JP3711289B2

JP3711289B2 - グラム−陰性球菌のリポオリゴ糖が除去された外膜蛋白質の製造および使用

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Publication number: JP3711289B2
Application number: JP12203294A
Authority: JP
Inventors: ゲイリー・ダブリユー・ズロトニク
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2020-11-02
Also published as: CA2123355C; EP0624376B1; DE69423383T2; DE69423383D1; US6921537B2; GR3033469T3; DK0624376T3; KR100355961B1; US20020136741A1; JPH0819396A; EP0624376A1; US6355253B1; ES2145072T3; ATE190502T1; CA2123355A1; PT624376E

Description

【０００１】
【背景】
バクテリア性髄膜炎は、軟膜中およびそれの隣接部分でバクテリアの成長により引き起こされる中枢神経系の炎症性疾病である。それは子供および若年成人に影響を与える急性であり且つしばしば致死性である感染性疾病である。ほとんどの世界的なバクテリア性髄膜炎の共通原因の一つは髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の感染である。多くの人間は疾病を示さずに集落化されているため、このバクテリア感染の発生は予期できない。一部の人間は一時的保菌者であるが、他の人間は慢性保菌者であり、髄膜炎菌を多かれ少なかれ連続的にまたは散発的に放出する。感染過程中に、殺バクテリア性抗体が感染人間の中で製造され、それがその人間をその後の感染に対してはっきり免疫化させる（ゴールドシュナイダー(Goldschneider)他、１９６９）。この観察がバクテリア性抗体を基にしたワクチンが髄膜炎に対して有効であるかもしれないという期待を生じた。
【０００２】
髄膜炎菌はグラム−陰性球菌(Gram-negative coccus)である。特徴的には、それは内側の血漿膜、血漿周辺空間(periplasmic space)、および外膜または細胞壁からなっている細胞膜により取り囲まれている。外膜はリポオリゴ糖（ＬＯＳ）分子、脂質、蛋白質および多糖からなっている。感染人間中で製造される保護抗体は被膜性多糖および外膜蛋白質の両者に対して向けられることが見いだされた（フラッシュ(Frasch)、１９８３）。
【０００３】
髄膜炎菌の菌株は被膜の型（抗原的および生化学的）に従い血清群に分類される。最近認識された血清群には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２８Ｅが包含される。群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｗ１３５およびＹの血清群特異性に関与する多糖が精製されている。血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５からの精製された被膜性多糖を基にした４価のワクチンが開発されている（ハンキンズ(Hankins)他、１９８２）。しかしながら、２才以下群すなわち髄膜炎菌感染の危険の最も多い年令群の免疫原性の欠如のために、このワクチンの使用は限定される。群Ｂ髄膜炎菌の被膜は、担体蛋白質と結合されている時でさえ、全ての年令群において免疫原性が劣っている。この被膜に対する抗体が胎児および新生児の脳組織と交差反応するかもしれないという証拠がある。
【０００４】
髄膜炎菌の主要な外膜蛋白質（ｏｍｐ）は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびペプチドマップ分析（ツサイ(Tsai)他、１９８１）上での泳動（Ｍｒ）により測定されて、構造的同様性を基にして５種の綱に分けられている。これらの蛋白質綱の中では、綱１蛋白質がワクチン製造に最も有利であるようである。それは髄膜炎菌のほとんどの単離物の中で発現されそして菌株の亜型特異性を基にしている。
【０００５】
外膜蛋白質を基にしたワクチンを製造するためのいくつかの試みがなされている。被膜性多糖および外膜蛋白質または小胞複合体中の外膜蛋白質だけからなるワクチンが試験されている。これらのワクチンの中の１種だけが５７％以上有効性であると報告されている（シエラ(Sierra)他、１９９１）。
【０００６】
外膜および被膜の両者を基にしたワクチンの開発における他の意義ある問題はバクテリア性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の存在であり、それが人間の中で毒性副作用を生ずる。リポオリゴ糖はバクテリア性内毒素とも称される。低量のリポオリゴ糖は発熱を引き起こす可能性があり、そして高いリポオリゴ糖量は患者の全身的瘠痩（悪液質）を生じる可能性がある。多くの最近の外膜複合体ワクチンは１０−７０μｇ／ｍｇ蛋白質の残存リポオリゴ糖水準を有する（ゾリンガー(Zollinger)、再調査に関する１９９０）。従って、髄膜炎菌により引き起こされるバクテリア性髄膜炎用の、そして特に群Ｂ菌株により引き起こされる疾病用の安全で且つ有効なワクチンに対する要望が存在する。
【０００７】
【発明の要旨】
本発明は、ある種の界面活性剤を用いる連続的抽出によるグラム−陰性球菌の外膜からのリポオリゴ糖（ＬＯＳ）の効果的な除去方法に関するものである。バクテリア性内毒素とも称されるリポオリゴ糖はワクチン中での例えば発熱の如き望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。ここに記載されている如く、該方法は極端に低いリポオリゴ糖含有量を有するが免疫原性を保有する外膜および可溶性外膜蛋白質を製造する。これらのリポオリゴ糖が除去された外膜生成物はさらに殺バクテリア性抗体を誘発することも示されている。従って、リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質を含んでなるワクチンが提供され、それらは髄膜炎およびグラム−陰性球菌により引き起こされる他の疾病に対する治療および予防において有用であると期待される。
【０００８】
ここで特記載されるものは髄膜炎菌の外膜生成物である。本方法により髄膜炎菌から製造される外膜生成物は約０.０１％（重量／重量全蛋白質）より少ないリポオリゴ糖含有量を有しそして動物中で殺バクテリア性抗体を誘発することが示される。その結果、髄膜炎菌に対するワクチンが提供され、それらは免疫学的に有効でありそして相対的にバクテリア性リポオリゴ糖を含んでいない。特に興味のあるものは、現在有効なワクチンがない髄膜炎菌の血清群Ｂ菌株に対するワクチンである。
【０００９】
本方法は他のグラム−陰性球菌にも適用できると期待されており、その理由はこれらのバクテリアが構造的に同様な外膜を有するからである。例えば、淋菌(N.gonorrhoeae)の如き他のナイセリア(Neisseria)種および例えばモラクセラ(Moraxella)の如きグラム−陰性球菌のリポオリゴ糖が除去された外膜を製造することができる。従って、下記の工程および生成物中では髄膜炎菌が他のグラム−陰性球菌の代表である。
【００１０】
この方法はさらにグラム−陰性球菌の種々の天然菌株並びに１種より多い亜型−特異的エピトープ、例えば１種より多い一亜型−特異的エピトープ、例えば１種より多い髄膜炎菌の綱１蛋白質、を製造するために遺伝子的に操作される組み換え体菌株にも適用できる。数種の血清群、血清型または亜型の表面エピトープを発現する菌株または組み換え体菌株の混合物を使用して多価ワクチンを製造することができる。
【００１１】
該方法は種々の界面活性剤を用いる連続的抽出を含んでなるものである。最初に、球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤（例えば、トリトン(TRITON)Ｘ−１００^TM、ＢＲＩＪ３５^TM、またはツイーン(TWEEN)８０^TM）で抽出して、内膜および一部のリポオリゴ糖が除去された外膜を生ずる。この次に、例えばツイッタージェント(ZWITTERGENT)^TMシリーズの１種（例えば３−１２または３−１４）またはエンピゲン(EMPIGEN)ＢＢ^TMの如き両性イオン系(zwitterionic)ベタイン界面活性剤で抽出する。これらの界面活性剤は蛋白質はほとんど抽出しないが残存リポオリゴ糖の本質的に全てを特異的に除去する。
【００１２】
生成したリポオリゴ糖が除去された外膜製剤は細胞壁成分と結合されている外膜蛋白質類（ｏｍｐ）からなっている。この製剤はワクチン目的用に直接使用することもでき、または外膜蛋白質を可溶化させそして塩緩衝液中で両性イオン系ベタイン界面活性剤を使用して、例えば約０.１〜約０.５ＭのＮａＣｌ中でのツイッタージェント３−１４^TMを用いて、他の細胞壁成分から抽出することができる。可溶化段階により、リポオリゴ糖が除去された留分が生成し、それらの一方は可溶性外膜蛋白質を含有しそして他方は他の細胞壁成分と結合されている不溶性外膜蛋白質を含有する。リポオリゴ糖が除去された外膜およびリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質の両者はハツカネズミ中で殺バクテリア性抗体を誘発することが示されている。
【００１３】
【発明の詳細な記述】
髄膜炎菌により例示されているようなグラム−陰性球菌の外膜製剤から有毒なリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を除去するために有効な方法がここに記載されている。該方法は簡単でありそして外膜製剤を無毒化するためのこれまでの方法で得られるものより低いリポオリゴ糖含有量を生ずる。さらに、免疫原性の意義あるほどの損失を伴わずにリポオリゴ糖が除去される。
【００１４】
該方法は異なる型の界面活性剤を用いる連続的抽出を含んでいる。最初に、球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００^TM、ＢＲＩＪ３５^TMまたはツイーン８０^TM、で抽出する。これは内膜および一部のリポオリゴ糖を除去する。次に、外膜を両性イオン系ベタイン界面活性剤、例えばツイッタージェント^TMシリーズの１種（例えば３−１２または３−１４）またはエンピゲンＢＢ^TM、で抽出する。この段階により、残存リポオリゴ糖の本質的に全てが除去されて、リポオリゴ糖が除去された蛋白質に富んだ外膜複合体（リポオリゴ糖が除去された外膜と称される）を生ずる。使用される特定の両性イオン系界面活性剤によっては痕跡量のリポオリゴ糖が残るかもしれないが、これらの水準は低くそして人間中で有毒な副作用を誘発するとは予測されない。
【００１５】
好適な工程はトリトンＸ−１００^TMで数回抽出しその後にツイッタージェント３−１４^TM（Ｚｗ３−１４）で数回抽出することである。例えば、リポオリゴ糖が除去された外膜は血清群Ｂ菌株、例えばＨ４４／７６、２９９６またはＨ１３、から製造される。バクテリア膜はトリトンＸ−１００^TMで２回抽出され、次にツイッタージェント３−１４^TMで少なくとも２回抽出される（図面参照）。１グラムの凍結乾燥されたバクテリアからの生ずる収量は約３２ｍｇのリポオリゴ糖が除去された蛋白質に富んだ外膜である。この生成物はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの銀染色法により検出可能な残存リポオリゴ糖を含有しない。
【００１６】
この方法のリポオリゴ糖が除去された外膜生成物は外膜蛋白質および細胞壁成分の複合体である。抗原製剤をさらに精製するために、外膜蛋白質（ｏｍｐ）をリポオリゴ糖が除去された細胞壁から、好適には塩緩衝液中での両性イオン系ベタイン界面活性剤を用いる抽出により、可溶化させる。約０.１〜約０.５Ｍの塩化ナトリウム中でのツイッタージェント３−１４^TMがこの目的用に好適である。他の両性イオン系界面活性剤および塩緩衝液、例えば塩化カリウム、も使用できる。可溶化段階により、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質および他の細胞壁成分と結合された不溶性外膜蛋白質を含有する別の留分が生成する。リポオリゴ糖が除去された細胞壁を０.５Ｍ塩化ナトリウム中の１.０％ツイッタージェント３−１４^TMで抽出することにより、１グラムの凍結乾燥された細胞当たり約１６ｍｇの可溶化された外膜蛋白質の収量が得られる。この抽出段階を繰り返すことにより、さらに多い蛋白質が得られる。
【００１７】
可溶性外膜蛋白質を、例えばエタノール沈澱、濾過、および吸収の如き蛋白質濃縮用の種々の標準的方法により、さらに濃縮することができる。可溶性外膜蛋白質の濃縮により、ワクチンまたは試薬組成物中の抗原の最終的濃度を調節することができる。
【００１８】
図面は、髄膜炎菌の全細胞を用いて開始されそして可溶性外膜蛋白質の濃縮に進行するようなリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を製造するための方法の一態様を示している。表１（詳細な記載の最後）は出発物質と比較されているリポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質のリポオリゴ糖および蛋白質含有量を示している。
【００１９】
使用される界面活性剤の型およびそれらの使用順序がこの方法にとって重要である。例えば、トリトンＸ−１００^TMは外膜から最少の蛋白質損失でリポオリゴ糖の大部分を除去する。しかしながら、リポオリゴ糖の残部の除去用に重要なのはツイッタージェント３−１４^TMである。界面活性剤の使用順序は蛋白質または他の細胞壁成分が抽出されるかまたは不溶性のままにするかを決めるのに重要である。それぞれの界面活性剤は、次の界面活性剤でどれが可溶化されるかに直接影響する。例えば、トリトンＸ−１００^TMの代わりにサルコシルを使用して内膜を抽出するなら、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される生じた外膜の蛋白質特徴が異なる。綱１外膜蛋白質の水準も減じられる。
【００２０】
上記の方法を種々に最適化してリポオリゴ糖の除去を最大にしそして蛋白質の損失を最少にできる。例えば、Ｚｗ３−１４の最適濃度範囲は約０.５％〜約１.０％（重量／容量）であると見いだされている。０.５％より低い水準は内毒素水準の減少においては有効ではない。それぞれの抽出段階は１回より多く行うこともできる。しかしながら、ポリオキシエチレン界面活性剤を用いる抽出は両性イオン系界面活性剤を用いる抽出に先立つべきである。多数回の抽出はさらに清浄な製剤を生ずるが、比較的低い収率ももたらす。界面活性剤の濃度が増加すると比較的少ない抽出で同じ結果を生ずることができる。異なるポリオキシエチレン界面活性剤および両性イオン系界面活性剤の組み合わせをそれぞれ第一および第二の抽出段階で使用することもできる。例えば、トリトン^TM抽出後に、外膜をＺｗ３−１２で２回そしてＺｗ３−１４で２回抽出することができる。
【００２１】
バクテリア細胞を溶解させそして膜および細胞質留分を分離するための標準的方法により、全膜が球菌から製造される。例えば、フレンチ圧力セルを使用してバクテリアを溶解させ、低速遠心分離を使用して破壊されていない細胞を除去し、そして超遠心分離を使用して全膜を回収する。それぞれの抽出後に希望しない留分からの希望留分の分離を遠心分離、濾過、透析、および吸収を含む種々の既知の方法により行うこともできる。
【００２２】
界面活性剤置換
種々の界面活性剤置換物を該方法で使用することができ、そして外膜の免疫原性を保有しながらのリポオリゴ糖の除去におけるそれらの有効性を試験できる。
【００２３】
ＢＲＩＪ^TM、トリトンＸ−１００^TM、およびツイーン８０^TMはポリオキシエチレン界面活性剤である。ＢＲＩＪ^TMおよびツイーン８０^TMはトリトン^TMと非常に同様に作用する。どちらも内毒素水準をトリトンＸ−１００^TMと同様に効果的には減少させるものではないが、それらはツイッタージェント３−１４^TMによるその後のリポオリゴ糖の除去に影響しない。生成したリポオリゴ糖が除去された外膜の全蛋白質含有量は同様である。サルコシルによるトリトンＸ−１００^TMの置換は低い内毒素含有量（１.８ｎｇ／ｍｇの蛋白質よりはるかに少ない）を生ずるが、全蛋白質に関するリポオリゴ糖が除去された外膜の収量はトリトン^TMで得られるものよりはるかに少ない。
【００２４】
両性イオン系ベタイン界面活性剤は下記の式：

［式中、
Ｒ₁は炭素数が１０より大きく且つ１６より小さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、
Ｒ₂はカルボキシル基またはスルホニル基であり、そして
ｎは１より大きく、そして好適には２−３である］
によりまとめられる。例えば、ツイッタージェント^TMシリーズはＲ₂＝スルホニル基（−ＳＯ₃ ^-）、ｎ＝３、およびＲ₁＝種々の長さのアルキル基を有する。ツイッタージェント^TMはアルキル鎖の長さが後記されており、例えば、Ｚｗ３−１２は炭素数１２のアルキルを有し、そしてＺｗ３−１４はＲ₁中に１４個の炭素を有する。エンピゲンＢＢ^TMはＲ₂＝カルボニル基（−ＣＯＯ^-）、Ｒ₁中の１２個の炭素原子、およびｎ＝２を有する。
【００２５】
ツイッタージェント^TM３−０８、３−１２および３−１４の中では、３−１４が過剰の蛋白質を抽出せずに内毒素を除去する点で最も有効である。比較的小さい鎖の界面活性剤（３−０８および３−１０）はリポオリゴ糖の除去において有効性が粗糖少なくそして比較的少ない蛋白質を生ずる。これらの結果は、Ｒ₁アルキル基の鎖長がリポオリゴ糖の除去における界面活性剤の有効性に影響を与えることを示唆している。Ｚｗ３−１２およびＺｗ３−１４はそれらの鎖がリポオリゴ糖分子の脂肪族鎖と大体同じ長さであるため有効である可能性がある。しかしながら、１６個より多い炭素数のアルキル基を有する界面活性剤は不溶性となるかもしれない。
【００２６】
エンピゲンＢＢ^TMはＺｗ３−１４と実質的に同一に機能する。それは内毒素の水準の減少において有効でありそして同じ蛋白質を抽出する。それにより、それは比較的少ない蛋白質を抽出するようであり、その結果外膜生成物中での増加された全蛋白質を生ずるという利点が得られる。
【００２７】
ここで特に挙げられているものと構造的に同様である他の生成物を、ここに記載されているようにして、リポオリゴ糖が除去された外膜および外膜蛋白質の製造における有効性に関して試験することができる。そのような界面活性剤は第一抽出段階におけるポリオキシエチレン界面活性剤または第二抽出段階もしくは可溶化段階で使用される両性イオン系界面活性剤の機能的同等物であると考えられる。
【００２８】
外膜生成物の免疫原性
この方法の外膜生成物の免疫原性を試験するために、外膜（トリトンＸ−１００^TMを用いる抽出後の生成物）、リポオリゴ糖が除去された外膜（示されているようなＺｗ３−１４およびＺｗ３−１２を用いる抽出後の生成物）、並びにリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質（可溶化段階後の生成物）を髄膜炎菌の組み換え体菌株（Ｈ１３）から製造する。菌株Ｈ１３（Ｂ：−：ｐ１.７,１６；ｐ１.５,２）は野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：ｐ１.７,１６）から誘導される二重変異体細胞系である。Ｈ１３は綱３および綱５外膜蛋白質が欠けており、そして遺伝子的に操作されてそれの天然ｐ１.７,１６綱１蛋白質の他にｐ１.５,２綱１蛋白質を発現する。野生型菌株２９９６（Ｂ：２Ｂ：ｐ１.５,２）はｐ１.５,２綱１蛋白質を発現する。従って、Ｈ１３はＨ４４／７６および２９９６の両者の綱１亜型を有する。
【００２９】
リポオリゴ糖が除去された外膜製剤をハツカネズミ中に注射しそして生じた血清を分析することによりそれらを免疫原性に関して試験する。血清を最初の免疫化から０、４、および８週間後に集め、そして１０週間で放血させる（実施例参照）。血清を次にイムノブロット分析および酵素−結合されたイムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により、菌株Ｈ４４／７６または２９９６からの完全細胞と反応する抗体の存在に関して並びに精製されたｐ１.７,１６綱１外膜蛋白質を認識する抗体に関して試験する。
【００３０】
表２は精製されたｐ１.７,１６の終点ＥＬＩＳＡ滴定量を示している。この表からわかるように、リポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質（ＳＯＭＰ−リポオリゴ糖）は精製されたｐ１.７,１６に対する最高の抗体滴定量を誘発するが、外膜およびリポオリゴ糖が除去された外膜（ＯＭ−リポオリゴ糖）により誘発される血清の滴定量はそれより低いものであるがほぼ等しい。Ｈ４４／７６および２９９６細胞の両者並びに精製されたｐ１.７,１６からの外膜に対する血清を用いるウェスタン・イムノブロット分析は、血清が外膜蛋白質に対する抗体だけを含有しておりそしてリポオリゴ糖に対する抗体を含有していないことを示している。
