FI77983C - Foerfarande foer framstaellning av ett antigenpreparat anvaendbart foer reducering eller foerhindring av tandkaries. - Google Patents

Description

Menetelmä hammaskarieksen vähentämisessä tai estämisessä käytettävän antigeenivalmisteen valmistamiseksi 1 77983 Tämä keksintö kohdistuu bakteerilajista Streptococcus mutans johdettuihin antigeeniproteiineihin hammasmätää vastaan.

Bakteerilajin Streptococcus mutans uskotaan näyttelevän merkittävää osaa karieksen synnyssä ja useat laboratoriot ovatkin osoittaneet, että aktiivisella immunisoinnilla, käyttäen tähän bakteeriin perustuvaa rokotetta, on mahdollista alentaa karieksen määrää koe-eläimillä. On esimerkiksi osoitettu, että sakkaroosipitoisella ruokavaliolla pidetyillä Macaca fascicularis-apinoilla, joko ehjillä S.mutans bakteereilla tai soluseinäpitoisella materiaalilla aiheutettua immunisointia seurasi merkittävä karieksen väheneminen. (Bowen, British Dental Journal, Voi. 126, 1969. ss. 159-160? Bowen et ai. British Dental Journal, Voi. 139, 1975 ss. 45-50; Cohen et ai. British Dental Journal, Voi. 147, 1979, ss. 9-14). On myöskin osoitettu, että suojaa ei saavuteta käyttämällä S.mutans bakteerin soluseiniä, joita on käsitelty trypsiinillä proteiinien tuhoamiseksi, ja täten osoitettiin, että suojaavaan immunisaatioon tarvitaan todennäköisesti S.mutans-soluseinän proteiinikompo-nentti (Colman ja Cohen, Pathogenic streptococci, 1979, s. 214, toimittanut M.T. Parker, Reedbooks, Chertsey, Englanti).

Kaikissa immunisointiproseduureissa on tärkeätä havaita suojaukseen liittyvä bakteerikomponentti. Yksi ilmeinen syy tähän on se, että lääkevalmisteet voidaan tällöin testata ennen käyttöä sen varmistamiseksi, että suojaan tarvittava välttämätön komponentti on olemassa. Lisäksi suojaavan antigeenin puhdistaminen mahdollistaa sellaisen rokotteen valmistamisen, josta voidaan poistaa ei-toivotut tai myrkylliset ainesosat. Bakteerilajin S.mutans tapauksessa on ollut huolestuttavaa osoitus siitä, että tämä organismi omaa sellaisia komponentteja, 2 77983 jotka aiheuttavat antigeenisen reaktion nisäkkäiden sydänkudoksessa (ks. esim. Hughes et ai., Infect Immun, 27, 1980, ss. 576-588). Kun tiedetään tällaisten sydämen kanssa risti-reagoivien antigeenien olemassaolosta lajissa S.mutans on toivottavaa, että ne identifioitaisiin ja karakterisoitaisiin siten, että ne voidaan poistaa rokotteesta.

UK-patenttihakemus 2033223A kuvaa kahta proteiinia, jotka ovat eristettävissä lajin S.mutans soluseinistä ja jotka käyttäytyvät antigeenisesti. Toiselle näistä antigeeniproteii-neista (merkitty antigeeni A) haetaan suojaa yllä mainitussa hakemuksessa, toisen (antigeeni B), joka osoitettavasti risti-reagoi sydänkudoksen kanssa, ei uskota olevan hyväksyttävä rokotekomponentti ihmisiin käytettäväksi. Antigeenit A ja B voidaan määritellä seuraavien kriteerien avulla: a. Niitä on läsnä kantojen S.mutans geneettisen ryhmän I solu-seinillä (Coykendall, J Gen Microbiol. 83, 1974, s. 327).

Tämä geneettinen ryhmä sisältää serotyyppien c, e ja f kannat kuten Perch et ai ovat määritelleet (Acta Path Microbiol Scand, 82, 1974, s. 357).

b. Ne säilyvät mainituilla seinillä keitettäessä 20 min nat-riumdodekyylisulfaatissa (SDS) suhteessa 10 g/1.

c. Määritettynä SDS-polyakryyliamidigeeli elektroforeesilla (SDS-PAGE) niiden keskimääräiset molekyylipainot ovat A: n.

29 000; B: n. 190 000.

d. Määritettynä isoelektrisellä fokusoinnilla akryyliamidi-geelissä, niiden isoelektriset pisteet ovat A: n. 4,3; B: n.

5,4 ja antigeenin A tapauksessa antigeeniproteiinit.

e. tuhotaan proteolyyttisellä entsyymillä, ja f. ne eivät ristireagoi sydänkudoksen kanssa.

Nyt on havaittu, että näiden lisäksi voidaan kannan S.mutans geneettisen ryhmän I soluseinistä eristää vielä yksi antigeeni-proteiiniryhmä (antigeeni C). Tätä proteiiniryhmää voidaan * käyttää monospesifisen antiseerumin valmistamiseen ja sillä näyttää olevan osuus suojauksessa hammasmätää vastaan annettuna 3 77983 rokotteessa S. mutans'in soluseinien mukana. Se ei ole osoittanut ristireaktioita nisäkkäiden sydänkudoksen kanssa.

Tämän keksinnön mukaisesti aikaansaadaan antigeenivalmiste käytettäväksi hammaskarieksen vähentämiseen tai ehkäisyyn valmisteen käsittäessä antigeeniä C (kuten myöhemmin määritellään), ja sen ollessa käytännöllisesti katsoen vapaa kannasta S. mutans saaduista sydämen kanssa ristireagoivista antigeeneistä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Antigeeni C sisältää niitä antigeeniproteiineja: a) joita on läsnä kannan Streptococcus mutans geneettisen ryhmän I soluseinillä; b) jotka jäävät soluseinien yhteyteen, joita on pesty SDS:llä o 15 C lämpötilassa; c) joiden molekyylipaino on 70 000 + 5 000 määritettynä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE); d) jotka tuhoutuvat proteolyyttisellä entsyymillä; e) joiden isoelektrinen piste on 4,45 + 0,24; ja f) jotka eivät ristireagoi sydänkudoksen kanssa.

Tämä antigeenipreparaatti voi sisältää antigeeniä C ainoana antigeeniproteiinina. Vaihtoehtoisesti sovellutusmuodossa preparaatti voi kuitenkin sisältää antigeeniä C seoksena muiden sydämen kanssa ristireagoimattomien antigeeniproteiinien kanssa, erityisesti antigeenin A kanssa, jota on kuvattu aikaisemmassa GB-hakemuksessamme 2 033 233A.

Tätä antigeeniproteiinia voidaan käyttää farmaseuttisen preparaatin, kuten rokotteen muodossa, sopivien farmaseuttisesti hyväksyttyjen laimentimien ja kantaja-aineiden, kuten apuaineiden (esim. alumiinihydroksidin), stabiloivien aineiden ja bakteriostaattien kanssa. Rokote voidaan antaa ihonalaisena, lihaksensisäisenä, laskimonsisäisenä tai limakalvon 4 77983 alaisena injektiona, tyypillisesti 1-50 ^ug:n annoksina, erityisesti n. 10 ^ug kokonaisantigeenejä kehon kiloa kohti. Immunisointi voidaan tehdä myös oraalista tietä, esimerkiksi niele-mällä kapseli, joka sisältää antigeenivalmistetta tai käyttämällä toistuvasti suuvesi- tai hammastahnavalmistetta, joka sisältää antigeeniä C.

Voidaan olettaa, että kariekselta suojaaminen tämän keksinnön mukaisella antigeeniproteiinilla johtuu tämän antigeenin vasta-aineista, joita tuottaa kehon immuunivaste. Tällaiset vasta-aineet voidaan tuottaa myös immunisoitavan kohteen ulkopuolella perinteisellä tekniikalla kuten injektoimalla sopiva S.mutans antigeenivalmiste, joka sisältää antigeeniä C esimerkiksi lehmiin tai kaniineihin ja sen jälkeen teurastamalla eläin. Tällä tavalla valmistetun ja perinteisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä laimentimia ja kantajia sisältävän vasta-ainevalmisteen antaminen estää tai vähentää tehokkaasti kariesta. Esillä oleva keksintö käsittää siksi vasta-ainevalmis-teet, jotka ovat spesifisiä antigeenin C antigeenideterminan-teille tai jotka sisältävät tämän antigeenin vasta-ainetta.

Se sisältää myös farmaseuttiset koostumukset, jotka käsittävät yllä kuvattuja antigeenipreparaatteja, joissa on perinteisiä laimentimia tai kantajia ja myös koostumukset, jotka käsittävät : antigeenin C vasta-aineita tällaisten laimentimien ja kantajien kanssa.

