HU217582B - Streptococcus B csoportba tartozó törzsek elleni immunitást biztosító, Rib fehérjenevű felületi protein, eljárás a protein tisztítására, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény - Google Patents
Streptococcus B csoportba tartozó törzsek elleni immunitást biztosító, Rib fehérjenevű felületi protein, eljárás a protein tisztítására, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény Download PDFInfo
- Publication number
- HU217582B HU217582B HU9501993A HU9501993A HU217582B HU 217582 B HU217582 B HU 217582B HU 9501993 A HU9501993 A HU 9501993A HU 9501993 A HU9501993 A HU 9501993A HU 217582 B HU217582 B HU 217582B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- rib
- strains
- multiplet
- variant
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 214
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 213
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 title claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims abstract 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 claims description 5
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 33
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 29
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 7
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037129 Newborn Diseases Infant Diseases 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MXVMRHIWTSFDPU-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1Cl MXVMRHIWTSFDPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000020241 Neonatal disease Diseases 0.000 description 2
- 206010061308 Neonatal infection Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- FGGKGJHCVMYGCD-UKJIMTQDSA-N Glu-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FGGKGJHCVMYGCD-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100022374 Homeobox protein DLX-4 Human genes 0.000 description 1
- 101000901614 Homo sapiens Homeobox protein DLX-4 Proteins 0.000 description 1
- ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N Ile-Ser-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)O)N ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Ser amino acid Chemical class 0.000 description 1
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- RERHJVNYJKZHLJ-UHFFFAOYSA-N bis(2-hydroxyethyl)azanium;2-(3,5-diiodo-4-oxopyridin-1-yl)acetate Chemical compound OCCNCCO.OC(=O)CN1C=C(I)C(=O)C(I)=C1 RERHJVNYJKZHLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Abstract
A találmány tárgya tisztítőtt Rib fehérje, valamint ennek természeteseredetű vagy mesterséges módősítőtt váltőzatai, szűbfragmensei ésműltiplettjei, amelynek jellemző vőnása, hőgy a fehérje a)előállítható B csőpőrtba tartőzó Streptőcőccűs törzsekből, előnyösen aIII szerőtípűsba tartőzó törzsekből; b) a tripszin és pepszin általőkőzőtt bőmlásnak viszőnylag ellenáll; c) 1. számú szekvenciánakmegfelelő N-terminális aminősavszekvenciával vagy ezzel legalább 90%-ban hőmőlóg szekvenciával rendelkezik; és d) védőhatású imműnitástbiztősít a fehérjét kifejező B csőpőrtba tartőzó Streptőcőccűs törzsekellen. A találmány kiterjed a fenti fehérje előállítására, errespecifikűs antitestekre, az antitestek és a fehérje detektálásáraalkalmas reagenskészletre, a fehérjét kódőló DNS-szekvenciáttartalmazó vektőrra, a megfelelő lambda-fágőkra, DNS-szekvenciára és afehérjét tartalmazó gyógyszerkészítményre és vakcinára. ŕ
Description
A találmány tárgya új Rib jelű fehéije (valamint ennek szubffagmense, változata és multiplettje), amely immunitást biztosít a legtöbb B csoportba tartozó Streptococcus törzs ellen. A találmány tárgya továbbá eljárás a fehérje tisztítására, a fehérjére specifikus antitest, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény, amely a fehérjét vagy annak fragmensét tartalmazza.
Az elmúlt három évtizedben a B csoportba tartozó Streptococcus törzsek az újszülöttkori betegségeket okozó legfontosabb mikroorganzimusok közé léptek elő. Csak az Egyesült Államokban évente mintegy 10 000 betegséget okoz ez a baktérium. A fertőzés mintegy 20%-ban halálos, és a legtöbb túlélő csecsemőben permanens neurológiai következmények maradnak vissza. Ezek alapján szükség van olyan eljárás kidolgozására, amely lehetővé teszi a B csoportba tartozó Streptococcusok által okozott fertőzés megelőzését, kezelését és mechanizmusának analizálását.
A nők mintegy 20%-a vaginálisan hordozza a B csoportba tartozó Streptococcusokat, és a baktérium által okozott újszülöttkori fertőzés fő oka feltehetően az anyai nemi szervekből kiinduló függőleges transzmisszió. Azonban a születéskor B csoportba tartozó Streptococcus törzseket hordozó csecsemőknek csak l-2%ánál jelentkezik súlyos fertőzés. Az újszülöttkori betegség kifejlődéséhez tehát más olyan faktorok is közrejátszanak, amelyek a születés közben érik a baktériumokat. A fertőzött csecsemők mamája lényegesen alacsonyabb mennyiségben tartalmazza a III típusú kapszulára vonatkozó antitesteket, ami arra utal, hogy ezek az antitestek fontos szerepet töltenek be az újszülöttkori betegség elleni védelemben [Baker C. J. és Kasper D. L.: N. Engl. J. Med. 294, 753 (1976)].
A B csoportba tartozó Streptococcus törzsek négy fő szerotípusba (la, lb, II és III szerotípus) sorolhatók a poliszacharid kapszula szerkezete alapján [Baker: J. Inf. Dis. 161, 917 (1990)]. A I, II és III szerotípusok durván azonos arányban jelennek meg a törzsek normál flórájában, de a III típus mintegy kétharmad arányban van jelen a fertőzés során izolált mintákban. Mivel a kapszula egy ismert virulens faktor, megfelelő részletességben tanulmányozták, főleg a III típusba tartozó törzseknél. Igyekeztek olyan vakcinát kifejlesztem, amelyben a III típusú poliszacharid kapszula lényeges komponenst képez. A poliszacharid kapszula vakcinaként történő alkalmazása azonban a humán szövetekkel képzett keresztreakciók miatt problémákkal járhat [Pritchard és munkatársai: Infect. Immun. 60, 1598 (1992)]. Szükség van ezért olyan vakcina kidolgozására, amely a poliszacharidtól eltérő fehérjéken alapszik.
A B csoportba tartozó Streptococcusok emellett szarvasmarháknál tőgygyulladást okoznak, ami jelentős gazdasági következményekkel járhat. A B csoportba tartozó Streptococcus fertőzések elleni vakcina kidolgozása ezért az állatgyógyászatban is nagy jelentőségű.
A B csoportba tartozó Streptococcusoknál korábban két sejtfelületi fehérjét tanulmányoztak közelebbről : az alfa- és a béta-fehérjét. Ezek a fehérjék védőhatású immunitást biztosítanak a fehérjéket kifejező törzsekkel szemben, de kevésbé fontosak a B csoportba tartozó Streptococcusok által okozott betegségeknél, mivel a III típusba tartozó törzsek, amelyek a súlyos fertőzések fő kórokozói, általában nem fejezik ki.
A találmány egy Streptococcus sejtfelületi fehérjére, ennek változataira és szubfragmenseire vonatkozik. Ezt a fehérjét, amelynek jele Rib fehérje, III szerotípusba tartozó B csoportbeli Streptococcus törzsekből izoláltuk egy különálló 95 kD fehérje formájában. Az Rib fehérjét a legtöbb III szerotípusú B csoportbeli Streptococcus törzs kifejezi, és ezenkívül néhány más szerotípusba, így a II szerotípusba tartozó törzs is. Kidolgoztunk egy eljárást az Rib fehérje tisztítására, és kimutattuk, hogy a fehérjére vonatkozó antitestek védelmet biztosítanak az Rib fehérjét kifejező törzsek által okozott halálos fertőzéssel szemben.
A találmány kiterjed a természetes eredetű és mesterséges módosított változatokra, szubfragmensekre és multiplettekre, amelyek képesek az Rib fehérjét kifejező baktériumok, elsősorban a III szerotípusba tartozó B csoportbeli Streptococcus törzsek által okozott fertőzések elleni védelemre.
A találmány tárgya továbbá vektor, így plazmid, kozmid vagy fág, amely tartalmazza az Rib fehérje, ennek változata, szubfragmense vagy fragmense genetikai kódját, nem humán gazdaszervezetbe inszertálható, és az adott szervezetben kifejezhető. Ezekre példaként említhető három fág klón, az Rib 1-3 lambda-fág, amelynek deponálási száma DSM 9039, az Rib 1-5 lambda-fág, amelynek deponálási száma DSM 9040 és az Rib 1-7 lambda-fág, amelynek deponálási száma DSM 9041.
A találmány tárgya továbbá Rib fehérjét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét kódoló DNS-szekvencia, amely megfelelő vektorba, így plazmidba, kozmidba vagy fágba beépíthető. A DNSszekvencia előállítható a fent említett deponált Rib 1-3 lambda-fágból, Rib 1-5 lambda-fágból vagy Rib 1-7 lamdba-fágból.
