo více polypeptidů, které jsou zesítěny za použití síťovadel, jako je biotin/avidin, gluteraldehyd nebo dimetylsuperimidát. Takové polymerní formy také zahrnují polypeptidy obsahující dvě nebo více tandemových nebo obrácených souvislých sekvencí vzniklých z multicistronových mRNA, vytvořených technologií rekombinace DNA.
Přednostně obsahuje fragment, analog nebo derivát polypeptidů podle vynálezu alespoň jednu antigenní oblast, tj . alespoň jeden epitop.
Za účelem dosáhnout vytvoření antigenních polymerů (tj syntetických multimérů), se mohou využít polypeptidy mající bishaloacetylové skupiny, nitroarylhalidy nebo podobně, přičemž činidla jsou specifická pro thioskupiny. Proto může být spojení mezi dvěma merkaptoskupinami různých peptidů tvořeno jednoduchou vazbou nebo může být složeno ze spojovací skupinyu alespoň dvou, v typickém případě alespoň čtyř a ne více než 16, ale obvykle ne více než asi 14 atomů uhlíku.
V určitém provedení polypeptidové fragmenty, analogy a deriváty podle vynálezu neobsahují počáteční zbytek methionin • · • · · · • · • · · · • · (Met). Upřednostňuje se, aby polypeptidy neobsahovaly vedoucí nebo sekreční sekvenci (signální sekvence). Signální část polypeptidu podle vynálezu se může stanovit danými metodami molekulární biologie. V obecném případě se může za účelem stanovení počátečního zbytku přirozeného proteinu z kultury GBS izolovat polypeptid a následně sekvenovat, získá se tak sekvence zralého peptidu.
Vynález dále popisuje vakcinační kompozice obsahující jeden nebo více polypeptidů GBS podle vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo adjuvans.
Vhodná adjuvans zahrnují oleje, například Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, sole, to je A1K(SO4)2, AlNH4(SO4)2ř A1(OH)3, A1PO4, oxid křemičitý, kaolin, derivát saponinu, uhlíkaté polynukleotidy, to znamená poly-IC a polyAU a také detoxifikovaný toxin cholery (CTB) a toxin mikroorganizmu E. coli nestabilní za tepla pro indukci mukosální imunity. Preferovaná adjuvans zahrnují QuilA™, Alhydrogel™ a Adjuphos”. Vakcíny podle vynálezu se mohou aplikovat parenterálně injekcí, rychlou infúzi, nosofaryngální absorbcí, dermoabsorbcí nebo bukálně nebo orálně.
Vakcinační kompozice podle vynálezu se používají při léčbě nebo profylaxi streptokokové infekce a/nebo onemocnění a symptomů způsobených streptokokovou infekcí, zvláště streptokoků skupiny A (Streptococcus pyogenes), streptokoků skupiny B (GBC nebo Streptococcus agalactiae) , Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus nocardia, stejně jako Staphylococcus aureus. Obecné informace o streptoko-kách jsou dostupné v publikaci Manual of Clinical Microbiology, P.R.Murray et al., (1995, 6th Edition, ASM Press, Washington, D.C.). Zvláště důležití jsou streptokoci skupiny B Streptococcus agalactiae. V určitém provedení vynálezu se vakcíny aplikují těm jednotlivcům, kteří jsou vystaveni nebezpečí infekce GBS, jako jsou těhotné ženy a kojenci, kterým hrozí sepse, meningitida a pneuomonie, stejně jako
imunokompromitovaní jedinci, kteří trpí cukrovkou, onemocněním jater nebo zhoubným bujením. Vakcíny se mohou také využít ve veterinární medicíně, jako je léčba mastitidy u dobytka, kterou způsobují shora v textu uvedené bakterie stejně jako bakterie E. coli.
Vakcínu podle vynálezu je možné také použít při výrobě medikamentu užívaného při léčbě nebo profylaxi infekce a/nebo onemocnění streptokoky a symptomů způsobených streptokokovou infekci, zvláště u streptokoků skupiny A (Streptococcus pyogenes) , u streptokoků skupiny B (GBC a Streptococcus agalactíae) , Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus nocardia, stejně jako Staphylococcus aureus. Zvláště důležití jsou streptokoci skupiny B Streptococcus agalactíae.
Vakcinační kompozice se přednostně připravují v jediné dávce, která obsahuje přibližně 0,001 až 100 pg/kg (antigen/tělesná hmotnost) a více se upřednostňuje 0,01 až 10 pg/kg a nejvíce se upřednostňuje 0,1 až 1 pg/kg. Dávka se aplikuje jednou až třikrát s intervalem mezi imunizací přibližně 1 až 12 týdnů. Více se upřednostňuje interval 1 až 6 týdnů.
Vynález dále popisuje polynukleotidy kódující polypeptidy streptokoků skupiny B (GBS) charakterizované aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující: SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,
ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 17, SEQ
NO: 18 , SEQ ID NO: 19, SEQ-ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ
NO: 23 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ
NO: 28 , SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ
NO: 33 , SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ
NO: 38 , SEQ ID NO: 39, : SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 a SEQ
NO: 44 nebo jejich fragmenty, analogy a deriváty.
• · • · · · • · · · · • ··· ······ · · · • · · · ···»· g ······· ·· ·· ·· ··
Preferované polynukleotidy jsou ty zobrazené na obrázcích la (SEQ ID NO: 1), 2a (SEQ ID NO: 7), 3a (SEQ ID NO: 13), 4a (SEQ ID NO: 22), 5a (SEQ ID NO: 27), 6a (SEQ ID NO: 32), 7a (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) a 9 (SEQ ID NO: 43), které odpovídají otevřeným čtecím rámcům, které kódují polypeptidy podle vynálezu.
Preferované polynukleotidy jsou ty zobrazené na obrázcích la (SEQ ID NO: 1), 2a (SEQ ID NO: 7), 3a (SEQ ID NO: 13), 4a (SEQ ID NO: 22), 5a (SEQ ID NO: 27), 6a (SEQ ID NO: 32), 7a (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) a 9 (SEQ ID NO: 43) a jejich fragmenty, analogy a deriváty.
Více preferované polynukleotidy podle vynálezu jsou ty zobrazené na obrázku č. 7 (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) a 9 (SEQ ID NO: 43) .
Nejvíce se preferují polynukleotidy podle vynálezu, které jsou zobrazeny na obrázku č. 8 (SEQ ID NO: 42) a 9 (SEQ ID NO: 43) .
Je vhodné, aby polynukleotidové sekvence zobrazené na obrázcích se mohly upravit s. degenerovanými kodony tak, že stále kódují polypeptidy podle vynálezu.
Na základě degenerace nukleotidových kódujících sekvencí se mohou použít v praxi jiné polynukleotidové sekvence, které kódují v podstatě stejné polypeptidy podle vynálezu. Tyto sekvence zahrnují, ale nejsou omezeny na nukleotidové sekvence, které jsou upravené substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek se sekvencí’, tak dochází k tzv. tiché změně.
Vynález - dále poskytuje polynukleotidy, které hybridízují se zde popsanou polynukleotidovou sekvencí (nebo jejím komplementem), která vykazuje 50 % přednostně 70 % shodu obou sekvencí. Více se preferují polynukleotidy, které hybridízují za přísných podmínek. To znamená, že vykazují alespoň 95 % shodu a nejvíce se preferuje více jak 97 % shoda.
• · · · ··· ···· ···· ···· · ·· · · ·· · • · · · ······ · · · • ··· ····· ······· ·· ·· ·· · ·
Schopnost hybridizovat za přísných podmínek znamená navázání molekuly nukleové kyseliny na alespoň oblast sekvence druhé nukleové kyseliny (ať už jde o cDNA, mRNA nebo genomovou DNA) nebo na její komplementární řetězec za standardních podmínek, například vysoké teplota a/nebo nízkého obsahu solí, které mají tendenci znevýhodňovat hybridizaci nekomplementárních nukleotidových sekvencí. Vhodný protokol se popisuje v publikaci Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Polynukleotidy kódující polypeptidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty, analogy nebo deriváty se dále mohou použít při způsobu imunizace pomocí DNA. To znamená, že je možné je začlenit do vektoru, který se po zavedení injekcí replikuje a exprimuje, přičemž produkuje antigenní polypeptidy in vivo. Například polynukleotidy se mohou začlenit do plazmidového vektoru za řízení promotoru CMV, který je funkční v eukaryontních buňkách. Vektor se přednostně zavádí intramuskulární injekcí.
Dále vynález popisuje způsob produkce polypeptidů podle vynálezu metodou rekombinace tak, že se exprimuje polynukleotid kódující uvedený polypeptid v hostitelské buňce a získá se exprimovaný polypeptidový produkt. V jiném případě se polypeptidy mohou produkovat podle zavedených syntetických chemických metod, tj . syntézou oligonukieotidů v roztoku nebo na pevné fázi, přičemž oligopeptidy se ligují za vzniku celého polypeptidů (bloková iigace).
Za účelem rekombinantní produkce se hostitelské buňky transfikuji vektory, které -kódují polypeptid, a pak se kultivují v nutričním médiu upraveném tak, aby bylo vhodné pro aktivaci promotorů, selekci transformantů nebo amplifikaci genů. Vhodné vektory jsou takové, které jsou životaschopné a replikovatelné ve vybraném - hostiteli, a zahrnují chromozomální, nechromozomální a syntetické sekvence DNA, jako jsou například bakteriální plazmidy, fágová DNA, t · bakuloviry, kvasinkové plazmidy, vektory získané z kombinací plazmidů a fágcvé DNA. Polypeptidová sekvence se může začlenit do vektoru ve vhodném místě za použití restrikčních enzymů tak, že jsou operativně spojeny s oblastí řídící expresi, která obsahuje promotor, místo vázající ribozom (konvenční nukleotidová sekvence nebo sekvence Shine-Dalgarno) a někdy i operátor (řídící element). Mohou se vybrat jednotlivé komponenty oblasti, které řídí expresi, jenž jsou vhodné pro daného hostitele, a vektory, které jsou sestaveny tak, aby splňovaly principy molekulární biologie (popisuje se v publikaci Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Vhodné promotory zahrnují, ale nejsou omezeny na LTR nebo SV40 promotor, lac mikroorganizmu E. coli, promotory tac nebo trp a promotor fágu lambda PL. Vektory budou přednostně zahrnovat počátek replikace, stejně jako selekční markéry, to je gen rezistence na ampicilin. Vhodné bakteriální vektory zahrnují pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, fágskript pDlO, psiX174, pblueskript, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 a eukaryontní pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG a pSVL. Hostitelskými buňkami mohou být bakterie, to znamená Bacillus subtilis, Streptomyces, plísně Aspergillus niger, Aspergillus nidulis, kvasinky Saccharomyces nebo eukaryontní buňky CHO, COS.
Po expresi polypeptidů v kultuře se buňky v typickém případě sklízí centrifugací. Pak se buňky poruší fyzikálním nebo chemickým způsobem (v případě, že se exprimovaný polypeptid nevylučuje do média) a výsledný surový extrakt se použije pro izolaci polypeptidů.
Čištění polypeptidů z kultivačního média nebo lyzátu se může dosáhnout zavedením technik, které závisí na vlastnostech polypeptidů. Tc znamená použitím srážení síranem amonným nebo etanolem, kyselou extrakcí, chromatografii s výměnou aniontů vektory tttl • · • · · · nebo kationtů, chromatografií na fosfocelulóze, hydrofóbní interakční chromatografií, hydroxylapatitovou chromatografií a lektinovou chromatografií. Konečného vyčištění se dosáhlo za použití HPLC.
Polypeptid se může exprimovat za přítomnosti vedoucí nebo sekreční sekvence nebo bez ní. V předešlém případě vedoucí sekvence může být odstraněna použitím post translačního zpracování (popisuje se v dokumentu č. 4,431,739, 4,425,437 a
4,338,397) nebo se může odstranit chemicky, následně po čištění exprimovaného polypeptidu.
Vynález dále popisuje polypeptidy GBS, které se mohou použít při diagnostickém testu vhodném pro stanovení streptokokové infekce, zvláště pak infekce GBS. Pro stanovení organizmus streptokokus v biologickém vzorku je možné použít několik diagnostických metod. Postup může být následovný:
a) získání biologického vzorku od pacienta
b) inkubace protilátek nebo jejich fragmentu, který je reaktivní s polypeptidem GBS podle vynálezu s biologickým vzorkem za vzniku směsi a
c) detekce specificky vázaných protilátek nebo vázaného fragmentu ve směsi, která indikuje přítomnost mikroorganizmu Streptococcus.
V jiném případě způsob detekce protilátek specifických pro streptokokový antigen v biologickém vzorku, který obsahuje nebo se očekává, že obsahuje uvedené protilátky, se může uskutečnit následujícím způsobem:
a) izolace biologického vzorku z pacienta,
b) inkubace jednoho nebo více polypeptidů GBS podle vynálezu nebo jejich fragmentů s biologickým vzorkem za vzniku směsi a
c) detekce specificky navázaného antigenu nebo vázaného fragmentu ve směsi, která indikuje přítomnost protilátek specifických pro streptokoka.
• · • · • · · ·
Odborník je schopný rozeznat, že tento diagnostický test může mít několik forem, které zahrnují imunologický test, jako je test ELISA, radíoimunologický test nebo latexový aglutinační test, které se dají použít ke stanovení, zda protilátky specifické pro protein jsou přítomny v organizmu.
Sekvence DNA kódující polypeptidy podle vynálezu se mohou také použít k navržení sond DNA, které jsou vhodné použít k detekci přítomnosti streptokoků v biologickém vzorku o němž se předpokládá, že obsahují uvedené bakterie. Metoda detekce podle vynálezu zahrnuje:
a) izolaci biologického vzorku z pacienta,
b) inkubaci jednoho nebo více sond DNA, které mají sekvenci DNA kódující polypeptid podle vynálezu nebo jejich fragmenty s biologickým vzorkem za vzniku směsi a
c) detekci specificky vázané sondy DNA ve směsi, která indikuje přítomnost bakterie streptococcus.
Sondy DNA podle vynálezu se mohou také použít pro detekci cirkulujících streptokoků. To znamená pro detekci nukleových kyselin GBS ve vzorku například za použití polymerázové řetězcové reakce, jako metody vhodné pro diagnostiku streptokokových infekcí. Sonda se může syntetizovat za použití běžných metod a může se imobilizovat na pevné fázi nebo se může značit detekční značkou. Preferovanou sondou DNA pro tento druh aplikace je oligomer, který má sekvenci komplementární alespoň přibližně se 6 následujícími nukleotidy polypeptidů GBS podle vynálezu.
Jiná diagnostická metoda vhodná pro detekci streptokoků u pacienta zahrnuje:..
a) značení protilátek reaktivních s polypeptidem podle vynálezu nebo jeho fragmentu s detekovatelnou značkou,
b) aplikace značených protilátek nebo značeného fragmentu pacientovi a
c) detekce specificky vázaných protilátek nebo značeného fragmentu pacientovi, což indikuje přítomnost streptokoka.
• · • * · · • ·
Vynález dále popisuje použiti polypeptidu GBS podle vynálezu jako imunogenů vhodných pro produkci specifických protilátek, které se mohou použit pro diagnózu a zvláště pro léčbu streptokokové infekce. Vhodné protilátky se mohou stanovit za použiti vhodných testovacích metod, například měření schopnosti určitých protilátek testovaný model· před streptokokovou infekcí zvířecího modelu je model myši popsaný v příkladech. Protilátky mohou být celé protilátky nebo jejich fragment vázající antigen a mohou v obecném případě patřit k libovolné třídě imunoglobulinů. Protilátky nebo jejich fragment může být zvířecího původu, zvláště savčího původu a specifičtěji pochází z myši, krys nebo lidí. Mohou to být přirozené protilátky nebo jejich fragment nebo je-li to nutné rekombinaníyt i protilátky nebo jejích „rekombinantní protilátka nebo její protilátky nebo fragment protilátky, který se produkuje za použití metod molekulární biologie. Protilátky a jejich fragmenty mohou být polyklonální nebo přednostně monoklonální. Mohou být specifické pro řadu epitopů spojených s polypeptidy GBS, ale preferuje se, aby byly specifické pouze pro jeden epitop.
pasivně chránit Jedním příkladem
Termín znamená fragment fragment
Přehled obrázků na výkrese
Na obrázku č. la je sekvence DNA klonu 1 (SEQ ID NO: 1) s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi otevřených čtecích rámců.
Na obrázku č. lb je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 2
Na obrázku č. lc je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 3
Na obrázku č. ld je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 4
Na obrázku č. le je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 5
Na obrázku č. If je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 6
• * · · • · • ·
2a je sekvence DNA klonu 2 (SEQ ID NO: 7) aminokyselinovými sekvencemi otevřených • · ··· ···· · • · »· · ·· · · «· ·
Na obrázku č. s odpovídajícími čtecích rámců.
Na obrázku č.
Na obrázku č.
Na obrázku č,
2b je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 8. 2c je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 9.
10,
Na obrázku č.
Na obrázku č,
Na obrázku č. s odpovídajícími čtecích rámců.
Na obrázku č.
16.
19,
Na obrázku č.
Na obrázku č.
Na obrázku č.
Na obrázku č,
Na obrázku č.
Na obrázku č.
Na obrázku č,
2d je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
2e je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
2f je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3a je sekvence DNA klonu 3 (SEQ aminokyselinovými sekvencemi ID NO: 13) otevřených
3b je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3c je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3d je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3e je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3f je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3g je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3h je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
3i je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
Na obrázku č s odpovídajícími čtecích rámců.
4a je sekvence DNA klonu 4 (SEQ ID NO: 22) aminokyselinovými sekvencemi otevřených
«· ·»»· · · ·· • * * · · · • • · • · • · · • · • • · · • · * · • · • · · • • • •
• · · · · e> *
• · · · · · ·
IR · · · ·
-1- ά ··*·«·· · · ··
Na obrázku č. 4b je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
23 Na obrázku č. 4c je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
24 Na obrázku č. 4d je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
25 Na obrázku č. 4e je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
26 Na obrázku č. 5a je sekvence DNA klonu 5 (SEQ ID NO: 27)
s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi otevřených
čtecích rámců. Na obrázku č. 5b je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
.
Na obrázku č. 5c je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO
29.
Na obrázku č. 5d je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO
30.
Na obrázku č. 5e je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO
31.
Na obrázku č. 6a je sekvence DNA klonu 6 (SEQ ID NO: 32)
s odpov ídaj ícími aminokyselinovými sekvencemi otevřených
čtecích rámců.
Na obrázku č. 6b je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
33.
Na obrázku č. 6c je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
34.
Na obrázku č. 6d je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
35 .·
Na obrázku č. 6e je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
36 •
Na obrázku č. 7a je sekvence DNA klonu 7 (SEQ ID NO: 37)
s odpovídaj ícími aminokyselinovými sekvencemi otevřených
čtecích rámců.
• · • ·9
39, ««·· · * · » • · s ·«·· · JI « · ·«·· · · · · · » · 9 • · · » · · 9 9 4 9 o « ·
Ί 6 · · · · · · » · · ······· 9 9 9 · » · «·
Na obrázku č. 7b je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
Na obrázku č. 7c je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
Na obrázku č. 7d je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
Na obrázku č. 7e je aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:
Na obrázku č. 8 je sekvence DNA části klonu 7, která zahrnuje signální sekvenci (SEQ ID NO: 42).
Na obrázku č. 9 je sekvence DNA Části klonu 7 bez signální sekvence (SEQ ID NO: 43).
Na obrázku č. 9a je aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO:
44) .
Na obrázku č. 10 je znázorněné rozdělení titrů testu ELISA proti GBS se sérem, které pochází z myší CD-I imunizovaných rekombinantním proteinem, jenž odpovídá sekvenci SEQ ID NO: 39.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Myší model letální infekce streptokoků skupiny B (GBS)
Myší model infekce GBS popsaný detailněji v publikaci Lancefield et al., J. Exp. Med. 142: 165-179, 1975. Kmen GBS C388/90 (klinické izoláty získané v roce 1990 z meningitidy, Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Canada) a NCS246 (National Center for Streptococcus, Provinciai Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Canada) se otypovaly sérem jako typ Ia/c a t^>II/R.
Aby se zvýšila virulence kmenů, kmeny C388/90 CBS (sérotyp Ia/c) a NCS 246 (sérotyp -II/R) se sériově pasážovaly přes myši, jak se popisuje dříve v textu (Lancefield et al., J. Exp. Med. 142: 165-179, 1975). Zvýšení virulence se r 9 • · « ·· 9 ·* ·9 ·« · · 9 · · · 9 « 9 • · 99 » ·9 * · * · 9 • 999 9*999» '« · monitorovalo za použiti intraperitonálni inokulace sériových ředění subkultur v půdě Todd-Hewith, která se získala buď z krve nebo ze sleziny infikovaných myší. Po poslední pasáži se infikované vzorky krve použily k inokulací půdy ToddHewith. Po inkubaci po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v 7 % atmosféře C02, se do kultury přidal glycerol při konečné koncentraci 10 % (objem). Kultura se pak rozdělila do alikvotů a skladovala se při teplotě -80 °C a dále se použila v experimentech opakované imunizace. Stanovil se počet cfu GBS, které jsou přítomny v těchto mrazených vzorcích. Stanovilo se, že bakteriální koncentrace nezbytná pro zabytí 100% (LD100) 18-ti týdenních myší, je v případě GBS kmen C388/90 3,5xl0: a u kmene NCS246 je uvedená hodnota Ι,ΙχΙΟ5, což odpovídá podstatnému zvýšení virulence u obou kmenů. Hodnota LD100 zaznamenaná před pasážováním u těchto dvou kmenů byla vyšší než 109 cfu.
Při bakteriální opakované imunizaci čerstvě roztavený alikvot virulentního kmene GBS se nastavil na vhodnou bakteriální koncentraci za použití půdy Todd-Hewitt a objem 1 ml se zavedl injekcí intraperitonálně do každé samice myši CD1. Myši používané v experimentech pasivní ochrany jsou 6 až 8 týdnů staré, zatímco myši užívané pro aktivní ochranné experimenty byly v době opakované imunizace staré přibližně 18 týdnů. Všechna inokula se ověřila, sečtením kolonií. U zvířat se sledovala libovolná znamení infekce. V době 48 hodin po infekci to bylo čtyřikrát denně pak po dalších 12 dní to bylo jednou denně.. Na konci této doby se získaly vzorky krve a zmrazily se při teplotě -20 °C. Slezina získaná z každé myši, která přežila opakovanou imunizaci, se kultivovala za účelem identifikace libovolných zbývajících GBS.
Příklad 2: Imunizace a ochrana u myší celými buňkami GBS, které se usmrtily formaldehydem • · · · , · · * • · · · • · • · · · • ·
Celé buňky GBS usmrcené formaldehydem se připravily postupem popsaným v publikaci Lancefield et al, J. Exp. Med. 142: 165-179, 1975). Kultura kmenů GBS kultivovaná přes noc na plotnách s agarem s ovčí krví se promyla dvakrát pufrem PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, pH 7,2), a naředila se tak, aby koncentrace byla přibližně 3xl09 cfu/ml a inkubovala se přes noc v PBS, které obsahuje 0,3 % (objem) formaldehydu. Suspenze usmrcených GBS se promyla PBS a uchovávala se zmrazená při teplotě -80 °C.
Samicím myší CD-I 6 až 8 týdnů starým (Charles River, St. Constant , Québec, Canada) se zavedlo podkožní injekcí třikrát ve dvou týdenních intervalech 0,1 ml buněk GBS kmene C388/90 usmrcených formaldehydem (přibližná koncentrace 6xl07 GBS) nebo 0,1 ml PBS v případě kontrolní skupiny. Den před imunizací se přidal do těchto přípravků Alhydrogel™ (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark) tak, aby jeho konečná koncentrace byla 0,14 mg nebo 0,21 mg Al, a inkubace proběhla přes noc při teplotě 4 °C za stálého míchání. Před začátkem imunizace a dva týdny po poslední injekci se z každé myši získaly vzorky séra. Séra se zamrazila při teplotě -20 °C.
Osmi myším v každé kontrolní skupině se zavedlo injekcí PBS a skupina se imunizovala buňkami GBS kmen 388/90 (Ia/c) usmrceným forir.aldehydem se opět imunizovaly l,5xl04 cfu GBS kmen C388/90 (ia/c) jeden týden po třetí injekci. Všechny myši imunizované celými buňkami GBS usmrcené formaldehydem přežily homologní opakovanou imunizaci, zatímco pátý den po opakované imunizaci pouze 4 z 8 myší, kterým se aplikovalo PBS přežilo infekci. Za účelem zvýšit úmrtnost v kontrolních skupinách se bakteriální suspenze upravila podle stáří myší v době bakteriální opakované imunizace. V následných experimentech opakované imunizace, kdy myši byly starší než 15 týdnů, zvýšila se koncentrace bakteriálního inokula na hodnoty 3,0 x 105 až 2,5 x 105 cfu.
• · • · • · · · · · ·
Tabulka č. 1: Imunizace myší CDl celými buňkami GBS usmrcenými formaldehydem a následná homologní opakovaná imunizace (kmen C388/90 (Ia/c)) a heterologní opakovaná imunizace (kmen NCS246 (II/R)).
antigenní přípravek používaný při imunizaci1 počet živých myší 14 dní po bakteriální opakované imunizaci (% přeživších)
homologní opakovaná imunizace kmenem C388/90 (Ia/c) heterologní opakovaná imunizace kmenem NCS246 (II/R)
1. infekce
buňky GBS kmen C388/90 (Ia/c)2 usmrcené formaldehydem 8/8 (100)3 n. d.5
kontrolní PBS 4/8(50) n.d.
2. infekce
buňky GBS kmen C388/90 (Ia/c)2 usmrcené formaldehydem 6/6 (100)* 0/6 (O)6
kontrolní PBS 2/6 (33) 0/6 (0)
použil se Alhydrogel™ při konečné koncentraci Al 0,14 mg nebo 0,21 mg 2 přibližně 6xl07 cfu, 3 intraperitoneální opakovaná imunizace s 1 ml kultivačního média Todd-Hewitt, které obsahuje suspenzi GBS C388/90 (Ia/c) upravenou na koncentraci 1,5 x 104 cfu, 4 intraperitoneální opakovaná imunizace s 1 ml kultivačního média Todd-Hewitt, které obsahuje suspenzi GBS C388/90 (Ia/c) upravenou tak, aby koncentrace byla 2,1 x 106 cfu, 5 nebylo provedeno, 6 intraperitoneální opakovaná imunizace 1 ml kultivačního média Todd-Hewitt, které obsahuje suspenzi GBS NCS246 (II/R) upravenou tak, aby koncentrace byla 1,2 x 105 cfu.
• · · · • · • · · ·
V jiném experimentu jedné skupině 12 myší odpovídá kontrolní skupina, které se aplikovalo injekcí PBS, zatímco druhá skupina 12-ti myší se imunizovala celými buňkami GBS kmene C388/90 (Ia/c) usmrcenými formaldehydem. Šest myší z každé ze dvou skupin se opakovaně imunizovalo 2,1 x 106 cfu GBS kmene C388/90 (Ia/c) (Tabulka č. 1). Stejně jako v prvním experimentu opakované imunizace všechny imunizované myši s GBS kmen C388/90 (Ia/c) přežily homologní opakovanou imunizaci. Pouze dvě myši z 6, kterým se injekcí aplikoval PBS přežilo inj ekci.
Zbývajících šest myší v obou skupinách se pak použilo o jeden týden později k ověření, zda tento antigenní přípravek mohl způsobit zkříženou ochranu proti kmenu NCS246 (II/R), který produkuje serologicky odlišné kapsule. Žádná z myší infikovaná tímto druhým kmenem GBS nepřežila infekci. Pozdější výsledky naznačují, že největší ochranná imunitní odezva indukovaná buňkami kmene C388/90 usmrcenými formaldehydem je řízena proti kapsulárnímu polysacharidu a že může být omezena na kmeny určitého sérotypu. Tyto výsledky jasně indikují, že tento určitý model infekce se může účinně použít ke studiu ochrany způsobené vakcínou.
Příklad 3: Imunizace králíka celými buňkami GBS usmrcenými formaldehydem a pasivní ochrana u myši
Za účelem získat hyperimunní sérum se novozelandští králíci o hmotnosti 2,5 kg, Charles River, St-Constant, Québec, Canada) imunizovali buňkami GBS kmene C388./90 (Ia/c) usmrcenými formaldehydem. Tomuto králíku se tři_krát podkožní injekcí v třís týdenních intervalech zavedlo přibližně l,5x_09 cfu celých buněk GBS kmen C388/90 (Ia/c) v přibližné koncentraci l,5xl09. Freundovo kompletní adjuvans (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, New York) se použilo jako adjuvans v případě první imunizace, zatímco
Freundovo neúplné adjuvans (Gibco BRL) se použilo v případě následujících dvou injekcí. Vzorky séra se získaly před začátkem imunizačního protokolu a dva týdny po poslední injekci. Séra se zamrazila při teplotě -20 °C.
Hodnotila se také schopnost tohoto určitého králičího hyperimunního séra pasivně chránit myši před letální infekcí GBS. Intrapericoneální injekce aplikovaná myším buď s 15 nebo 25 μΐ hyperimunního králičího séra 18 hodin před opakovanou imunizací ochránila 4 z 5 myší (80 %) před infekcí.
Zaznamenala se frekvence myší, které přežily, nižší než 20 % u myší v kontrolní skupině, kterým se injekcí zavedlo PBS nebo sérum získané z králíků imunizovaných přípravkem z meningokokových vnějších membrán. Tento výsledek jasně indikuje, že imunizace jiných zvířecích druhů usmrcenými buňkami GBS může indukovat produkci protilátek, které pasivně chrání myši. Toto činidlo je možné použít ke charakterizaci klonů.
Tabulka č. 2: Pasivní ochrana myší CD-I způsobená králičím sérem, které se získalo po imunizaci antigenním přípravkem z celých streptokoků skupiny B usmrcených formaldehydem (kmen C388/90 (Ia/c))
skupiny počet živých myší 14 dní po bakteriální opakované imunizaci GBS kmenem C388/90 (Ia/c)2 % přeživších
králičí hyperimunní sérum 2 -25 μΐ 4/5 80
králičí hyperimunní sérum 2 -15 μΐ 4/5 80
kontrolní králičí sérum 2 -25 μΐ 1/5 20
kontrolní PBS
1Freundovo úplnéadjuvansšěpoužilopřiprvní imunizaci a Freundovo neúplné adjuvans se použilo při následujících injekcích 2 intraperitoneální opakovaná imunizace 1 ml kultivačního média Todd-Hewitt obsahující suspenzi GBS C388/90 (Ia/c) se upravilo na koncentraci 2xl04 cfu.
Příklad 4: Rekombinantní produkce fúzního proteinu His.Tag-GBS Kódující oblast genu GBS se amplifikovala PCR (systém vhodný pro DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR, 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) z genomové DNA GBS kmene C388/90 (Ia/c) za použití oligonukleotidů, které obsahovaly extenzi baží pro adici restrikčních míst BglII (AGATCT) a HindlII (AAGCTT). Produkt PCR se čistil z agarózového gelu za použití extrakčního kitu Qiaex II od firmy Qiagen (Chatsworth, CA) štěpené restrikčními enzymy BglII a Hind III (Pharmacia Canadá lne Baie ďUrfe, Canada) a extrahovaly se směsí fenol:chloroform a pak se srážely etanolem. Vektor pET-32b(+) (Novagen, Madison, WI) obsahující sekvenci thioredoxin-His.Tag se štěpil restrikčními enzymy BglII a HindlII, extrahoval se směsí fenol:chloroform a pak se precipitoval etanolem.
Fragment BglII-HindlII genomové DNA se ligoval do vektoru BglII-HindlII pET-32b(+) za vzniku kódující sekvence pro fúzní protein thioredoxin-His.Tag-GBS, jehož gen řídí promotor T7 . Ligované produkty se transformovaly do mikroorganizmu E. coli kmen XLI Blue MRF' (Δ (mcrň) 138Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac [F'proAB 2acIqZAM15TnlO (Tetr)]c) (Strazagene, La Jolla, CA) podle způsobu popsané^ v publikaci Simanis Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed.), pp. 109-135. Rekombinantní plazmid pET se čistil • · • · · ·
II, BIO-RAD Labs, E. coli AD494 (DE3) za použití kitu Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) a nukleotidová sekvence inzertu DNA se potvrdila sekvenováním DNA (Taq Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA) . Rekombinantní plazmid pET se transformoval elektroporací (přístroj Gene Pulser
Missíssauga, Canada) do mikroorganizmu (Aara~ leul 697 AlacX14 AphoA PvuII phoR AmalF F '[lac+ (laclq)pro] trxB: :Kan (DE3)) (Novagen, Madison, WI). V tomto kmenu mikroorganizmu E. coli promotor řídící expresi fúzního proteinu je specificky rozeznáván T7 RNA polymerázou (přítomnou na profágu λϋΕ3), jejíž gen je řízen promotorem lac, který je indukovatelný látkou izopropyl-p-D-thiogalaktopyranozid (IPTG).
Transformant AD494(DE3)/rpET se kultivoval při teplotě 37 °C za stálého míchání při 250 ot./min. v půdě LB (pepton 10g/l, kvasinkový extrakt 5g/l, NaCl 10g/l), která obsahuje 100 pg ampicilinu (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada) na jeden mililitr až do doby, kdy hodnota Aéoo je 0,6. Za účelem indukovat produkci fúzního proteinu thíoredoxinHis.Tag-GBS se buňky inkubovaly po další 2 hodiny v přítomnosti IPTG v konečné koncentraci 1 mM. Bakteriální buňky se sklidily centrifugací.
Rekombinantní fúzní protein produkovaný AD494(DE3)/rpET32 po indukci IPTG po dobu 2 hodin se částečně získal jako rozpuštěný v inkluzních tělískách, která se čistila z endogenních proteinů izolací nerozpustných agregátů (Gerlach, G.F. et al. , 1992, Infect. Immun. 60: 892).
Indukované buňky získané z objemu kultury 500 ml se opětně suspendovaly ve 20 ml pufru, který obsahuje 25 % sacharózy-50 mM Tris-Hcl (pH8,0) a zmrazil se při teplotě -70°C. Lyže buněk v rozmražené suspenzi se dosáhlo přidáním 5 ml roztoku lysozymu (10 mg/ml) ve 250 mM pufru Tris-HCl (pH8,0), po čemž následuje inkubace 10 až 15 minut na ledu a přidání 150 ml směsi detergenru (5 částí 20 mM pufru Tris-HCl (pH7,4)-300 mM • ·
NaCl-2% kyselina deoxycholová-2% Nonidet P-40 a 4 části pufru 100 mM Tris-HCl (pH8,0)-50 mM EDTA-2% Triton X-100), pak následuje 5 minut inkubace na ledu. Po sonikaci se proteinové agregáty sklidily centrifugací po dobu 30 minut při 35 000 x g vzorek zachoval se vzorek rozpustné buněčné frakce. Agregované proteiny se rozpouštěly v 6M guanidinhydrochloridu. Přítomnost fúzního proteinu v rozpustné i v nerozpustné frakci se analyzovala westernovým přenosem za použití séra myší, kterým se injekcí zavedly buňky GBS usmrcené formaldehydem kmene C388/90 (Ia/c), které přežily bakteriální opakovanou imunizaci odpovídajícím kmenem GBS.
Čištění fúzního proteinu od rozpustná frakce, AD494(DE3)/rpET indukovaných IPTG se provedlo afinitní chromatografií založenou na vlastnostech sekvence His.Tag (6 konzekutivních histidinových zbytků) vázat dvojvalentní kationty (Ni2+) imobilizované na His.Bind pryskyřici s chelatací kovů (Novagen, Madison, WI). Používané metody čištění se popisují v pET systému Manual, 6th Edition (Novagen, Madison, WI). Peletované buňky získané ze 100 ml kultury indukované IPTG se resuspendovaly ve 4 ml vazebného pufru (5 mM imidazol-500 mM NaCl-20 mM Tris-HCl pH 7,9), sonikovaly se a centrifugovaly se při 39 000 x g po dobu 20 minut. Supernatant se filtroval (přes membránu s velikostí pórů 0,45 μιη) a nanesl se na kolonu s pryskyřicí His.Bind, která se uvedla do rovnováhy vazebným pufrem. Kolona se pak promyla 10ti násobkem objemu vazebného pufru a pak 6-ti objemy kolony promývacího pufru (20 mM imidazol-500 mM NaCl-20 mM Tris-HCl pH 7,9). Fúzní protein thoredoxin-His.Tag-GBS se eluoval elučním pufrem (ÍM imidazol-500 mM NaCl-20 mM Tris-HCl pH7,9). Odstranění soli a imidazolu ze vzorku se uskutečnilo dialýzou proti 3x11 PBS při teplotě 4 °C.
Množství fúzního proteinu získaného z rozpustné nebo nerozpustné cytoplazmatické frakce mikroorganizmu E. coli se odhadlo barvením podle Comassie SDS-polyakrylamidového gelu se • · • « · • · · • · · • · · ředění uvedených proteinů a standardem séra (Pierce Chemical Co. Rockford, 111.).
sériovým bovinního albuminu
Příklad 5: Rekombinantní produkce proteinu GBS řízená promotorem lambda PL
DNA oblast kódující protein GBS se začlenila po směru exprese genu promotoru ÁPL do translačního vektoru pURV22.
Tento plazmid se získal Bio/Technology 5:600), ze z p629 (George et al., 1987, kterého se odstranila kódující oblast části glykoproteinu (gD-1) víru herpes simplex typ I (HSV-I) a gen nesoucí rezistenci na ampicilin se nahradil kanamycinovou kazetou, která se získala z plazmidového vektoru pUC4K (Pharmacia Biotech Canada lne., Baie D'Urfe, Canada). Vektor obsahoval kazetu represorového genu bakteriofága λ cI857 citlivého na teplotu, ze kterého se odstranil funkční promotor Pr. Deaktivace represoru cl857 vzrůstem teploty v rozmezí 30 37 °C až 37 - 42 °C vedli k indukci genu řízeného promotorem λ PL. Translace genu se řídila vazebným místem pro ribozóm cro, po kterém následuje po směru exprese restrikční místo BglII (AGATCT) a ATG: ACTAAGGAGGTTAGATCTATG.
Restrikční místa a T4 DNA ligáza se použily podle doporučení výrobce (Pharmacia Biotech Canada lne., Baie D'Urfe, Canada a New England Biolabs Ltd., Mississauga, Canada). Elektorforéza gelových fragmentů na agarózovém gelu se provedla způsobem, který se popisuje v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.) Chromozomální DNA bakterií GBS se připravila podle postupu popsaného v publikaci Jayarao et al., J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 2774).
Amplifikační reakce DNA polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) se provedla za použití systému DNA Thermal CyclerAmp PCR systém 2 400 (Perkin Elmer, San Jose, CA) . Plazmidy používané pro sekvenování DNA se čistily za použití plazmidového kitu od firmy Qiagen (Chatsworth, CA) . Fragmenty DNA se čistily z agarózového gelu za použití gelového extrakčního kitu Qiaex II od firmy Qiagen (Chatsworth, CA) . Transformace plazmidu se provedly způsobem popsaným v publikaci Hannah, DNA Clonning, Glover (ed.) pp, 109-135, 1985. Sekvenování genomových inzertů DNA v plazmidech se provedlo za použití syntetických oligonukleotidů, které se syntetizovaly oligonukleotidovým syntetizérem model 394 (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div. (ABI), Foster City, CA). Sekvenační reakce se provedly pomocí PCR za použití Taq Dye Deoxy Terminátor Cycie Sequencing kitu (ABI, Foster City, CA) a DNA elektroforéza se uskutečnila na automatizovaném DNA sekvenátoru 373A (ABI, Foster City, CA) . Sestavení sekvence DNA se uskutečnila za použití programu Sequencer 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Analýza sekvencí DNA a jejich předpokládané polypeptidy se uskutečnily za použití programu Gene Works verze 2.45 (Intelligenetics, lne. Mountain View CA).
Kódující oblast genu GBS se amplifikovala PCR z GBS kmene C388/90 (Ia/c) genomové DNA za použití oligonukleotidů, které obsahovaly extenze baží pro přidání restrikčních míst BglII (AGATCT) a Xbal (TCTAGA). Produkt PCR se čistil z agarózového gelu za použití extrakčního kitu Qiaex II od firmy Qiagen (Chatsworth, CA), štěpil se restrikčními enzymy BglII a Xbal a extrahoval se směsí fenol : chloroform a pak se srážel etanolem. Vektor pURV22 se štěpil restrikčními enzymy BglII a Xbal, extrahoval se směsí fenol : chloroform a srážel se etanolem. BglII-Xbal fragment genomové DNA se ligoval do vektoru pURV22 štěpeného BglII-Xbal, ve kterém gen GBS je řízen promotorem ÁPL. Ligované.protdukty se transformovaly do mikroorganizmu E. coli kmen XLI Blue MRF'(Δ(mcriA)183Δ(mrcCBhsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac[F'proAB laclqZAM15 TnlO (Tetr) ]c) (Stratagene, La Jolla CA) podle metod pospaných v publikaci Hannah, DNA Clonning, Glover (ed. ) pp, 109-135, 1985. Transformanty nesoucí plazmidy s inzertem se identifikovaly analýzou lyžovaných buněk, které v · » <
· r · » * • « • · · · · · · se podrobily elektroforéze na agarózovém gelu (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Rekombinantni plazmid pURV22 se čistil za použití kitu Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) a nukleotidová sekvence inzertu DNA se ověřila sekvenováním DNA.
Transformant XLI Blue MRF'/rpURV22 se kultivoval při teplotě 34 °C za stálého míchání při 250 ot./min. v půdě LB, která obsahuje 50 μς kanamycínu na jeden mililitr až do okamžiku, kdy hodnota A60o dosáhne 0,6. Za účelem vyvolat produkci fúzního proteinu se buňky inkubovaly po dobu 4 hodin při teplotě 39 °C. Bakteriální buňky se sklidily centrifugací, resuspendovaly se ve vzorkovém pufru, povařily se po dobu 10 minut a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
Příklad 6: Subklonování genu proteinu GBS v CMV plazmidu pCMVGH
Oblast kódující DNA proteinu GBS se začlenila po směru exprese genu lidského růstového hormonu (hGH), jehož transkripci řídí promotor cytomegaloviru (CMV) v plazmidovém vektoru pCMV-GH (Tang et al., Nátuře, 1992, 356: 152).
Promotor CMV není funkční v buňkách E. coli, ale aktivuje se po aplikaci plazmidu do eukaryontních buněk. Vektor také začleňuje gen rezistence na ampicilin.
Kódující oblast genu se amplifikovala z genomové DNA GBS kmen C388/90 (Ia/c) oligonukleotidů, které obsahovaly extenze baží vhodné pro přidání restrikčních míst BglII (AGATCT) a HindlII (AAGCTT). Produkt PCR se čistil z agarózového gelu_ za použití extrakčního kitu Qiaex II od firmy Qiagen (Chatsworth, CA) , který se štěpil restrikčními enzymy BglII a HindlII a extrahoval se směsí fenol:chloroform a pak se srážel etanolem. Vektor pCMV-GH (pochází z laboratoře Dr.
Johnstona, Department of Biochemistry, The pomocí PCR za použití
Stephena, A. University of
Texas, Dallas, Texas), který obsahuje lidský růstový hormon za účelem vzniku fúzních proteinů, se štěpil restrikčními enzymy BamHI a HindlII, extrahoval se směsí fenol:chloroform a srážel se etanolem. BglII-HindlII fragment genomové DNA o velikosti 1,3 kb se ligoval do vektoru pCMV-GH štěpeného BamHI-HindlII za vzniku fúzního proteinu hGH-GBS, který řídí promotor CMV. Ligované produkty se transformovaly do mikroorganizmu E. coli kmen DH5a[<D80 lacZ ΔΜ15 endAl recAl hsdRll (rK'mK+) supE44 thi1λ~ gyrA96 relAl Δ(lacZYA-argF)U169] (gibco BRL, Gaithersburg, MD) způsoby, které se popisují v publikaci Simanis Hanahan, D.
DNA
Cloning, 1985, D.
M.
Glover (ed.), pp.
109-135.
Transformanti nesoucí plazmidy s inzertem se identifikovaly analýzou lyžovaných buněk, na elektroforéza na agarózovém gelu kterých se provedla (popisuje se v publikaci nd
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Rekombinantní plazmid pCMV se čistil za použití kitu Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) a nukleotidová sekvence inzertu DNA se ověřila sekvenováním
DNA.
Příklad 7: Imunologická aktivita proteinu GBS vůči opakované imunizaci GBS
Čtyřem skupinám 12-ti samic myší CD-I (Charles River, StConstant, Quebec, Canada) 6 až 8 týdnů starým se podkožní injekcí zavedlo třikrát ve tří týdenních intervalech 0,1 ml následujícího antigenního přípravku: buňky GBS kmen C388/90 usmrcené formaldehydem (přibližně 6xl07 cfu), 20 pg fúzního proteinu thioredoxin-His.Tag-GBS, který se získal z nerozpustné frakce ’(inkluzní tělíska) nebo 20 pg fúzního proteinu, který se čistí na základě své afinity (na niklové koloně) od rozpustné cytoplazmatické frakce organizmu E. coli nebo 20 pg afinitně čištěné (niklová kolona) látky thioredoxinHis. Tag kontrolního polypeptidů. Ke každému antigennímu přípravku se jako adjuvans přidalo 20 pg QuilA™ (Cedarlane • · • ·
Laboratories Ltd, Hornby, Canada). Před imunizací (PB) a v den 20 (TB1), 41 (132) a 54 (TB3) během imunizace se z každé myši získaly vzorky sér. Séra se zmrazila při teplotě -20 °C.
Po každé injekci fúzního proteinu se zaznamenávalo zvýšení titrů ELISA, které indikuje dobrou primární odezvu a zesílení specifické humorální imunitní odezvy po každé druhé a třetí aplikaci. Na konci imunizační doby průměr recipročních titrů ELISA byl v případě skupiny imunizované 20 μς fúzního proteinu získaného z inkíuzních tělísek 456 145 v porovnání se skupinou myší imunizovaných proteinem z rozpustné frakce v mikroorganizmu E. coli, kde tato hodnota je 290 133. Pozdější výsledek naznačuje, že protein získaný z inkíuzních tělísek by mohl být více imunnogenní, než rozpustný protein. Analýza myšího séra v testu ELISA za použití afinitně čištěné látky thioredcxin-his.Tag na potažení ploten ukázala, že nepatrné titry protilátek se vytvořily proti části thioredoxin-His.Tag fúzního proteinu. Reaktivita séra z myši, kterým se injekcí zavedl rekombinantní fúzní protein se také testovala testem ELISA proti celým buňkám GBS kmen C388/90 usmrceným formaldehydem. Protilátky indukované imunizací rekombinantním fúzním proteinem také rozeznávají jejich specifické epitopy na buňkách GBS, které indikují, že jejich konformace je dostatečně blízká přirozenému streptokokovému proteinu, aby vyvolala zkříženě reaktivní protilátky.
Aby se ověřilo, zda imunitní odezva vyvolaná imunizací mohla chránit před infekcí GBS, myši se opakovaně imunizovaly 3,5xl05 cfu GBS v případě kmene C338/90 (Ia/c) a l,2xl05 cfu v případě kmene NCS246 (II/R). Výsledky imunizací jsou uvedeny v Tabulce 3 a 4. Myši imunizované kontrolním peptidem thioredoxin-His.Tag nejsou chráněné proti opakované imunizaci kmenem GBS, zaoímco myši imunizované celými buňkami C388/90 usmrcenými formaldehydem poskytovaly ochranu pouze proti homologní opakované imunizaci. Fúzní protein thioredoxinHis. Tag-GBS podle vynálezu chránil myši před opakovanou • ·
imunizací s oběma kmeny GBS. Krevní kultury a kultury slcz/Oy těchto myší nevykazují přítomnost žádného GBS.
Tabulka č.3: Myši, které přežily opakovanou imunizaci GBS kmenem C388/90 (Ia/c)1
imunizační činidlo počet myší, které přežily opakovanou imunizaci % myší, které přežily imunizaci
------— thioredoxm-His. Tag 1/6 17
buňky C388/90 usmrcené formaldehydem 6/6 100
fúze thioredoxin- His.Tag-GBS (přípravek z inkluzních tělísek)4 6/6 100
fúze thioredoxin- His.Tag-GBS (přípravek z inkluzních tělísek)4 6/6 100
1 Intraperitoneální aplikace š Ϊ ml kultivačnímmédiemToddHewitt upraveným na koncentraci 3,5xl05 cfu, aplikováno 23 pg, u myší, které přežily, jsou paralyzované zadní nohy, GBS se detekovaly v krvi a v slezině, 3 aplikovalo se 6xl07 cfu, 4 aplikovalo se 20 pg.
Tabulka č. 4: Myši, které přežily opakovanou imunizaci GBS kmenem NCS246 (II/R)1
imunizační činidlo počet myší, které přežily opakovanou % myší, které přežily imunizaci
• · • · • ·
imunizaci
thioredoxin-His.Tag2 0/6 0
buňky C388/90 usmrcené formaldehydem3 2/6 34
fúze thioredoxin- His .Tag-GBS (přípravek z inkluzních tělísek)4 5/54 100
fúze thioredoxin- His .Tag-GBS (cytopiazmatická frakce)4 6/6 100
Ί Intraperitoneální aplikace š ϊ ϊηΐ kultivačním médiemToddHewitt obsahující suspenzi GBS NCS246 (II/R) upraveným na koncentraci l,2xl05 cfu, 2 aplikováno 20 μς,
O -y aplikovalo se 6x10 cfu, 4 jedna myš zemřela během imunizace.
Příklad 8: Imunizace rekombinantním proteinem GBS propůjčuje ochranu proti experimentální infekci GBS
Tento příklad popisuje ochranu myší před fatální infekcí GBS imunizací rekombinantním proteinem, který odpovídá SEQ ID NO: 39.
Skupiny deseti myší CD-I (Charles River) se imunizovaly podkožně třikrát ve tří týdenních intervalech 20 μς rekombinantního proteinu získaného z mikroorganizmu E. coli kmen BLR (Novageň) nesoucího rekombinantní plazmidový vektor pURV22, který obsahuje gen GBS odpovídající SEQ ID NO: 42, v přítomnosti 20 μg adjuvans QuilA™ (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada). Jako kontrola slouží samotné adjuvans QuilA™ v PBS. Vzorky krve se shromáždily z orbitální dutiny • ·
32 • • • • · · » · · · • · · · · * • · · · • · · • · · · · · • · t · · · • « · • · · • · · • · · • · · ·
před každou imunizací v den 1, 22 a 43 dříve než a 14 dní (den
57) po poslední injekci. 0 jeden týden pozděj i se myši
imunizovaly přibližně 104 až 106 cfu různých virulentních kmenů GBS. Vzorky inokula GBS pro opakovanou imunizaci se nanesly na plotny s TSA/5 % agarem s krví z ovce, aby se stanovily CFU a ověřila se dávka opakované imunizace. Úmrtí se monitorovalo v období 14 dní a čtrnáctý den po imunizaci. Myší, které přežily se usmrtily a u krve a sleziny se testovala přítomnost organizmů GBS. Cata jsou uvedena v tabulce č. 5.
V sérech odebraných před imunizací . se analyzovala přítomnost protilátek reaktivních s GBS ve standardních imunologických testech. Test ELISA a imunoblotační analýzy ukázaly, že imunizace rekombinantním proteinem GBS produkovaným v mikroorganizmu E. coli vyvolal protilátky, které reagují jak s rekombinantním a přirozeným proteinem GBS. Protilátková odezva na GBS se popisuje v Příkladu 9.
Tabulka č. 5: Schopnost rekombínantního proteinu GBS odpovídajícímu SEQ ID NO: 39 vyvolat ochranu proti 8 diverzním kmenům GBS
kmen pro opakovanou imunizaci
imunogen označení typ počet živých : počtu zemřelých4
protein rGBS žádný C388/90 Ia/c 8:2 (P<0,0001). 0:10
protein rGBS žádný NCS 246 II/R 10:0 (P=0,0012) 3:7
protein rGBS žádný ATCC12401 lb 10:0 (P=0,001) 3:7
protein rGBS žádný NCS 535 V 10:0 (P=0,01) 5:5
protein rGBS žádný NCS 9842 VI 10:0 (P<0,0001) 0:10
• <
I · · · · • · • · · ·
protein rGBS NCS 915 III 7:3 (P=0,002)
NCS 915-F3 4 : 6
žádný 1:9
protein rGBS NCS 954 III/R 7:3 (P=0,0007)2
NCS954-F 1:9
žádný 4 : 6
protein rGBS COH1 III 4:6 (P=0,0004)
COH1-F 3:7
žádný 0:10
1 použily se skupiny 10-ti myší. Stanovil se počet myší, které přežily infekci, a počet usmrcených myší. Křivka. znázorňující myši, které přežily, odpovídající zvířatům imunizovaným rekombinantním proteinem GBS se porovnávala s křivkou slepě imunizovaných zvířat za použití logaritmického testu pro neparametrickou analýzu.
2 Srovnávací analýza se zvířaty imunizovanými NCS915-F 3 Zvířata se imunizovala GBS usmrcenými formaldehydem v přítomnosti adjuvans QuilA™.
Všechny krevní kultury myší, které přežily, byly 14-tý den po imunizaci negativní. Také kultury slexíoy myší, které přežily, byly negativní s výjimkou několika myší z experimentu
MB-11.
Příklad 9: Vakcinace s rekombinantním proteinem GBS, který vyvolává imunitní odezvu na GBS.
Skupiny deseti samic myší CD-I se imunizovaly podkožně rekombinantním proteinem GBS, který odpovídá SEQ ID NO: 39, jak se popisuje v příkladu 8. Za účelem odhadnout protilátkovou odezvu na přirozený protein GBS, se testovaly séra shromážděná před každou imunizací a 14 dní po třetí imunizaci. V těchto sérech se testovala přítomnost protilátek, které reagují s buňkami GBS, testem ELISA za použití ploten potažených buňkami GBS usmrcenými formaldehydem z typu III kmene NCS 954, typu lb kmene ATCC12401, typu V kmene NCS 535 • · nebo typu IV kmene NCS 9842. Specifita vytvořených protilátek v případě proteinu GBS se potvrdila analýzou westernovým přenosem extraktů buněk GBS a čištěných rekombinantních antigenů. Výsledky uvedené na obrázku č. 10 jasně ukazují, že zvířata odpovídají silně na rekombinantní protein GBS používaný jako imunogen, přičemž průměrné reciproční titry protilátek kolísají mezi hodnotami 12 000 a 128 000 v případě sér sebraných po třetí imunizaci a závisí na potahovacím antigenu. Všechny preimunní séra jsou negativní v případě, že se testují v ředění 1:100. Protilátky reaktivní s GBS se detekovaly v séru každého zvířete po jediné injekci rekombinantního proteinu GBS.
Příklad 10: Antigenní konzervace proteinu GBS podle vynálezu
Monoklonální protilátky (MAb) specifické pro protein GBS podle vynálezu se použily k demonstraci skutečnosti, že tento uvedený antigen se produkuje všemi GBS a že je také antigenně vysoce konzervativní.
Sbírka 68 izolátů GBS se použila pro hodnocení reaktivity MAb specifických pro GBS. Tyto kmeny se získaly z instituce National Center for Streptococcus, Provinciai Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Canada, Centfce Hospitalier Universitaire de Quebec, Pavillon CHUL, Quebec, Canada, American Type Culture Collection, USA, Laboratoire de Sante Publique du Quebec, Canada, a Dept. of Infectious Disease, Children's Hospital and Medical Center, Seattle, USA. Všech osm MAb se testovalo proti následujícímu panelu kmenů: 6 izolátů sérotypu la nebo Ia/c, 3 izoláty sérotypu lb, 4 izoláty sérotypu II, 14 izolátů sérotypu III, 2 izoláty sérotypu IV, 2 izoláty sérotypu V, 2 izoláty sérotypu VI, 2 izoláty sérotypu VII, 1 izolát sérotypu VIII, 10 izolátů, které se nepodrobily stanovení sérotypu a 3 bovinní kmeny mikroorganizmu S. agalactiae. MAb 3A2 také reagovaly s dalšími GBS: 9 izolátů sérotypu Ia/c a 10 izolátů sérotypu V. Kmeny se • · • * « · · kultivovaly přes noc na plotnách s krevním agarem při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % C02. Kultury se uchovávaly při teplotě 70 °C v půdě se srdeční infúzi s 20 % (objem) glycerolem.
Aby se získaly MAb specifické pro protein GBS, myši se imunizovaly třikrát ve třítýdenních intervalech s 20 pg čištěného rekombinantního proteinu GBS (SEQ ID NO: 44) v přítomnosti 20 % QuilA™ jako adjuvans. Buněčné linie hybridomů se vytvořily fúzí sl^zYh ových buněk získaných z imunizovaných myší s buněčnou linií nesekretujicich myelomů SP2/O, jak se popisuje dříve v textu v publikaci Hamel J. et al., 1987, J. Med. Microbiol. 23: 163-170). U supernatantů hybridních klonů se testovala specifická produkce protilátek testem ELISA za použití GBS deaktivovaných formaldehydem a čištěným rekombinantním proteinem GBS (SEQ ID NO: 39 nebo 44) jako potahovacího antigenu, jak se dříve v textu popisuje v publikaci Hamel, J. et al., 1987. J. Med. Microbiol. 23: 163-170). Specifický hybrid se klonoval limitujícím ředěním, expandoval a zmrazil se v kapalném dusíku. Produkce rekombinantního proteinu GBS se prezentovala v příkladech 4 a 5. Čištěný rekombinantní protein GBS nebo formaldehydem deaktivované GBS se znovu rozdělily elektroforézou za použití přerušovaného pufrového systému Laemmli, jak se doporučuje výrobcem. Pak se přenesly na nitrocelulózovou membránu westernovým přenosem, jak se popisuje dříve v textu (Martin et al., 1992, Infect. Immun. 60: 2718-2725).
Westernový imunoblotační experimenty jasně indikovaly, že všech osm MAb rozeznávalo proteinový pruh, který odpovídal čištěnému rekombinantnímu proteinu GBS (SEQ ID NO: 39). Tyto MAb také reagovaly s proteinovým pruhem přítomným v každém dosud testovaném izolátu GBS. Reaktivity těchto MAb specifických pro GBS jsou uvedeny v tabulce 6. Každá MAb reagovala se všemi 46 GBS. Navíc tyto MAb také rozeznávaly kmeny mikroorganizmu S. agalactíae pocházející s dobytka. MAb 3A2 také rozeznávaly 19 GBS, 9 izolátů sérotypu Ia/c a 10 • · · · izolátů sérotypu V. Další MAb se netestovaly proti těmto dalším kmenům.
Tyto výsledky ukázaly, že protein GBS (SEQ ID NO: 39) se produkoval všemi 65 GBS a také se testovaly tři kmeny mikroorganizmu S. agalactiae bovinního původu. Více důležité je, že výsledky ukazují, že epitopy rozeznávané těmito osmi MAb specifickými pro GBS se široce rozšířily a konzervovaly mezi GBS. Tyto výsledky také indikovaly, že epitopy nebyly omezeny na serologicky příbuzné izoláty, protože se testovaly zástupci všech známých sérotypů GBS zahrnující hlavní skupiny způsobující onemocnění.
Data uvedená v tomto příkladu jasně ukazují, že protein GBS podle vynálezu produkují všechny GBS a že je antigenně vysoce konzervativní.
Tabulka č. 6: Reaktivita osmi MAb specifických pro protein GBS z různých kmenů S. agalactiae, jak se hodnotilo testem westernovým přenosem.
Mab počet každého sérotypu kmenů S. agalactiae rozeznávané MAb celkem (26) 'bovinní (3)
la or Ia/c (6) lb (3) II (4) III (4) IV (2) v (2) VI (2) VII (2) VIII (1) NT(10)2
3A21 2 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 '46 3
5A12 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
6G11 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 2
8B9 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
8E11 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
12B12 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
18F11 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
• 20G2 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
MAb 3A2 rozeznávají dalších devět kmenů sérotypu Ia/c a 10 kmenů sérotypu V u těchto typu se neprovedla typizace sérem

Claims (41)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    Γΐο,
    1. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid, který vykazuje alespoň 70 % shodu s druhým polypeptidem, jenž má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ
    ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
    9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14,
    SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 4
    SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40
    4 nebo jeho fragmenty, analogy nebo deriváty.
  2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, kde uvedený polynukleotid kóduje polypeptid vykazující polypeptidem.
  3. 3. Izolovaný polynukleotid generovat protilátky, které alespoň 95 shodu s druhým kódující polypeptid schopný mají vazebnou specifitu pro polypeptid, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO 12 , SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO 18 , SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO 24 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 29 , SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO 39 SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO:
    44 nebo jeho fragmenty, analogy nebo deriváty.
  4. 4. Izolovaný polynukleotid, který je s polynukleotidem podle nároku 1.
  5. 5. Izolovaný polynukleotid, který je s polynukleotidem podle nároku 3.
    komplementární komplementární • » · · · · · • · ····· * * • · · · · · ·· ·· ·· · *
    6. DNA Polynukleotid podle nároku 1, kde uvedený polynukleotid je 7 . DNA Polynukleotid podle nároku 3, kde uvedený polynukleotid je 8 . RNA Polynukleotid podle nároku 1, kde uvedený polynukleotid je 9. Polynukleotid podle nároku 3, kde uvedený polynukleotid je
    RNA.
  6. 10. Polynukleotid, který hybridizuje za přísných podmínek s druhým polynukleotidem, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, nebo jeho fragmenty, analogy nebo deriváty.
  7. 11. Polynukleotid, který hybridizuje za přísných podmínek s druhým polynukoleotidem, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO:
    43.
  8. 12. Polynukleotid podle nároku 11, který hybridizuje za přísných podmínek s druhým polynukleotidem, který má sekvenci SEQ ID NO: 37.
  9. 13. Polynukleotid podle nároku 11, který hybridizuje za přísných podmínek s druhým polynukleotidem, který má sekvenci SEQ ID NO: 42.
  10. 14. Polynukleotid podle nároku 11, který hybridizuje za přísných podmínek s druhým polynukleotidem, který má sekvenci SEQ ID NO: 43.
  11. 15. Polynukleotid podle nároku 10, který vykazuje alespoň 95 % komplementaritu s druhým polynukleotidem.
  12. 16. Polynukleotid podle nároku 11, který vykazuje alespoň 95 % komplementaritu s druhým polynukleotidem.
  13. 17. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 1, kde uvedený polynukleotid je operativně spojen s oblastí řídící expresi.
    • ·
  14. 18. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 3, kde uvedený polynukleotid je operativně spojen s oblastí řídící expresi.
  15. 19. Hostitelská buňka, transfikovaná vektorem podle nároku 17.
  16. 20. Hostitelská buňka, transfikovaná vektorem podle nároku 18.
  17. 21. Způsob produkce polypeptidu, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 19 za podmínek vhodných pro expresi uvedeného polypeptidu.
  18. 22. Způsob produkce polypeptidu, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle vhodných pro expresi uvedeného nároku 20 za podmínek polypeptidu.
  19. 23. Izolovaný polypeptid vykazující alespoň 70 shodu s druhým polypeptidem, který má sekvenci vybranou ze skupiny
    zahrnuj ící SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:
    36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 44, nebo jeho fragmenty, analogy nebo deriváty.
  20. 24.Izolovaný polypeptid podle nároku 23, který má sekvenci podle SEQ ID NO: 39.
  21. 25. Izolovaný polypeptid podle nároku 23, který má sekvenci podle SEQ ID NO: 44. .
  22. 26. Izolovaný polypeptid schopný vytvořit protilátky, které mají vazebnou specifitu pro druhý polypeptid, který má sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, SEQ ID
    NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,
    SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ
    ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID • » · · • » · · · • · · · · *· * »····
    NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 a SE Q I D NO: 44 , ne bo j eho f ra gmenty,
    analogy nebo deriváty.
  23. 27. Izolovaný polypeptid podle nároku 26, který má sekvenci podle SEQ ID NO: 39.
  24. 28. Izolovaný polypeptid podle nároku 26, který má sekvenci podle SEQ ID NO: 44.
  25. 29. Izolovaný polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující
    SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 , s EQ I D NO : 5, SE Q ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SE Q I D NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 41, nebo jeho
    fragmenty, analogy nebo deriváty.
  26. 30. Izolovaný polypeptid podle nároku 29, který má aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 39.
  27. 31. Izolovaný polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID NO: 44.
  28. 32. Izolovaný polypeptid podle libovolného z nároků 29 až 31, kde je odstraněn N-terminální zbytek Met.
  29. 33. Izolovaný polypeptid podle libovolného z nároků 29 až 30, kde je odstraněna sekreční aminokyselinová sekvence.
  30. 34. Vakcinační přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje polypeptid podle libovolného z nároků 23 až 31 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo adjuvans.
    * · w * « · • * * · ♦ ·
  31. 35. Vakcinační přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 32 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo adjuvans.
  32. 36. Vakcinační přípravek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 33 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo adjuvans.
  33. 37. Způsob terapeutické a profylaktické léčby streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci, vyznačující se tím, že se živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku podle nároku 34.
  34. 38. Způsob terapeutické a profylaktické léčby streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci, vyznačující se tím, že se živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku podle nároku 35.
  35. 39. Způsob terapeutické a profylaktické léčby streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci, vyznačující se tím, že se živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku podle nároku 36.
    40 Způsob podle libovolného z nároků 37 až 39, v y z n a č u jící se tím ! že uvedeným živočichem je hovězí dobyc ek. 41 Způsob podle libovolného Z nároků 37 až 39, v y z n a č u jící se tím že uvedeným živočichem je člověk. 42 Způsob podle libovolného z nároků 37 až 39, V ' y z n a č u j ící se tím, ž e uvedená bakteriální
    infekce je vybrána ze skupiny zahrnující streptokoky skupiny A a B.
  36. 43. Způsob podle nároku - 42, vyznačuj ící se tím, že uvedená bakteriální infekce je streptokok skupiny B.
    99 9
  37. 44. Použití vakcinačního přípravku podle nároku 34 při terapeutické a profylaktické léčbě streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci nebo infikovaného uvedenou infekcí, při němž se uvedenému živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku.
  38. 45. Použití vakcinačního přípravku podle libovolného z nároků 35 až 36 při terapeutické nebo profylaktické léčbě streptokokové oakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci nebo infikovaného uvedenou infekcí, při němž se uvedenému živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku.
  39. 46. Použití vakcinačního přípravku podle libovolného z nároků 23 až 31 při výrobě vakciny pro terapeutickou nebo profylaktickou léčbu streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci nebo infikovaného uvedenou infekcí, při němž se uvedenému živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku.
  40. 47. Použití vakcinačního přípravku podle nároku 32 pro výrobu vakciny pro terapeutickou nebo profylaktickou léčbu streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci nebo infikovaného uvedenou infekcí, při němž se uvedenému živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku.
  41. 48. Použití vakcinačního přípravku podle nároku 33 pro výrobu vakciny pro terapeutickou nebo profylaktickou léčbu streptokokové bakteriální infekce u živočicha náchylného ke streptokokové infekci nebo infikovaného uvedenou infekcí, při němž se uvedenému živočichovi aplikuje terapeutické nebo profylaktické množství přípravku.
CZ20003054A 1998-02-20 1999-02-17 Antigeny streptokoku skupiny B CZ301056B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7542598P 1998-02-20 1998-02-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20003054A3 true CZ20003054A3 (cs) 2001-03-14
CZ301056B6 CZ301056B6 (cs) 2009-10-29

Family

ID=22125658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003054A CZ301056B6 (cs) 1998-02-20 1999-02-17 Antigeny streptokoku skupiny B

Country Status (22)

Country Link
US (4) US20030031682A1 (cs)
EP (3) EP1757697A3 (cs)
JP (2) JP4637350B2 (cs)
KR (1) KR100771148B1 (cs)
CN (2) CN1268745C (cs)
AP (1) AP2000001886A0 (cs)
AT (1) ATE347600T1 (cs)
AU (1) AU2505999A (cs)
CA (1) CA2321106C (cs)
CZ (1) CZ301056B6 (cs)
DE (1) DE69934299T2 (cs)
EA (1) EA200000860A1 (cs)
ES (2) ES2540281T3 (cs)
HU (1) HU228497B1 (cs)
ID (1) ID27482A (cs)
IL (3) IL137921A0 (cs)
NO (2) NO330491B1 (cs)
NZ (1) NZ529854A (cs)
OA (1) OA11686A (cs)
TR (1) TR200002437T2 (cs)
WO (1) WO1999042588A2 (cs)
ZA (1) ZA991325B (cs)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU228497B1 (en) * 1998-02-20 2013-03-28 Id Biomedical Corp Quebec Group b steptococcus antigens
JP2002531054A (ja) * 1998-07-27 2002-09-24 マイクロビアル テクニクス リミティッド Ｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質
US7098182B2 (en) 1998-07-27 2006-08-29 Microbial Technics Limited Nucleic acids and proteins from group B streptococcus
US6890539B2 (en) 1998-12-22 2005-05-10 Microscience, Ltd. Genes and proteins, and their use
ATE353367T1 (de) 1998-12-22 2007-02-15 Microscience Ltd Group b streptococcus proteine und deren verwendung
GB0105922D0 (en) * 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Genes and proteins, and their use
US7128918B1 (en) 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US6833356B1 (en) 1999-08-25 2004-12-21 Medimmune, Inc. Pneumococcal protein homologs and fragments for vaccines
EP1210366A1 (en) * 1999-08-25 2002-06-05 Medimmune, Inc. Homologs of a pneumococcal protein and fragments for vaccines
US6833134B2 (en) 2000-06-12 2004-12-21 University Of Saskacthewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
DK1332155T3 (da) * 2000-06-12 2007-02-26 Univ Saskatchewan Vaccination af malkekvæg med GapC protein mod streptokokinfektion
US6866855B2 (en) 2000-06-12 2005-03-15 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
EP1734050A3 (en) * 2000-06-12 2012-12-05 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against streptococcus infection
US6660270B2 (en) 2000-06-12 2003-12-09 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with chimeric GapC protein against Streptococcus infection
CA2424433A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Shire Biochem Inc. Bvh-a2 and bvh-a3 antigens of group b streptococcus
SG165981A1 (en) 2000-10-27 2010-11-29 Chiron Srl Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
AU2002216863B8 (en) * 2000-12-21 2008-03-20 Id Biomedical Corporation Streptococcus pyogenes antigens and corresponding DNA fragments
FR2824074A1 (fr) * 2001-04-26 2002-10-31 Pasteur Institut Sequence du genome streptococcus agalactiae, application au developpement de vaccins, d'outils de diagnostic, et a l'identification de cibles therapeutiques
ATE543906T1 (de) * 2002-02-11 2012-02-15 Id Biomedical Corp Antigen von streptococcus aus der b-gruppe
GB0210128D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Chiron Spa Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
ES2505695T3 (es) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Composiciones inmunógenas para Streptococcus pyogenes
US8945589B2 (en) 2003-09-15 2015-02-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae
US20090317420A1 (en) 2004-07-29 2009-12-24 Chiron Corporation Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
AU2005294275B2 (en) 2004-10-08 2012-09-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic and therapeutic compositions for Streptococcus pyogenes
WO2006086330A2 (en) * 2005-02-08 2006-08-17 Id Biomedical Corporation Of Quebec C.O.B. As Glaxosmithkline Biologicals North America Pharmaceutical compositions
GB0605247D0 (en) * 2006-03-15 2006-04-26 Chiron Srl Compositions and methods for immunisation
AU2008299376B2 (en) 2007-09-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. GAS57 mutant antigens and GAS57 antibodies
BRPI0821240B8 (pt) 2007-12-21 2022-10-04 Novartis Ag formas mutantes de estreptolisina o
CN102304185A (zh) * 2011-09-02 2012-01-04 黑龙江八一农垦大学 预防奶牛乳房炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用
EP2949340A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-02 IDT Biologika GmbH Vaccine composition against Streptococcus suis infection

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4425437A (en) 1979-11-05 1984-01-10 Genentech, Inc. Microbial polypeptide expression vehicle
US4431739A (en) 1979-11-05 1984-02-14 Genentech, Inc. Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein
US5302386A (en) * 1986-04-16 1994-04-12 Brigham And Women's Hospital, Inc. Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture
US5472696A (en) * 1988-02-26 1995-12-05 Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. Antigen of group B streptococci
US5648241A (en) * 1989-09-15 1997-07-15 The General Hospital Corporation Conjugate vaccine against group B streptococcus
US5679768A (en) * 1991-02-15 1997-10-21 Uab Research Foundation Epitopic regions of pneumococcal surface protein A
US5225331A (en) * 1991-04-25 1993-07-06 National Research Council Of Canada Immunoassay for detecting group b streptococcus
CA2158658A1 (en) 1993-03-19 1994-09-29 Margaretha Stalhammar-Carlemalm Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group b streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition
US5595740A (en) * 1994-05-16 1997-01-21 University Of Florida Cloning of non-IgA FC binding forms of the group B streptococcal beta antigens
AU706304B2 (en) * 1994-11-01 1999-06-10 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Peptide sequence that forms mucin sugar chain and technique for modifying protein to be linked with mucin sugar chain
DE69737125T3 (de) * 1996-10-31 2015-02-26 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe
HU228497B1 (en) * 1998-02-20 2013-03-28 Id Biomedical Corp Quebec Group b steptococcus antigens
US6248329B1 (en) * 1998-06-01 2001-06-19 Ramaswamy Chandrashekar Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof
JP2002531054A (ja) 1998-07-27 2002-09-24 マイクロビアル テクニクス リミティッド Ｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質
ATE422899T1 (de) 1998-12-21 2009-03-15 Medimmune Inc Streptococcus pneumoniae proteine und immunogene fragmente für impstoffe
HU229664B1 (en) 1998-12-23 2014-04-28 Id Biomedical Corp Quebec Streptococcus antigens
US7128918B1 (en) * 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
GB9921125D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Microbial Technics Limited Proteins
ATE543906T1 (de) 2002-02-11 2012-02-15 Id Biomedical Corp Antigen von streptococcus aus der b-gruppe

Also Published As

Publication number Publication date
OA11686A (en) 2005-01-12
IL190018A (en) 2011-07-31
CA2321106A1 (en) 1999-08-26
HU228497B1 (en) 2013-03-28
EP2280072B1 (en) 2015-03-25
CN1944652A (zh) 2007-04-11
CA2321106C (en) 2013-07-23
EP1757697A3 (en) 2007-05-30
KR100771148B1 (ko) 2007-10-29
AP2000001886A0 (en) 2000-09-30
WO1999042588A2 (en) 1999-08-26
CZ301056B6 (cs) 2009-10-29
US20110182923A1 (en) 2011-07-28
EP1054971A2 (en) 2000-11-29
US20030228323A1 (en) 2003-12-11
DE69934299T2 (de) 2007-07-05
US7914794B2 (en) 2011-03-29
DE69934299D1 (de) 2007-01-18
AU2505999A (en) 1999-09-06
IL137921A (en) 2008-06-05
EP2280072A2 (en) 2011-02-02
US20130095498A1 (en) 2013-04-18
EA200000860A1 (ru) 2001-10-22
EP1054971B1 (en) 2006-12-06
IL137921A0 (en) 2001-10-31
JP4637350B2 (ja) 2011-02-23
HUP0102304A3 (en) 2008-03-28
ES2278436T3 (es) 2007-08-01
CN1297482A (zh) 2001-05-30
ES2540281T3 (es) 2015-07-09
HUP0102304A1 (hu) 2001-10-28
ATE347600T1 (de) 2006-12-15
KR20010034518A (ko) 2001-04-25
US8580262B2 (en) 2013-11-12
JP2002507396A (ja) 2002-03-12
TR200002437T2 (tr) 2000-11-21
NO330491B1 (no) 2011-05-02
NO20101682L (no) 2000-10-19
NO20004161D0 (no) 2000-08-18
US8226953B2 (en) 2012-07-24
WO1999042588A3 (en) 2000-03-23
ZA991325B (en) 1999-08-20
IL190018A0 (en) 2008-08-07
NO20004161L (no) 2000-10-19
JP2009242403A (ja) 2009-10-22
EP2280072A3 (en) 2012-06-06
CN1268745C (zh) 2006-08-09
ID27482A (id) 2001-04-12
EP1757697A2 (en) 2007-02-28
US20030031682A1 (en) 2003-02-13
NZ529854A (en) 2005-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1054971B1 (en) Group b streptococcus antigens
EP1141306B1 (en) Streptococcus antigens
US7262024B2 (en) Streptococcus antigens
AU2001270381A1 (en) Streptococcus antigens
EP1303612A2 (en) Streptococcus antigens
AU2010227084B2 (en) Group B Streptococcus Antigens
AU2007200130B2 (en) Group B Streptococcus Antigens
EP1325133B1 (en) Bvh-a2 and bvh-a3 antigens of group b streptococcus
EP1950302B1 (en) Streptococcus antigens
MXPA00008111A (en) Group b streptococcus antigens

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20190217