【００３１】
表３および４は、それぞれＨ４４／７６および２９９６全細胞に対する血清の終点ＥＬＩＳＡ滴定量を示している。Ｚｗ３−１２並びにＺｗ３−１４を使用して製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜からの血清の滴定量が示されている。３種全ての抗血清のＥＬＩＳＡ滴定量はＨ４４／７６全細胞に対しても同様である（表３）。可溶性外膜蛋白質により誘発される血清およびリポオリゴ糖が除去された外膜により誘発される血清は放血における平らな段階に達するようである。粗製外膜により誘発される血清中の抗体水準は線状で増加するようである。２９９６全細胞に対するＥＬＩＳＡ（表４）では、粗製外膜により誘発される血清の滴定量とリポオリゴ糖が除去された外膜により誘発されるものはほぼ等しく、そして両者はリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質により誘発される血清の滴定量より低い。これらの結果は、この方法のリポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質生成物では内毒素含有量が極端に低く免疫原性の意義ある損失を伴わないことを示している。さらに、これらの結果は異なる血清型および亜型（Ｈ４４／７６および２９９６）を有する２種の菌株に対する抗体が両者の菌株の綱１亜型を発現する組み換え体菌株（Ｈ１３）から製造される外膜生成物により誘発されることも示している。
【００３２】
殺バクテリア活性
リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質製剤が機能的抗体（すなわち、髄膜炎菌細胞の補体−介在性破壊を誘発可能な抗体）を誘発する能力を、血清の殺バクテリア活性を測定することにより、試験する。殺バクテリア活性に関する検定は実施例に記載されている。表５は菌株２９９６（亜型ｐ１.５,２）または組み換え体菌株Ｈ１３（亜型ｐ１.５,２およびｐ１.７,１６）を使用して得られた結果を示している。２９９６のリポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質は髄膜炎菌の同種菌株を死滅させることができるが異種菌株であるＨ４４／７６は死滅させることができない抗体を製造する。Ｈ４４／７６および２９９６の両者の綱１亜型を発現するＨ１３から製造されるリポオリゴ糖が除去された外膜製剤はＨ４４／７６全細胞に対する殺バクテリア性抗体を誘発するが２９９６全細胞に対するものは誘発しない。この２９９６に対する殺バクテリア活性の欠如は、粗製外膜も機能性抗体を誘発しないため、リポオリゴ糖の除去中の損失によるものではない。以上で示されている如く、Ｈ１３から製造されるリポオリゴ糖が除去された外膜生成物は２９９６細胞に対する抗体を誘発する（表４）。これらの条件下での２９９６細胞に対する殺バクテリア活性の欠如はＨ１３菌株中のｐ１.５,２綱１蛋白質の弱い発現によるものかもしれない。これは、Ｈ１３菌株が天然ｐ１.７,１６綱１蛋白質より相当少ないｐ１.５,２蛋白質を発現するというウエスタン・ブロットからの観察と一致する。この問題は、天然綱１蛋白質のものと匹敵する水準において組み換え体綱１蛋白質を発現する組み換え体菌株からリポオリゴ糖が除去された外膜を製造することにより、克服できる。Ｈ１３コロニーをが含有するフィルターを抗ｐ１.５,２抗体に関する反応性に関してスクリーニングすることにより、ｐ１.５,２のさらに強い発現を有するＨ１３のクローンを選択することもできる。或いは、リポオリゴ糖が除去された外膜または可溶性外膜蛋白質の免疫化投与量を増加することにより殺バクテリア性抗体を誘発することもできる。
【００３３】
【発明の用途】
上記の方法は髄膜炎菌および他のグラム−陰性球菌に対するワクチンの製造用に有用である。従って、これらの球菌により引き起こされる疾病（例えば髄膜炎）に対する治療または予防方法が提供される。これまでのワクチン製造方法は、最初に外膜蛋白質（ｏｍｐ）を細胞壁から抽出しそして次にできるだけ多くリポオリゴ糖を除去するという方法に従っている。外膜蛋白質の抽出前にリポオリゴ糖を除去するという点で、本方法はこれまでの方法と異なる。その結果、外膜蛋白質からの免疫原性の意義ある損失を伴わずにリポオリゴ糖含有量が非常に減じられる。
【００３４】
本方法はリポオリゴ糖を外膜蛋白質の可溶化段階の前に０.０１％（重量／重量全蛋白質）より少なくまで除去することができる。可溶性外膜蛋白質製剤は１μｇの蛋白質当たり約３.０ｎｇより少ないリポオリゴ糖を含有する。これはゾリンガー他によりそれらのワクチンに関して１９７８年に報告されたもの（ゾリンガー(Zollinger)、米国特許番号第４,７０７,５４３号）より４０倍少ない内毒素でありそしてキューバおよびブラジルで最近試験されたもの（シエラ(Sierra)他、１９９１）より１０倍少ない内毒素である。
【００３５】
他の利点は、２種の型のリポオリゴ糖が除去された製剤すなわち外膜複合体および可溶性外膜蛋白質が製造され、それらの両者は免疫原性でありそしてリポオリゴ糖含有量が低いことである。可溶性の抗原製剤は佐薬の選択における比較的大きい柔軟性およびワクチンの比較的容易な投与を可能にする。可溶性外膜蛋白質の製剤は小胞構造の不存在下における機能的抗体応答を誘発可能であることが注目される。全てのこれまでのワクチン試みは外膜複合体または小胞形を使用する（シエラ他、１９９１）。さらに、これらのこれまでのワクチンは低いが測定可能な水準のリポオリゴ糖を有する。実際に、血清型Ｂ髄膜炎菌に対するこれまでのワクチンは全蛋白質に関して１重量％のリポオリゴ糖を含有する。
【００３６】
本方法は多価ワクチンの製造用に有用である。例えば、一態様では、リポオリゴ糖が除去された外膜または可溶性外膜蛋白質が髄膜炎菌の種々の血清群、血清型および亜型の混合物を使用して製造される。他の態様では、種々の綱１蛋白質亜型の如き菌株−特異的外膜エピトープの混合物を発現する組み換え体菌株が比較的広い保護値を有するワクチン用の出発物質として使用される。多数の髄膜炎菌の綱１外膜蛋白質のクローニング（バルロウ(Barlow)他、１９８７）および配列並びに組み換え体バクテリア菌株の構造はこれまでに記載されている（セイド(Seid)他、ＷＯ９０／０６６９６）。
【００３７】
可溶性外膜蛋白質を含むリポオリゴ糖が除去された外膜製剤は、例えば細胞壁または外膜蛋白質に対する抗体を球菌被膜またはリポオリゴ糖に対する抗体から区別するための、透析試薬としても有用である。さらに、免疫原性製剤は外膜蛋白質または細胞膜を認識するが被膜性の糖は認識しない抗体を増加させるためにも有用である。
【００３８】
リポオリゴ糖が除去された外膜および可溶性外膜蛋白質を製造するためのこの方法は種々のグラム−陰性球菌上で有効であると予測され、その理由はこれらのバクテリアが構造的に同様な外膜を有するからである。例えば、リポオリゴ糖が除去された外膜生成物およびワクチンは、この方法により他のナイセリア、例えば淋菌、並びに他のグラム−陰性球菌、例えばモラクセラおよび特にＭ.カタルハリス(M. catarrhatis)、から製造できる。
【００３９】
下記の実施例は本発明を特に説明するものである。
【００４０】
【実施例】
髄膜炎菌菌株
髄膜炎菌Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：ｐｌ.７,１６）、２９９６（Ｂ：２Ｂ：ｐ１.５,２）、およびＨ１３（Ｂ：−：ｐ１.７,１６；ｐ１.５,２）細胞はオランダのＪ.Ｔ.プールマン(Poolman)の好意により提供された。Ｈ４４／７６は１９８９年１２月１１日にオランダ、バーンのセントラル・ビューロー・ヴール・シンメルカルツレン(Centraal Bureau Voor Schimmelculturen(CBS))にブダペスト・トリーティー(Budapest Treaty)として預託されており、そしてＣＢＳＧ３５−８９と照合される。２９９６およびＨ１３はオランダのＲＩＶＭから入手可能である。菌株の型分類はフラッシュ(Frasch)により提案されている方式に基づいている（１９８３）。
【００４１】
髄膜炎菌菌株を、デキストロース（４ｇ／Ｌ）、グルタミン（０.１ｇ／Ｌ）、コカルボキシラーゼ（０.２ｍｇ／Ｌ）、および硝酸第二鉄（５ｍｇ／Ｌ）が補充されているＧＣ寒天媒体（ミシガン州、デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ）の凍結原料から成長させた。板を５％ＣＯ₂中で３５℃において６時間培養した。６時間成長させた後に、１個の板からのコロニーを使用して０.２％の透析された酵母抽出物、Ｌ−グルタミン酸（１.３ｇ／Ｌ）、Ｌ−システイン−ＨＣｌ（０.０２ｇ／Ｌ）、二塩基性燐酸水素二水塩（１０ｇ／Ｌ）、塩化カリウム（０.０９ｇ／Ｌ）、塩化アンモニウム（１.２５ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム六水塩（０.６ｇ／Ｌ）、デキストロース（５ｇ／Ｌ）、および酢酸第二鉄（１００μＭ）からなる１００ｍＬの液体培養媒体に接種した。この液体培養物を３７℃において１８時間成長させた。１８時間培養物の部分試料を２０−３０レット単位すなわち６５０ｎｍにおける０.１の光学的密度に希釈し、そして培養物を成長させて後期指数期とした。細胞が後期指数期に達したら、それらを熱で死滅させ、分割し、凍結し、そして凍結乾燥した。
【００４２】
リポオリゴ糖が除去された髄膜炎菌外膜および可溶性外膜蛋白質の製造
トリトンＸ−１００^TM、ＢＲＩＪ^TM、エンピゲンＢＢ^TMおよびツイッタージェント^TMはカリフォルニア州サンディエゴのカルビオケムから入手できる。ツイーン８０^TMはオハイオ州クイーブランドのＩＣＮヌートリショナル・バイオケミカルズから入手できる。
【００４３】
１.５グラムの凍結乾燥された熱で死滅した細胞を、１０ｍＭのｐＨ７.４のヘペス(Hepes)−ＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡの７５ミリリットルの低張性溶液の中に懸濁させ、そしてＳＬＭ／アミンコ・フレンチ・プレッシャー・セル(AMINCO French Pressure Cell)の中に溶解させた。バクテリアを遠心分離（５分間、８０００×ｇ、１０℃）によりペレット状にした。細胞溶解物を０.５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、細胞質抽出物を遠心分離（２００,０００×ｇ、１時間、１０℃）により除去した。内膜を可溶化しそして４００,０００×ｇでの１０℃における１時間の遠心分離およびその後の１０ｍＭのｐＨ７.４のヘペス−ＮａＯＨ、１ｍＭの塩化マグネシウム中１％トリトンＸ−１００^TMを用いる抽出により除去した。この抽出は１回繰り返された。それらを次に同一緩衝液中の１％ツイッタージェンツ３−１４^TM（重量／容量）でそれぞれ１時間にわたり２回抽出し、そして４００,０００×ｇで１０℃において１時間遠心分離した。蛋白質−含有細胞壁を１％ツイッタージェンツ３−１４^TM（重量／容量）および０.５Ｍ塩化ナトリウムで室温において１時間抽出することにより外膜蛋白質を可溶化し、そして８０％エタノール（容量／容量）沈澱により濃縮した。濃縮された外膜蛋白質をｐＨ８.０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％ツイッタージェント３−１４^TM、０.５ＭのＮａＣｌの中で可溶化させた。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット法
外膜小胞（ＯＭＶ）および可溶化された蛋白質の蛋白質特徴およびリポオリゴ糖含有量を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でラエンムリ(Laemmli)（１９７０）の緩衝液システムを用いて分析した。使用された装置はバイオラッド（カリフォルニア州リッチモンド）のミニ・プロテアンIIデュアル・スラブ・ゲル・システムであった。試料をｐＨ７.０の０.１Ｍトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭのジチオスレイトール、２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する試料緩衝液の中で１００℃に５分間加熱し、次に６％スクロースとなるようにに調節した。ゲルを１５０Ｖにおいて４５−６０分間実験し、そしてモリッセイ(Morrisey)の方法（１９８１）により銀染色するか、または蛋白質を記載されているようなイムノブロット法（トウビン(Towbin)他、１９７９；ジョンソン(Johnson)他、１９８４）用のニトロセルロースの上に移した。ブロットをBLOTTO（５％乾燥牛乳、ｐＨ８.０の０.０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、０.１５ＭのＮａＣｌ）の中で３７℃において１５分間遮断し、そしてBLOTTO中で３７℃において１時間にわたり１：５００希釈度の血清と共に培養した。綱１の外膜蛋白質（ＯＭＰ）であるｐ１.５,２およびｐ１.７,１６の存在をモノクローン抗体（Ｊ.Ｔ.プールマン(Poolman)を使用して確認した。反応性蛋白質をホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（カリフォルニア州バーリンガムのＴＡＧＯインコーポレーテッド）と結合されている山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを用いて視覚化し、そして４−クロロ−１−ナフトールを基質として用いる現像を行った。
【００４５】
蛋白質定量化
全蛋白質含有量をピエルス(Pierce's)（イリノイ州ロックフォード）ＢＣＡプロテイン・アセイ・キットにより牛血清アルブミンを標準として用いて測定した。
【００４６】
動物研究