Az Rib fehérjét különböző III típusú törzsek fejezik ki. Számos különböző törzsből extraktumot képeztünk, és anti-Rib szérummal a Western foltképzési eljárással analizálva kimutattuk, hogy szinte az összes extraktum tartalmazza az Rib fehérjét, de a fehérje móltömege 65-125 kD között változik. Ez az eredmény nem volt meglepő, mivel a méret változékonyságáról már más B csoportba tartozó Streptococcus fehérjénél, így az alfaés béta-fehérjénél beszámoltak.
A kapott adatok arra utalnak, hogy a fehéije ismétlődő egységekből áll, ahol az egyes egységek móltömege mintegy 9 kD. A találmány ezért kiterjed a 95 kD fehérje vagy az azonos jellemzőkkel rendelkező alapegység szubfragmenseire és multiplettjeire. A változatok aminosavak helyettesítésével vagy beépítésével alakulnak ki anélkül, hogy változna a fehérjét kifejező baktériumok által okozott fertőzés elleni védőképesség.
A B csoportba tartozó Streptococcus törzsek jól ismertek, és előállíthatók fertőzött humán betegek véréből. Az általunk alkalmazott BM110 törzs beszerezhető Dr. S. Mattinglynél (University of Texas, San Antonio, Texas, USA), míg a hivatkozott többi törzs beszerezhe2
HU 217 582 Β tő a feltalálóktól a University of Lund és a Lund University Hospital intézményeknél (Dr. Gunnar Lindahl, Department of Medical Microbiology, Sölvegatan 23, S 22362 Lund, Svédország).
Az Rib fehéqe a III szerotípusba tartozó B csoportbeli Streptococcus törzsekből, előnyösen a BS30 vagy BM110 törzsből izolálható. A találmány kiterjed az Rib fehérje tisztítására alkalmas eljárásra.
A fehéije izolálását az alábbi eljárással végezzük.
A fehéqét kifejező B csoportbeli Streptococcus törzset tenyésztjük, a közeget és/vagy a mikroorganizmust izoláljuk, a baktériumot enzimmel, előnyösen mutanolizinnel emésztjük, adott esetben proteáz inhibitort adunk hozzá, az emésztett fehéqét a felülúszótól elválasztjuk, és az Rib fehérjét a felülúszóból extraháljuk. Tápközegként alkalmazható bármely, Streptococcusok tenyésztésére alkalmas tápközeg, így Todd-Hewitttápközeg (oxoid), és a sejteket előnyösen 1 -30 órán keresztül, különösen előnyösen 12-20 órán keresztül tenyésztjük. Az emésztést enzimmel, előnyösen mutanolizinnel végezzük 1-30 órán, előnyösen 10-20 órán, különösen előnyösen 15-18 órán keresztül 20-40 °C közötti, előnyösen 37 °C hőmérsékleten rázva. A fehérje izolálható a tápközegből, és ilyen esetben nincs szükség a sejtfal roncsolására alkalmazott enzimes emésztésre. A mutanolizint szennyező vagy a mikroorganizmusban előforduló proteázok hatásának kiküszöbölése érdekében proteáz inhibitort, így benzamidin-kloridot, jód-ecetsavat vagy fenil-metil-szulfonil-fluoridot alkalmazunk.
A fehérje tisztítható ioncserélő kromatográfiával, előnyösen anioncserélő kromatográfiával és gélszűréssel, amelynek során a fehérjét tartalmazó frakciókat a szokásos módon gyűjtjük össze.
A találmány kiterjed a lényegében tiszta Rib fehérjére vagy ennek szubffagmenseire. A „lényegében tiszta” kifejezés alatt azt értjük, hogy az anyag farmakológiai szempontból káros anyagoktól mentes.
A találmány kiterjed az Rib fehérjére, valamint ennek szubfragmenseire, változataira vagy multiplettjeire vonatkozó antitestekre. Ennek során általánosan ismert módon egy állatot antigénnel, jelen esetben Rib fehérjével immunizálunk, vérmintát veszünk, a szérumot izoláljuk, és a fehérjével reagáló antitesteket felhasználjuk. A fehérje analizálására az antitestet tartalmazó szérumot vagy IgG-ffakciót használjuk.
Mivel az Rib fehérje antitestek védelmet biztosítanak a B csoportba tartozó Streptococcus törzsek által kiváltott halálos fertőzéssel szemben, hasznos lehet az antitestek mennyiségének mérése, például annak meghatározására, hogy egy terhes nő tartalmaz-e elegendő antitestet a gyermek ilyen típusú fertőzéstől történő megvédéséhez. A Rib fehérje vagy ennek szubfragmense felhasználható a fehérjére vonatkozó antitestek detektálására. A találmány tárgya ezért kiterjed az Rib fehéqét vagy ennek szubfragmensét tartalmazó reagenskészletre.
Szükség lehet továbbá különböző mintákban az Rib fehérje kimutatására. Ehhez felhasználhatók a fehérjére vonatkozó antitestek. A találmány tárgya ezért kiteqed az Rib fehérjére vagy ennek szubffagmenseire vonatkozó antitestet tartalmazó reagenskészletre, amely alkalmas a fehéqe kimutatására. A reagenskészlet bármilyen, az antitestet tartalmazó fent említett vérffakciót tartalmazhat. Tartalmazhatja továbbá a fehérjét, ennek szubfragmensét vagy multiplettjét, amely standardként alkalmazható.
Az Rib fehéqe tulajdonságai arra utalnak, hogy ez a fehérje felhasználható a B csoportba tartozó Streptococcusok elleni vakcina kifejlesztésére. A találmány ezért kiterjed az olyan gyógyszerkészítményre, amely hatóanyagként a fehérjét vagy annak ffagmensét tartalmazza a szokásos gyógyszerészeti hordozóanyagok és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagok mellett. Ehhez bármely általánosan használt gyógyszerészeti hordozóanyag felhasználható, példaként említhető a mannitol, laktóz, keményítő, cellulóz és glükóz. A példákban említett hordozóanyagok és segédanyagok nem jelentik az alkalmazható anyagok körének korlátozását.
A találmány részletesebb megértését célzó rajzokat az alábbiakban mutatjuk be.
Az 1. ábra B csoportbeli Streptococcus törzsekből előállított extraktumok Westem-foltanalízisét mutatja be a négy fő szerotípust reprezentálva (la típus: A909 törzs, Ib típus: SB35, II típus: B1284, III típus: BS30). Az immun foltanalízisből látható, hogy az la és Ib típusú törzsek kifejezik az alfa- és béta-fehéqét, amely fehéqék helyzetét a megfestett gélen nyilakkal jelöljük (alsó nyíl: alfa-antigén, felső nyíl: béta-antigén). A III típusú BS30 törzsből származó 95 kD Rib fehéqe pozícióját a megfestett gélen csillaggal jelöljük. A móltömeg markereket kD mértékegységben kifejezve bal oldalon mutatjuk.
A 2A. és 2B. ábrák az Rib fehérje tisztítását mutatják a III típusba tartozó BS30 törzsből. A 2A. ábrán a mutanolizinextraktumot mutatjuk be, amit egy előzetes DEAE ioncserélő kromatográfiás lépéssel részlegesen tisztítunk, majd egy 30 ml-es DEAE biogél A oszlopon 800 ml nátrium-klorid/10 mmol/1 írisz (pH=8,0), majd 60 ml 1 mol/1 nátrium-klorid lineáris gradienssel eluálva ismét kromatografálunk. A vonalkázott terület az Rib fehérjét tartalmazó frakciókat jelöli. Az inszertben az Rib fehérjét tartalmazó frakciók SDS-PAGEanalízisét mutatjuk be a móltömeg markerekkel együtt, amit kD mértékegységekben bal oldalon adunk meg. A 95 kD Rib fehérje pozícióját nyíl mutatja. A 2B. ábrán az Rib fehérjét tartalmazó frakciók egy részének gélszűrését mutatjuk be Sepharose CL6B oszlopon (4,2 χ 90 cm). A vonalkázott terület az Rib fehérjét tartalmazó frakciókat jelöli, és az inszertben a frakciók SDS-PAGE analízisét mutatjuk be. Vo az üres térfogatot és Vt az össztérfogatot jelöli.
A 3A., 3B. és 3C. ábra a négy fő szerotípusba tartozó B csoportbeli Streptococcus törzsek analízisét mutatja az alfa-, béta- és Rib fehérjék sejtfelületi kifejezésére. Öt törzset vizsgálunk: A909 (la típus), SB35 (Ib típus), B1284 (II típus), BS30 (III típus) és BM110 (III típus). Az öt törzs azonosítására alkalmazott szimbólumokat a C panel mutatja. A baktériumszuszpenziót kü3
HU 217 582 Β lönböző hígítású, alfa-, béta- vagy Rib fehérjére vonatkozó nyúlantiszérummal inkubáljuk a megadott hígításban. Az X tengelyen megadott számok az antitest végső hígítását mutatják a baktériumelegyben. Az antitestek megkötését radiojelölésű G fehéqével végzett inkubálással detektáljuk. Minden kísérletnél reimmun nyúlszérumot használunk kontrollként, amely minden esetben teljesen negatívnak bizonyul.
A 4. ábra a tisztított alfa-, béta- és Rib fehérje a tisztított fehérjékkel szemben kifejlesztett nyúlantiszérummal felvett Westem-foltanalízisét mutatja. Az antiszérumot 1:1000 hígításban használjuk, és a megkötött antitesteket radiojelölésű G fehéijével detektáljuk. A móltömeg markereket kD mértékegységben a bal oldalon adjuk meg.
Az 5. ábra a tripszinnel vagy pepszinnel kezelt tisztított alfa-, béta- és Rib fehérje SDS-PAGE-analízisét mutatja. A tripszines kezelést pH=7,5 értéken, a pepszines kezelést pH=4,0 értéken végezzük. A mintákat az SDS-PAGE analízis előtt semlegesítjük. A kontrollt a tripszines vagy pepszines mintákkal azonos módon, de enzim nélkül kezeljük, amely kezelés nem okoz bomlást a fehérjéknél. P jelentése pepszin, T jelentése triszpin, a móltömeg markereket kD mértékegységben a bal oldalon adjuk meg.
A 6A., 6B. és 6C. ábrák a BM110 törzsből származó Rib gén klónozását és az Rib fehérje Escherichia coli-ban történő kifejezését mutatják. A 6A. ábrán hét különböző lambda-klón és a BM100 Westem-foltanalízisét adjuk meg anti-Rib inkubálás után. A 6B. ábrán a BM110 törzsből származó kromoszóma DNS-emésztését mutatjuk be. A 6C. ábrán az Rib fehérjét kifejező lamdba-klón, a lambda-Rib 3 emésztését mutatjuk be.
A különböző szerotípusokba tartozó törzsek mutanolizinextraktumát SDS-PAGE analízissel és immun foltanalízissel vizsgáljuk, amelynek során alfa- és bétafehérjék elleni antiszérumot használunk (lásd az 1. példát). A négy fő szerotípust reprezentáló négy törzsnél kapott eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be. Az la típusú törzsek és az lb típusú törzsek által kifejezett alfaés béta-fehérjék elkülönülő sávokat adnak a megfestett gél nagy móltömegü szakaszában. Ezen fehérjék mérete a két törzsben eltérő, ami összhangban van a korábbi megfigyelésekkel. A III típusú törzsből előállított extraktumnál egy másik nagyméretű fehérje jelenik meg a nagy móltömegű szakaszban annak ellenére, hogy ez a törzs sem az alfa-fehéijét, sem a béta-fehérjét nem fejezi ki. Ez az elkülönülő, nagy móltömegü fehérjefajta megfigyelhető más III típusú törzsek extraktumában is, és a fehérje mérete a különböző törzseknél változik. Ez az alfa- és béta-fehérjékhez hasonló tulajdonság adott alapot a III típusú törzsekből származó nagy móltömegű fehérjék további vizsgálatára. Ehhez a BS30 törzset választjuk, mivel ez egérben virulens. A törzs által kifejezett 95 kD fehérjét (1. ábra) a mutanolizinextraktumból tisztítjuk (2. példa) két egymást követő ioncserés kromatografálással és ezt követő gélszűréssel (2. ábra). A frakciókban SDS-PAGE analízissel vizsgáljuk a 95 kD fehérje jelenlétét. A gélszűréssel kapott megfelelő frakciók analízisével csak két fehérjefajta mutatható ki, egy nagyobb, 95 kD fehérje és egy kisebb, 90 kD fehérje (lásd a 2B. ábra inszertjét). A 90 kD fehéije feltehetően a 95 kD fehérje bomlásterméke, mivel erről a két fehéijéről később kimutattuk, hogy azonos N-terminális-szekvenciával rendelkeznek. A tisztított fehérjét Rib fehérjének neveztük el (amely a proteázzal szembeni rezisztenciára, immunitásra és a B csoportra utal). A 95 kD Rib fehérjére vonatkozó antiszérumot úgy állítjuk elő, hogy nyulakat az SDSPAGE gélről kiváltott csíkokkal immunizálunk.
Annak vizsgálatához, hogy az Rib fehéije sejtfelületi fehéije-e, a négy fő szerotípust reprezentáló törzsekben vizsgáljuk az anti-Rib szérum megkötését (3. ábra). A vizsgált öt törzs közül négy törzs azonos a fenti törzsekkel, és a további III típusú törzs a BM110 törzs, ami egy erősen virulens III típusú klón. Összehasonlításként az öt törzsben vizsgáljuk az alfa- és béta-fehéijék kifejezését is, amelyhez a fenti fehéijék nagy tisztaságú preparátumára kifejlesztett antiszérumot használjuk.
Az anti-alfa-szérum a várakozásnak megfelelően erősen reagál az la és lb törzsekkel, és gyenge reakciót mutat a két III típusú törzzsel (3C. ábra). A III típusú törzsek mutanolizinextraktuma azonban kimutatható mennyiségű alfa-fehérjét nem tartalmaz a Westem-foltanalízis szerint. Ebből arra következtetünk, hogy az anti-alfa-szérummal kiváltott gyenge reakció a III típusú teljes baktériumoknál más sejtfalkomponensekkel kiváltott keresztreakciókra utal. Az adatok szerint az anti-alfa-szérum reakcióképessége egyértelműen felhasználható annak kimutatására, hogy a törzs kifejezi-e az alfa-antigént a sejt felületén. Hasonló adatok nyerhetők anti-béta-szérummal (3B. ábra).
Az Rib fehéije elleni antiszérum a két III típusú törzzsel reagál, de nem lép reakcióba az la és lb típusú törzsekkel (3A. ábra). Egy közepes szintű kötődés figyelhető meg a II típusú törzsnél. Ha az öt törzs mutanolizinextraktumát Westem-foltanalízissel vizsgáljuk anti-Rib szérum felhasználásával, akkor III típusú törzsek extraktuma erősen reagál, és a 95 kD értéknél fő sávot ad, de a három másik törzs reakciója teljes egészében elmarad (adatok nincsenek). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az anti-Rib szérum II típusú törzseknél mutatott közepes reakcióképessége keresztreakcióknak köszönhető, amelyek a Westem-foltanalízis körülmények között eltűnnek. Ebből az a következtetés vonható le, hogy az Rib fehéije a két III típusú törzs sejtfelületén kifejeződik, de a másik három törzsnél nem.
Ezután az ismert szerotípusú összes 58 törzset, valamennyit fertőzésekből izolálták, vizsgáltuk az Rib fehérje elleni antitestek megkötése vonatkozásában (lásd az 1. táblázatot és a 6. példát). Valamennyi törzsnél vizsgáltuk az alfa- és béta-fehéijék elleni antitestek megkötését is. A sok törzs vizsgálatának egyszerűsítése érdekében az egyes antiszérumokat egyetlen ezerszeres hígításban vizsgáljuk, amit a 3. ábrán bemutatott adatok alapján választunk ki. Az analízissel kapott egyértelmű adatokat a
6. példa 1. táblázatán mutatjuk be. Az Rib fehéije a 33 III típusú törzs közül 31 törzs sejtfelületén kimutatható, a 13 II típusú törzsnél csak az egyik felületén található, de a 12 la és lb típusú törzs egyikén sem mutatható ki.
HU 217 582 Β
Lehetséges, hogy azoknál a törzseknél, ahol az Rib fehérje nem mutatható ki a sejt felületén, a fehérje kiválasztódik a közegbe. Analizáljuk ezért az 1. táblázatban felsorolt 58 törzs tenyészközegének felülúszóját a dot-blot vizsgálattal, amelynek során anti-Rib szérumot használunk. Az Rib fehéije nem mutatható ki a 26 törzs felülúszójának egyikében sem, amelyek a fehérjét nem fejezik ki a sejt felületén, de kimutatható a sejt felületén a fehérjét kifejező 32 törzs közül 26 felülúszójában (adatok nincsenek).
