JP2002507396A

JP2002507396A - グループｂ連鎖球菌抗原

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Publication number: JP2002507396A
Application number: JP2000532528A
Authority: JP
Inventors: ベルナール・エール・ブロドール; クレマン・リュウ; マルティーヌ・ボワイエ; イザベル・シャルルボワ; ジョゼ・ハメル; デニ・マルタン
Original assignee: バイオケムファーマインコーポレイテッド
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2002-03-12
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: US20030031682A1; HUP0102304A1; CZ20003054A3; US20130095498A1; IL190018A; CA2321106A1; NO20101682L; IL190018A0; CA2321106C; NO20004161L; US20030228323A1; EP2280072B1; EP1054971A2; ATE347600T1; NZ529854A; JP4637350B2; HU228497B1; ES2540281T3; AU2505999A; KR100771148B1

Abstract

(57)【要約】グループＢ連鎖球菌(GBS)タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドを記載する。該タンパク質は抗原性であり、従って動物における連鎖球菌感染の予防または治療のための有用なワクチン成分である。またタンパク質抗原の製造の組換え法および連鎖球菌細菌感染の検出の診断法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は治療および／または予防のためのワクチン成分として有用な抗原、よ
り具体的には、グループＢ連鎖球菌(GBS)細菌病原体のタンパク質抗原に関する。

【０００２】 (発明の背景) 連鎖球菌はグラム(＋)細菌であり、細胞表面に見られるグループ特異的炭水化
物抗原ＡからＯにより区別される。連鎖球菌は、更に、タイプ特異的カプセル状
ポリサッカライド抗原により分類される。数種の抗原型がグループＢ連鎖球菌(G
BS)に関して同定されている：Ｉａ、Ｉｂ、II、III、IV、Ｖ、VI、VIIおよびVII
I。GBSはまた“Ｃ−タンパク質”(アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ)とし
て既知の抗原タンパク質を含み、その幾つかはクローン化されている。

【０００３】 GBSは正常ヒト膣および結腸叢の常在菌であり、この病原体は長い間新生児敗血症および髄膜炎、幼児の遅延発症髄膜炎、分娩後子宮内膜炎ならびに乳牛乳房
炎の主な原因であるとして認識されている。GBSに曝された妊婦は、分娩後感染の危険性があり、子供が、産道を通過する際に感染が赤ん坊に伝播している可能
性がある。本生物は抗生物質に感受性であるが、高い攻撃率および新生児におけ
る敗血症および幼児の髄膜炎の速い発症は、高い罹病率および致死率をもたらす
。

【０００４】個体をGBS感染から保護するワクチンを発見するために、研究はタイプ特異的抗原に向かっている。不幸なことに、これらのポリサッカライドはヒトで免疫原
性が乏しく、ポリサッカライドが由来する特定の抗原型に限定されている。更に
、カプセル状ポリサッカライドはＴ細胞非依存的反応を誘発し、即ち、ＩｇＧ産
生をしない。結果として、カプセル状ポリサッカライド抗原は、GBS感染に対する保護のためのワクチン成分として適していない。

【０００５】他の研究は、マウスおよびウサギモデルで免疫原性特性が証明されているＣ−
タンパク質ベータ抗原を焦点にしている。このタンパク質は、ヒトIgAのFc領域と高親和性および非免疫原性方法で相互作用する望ましくない特性のために、ヒ
トワクチンとしては不適当であることが判明した。Ｃ−タンパク質アルファ抗原
は殆どのGBS介在状態を担う抗原型であるGBSのタイプIII抗原型で少なく、従って、ワクチン成分としての使用はほとんどない。

【０００６】従って、GBS感染の予防および／または治療のためのワクチン成分として使用し得るGBS抗原のまだ充たされていない必要性がある。

【０００７】 (発明の要約) 一つの態様にしたがって、本発明は：配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号
２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９
、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４またはそのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体からなる群から選択される配列を有する第２のポリペプチド
と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレ
オチドを提供する。

【０００８】他の態様において、発現性制御領域に操作可能に結合した本発明のポリヌクレ
オチドを含むベクター、および該ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞お
よび該宿主細胞を発現に適した条件下で培養することを含むポリペプチドの製造
法を提供する。

【０００９】更に別の態様において、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる新規ポ
リペプチドを提供する。

【００１０】 (図面の説明) 図１ａは、クローン１(配列番号１)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図１ｂは配列番号２のアミノ酸配列；図１ｃは配列番号３のアミノ酸配列；図１ｄは配列番号４のアミノ酸配列；図１ｅは配列番号５のアミノ酸配列；図１ｆは配列番号６のアミノ酸配列；

【００１１】図２ａは、クローン２(配列番号７)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図２ｂは配列番号８のアミノ酸配列；図２ｃは配列番号９のアミノ酸配列；図２ｄは配列番号１０のアミノ酸配列；図２ｅは配列番号１１のアミノ酸配列；図２ｆは配列番号１２のアミノ酸配列；

【００１２】図３ａは、クローン３(配列番号１３)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図３ｂは配列番号１４のアミノ酸配列；図３ｃは配列番号１５のアミノ酸配列；図３ｄは配列番号１６のアミノ酸配列；図３ｅは配列番号１７のアミノ酸配列；図３ｆは配列番号１８のアミノ酸配列；図３ｇは配列番号１９のアミノ酸配列；図３ｈは配列番号２０のアミノ酸配列；図３ｉは配列番号２１のアミノ酸配列；

【００１３】図４ａは、クローン４(配列番号２２)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図４ｂは配列番号２３のアミノ酸配列；図４ｃは配列番号２４のアミノ酸配列；図４ｄは配列番号２５のアミノ酸配列；図４ｅは配列番号２６のアミノ酸配列；

【００１４】図５ａは、クローン５(配列番号２７)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図５ｂは配列番号２８のアミノ酸配列；図５ｃは配列番号２９のアミノ酸配列；図５ｄは配列番号３０のアミノ酸配列；図５ｅは配列番号３１のアミノ酸配列；

【００１５】図６ａは、クローン６(配列番号３２)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図６ｂは配列番号３３のアミノ酸配列；図６ｃは配列番号３４のアミノ酸配列；図６ｄは配列番号３５のアミノ酸配列；図６ｅは配列番号３６のアミノ酸配列；

【００１６】図７ａは、クローン７(配列番号３７)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列；図７ｂは配列番号３８のアミノ酸配列；図７ｃは配列番号３９のアミノ酸配列；図７ｄは配列番号４０のアミノ酸配列；図７ｅは配列番号４１のアミノ酸配列；

【００１７】図８は、シグナル配列を有するクローン７の一部のDNA配列(配列番号４２)；図９はシグナル配列なしのクローン７の一部のDNA配列(配列番号４３)；図９ａはアミノ酸配列(配列番号４４)；図１０は、配列番号３９に対応する組換えGBSタンパク質で免疫化したCD-1マウスの血清の抗−GBS ELISA力価の分布を示す。

【００１８】 (発明の詳細な説明) 本発明は：配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号
２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９
、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４またはそのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列により特徴付けられ
るグループＢ連鎖球菌(GBS)の新規抗原性ポリペプチドに関する。

【００１９】本発明の好ましい態様は、配列番号３９および配列番号４４を含む。本発明の更に好ましい態様は、配列番号３９を含む。本発明の更に好ましい態様は、配列番号４４を含む。

【００２０】本明細書で使用する限り、本発明のポリペプチドの“フラグメント”、“誘導
体”または“アナログ”は、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、天然または
非天然であり得る保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存)で置換された
ポリペプチドを含む。

【００２１】本発明の“フラグメント”、“誘導体”または“アナログ”なる用語は、また
ポリペプチドが免疫応答を誘導する能力を保持する限り、アミノ酸の付加、欠失
、置換により修飾されたポリペプチドを含む。

【００２２】 “保存アミノ酸”は、１個またはそれ以上のアミノ酸の、ある抗原の抗原決定
基(二次構造およびヒドロパシー性質を含む)が、置換にもかかわらず完全にまた
は部分的に保存されている、他のものへの置換を意味する。

【００２３】例えば、配列内の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を、機能的相同物として
働き、沈黙的改変をもたらす同様の極性の他のアミノ酸に置換できる。配列内の
アミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択し得る
。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極
性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギンおよびグルタミンを含む。陽性荷電(塩基性)アミノ酸はアルギニン、リ
ジンおよびヒスチジンを含む。陰性荷電(酸性)アミノ酸はアスパラギン酸および
グルタミン酸を含む。

【００２４】好ましくは、本発明のポリペプチドの誘導体およびアナログは、図に記載の配
列またはそのフラグメントと約７０％の同一性を有する。即ち、７０％の残基が
同じである。より好ましくは、ポリペプチドは９５％以上の相同性を有する。他
の好ましい態様において、本発明のポリペプチドの誘導体およびアナログは約２
０個より少ない、およびより好ましくは１０個より少ないアミノ酸残基置換、修
飾または欠失を有する。好ましい置換は、当分野で保存として既知のもの、すな
わち、置換残基が疎水性、サイズ、電荷または官能基のような物理的または化学
的性質を共有するものである。

【００２５】更に、アミノ酸領域が多形体である状況において、１個またはそれ以上の特定
のアミノ酸を異なるGBS株の異なるエピトープをより有効に模倣するように変えることが望ましい場合がある。

【００２６】またポリペプチド生理学的または薬理学的性質を変える他の化合物、即ち、半
減期を増加させるためのポリエチレングリコール(PEG)；精製を容易にするためのリーダーまたは分泌性アミノ酸配列；プレプロ−およびプロ−配列；および( ポリ)サッカライドと融合したポリペプチドが含まれる。

【００２７】更に、本発明のポリペプチドは、安定性、支持体または他の分子への連結また
は結合のための疎水性の増加を提供するため、末端−NH₂アシル化(例えば、アセ
チル化、または例えばアンモニアまたはメチルアミンでのチオグリコール酸アミ
ド化、末端カルボキシアミド化)により修飾できる。

【００２８】また意図されるのは、ポリペプチドフラグメント、アナログおよび誘導体のヘ
テロおよびホモポリペプチド多量体である。これらの多量体形は、例えば、アビ
ジン／ビオチン、グルタールアルデヒドまたはジメチル−スペルミデートのよう
な架橋剤で架橋している１個またはそれ以上のポリペプチドを含む。このような
多量体形はまた、組換えDNA法により多シストロン性mRNAから産生された２個またはそれ以上の連結(tandem)または逆転連結(inverted contiguous)配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のポリペプチドのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体は少なくとも一つの抗原性領域、即ち、少なくとも一つのエ
ピトープを含む。

【００２９】抗原性ポリマー(即ち合成多量体)の形成を達成するために、試薬がチオ基に特
異的であるとき、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライド等を有するポリ
ペプチドを利用し得る。従って、異なるポリペプチドの二つのメルカプト基の間
の結合は単結合であり得、または少なくとも２個、典型的には少なくとも４個、
そして１６個を超えないが、通常約１４個を超えない炭素原子の架橋基を含み得
る。

【００３０】特定の態様において、本発明のポリペプチドフラグメント、アナログおよび誘
導体はメチオニン(Met)開始残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドはリーダーまたは分泌性配列(シグナル配列)を包含しない。本発明のポリペプチドのシ
グナル部分は確立された分子生物法により決定し得る。一般に、目的のポリペプ
チドはGBS培養から単離し、続いて配列決定して成熟タンパク質の最初の残基、従って成熟ポリペプチド配列を決定し得る。

【００３１】他の態様において、本発明の１個またはそれ以上のGBSポリペプチドを、薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントとの混合物で含むワクチン組成
物を提供する。

【００３２】適当なアジュバントは、油、即ち、フロインド完全または不完全アジュバント
；塩、即ちAlK(SO₄)₂、AlNa(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)₂、Al(OH)₃、AlPO₄、シリカ、カ
オリン；サポニン誘導体、炭素ポリヌクレオチド、即ち、ポリICおよびポリＡＵ
およびまた粘膜免疫性の誘導のための無毒化コレラ毒素(CTB)およびE. coli加熱
不安定毒素を含む。好ましいアジュバントは、QuilA(登録商標)、Alhydrogel(登
録商標)およびAjduphos(登録商標)を含む。本発明のワクチンは、注射、急速点滴、鼻咽腔吸収、皮膚吸収により非経腸的に、またはバッカルまたは経口で投与
し得る。

【００３３】本発明のワクチン組成物は連鎖球菌感染および／または連鎖球菌、特にグルー
プＡ連鎖球菌(発熱原)、グループＢ連鎖球菌(GBSまたはagalactiae)、dysgalact
iae、uberis、nocardiaならびにStaphylococcus aureus感染により媒介される疾
病および症状の処置または予防に使用される。連鎖球菌に関する一般的情報は、
Manual of Clinical Microbiology, P. R. Murray et al., (1995, 第６版, ASM
Press, Washington, D.C.)から入手可能である。より具体的に、グループＢ連鎖球菌、agalactiae。特定の態様において、ワクチンは妊婦および幼児のような
敗血症、髄膜炎および肺炎の感染の危険性のある個体に、および糖尿病、肝臓疾
患または癌のような免疫無防備個体に投与する。ワクチンはまた、上記の細菌お
よびE. coliにより媒介されるウシの乳房炎の処置のような獣医学的適用を有し得る。

【００３４】本発明のワクチンはまた連鎖球菌感染および／または連鎖球菌、特にグループ
Ａ連鎖球菌(発熱原)、グループＢ連鎖球菌(GBSまたはagalactiae)、dysgalactia
e、uberis、nocardiaならびにStaphylococcus aureus感染により介在される疾病
および症状の処置または予防に使用する医薬の製造にも使用される。より具体的
に、グループＢ連鎖球菌、agalactiae。

【００３５】ワクチン組成物は、好ましくは約０.００１から１００μg／kg(抗原／体重)お
よびより好ましくは０.０１から１０μg／kg、最も好ましくは０.１から１μg／
kgの単位投与量を１から１２週、およびより好ましくは１から６週間隔で１から
３回投与する。

【００３６】他の態様において：配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号
２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９
、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４またはそのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸により特徴付けられる、
グループＢ連鎖球菌(GBS)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

【００３７】好ましいポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、オープン
リーディングフレームに対応する、図１ａ(配列番号１)、２ａ(配列番号７)、３
ａ(配列番号１３)、４ａ(配列番号２２)、５ａ(配列番号２７)、６ａ(配列番号３２)、７ａ(配列番号３７)、８(配列番号４２)および９(配列番号４３)に説明するものである。

【００３８】好ましいポリヌクレオチドは、図１ａ(配列番号１)、２ａ(配列番号７)、３ａ
(配列番号１３)、４ａ(配列番号２２)、５ａ(配列番号２７)、６ａ(配列番号３２)、７ａ(配列番号３７)、８(配列番号４２)および９(配列番号４３)に説明するものおよびそのフラグメント、アナログおよび誘導体である。

【００３９】より好ましい本発明のポリヌクレオチドは、図７(配列番号３７)、８(配列番号４２)および９(配列番号４３)に説明するものである。最も好ましい本発明のポリヌクレオチドは、８(配列番号４２)および９(配列番号４３)に説明するものである。

【００４０】図に記載のポリヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドをなおコードして
いる限り、縮重コドンで改変されていてもよい。

【００４１】ヌクレオチドコード配列の縮重のために、実質的に本発明と同じポリペプチド
をコードする他のポリヌクレオチド配列を本発明の実施に使用し得る。これらは
、配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンへの置換、即ち、沈黙的
改変を行うことを含むが、これらに限定されない。

【００４２】従って、本発明は更に配列の間の５０％、好ましくは少なくとも７０％の同一
性を有する上記のポリヌクレオチド配列(またはその相補的配列)とハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、ポリヌクレオチドはスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズできる、即ち、少なくとも９５％同一性
および最も好ましくは９７％以上の同一性を有する。

【００４３】ストリンジェントな条件下でハイブリダイズを行うことは、核酸分子の、第２
核酸配列(cDNA、mRNAまたはゲノムDNAにかかわらず)の少なくとも一つの領域へのまたはその相補的鎖への、標準条件下、例えば、非相補的ヌクレオチド配列の
ハイブリダイゼーションを好まない傾向のある高温および／または低塩濃度での
アニーリングを意味する。適当なプロトコールは、引用して本明細書に包含させ
るManiatis T. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, 1982に記載されている。