生後８週間のスイス・ウエブスターハツカネズミの各群を、２５μｇの３−Ｏ−デアシルモノホスホリル脂質Ａ（マサチュセッツ州ハミリトンのリビ・イムノケム・リサーチ・インコーポレーテッド）が含まれている０.２ｍｌ量の食塩水中の２５μｇの外膜、リポオリゴ糖が除去された外膜またはリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を用いて皮下的に免疫感作させた。３回の予防接種を０、４、および８週間投与した。ハツカネズミを同じ間隔で出血させ、そして１０週間において放血させた。各群からの一緒にした血清をイムノブロットおよび酵素−結合されたイムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により分析した。イムノブロット法は上記の如くして行われそして血清をＨ４４／７６および２９９６細胞並びに精製されたｐ１.７,１６外膜蛋白質からの外膜複合体に対して１：５００希釈度で試験した。ＥＬＩＳＡ検定は菌株Ｈ４４／７６もしくは２９９６または精製された綱１外膜蛋白質の全細胞を利用した。バクテリアを５６℃において１時間にわたり不活性化し、そして殺菌性燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ：２７ｍＭのＫＣｌ、４３ｍＭのＮＡ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭのＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、１.４ＭのＮａＣｌ）中で希釈した。９６−ウェルの平らな底の微量滴定板（ヌンク(Nunc)）に１００μｌの細胞をコーテイングし、そして乾燥培養器中で一夜３７℃において乾燥した。板をＰＢＳ（洗浄緩衝液）中の０.０５％ツイーン２０^TMで３回洗浄し、その後に遮断用に１００μｌのＰＢＳ中０.１％ゼラチンで培養した。板を洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳ中０.１％ゼラチンおよび０.０５％ツイーン２０^TMを使用して対照血清および試験血清を希釈し、そして１００μｌのこれらの希釈物を板に加えそして室温で９０分間培養した。板を再び３回洗浄し、１００μｌの１：１０００希釈度のアルカリ性ホスファターゼ（ＴＡＧＯ）と結合されている山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを加え、そして混合物を室温で１時間培養した。板を３回洗浄し、その後１００μｌの基質である燐酸ニトロフェニル（シグマ）と共に１.０ｍｇ／ｍｌにおいて１Ｍのジエタノールアミン／０.５ｍＭの塩化マグネシウムの中で１時間培養し、そして４２０ｎｍにおける吸収を読み取った。
【００４７】
綱１外膜蛋白質ｐ１.７,１６に対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ法も行われた。９６−ウェルの平らな底の微量滴定板をｐＨ９.６の１４ｍＭの炭酸ナトリウム／３６ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０.０２％ナトリウムアジド緩衝液中の１００μｌの精製されたｐ１.７,１６で５μｇ／ｍｌで３７℃において９０分間にわたりコーテイングした。板をＰＢＳ／０.１％ツイーン２０^TM（洗浄緩衝液）で６回洗浄した。ネズミ血清をＰＢＳ／０.０５％ツイーン２０^TM中で順次希釈し、１００μｌをそれぞれの洗浄された板に加え、そしてそれぞれの板を３７℃において１時間培養した。板を再び洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μｌの１：２０００希釈度のアルカリ性ホスファターゼと結合されている山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭを加え、そして混合物を３７℃において１時間培養した。板を前記の如く洗浄し、１００μｌの燐酸ニトロフェニルのジエタノールアミン中１ｍｇ／ｍｌ溶液を加え、そして板をそのまま室温で１時間培養した。反応を５０μｌの３Ｎ水酸化ナトリウムを用いて停止し、そして４０５ｎｍにおける吸収を読み取った。
【００４８】
殺バクテリア性検定
検定工程はホイビー(Hφiby)他（１９９１）から変更されていた。髄膜炎菌菌株をデキストロース（４ｇ／Ｌ）、グルタミン（０.１ｇ／Ｌ）、コカルボキシラーゼ（０.２ｍｇ／Ｌ）、および硝酸第二鉄（５ｍｇ／Ｌ）が補充されているＧＣ寒天媒体（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリース）の凍結原料から成長させた。板を５％ＣＯ₂中で３５℃において６時間培養した。６時間成長させた後に、１枚の板からのコロニーを使用して０.２％の透析された酵母抽出物、Ｌ−グルタミン酸（１.３ｇ／Ｌ）、Ｌ−スステイン−ＨＣｌ（０.０２ｇ／Ｌ）、二塩基性燐酸ナトリウム二水塩（１０ｇ／Ｌ）、塩化カリウム（９.０９ｇ／Ｌ）、および塩化アンモニウム（１.２５ｇ／Ｌ）からなる１００ｍＬの液体培養媒体を接種した。この液体培養物を３７℃において１８時間成長させた。１８時間培養の部分試料を２０−３０レット単位すなわち６５０ｎｍにおける０.１の光学的密度に希釈し、そして培養物を成長させて後期指数期とした。細胞が後期指数期に達した時に、それらを殺バクテリア性検定で使用した。
【００４９】
殺バクテリア性検定は、１０μＬの髄膜炎菌細胞（約２−４,０００個のバクテリア）、１０μＬの補体（２０％正常人間血清）、０.０１５ｍＭのＣａＣｌ₂および０.５ｍＭのＭｇＣｌ₂（ＰＣＭ）を含む２５μＬのＰＢＳ、並びに５μＬの希釈された血清（希釈剤としてＰＣＭ）を混合することにより、殺バクテリア性検定を行った。補体源をそれ自身の殺バクテリア活性の欠如に関して予備試験した。混合物を３６℃において４５分間培養し、その時点で２００μＬのＰＣＭで希釈し、そして５０μＬをＧＣ寒天板の上に一度に延ばした。培養板を２４時間にわたり３５−３６℃において５％ＣＯ₂と共に培養した。コロニーを次に計数しそして殺バクテリア活性を％対照（血清が加えられていない）として表示した。滴定量は、％死滅対希釈度のプロットから外挿されて、検定中でバクテリアの５０％が死滅した希釈度の逆数として表示されている。全ての血清を１０週間において通常試験をした。試験した血清の最高濃度は１／５０であり、１／５０において死滅させない血清は＜５０の滴定量を有すると報告された。全２９９６細胞に対して製造された正の対照用抗血清はこれらの条件下で菌株２９９６を死滅させるための補体源を使用することができる。
【００５０】

これらの製剤用の出発物質は１.５ｇ乾燥重量のＨ１３細胞である。
【００５１】
内毒素単位(Ｅｕ)は懸濁計検定により大腸菌リポ多糖(ＬＰＳ)を標準として使用して測定され、ここで１Ｅｕ＝０.１ｎｇ大腸菌ＬＰＳである。
【００５２】

【００５３】
試験した血清の最高濃度は１／５０である。１／５０で死滅しない血清は＜５０の滴定量を有すると報告されている。
【００５４】
文献目録
バルロウ(Barlow),Ａ.Ｋ.他（１９８７）、「大腸菌Ｋ−１２中の髄膜炎菌綱１外膜蛋白質の分子クローニングおよび発現(Molecular cloning and expression of Neisseria meningitidis Class 1 outer membrane protein in Escherichia coli K-12)」、インフェクション・アンド・イミュニティ(Infection and Immunity)、５５(１１)：２７３４−２７４０。
【００５５】
フラッシュ(Frasch),Ｃ.Ｅ.（１９８３）、「髄膜炎菌に対する免疫化(Immunization against Neisseria meningitidis)」、メディカル・マイクロバイオロジー(Medical Microbiology)（Ｃ.Ｓ.Ｆ.イーストマン(Eastman)およびＪ.ジェルジャスゼヴィツ(Jeljaszewicz)編集）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、２巻、１１５−１４４頁。
【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
ホイビー(Hφiby),Ｅ.Ａ.他（１９９１）、NIPH Annals、１４(２)：１４７−１５５。
【００５９】
ジョンソン(Johnson),Ｄ.Ａ.他（１９８４）、Gene Anal. Technol.、１：３−８。
【００６０】
ラエンムリ(Laemmli),Ｕ.Ｋ.（１９７０）、ネーチャー(Nature)、２２７：６８０−６８５。
【００６１】
モリッセイ(Morrissey),Ｊ.Ｈ.（１９８１）、Anal. Biochem.、１１７：３０７−３１０。
【００６２】
セイド(Seid),Ｒ.Ｃ.他、ＷＯ９０／０６６９６、「髄膜炎菌綱１外膜蛋白質ワクチン(Meningoccal Class 1 Outer-Membrane Protein Vaccine)」、１９９０年６月２８日。
【００６３】
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【００６４】
トウビン(Towbin),Ｈ.他（１９７９）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、７６：４３５０−４３５５。
【００６５】
ツサイ(Tsai),Ｃ.Ｍ.他（１９８１）、「髄膜炎菌中の主要な外膜蛋白質の５種の構造的綱(Five Structural classes of major outer membrane proteins in Neisseria meningitidis)」、J. Bacteriol.、１４６：６９−７８。
【００６６】
ゾリンガー(Zollinger),Ｗ.Ｄ.（１９９０）、「髄膜炎菌疾病に対する新規および改良ワクチン(New and improved vaccines against meningococcal disease)」。新世代ワクチン(New Generation Vaccines)（Ｇ.Ｃ.ウッドロウ(Woodrow)およびＭ.Ｍ.リヴィン(Levine)編集）中、マルセル・デッカー・インコーポレーテッド、ニューヨーク、３２５−３４８頁。
【００６７】
ゾリンガー(Zollinger),Ｗ.Ｄ.他、米国特許番号第４,７０７,５４３号、「無毒化された多糖−外膜蛋白質複合体の製造方法、および抗バクテリアワクチンとしてのそれらの使用(Process for the Preparation of Detoxified Polysaccharide-Outer Membrane Protein Complexes, and Their Use As Antibacterial Vaccines)」、１９８７年１１月１７日。
【００６８】
同等物
当技術の専門家はここに特に記載されている本発明の特定態様の多くの同等物をわかったりまたは単に日常的実験を用いて確認したりするであろう。そのような同等物も請求の範囲に包括されることを意図する。
【００６９】
本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。
【００７０】
１．グラム−陰性球菌の全膜からリポオリゴ糖が除去された外膜を製造する方法であって、該方法が
ａ）球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して内膜が除去された外膜を製造し、そして
ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系(zwitterionic)ベタイン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外膜を製造する
ことを含んでなる方法。
【００７１】
２．球菌がナイセリアおよびモラクセラからなる群から選択される、上記１の方法。
【００７２】
３．球菌が髄膜炎菌、淋菌およびモラクセラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記２の方法。
【００７３】
４．段階ａ）中のポリオキシエチレン界面活性剤が
ａ）トリトンＸ−１００^TM、
ｂ）ＢＲＩＪ３５^TM、および
ｃ）ツイーン８０^TM
からなる群から選択される、上記１の方法。
【００７４】
５．両性イオン系ベタイン界面活性剤が式：

［式中、
Ｒ₁は炭素数が１０より大きく且つ１６より小さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、
Ｒ₂はカルボキシル基またはスルホニル基であり、そして
ｎは１より大きい］
を有する、上記１の方法。
【００７５】
６．両性イオン系ベタイン界面活性剤が
ａ）ツイッタージェント３−１２^TM、
ｂ）ツイッタージェント３−１４^TM、および
ｃ）エンピゲンＢＢ^TM
からなる群から選択される、上記５の方法。
【００７６】
７．段階ａ）が段階ｂ）に進む前に１回より多く行われる、上記１の方法。
【００７７】
８．段階ｂ）が１回より多く行われる、上記１の方法。
【００７８】
９．段階ｂ）により製造された外膜を塩緩衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して可溶性外膜蛋白質を含有する留分並びに不溶性外膜蛋白質および細胞壁成分を含有する留分を製造することをさらに含んでなる、上記１の方法。
【００７９】
１０．両性イオン系ベタイン界面活性剤がツイッタージェント３−１４^TMであり、そして塩緩衝液が約０.１〜約０.５ＭのＮａＣｌであり、そしてさらに可溶性外膜蛋白質を濃縮することを含んでなる、上記９の方法。
【００８０】
１１．上記１、上記４、上記６、上記９および上記１０の方法により製造される、単離されたリポオリゴ糖が除去された外膜。
【００８１】
１２．上記９の方法により製造される、リポオリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質および細胞壁成分。
【００８２】
１３．上記１０の方法により製造される、濃縮されたリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質。
【００８３】
１４．グラム−陰性球菌に対する殺バクテリア性抗体を誘発可能な組成物を製造する方法であって、該方法が
ａ）グラム−陰性球菌の全膜を得、
ｂ）該全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して内膜が除去された外膜を製造し、そして
ｃ）段階ｂ）により製造された外膜を両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された外膜を製造し、そして
生理学的に許容可能な賦形薬と組み合わせ、それによりグラム−陰性球菌に対する殺バクテリア性抗体を誘発可能な組成物を製造する
ことを含んでなる方法。
【００８４】
１５．球菌がナイセリアおよびモラクセラからなる群から選択される、上記１４の方法。
【００８５】
１６．球菌が髄膜炎菌、淋菌およびモラクセラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記１５の方法。
【００８６】
１７．髄膜炎菌が血清群Ｂに属する、上記１６の方法。
【００８７】
１８．１種より多いグラム−陰性球菌の菌株を段階ａ）で使用し、該菌株がバクテリアの１種より多い血清群(serogroup)、血清型(serotype)または亜型(subtype)に属する、上記１４の方法。
【００８８】
１９．グラム−陰性球菌が組み換え体でありそして組み換え体球菌が綱１(class１)外膜蛋白質の１種より多い亜型を発現する、上記１４の方法。
【００８９】
２０．段階ｂ）中のポリオキシエチレン界面活性剤が
ａ）トリトンＸ−１００^TM、
ｂ）ＢＲＩＪ３５^TM、および
ｃ）ツイーン８０^TM
からなる群から選択され、ここで
両性イオン系ベタイン界面活性剤が式：

［式中、
Ｒ₁は炭素数が１０より大きく且つ１６より小さいかまたは１６に等しいアルキル鎖であり、そして
Ｒ₂はカルボキシル基またはスルホニル基であり、そして
ｎは１より大きい］
を有する、上記１４の方法。
【００９０】
２１．両性イオン系ベタイン界面活性剤が
ａ）ツイッタージェント３−１２^TM、
ｂ）ツイッタージェント３−１４^TM、および
ｃ）エンピゲンＢＢ^TM
からなる群から選択される、上記２０の方法。
【００９１】
２２．ｄ）段階ｃ）により製造された外膜蛋白質を塩緩衝液の中で両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して可溶性外膜蛋白質を得ることをさらに含んでなり、ここで両性イオン系ベタイン界面活性剤がツイッタージェント３−１４^TMでありそして塩緩衝液が約０.１−約０.５ＭのＮａＣｌである、上記１４の方法。
【００９２】
２３．上記１４、上記１６、上記１７、上記１８、上記１９、上記２０、上記２１および上記２２の方法により製造される組成物を含んでなるワクチン。
【００９３】
２４．上記２３のワクチンを投与することを含んでなる、グラム−陰性球菌により引き起こされる疾病に対する予防または治療方法。
【００９４】
２５．疾病が髄膜炎である、上記２４の方法。
【００９５】
２６．上記１１の単離されたリポオリゴ糖が除去された外膜を動物中でこの単離された外膜に対する抗体を誘発するのに適する環境下で動物に投与することを含んでなる、グラム−陰性球菌の外膜を認識しそして該有機体のリポオリゴ糖と交差反応しない抗体を製造する方法。
【００９６】
２７．球菌がナイセリアおよびモラクセラからなる群から選択される、上記２６の方法。
【００９７】
２８．球菌が髄膜炎菌、淋菌およびモラクセラ・カタルハリスからなる群から選択される、上記２７の方法。
【００９８】
２９．上記２６の方法により製造される抗体。
【図面の簡単な説明】
【図１】髄膜炎菌からリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を製造する方法の工程図である。

Claims

ａ）グラム−陰性球菌の全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して内膜が除去された外膜を製造し、
ｂ）段階ａ）により製造された外膜を両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して約０．０１重量％未満のリポオリゴ糖を含むリポオリゴ糖が除去された外膜を含有する不溶性画分とリポオリゴ糖を含有する可溶性画分を製造し、そして
ｃ）段階ｂ）により製造された不溶性画分からリポオリゴ糖が除去された外膜を回収する
ことを特徴とするグラム−陰性球菌の全膜からリポオリゴ糖が除去された外膜の製造方法。
段階ｃ）により製造されたリポオリゴ糖が除去された外膜を塩緩衝液中の両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質を含有する画分並びにリポオリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質および細胞壁成分を含有する画分を製造することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
請求項２に記載の方法により製造される、単離されたリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜。
請求項２の方法により製造される、リポオリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質および細胞壁成分。
請求項２の方法により製造される、濃縮されたリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質。
ａ）グラム−陰性球菌の全膜を得、
ｂ）該全膜をポリオキシエチレン界面活性剤で抽出して内膜が除去された外膜を製造し、
ｃ）段階ｂ）により製造された外膜を両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出して約０．０１重量％未満のリポオリゴ糖を含む外膜を含有する不溶性画分とリポオリゴ糖を含有する可溶性画分を製造し、
ｄ）段階ｃ）により製造された不溶性画分から外膜を回収し、そして
ｅ）段階ｄ）からの外膜を生理学的に許容可能な賦形薬と組み合わせ、それによりグラム−陰性球菌に対する殺バクテリア性抗体を誘発しうる組成物を製造する
ことを特徴とするグラム−陰性球菌に対する殺バクテリア性抗体を誘発しうる組成物の製造方法。
ｆ）段階ｃ）により製造された約０．０１重量％未満のリポオリゴ糖を含む外膜を含有する不溶性画分とリポオリゴ糖を含有する可溶性画分を塩緩衝液中の両性イオン系ベタイン界面活性剤で抽出してリポオリゴ糖が除去された可溶性外膜蛋白質とリポオリゴ糖が除去された不溶性外膜蛋白質を得ることをさらに含んでなり、ここで両性イオン系ベタイン界面活性剤がｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネートでありそして塩緩衝液が約０.１〜約０.５ＭＮａＣｌである請求項６に記載の方法。
請求項６および請求項７のいずれかに記載の方法により製造される組成物を含んでなるワクチン。
グラム−陰性球菌により引き起こされる疾病の予防または治療のための請求項８に記載のワクチン。
請求項１に記載の方法により製造される、単離されたリポオリゴ糖が除去された不溶性外膜。
請求項３、請求項４または請求項１０に記載のリポオリゴ糖が除去された外膜に対する抗体。