Egérmodellen ellenőrizzük, hogy az Rib fehéije elleni nyúlantitestek felhasználhatók-e a B csoportba tartozó Streptococcusok halálos fertőzése elleni védelemhez (2. táblázat, 7. példa). A kontrollállatok alfa-fehérje antiszérumot vagy preimmunszérumot kapnak. Az adatok szerint az Rib fehérje elleni antiszérum az egereket megvédi az Rib fehérjét kifejező törzsek halálos fertőzésével szemben.
Mivel az Rib fehérje az alfa- és béta-fehérjékhez hasonlóan védőhatású immunitást biztosít, érdekesnek tűnik a három fehéije összehasonlítása. Az elvégzett Westem-foltkísérletet, amelynek analíziséhez tisztított fehérje elleni antiszérumot használunk, a 4. ábra mutatja. A megfestett gél szerint a három fehérje nagy tisztaságú, minden preparátumban egy fő összetevő található, de a Westem-blotvizsgálat szerint a három fehérje között nincs szerológiai keresztreakció.
Az alfa- és béta-fehérjéket eredetileg a proteázzal szembeni érzékenységben mutatott eltérés alapján különböztették meg. Az alfa-fehérje ellenáll a tripszinnek, de érzékeny a pepszinre, míg a béta-fehérje mindkét proteázra érzékeny [Bevanger és Maeland: Acta Path Microbiol. Scnad. Sect. B 87, 51 (1979)]. A tisztított alfa- és béta-fehéijékkel végzett kísérlet igazolja ezt a különbséget, és alátámasztja, hogy az Rib fehérje a tripszinnek is és a pepszinnek is ellenáll (5. ábra). A várakozásoknak megfelelően mindhárom fehérje érzékeny a K proteinázzal végzett bomlásra (adatok nincsenek). A Rib fehéije proteázzal szembeni rezisztenciája nem egy inhibitor jelenlétének köszönhető, mivel a béta-fehérje mind tripszin, mind pepszin hatására teljesen lebomlik, még akkor is, ha Rib fehéije van jelen (adatok nincsenek).
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. példa
A fehérje azonosítása
Referenciatörzsként a négy fő szerotípust reprezentáló négy B csoportbeli Streptococcus törzset használunk: A909, Ia/c típus; SB35, Ib típus; B1284 II típus; BS30 III típus. A BS30 törzset a Lund University Hospital kórházban izolálták újszülöttkori fertőzésben szenvedő fiúból. A baktériumtörzseket Todd-Hewitttápközegen (oxoid) növesztjük 37 °C hőmérsékleten rázás nélkül. A törzsek mutanolizinextraktumát SDSPAGE és immun-foltanalízissel vizsgáljuk, amelynek során alfa- és béta-fehérjék elleni antiszérumot használunk. A Streptococcus törzsek kisméretű mutanolizinextraktumát a fehérjetisztításhoz alkalmazott nagyméretű extraktumhoz hasonlóan állítjuk elő, de a tenyészetből csak 50 ml részt használunk a 20%-os baktériumszuszpenzió előállításához, amelyből 1 ml mintát az enzimmel emésztünk.
Az SDS-PAGE analízist a szokásos módon végezzük, amelynek során az összpoliakrilamid-koncentráció 10%, a keresztkötés 3,3%. A mintákat 3 percen keresztül 2 tömeg% SDS-t és 5 tömeg% 2-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban forraljuk az elektroforézis előtt. Az elválasztott fehéijéket Coomassie Brilliant Blue R-250 festékkel festjük meg, vagy az elektromos foltvizsgálathoz metanollal aktivált poli(vinilidén-difluorid) membránra (Immobilon-P, Millipore Corp., Molsheim, Franciaország) visszük egy Semi-Dry Electroblotter készülékkel (Ancos, Víg, Dánia). A membránokat a szokásos módon zselatinnal blokkoljuk, majd a megadott típusú és ezerszeresen hígított nyúl antiszérummal inkubáljuk (lásd a
7. példát), majd az inkubálást radiojelölésű G fehéijével folytatjuk, autoradiográfiás vizsgálatot végzünk.
A fehérjéket hordozómentes 125I-dal (Amersham International, Anglia) jelöljük a klóramin-T módszerrel. Az összfehéije-koncentrációt mikro-BCA fehérjevizsgáló reagenssel (Pierce) határozzuk meg. A fehérje elektroeluálását az SDS-PAGE gélről 422 ElectroEluter készülékkel (Bio-Rad) végezzük.
Az eredményeket az 1. ábra mutatja.
2. példa
Az Rib fehérje tisztítása
Egy 10 literes egyéjszakás BS30 tenyészetből a baktériumokat lecentrifugáljuk, kétszer 50 mmol/1 trisz-pufferrel (pH=7,3) mossuk, és 20 térfogat% fenti pufferben szuszpendáljuk. A mutanolizint (Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO, USA) 5000 egység/ml koncentrációjú, 10 mmol/1 kálium-foszfát-pufferben (pH=6,2) felvett oldat formájában adjuk a baktériumszuszpenzióhoz (125 ml), amikor is a végső koncentráció 250 egység/ml. Az emésztést 17 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten enyhe rázás közben végezzük, majd proteáz inhibitort adunk hozzá a következő menynyiségben: 5 mmol/1 benzamidin-klorid, 5 mmol/1 jódecetsav és 2 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluorid. A szuszpenziót centrifugáljuk, és a felülúszót azonnal dializáljuk (Spectrapor 4 dializálócsőben) 10 mmol/1 trisz-pufferrel (pH=8,0) szemben. A dializált preparátumot két egymást követő lépésben ioncserés kromatográfíával tisztítjuk, ami az előkísérletek szerint a legjobb feltárást biztosítja a tiszta Rib fehérjére. Az Rib fehérje jelenlétét SDS-PAGE analízissel és a gél 95 kD sávnál történő vizuális ellenőrzésével vizsgáljuk. Az első kromatográfiás lépésben a dializált preparátumot (110 ml) azonos térfogatú 0,4 mol/1 nátrium-klorid-oldattal (10 mmol/1 trisz-pufferben felvéve, pH=8,0) és 30 ml DEAE Bio-Gel A (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) keverjük, amely utóbbit 10 mmol/1 trisz-pufferrel (pH=8,0) szemben egyensúlyozunk ki. Az elegyet 1 órán keresztül óvatosan 4 °C hőmérsékleten kevertetjük, és az abszorbeálatlan anyagot (Rib fehéijét tartalmaz) a gélről üvegszűrőn történő
HU 217 582 Β szűréssel távolítjuk el. A második kromatográfiás lépéshez (2A. ábra) az Rib fehérjét tartalmazó szűrletet desztillált vízzel hússzorosára hígítjuk az ionerősség csökkentése érdekében, és 30 ml DEAE Bio-Gel A-val keverjük, amit a fent leírt módon egyensúlyozunk ki. 16 órán keresztül óvatosan 4 °C hőmérsékleten kevertetjük, majd a gélt szűréssel feltárjuk, és 10 mmol/1 trisz-pufferrel (pH=8,0) mossuk. Az abszorbeált fehérjéket (Rib fehérjét tartalmaz) 800 ml lineáris sógradienssel (0-0,2 mol/1 nátrium-klorid 10 mmol/1 trisz-pufferben, pH=8,0), majd 60 ml 1 mol/1 nátriumkloriddal eluáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és az Rib fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és Sepharose CL6B oszlopon (4,2x90 cm) PBSAoldatban (0,12 mol/1 nátrium-klorid, 0,03 mol/1 foszfát, 0,02 tömeg% NaN3, pH=7,2) gélszűréssel tisztítjuk (2B. ábra). A frakciókat SDS-PAGE elektroforézissel analizáljuk a 95 kD sáv jelenlétére. Az Rib fehérjét tartalmazó 10 ml-es frakciókat egyesítjük, és fagyasztjuk. Az Rib fehérje kitermelése mintegy 6 mg 25 baktériumból. Az immunokémiai analízishez használt Ribfehérje-preparátum tisztaságának biztosítása érdekében az alkalmazott fehérjét SDS-PAGE módszerrel, majd a 95 kD sáv elektroeluálásával tovább tisztítjuk. Az SDS-PAGE analízissel azonban nem mutatható ki különbség az így elektroeluált anyag és a gélszűréssel feltárt anyag tisztasága között.
Mint fent említettük, az Rib fehérje megtalálható a fehérjét kifejező törzsek tápközegében is. A fehéije a közegből a fentiekhez hasonló módon tisztítható.
