JPS58500948A - 「う」蝕症からの保護 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉｆ！＞蝕症からの 本発明は、細菌種見■二戸、ｏｃｏｅ工歴−叩殖見す−から誘導しつる抗原性蛋 白質と、試１症発生率を減少させるべきワクチン用の骸蛋白質な含有する製剤と に関する。

ｐ■ｕｌμ匹とじは＃商蝕症という疾病に於て重要な役割を果すと考えられ、又 この細菌に基づくワクチンを用いる自働免疫法によって実験動物の締蝕のレベル な減少させ得ることが、多数の研究所により【立証された。例えば、サッカロー スに富む食餌を与えられたＭａｅａｃａ　ｆｓ＠ｅｉｃｕｌａｒｉｓ　種のサル の場合、３０ｍｕｔａｎｓそのま＼又は細胞壁に富む物質のいずれかを用いて免 疫処断をすると、台西蝕を著しく減少させ得ることが判明した（　Ｂｏｗｅｎ　 、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　、第１２６巻。

１５９〜１６０頁、１９６９年；　Ｂｏｖｒｅｎ等、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｄｅｎ ｔａｌＪｏｕｒｎａｌ、第１３９巻、４５〜５０頁、１９７５年；　Ｃｏｈｅｎ 等、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、第１４７巻、９〜１４頁 、１９７９年）。蛋白質を破壊するためにトリプシンによって処理されたｓ８ｍ ｕｔａｎｓの細胞壁を用いることによっては、保護し得ないことも判明し、恐ら くは保護免疫処置に必要なものはＳ、ｍｕｔａｎｓの細胞壁の蛋白質成分でおる ことが判った（英国Ｃｈｅｒｔｍｅｙ州Ｒｓｅｄｂｏｅｋｍ社のＭ、Ｔ、Ｐａｒ ｋｅｒによって編集されたＣ６１ｍｍＨとＣｏｈｅＨのＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ　 ５ｔｒｅｐｔｏｅｏｅｃｉ　、　２１４頁、１９７９年）。

いかなる免疫処置法に於ても、保護剤に含まれる細菌成分を識別し得ることが重 要ヂある。このことに関する明白な理由の一つは、保護に必要な成分が存在する ことを保証するために。

使用前に製剤を更にテストできるということである。更に、保護抗原を精製する ことによって、ワクチンの調製が可能になり。

ワクチンから不必要な成分又は毒性成分を除外することができる。この細菌が、 哺乳動物の心臓組織と抗原的に交差反応する成分をもっていることが立証された ことによって、Ｓｍｕｔ見すの場合に問題が提起された（例えば、　Ｈｕｇｈ＠ ｓ等のＩｎｆｅｃｔ、ｐＩｍｍｕｎ、　、　＄　２７巻、５７６〜５８ｇ頁、１ ９８０年を参照）。

Ｓ、ｍｕｔａｎ＋ｓ中に前記心臓交差反応性抗原が存在することを意識すること によって、心臓交差反応性抗原をワクチン製剤から除外するために、これらの抗 原を同定し且つ特性づ轄るべきであることが推奨される、 英国特許出願公開第２０３３２２３Ａ号には、Ｓｍｕｔμｍの細胞機から単離し 得る蛋白質と、抗原性挙動を示す蛋白質の２ｓが記載されている。これらの抗原 性蛋白質のうちの一方（標識＃１表昭５８−５（１（１９４８（３）抗Ｊ［Ａ） が前記特許出願中に請求されｉおり、心臓組織との明白な寥差反応性を示す他方 の蛋白質（抗原Ｂ）は、ワクチン成分としてヒトに於ける使用は許容し得ないと 考えられる。抗原Ａ及びＢを下記の一連の基準によって定義することができる： ａ、抗原Ａ及びＢはＳ、ｍｕｔａｎｓの遺伝群ｘ７４株の細胞壁に存在する（　 Ｃｏｙｋｅｎｄａｌｌ　＊　Ｊ、Ｇｃｎ、Ｍｉｅｒｏｂ、ｉｏｌ、ｓ第８３巻、 ３２７頁、１９７４年）。この遺伝群は、Ｐｅｒｃｈ等（Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　５ｅａｎｄ、、　８８２巻、３５７頁、１９７４年）によ って特定されたように、抗１ｊｌｉ４　、　ｅ及び工の菌株を含む。

ｂ、抗原Ａ及びＢは、１０１１／ｌｊ　のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と 共に２０分間煮沸した後に、前記細胞ｅに残存する。

ｅ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル１気泳動法（８ＤＳ−ＰＡＧＥ）によって 分析した場合、これらの抗原の見掛の分子量は、八については約２９，０００　 であり、ＢＫついては約１９０，０００である。

ｄ、アクリルアミドゲル中での等電点電気泳動法に工って分析した場合、これら の抗原の等電点け、ＡＫついては約４．３で性蛋白質ｅは蛋白分解酵素によって 破壊され、抗原性蛋白質ｆは心臓組織と交差反応しなＩ／ｙ。

抗原性蛋白質のもう一つのＦｒ（抗原Ｃ）をＳ、ｍａｔａｎｇ遺伝群ＩＩ遺伝群 細１１株ら単離できることが判明した。この群の蛋白質は、単一特異的抗血清を 製造するのに使用することができ。

且つＳ、ｍｕｔａｎｇの細胞壁を用いるワクチン接種によってもたらされる薊蝕 症からの保護に関連すると思われる。この許の蛋白質は哺乳動物の心臓組織との 交差反応性を全く示さなかった、故に１本発明は、抗Ｊ［Ｃ（後に定義されるよ うな）を含む。

書西蝕症の減少又は予防に用いるための抗原製剤を提供する。前記製剤はＳ、ｍ ｕｔａｎ＋ｓから誘導しうる心臓交差反応性抗原を実質的に含有しない・ 抗ＮＡＣは、 記細胞を１０分間処理することによって、破壊さするか、又は抽出されるが、１ ５℃のＳＤＳ中で洗滌された細胞壁と会合して残存し。

ｅ、５ＤＢ−ポリアクリルアミドゲルを気詠動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分 子ｉ　７０，０００±５，０００’＠有し。

ｄ、蛋白分解Ｗ＃素によって破壊され、抗原性蛋白質群を包含する・ 本抗原製剤は、唯一の抗原性蛋白質として、抗原Ｃを含有し得る。然しなから、 別の具体例に於ては、本製剤は、別の非心臓交差反応性抗原性蛋白質、特に、以 前の英国特許出願公ＷＩＡ第本抗原製剤は、アジュバント（例えば水酸化アルミ ニウム）、安定剤及び製画剤等の適当な医薬上許容しうる希釈剤又は担体型の用 量で、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射又は粘膜下注対によって投与され得る 、免疫処ｔは、経口経路Ｙ介して、例えば抗原製剤ケ含有するカプセル乞えん下 するか、又は抗ＷＣを含有する含微剤処方もしくは錬歯磨処方な反彷使用するこ とによっても行われ得る。

本発明の抗原性蛋白質によってもたらされるｉ症からの保護は、身体の免疫応答 によって生成されるこの抗原に対する抗体に原因することが認識される。そのよ うな抗体は、例えば牝牛又はウサギに抗原（１−含む適当なＳ　ｍｕ’ｔａｎｇ 抗原製剤を注射し、次に瀉血を行う勢の従来技術によって、免疫性を与えるべき 被検者の体外で発生させ得る。又、このようにして製造され。

且つ通常の医薬上許容しうる希釈剤又は担体を含む抗体製剤の投与はｄ１蝕症を 予防又は減少させる際に有効である。従って、本発明は、抗原Ｃの抗原決定基に 対して特異的な抗体製剤又はこの抗ＷＫ対する抗体を含有する抗体製剤を包含す る。本発明は１通常の希釈剤又は担体と共に上述の抗原製剤を含む医薬組成物、 及びそのような希釈剤又は担体と共に抗ｗ、Ｃｒｃ対する抗体を含む医薬組成物 をも包含する。

抗原ＣはＳ、ｍｎｔａｎｓ＋の細胞壁上及び細胞を含まないＳ、ｍｕｔａｎｓの 培養Ｐ液中の双方に存在する。細胞構成物から蛋白質を除去するために用いられ る通常の技術を変形することによって、Ｓｏｍｕｔａｎｓの細胞壁から抗原Ｃを 抽゛出することができるけれども、精製方法を妨害しそうな物質を比較的僅かし か一般に含有しないＳ、ｒｎｕｔａｎｓの細胞を含まない培養ｒ液又は全細胞抽 出物のいずれかから抗原Ｃを分離するのが軒ましい。

又は予防に使用するための抗原Ｃを含む抗原製剤を製造する方法が提供される。

前記製剤は、　ｔｒｅ　ｔｏｃｏｅｅｕｓ　ｍｕｔ４ｎｓから誘導しうる心臓交 差反応性抗原を実質的に含まず、前記方法は、適当な培地中で細動、」すｊ１リ ヒ！す把１コリ１υリー乞成長させ、蛋白質溶液を残すために、得られる培養菌 から少くとも細胞壁を除去し、及び前記蛋白質溶液から必要な（所望とする）抗 原製剤を分離することから成る。

適切なゲル濾過物質、イオン交換物質又は疎水相互作用物質を用いるカラムクロ マトグラフィーにかけることによって、分離を行い得るけれども、抗原Ｃに対す る固定化抗体上のアフイニテイクロマトグラフイーにかけるステップを包含する 分離法を用いるのが好ましい。固定化抗体は、抗原Ｃに対する単一特異的抗体、 又は細胞のハイブリダイゼーション技術によって調製された抗Ｊ［Ｃに対する１ 種又は２ｓ以上の単クローン性抗体のいずれかであり得る、 抗原Ｃと抗ＷＡの混合物を必要とする場合には、今度は、固定化抗体上σ）アフ イニティクロマトグラフイーにかけることによってこの２つの抗原を別々Ｋｖ！ ４製して、次にこわらを組み合せ得る、又は抗−抗原Ｃと、抗−抗原への固定化 抗体との組み合せのアフイニテイクロマトグラフイーにかけることによって。

一段階で混合物を調製し得る。

培地は、トッド−ヒユーイツトプロス（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｊｔｔｂｒｏｔｈ）、 　）リプトン／イースト抽出物又は化学的に定義された培地尋のＳ０ｍｕｔａｎ ｓ用の任意の通常の培地であり得る。その後の精製を容易にするた込に、化学的 に定義された培地が好ましい。培養のすべての段階に於て、抗原Ｃが成長培地中 に放出される。細胞はバッチ式培養で成長させ得、好ましくは初期の定常段階（ 典型的には、３７℃で１５〜２５時間）で得られる。

別に、細胞を連続培養で、好ましくは約０．０１〜０．１／時間、％に約０，０ ５７時間の稀釈速度で成長させ得る。

蛋白質溶液は、全細胞を除去することによって得らｊた培養ｆ液、又は細胞壁と 破片とを含まない細胞抽出物から成り得る。

別に、蛋白質溶液は、全培養菌の細胞を粉砕し、次に細胞壁と破片を除去するこ とにより得られたこ４らの混合物であり得る。

ｈ胞壁を全細胞又は廟解後のフラグメントのいずれかとして、遠心分離又はｔ過 等の通常の方法によって除去し得る。

次に、絡付図面を参照しながら、単なる実施例によって１本発明による典型的な 生成物と方法とを説明する。添付図面に於て。

第１図は、４匹の対照サルと、ｈ１１！！１壁を用いて免疫性を与えられた（１ ９７５年Ｋ　Ｂｏｖｅｎ　Ｉ４によって記載された（実験Ｃ）ように）４匹のサ ルに於ける抗原ＣＫ対する血清ＩｇＧ　抗体のＥＬＩＳＡ法による力価測定を、 血清希釈に対して４０５　ｎｍ　Ｋ１ｆｆるｐ−ニトロフェノールの吸光度をプ ロットすることによって説明し。

の発生と、５匹の対照動物（１９７９年ｒｃｃｏｈｅｎ　尋によって記載された （実験１９　）、＄ように）の永久歯に於ける−−の発生とを比較し、及び 第３図は、４匹の対照サルと、細胞壁を用いて免疫性を与えられた（１９７９年 にＣｏｈｅｎ　等り（実験１９）に記載されたように）４匹のサルに於ける抗原 Ｃに対する血清ＩｇＧ　抗体のＥＬＩＳＡ法による力価測定を、血清希釈に対し て４０５　ｍｍ　Ｋ於ｆｆるｐ−ニトロフェノールの吸光度をプロットすること によって説明する。

周知のＩｎｇｂｒｉｔｔ菌株のＳ６ｍｕｔａｎｓ＋が用いられた。この菌株は、 Ｋｒａｓｓｅによって記載（Ａｒｅｈｓ、Ｑｒａｌ、Ｂｉｏｌ、第１１巻、４２ ９〜４３Ｊ６頁、１９６６年）され、又この１株はＣｏｙｋｅｎｄａｌｌＫＡつ て遺伝群Ｉとして分類され、Ｐａｒｅｈ　等によるとＫＩＮ型二として分類され ている。この菌株は、スコツトランドのアバ−ディンにあるＮａｔｉｏｎａｌ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＩｎｄｕ＠ｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａに、ＮＣ ｌＢ１１５１６として寄託された。ロンドンのコリンダールにあるＮａｔｉｏｎ ａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ’ｒｅｓから得た菌株 （ＮＣＴＣ１０４４９）を用いて類似の結果が得られた。この菌株はＩｎｇｂｒ ｉｔｔｌ１株と近縁関係にある。

この細菌を６００ｗＬｔの恒成分培養槽（ｃｈｅｍｏｓｔａｔ　）　中のＥｌｌ ｗｏｏｄ　郷に↓って記載された培地（Ａｒｅｈｓ、０ｒａｌ　Ｂｉｏｌ−。

第１９巻、６５９〜６６４頁、１９７４年）に於て０．０５／時間の希釈速度で 成長させた、この場合、水酸化カリウムを自動的に添加することＫよってｐＨを ６．５に維持した。細菌を遠心分離によって捕集し、生理食塩水中で洗滌し、自 己融解酵素を不活性化するために、６０°で３θ分間加熱した。次に、Ｍｉｅｋ ｌｅの組織ジスイッチグレーター中でＢａ１ｌｏｔｉｎｉ　の１２号ガラスピー ズな用いて振盪することによって細菌を破壊した。破壊された細胞なｆ過によっ てガラスピーズから分離しｓ　Ｐｏｔｔｅｒの組織ホモジナイザーによってＳＤ Ｂ　水溶液Ｃ１ｏ９／ｌ）Ｋ再び懸濁させるＩＩＩＫ、水で２回洗滌し、Ｉ　Ｍ ＮａＣＩを用いて２目洗滌した。低速遠心分離によって細胞壁から細１をそのま ＼分離し、細胞壁を生理食塩水と水で何回も洗滌した螢に、凍結乾燥した。

トッド−ヒユーイツトブロス（Ｊ、Ｐａｔｈ、ａｎｄ　Ｂａｅｔ＠ｒｉｏｌ　ｓ 第３５巻、９７３〜９７４頁、１９３２都）又はグルコースを含有する培地、ｐ Ｈを制御したトリプトンとイースト抽出物中でバッチ方式で成長させた細■を用 ｒ、　Ｂｒａｔ＋ａ　ホモジナイザー中で細胞を破壊するか、さもなければ細胞 を室温で比較的長時間ＳＤ８　による抽出にかけるかして、同様の結果を得た。

ｚ　Ｆ）ＩＩｌ 凍結乾燥した細胞壁を１ＩＩｌｉｉｌ／ｄの濃度になるように無−生理食塩水Ｋ ｌｌ濁して、サル（下記参照）又はウナギに免疫性を与えるために使用した。ウ サギに、３週間間隔で３回１０％の水酸化アルミニウムアジュバントを含有する 生理食塩水中の細胞壁ｌＩＩｇをそれぞれ筋肉内に接種した。その後、ウサギは 。

鍛後の注射後１遇関目に、心臓穿１１ｉ１３によって採血された。

λ　疫　動 前述の如く調製した細胞壁に対する抗血清が、抗原Ｃの特性表示と精製の双方に 使用された。Ｉｎｇｂｒｉｔｔ　１１株（又は近縁−抹）の培養Ｐ液からの蛋白 質が、Ａｘｅｌｓｅｎ等（’　Ａ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｑｕｍｎｔａｔｉｖｅ　 Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈａｒｖｓｉｓ″、　０ＢＬＯｎ　１９７３年） によって記載された方法に従って行った交差免疫電気泳動実験に於て抗原とじ【 用いられ、且つ細胞壁に対する抗血清に入れて電気泳動にかけられた場合、３つ の沈降ピークが観察された。

抗Ｊ［Ａ及びＢ又はム及びＢに対する単一特異的抗血清のいずれかを含む中間ゲ ルによる中間ゲル技術（Ａｘ＠ｌ＠ｅｍ　等、７１頁）を用いる実験によって、 ２つの沈降ピークは抗原Ａ及びＢに基因するものであり、第３番目のピークは無 関係な抗原、即ちＣに基因することを示し得た。

抗原Ｃの特性を究明するために、交差電気泳動法によって試験するに先立って、 抗原製剤を各種の処理にかけた。蛋白分解酵素トリプシン又はプロナーゼ２００ 　ＩＬＩＩ／Ｍｉと共に３７℃で３時間培養することによって、抗原Ｃが破壊さ れることが判った、従って、抗原Ｃは本来蛋白質である。抗原Ｃのサンプルが。

５．０未５雨のＰＨを示す酸Ｓ液に３時間さらされることによっても破壊されて 、抗原Ｃが酸に不安定であるという示唆と一致した。

抗原Ｃの物理的特性に関する情報が、交差免疫電気泳動法によって得られた。そ の場合、最初の大きさによる分離は、分子量に応じて蛋白質を分離するための８ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（方法の詳細は、Ｒｕ５ｓｅｌｌのＪ 、Ｇｅｎ、Ｍｉｔｒｏ　−ｂｌｏｌ、＊第１１４巻、１０９〜１１５頁、１９７ ９年にある）、又は蛋白質の電荷に応じて蛋白質を分離するアガロース中での交 差免疫等電点電気泳動法（Ｒｏｓｓｎ及びＡｍａｎのＪ、Ｉｍｍｔ＋ｎｏｌ。

Ｍ＠ｔｈ、、　１９７９年、２８、ｌ）によって行われた。その結果から、抗原 Ｃは７０，０００±５，０００（ＳＤ）の見掛けの分子量と、４．４５±０．２ ４の等電点とを示すことが判った。

細胞壁に対する抗血清又は純粋な抗原Ｃ（下記参照）に対する抗血清を用いる免 疫拡散実験によって、抗原Ｃを検出することもできた。従って、Ｃと同一の抗原 が、抗原ｗｃのＳｏｍａｔｔｔＩｍの６種の別の菌株によって産生され、又抗Ｊ ［型！及び工の典型的な菌株によっても産生されることを立証するために、免疫 拡散法が用いられた。

（抗原Ｃのｎｊｌ 既に示されたデータから、抗原Ｃは、細胞壁上又は細胞を含まない培養ｆ液中の 双方に存在することが判る。適切な方法によって細胞壁から抗原Ｃを抽出するこ とができるけれども、これが、精製方法を妨害すると思われ５る比較的少量の物 質を含有するので、培養ｆ液から抗原Ｃを精製するのが好ましい。

Ｎ、ｔば、適切なゲルパーミェーションマトリックス及びイオン交換でトリック スを用諭るカラムクロマトグラフィーという日常の実験室的方法によって抗原Ｃ を精製し得るけれども、免疫吸着剤アフニティクロマトグラフイーによって抗原 Ｃを最も好適に単離することかできる。従って、この技術に基づく実験を以下に 説明する。

ａ、Ｓ、ｍｕｔａｎｇのＩｎｇｂｒｉｔｔ　１株を半特定培地（Ｒａｓ＋ｓｅｌ １ｇＦＥＭ８　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、、　ｆｌ　６巻、１９７〜１９ ９頁。

１９７９年）中で初期定常段階まで収長させ、遠心分離にかけ１次にガラス繊維 を通してｒ遇することによって細胞を除去した。細菌の生育を抑制するために、 アジ化ナトリウム（最終濃度０．０２慢）と共にプロテアーゼ阻ｌ剤フッ化フェ ニルメチルスルホニル（ＰＭＳ　Ｆ　）　ヲ１　ｍＭのＲ１１１！爵度で皺加し た。次に、グルコシル転移酵素、及び次の免疫吸着剤カラムに別の方法で結合し 得る別のデキストラン−結合蛋白質（ＲｕｓＩｅｌｌ、ＦＥＭＳ　Ｍｉｅｒｏｂ ｉｏｌ。

Ｌｅｔｔ、、　１９８１年、１１，２７９）を除去するために、不ｍ＝ｙルコー スポリマーミュタン（１ｎｓｏｌｕｂｌ＠ｇｌｕｃｏｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ｚ ｕｔａｎ　）と、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉ　ｃｒｏｂｊｏｌ　＋ｊ第１１２巻、１９７〜２０１頁、１９７９年）によ って記載されるように実質的に調製されたアガロースゲルビーズ（５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ　）とを含むアフイニテイクロマトグラフイーカラムにＰ液 を通した。次に培養Ｐ液を。

１）抗原ＡＫ対する単一特異的抗体、 腸）抗原ＢＫ対する単一特異的抗体。

１）ａｌｌ胸壁 を含む一連の３個の免疫吸着剤カラムに順次通した。

このよう（して、第３番目のカラムは抗ｊ［Ａ、Ｂ及びＣに対する抗体を含んで いた轢れども、抗原Ａ及びＢは。

第３番目のカラムに達する以＠Ｃ試料から除去されるので、抗原Ｃのみが保持さ れ、次に３Ｍのチオシアン酸ナトリウム勢の適切な試薬（よつ″Ｃ溶離され得た 。標準的な方法によって、免疫吸着剤カラムを調製した。この場合、製造元の推 奨する手法に従って、血清の免疫グロブリンＧｊｉ分を架橋アガロースビーズ（ Ｐｈａｒｍａｅｉａ　ＦｉｎａＣｈ＠ｍ１ｃａｌ−社のＣｎＢｒ−活性化セファ ロース４Ｂ）Ｋ結合させた。

次に、前述の方法で調製した抗原Ｃを用いて、単一特異的抗血清を生じさせた。

この抗血清は、一段での抗原精製を行い得るＣ−＠Ａ性免疫吸着剤カカラの構成 を可能和した。

ｂ、抗＊　ｃ　ｔ’ｓｍするための別の方法として、免疫吸着剤アフイニテイク ロ！トゲラフイー〇次に疎水相互作用クロマトグラフィーにかける方法が用いら れた。この方法の場合、先づ、ミュタン（ｍａｔａｎ　）とセファロースとを含 むアフイニテイカ之ムに培養Ｐ液を通し１次に細胞壁に対する抗体を含む免疫吸 着剤カラム（通した。抗Ｊ［Ａ。

Ｂ及びＣが、そのようなカラムによって保持され、３Ｍチオシアン酸ナトリウム の０．０５　Ｍ　トリスＭＣＩ　緩衝液（ｐＨ７，５）で溶出され得た。チオシ アン酸ナトリウムを透析によって除去し、抗原性蛋白質溶液を１Ｍ硫酸アンモニ ウムを含有する０、０５Ｍ）リスＨＣＩＩＩ街液（ｐＨ７，５）中で平衡化した 。次にこの試料を、フェニルセファロースＣＬ　−４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｅｉａ 　Ｆｌｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を含むクロマトグラフィーカラムに適用し た。次にカラムによって保持された蛋白質を、硫酸アンモニウムの減少濃度勾配 と同時にエチレングリコールの増加＃１度勾配（最終濃度はそれぞれ０嗟及び５ Ｑチ）＃ＩＣよって溶出した。０．６〜０．７Ｍ硫酸アンモニウム／１５〜２０ チエチレングリコールの間で抗原Ｃが抗Ｊ［Ａ及びＢよりも先に溶出した。

次に、前述の方法で調製した抗Ｊ［Ｃを用いて単一特異的抗血清を生じさせた。

この抗血清は、一段での抗原精製を行い得るＣ−特異性免疫吸着剤の構成を可能 和した。

細胞壁を用いて免疫処置することによる１蝕に対する保護上述のようＫｗＩ４製 したＳ、ｍｔ＋ｔａｎ＠のＩｎｇｂｒｉｔｔ■株の細胞壁を用いて免疫性を与え ると、サル（Ｍａｅａｅａ　ｆａｇｅｌ　ｅｕｌａｒｉｍ　）では醸、蝕から保 護されることが、２つの別個の実験で判明し。

これらの実験の詳細は、Ｂｏｖｅｎ等（Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｊｏｉ ＋ｒｎａｌ第１３９巻、４５〜５ｇ頁、１９７５年）及びＣｏｈｓｎ　１１！！ （Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　＊　第１４７巻、９〜１４ 頁。

１９７９年）によって発表された、 Ｂｏｗｅｎ　吟によって記載された実験Ｃに於ては、鹸蝕促遂食餌で飼育された ５匹の対照動物が、細胞壁を用いて免疫性を与えられた４匹の動物と比較された 。この実験開始後５年目に、対照動物中の共蝕障害の全数は６４件であり、一方 、免疫処置群に於ては全数で僅か４件の障害が検出された。この保護は少くとも ９年間続行された（Ｃｏｈｓｎ郷、１．９７９年）。交差免疫電気泳動法による 実験開始後５年目に実験動物からの血清サンプルを試験することによって、細胞 壁を用いて免疫性を与えると、抗原Ａ、Ｂ及びＣ［対する抗体が誘発されること が判明した。この鋭敏な方法は、それ以上の抗原に対する抗体が存在することを 示すことができなかった。

抗体応答の定量は、エンザイムオムノアツセ（（ｅｎｚｙｍｅ　−１１ｎｋａｄ 　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓａａｙ、ＥＬＩｓＡ）　Ｋよって行われ、 その次［■ｏ１１ｅｒ等（１９７７年、Ｆｌｏｖｌｉｎｅ出版社）のマイクロプ レート法によって行われた。約１　ｘｉ／Ｍ　ｆ’）　濃度の純粋な抗原Ｃを用 いてプラスチック製のｉイクロタイタートレイを被覆した。

アルカリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ＠ｍ１ｅａ１社）に結合させた抗 −ヒ）ＩＩＧ　と共に培養し、４０５　ｎｍで発色団の吸光度を測定することに より発色団（ｐ−ニトロフェノール）の生成量を測定することによって、抗原に 結合したサルの抗体量を定量した。第１図は、サルの対照群とサルの免疫処置群 からの抗血清について力価を測定した結果を示す。結果を表１＃ｃ表示する。細 胞壁を用いて免疫性を与えることによって、抗原Ｃに対する抗体のレベルが著し く増加した。非免疫処置対照動物でさえ年令と共［Ｓ、ｍｕｔａｎｓ抗原に対す る抗体を発生することが以前から判っていた点に注目され得る（Ｒｕｓｓｅｌｌ 　ａｎｄＢｅｉｇｈｔｏｎ　、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　＆　Ｉｍｍ、ｔ＋ｎｉ　 ｔｙｓ　Ｉ！　３５巻、７４１〜７４４７ｊ、１９８１年）。

１／２０　１λ５±０ｊ７５　１．９９６±０．０１１／４０　０，９１±０λ １　１，８５９±０．０９１７８０　０．７４７±、０，２１　１．６４±（ｊ 、２１１／１６０　０，５６６±０，１３　１，３３土０ｊ９１７３２０　Ｇ、 ３８ｇ±０．０９　０，９６８±０．！７１／６　ｊＯ０２６２十０．０６　０ ．６７７±０．２０１７１２８０　０．１８±０．０５　０，４３０土０．１３ １／２５６０　０．１１５±０，０３　０λ９６±０．０８Ｃｏｈｓｎ　等（１ ９７９年）Ｋよって記載された実験１９に於ては、対照サル群が、０．０５／時 間の希釈速度■で恒成分培養槽中で成長させたＳ、ｍｕｔａｎｓのＩｎｇｂｒｉ ｔｔ　菌株から調製した細胞壁によって免疫性を与えられた群と比較された、こ れらの動結果を表２に表示する。

表　２ １６１．０±０．４５０ １８　１．４±０．７５　０ ２１　２．４±０．９７　０ ２５３２±１．８８　０ ２９　３．４±１．６３　０ ３１　３．６±１．６０　０．３３±０．３３４　５．２±１．６７　０．３３ 土０コ３６　５．７５±１，８６　０．３３±０コ４５　７ｊ５±２Ａ２１，３ ３±０２９実験の各種の段階で採取された血清サンプル中の抗原ＣＫ対する抗体 のレベルがＥＬＩＳＡ法によって測定された。この実験を通じて、ｐ　＝　０． ０５７時間で成長させた細胞からの細胞Ｕによって免疫性を与えられた動物は、 抗原Ｃに対する抗体について高い力価を示し、これらの力価は対照動ＩＩＩＪに 於けるよりも可成り高いことが判明した。実験開始後３年目に採取された血清サ ンプルを用いて得られた代表的な結果を第３図に示す。これらの結果を表３に表 示する。

抗＠ＣＫ対する抗体の高レベルでの誘発と猷・蝕からの保膜との関に強い相関関 係が存在する。

１７２０　０．２６２±０．０Ｓ　Ｏ，７５２±０２１５１７４０　０．２５３ ±０．０７　０，４７Ｂ±０．０８１７１４０　０．１８１：０，０４　０，４ ００±０．０５１／１６０　０，１７３±０．０４　０，３３０±０Ａ４１／３ ２０　０，１４４±ｏ、ｏｚ　ｏλ２８±０．０４１／６４０　０．１４５±０ ．０３　０Ｊ８１±０．０４免疫処置されたサルの抗体応答 細胞壁によって免疫性を与えられた動物からの血清には抗原Ｃ［対する抗体が含 まれ【いた。純粋な抗原Ｃを利用する免疫拡散実験又は免疫電気原動実験（よっ て、そのような抗体を容易に立証することができた。免疫処置されなかった対照 動物からの血清の場合には、そのような抗体を観察することができなかった。こ のようにして、ＣＫ対する抗体の存在が、細胞壁によって免疫処置されたサルの 保護と相互に関連することは明白である。

これらの研究所に於て、１２都以上の閏、各種ワクチン製剤によるサルの免疫処 置＃ＩＣ関する実験が進められた。これらの実験に於て参数の動物から得られた 血清サンプルは今でも利用することができる。又これらの血清サンプルは、抗Ｊ ［Ｃ［対する抗体が存在すること（ついて試験された。結果を表４に要約する。

これらの結果は、ＣＫ対する抗体の存在と保護との間の相関関係を確実なものに する。

実験番号　ワクチン　−の減少　ＣＫ対する抗体４　細胞壁　１００％　＋ １１　細胞　５０哄　十 １４　細胞　６０−＋ １７　ＧＴＰ　Ｏ− （グルコシル転移酵素） １９　細胞壁　１００％　や （３０ケ月） 血清のｙ＃軌

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．４ａｌＳｔｒｅすｏｅｏｅｅｕｍ二４すΔシー遺伝群■菌株の細胞壁上に存 在し。 ｌｂｌ沸騰ドデシル硫酸ナトリウＡ（ＳＤＢ）水溶液（１０ｙｒｒｖ’ｌ　）を 用いて前記細胞壁を１０分間処理することによって、破壊又は抽出されるが、１ ５℃のＳＤＢ中で洗滌された細胞壁と会合して残留し。 ＋ａ　Ｓ　Ｄ　８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法に よる分子量７０，０００土ｓ、ｏｏｏを有し、ｌｄｌ蛋白分解酵素によって破壊 され、１６１４．４５±０．２４の等電点を有し、及びｌｆｌ心臓組織と交差反 応しない 抗原性蛋白質を含む、踪蝕症の軽減又は予防に用いる抗原製剤であって、旦ｖジ お１どμｍ２」μじから誘導し得る任意の心臓交差反応性抗原を実質的に含まな い抗原製剤。 ｒｅ　ｅｏｅｃｕ！＋　ｍｕｔａｎｓ遺伝群Ｉ［株から誘導されることを特徴と する請求の範囲１［記載の抗原製剤。 ｒｅ　ｅｏｅｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ抗原型ｅｌ１株から誘導されることを特徴と する請求の範囲２に記載の抗原製剤。 し、 （ｂｌ　１０１ｍ／ｌのＳＤＢと共に２０分間煮沸後に、前記細胞壁上（残存し 、 ｌｅｔ　８　Ｄ　Ｂ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＢ−ＰＡＧＥ）法 による分子量約２９．０００を有し。 肯約４．３の醇電点を有し、 （・）蛋白分解酵素によって破壊され、及びｌｆｌ心臓組織と交差反応を行わな い 抗原性蛋白質を更に含むことを特徴とする請求の範囲ＩＫ記載の抗原製剤、 ＆　医薬上許容し得る希釈剤又は担体と共に、無毒性有効量の有効成分を含む哺 乳動物の踪蝕症の軽減又は予防に用いるための医薬製剤であって、前記有効成分 が請求の範囲ＩＫ記載の抗原製剤、請求の範囲４に記載の抗原製剤及びこれらの 抗原製剤のいずれかに対する抗体から成る群から選択されてなる医薬製剤。 ６、注射又は経口投与に適する形態にあることを特徴とする請求の範囲５に記載 の医薬製剤。 ７、　アジュバントとして水酸化アルミニウムを含有することな特徴とする請求 の範囲６に記載の医薬製剤。 ＆　口内に局所的に適用するに適する形ＩＩｌにあることを特徴とする請求の範 囲５に記載の医薬製剤。 ９、錬歯磨又は含轍剤の形Ｓにあることを特徴とする請求の範囲８に記載の医幣 製剤。 １（Ｌ　適当な培地中で５ｔｒｅ　ｔｏｅｏｅｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ種の細菌を 成長させ、蛋白質溶液を残すために、得られる培養菌から少くとも細胞壁を除去 し、及び前記蛋白質溶液から必要な抗原製剤を分離することから成る請求の範囲 ＩＫ記載の抗原製剤の製造方法。 １１、１８１　ｌ竪叶υ工竺」土！すμＶ遺伝群Ｉ菌株の細胞壁上に存在し。 １１ｍ１沸騰ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　水溶液（１０？ル９）を用い て１０分間前記細胞壁を処理することによって破壊され又は抽出されるが、１５ ℃のＳＤＳで洗滌された細胞壁と会合して残留し。 ＩｃＩ　Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法 による分子量７０，０００±５，０００を有し、ｌｄｌ蛋白分解酵素によって破 壊され。 １６１４．４５±０．２４の等電点な有し、及びｌｆｌ心臓組織と交差反応しな い 抗原性蛋白質に対する固定化抗体上でアフイニテイクロマトグラフイーにかける 段階を含む方法によって、抗原製剤を蛋白質溶液から分離することを特徴とする 請求の範囲１０＃ｃ記載の方法。 １２　適当な培地中で５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ種の細菌を成 長させ、蛋白質溶液を残すために、得られる培養菌から少くとも細胞壁を除去し 、及び前記蛋白質溶液から必要な抗原製剤を分離することから成る請求の範囲４ に記載の抗原製剤の製造方法であって、 ｌａｌ　５ｔｒｅｐｔｏｅｏｅｅｕｓ　ｍｕｔａｎｇ遺伝群■菌株の細胞壁上に 存在し、 ＋ｂｔ沸騰ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　水溶液（１０ｙｒｖ’ｌ　）を 用いて１０分間前記細胞壁を処理することによって、破壊又は抽出されるが、１ ５℃のＳＤＳを用いて洗滌された細胞壁と会合して残留し。 ＩｃＩ　Ｓ　Ｄ　Ｂ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法 による分子量７０，０００±５０００を有し。 ｌｄｌ蛋白分解酵素によって破壊され。 （・１４．４５±０．２４の１１℃亀点を有し、及び（１）心臓組織と交差反応 しない 抗原性蛋白質と。 １ａｌＳｔｒｅ　ｔｏｃｏｅｃｕｇ　ｍｕｔｓｎｓ遺伝許Ｉ―株の細胞壁上に存 在し。 ｌｂｌｌＯｙｍ／ｌのＳＤＳと共に２０分間沸騰した後、前記細胞壁上に残存し 。 ＩｃＩ　Ｓ　ｐ　８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法 による分子量約２９，０００を有し、ｆｄｉ約４．３の等を点を有し。 神）蛋白分解酵素によって破壊され、及びｌｆｌ心臓組織と交差反応しない 抗原性蛋白質の双方に対する固定化抗体上のアフイニテイクロマトグラフイーに かりる段階を含む方法によって、蛋白質溶液から抗原製剤を分離することから成 る方法。 】１　細菌を０．０１〜０．１／時間の稀釈速度で成長させることを特徴とする 請求の範囲１（１ｍ記載の方法。 １１　請求の範囲５に記載の医薬製剤の無毒有効ｔを投与することから成る哺乳 動物の鴬７蝕症を制御する方法８１５請求の範囲６に記載の医薬製剤の無毒ワク チン接種量を投与することから成る哺乳動物の哩１蝕症予防方法。