【００４４】更なる態様において、本発明のポリペプチド、またはそのフラグメント、アナ
ログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを、DNA免疫化法に使用し得る。即ち、それらを注射により複製可能および発現可能なベクターに包含させ、そ
れによりインビボで抗原ポリペプチドを産生することができる。例えば、ポリヌ
クレオチドを、真核細胞内で機能的なCMVプロモーターの制御化にプラスミドベクターに包含させる。好ましくは、ベクターを筋肉内注射する。

【００４５】他の態様に従って、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞
内に発現させ、発現ポリペプチド生産物を回収することによる、組換え法による
本発明のポリペプチドの製造法が提供される。あるいは、ポリペプチドを確立さ
れた合成化学法、即ち、完全ポリペプチドを製造するためにライゲートする(ブロックライゲーション)オリゴペプチドの液相または固相合成により製造できる。

【００４６】組換え製造のために、宿主細胞をポリペプチドをコードするベクターでトラン
スフェクトし、次いでプロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の
増幅に適当なように修飾した栄養培地で培養する。適当なベクターは、選択した
宿主内で生存可能および複製可能であり、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えば細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合わせに由来するベクターを含む。ポリペプチド配列は、プロモーター、リボソーム結合部位(コンセンサス領域またはシャイン −ダルガーノ配列)、および所望によりオペレーター(コントロール要素)を含む発現制御領域に操作可能に結合するように、制限酵素を使用して適当な部位でベ
クターに取りこまれる。ある宿主およびベクターに適当な発現制御領域の個々の
成分を、確立された分子生物学原理に従って選択できる(引用して本明細書に包含させるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.
, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)。適当なプロモーターは、LTRまたはSV40プ
ロモーター、E. coli lac、tacまたはtrpプロモーターおよびファージラムダP_L プロモーターを含むがこれらに限定されない。ベクターは好ましくは複製起源お
よび選択マーカー、即ち、アンピシリン耐性遺伝子を含む。適当な細菌ベクター
は、pET、pQE70、pQE60、pQE-9、PBS、pD10ファージスクリプト、psiX174、pblu
escript SK、PBSks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-2、pKK
233-3、pDR540、pRIT5および真核ベクターpBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG4
4、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLを含む。宿主細胞は、細菌、即ち、E. coli、Bacillus subtilis、Streptomyces；真菌、即ちAspergillus niger 、Aspergillus nidulins；酵母、即ち、Saccharomycesまたは真菌、即ちCHO、CO
Sを含む。

【００４７】培養におけるポリペプチドの発現後に、細胞を典型的に遠心により回収し、次
いで物理的または化学的手段(発現ポリペプチドが媒体中に分泌されない場合)で
粉砕させ、得られた粗抽出物を保持して目的のポリペプチドを単離する。培養媒
体または細胞破砕物からのポリペプチドの精製は、ポリペプチドの性質に依存し
て、確立された方法で、すなわち、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸
抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト
クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを使用して達成し得る。
最終精製はHPLCを使用して達成し得る。

【００４８】ポリペプチドは、リーダーまたは分泌配列を伴いまたは欠いて発現し得る。前
者の場合、リーダーは翻訳後処理(引用して本明細書に包含させる米国特許4,431
,739；4,425,437；および4,338,397参照)を使用して除去し得、または発現ポリペプチドの精製に続いて化学的に除去し得る。

【００４９】更なる態様に従って、本発明のGBSポリペプチドは特定のGBS感染における連鎖
球菌感染の診断的試験に使用し得る。数個の診断法、例えば、生物学的サンプル
中の連鎖球菌生物の検出が可能であり、以下の方法に従い得る：ａ)患者からの生物学的サンプルの所得；ｂ)混合物を形成するための本発明のGBSポリペプチドと反応性の抗体またはその
フラグメントと生物学的サンプルのインキュベーション；ｃ)混合物中の、連鎖球菌に特異的な抗体の存在を示す特異的結合抗体または結合フラグメントの検出。

【００５０】あるいは、抗体を含む、または含むことが疑われる生物学的サンプル中の連鎖
球菌抗原に特異的な抗体の検出法は、以下の通りに行い得る：ａ)患者からの生物学的サンプルの分離；ｂ)混合物を形成するための本発明のGBSポリペプチドまたはそのフラグメントと
生物学的サンプルのインキュベーション；ｃ)混合物中の、連鎖球菌に特異的な抗体の存在を示す特異的結合抗原または結合フラグメントの検出。

【００５１】当業者は、本診断試験が、本質的にタンパク質に特異的な抗体が生物中に存在
するか否かを決定する、酵素結合免疫収着検定(ELISA)、放射免疫アッセイまたはラテックス凝集アッセイのような酵素免疫学的試験を含む数個の形で行い得る
ことを認識する。

【００５２】本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、また連鎖球菌の存在の、このような細菌を含むことが疑われる生物学的サンプルでの検出に使用する、DNAプローブの設計に使用し得る。本発明の検出法は：ａ)患者からの生物学的サンプルの分離；ｂ)混合物を形成するための本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするDNA配列を有する１個またはそれ以上のDNAプローブと生物学的サンプル
のインキュベーション；ｃ)混合物中の、連鎖球菌の存在を示す特異的結合DNAプローブの検出を含む。

【００５３】本発明のDNAプローブは、また、連鎖球菌感染の診断法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用したサンプル中の循環連鎖球菌、即ちGBS核酸の検出にも使用し得る。プローブは、慣用の方法を使用して合成し得、固相に固定化し得
、または検出可能標識で標識し得る。この適用のための好ましいDNAプローブは、本発明のGBSポリペプチドの少なくとも約６連続ヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴマーである。

【００５４】患者における連鎖球菌の他の検出法は：ａ)本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントと反応性の抗体の検出可能標識での標識；ｂ)標識抗体または標識フラグメントの患者への投与；そしてｃ)連鎖球菌の存在を示す、患者の中の特異的結合標識抗体または標識フラグメントの検出を含む。

【００５５】本発明の更なる態様は、本発明のGBSポリペプチドの、診断用および特に連鎖球菌感染処置用の特異的抗体の製造のための免疫原としての使用である。適当な
抗体は、適当なスクリーニング法、例えば、特定の抗体が試験モデルにおいて連
鎖球菌感染に対して受動的に保護する能力の測定により決定し得る。動物モデル
の一つの例は、本明細書の実施例に記載するマウスモデルである。抗体は全抗体
またはその抗原結合フラグメントであり得、一般に任意の免疫グロブリンクラス
に属する。抗体またはフラグメントは、動物起源、特に哺乳類起源、およびより
特異的にはマウス、ラットまたはヒト起源であり得る。天然抗体またはそのフラ
グメント、または所望により、組換え抗体または抗体フラグメントであり得る。
組換え抗体または抗体フラグメントなる用語は、分子生物法を使用して産生され
た抗体または抗体フラグメントを意味する。抗体または抗体フラグメントは、ポ
リクローナル、または好ましくはモノクローナルであり得る。GBSと会合するエピトープの数については特異的であり得るが、好ましくは一つに対して特異的で
ある。

【００５６】 (実施例) 実施例１致死グループＢ連鎖球菌(GBS)感染のマウスモデル GBS感染のマウスモデルは、Lancefield et al (J Exp Med 142:165-179, 1975
)に詳述されている。GBS株C388/90(臨床単離物は、Children's Hospital of Eas
tern Ontario, Ottawa, Canadaから、髄膜炎に罹患している患者の頭脊柱(cepha
lorachidian)液から１９９０年に得られている)およびNCS246(National Center
for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern A
lberta, Edmonton, Canada)は、各々抗原型タイプIa/cおよびタイプII/Rと分類された。

【００５７】その毒性を増加させるために、GBS株C388/90(抗原型Ia/c)おおびNCS246(抗原型II/R)を先に記載(Lancefield et al. J Exp Med 142:165-179, 1975)のように
マウスを通して連続的に継代した。簡単に、毒性の増加を、感染マウスの血液ま
たは脾臓のいずれかから得たトッド−ヒューイットブロスの継代培養の連続希釈
の腹腔内接種を使用して追跡した。最後の継代の後、感染血液サンプルを使用し
てトッド−ヒューイットブロスに接種した。２時間、３７℃で７％CO₂での２時間のインキュベーション後、最終濃度１０％(v/v)のグリセロールを培養に添加した。次いで、GBS攻撃実験に使用するために、培養を等分し、−８０℃で貯蔵した。これらの凍結サンプルに存在するGBSのcfuの数を決定した。１８週齢マウ
スを１００％を殺すのに必要な細菌濃度(LD100)は、GBS株C388/90およびNCS246 で各々３.５×１０⁵および１.１×１０⁵であり、両方の株の毒性の有意な増加に
対応した。実際、これらの二つの株の継代前に記録されたLD100は１０⁹cfuより高かった。

【００５８】細菌攻撃において、毒性GBS株の新たに融解したアリコートを、トッド−ヒューイットブロスを使用して適当な細菌濃度に希釈し、１mLを各雌CD-1マウスに腹
腔内注射した。受動的保護の実験に使用したマウスは６から８週齢であったが、
報道的保護実験に使用したものは攻撃時に約１８週齢であった。全ての接種物は
コロニー計数で立証した。動物は攻撃後最初の４８時間は１日４回、ついで次ぎ
の１２日は毎日感染の兆候に関して観察した。この期間の終りに血液サンプルを
生存動物から得、−２０℃に凍結させた。この攻撃で生存した各マウスから得た
脾臓を残ったGBSの同定のために培養した。

【００５９】実施例２ホルムアルデヒド死滅全GBS細胞でのマウス免疫化および保護ホルムアルデヒド死滅GBS全細胞をLancefield et al (J Exp Med 142:165-179
, 1975)に記載の方法に従って調製した。簡単に、GBS株のヒツジ血液寒天プレー
ト(Quelab Laboratories, Montreal, Canada)での一晩の培養を、２回PBS(リン酸緩衝化食塩水、pH７.２)で洗浄し、約３×１０⁹cfu／mLに調節して一晩０.３％(v/v)ホルムアルデヒド含有PBS中でインキュベートした。死滅GBS懸濁液をPBS
で洗浄し、−８０℃に保った。

【００６０】雌CD-1マウス、６から８週齢(Charles River, St-Constant, Quebec, Canada)
に、C388/90(〜６×１０⁷GBS)の０.１mlのホルムアルデヒド死滅細胞またはコン
トロールグループのために０.１mlのPBSを皮下注射した。免疫化の前日、Alhydr
ogel(登録商標)(Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark)を０.１４mgまたは０.２１mgのAlの最終濃度でこれらの調製物に添加し、一晩４℃で撹拌しながらインキュベートした。血清サンプルを各マウスから免疫化プロトコール開始
前および最後の注射２週間後に得た。血清を−２０℃で凍結させた。

【００６１】各々PBSを注射したコントロールグループおよびホルムアルデヒド死滅全細胞G
BS株C388/90(Ia/c)で免疫化した８匹のマウスを、１.５×１０⁴cfuのGBS株C388/
90(Ia/c)で３回目の注射の１週間後に攻撃した。ホルムアルデヒド死滅GBS全細胞で免疫化した全マウスは同種攻撃で生存したが、攻撃後５日以内に、PBSを注射した８匹のうち４匹のみが感染から生存した。コントロール群の致死率を増加
させるために、細菌懸濁液を細菌攻撃の時点のマウスの年齢に従って調節してい
る。続く攻撃実験において、マウスが１５週齢より上である場合、細菌接種は３
.０×１０⁵および２.５×１０⁶cfuの間に増加させた。

【００６２】

【表１】 ¹ 最終濃度０.１４mgまたは０.２１mgのAl濃度のAlhydrogel(登録商標)を使用した；² 約６×１０⁷cfu；³ １.５×１０⁴に調節したGBS C388/90(Ia/c)懸濁液含有１mLトッド−ヒューイット培養培地で腹腔内攻撃⁴ ２.１×１０⁴に調節したGBS C388/90(Ia/c)懸濁液含有１mLトッド−ヒューイット培養培地で腹腔内攻撃⁵ 実施せず⁶ ２.１×１０⁴に調節したGBS NCS246(II/R)懸濁液含有１mLトッド−ヒューイ
ット培養培地で腹腔内攻撃。

【００６３】他の実験において、コントロールグループに対応する１２匹のマウスにPBSを注射し、一方１２匹のマウスの第２グループをGBS株C388/90(Ia/c)のホルムアル
デヒド死滅全細胞で免疫化した。これらの２つのグループの各々由来の６匹のマ
ウスを、GBS株C388/90(Ia/c)の２.１×１０⁶cfuで攻撃した(表Ｉ)。最初の攻撃実験において、GBS株C388/90(Ia/c)で免疫化した全マウスは同種攻撃で生存した
。PBSを注射した６匹のマウスのうち２匹のみが感染から生存した。

【００６４】両方の群の残りの６匹のマウスを次いで１週間後に使用して、この抗原性調製
物が、血清学的に異なるカプセルを産生する株HCS246(II/R)に対する交差防御を
付与するかを確かめた。この第２GBS株で感染したマウスで生存したものはなかった。後者の結果は、ホルムアルデヒド死滅株C388/90により誘導された保護的免疫応答のほとんどが本カプセル状ポリサッカライドに対するものであり、特定
の抗原型の株に限定されることを示す。これらの結果は、感染の特定のモデルが
、ワクチン化により付与される保護の実験に効率的に使用できることを示す。

【００６５】実施例３ホルムアルデヒド死滅全GBS細胞でのウサギの免疫化およびマウスの受動的保護ニュージーランドウサギ(２.５kg、Charles River, St-Constant, Quebec, Ca
nada)を、GBS株C388/90(Ia/c)のホルムアルデヒド死滅細胞で免疫化し、高度免疫血清を得た。このウサギに３回、３週間間隔で、約１.５×１０⁹cfuのGBS株C3
88/90(Ia/c)のホルムアルデヒド死滅全細胞を注射した。フロインド完全アジュバント(Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, New York)を最初の免疫化のアジュバントとして使用し、一方フロインド不完全アジュバント(Gibco BRL
)を続く２回の注射に使用した。血清サンプルを免疫化プロトコールの開始前および最後の注射２週間後に得た。血清を−２０℃で凍結させた。

【００６６】この特定のウサギ高度免疫血清の、GBS致死感染に対する受動保護の能力をまた評価した。マウスへの１５または２５μLの高度免疫ウサギ血清の攻撃１８時間前の腹腔注射は、感染に対し５匹中４匹(８０％)のマウスを攻撃から保護した
。比較して、PBSまたは髄膜炎菌外膜調製物で免疫化したウサギ由来の血清を注射したマウスで、２０％以下の生存率が記録された。この結果は、他の動物種の
死滅GBS細胞での免疫化が、マウスを受動的に保護できる抗体の産生を誘導できることを明らかに示す。この試薬はまたクローンの特徴づけにも使用する。

【００６７】

【表２】 ¹ フロインド完全アジュバントを最初の免疫化に、フロインド不完全アジュバントを続く２回の注射に使用した；² ２.１×１０⁴cfuに調節したGBS NCS246(II/R)懸濁液含有１mLトッド−ヒューイット培養培地で腹腔内攻撃。

【００６８】実施例４ Hisタグ−GBS融合タンパク質の組換え製造 GBS株C388/90(Ia/c)のゲノムDNA由来のGBS遺伝子のコード領域を、制限部位Bg
lIII(AGATCT)およびHindIII(AAGCTT)のおのおの制限部位の付加のために伸ばされた塩基を含むオリゴを使用して、ＰCR(DNA Thermal Cyclar GeneAmp PCRシステム Perkin Elmer, Sna Jose, CA)で増幅した。PCR生産物をアガロースゲルか
ら、Qiagen(Chatsworth, CA)からのQiaex IIゲル抽出キットを使用して精製し、
制限酵素BglIIおよびHindIII(Pharmacia Canada Inc Baie d'Urge, Canada)で消
化させ、フェノール：クロロホルムで抽出してエタノール沈殿した。チオレドキ
シン−Hisタグ配列を有するpET-32b(+)ベクター(Novagen, Madison, WI)を制限酵素BglIIおよびHindIIIで消化させ、フェノール：クロロホルムで抽出し、次い
でエタノール沈殿した。BglII-HindIIIゲノムDNAフラグメントをBglII−HindIII
pET-32b(+)ベクターにライゲートし、チオレドキシン−Hisタグ−GBS融合タンパク質を製造し、その遺伝子はT7プロモーターの制御下にあった。ライゲートし
た生産物をE. coli株XLI Blue MRF'(Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 end
A1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F'proAB lacI^qZΔM15Tn10(Tet^r)]^c)(
Stratagene, La Jolla, CA)に、Simanis(Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M.
Glover (ed.), pp. 109-135)の方法に従って形質転換した。組換えpETプラスミ
ドをQiagenキット(Qiagen, Chatsworth, CA)を使用して精製し、DNA挿入物のヌクレオチド配列をDNA配列決定(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing ki
t, ABI,, Foster City, CA)にりより確認した。組換えpETプラスミドを電気穿孔
(Gene Pulser II装置, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada)により、E. coli株
AD494(DE3)(Δara^-leu7697Δlacx74 ΔphoA PvuII phoR ΔmalF3 F'[lac⁺(lacI^q )pro]trxB::Kan(DE3))(Novagen, Madison, WI)に形質転換した。E. coliのこの株において、融合タンパク質のT7プロモーター制御発現がT7 RNAポリメラーゼ( λDEプロファージに存在)により特異的に認識され、その遺伝子はイソプロピル −β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド(IPTG)により誘導可能なlacプロモーターの制御下である。

【００６９】形質転換体AD494(DE3)/rpETを３７℃で、１mL当たり１００μgアンピシリン(S
igma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada)含有LBブロス(ペプトン１０ｇ／
Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、NaCl １０ｇ／Ｌ)中２５０rpmで撹拌しながら、Ａ₆₀ ₀ が０.６の値に近づくまで生育させた。チオレドキシン−Hisタグ−GBS融合タン
パク質の製造の誘導のために、細胞を更に２時間、最終濃度１mMのIPTG存在下で
インキュベートした。細菌細胞を遠心により回収した。

【００７０】２時間、IPTG誘導によりAD494(DE3)/rpET32により産生された組換え誘導タンパク質は、不溶性体として部分的に得られ、それを内因性E. coliタンパク質から不溶性凝集体の単離により精製した(Gerlach, G.F. et al. 1992, Infect. Im
mun. 60:892)。５００mL培養から誘導された細胞を２０mLの２５％スクロース−
５０mMトリス−HCl緩衝液(pH８.０)に再懸濁し、−７０℃で凍結させた。融解懸
濁液中の細胞溶解を５mLの２５０mMトリス−HCl緩衝液(pH８.０)中のリソザイム
(１０mg／mL)の添加、続く１０から１５分の氷上でのインキュベーション、およ
び15mLの界面活性剤混合物(５部の２０mMトリス−HCl緩衝系[pH７.４]−３００m
M NaCl−２％デオキシコール酸−２％ Nonidet P-40および４部の１００mMトリス−HCl緩衝液[pH８]−５０mM EDTA−２％Triton X-100)の添加、続く５分の
氷上でのインキュベーションにより達成した。超音波処理の後、タンパク質凝集
物を３０分、３５,０００×ｇで遠心することにより回収し、可溶性細胞性フラクションのサンプルを保有した。凝集タンパク質を６Ｍグアニジン塩酸塩中に可
溶化した。可溶性および不溶性フラクションの両方への融合タンパク質の存在を
、ウェスタンブロット分析により、GBS株C388/90(Ia/c)のホルムアルデヒド死滅
細胞を注射された対応するGBSの攻撃で生存したマウスの血清を使用して示した。

【００７１】 IPTG−誘導AD494(DE3)/rpETの可溶性フラクション由来の融合タンパク質の精製を、His結合金属キレート化樹脂(Novagen, Madison, WI)に固定化した２価カチオン(Ni²⁺)に結合するHisタグ配列の脂質に基づいた親和性クロマトグラフィーにより行った。使用した精製法は、pETシステムマニュアル、第６版Novagen,
Madison, WI)に記載のものである。簡単に、IPTGで誘導した１００mL培養から得
たペレット化細胞を４mLの結合緩衝液(５mMイミダゾール−５００mM NaCl−２０mM トリス−HCl pH７.９)に再懸濁し、超音波処理し、３９,０００×ｇで２
０分回転させて残骸を除去した。上清を濾過し(０.４５μmポアサイズ膜)、結合
緩衝液で平衡化したHis結合樹脂のカラムに沈着させた。次いで、カラムを１０カラム容量の結合緩衝液、続いて６カラム容量の洗浄緩衝液(２０mMイミダゾール−５００mM NaCl−２０mMトリス−HCl、pH７.９)で洗浄した。チオレドキシン−Hisタグ−GBS融合タンパク質は、溶出緩衝液(１Ｍイミダゾール−５００mM NaCl−２０mMトリス−HCl pH７.９)で溶出した。サンプルからの塩およびイミダゾールの除去は、３×１リットルPBSに対する４℃での透析により行った。

【００７２】 E. coliの可溶性または不溶性のいずれかの細胞質フラクションから得た融合タンパク質の量を、これらのタンパク質の連続希釈およびウシ血清アルブミン標
準(Pierce Chemical Co. Rockford, Ill)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリ
アクリルアミドゲルのクーマシー染色により概算した。

【００７３】実施例５ラムダP_Lプロモーター制御下のGBSタンパク質の組換え産生 GBSのDNAコード領域を、翻訳ベクターpURV22のプロモーターλP_Lの下流に挿入
した。本プラスミドは、Ｉ型単純ヘルペス(HSV-I)糖タンパク質(gD-1)が除去され、アンピシリン耐性遺伝子がプラスミドベクターpUC4K(Pharmacia Biotech Ca
nada Inc., Baie D'Urfe, Canada)から得られたカナマイシンカセットで置き換えられたp629(George et al, 1987, Bio/Technology 5:600)由来であった。ベク
ターは、機能的P_Rプロモーターが欠失しているバクテリオファージλcI85温度感
受性リプレッサー遺伝子のカセットを含んだ。cI857リプレッサーの３０−３７ ℃から３７−４２℃への温度上昇による不活性化は、λP_L制御下の遺伝子の誘導
をもたらした。遺伝子の翻訳は、下流がbGlII制限部位(AGATCT)およびATG:ACTAA
GGAGGTTAGATCTATGに続くリボソーム結合部位により制御された。

【００７４】制限酵素およびT4 DNAリガーゼを供給者(Pharmacia Biotech Canada Inc., Ba
ie D'Urfe, Canada; およびNew England Biolabs Ltd., Mississauga, Canada) に従って使用した。DNAフラグメントのアガロースゲル電気泳動をSambrook et a
l. (Molecular cloning: A laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, N.Y.)に記載のように行った。GBS細菌の染色体DNAをJayarao et
al (J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2774)に記載の方法のように製造した。ポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNA増幅反応は、DNA Thermal Cycler GeneAmp P
CRシステム2400(Perkin Elmer, San Jose, CA)を使用して行った。DNA配列決定に使用したプラスミドはQiagen(Chatsworth, CA)由来のプラスミドキッドを使用
して精製した。DNAフラグメントは、Qiagen(Chatsworth, CA)由来のQiaex IIゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製した。プラスミド形質転換は、
Hanahan(DNA Cloning, Glover(ed.) pp, 109-135, 1985)に記載の方法により行った。プラスミド中のゲノムDNA挿入物の配列決定は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーモデル３９４(Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div. (ABI)
, Foster City, CA)で合成した合成オリゴヌクレオチドを使用して行った。配列
決定反応は、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencingキット(ABI, Foster
City, CA)を使用したPCRにより行い、DNA電気泳動は、自動DNAシークエンサー37
3A(ABI, Foster City, CA)を使用して行った。DNA配列およびその推定されるポリペプチドの分析は、プログラムGene Worksバージョン２.４５(Intelligenetic
s, Inc., Mountain View CA)で行った。

【００７５】 GBS遺伝子のコード領域は、制限部位BglII(AGATCT)およびXbaI(TCTAGA)のため
に各々伸ばされた塩基を含むオリゴを使用したGBS株C388/90(Ia/c)ゲノムDNA由来のPCRにより増幅した。PCR生産物を、Qiagen(Chatsworth, CA)由来のQiaex II
ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製し、制限酵素BglIIおよびXba
Iで消化し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿した。pURV22 ベクターを制限酵素BglIIおよびXbaIで消化し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿した。BglII−XbaIゲノムDNAフラグメントをBglII-XbaI p
URV22ベクターにライゲートし、その中でGBS遺伝子はλP_Lプロモーターの制御下
であった。ライゲートした生産物をE. coli株XLI Blue MRF'(Δ(mcrA)183Δ(mcr
CB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F' proAB lac
1^qZΔM15 Tn10(Tet^r)]^c](Stratagene, La Jolla CA)に、Hanahan, 前掲に記載の
方法に従って形質転換した。プラスミド挿入物を担持する形質転換体を、アガロ
ース電気泳動(Sambrook et al., 前掲)に従った溶解細胞の分析により同定した。組換えpURV22プラスミドをQiagenキット(Qiagen, Chatsworth, CA)に従って精
製し、DNA挿入物のヌクレオチド配列を、DNA配列決定により確認した。

【００７６】形質転換体XL1 Blue MRF'/rpURV22を３４℃で、２５０rpmで撹拌しながら、１
mL当たり５０μgカナマイシン含有LBブロス中で、Ａ₆₀₀が０.６の値に到達するまで生育させた。融合タンパク質の産生を誘導するために、細胞を更に４時間３
９℃でインキュベートした。細菌細胞を遠心により回収し、サンプル緩衝液に再
懸濁し、１０分沸騰させ、−２０℃に保った。

【００７７】実施例６ CMVプラスミドpCMV-GH中のGBSタンパク質遺伝子のサブクローニング GBSタンパク質のDNAコード領域を、プラスミドベクターpCMV-GH(Tang et al,
Nature, 1992, 356:152)中のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの転写的制御下にあるヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子の下流に相で挿入した。CMVプロモー
ターはE. coli細胞内で非機能性であるが、真核細胞内のプラスミドの投与により活性となる。ベクターはまたアンピシリン耐性遺伝子も含む。

【００７８】遺伝子のコード領域は、制限部位BglII(AGATCT)およびHindIII(AAGCTTT)のために各々伸ばされた塩基を含むオリゴを使用したGBS株C388/90(Ia/c)のゲノムDN
AからのPCRにより増幅した。PCR生産物を、Qiagen(Chatsworth, CA)由来のQiaex
IIゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製し、制限酵素BglIIおよび
HindIIIで消化し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿した。誘導タンパク質を創造するためにヒト成長ホルモン含有pCMV-GHベクター(Labora
tory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The Univers
ity of Texas, Dallas, Texas)を制限酵素BamHIおよびHindIIIで消化し、フェノ
ール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿した。１.３kb BglII−HindIII ゲノムDNAフラグメントをBamHI-HindIII pCMV-GHベクターにライゲートし、CMV プロモーターの制御下にhGH-GBS誘導タンパク質を創造した。ライゲート生産物をE. coli株DH5α[Ф80 lacZ ΔM15 endA1 recA1 hsdR17 (^rK^-mK⁺) supE44 thi-
1λ^- gyrA96 relA1 Δ(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL, Gaithersburg, MD)に、H
anahan、前掲の方法に従って形質転換した。挿入物を有するプラスミドを担持す
る形質転換体は、アガロースゲルでの電気泳動により提供された融解細胞の分析
により同定した(Sambrook, J. et al, 前掲)。組換えpCMVプラスミドをQiagenキ
ット(Qiagen, Chatsworth, CA)を使用して精製し、DNA挿入物のヌクレオチド配列をDNA配列決定により確認した。

【００７９】実施例７ GBSタンパク質のGBS攻撃に対する免疫学的活性６から８週齢の１２匹の雌CD-1マウス(Charles River, St-Constant, Quebec,
Canada)の４つの群に、３回、３週間間隔で０.１mLの以下の抗原調製物を皮下注射した：GBS株C388/90のホルムアルデヒド死滅細胞(〜６×１０⁷cfu)、不溶性
(封入体)から得た２０μgのチオレドキシン−Hisタグ−GBS融合タンパク質、またはE. coli内の可溶性細胞質フラクション由来の親和性精製(ニッケルカラム) した２０μgの融合タンパク質、または２０μｇの親和性精製(ニッケルカラム) チオレドキシン−Hisタグコントロールポリペプチド。２０μgのQuilA(登録商標
)(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)をアジュバントとして各抗原性調製物に添加した。血清サンプルを各マウスから、免疫化前(PB)ならびに免疫
化プロトコール中の２０日目(TB1)、４１日目(TB2)および５４日目(TB3)に得た。血清を−２０℃で凍結させた。

【００８０】 ELISA力価の増加を、融合タンパク質の各注射後に記録し、各第２回および第３回投与後に特異的な体液性免疫応答の良好な初期応答および追加免疫が示され
た。免疫化期間の最後に、相互的ELISA力価は、E. coli内の可溶性フラクション
から得たタンパク質で免疫化したマウスの群の２９０,１３３と比較して、封入体から得た２０μgの融合タンパク質に関して４５６,１４５であった。後者の結
果は、封入体から得たタンパク質が、可溶性タンパク質よりも免疫原性であるこ
とを示す。プレートをコートするために親和性精製チオレドキシン−Hisタグを使用したELISAにおけるマウス血清の分析は、無視できる抗体力価が、融合タンパク質のチオレドキシン−Hisタグ部分に対して産生されることを示した。組換え誘導タンパク質を注射したマウスからの血清の反応性をまたGBS株C388/90のホ
ルムアルデヒド死滅全細胞に対するELISAにより試験した。組換え誘導タンパク質での免疫化により誘導した抗体はまたGBS細胞上のその特異的エピトープを認識し、その立体配置が交差反応性抗体を誘導するために天然連鎖球菌タンパク質
と十分近いことを示す。

【００８１】免疫化により誘導された免疫応答が、GBS感染に対して保護するかを確認するために、マウスを３.５×１０⁵cfuのGBS株C338/90(Ia/c)および１.２×１０⁵cfu
の株NSC345(II/R)で攻撃し、その結果を表３および４に各々記載する。コントロ
ールチオレドキシン−Hisタグで免疫化したマウスは、いずれのGBS株の攻撃に対
しても保護されなかったが、ホルムアルデヒド死滅C388/90全細胞での免疫化は、同種攻撃に対してのみ保護を提供した。本発明のチオレドキシン−Hisタグ−G
BS誘導タンパク質は両方のGBS株の攻撃からマウスを保護した。これらのマウスの血液および脾臓培養はGBSの存在を示さなかった。

【００８２】

【表３】 ¹ ３.５×１０⁴cfuに調節した１mlトッド−ヒューイット培養培地の腹腔内投与
；² ２０μg投与；後足が生存マウスで麻痺；血液および脾臓でGBSが検出；³ ６×１０⁷cfu投与；⁴ ２０μg投与。

【００８３】

【表４】 ¹ １.２×１０⁵cfuに調節したGBS C388/90(Ia/c)懸濁液含有１mlトッド−ヒュ
ーイット培養培地の腹腔内投与；² ２２０μg投与；³ ６×１０⁷cfu投与；⁴ 免疫化中に１匹のマウス死亡。

【００８４】実施例８組換えGBSタンパク質での免疫化の実験的GBS感染に対する保護の提供本実施例は、配列番号３９に対応する組換えタンパク質による免疫化による、
胎児GBS感染に対するマウスの保護を説明する。

【００８５】１０匹の雌CD-1マウス(Charles River)を３回、３週間間隔で、配列番号４２に対応するGBS遺伝子を含む組換えpURV22プラスミドベクターを担持するE. coli
株BLR(Novagen)から精製した２０μgの組換えタンパク質で、２０μgのアジュバ
ントCedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下、またはコントロールとして、PBS中のQuilA(登録商標)単独で免疫化した。血液サンプルを各免疫
化の前１、２２および４３日、および３回目の注射に後１４日目(５７日目)に眼
窩の洞から採取した。１週間後、マウスを約１０⁴から１０⁶CFUの種々の毒性GBS
株で攻撃した。GBS攻撃接種のサンプルをTSA／５％ヒツジ血液寒天プレートにま
き、CFUを決定し、攻撃投与量を確認した。死亡を１４日間の期間および攻撃後１４日に記録し、生存マウスを殺して血液および脾臓をGBS生物の存在に関して試験した。生存データを表５に示す。

【００８６】攻撃前血清は、標準免疫アッセイによりGBSと反応性の抗体の存在について分析した。ELISAおよび免疫ブロット分析は、E. coli内で産生された組換えGBSでの免疫化が、組換えおよび天然GBSタンパク質の両方と反応性の抗体を誘発することを示した。GBSに応答する抗体を実施例９に記載する。

【００８７】

【表５】 ¹ グループ当たり１０匹のマウスのグループを使用し、感染により生存したマウスの数および死亡したマウスの数を示す。組換えGBSタンパク質−免疫化動物に対応する生存曲線を擬似感染動物に対応する生存曲線と、ノンパラメトリック
分析に関してログ−ランク試験を使用して比較。² NCS915-F-免疫化動物との比較分析；³ 動物を、QuilA(登録商標)アジュバント存在下、ホルムアルデヒド死滅GBSで免疫化した。

【００８８】生存マウスからの全ての血液培養(hemoculture)は、攻撃後１４日に陰性であった。生存マウスからの脾臓は、実験MB-11由来の数匹のマウス以外、陰性であった。

【００８９】実施例９組換えGBSタンパク質のワクチン接種はGBSに対する免疫応答を誘発す
る１０匹の雌CD-1マウスのグループを、実施例８の配列番号３９に対応する組換
えGBSタンパク質で免疫化した。天然GBSタンパク質に対する抗体応答を評価する
ために、免疫化前および３回目の免疫化１４日後に採取した血液サンプル由来の
血清を、タイプIII株NCS 954、タイプIB株ATCC12401、タイプＶ株NCS 535または
タイプVI株NCS 9842由来のホルムアルデヒド死滅GBS細胞でコートしたプレートを使用して、ELISAによりGBSと反応性の抗体に関して試験した。GBSタンパク質に対して惹起した抗体の特性を、GBS細胞抽出物および組換え抗原に対するウェスタンブロットにより確認した。図１０に示す結果は、３回目の免疫化後に採取
した血清に対して、コート抗原に依存して、１２０００から１２８０００の間で
変化する中間相互抗体力価を免疫原として使用した組換えGBSタンパク質と動物が強く応答することを明らかに示す。全ての前免疫血清は、１：１００の希釈で
試験したとき、陰性であった。GBS反応性抗体は、組換えGBSタンパク質の１回の
注射の後に各動物の血清で検出可能であった。

【００９０】実施例１０本発明のGBSタンパク質の抗原性保存本発明のGBSタンパク質に特異的なモノクローナル抗体(MAb)を使用して、この
表面抗原が全てのGBSにより産生され、また抗原性が非常に保存されていることを証明した。

【００９１】６８種のGBS単離体の収集物を使用して、GBS−特異的MAbの反応性を評価した。これらの株はNational Center for Streptococcus, Provincial Laboratory o
f Public Health for Northern Alberta, Canada; Centre Hospitalier Univers
itaire de Quebec, Pavillon CHUL; American Type Culture Collection, USA;
Laboratoire de Sante Publique de Quebec, Canada; およびDept. of Infectio
us Disease, Children's Hospital and Mdical Center, Seattle, USAから得た。全８種のMAbを以下のパネルの株に対して試験した；抗原型ＩａまたはIa/cの６種の単離体、抗原型Ｉｂの３種の単離体、抗原型IIの４種の単離体、抗原型II
Iの１４種の単離体、抗原型IVの２種の単離体、抗原型Ｖの２種の単離体、抗原型VIIVの２種の単離体、抗原型VIIIの１種の単離体、抗原型分離されていない１
０種の単離体および３種のウシS. agalactiae株。MAb 3A2をまた更なるGBSと反応させた：抗原型Ia/cの９種の単離体および抗原型Ｖの１０種の単離体。株を一
晩血液寒天プレートで、３７℃で５％ CO₂の雰囲気中で生育させた。培養物を −７０℃で２０％(v/v)グリセロール添加心臓浸出液ブロス中で貯蔵した。

【００９２】 GBSタンパク質特異的MAbを得るために、マウスを３回、３週間間隔で２０μg の精製組換えGBSタンパク質(配列番号４４)で、２０％QuilA(登録商標)アジュバ
ント存在下で免疫化した。ハイブリドーマ細胞を免疫化マウスから回収した脾臓
細胞と、非分泌性SP2/0ミエローマ細胞から、先に(Hamel, J. et al. 1987. J.
Med. Microbiol. 23:163-170)記載のように産生した。ハイブリッドクローン上清を、先に(Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23:163-170)記載のよ
うにELISAにより、ホルムアルデヒド不活性化GBSおよび精製組換えGBSタンパク質(配列番号３９または４４)をコート抗原として使用して特異的抗体産生に関し
て試験した。特異的ハイブリッドの限定希釈、拡大、および液体窒素中での凍結
によりクローン化した。組換えGBSタンパク質の産生は、実施例４および５に記載した。精製組換えGBSタンパク質またはホルムアルデヒド不活性化GBSを、電気
泳動により、Laemmliの不連続緩衝系を製造者が推奨のように使用して解析し、次いで先に(Martin et al. 1992. Infect. Immum. 60:2718-2725)記載のようにウェスタン免疫ブロッティングのためにニトロセルロース膜に移した。

【００９３】ウェスタン免疫ブロッティング実験は、明らかに、全８種のMAbが精製組換えG
BSタンパク質(配列番号３９)に対応するタンパク質バンドを認識することを示し
た。これらのMAbはまたこれまで試験した全てのGBS単離体に存在するタンパク質
バンドと反応した。これらのGBS−特異的MAbの反応性は表６に示す。各MAbは全４６種のGBSと良好に反応した。加えて、これらのMAbはまた試験したウシ起源の
３種のS. agalactiae株を認識した。Mab 3A2はまた１９種のGBS；抗原型Ia/cの９種のおよび抗原型Ｖの１０種の単離体を認識した。他のMAbはこれらの付加的株に対して試験しなかった。

【００９４】これらの結果は、GBSタンパク質(配列番号３９)がこれまで試験した全６５種のGBSおよびウシ起源の３種のS. agalactiae株の全てにより産生されることを証
明した。より重要なことに、これらの結果は、これらの８種のGBS−特異的MAbに
より認識されるエピトープは、広範囲に分布し、GBS間で保存的であることを証明した。これらの結果はまたこれらのエピトープが、主要な疾病の原因グループ
を含む全ての既知のGBS抗原型の代表を試験したため、血清学的に関連する単離体に限定されないことを示した。

【００９５】結論として、本実験で示されるデータは、本発明のGBSタンパク質が全GBSによ
り産生され、抗原的に非常に保存的であることを明らかに証明した。

【００９６】

【表６】

【００９７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】クローン１(配列番号１)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図１ｂ】配列番号２のアミノ酸配列。

【図１ｃ】配列番号３のアミノ酸配列。

【図１ｄ】配列番号４のアミノ酸配列。

【図１ｅ】配列番号５のアミノ酸配列。

【図１ｆ】配列番号６のアミノ酸配列。

【図２ａ】クローン２(配列番号７)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図２ｂ】配列番号８のアミノ酸配列。

【図２ｃ】配列番号９のアミノ酸配列。

【図２ｄ】配列番号１０のアミノ酸配列。

【図２ｅ】配列番号１１のアミノ酸配列。

【図２ｆ】配列番号１２のアミノ酸配列。

【図３ａ】クローン３(配列番号１３)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図３ｂ】配列番号１４のアミノ酸配列。

【図３ｃ】配列番号１５のアミノ酸配列。

【図３ｄ】配列番号１６のアミノ酸配列。

【図３ｅ】配列番号１７のアミノ酸配列。

【図３ｆ】配列番号１８のアミノ酸配列。

【図３ｇ】配列番号１９のアミノ酸配列。

【図３ｈ】配列番号２０のアミノ酸配列。

【図３ｉ】配列番号２１のアミノ酸配列。

【図４ａ】クローン４(配列番号２２)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図４ｂ】配列番号２３のアミノ酸配列。

【図４ｃ】配列番号２４のアミノ酸配列。

【図４ｄ】配列番号２５のアミノ酸配列。

【図４ｅ】配列番号２６のアミノ酸配列。

【図５ａ】クローン５(配列番号２７)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図５ｂ】配列番号２８のアミノ酸配列。

【図５ｃ】配列番号２９のアミノ酸配列。

【図５ｄ】配列番号３０のアミノ酸配列。

【図５ｅ】配列番号３１のアミノ酸配列。

【図６ａ】クローン６(配列番号３２)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図６ｂ】配列番号３３のアミノ酸配列。

【図６ｃ】配列番号３４のアミノ酸配列。

【図６ｄ】配列番号３５のアミノ酸配列。

【図６ｅ】配列番号３６のアミノ酸配列。

【図７ａ】クローン７(配列番号３７)のDNA配列とオープンリーディングフレームに関して対応するアミノ酸配列。

【図７ｂ】配列番号３８のアミノ酸配列。

【図７ｃ】配列番号３９のアミノ酸配列。

【図７ｄ】配列番号４０のアミノ酸配列。

【図７ｅ】配列番号４１のアミノ酸配列。

【図８】シグナル配列を有するクローン７の一部のDNA配列(配列番号４２) 。

【図９】シグナル配列なしのクローン７の一部のDNA配列(配列番号４３)。

【図９ａ】アミノ酸配列(配列番号４４)。

【図１０】配列番号３９に対応する組換えGBSタンパク質で免疫化したCD-1 マウスの血清の抗−GBS ELISA力価の分布を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年５月１１日（２０００．５．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クレマン・リュウカナダ、ジー１ワイ・２エックス１、ケベック、ヴィル・ドゥ・カップ・ルージュ、ジャン−シャルル・カンタン1012番 (72)発明者マルティーヌ・ボワイエカナダ、ジー１イー・７ジー１、ケベック、ボポール、デ・ムエット25番、アパルトマン204 (72)発明者イザベル・シャルルボワカナダ、ジー７エイ・２エル５、ケベック、サン−ニコラ、ミラベル410番 (72)発明者ジョゼ・ハメルカナダ、ジー１ティ・１エヌ６、ケベック、シレリ、リュ・マリテン2401番 (72)発明者デニ・マルタンカナダ、ジー３エイ・１イー９、ケベック、サン−オーギュスタン−ドゥ−デスモーレ、リュ・ガブリ4728−ジェ番Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 4B065 AA26X AB01 BA02 CA24 CA25 CA45 4C085 AA13 BA14 CC07 DD61 4H045 AA11 BA10 BA41 CA11 DA86 EA29 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配
列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列
番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番
号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号
３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４またはそ
のフラグメント、アナログまたは誘導体からなる群から選択される配列を有する
第２のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコード
する単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】該ポリヌクレオチドが、第２のポリペプチドと少なくとも９
５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載のポリヌクレオ
チド。
【請求項３】配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配
列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列
番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番
号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号
３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４またはそ
のフラグメント、アナログまたは誘導体からなる群から選択される配列を有する
ポリペプチドに結合特性を有する抗体を産生できるポリペプチドをコードする単
離ポリヌクレオチド。
【請求項４】請求項１のポリヌクレオチドに相補的である、単離ポリヌク
レオチド。
【請求項５】請求項３のポリヌクレオチドに相補的である、単離ポリヌク
レオチド。
【請求項６】該ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】該ポリヌクレオチドがDNAである、請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】該ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】該ポリヌクレオチドがRNAである、請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】配列番号１、配列番号７、配列番号１３、配列番号２２、
配列番号２７、配列番号３２、配列番号３７、配列番号４２および配列番号４３
またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体からなる群から選択される配列
を有する第２のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド。
【請求項１１】配列番号３７、配列番号４２および配列番号４３からなる
群から選択される配列を有する第２のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１２】配列番号３７を有する第２のポリヌクレオチドと、ストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１１記載のポリヌクレオチド
。
【請求項１３】配列番号４２を有する第２のポリヌクレオチドと、ストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１１記載のポリヌクレオチド
。
【請求項１４】配列番号４３を有する第２のポリヌクレオチドと、ストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１１記載のポリヌクレオチド
。
【請求項１５】該ポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドに少なく
とも９５％の相補性を有する、請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】該ポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドに少なく
とも９５％の相補性を有する、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】請求項１記載のポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオ
チドが発現制御領域に操作可能に結合している、ベクター。
【請求項１８】請求項３記載のポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオ
チドが発現制御領域に操作可能に結合している、ベクター。
【請求項１９】請求項１７記載のベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞。
【請求項２０】請求項１８記載のベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞。
【請求項２１】請求項１９記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に適
当な条件下で培養することを含む、ポリペプチドの産生法。
【請求項２２】請求項２０記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に適
当な条件下で培養することを含む、ポリペプチドの産生法。
【請求項２３】配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配
列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列
番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番
号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４または
そのフラグメント、アナログまたは誘導体からなる群から選択される配列を有す
る第２のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有する単離ポリペプチド。
【請求項２４】配列番号３９記載の配列を有する、請求項２３記載の単離
ポリペプチド。
【請求項２５】配列番号４４記載の配列を有する、請求項２３記載の単離
ポリペプチド。
【請求項２６】配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配
列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列
番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番
号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４４または
そのフラグメント、アナログまたは誘導体からなる群から選択される配列を有す
るポリペプチドに結合特性を有する抗体を産生できる単離ポリペプチド。
【請求項２７】配列番号３９記載の配列を有する、請求項２６記載の単離
ポリペプチド。
【請求項２８】配列番号４４記載の配列を有する、請求項２６記載の単離
ポリペプチド。
【請求項２９】配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配
列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列
番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番
号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１またはそのフラグメン
ト、アナログまたは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離
ポリペプチド。
【請求項３０】配列番号３９記載の配列を有する、請求項２９記載の単離
ポリペプチド。
【請求項３１】配列番号４４記載の配列を有する、単離ポリペプチド。
【請求項３２】Ｎ−末端Met残基が除かれている、請求項２９から３１のいずれかにキシアの単離ポリペプチド。
【請求項３３】分泌性アミノ酸配列が除かれている、請求項２９から３０
のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項３４】請求項２３から３１のいずれかに記載のポリペプチドと薬
学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３５】請求項３２に記載のポリペプチドと薬学的に許容される担
体、希釈剤またはアジュバントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３６】請求項３３に記載のポリペプチドと薬学的に許容される担
体、希釈剤またはアジュバントを含む、ワクチン組成物。
【請求項３７】動物に治療または予防量の請求項３４記載の組成物を投与
することを含む、連鎖球菌感染に罹病性である動物の連鎖球菌細菌感染の治療的
または予防的処置法。
【請求項３８】動物に治療または予防量の請求項３５記載の組成物を投与
することを含む、連鎖球菌感染に罹病性である動物の連鎖球菌細菌感染の治療的
または予防的処置法。
【請求項３９】動物に治療または予防量の請求項３６記載の組成物を投与
することを含む、連鎖球菌感染に罹病性である動物の連鎖球菌細菌感染の治療的
または予防的処置法。
【請求項４０】動物がウシである、請求項３７から３９のいずれかに記載
の方法。
【請求項４１】動物がヒトである、請求項３７から３９のいずれかに記載
の方法。
【請求項４２】該細菌感染がグループＡ連鎖球菌およびグループＢ連鎖球
菌からなる群から選択される、請求項３７から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】該細菌感染がグループＢ連鎖球菌である、請求項４２記載
の方法。
【請求項４４】動物に治療または予防量の組成物を投与することを含む、
連鎖球菌感染に罹病性であるまたは感染している動物の連鎖球菌細菌感染の治療
的または予防的処置法における請求項３４記載のワクチン組成物の使用。
【請求項４５】動物に治療または予防量の組成物を投与することを含む、
連鎖球菌感染に罹病性であるまたは感染している動物の連鎖球菌細菌感染の治療
的または予防的処置法における請求項３５または３６のいずれかに記載のワクチ
ン組成物の使用。
【請求項４６】動物に治療または予防量の組成物を投与することを含む、
連鎖球菌感染に罹病性であるまたは感染している動物の連鎖球菌細菌感染の治療
的または予防的処置法における請求項２３から３１のいずれかに記載のワクチン
組成物の使用。
【請求項４７】動物に治療または予防量の組成物を投与することを含む、
連鎖球菌感染に罹病性である動物の連鎖球菌細菌感染の治療的または予防的処置
用ワクチンの製造のための請求項３２記載のワクチン組成物の使用。
【請求項４８】動物に治療または予防量の組成物を投与することを含む、
連鎖球菌感染に罹病性である動物の連鎖球菌細菌感染の治療的または予防的処置
用ワクチンの製造のための請求項３３記載のワクチン組成物の使用。