Az Immobilonra átvitt fehérjesávok automatikus aminosavszekvencia-analízisét közvetlenül a membránon végezzük Applied Biosystems 470A típusú gázfolyadék-szilárd fázisú szekvenátorral. A membránokat Coomassie Brilliant Blue festékkel enyhén megfestjük a fehéijesávok lokalizálása érdekében, majd a szekvenáláshoz kivágjuk. A fehérjeszekvencia analizálására Swiss Prot Data Bankot használunk.
A BS30 törzsből származó Rib fehéije N-terminális-szekvenciáját az 1. számú szekvencia mutatja. A két fehérje becsült móltömege 95 kD és 90 kD a tisztított Rib fehérjében (2B. ábra), amelyek azonos Ntermimális-szekvenciát mutatnak, ami arra utal, hogy a kisebb molekula a nagyobbik bomlásterméke. Az adatbankban végzett kutatás szerint az Rib fehérje Nterminális-szekvenciája egyedi.
Ugyanezzel az eljárással tisztítható az Rib fehérje a BM110 törzsből. A BM110 törzsből izolált Rib fehérje N-terminális-szekvenciája (2. számú szekvencia) a 7pozícióban eltérhet a BS30-ból izolált megfelelő fehérje N-terminális-szekvenciájától, mivel a BM110 fehérjében Ser aminosav állhat az Asp helyén.
3. példa
Az alfa-fehérje tisztítása
Az alfa-fehérjét az SB35 törzsből tisztítjuk, amely az alfa- és a béta-fehérjét kifejező Ib típusú törzs. Az eljárás lényegében azonos az Rib fehéije BS30 törzsből történő tisztításával. A frakciókban az alfa-fehérje jelenlétét dot-blot analízissel vizsgáljuk, nyúl-anti-alfaszérum (Dr. L. Bevanger, University of Trondheim, Norvégia) és G fehéije (Cal-biochem Co., San Diego, CA, USA) segítségével, amely 125I -dal van jelölve. Az ioncserés és gélszűréses lépésekben az alfa-fehéije viselkedése azonos az Rib fehérével (lásd a 2. ábrát). A gélszűrésből feltárt alfa-fehérje éles csúcsot ad. Az anyagot különböző antiszérumokkal vizsgálva azt találjuk, hogy nyomnyi mennyiségben béta-fehérjét tartalmaz, ami eltávolítható, ha a preparátumot rövid IgA Sepharose oszlopon hajtjuk keresztül. A tisztított alfafehéije móltömege mintegy 110 000 az SDS-PAGE analízis szerint (lásd a 4. ábrát). Az alfa-fehérje kitermelése 12 mg 39 g baktériumból. Az immunokémiai vizsgálathoz használt alfa-fehérjét SDS-PAGE gélről elektroeluálva tovább tisztítjuk az Rib fehérjénél ismertetett módon. SDS-PAGE analízissel nem mutatható ki különbség az elektroeluált anyag és a gélszűréssel feltárt anyag tisztasága között.
4. példa
A béta-fehérje tisztítása
Az IgA kötődő béta-fehéijét [Russel-Jones és munkatársai: J. Exp. Med. 760, 1467 (1984)] az Rib fehéijénél és az alfa-fehéijénél ismertetett eljárással hasonló módon tisztítjuk. A kiindulási anyag előállításához mosott SB35 baktériumokat 50 mmol/1 glicin-NaOH pufferben (pH= 11,0) inkubálunk (a szuszpenzió végső pHértéke 9,7). Az előkísérletek szerint az ilyen extraktumban a fő fehérje a béta-fehéije. Az extraktumot (222 ml) közvetlenül ezután dializáljuk 10 mmol/1 trisz-pufferrel (pH=8,0) szemben, amit desztillált vízzel hússzorosára hígítunk, és 40 ml DEAE Bio-Gel A-val (10 mmol/1 trisz-pufferrel kiegyensúlyozva, pH=8,0) keverünk. Az anyagot 2 órán keresztül óvatosan 4 °C hőmérsékleten keveijük, majd a gélt oszlopra visszük, és 800 ml lineáris sógradienssel (0-0,2 mol/1 nátrium-klorid 10 mmol/1 trisz-pufferben, pH=8,0) eluáljuk. A 10 ml-es frakciókban dot-blot eljárással vizsgáljuk a béta-fehéije jelenlétét radiojelölésű IgA és anti-béta-szérum, valamint radiojelölésű G fehéije alkalmazásával. A béta-fehéqét a gradiens első részében eluáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és AcA34 (Pharmacia-LKB, Uppsala, Svédország) oszlopon (4,2x100 cm) PBSAban gélszűijük. A béta-fehérje jól definiált csúcsban eluálódik. A megfelelő frakciókat egyesítjük, bepároljuk és fagyasztjuk. A kitermelés 9 mg tiszta fehéije 23 g baktériumból. A preparátum fő tömegét képező fehéije móltömege mintegy 130 000 az SDS-PAGE vizsgálat szerint, de kis mennyiségű, kisebb móltömegű bomlástermékek szintén kimutathatók a fehéije Westem-foltanalízisével.
5. példa
A proteázérzékenység vizsgálata
A proteázérzékenység vizsgálatához (5. ábra) 200 pl tisztított alfa-, béta- vagy Rib fehérjemintát (0,5 mg/ml) egy órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubálunk tripszinnel, pepszinnel vagy K-proteinázzal (0,2 mg/ml). A tripszines emésztést 0,25 mol/1 nátriumfoszfát-pufferben (pH = 7,5), a pepszines emésztést
HU 217 582 Β
0,25 mol/1 nátrium-acetát-pufferben (pH=4,0) és a Kproteináz-emésztést 0,25 mol/1 trisz-pufferben (pH=7,4) végezzük. A mintákat az SDS-PAGE analízis előtt semlegesítjük.
6. példa
Az alfa-, béta- és Rib fehérje sejtfelületi kifejeződésének vizsgálata Streptococcus törzseken Öt referenciatörzsön vizsgáljuk az alfa-, béta- és Rib fehéije sejtfelületi kifejeződését. Ezután a vizsgálatot 58 B csoportbeli Streptococcus törzsön megismételjük, valamennyit fertőzésből izolálták (lásd az 1. táblázatot). A B csoportba tartozó Streptococcus törzsek besorolását a Lund University Hospital Mikrobiológiai Klinikai Laboratóriumában végezzük a szokásos módon.
ml tenyészetben egy éjszakán tenyésztett baktériumokat PBSAT folyadékkal (0,05 tömeg% Tween 20szal kiegészített PBSA) kétszer mossuk, majd PBSATben 1 tömeg% szuszpenziót készítünk. A baktériumszuszpenzió mintáját (180 pl) 20 pl, PBSAT-ban hígított nyúlantiszérummal keveijük, és egy órán keresztül 23 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 2 ml PBSAT-t adunk hozzá, centrifugáljuk, 2 ml PBSAT-vel egyszer mossuk, és 200 μΐ PBSAT-ben szuszpendáljuk. A kötött IgG detektálásához 25 μΐ radiojelölésű G fehéijét (mintegy 104 cpm a PBSAT-ban) adunk hozzá, és egy órán keresztül 23 °C hőmérsékleten tovább inkubáljuk. 2 ml PBSAT hozzáadása után a baktériumokat centrifugáljuk, és a pelletet további 2 ml PBSAT-vel mossuk. Egy végső centrifugálás után a felülúszót eldobjuk, és a pellet radioaktivitását meghatározzuk. A legtöbb törzs alfa-, béta- és Rib fehéije kifejezésére történő vizsgálata után (1. táblázat) egy végső 1:1000 arányú antiszérumhígítást használunk. A kontroll minden esetben preimmunnyúl-antiszérum volt, ami negatív eredményt ad. Az Rib fehérje a 33 III típusú törzs közül 31 sejtfelületén kimutatható, de a 12 la és Ib típusú törzs egyikénél sem található meg.
1. táblázat
Alfa-, béta- és Rib fehérje sejtfelületi kifejeződése fertőzött betegekből izolált 58 B csoportba tartozó Streptococcus törzsben
| Kifejezett fehérje | A kapszula típusa | |||
| la (n=9) | Ib (n=3) | II (n=13) | III (n=33) | |
| alfa-fehérje | 6 | 0 | 4 | 0 |
| béta-fehérje | 1 | 0 | 0 | 0 |
| alfa- és béta-fehéije | 1 | 3 | 5 | 0 |
| Rib fehéije | 0 | 0 | 1 | 31 |
| nincs fehérje | 1 | 0 | 3 | 2 |
Az alfa-, béta- és Rib fehérje sejtfelületi kifejeződését specifikus antiszérummal analizáljuk, és a kötött antitesteket radiojelölésű G fehérével detektáljuk a 3. ábrán bemutatott módon.
A vizsgált 58 törzset fertőzött betegekből izolálták, de nem jelenti a törzsek véletlenszerű gyűjteményét, mivel a legtöbb II típusú törzset később hozzáadtuk az eredetileg vizsgált gyűjteményhez, amely csak két II típusú törzset tartalmazott.
7. példa
Antiszérum előállítása és egerek védelmének vizsgálata
Az antiszérumot nyálban állítjuk elő, amit a hátán szubkután immunizálunk. A BS30 törzs által kifejezett Rib fehérje elleni antiszérum előállításához az SDSPAGE gél 95 kD sávját kivágjuk, kis darabokra osztjuk, és komplett Freund-adjuvánssal elkeverjük. A kezdeti immunizáláshoz hat darabot (mintegy 60 pg fehérje) 1 ml PBS-sel elkeverünk, és 1 ml adjuvánst adunk hozzá. Három darabot (30 pg fehérje) használunk a megerősítőinjekciókhoz. Az első megerősítést négy hét elteltével és további három megerősítést kéthetes intervallumokban adunk. A nyulakat háromhetes intervallumokban háromszor kivéreztetjük, és az így kapott szérumot egyesítjük, és az ismertetett kísérlethez felhasználjuk. Az alfa-fehérje antiszérumát azonos módon állítjuk elő. Az anti-alfa-szérum első mintáját a tisztításnál keletkezett frakciók analíziséhez használtuk, és Dr. Lars Bevanger (Trondheim) laboratóriumából kaptuk. A tisztított béta-fehérje elleni antiszérumot magunk állítjuk elő.
A vizsgálatokhoz saját tenyésztésű C3H/HeN egereket használunk 10-20 hetes korban. Az egereknek ip. injekció formájában 0,5 ml nyúlszérumot adunk PBSben ötszörösére hígítva, és 4 órával később ip. injekció formájában 0,5 ml, Todd-Hewitt-tápközegben hígított lóg fázisú baktériummal fertőzzük. A használt baktériumok mennyisége, ami a becsült halálos dózis 90%-a (LD90) 2xl06 c. f. u. a BM110, BE210 és SB35sedl törzsnél és 2 χ 107 c. f. u. a BS30 és L25 törzsnél. Az elhullott állatokat 4 napon keresztül naponta megszámoljuk. A kontrollállatok általában 24 órán belül elpusztulnak.
2. táblázat
Rib fehéije elleni nyúl antiszérum védőhatása egereken a fehéij ekifejező 8 csoportbeli Streptococcus törzsek halálos fertőzése ellen
| Törzs | A kap- szula típusa | Fehérje* | Túlélő egerek száma** | ||
| anti- Rib szérum | anti- alfa- szérum | normál szérum | |||
| BS30 | III | Rib | 29/32* | 1/15 | 4/20 |
| BM110 | III | Rib | 15/24* | 0/15 | 0/15 |
| L25 | III | - | 0/15 | 2/14 | n. d.·*· |
| BE210 | II | Rib | 10/15*· | 0/14 | n. d. |
| SB35sedl | Ib | alfa | 1/15 | 10/15·· | n. d. |
A C3H/HeN egereknek ip. injekció formájában 0,1 ml nyúlszérumot adunk PBS-sel 0,5 ml-re hígítva, és
HU 217 582 Β órával később 0,5 ml Todd-Hewitt-tápközegben felvett lóg fázisú baktériumok LD90 dózisával fertőzzük.
Megjegyzések:
+: a vizsgálatban relevánsként antigén, az Rib fehéije vagy az alfa-fehérje kifejezése + +: a 4 napon keresztül túlélő egerek száma/a fertőzött egerek összes száma *: az anti-alfa-szérumot vagy normál szérumot kapott kontrolihoz viszonyítva, P <0,001.
**: az anti-alfa-szérumot kapott kontrolihoz viszonyítva, P <0,001.
***: n. d.=nincs adat ****: az anti-Rib szérummal kezelt kontrolihoz viszonyítva, P <0,01.
A 2. táblázat adatai igazolják, hogy az Rib fehéije elleni antiszérum védőhatást biztosít azzal a III típusú BS30 törzzsel szemben, amelyből a fehéijét tisztítottuk. A kontrollszérummal végzett kísérletek szerint a védelem specifikus. Az anti-Rib szérum védőhatást fejt ki más III típusú törzs, így az erősen virulens B csoportba tartozó Streptococcus klón, a BM110 törzs [Musser és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4731, (1989)] halálos fertőzésével szemben is. Ezzel ellentétben az anti-Rib szérum nem biztosít védelmet az L25 fertőzéssel szemben, amely olyan III típusú törzs, amelyik nem fejezi ki az Rib fehéijét (lásd az 1. táblázatot). Az anti-Rib szérum védőhatása nem korlátozódik III típusú törzsekre, mint ez az Rib fehéijét kifejező II típusú törzzsel végzett kísérletből látható. A várakozásnak megfelelően, az anti-Rib szérum nem biztosít védelmet az alfa-antigént kifejező Ib típusú törzzsel szemben. Összefoglalva, az adatok egyértelműen igazolják, hogy az Rib fehéije szinte valamennyi III típusú törzsnél és több II típusú törzsnél, vagyis a legtöbb B csoportbeli Streptococcus törzsnél virulens faktor.
8. példa
Rib gén klónozása és az Rib fehérje kifejezése
Escherichia coliban
Az Rib fehérje szerkezeti génjét a III szerotípusú BM110 törzsből klónozzuk, amely egy erősen virulens klón. A törzs által kifejezett Rib fehérje (2. számú szekvencia) és a BS30 törzs által kifejezett Rib fehérje (1. számú szekvencia) hasonló méretet és N-terminálisszekvenciát mutat. A BM110 törzs DNS-táiját lambdabakteriofágban vesszük fel. A BM110 törzs 500 ml Todd-Hewitt-közegben felvett és lóg fázisú tenyészetét centrifugáljuk. A pelletet fagyasztjuk és felolvasztjuk, és ezt a műveletet háromszor ismételjük, majd 20 ml TE-pufferben (10 mmol/1 trisz, 1 mmol/1 EDTA, pH=8,0) szuszpendáljuk, centrifugáljuk, mossuk és 4 ml fenti pufferben ismét szuszpendáljuk. Butanolizint (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 5000 egység/ml koncentrációig 10 mmol/1 kálium-foszfátpufferben (pH = 6,2) hordunk, és a baktériumszuszpenzióhoz adjuk 500 egység/ml végső koncentrációban. Az elegyhez lizozimot (Sigma) adunk 8 mg/ml végső koncentrációban, és az emésztést 3 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten végezzük. A baktériumsejteket 200 μΐ 10 tömeg% SDS és 500 μΐ Tween roncsolóelegy (2 tömeg% Tween 20, 50 mmol/1 trisz, pH = 8,0, és 60 mmol/1 EDTA) segítségével roncsoljuk, majd további 200 μΐ 10 tömeg% SDS-elegyet adunk hozzá. A lizátumot K-proteinázzal (Sigma, 100 pg/ml) 19 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten kezeljük, majd fenollal és kloroformmal ismételten extraháljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, SpeedVac koncentrátorban (SAVAC) szárítjuk, és 4,5 ml TE-pufferben oldjuk. A DNS-t CsCl sűrűséggradiens ultracentrifugálással tovább tisztítjuk, és TE-pufferrel szemben dializáljuk. A DNS-koncentráció mintegy 2,5 pg/ml. Ezt a DNS-t Sau 3AI enzimmel (Promega) parciálisán hasítjuk, és lambdaEMBL3 (Statagene) BamHI enzimmel hasított kaijaihoz ligáljuk. A rekombináns fág DNS-t in vitro Gigapack II Gold Packaging Extráét (Stratagene) segítségével becsomagoljuk. A tárat LE392 E. coli törzsre visszük, és az Rib fehéije termelését immun folttechnikával vizsgáljuk: mintegy 1000 plakkot tartalmazó lemezt nitro-cellulóz-membránnal fedünk le, és 1 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten tartjuk. A membránokat eltávolítjuk, blokkoljuk, és 50-szeres hígítású nyúlantiRib-szérumot tartalmazó pufferrel inkubáljuk. A pozitív plakkokat, vagyis a nyúl IgG-t megkötő plakkokat peroxidázzal jelölt A fehérjével (Sigma, 20 pg/ml) detektáljuk, és a peroxidáz jelenlétét a szokásos módon vizualizáljuk. így hét, egymástól független Rib kifejező lambda-klónt izolálunk. Ezekből három klón, az Rib 1-3 lambda-klón, Rib 1-5 lambda-klón és Rib 1-7 lambda-klón deponálásra került a Deutsche Sammlung von Microorganismen gyűjteményben, deponálási számuk rendre DSM 930, DSM 940 és DSM 941. A Rib 1-3 lambda-klónból DNS-t állítunk elő mintegy 0,5 pg/ml koncentrációban. A hét klón lizátumát Western immun foltanalízissel vizsgáljuk antiRib szérum segítségével (lásd a 6. ábrát). A legtöbb klón a BM110 törzsből közvetlenül izolált Rib fehérjével azonos méretű Rib fehéijét fejez ki.
SZEKVENCIALISTA
2. Információ az 1. számú szekvenciáról
i) a szekvencia jellemzői:
A) hosszúság: 12 aminosav
B) típus: aminosav D) topológia: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje iii) feltételezett: nem iv) antiszensz: nem
v) fragmens típusa: N-terminális vi) eredeti forrás
A) mikroorganizmus:
B csoporthoz tartozó Streptococcus
B) törzs: BS30 xi) a szekvencia ismertetése: az 1. számú szekvencia: Ala Glu Val Ile Ser Gly Asp Ala Val Thr Leu Asn 1 5 10
2. Információ a 2. számú szekvenciáról
i) a szekvencia j ellemzői:
A) hosszúság: 12aminosav
B) típus: aminosav D) topológia: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje
HU 217 582 Β iii) feltételezett: nem
v) fragmens típusa: N-terminális vi) eredeti forrás
A) mikroorganizmus:
B csoporthoz tartozó Streptococcus
B) törzs: BM110 xi) a szekvencia ismertetése: a 2. számú szekvencia: Alá Glu Val Ile Ser Gly Ser Alá Val Thr Leu Asn 1 5 10
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Rib jelű tisztított fehérje, valamint ennek a védőhatású, immunitást kialakítani képes, természetes eredetű vagy mesterséges módosított változatai, szubfragmensei és multiplettjei, azzal jellemezve, hogy a fehérjea) előállítható a B csoportba tartozó Streptococcus törzsekből, előnyösen a III szerotípusba tartozó törzsekből;b) a tripszin és pepszin által okozott bomlással szemben viszonylag ellenálló;c) az 1. számú szekvenciának megfelelő N-terminális aminosavszekvenciával vagy ezzel legalább 90%ban homológ szekvenciával rendelkezik; ésd) védőhatású immunitást biztosít a fehérjét kifejező B csoportba tartozó Streptococcus törzsek ellen.
- 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a törzs BS30 vagy BM110 törzs, és a fehéije látszólagos móltömege SDS-PAGE eljárással meghatározva mintegy 95 kD.
- 3. Eljárás Rib fehérje izolálására, azzal jellemezve, hogy a fehérjét kifejező B csoportba tartozó Streptococcus törzset tenyésztünk, a tápközeget izoláljuk, adott esetben proteáz inhibitort adunk hozzá, és az Rib fehérjét a közegből extraháljuk és/vagy mikroorganizmust izoláljuk, a baktériumot enzimmel, előnyösen mutanolizinnel emésztjük, adott esetben proteáz inhibitort adunk hozzá, az emésztett baktériumot a felülúszótól elválasztjuk, és az Rib fehéijét a felülúszóból extraháljuk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét a felülúszóból dialízissel extraháljuk, és ioncserés kromatográfiával és gélszűréssel ffakcionáljuk.
- 5. Antitest, azzal jellemezve, hogy erősen specifikus az 1. igénypont szerinti Rib fehéijére, ennek változataira, szubfragmenseire és multiplettjeire.
- 6. Reagenskészlet Rib fehéije antitestek detektálására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét és/vagy multiplettjét tartalmazza.
- 7. Reagenskészlet Rib fehéije detektálására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti fehérjére specifikus antitestet és adott esetben standardként Rib fehérjét, ennek változatát, szubfragmensét és/vagy multiplettjét tartalmazza.
- 8. Vektor, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
- 9. A 8. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor Rib fehérjét kódoló DNS-szekvenciája lényegében azonos az Rib 1-3 lambda-fág megfelelő DNS-szekvenciájával, amelynek deponálási száma DSM 9039.
- 10. A 8. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor Rib fehérjét kódoló DNS-szekvenciája lényegében azonos az Rib 1-5 lambda-fág megfelelő DNS-szekvenciájával, amelynek deponálási száma DSM 9040.
- 11. A 8. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor Rib fehéijét kódoló DNS-szekvenciája lényegében azonos az Rib 1-7 lambda-fág megfelelő DNS-szekvenciájával, amelynek deponálási száma DSM 9041.
- 12. Lambda-fág, azzal jellemezve, hogy Rib 1-3 lambda-fág, amelynek deponálási száma DSM 9039, Rib 1-5 lambda-fág, amelynek deponálási száma DSM 9040 vagy Rib 1-7 lambda-fág, amelynek deponálási száma DSM 9041.
- 13. Rib fehérjét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét kódoló DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy előállítható a 8. igénypont szerinti vektorból.
- 14. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét tartalmazza a szokásos gyógyszerészeti hordozóanyagok és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagok mellett.
- 15. Vakcina, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehérjét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét tartalmazza a szokásos gyógyszerészeti hordozóanyagok és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagok mellett.
- 16. Eljárás az 1. igénypont szerinti Rib fehéijére, ennek változataira, szubfragmenseire és multiplettjeire erősen specifikus antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az Rib fehérjére, ennek változataira, szubfragmenseire és multiplettjeire erősen specifikus antitestet fejlesztünk ki, és az antitestet izoláljuk.
- 17. Eljárás Rib fehéije antitestek detektálására alkalmas reagenskészlet előállítására, azzal jellemezve, hogy a szokásos reagenskészlet-komponensekhez az 1. igénypont szerinti Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét és/vagy multiplettjét adjuk.
- 18. Eljárás Rib fehérje detektálására alkalmas reagenskészlet előállítására, azzal jellemezve, hogy a szokásos reagenskészlet-komponensekhez az 1. igénypont szerinti fehérjére specifikus antitestet és adott esetben standardként Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét és/vagy multiplettjét adjuk.
- 19. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét kódoló DNSszekvenciát replikáció vagy inszerció előidézésére alkalmas szekvenciához kapcsolunk.
- 20. Eljárás lambda-fág előállítására, azzal jellemezve, hogy Rib 1-3 lambda-fággal, amelynek deponálási száma DSM 9039, Rib 1-5 lambda-fággal, amelynek deponálási száma DSM 9040 vagy Rib 1-7 lambda9HU 217 582 Β fággal, amelynek deponálási száma DSM 9041, az ismertjellemzőkben azonos lambda-fágot állítunk elő.
- 21. Eljárás DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy Rib fehérjét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét kódoló szekvenciát természe- 5 tes forrásból izolálunk, vagy enzimatikus vagy szintetikus úton előállítunk.
- 22. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehérjét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multip- 10 lettjét szokásos gyógyszerészeti hordozóanyagokkal és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagokkal keverjük, és a keveréket gyógyszerkészítménynyé alakítjuk.
- 23. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Rib fehéijét, ennek változatát, szubfragmensét vagy multiplettjét szokásos gyógyszerészeti hordozóanyagokkal és adott esetben egyéb gyógyszerészeti segédanyagokkal keveijük, és a keveréket vakcinává alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9300234 | 1993-03-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9501993D0 HU9501993D0 (en) | 1995-08-28 |
| HUT72841A HUT72841A (en) | 1996-05-28 |
| HU217582B true HU217582B (hu) | 2000-02-28 |
Family
ID=20388669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501993A HU217582B (hu) | 1993-03-19 | 1994-03-21 | Streptococcus B csoportba tartozó törzsek elleni immunitást biztosító, Rib fehérjenevű felületi protein, eljárás a protein tisztítására, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5869064A (hu) |
| EP (1) | EP0656014B1 (hu) |
| JP (1) | JP3976334B2 (hu) |
| KR (1) | KR100331358B1 (hu) |
| CN (1) | CN1046291C (hu) |
| AT (1) | ATE240351T1 (hu) |
| CA (1) | CA2158658A1 (hu) |
| DE (1) | DE69432658T2 (hu) |
| DK (1) | DK0656014T3 (hu) |
| ES (1) | ES2194024T3 (hu) |
| HK (1) | HK1008825A1 (hu) |
| HU (1) | HU217582B (hu) |
| NZ (1) | NZ263275A (hu) |
| PT (1) | PT656014E (hu) |
| SG (1) | SG47049A1 (hu) |
| SI (1) | SI0656014T1 (hu) |
| WO (1) | WO1994021685A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA941958B (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6015889A (en) * | 1993-03-19 | 2000-01-18 | Gunnar Lindahl | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition |
| HU228497B1 (en) | 1998-02-20 | 2013-03-28 | Id Biomedical Corp Quebec | Group b steptococcus antigens |
| PL201887B1 (pl) * | 1998-12-22 | 2009-05-29 | Microscience Ltd | Peptyd, polinukleotyd kodujący ten peptyd, szczepionka, zastosowanie peptydu i polinukleotydu kodującego ten peptyd oraz przeciwciało |
| CZ20012174A3 (cs) | 1998-12-22 | 2002-02-13 | Microscience Limited | Vnějąí povrchové proteiny, jejich geny a jejich pouľití |
| US6890539B2 (en) | 1998-12-22 | 2005-05-10 | Microscience, Ltd. | Genes and proteins, and their use |
| US7128918B1 (en) | 1998-12-23 | 2006-10-31 | Id Biomedical Corporation | Streptococcus antigens |
| CA2356836C (en) * | 1998-12-23 | 2011-09-13 | Shire Biochem Inc. | Novel streptococcus antigens |
| GB9910375D0 (en) | 1999-05-05 | 1999-06-30 | Lindahl Gunnar | Vaccine composition |
| EP1795594A3 (en) * | 2001-05-31 | 2008-04-02 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Method of evaluating the function of phagocyte and utilization thereof |
| JP3934605B2 (ja) * | 2001-05-31 | 2007-06-20 | 扶桑薬品工業株式会社 | 感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法 |
| JP2005535287A (ja) * | 2002-02-11 | 2005-11-24 | アイディー バイオメディカル コーポレイション | グループｂ連鎖球菌抗原 |
| US20070014841A1 (en) * | 2005-02-08 | 2007-01-18 | Denis Martin | Pharmaceutical compositions |
| PT2144924T (pt) | 2007-04-16 | 2016-08-17 | Minervax Aps | Vacina de proteína de fusão |
| CN108135992A (zh) | 2015-10-21 | 2018-06-08 | 米纳瓦克斯有限责任公司 | 免疫原性融合蛋白 |
| CA3004631A1 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Minervax Aps | Immunogenic complex for eliciting protective immunity against group b streptococcus |
| CA3066020A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Method of treatment |
| CA3161857A1 (en) | 2019-11-22 | 2021-05-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Dosage and administration of a bacterial saccharide glycoconjugate vaccine |
| EP4066854A1 (en) | 2021-03-29 | 2022-10-05 | MinervaX | Immunogenic fusion protein |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5302386A (en) * | 1986-04-16 | 1994-04-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture |
| US4772584A (en) * | 1986-05-23 | 1988-09-20 | Cleary Paul P | Inhibitor of C5a-mediated chemotaxis |
| EP0367890A1 (en) * | 1988-11-11 | 1990-05-16 | HighTech Receptor AB | Protein Arp, with immunoglobulin A binding activity, cloning and expression thereof |
| US5648241A (en) * | 1989-09-15 | 1997-07-15 | The General Hospital Corporation | Conjugate vaccine against group B streptococcus |
| IL95578A (en) * | 1989-09-15 | 1998-08-16 | Gen Hospital Corp | A vaccine made from polysaccharide and protein |
| WO1992017588A2 (en) * | 1991-03-29 | 1992-10-15 | Ervin Faulmann | METHOD FOR PRODUCTION OF AN IgA BINDING PROTEIN DERIVED FROM GROUP B STREPTOCOCCI |
-
1994
- 1994-03-21 AT AT94911348T patent/ATE240351T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-03-21 JP JP52094694A patent/JP3976334B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-21 SI SI9430453T patent/SI0656014T1/xx unknown
- 1994-03-21 NZ NZ263275A patent/NZ263275A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-21 HU HU9501993A patent/HU217582B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-03-21 CA CA002158658A patent/CA2158658A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-21 CN CN94191519A patent/CN1046291C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-21 ES ES94911348T patent/ES2194024T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-21 PT PT94911348T patent/PT656014E/pt unknown
- 1994-03-21 EP EP94911348A patent/EP0656014B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-21 ZA ZA941958A patent/ZA941958B/xx unknown
- 1994-03-21 DK DK94911348T patent/DK0656014T3/da active
- 1994-03-21 KR KR1019950703989A patent/KR100331358B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-21 SG SG1996004387A patent/SG47049A1/en unknown
- 1994-03-21 WO PCT/SE1994/000246 patent/WO1994021685A1/en active IP Right Grant
- 1994-03-21 DE DE69432658T patent/DE69432658T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/487,675 patent/US5869064A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-07-29 HK HK98109536A patent/HK1008825A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1119442A (zh) | 1996-03-27 |
| EP0656014B1 (en) | 2003-05-14 |
| JPH09500092A (ja) | 1997-01-07 |
| DE69432658T2 (de) | 2004-04-08 |
| PT656014E (pt) | 2003-09-30 |
| SI0656014T1 (en) | 2003-12-31 |
| JP3976334B2 (ja) | 2007-09-19 |
| AU681130B2 (en) | 1997-08-21 |
| EP0656014A1 (en) | 1995-06-07 |
| WO1994021685A1 (en) | 1994-09-29 |
| KR960701096A (ko) | 1996-02-24 |
| SG47049A1 (en) | 1998-03-20 |
| NZ263275A (en) | 1997-07-27 |
| HUT72841A (en) | 1996-05-28 |
| AU6389194A (en) | 1994-10-11 |
| KR100331358B1 (ko) | 2002-08-13 |
| CA2158658A1 (en) | 1994-09-29 |
| DK0656014T3 (da) | 2003-08-11 |
| HK1008825A1 (en) | 1999-05-21 |
| DE69432658D1 (de) | 2003-06-18 |
| US5869064A (en) | 1999-02-09 |
| CN1046291C (zh) | 1999-11-10 |
| ZA941958B (en) | 1995-01-27 |
| ES2194024T3 (es) | 2003-11-16 |
| HU9501993D0 (en) | 1995-08-28 |
| ATE240351T1 (de) | 2003-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217582B (hu) | Streptococcus B csoportba tartozó törzsek elleni immunitást biztosító, Rib fehérjenevű felületi protein, eljárás a protein tisztítására, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény | |
| US5866140A (en) | Type I surface antigen associated with staphylococcus epidermidis | |
| FI77983C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett antigenpreparat anvaendbart foer reducering eller foerhindring av tandkaries. | |
| HU181957B (en) | Process for producing protein-type antygene compositions /preparates/ against caries | |
| US7902349B2 (en) | Nucleic acids encoding protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly) | |
| IE59627B1 (en) | Cross-protective human monoclonal antibody compositions | |
| KR19990087436A (ko) | 치주염의 진단 및 치료용 포르피로모나스 긴기발리스 항원 | |
| WO1999008705A1 (en) | Capsular polysaccharides from enterococci | |
| CA2127550A1 (en) | Multifunctional surface protein of streptococci | |
| CA2259141C (en) | Treatment and diagnosis of infections of gram positive cocci | |
| Challacombe et al. | Natural antibodies in man to a protein antigen from the bacterium Streptococcus mutans related to dental caries experience | |
| Dom et al. | NAD-independent Actinobacillus pleuropneumoniae strains: production of RTX toxins and interactions with porcine phagocytes | |
| EP0362274B1 (en) | Treatment and diagnosis of footrot using the basic protease of bacteroides nodosus | |
| AU681130C (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity tomany strains of the group B streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| Johnson et al. | Purification and characterization of group A streptococcal T-1 antigen | |
| US5093118A (en) | Antigen of Blastomyces dermatitidis and its uses | |
| US5300632A (en) | Method for purifying an outer membrane protein of Haemophilus influenzae | |
| US5919640A (en) | Streptococcus suis adhesin protein and method for producing it | |
| US20040151737A1 (en) | Streptococcal serum opacity factors and fibronectin-binding proteins and peptides thereof for the treatment and detection of streptococcal infection | |
| Birkholz et al. | Intermediate filaments vimentin and desmin share epitopes with M 1 protein of group A streptococci | |
| Peterson et al. | Pathogenesis of Salmonellosis: Salmonella Exotoxins | |
| JPH03173899A (ja) | 生体由来のタンパク質 | |
| JP2002512528A (ja) | ストレプトコッカス イクイの保護ｍ−様タンパク質をコードする化合物及びその検定 | |
| JP2004041084A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌に対するワクチン用ペプチド、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらの利用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |