-
Vs AIJRN ZUR IIEKSTELLUNG MEMBRANSTANDIGER PROTEINE AUS
-
BIOLOGISCHEM MATERIAL ZUX ANWENDUNG IN BIOLOGISCHEN SYSTEEZN.
-
In der modernen Biochemie erweitern sich ständig die Einsatzmöglichkeiten
für biologische Analysen-, Test- oder Herstellungsverfahren, insbesondere unter
Einsatz von Proteinen oder anderen Stoffen, welche aus den Membranen der Zelloberfläche,
der Mitochondrien, der Mikrosomen, der Kernmembran oder anderer Zellorganellen stammen.
-
Solche membranständigen Proteine sind von herausragender Bedeutung,
da sie in vielfältiger Weise die Beziehungen der Zellkompartimente, der Zellen und
der Gewebe eines Organismus untereinander kontrollieren und regulieren und dabei
den Gesamtzustand der Einzelzelle ( Zellstoffwechsel) steuern, als auch ihre Beziehungen
nach außen (Nahrungs-nd Körperstoffwechsel, Zell-Zell- Erkennung, Somplement- und
Immunreaktionen) bestimmen.
-
Membranständige Proteine sind in ihrer natürlichen Umgebung in eine
jeweils ganz spezifische Membran von Lipiden oder lipidähnliche Substanzen eingebaut.
Die Zusammensetzung der Lipide ist jedoch sehr variant und abhängig von z. B. :
Spezies, Stamm, Geschlecht, Alter und Ernährungszustand des Individuums, dem das
Gewebe entnommen wurde und von der Art und dem Entwicklungszustand des Probegewebes
und dem Ort des Vorkommens in der Zelle selbst.
-
Für viele membranständige proteine wurden Darstellungsmethoden entwickelt,
die geeignet sind für die Durchführung von analytischen und kinetischen Versuchen
oder für Untersuchungen zur Struktur oder Wirkungsweise dieser Proteine.
-
Beim Einsatz der so dargestellten, membranständigen Proteine in sensible
biologische Test- oder Kultursysteme traten jedoch praktisch unüberwindliche Schwierigkeiten
auf, da sich die Stoffe ( - Detergenzien A - ), die zur Herauslösung der Proteine
aus ihrer natürlichen Umgebung notwendig sind, für das biologische Material der
Test- oder Kultursysteme ( Einzelzellen, Gewebekulturen ) als toxisch erwiesen.
-
Der Grund hierfür ist hauptsächlich darin zu sehen, daß sich die Detergenzien
A im lipophilien Bereich der Proteine auf Grund der lipophilen Wechselwirkung stets
im Überschuß anlagern und sich diese überschüssigen Detergenzien A dann beim Einsatz
in empfindlichen Test- oder Kultursystemen in die Membranen der Töst- oder Yulturoboekte
einlagern und dort den Metabolismus stören oder unterbinden, z. 3. durch Veränderung
oder Entkoppelung der membranständigen Proteinfunktion, bzw. durch lytische, inhibierende
oder toxische Wirkung per se.
-
Der erfindungsgemäße Gedanke ist nun der, zur erauslösung der membranständigen
Proteine nur eine so minimale Menge an Detergens A zu verwenden, daß beim Einsatz
der solubilisierten ( in beständige Lösung überführten) Proteine in Test- oder Kultursysteme
wie oben beschrieben eine toxische Wirkung unterbleibt, da Detergens A nicht im
Überschuß vorhanden ist.
-
Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Minimalkonzentration an Detergens
A, die zur Solubilisierung der Proteine erforderlich ist, für viele Anwendungszwecke
bereits -zu toxisch wirkt, wenn die Solubilisierung mit dem Detergens A alleine
vorgenommen wird.
-
Deswegen wird weiter vorgeschlagen, ein Hilfsdetergens B enzusetzen,
das physiologisch verträglich ist und bis zu einem geringen estbestand -der dazu
erforderlich ist, das präparierte Protein in Lösung zu halten- wieder durch Dialyse
entfernt werden kann.
-
Auf Grund der lipophilen Wechselwirkung zwischen Lipiden, Detergenzien
A und den Abschnitten der membranständigen Proteine im Bereich der Einbettung dieser
Proteine in der Membran ist die gewünschte Besetzung der lipophilen Proteinbereiche
in minimalster konzentration Detergens A durch die Einstellung eines Gleichgewichtes
gegen eine Dialysierflüssigkeit mit vorgegebener Konzentration Detergens A nicht
möglich: Der entstehende " Schwarm " von Detergens A- Molekülen um die fraglichen
Proteinstrukturen würde sofort wieder zu einer über das tolerierbare Maß hinausgenden
Anlagerung führen.
-
Vielmehr erreicht man aber diese, für eine " Minimalsolubilisation
" der membranständigen Proteine notwendige Anlagerung von Detergens A dergestalt,
daß zu einem bestehenden Dialysesystem mit einer bekannten Menge Protein in den
Membranfraktionen bekannter herkunft eine festgelegte Menge Detergens A von außen
zugegeben wird.
-
Nur durch langsame Diffusion in das proteinhaltige Dialysat läßt sich
die Anlagerung von Detergens A kontrollieren und limitieren.
-
Arbeitsvorschrift: Nach einem der an sich bekannten Verfahren werden
in sich einheitliche Fraktionen vcn Zellmembranen gewonnen ( Aufschluß, frenchpress,
Cltrabeschallung, Homogenisierung, Zentrifugationen u.s.w.
-
und in Puffer B (enthält Detergens B ) aufgenommen und homogenisiert.
-
Nach diesem Prozeß soll die Proteinkonzentration im Dialysat 2 - 8
mg Protein / ml betragen. Diese Lösung wird genau ( rl ) gemessen und in z. B. einen
vorgequollenen Dialyseschlauch gefüllt. Die Dialyse erfolgt gegen etwa das 2 - 8-
fachen, vorzugsweise gegen das 4- fache Volumen Puffer B. Das Dialysat wird stark
gerührt und dann Detergens A tropfenweise in genau vorausberechneter Menge über
einen größeren Zeitraum - z. B. 30 min.- zugegeben. Man läßt 2 Stunden weiterrühren,
entnimmt den Dialyseschlauch und zentrifugiert das Dialysat. Dabei ist die Zentrifugation
anhaltsweise nach der Größe und der Herkunft der Ausgangsmembranen zu bemessen.
-
Je nach Verwendungszweck kann das Dialysat vor der Zentrifugation
vorsichtig auf z. B. das doppelte Volumen mit einer geeigneten Lösung - z. 13. Kulturmedium
oder Puffer B ohne Detergens B - verdünnt werden So erhalt man oft einen Niederschlag
von vergleichbarer Größe des Ausgangsmaterials, wobei aber das herausgelöste Protein
im Überstand verbleibt.
-
Die so gewonnenen Substanzen können in üblicher Weise weiterverarbeitet
werden.
-
Z. B. können die Proteine einer Ammonsulfatfällung unterzogen und
wieder aufgelöst werden, Glykoproteine lassen sich mit Polyäthylenglycol-Aceton
fällen, das Gesamtgemisch kann z. B. durch isoelektrische Fokussierung oder Gelelektrophorese
oder einer Kombination davon gereinigt oder nach dem Vorschlag des Entwicklungsbüros
Dr. Busse, Berlin hochauflösend analysiert werden. Ebenso ist es möglich, die Proteine
kationisch bzw. anionisch zu binden und entsprechend abzulösen oder mit bekannten
Affinitätstechniken über die Bindung an Substrate oder Substratanaloga zu reinigen.
-
Insbesondere sind die so gewonnenen Proteine nicht denaturiert und
besitzen die normale metabolische Aktivität und die unveränderten antigenen Determinanten.
-
Sie lassen sich als metabolisch aktive Spezies in biologischen Testsystemen
einsetzen ( Suspensionen von Zellorganellen, Lösungen von Enzymen oder Makromolekülen,
Zell- oder Gewebekulturen, Kulturen von limb- buds, whole embryos, Eier, Organschnitte
u.s.w.) oder direkt oder in weiter gereinigter Form zur Immunisierung verwenden.
-
Die Stimulierung von B- Lymphozyten zur Produktion von Antikörpern
ist in- vitro möglich. Hierbei kann das antigene Material in hoher Konzentration
vorgelegt werden, da noch verbleibendes Detergens selbst in kleinen Voluminas, wie
z.B. in den vials von Titerplatten keine erkennbare toxische Wirkungen entfaltet.
-
DETERGENSKLASSE A : Brij 58x oder Lubrol WXx oder Emulgen 911x oder
Triton X- 100x oder Renex 690x.
-
DETERGENSKLASSE B : Cholsäure- Na- Salz oder Zwittergentx.
-
x = registrierte Handelsnamen.
-
Puffer B: 40 mM Phosphat/Hydrogenphosphat, pH = 7,2 bis 6,6 20 % Glycerin(
v/v ), 0,1 mM butyliertes Hydroxytoluol 200 mM Sucrose 100 mM Dithioerythritol 0.4
% Detergens B ( v/v ) Beispiel: AusFanFsmaterial Detergens A bevorzugt Ausbeute
Prot Sprague- Mitochondrien 1. 2 - 6 (µ Mol 5 92 % 4% Dawley Mikrosomen 1. 2 - 5
3,5 95 % 4% Hatte, m, Mitochondrien b. 3 - 8 mg Prot.) 4,5 90 % max.
-
120 g, Mikrosomen b. 3 - 7 4,0 90 O,b max.
-
Normaldiät liter 1. surf. 4 -10 5,0 92 * + brain b. surf. 4 -10 5,2
90 % max.