Antigeeniä C on läsnä sekä lajin S.mutans soluseinällä, että soluista vapaissa viljelmäsuodoksissa. Se voidaan uuttaa S. mutans'in soluseinistä soveltamalla perinteistä tekniikkaa, jota on käytetty proteiinien poistamiseksi solurakenteista mutta edullisesti se erotetaan joko soluista vapaista viljelmäsuo-doksista tai kokonaisten S.mutans'ien solujen uutteesta, mitkä tavallisesti sisältävät vähemmän aineita, jotka todennäköisesti ovat haitaksi puhdistusproseduureissa.

Toinen tämän keksinnön tarkoitus on siten aikaansaada menetelmä hammaskarieksen vähentämisessä tai estämisessä käytettävän antigeenivalmisteen valmistamiseksi, joka valmiste sisältää s 77983 antigeeniä C mainitun valmisteen ollessa oleellisesti vapaa kaikista sydämen kanssa ristireagoivista lajeista, Streptococcus mutans saatavista antigeeneistä, menetelmän käsittäessä Streptococcus mutans bakteerin viljelyn sopivassa kasvatusalustassa, ainakin soluseinien poistamisen saadusta viljelmästä, jolloin jäljelle jää proteiiniliuos ja vaaditun antigeenivalmis-teen erottamisen mainitusta proteiiniliuoksesta.

Erotus kolonnikromatografisesti käyttäen sopivaa geelipermeaati-ota, ioninvaihtoa tai hydrofobisia vuorovaikutteisia materiaaleja on mahdollista, mutta on edullista käyttää erotusprosessia, mihin sisältyy affiniteettikromatografiavaihe immobilisoidulla antigeenin C vasta-aineella. Immobilisoitu vasta-aine voi olla joko monospesifisiä vasta-aineita antigeenille C tai yksi tai useampi monokloonattu vasta-aine antigeenille C, joka on valmistettu soluhybridisaatiotekniikalla.

Jos sitten halutaan antigeenin C ja antigeenin Λ seos, molemmat antigeenit voidaan valmistaa erillään affiniteettikromatogra-fialla immobilisoidulla vasta-aineella ja sen jälkeen yhdistää, tai seos voidaan valmistaa yhdessä vaiheessa affiniteettikroma-tografialla yhdistetyllä antigeenin C ja antigeenin A immobilisoidulla vasta-aineella.

Viljelyalusta voi olla mikä tahansa tavanomainen lajille S. mutans käytetty väliaine, kuten Todd-Hewit®-lihaliemi, tryptone/hiivauute tai kemiallisesti määritelty väliaine. Myöhemmän puhdistuksen helpottamiseksi on edullista käyttää kemiallisesti määritettyä väliainetta. Antigeeni C vapautetaan kasvatusväliaineeseen kaikissa viljelyn vaiheissa. Soluja voidaan kasvattaa panosviljelyssä ja ne erotetaan edullisesti aikaisessa stationäärivaiheessa (tyypillisesti 15-25 h 37°C:ssa). -; Vaihtoehtoisesti solut voidaan kasvattaa jatkuvassa viljelyssä, edullisesti laimennusnopeudella n. 0,01-0,1, erityisesti n.

0,05 h-1.

Proteiiniliuos voi käsittää viljelmäsuodoksia, jotka saadaan poistamalla koko solut tai solu-uutetta, joka on vapaa solu- 6 77983 seinistä ja jäänteistä. Vaihtoehtoisesti se voi olla näiden seos, joka on valmistettu hajottamalla koko viljelmän solut ja sen jälkeen poistamalla soluseinät ja jäänteet. Soluseinät voidaan poistaa joko kokonaisina soluina tai hajottamisen seurauksena saatuina fragmentteina perinteisellä tekniikalla kuten sentrifugoimalla tai suodattamalla.

Tyypillisiä tämän keksinnön mukaisia tuotteita ja prosesseja kuvataan nyt ainoastaan esimerkinomaisesti viittauksin oheisiin piirroksiin, joissa kuvassa 1 on esitetty seerumin IgG antigeenin C vasta-aineen titraus ELISA:11a neljälle kontrolliapinalle ja neljälle apinalle, jotka immunisoitiin soluseinillä, /kuten Bowen et ai, 1975 ovat kuvanneet (koe C//, piirtämällä p-nitrof enolin absorbanssi 405 nm:ssä seerumin laimennuksen funktiona, kuvassa 2 verrataan karieksen kehittymistä hampaansaannissa kolmella apinalla (Macaca fascicularis), jotka immunisoitiin lajin S.mutans soluseinillä, karieksen kehittymiseen viidellä kontrollieläimellä /kuten Cohen et ai, 1979 ovat kuvanneet (koe 19/7/ ja kuvassa 3 on esitetty seerumin IgG antigeenin C vasta-aineen titraus neljällä kontrolliapinalla ja neljällä apinalla, jotka immunisoitiin soluseinillä /kuten Cohen et ai, 1979 ovat esittäneet (koe 19//, piirtämällä p-nitrofenolin absorbanssi 405 nm:llä seerumin laimennuksen funktiona.

Antigeeni C

1. Soluseinien tuottaminen Käytettiin bakteerilajin S.mutans yleisesti tunnettua kantaa Ingbritt, Krasse (Archs Oral Biol 11, 1966, ss. 429-436) on kuvannut tätä kantaa ja Coykendall luokittelee sen geneettisenä ryhmänä I ja Perch et ai serotyyppinä C. Tämän kannan on tallentanut National Collection of Industrial Bacteria,

Aberdeen, Scotland, NCIB 11516:na. Samanlaisia tuloksia on 7 77983 saatu käyttämällä kantaa tallentajalta the National Collection of Type Cultures, Colindale, London (NCTC 10449), mikä on läheistä sukua kannalle Ingbritt.

Bakteeria kasvatettiin väliaineessa, jota ovat kuvanneet Ellwood et ai, (Archs Oral Biol. 19, 1974, ss. 659-664) 600 ml:n kemostaatissa laimennusnopeudella 0,05 h pH pidettiin arvossa 6,5 kaliumhydroksidin automaattisella lisäyksellä.

Bakteeri kerättiin sentrifugoimalla, pestiin suolavedellä ja lämmitettiin 60°C:een 30 minuutiksi autolyyttisen entsyymin inaktivoimiseksi. Sen jälkeen ne rikottiin ravistamalla n:o 12 BallotinJ^-lasihelmien kanssa Mickle Tissu^ -disintergraatto-rissa. Rikotut solut erotettiin lasihelmistä suodattamalla ja pestiin kahdesti vedellä ja kahdesti IM NaCl-liuoksella ennen kuin ne uudelleen suspendoitiin SDS:llä (10 g/1) vedessä Pottei®-kudoshomogenisoijän avulla. Ehjä bakteeriaines erotettiin seinistä hitaalla sentrifugoinnilla ja seinät pestiin perusteellisesti suolavedellä ja puhtaalla vedellä ennen kylmäkuivatusta.

Samanlaisia tuloksia on saatu käyttämällä bakteeria, joka on kasvatettu panoksittaan Todd-Hewit^-lihaliemessä (J. Path and Bacteriol, 35, 1932, ss 973-974) tai väliaineessa, joka sisältää glukoosia, tryptonia ja hiivauutetta säädetyssä pH:ssa ja joko rikkomalla solut Braur^-homogenisaattorissa tai muulla tavoin uuttamalla niitä pitkään SDSillä huoneen lämpötilassa.

2. Antiseerumin valmistus

Kylmäkuivatut seinät suspensoitiin steriiliin suolaveteen pitoisuudessa 1 mg/ml ja käytettiin apinoiden (katso alempana) tai kaniinien immunisointiin. Kaniinit saivat kolme injektiota lihak-seen, kolmen viikon välein, kunkin milligramman soluseiniä si-•· sältäessä 10 % alumiinihydroksidia apuaineena. Viikko viimei sen injektion jälkeen ne tapettiin pistämällä sydämeen.

3. Immnnoelektroforeesikokeet

Yllä kuvatulla tavalla valmistettua soluseinien antiseerumia 8 77983 käytettiin sekä antigeenin C karakterisointiin että sen puhdistukseen. Kun kannan Ingbritt (tai läheisten kantojen) viljelmäsuodoksesta saatuja proteiineja käytettiin antigeeninä ristikkäisessä inununoelektroforeesikokeessa, joka tehtiin Axelsen’in et ai (A Manual of Quantitative Immunoelektrophore-sis, Oslo, 1973) kuvaamien menetelmien mukaisesti ja suoritettiin elektroforeesi soluseinien antigeeniksi, havaittiin kolme saostumapiikkiä. Kokeiden avulla, käyttäen intermediääristä geelitekniikkaa (Axelsen et ai, s. 71) intermediäärisellä geelillä, joka sisälsi joko antigeeniä A ja B tai monospesifistä antiseerumia A:lie ja B:lle oli mahdollista osoittaa, että kaksi saosturaapiikeistä johtui antigeeneistä A ja B, kolmas kaukaisemmasta antigeenistä, nimittäin antigeenistä C.

Antigeenin C luonteen tutkimiseksi antigeenivalmistetta käsiteltiin useilla tavoin ennen sen tutkimista ristikkäisellä elektroforeesilla. Havaittiin, että antigeeni C tuhoutui inkuboimalla 3 tuntia 37°C:ssa proteolyyttisen entsyymin, tryp-siinin tai pronaasin kanssa, jota oli 200 ^ug'ml. Antigeeni C on siten luonteeltaan proteiini. Antigeenin C näytteet tuhottiin myös puskuroimalla alle pH-arvon 5 kolmeksi tunniksi havaiten siten,että antigeeni C on myös happolabiili.

Antigeenin C fysikaalisista ominaisuuksista saatiin tietoa ristikkäisellä immunoelektroforeesilla, jossa ensimmäisen dimension erotus tehtiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla proteiinien erottamiseksi molekyylipainojen mukaan (menetelmän yksityiskohdat julkaisussa Russel, J.Gen.Microbiol, 144, 1979, 109-115) tai ristikkäisellä elektrofokusoinnilla agaroosissa (Rosen ja Aman, J. Immunol.Meth, 1979, 28, 1), jossa proteiinit erotettiin varauksen mukaan. Tulokset osoittivat, että antigeenin C keskimääräinen molekyylipaino oli 70 000 + 5000 (SD) ja isoelektrinen piste oli 4,45 + 0,24.

Antigeeniä C voidaan tutkia myös immunodiffuusiokokeilla seinien antiseerumilla tai puhtaalla antigeenillä C (ks. alla).

9 77983

Immunodiffuusiota käytettiin siksi osoittamaan, että antigeenejä, jotka ovat identtisiä antigeenille C tuotti 6 muuta lajin S.mutans serotyypin c kantaa ja myös serotyyppien e ja f edustajat.

4. Antigeenin C puhdistaminen

Yllä esitetyt tiedot osoittavat, että antigeeniä C on sekä solu-seinillä, että soluista vapaassa viljelmäsuodoksessa. Vaikka antigeeni C voidaan uuttaa seiniltä sopivilla tavoilla, on edullista puhdistaa se viljelmäsuodoksesta, koska tämä mahdollisesti sisältää vähemmän aineita, jotka todennäköisesti vaikeuttavat puhdistusproseduureja.

Antigeeni C voidaan puhdistaa rutiininomaisilla laboratorio-proseduureilla kolonnikromatografisesti käyttäen esimerkiksi sopivaa geelipermeaattia ja ioninvaihtomatriiseja, kuitenkin mukavimmin se voidaan eristää immunosorbenttiaffiniteettikromato-grafialla, ja alla on esitetty tämän tekniikan vaiheet.

a. Lajin S.mutans kantaa Ingbritt kasvatettiin puoli-määritellyssä väliaineessa (Russell,FEMS Microbiol Sett 6, 1979 ss. 197-199) aikaiseen stationäärivaiheeseen asti ja solut poistettiin sentrifugoimalla jonka jälkeen suoritettiin suodatus lasikuidun läpi. Proteaasi-inhibiittoria fenyylimetyylisulfonyyli-fluoridia (PMSF) lisättiin lopulliseksi konsentraatioksi 1 mM yhdessä natriumatsidin kanssa (lopullinen 0,02 %) estämään bakteerikasvu. Suodos ajettiin sen jälkeen affiniteettikromatografia-kolonnin läpi, joka sisälsi liukenematonta gJukoosipolymeeriä mutaania ja agaroosigeelihelmiä (Sepharos CL-6B), jotka on .. valmistettu pääasiassa Russell'in (J Gen, Microbiol, 112, 1979, ss. 197-201) kuvaamalla tavalla glukosyylitransferaasientsyy-min ja muiden dekstraaniin sitoutuvien proteiinien poistamiseksi. Nämä saattavat muutoin sitoutua seuraaviin immunosorbentti-kolonneihin (Russell FEMS Microbiol, Lett, 1981, 11, 279).

Viljelmäsuodos ajetaan tämän jälkeen immunosorbenttikolonni-sarjan läpi, kolonnit sisältävät 10 77983

i) monospesifisen vasta-aineen antigeenille A

ii) monospesifisen vasta-aineen antigeenille B

iii) soluseiniä.

Kolmas kolonni sisälsi siten vasta-ainetta antigeeneille A, B ja C, mutta koska antigeenit A ja B poistetaan näytteestä ennen kuin ne tulevat kolmanteen kolonniin, ainoastaan antigeeni C jäi jäljelle ja voitiin sitten eluoida sopivalla aineella kuten 3 M natriumtiosyanaatilla. Immunosorbenttikolonnit valmistettiin standardimenetelmillä, joissa seerumin immunoglobulii-nin G jakeet yhdistettiin siloitettuihin agaroosihelmiin (CnBr-aktivoitu Sepharos^^ 4B, Pharmacia Fine Chemicals Ltd.) valmistajien suosittelemilla proseduureilla.

Yllä kuvatulla tavalla valmistettu antigeeni C käytettiin nostamaan monospesifistä antiseerumia tehden mahdolliseksi C-spesifisen immunosorbenttikolonnien konstruktion, mikä salli antigeenin puhdistamisen yhdessä vaiheessa.

b. Vaihtoehtoinen proseduuri antigeenin C puhdistamiseksi sisälsi immunosorbenttiaffiniteettikromatografiän, jota seurasi hydrofobinen vuorovaikutteinen kromatografia. Tässä menetelmässä viljelmäsuodos ajettiin ensin affiniteettikolonnin läpi, joka sisälsi mutaania ja Sepharosei^ sitten immunosorbenttikolon-nin läpi, joka sisälsi vasta-ainetta soluseinille. Antigeenit A, B ja C pysähtyivät tällaisiin kolonneihin ja ne voitiin eluoida 3 m natriumtiosyanaatilla 0,05 M tris-HCl-puskurissa (pH 7,5). Natriumtiosyanaatti poistettiin dialyysillä ja antigeeni-proteiinien liuos tasapainotettiin 0,05 M tris-HCl-puskurissa (pH 7,5), joka sisälsi IM ammoniumsulfaattia. Tämä näyte syötettiin sitten kromatografiakolonniin, joka sisälsi fenyyli-Sepharose^CL-4B (Pharmacia Fine Chemicals) : Proteiinit jäivät ; kolonniin, josta ne sitten eluoitiin liuoksella, jolla oli pie nenevä anmoniumsulfaatti konsentraatiogradientti ja samanaikaisesti kasvava etyleeniglykolikonsentraatio (lopulliset kon-sentraatiot 0 % ja 50 %). Antigeeni C eluoitiin ammoniumsulfaatilla, jonka pitoisuus oli välillä 0,6 ja 0,7 M/15-20 prosenttisella etyleeniglykolilla antigeenien A ja B edetessä.

n 77983

Yllä kuvatulla tavalla valmistettuaantigeeniä C käytettiin sitten nostamaan monospesifistä antiseerumia tehden mahdolliseksi C-spesifisen immunosorbenttikolonnien konsentraation, mikä salli antigeenin puhdistamisen yhdessä vaiheessa.

Suojaaminen kariesta vastaan immunisoimalla soluseinillä Immunisoinnin yllä kuvatulla tavalla valmistetuilla lajin S. mutans kannan Ingbritt soluseinillä on havaittu kahdessa kokeessa antavan suojan kariesta vastaan apinoilla (Macaca fascicularis) ja Bowen et ai. (British Dental Journal 1975, Voi. 139, ss.

45-58) ja Cohen et ai. (British Dental Journal, 1979, Voi. 147, ss. 9-14) ovat julkaisseet näitä kokeita koskevia yksityiskohtia.

Kokeessa C, kuten Bowen et ai, ovat kuvanneet, viittä kariesta edistävällä dieetillä pidettyä kontrollieläintä verrattiin neljään eläimeen, jotka oli immunisoitu soluseinillä. Viisi vuotta kokeen aloittamisen jälkeen hammasmädän vioittamien kontrollieläinten lukumäärä oli 64, kun taas immunisoidussa ryhmässä havaittiin vain neljä vioittunutta. Tätä suojausta pidettiin yllä vähintään 9 vuotta (Cohen et ai, 1979). Viisi vuotta kokeen aloittamisen jälkeen otettujen koe-eläinten seeruminäytteiden tutkiminen ristikkäisellä immunoelektroforeesilla osoitti, että immunisointi soluseinillä oli indusoinut vasta-ainetta antigeenejä A, B ja C vastaan. Tämä herkkä tekniikka ei paljastanut minkään muiden antigeenien vasta-aineiden olemassaoloa.

Vasta-ainevasteiden määrän määrittäminen suoritettiin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-tekniikalla, jota seurasi Voller et ai (1977, Flowline Publications) mukainen mikro-levytekniikka. Muoviset mikrotiitterivadit peitettiin puhtaalla antigeenillä C konsentraation ollessa n. 1^ug/ml.

Antigeeniin sitoutuneen apina-vasta-aineen määrä saatiin inkuboimalla antihumaanilla IgG:llä konjugoituna alkaliseen fosfataasiin (Sigma Chemical Co.) ja määrittämällä vastaava kromofoorin (p-nitrofenoli) tuotanto mittaamalla sen absorbanssi 12 77983 405 nm:ssä. Kuvassa 1 esitetään kontrolliapinoista ja immunisoitujen apinoiden ryhmästä saadun antiseerumin titrauksen tulokset. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Soluseinillä immunisoiminen aiheutti merkittävän antigeenin C vasta-ainetason nousun. On huomattava, että aikaisemmin on osoitettu, että myös immunisoimattomat kontrollieläimet kehittävät vasta-ainetta lajin S.mutans antigeeneille ajan myötä (Russell and Brighton, Infection & Immunity 1981, Voi. 35, ss. 741-744).

Taulukko 1

Laimennus Vertailu Immunisoitu 1/20 1,35+0,275 1,996+0,01 1/40 0,91+0,21 1,859+0,09 1/80 0,747+0,21 1,64+0,21 1/160 0,566+0,13 1,33+0,29 1/320 0,386+0,09 0,968+0,27 1/640 0,262+0,06 0,677+0,20 1/1280 0,18+0,05 0,430+0,13 1/2560 0,115+0,03 0,296+0,08

Kokeessa 19, jota Cohen et ai (1979) ovat kuvanneet, ryhmää kontrollieläimiä verrattiin sellaisten ryhmien kanssa, jotka oli immunisoitu lajin S.mutans kannan Ingbritt soluseinillä, kanta oli kasvatettu kemostaatissa laimennusnopeudella (D) 0,05 h "*. Karieksen edistymistä näissä eläimissä on esitetty kuvassa 2 ja se osoittaa, että sellaisten solujen seinät, jotka ovat kasvaneet nopeudella D = 0,05 h ^ antoivat merkittävän suojan. Tulokset on annettu taulukossa 2.

13 77983

Taulukko 2

Aika kokeen alusta (kk) Kariesmäärä + Standardlpoikkeama

Vertailu Intnunl soitu 11 0 0 16 1,0 + 0,45 0 18 1,4 + 0,75 0 21 2,4 + 0,97 0 25 3,2 + 1,88 0 29 3,4 + 1,63 0 31 3,6 + 1,60 0,33 + 0,3 34 5,2 + 1,67 0,33 + 0,3 36 5,75+1,86 0,33 + 0,3 45 7,25+2,62 1,33 + 0,29

Antigeenin C vasta-ainetasot seeruminäytteissä, jotka oli otettu kokeen useissa vaiheissa mitattiin ELISA-tekniikalla. Kokeen aikana havaittiin, että eläimillä, jotka oli immunisoitu nopeudella D = 0,05 h ^ kasvatettujen solujen seinillä oli kohonneet antigeenin C vasta-aineen tiitterit ja nämä tiitterit olivat merkittävästi korkeampia kuin vertailueläimillä. Edustavat tulokset, jotka saatiin kolme vuotta kokeen aloittamisen jälkeen otetuilla seeruminäytteillä on esitetty kuvassa 3. Tulokset on annettu taulukossa 3.

Taulukko 3

Laimennus Vertailu Immunisoitu 1/20 0,262 + 0,08 0,752 + 0,15 1/40 0,253 + 0,07 0,478 + 0,08 1/80 0,188 + 0,04 0,400 + 0,05 1/160 0,173 + 0,04 0,330 + 0,04 1/320 0,144 + 0,02 0,228 + 0,04 1/640 0,145 + 0,03 0,181 + 0,04

Immunisoitujen apinoiden vasta-ainevasteet

Soluseinillä immunisoitujen eläinten seerumi sisälsi vasta-ainetta antigeeniä C vastaan. Tällaiset vasta-aineet voidaan suoraan osoittaa immunodiffuusio- tai immunoelektroforeesiko-keilla käyttäen puhdasta antigeeniä C. Tällaista antigeeniä 14 77983 ei havaita immunisoimattomien vertailueläinten seerumissa.

On siten ilmeistä, että C:n vasta-aineen olemassaolo korreloi soluseinillä immunisoitujen apinoiden suojan kanssa.

Apinoiden immunisointikokeita usein rokotevalmisteita käyttäen on kehitetty näissä laboratorioissa yli 12 vuoden ajan. Näissä kokeissa käytetyt useiden eläinten seeruminäytteet on edelleen saatavilla ja niistä tutkittiin antigeenin C vasta-aineen esiintyminen. Tulokset on koottu alla olevaan taulukoon 4 ja ne vahvistavat C:n vasta-aineen ja suojan välisen riippuvuuden.

Taulukko 4

Koe n:o Rokote Karieksen Vasta-aine väheneminen C:lle 4 seiniä 100 % + 11 soluja 50 % + 14 soluja 60 % + 17 GTP (Glukosyyli- 0 transferääsi) 19 (30 kk) seiniä 100 % +

Claims (4)

77983 Patentti vaatimukset.

1. Menetelmä hammaskarieksen vähentämisessä tai estämisessä käytettävän antigeenivalmisteen valmistamiseksi baktee-rilajista Streptococcus mutans, joka menetelmä käsittää lajin S. mutans bakteerien kasvattamisen kasvatusalustalla soluviljelmän tuottamiseksi, ainakin soiuseinämien poistamisen mainitusta soluviljelmästä, jolloin jäljelle jää proteiini-liuos, ja antigeenivalmisteen erottamisen proteiiniliuoksesta, tunnettu siitä, että erotetaan proteiiniliuoksesta, anti-geenivalmisteena, yksi tai useampi antigeeniproteiini menetelmällä, johon sisältyy immunosorbenttiaffiniteettikromato-grafia käsittäen proteiiniliuoksen saattamisen yhteyteen im-mobilisoitujen vasta-aineiden kanssa, ei-toivotun materiaalin poispesemisen immobilisoidusta vasta-aineesta ja antigeeni-valmisteen eluoimisen immobilisoidusta vasta-aineesta, jolloin immobilisoidulla vasta-aineella on spesifisyyttä yhtä tai useampaa antigeeniproteiinia vastaan, joilla on seuraavat ominaisuudet: a) niitä on kantojen Streptococcus mutans geneettisen ryhmän I soluseinillä, o b) ne jäävät natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) 15 C lämpötilassa pestyjen soluseinien yhteyteen, c) niiden molekyylipa!no on 70 000 + 5 000 määritettynä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), d) ne tuhoutuvat proteolyyttisten entsyymien vaikutuksesta, e) niiden isoelektrinen piste on 4,45 + 0,24, ja f) ne eivät ristireagoi sydänkudoksen kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunosorbenttiaffiniteettikromatografiavaihetta seuraa vaihe, jossa immunosorbenttiaffiniteettikromatogra- fiästä saatu eluentti saatetaan hydrofobiseen vuorovaikutus-kromatografiaan kolonnissa ja proteiinit eluoidaan kolonnista, jotka proteiinit eluoidaan ammoniumsulfaattipitoisuuden laskevalla gradientilla samanaikaisesti lisäten etyyliglykoli-konsentraatiota välillä 0,6 ja 0,7 M ammoniumsulfaattia/15-20 % etyleeniglykolia. 16 77983

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunosorbenttiaffiniteettikromatografiavaihetta edeltää proteiiniliuoksen saattaminen yhteyteen immobilisoi-dun vasta-aineen kanssa antigeeneille A ja B, joilla on seu-raavat ominaisuudet: a) niitä on kantojen Streptococcus mutans geneettisen ryhmän I soluseinillä, b) ne jäävät natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) 10 g/l 20 minuutin keittämisen jälkeen soluseinien yhteyteen, c) niiden molekyylipainot ovat A: noin 29 000 ja B: noin 190 000 määritettynä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee-silla (SDS-PAGE), d) niiden isoelektriset pisteet ovat A: noin 4,3 ja B: noin 5,4 määritettynä isoelektrisellä fokusoinnilla akryyliamidigeel issä, ja antigeeni A:n tapauksessa antigeeniset proteiinit e) tuhoutuvat proteolyyttisten entsyymien vaikutuksesta, ja f) eivät ristireagoi sydänkudoksen kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine .