DE2656746A1

DE2656746A1 - Verfahren zur herstellung einer masse von in einer physiologischen loesung suspendierten beladenen zellen

Info

Publication number: DE2656746A1
Application number: DE19762656746
Authority: DE
Inventors: Karin Bock; Hermann Josef Buers; Guenter Dr Pilwat; Ulrich Prof Dr Zimmermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1976-12-15
Filing date: 1976-12-15
Publication date: 1978-06-29
Also published as: DE2656746C2; CH632928A5; IL53596A0; SE445296B; JPS5375385A; SE7713946L; FR2374045B1; GB1557649A; IL53596A; FR2374045A1; US4289756A

Description

Kernforschungsanlage Jülich Gesellschaft mit beschränkter Haftung

Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit außerhalb der Zellmembran befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisende, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Austausch mit dem Zellinhalt in das Innere der zu beladenden Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirken des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der

die Stoffe enthaltenden zellvertraglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden.

Verfahren zur Herstellung einer Masse der eingangs bezeichneten Art sind aus der DT-PS 23 26 224, aus der DT-OS 23 26 161 und aus der DT-OS 24 05 119 bekannt. Dabei bezieht sich das aus der vorgenannten Patentschrift bekannte Verfahren auf den Einschluß von Komplexbildnern in aus lebenden Zellen von Lebewesen gebildeten beladenen Zellen und das aus der DT-OS 23 26 bekannte Verfahren auf den Einschluß von katalytisch wirkenden Stoffen wie Enzymen oder Pharmaka in beladenen Zellen, wobei bei beiden bekannten Verfahren die Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran durch Einwirkung' osmotischen Druckes auf die Zellmembran erzielt wird. Bei dem aus der DT-OS 24 05 119 bekannten Verfahren wird dagegen die Erhöhung der Permeabilität durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erreicht.

Neben der Bezeichnung "beladene Zellen" oder "loaded cells" - die zum Ausdruck bringen soll, daß es sich um Zellen handelt, die mit solchen Substanzen "beladen" worden sind, die sich vom Zellinhalt unterscheiden sind für die nach den bekannten Verfahren hergestellten Gebilde auch die Bezeichnungen "Membranvesikel",

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"Ghost-Zellen" oder "Geister-Zellen" oder auch "membraneenvelope" bekannt geworden.

Für die bekannten Verfahren zur Herstellung der Masse aus beladenen Zellen sind sowohl Zellen, die als Einzelzellen in einer physiologischen Lösung vorkommen, wie beispielsweise Erythrozyten, Lymphozyten, Thrombozyten oder Leukozyten, als auch solche Zellen verwendbar, die - wie beispielsweise Leberzellen - in Geweben als Verbände von miteinander zusammenhängenden Zellen angeordnet sind. Denn der Zellverband eines Gewebes ist durch biochemische oder biophysikalische Maßnahmen auflösbar, so daß auf diese Weise in einer Lösung suspendierbare Zellen erhalten werden. Dabei wird bei der Durchführung der bekannten Verfahren, insbesondere beim Einschluß der Stoffe in die beladenen Zellen, eine spezifische Eigenschaft der Membran lebender Zellen ausgenutzt, nämlich die, daß eine in Grenzen vorgenommene Permeabilitätserhöhung durch Regeneration der Zellen wieder ausheilbar ist. Die ausgeheilte Membran der beladenen Zellen erlangt daher wieder die semipermeablen Eigenschaften der Membran der ursprünglichen Zellen. Dadurch ist es - abgesehen von der Verwendung von Stoffen, die nach ihrem Einschluß in die beladenen Zellen die Membran zerstören und dadurch freigesetzt werden - möglich, die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe mit in in einer physiologischen Lösung außerhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen in Wechselwirkung

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zu bringen, ohne daß die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe in die physiologische Lösung gelangen. Das geschieht dadurch, daß die beladenen Zellen in die die Substanzen enthaltende physiologische Lösung eingegeben werden und die Substanz durch Permeation durch die semipermeable Membran der beladenen Zellen gelangen. Dadurch ist es beispielsweise möglich, durch das in beladenen Zellen eingeschlossene Enzym Invertase den in einer physiologischen Lösung befindlichen Rohrzucker zu Glucose und Fructose umzusetzen, da sowohl der Rohrzucker als auch Glucose und Fructose durch die Membran gelangen, während das Enzym Invertase in den beladenen Zellen eingeschlossen bleibt. Auch ist es beispielsweise möglich, Zellen mit Urease zu beladen, die gebildeten beladenen Zellen in die Blutbahn eines menschlichen Körpers zu injizieren und, ohne daß die Urease aus den beladenen Zellen in das Blut freigesetzt wird, den im Blut befindlichen und in die beladenen Zellen eindringenden Harnstoff abzubauen.

Von Nachteil ist bei der nach den bekannten Verfahren hergestellten Masse von beladenen Zellen jedoch, daß die Wechselswirkung der in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe mit den außerhalb der Zellmembran befindlichen Substanzen sich auf den gesamten Bereich der physiologischen Lösung erstreckt und somit die Wirkung des Stoffes nicht auf eine bevorzugte Stelle in der physiologischen Lösung konzentriert werden kann. Werden

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beispielsweise aus Erythrozyten gebildete beladene Zellen in die Blutbahn des tierischen oder menschlichen Körpers injiziert, so erstreckt sich bei der nach den bekannten Verfahren hergestellten Masse von beladenen Zellen die Wirkung des in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffes auf den gesamten Körper. Eine Beschränkung der Wirkung, beispielsweise eines in den beladenen Zellen eingeschlossenen Medikaments auf eine bestimmte Stelle innerhalb der Blutbahn des Körpers oder gar auf ein Organ, ist bei den nach den bekannten Verfahren gebildeten beladenen Zellen nicht möglich.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ausgehend von den aus den vorgenannten Druckschriften bekannten Verfahren, ein Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen zu schaffen, die es ermöglicht, in den beladenen Zellen eingeschlossene Stoffe durch die in die Blutbahn des Körpers injizierten beladenen Zellen durch kontrolliertes Freisetzen aus den beladenen Zellen bevorzugt in der Milz und/oder der Leber des tierischen oder menschlichen Körpers zur Wirkung zu bringen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß zusammen mit zur Wechselwirkung mit in der Milz und/oder der Leber des tierischen oder menschlichen Körpers befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen und den die Zellmembran

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mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen zur Aufnahme in die zu beladenden Zellen osmotisch aktive, mit der Membran verträgliche Substanzen organischer oder anorganischer Art mit einem auf die Membran der Zellen bezogenen Reflexionskoeffizienten von möglichst nahe an 1 in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, daß nach Einschluß der Stoffe und der osmotisch aktiven Substanzen in den beladenen Zellen die Größe und/oder die Form der beladenen Zellen sich von der Größe und/oder der Form der ursprünglich eingegebenen Zellen soweit unterscheidet, daß die beladenen Zellen nach Injizieren in die Blutbahn eines tierischen oder menschlichen Körpers von dem System der Organe Milz und Leber aus dem Blut abgesondert und abgebaut werden.

Die Substanzen mit einem auf die Membran der Zellen bezogenen Reflexionskoeffizienten von 1 werden zu 100 % an der Membran reflektiert und verbleiben somit nach ihrem Einschluß in den beladenen Zellen auch zu 100 % in den beladenen Zellen. Dadurch wird Wasser in die beladene Zelle gesaugt, wobei sich die beladene Zelle bis zum Erreichen des thermodynamischen Gleichgewichts ausdehnt. Die Volumenvergrößerung hängt dabei von der Teilchenzahl der osmotisch aktiven. Substanzen in der beladenen Zelle ab.

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Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäß der Erfindung ferner dadurch gelöst, daß in das Innere der sich bildenden beladenen Zellen Stoffe eingeschlossen werden, die zur Wechselwirkung mit in der Milz und/ oder der Leber des tierischen oder menschlichen Körpers befindlichen Substanzen vorgesehen sind und daß die gebildeten beladenen Zellen in eine isotone Lösung gegeben werden, in der Substanzen organischer Art enthalten sind, die durch Reaktion mit der Lipid- oder Protein-Schicht der Membran ohne Zerstörung der beladenen Zellen die Membran verändern, wobei die beladenen Zellen in der isotonen Lösung solange belassen und die Konzentration der mit der Lipid- oder Protein-Schicht reagierenden Substanzen so gewählt werden, daß die beladenen Zellen nach Injizieren in die Blutbahn eines tierischen oder menschlichen Körpers von dem System der Organe Milz und Leber aus dem Blut abgesondert und abgebaut werden. Substanzen, die mit der Lipid- oder Protein-Schicht der Membran reagieren, sind Substanzen mit reaktiven Gruppen, wie beispielsweise Glutadialdehyd oder Formaldehyd, die mit der Proteinphase reagieren, sowie Difluordinitrobenzol, das mit der Lipidphase reagiert oder auch Lectine. Die Verwendung dieser Substanzen bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung hat dabei den zusätzlichen Vorteil, daß die Membranen der beladenen Zellen stabilisiert werden.

Durch die - möglicherweise mit einer Verformung der beladenen Zellen verbundenen - Volumenveränderung, ebenso durch die Veränderung der Membran der beladenen Zellen wird erreicht, daß die beladenen Zellen von der Milz quasi als Fremdkörper angesehen, dem Blut entnommen und aufgearbeitet werden. Dabei werden die in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe frei und werden über das Pfortadersystem bevorzugt zur Leber transportiert. Es ist somit bei Verwendung von nach den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten beladenen Zellen auf einfache Weise möglich, Medikamente oder auch andere Stoffe, wie beispielsweise Radionuklide in dem Inneren von Milz oder Leber freizusetzen.

Eine vorteilhafte Weiterausgestaltung des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin, daß bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluß in die beladenen Zellen durch Wechselwirkung mit der Zellmembran zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würden - was eine vorzeitige unkontrollierte Freisetzung des Stoffes zur Folge hätte zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen, den osmotisch aktiven Substanzen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen weitere Stoffe, die mit den zur Wechselwirkung mit den außerhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen Wasserstoffbrücken bilden oder kovalente Bindungen eingehen, so daß die Stoffe nicht mit der Membran reagieren können, ihre vorgesehene Wirkung jedoch nicht beeinträchtigt

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wird, in die für den Stoffaustausch vorgesehene physiologische Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, daß nach Einschluß sämtlicher Stoffe in den beladenen /Seilen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran für eine vorbestimmte Zeit verhindert wird. Dadurch ist es möglich, mittels der beladenen Zellen auch solche Stoffe über die Blutbahn zur Milz oder zur Leber zu transportieren, die bei alleinigem Einschluß in die beladenen Zellen zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würden.

Ein die Zellmembran zerstörender Stoff ist beispielsweise Methotrexat, das zu den Folsaureantagonisten gehört, die heute neben alkylierenden Wirkstoffen zu den wirksamsten Substanzen für die Behandlung von Neoplasien (Geschwulsten) zählen. Eine nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellte Masse von beladenen Zellen mit einer Anreicherung von Methotrexat und einem die zur Zerstörung der Membran führende Wirkung des Methotrexats verhindernden Stoff, beispielsweise dem Protein Albumin oder Saccharose ist daher in hervorragender Weise einsetzbar zur direkten Behandlung von Tumoren in der Leber. Während es bisher bei der Behandlung von Lebertumoren lediglich möglich war, Methotrexat direkt in die Blutbahn zu injizieren, wo es überall im Körper seine Wirkung entfaltete und somit auch gesundes Gewebe angriff, ist es nunmehr in vorteilhafter Weise durch Verwendung der beladenen Zellen gemäß der Erfindung

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möglich, Methotrexat direkt in der Milz oder der Leber zur Wirkung zu bringen, ohne daß es in der gesamten Blutbahn des Körpers oder über mehrere Organe verteilt wird. Dadurch wird erreicht, daß eine geringere Dosis Methotrexat als bisher erforderlich für die Tumorbehandlung in den Körper eingebracht zu werden braucht oder daß eine geringere Zahl von Injektionen als bisher nötig ist, was dazu beiträgt, negative Nebenwirkungen beim Einsatz dieses Mittels zu vermeiden.

Eine weitere, ebenfalls sehr vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht ferner darin, daß die Stoffe mit einer aus Liposomen bestehenden Umhüllung eines Durchmessers im Bereich zwischen 5-20 nm in die für den Stoffaustausch vorgesehene physiologische Lösung eingegeben werden. Da die Liposomen nach ihrer Freisetzung aus den beladenen Zellen sofort von dem die Blutbahn angrenzenden Gewebe aufgenommen werden, ist es somit möglich, bestimmte Stoffe in das Innere des Gewebes von Milz und Leber einzubringen.

Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung kann, je nach den Erfordernissen, die Permeabilitätserhöhung wahlweise durch Einwirkung osmotischen Druckes oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erfolgen.

Für den Fall, daß gemäß der in der DT-PS 23 26 224 und in der DT-OS 23 26 191 gegebenen Lehre die Permeabi-

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litätserhöhung durch Einwirkung osmotischen Druckes erfolgen soll, wird bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung, bei dem mit der Membran verträgliche Substanzen mit einem auf die Membran der Zellen bezogenen Reflexionskoeffizienten von möglichst nahe an 1 verwendet werden, folgendermaßen verfahren:

Die für die Herstellung der Masse aus beladenen Zellen vorgesehenen Zellen werden in eine zellverträgliche Lösung, die beispielsweise eine mindestens 0,5 mM/1 Magnesium- und/oder Kalzium sowie Kalium-Ionen enthaltende wäßrige Lösung sein kann, gegeben, deren Osmolarität gegenüber der Osmolarität des Zellinhaltes so niedrig ist, daß durch den in den Zellen dadurch entstehenden osmotischen Druck die Permeabilitätserhöhung der Zellmembran - ohne diese jedoch zu zerstören - bewirkt wird. Falls Erythrozyten zur Herstellung von beladenen Zellen verwendet werden, beträgt der zu wählende Osmolaritätsunterschied etwa einen Faktor 15. In der zellverträglichen Lösung sind außerdem die in den beladenen Zellen einzuschließenden Stoffe enthalten oder werden nunmehr eingegeben. Dabei werden gemäß der durch die Erfindung gegebenen Lehre die osmotisch aktiven, mit der Membran verträglichen Substanzen anorganischer oder organischer Art in geeigneter Dosierung in die zellverträgliche Lösung eingegeben. Nachdem

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der Stoffaustausch zwischen den in der zellverträglichen Lösung befindlichen Stoffen und dem Zellinhalt durch die nunmehr eine erhöhte Permeabilität aufweisende Zellmembran erfolgt ist und der Inhalt der sich bildenden beladenen Zellen praktisch der zellverträglichen Lösung entspricht, wird im Anschluß daran die Osmolarität der zellverträglichen Lösung durch Zugabe osmotisch aktiver stoffe, wie Kalzium-, Kalium- und Natriumionen, auf die Osmolarität des ursprünglichen Zellinhaltes erhöht. Unter osmotisch aktiven Stoffen werden hier Stoffe verstanden, die einen Reflexionskoeffizienten von etwa 0,8 aufweisen, dennoch aber, da sie im allgemeinen in einer zellverträglichen Lösung enthalten sind, einen hinreichenden osmotischen Druck aufbauen. Nach einer Verweilzeit, in der die Zellmembranen ausheilen, werden die so gebildeten beladenen Zellen von der zellverträglichenLösung abgetrennt und die so hergestellte Masse aus beladenen Zellen zur Aufbewahrung in eine isotone, physiologische Flüssigkeit gegeben. Bei Verwendung von Erythrozyten ist es zweckmäßig, zur Ausheilung der bei der Permeabilitätserhöhung bewirkten Veränderungen der Zellmembran die Zellen etwa 5 Minuten bei 0 C zu belassen und sodann für etwa 30 bis 60 Minuten auf Körpertemperatur aufzuwärmen.

Für den Fall, daß gemäß der in der DT-OS 24 05 119 gegebenen Lehre die Permeabilitätserhöhung durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erfolgen soll, wird

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bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wie folgt verfahren:

Die für die Herstellung der Masse aus beladenen Zellen vorgesehenen Zellen werden in eine zweckmäßigerweise zwischen 0⁰C und 25°C liegende Temperatur aufweisende, elektrischen btrom leitende, eine zellverträgliche Elektrolytlösung bildende Flüssigkeit eingegeben. Im Anschluß daran wird die die Zellen enthaltende Elektrolytlösung einem elektrischen Feld mit einer Stärke von 10 bis 10 V/cm solange ausgesetzt, bis die Permeabilität der Zellmembran soweit erhöht ist, daß Moleküle mit einem Radius von wenigstens 0,5 nm durch die Zellmembran gelangen. Dabei wird zweckmäßigerweise die Elektrolytlösung durch den Fokus eines elektrischen Feldes geleitet. Die erfolgte Permeabilitätserhöhung ist beispielsweise bei Anwendung des Verfahrens auf Erythrozyten an der Verfärbung der Elektrolytflüssigkeit infolge des aus dem Zellinneren austretenden Hämoglobins und an der Entfärbung der Erythrozyten zu erkennen. Für den Fall, daß in der zellverträglichen Elektrolytlösung bereits die in den beladenen Zellen einzuschließenden Stoffe und Substanzen enthalten sind, findet nach der Permeabilitätserhöhung der Stoffaustausch statt. Es ist jedoch auch möglich, nach der Permeabilitätserhöhung die Zellen noch vor dem erfolgten Ausheilen der Zellmembran in eine zellverträgliche Lösung zu geben, deren Osmolarität der Osmolarität des zellinhaltes der ursprünglichen Zellen entspricht. In dieser zellverträglichen Lösung, in der die in die beladenen Zellen einzuschließenden

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Stoffe enthalten sind, findet der Stoffaustausch zwischen den Stoffen und dem Zellinhalt statt. Nach einer Verweilzeit, in der die Zellmembranen ausheilen, werden die gebildeten beladenen Zellen von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und die so hergestellte Masse aus beladenen Zellen zur Aufbewahrung in eine isotone,physiologische Flüssigkeit gegeben. Bei Verwendung von Erythrozyten ist es zweckmäßig, die beladenen Zellen in einer Kaliumchloridlösung herzustellen und die gebildeten beladenen Zellen sodann in eine isotone Natriumchloridlösung zu übertragen, die in ihrer Ionenkonzentration und Osmolarität dem Blutserum entspricht.

Ausführungsbeispiel 1

Erythrozyten, die aus Citratblut durch zweimaliges Zentrifugierengewonnen worden waren, wurden in einer Lösung im Verhältnis von etwa einem Volumenteil Erythrozyten zu 10 Volumenteilen Lösung suspendiert, wobei die Lösung

105 mM KCl; 20 mM NaCl; 4 mM MgCl₂; /,6 mM Na₃HPO₄; 2,4 mM NaH₃PO₄ und 10 mM Glucose

enthielt. Dabei war das Na₃HPO₄ und das NaH₃PO₄ der Lösung zugegeben worden, um gemäß der Erfindung die Volumenvergrößerung der beladenen Zellen zu bewirken. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,2.

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Von der so gebildeten Suspension wurden 10 ml in einer hierfür geeigneten Apparatur für 40 ,us bei 0⁰C einer elektrischen Feldstärke von 12 kV/cm ausgesetzt. Etwa 1 Minute nach Anwendung des elektrischen Feldes, auf die die Hämolyse erfolgte, wurden 5 mM pro Liter Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, der Lösung zugegeben. Nach der Hämolyse, die etwa 5 Minuten dauerte, wurde die Lösung für weitere 5 Minuten auf 0⁰C gehalten, um einen Ausgleich des Zellinneren mit der Außenlösung, die das Methotrexat enthielt, zu erreichen. Im Anschluß daran wurde die Temperatur der Lösung auf 37°C erhöht, um das Ausheilen der in den Membranen durch das elektrische Feld bewirkten Veränderungen zu beschleunigen. Der Ausheilvorgang war dabei nach etwa 20 Minuten abgeschlossen. Die beladenen Zellen wurden sodann bei einer Beschleunigung, die dem lOOOOfachen Wert der Erdbeschleunigung entspricht, 10 Minuten lang abzentrifugiert und das so erhaltene Sediment an beladenen Zellen in einer physiologischen Lösung suspendiert, die wie folgt zusammengesetzt war:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na₂HPO₄; 2,7 mM NaH₂PO₄.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4, die Suspensionsdichte der Lösung 6 %.

Wie eine Untersuchung an einem Teil der gebildeten beladenen Zellen zeigte, war das mittlere Volumen der so gebildeten beladenen Zellen um 35 % größer als das der ursprünglichen Erythrozyten.

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200 /Ul der die beladenen Zellen enthaltenden physiologischen Lösung wurden in die Schwanzvene einer Maus injiziert. Etwa 10 Minuten nach der Injektion wurden in der Leber 98 % des injizierten Methotrexats, nach einer Stunde noch über 25 % und nach einer weiteren Stunde noch 15 % festgestellt. Selbst nach 3 Stunden wurden noch 10 % der Aktivität in der Leber nachgewiesen.

Bei einer Lagerung der beladenen Zellen bei etwa 4°C wurden nach etwa einem Tag noch 90-%, nach 2 Tagen 87 %, nach 4 Tagen noch 65 % und nach 7 Tagen noch 53 % der beladenen Zellen im Zellsediment nachgewiesen.

Bei einem Testversuch zur Herstellung von mit Methotrexat beladenen Zellen des gleichen Volumens wie das der ursprünglichen Erythrozyten wurde von der zuerst hergestellten, die Erythrozyten enthaltenden Suspension ausgegangen und - wie weiter oben beschrieben 10 ml der Suspension elektrischen Impulsen ausgesetzt. Sofort nach der Applizierung der elektrischen Impulse wurde der Suspension 25 ml einer Lösung folgender Zusammensetzung zugegeben:

63 mM KCl; 12 mM NaCl; 12,4 mM MgCl₂; 4,56 mM Na₂HPO₄; 1,44 mM NaH₃PO₄; 6 mM Glucose und 5 mM Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war.

Der pH-Wert der zugegebenen Lösung betrug 7,2.

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Nach weiteren 5 Minuten bei O⁰C wurden 10 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung zugefügt:

210 mM KCl; 40 mM NaCl? 8 mM MgC^; 15,2 niM Na₃HPO₄; 4,8 mM NaH₃PO₄; 20 mM Glucose und 5 mM Methotrexat.

Die Temperatur wurde sodann auf 37°C erhöht. Die dabei gebildeten beladenen Zellen wurden nach Abzentrifugieren in eine physiologische Lösung der oben angegebenen Zusammensetzung suspendiert und ebenso in die Schwanzvene einer Maus injiziert. 10 Minuten nach der Injektion wurden 60 % der injizierten beladenen Zellen in der Leber nachgewiesen.

Bei einem weiteren Testversuch, bei dem die gleiche Dosis an Methotrexat direkt in die Vene injiziert worden war, ergaben sich folgende Werte:

Etwa 10 Minuten nach der Injektion waren etwa 24 % des Methotrexats in der Leber akkumuliert. Nach 1 bis 2 Stunden war die Aktivität an Methotrexat in der Leber auf weniger als 1 % abgesunken.

Ausführungsbeispiel 2

Erythrozyten wurden im Volumenverhältnis von 1 : 10 in einer Lösung suspendiert, die:

105 mM KCl; 20 mM NaCl; 4 mM MgCl₂; 5 mM Tris-

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HCl; 10 mM Saccharose und 10 mM Glucose

enthielt. Dabei waren - im Unterschied zu Ausführungsbeispiel 1 - Tris-HCl und Saccharose der Lösung zugegeben worden, um gemäß der Erfindung die Volumenvergrößerung der beladenen Zellen zu bewirken. Der pH-Wert der Lösung betrug wiederum 7,2.

Die beladenen Zellen wurden - wie in Ausführungsbeispiel 1 durch Anwendung eines elektrischen Feldes bei gleichzeitigem Einschluß von mit Tritium markiertem Methotrexat gebildet.

Nach dem Abzentrifugieren der beladenen Zellen aus der Lösung und Bilden der für die Injektion vorgesehenen Lösung wurden nach Injektion von 500 ml der physiologischen Lösung in die Schwanzvene einer Maus die gleichen Ergebnisse erzielt wie in Ausführungsbeispiel 1.

Ausführungsbeispiel 3

Die beladenen Zellen wurden - wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben - gebildet, wobei jedoch zusätzlich zu dem mit Tritium markierten Methotrexat noch 0,1 Volumen % Albumin in die Lösung gegeben wurden, in der die Erythrozyten dem elektrischen Feld zur Permeabilitätserhöhung und zum Einschluß der Stoffe ausgesetzt wurden. Die Untersuchungen an einer Maus ergaben die gleichen Ergebnisse wie in Ausführungsbeispiel 1.

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Die beladenen Zellen konnten bei einer Temperatur von etwa 4 C über eine längere Zeit gelagert werden als die nach dem Ausführungsbeispiel 1 gebildeten beladenen zellen. Nach 7 Tagen wurden noch 75 % der beladenen Zellen im Zellsediment nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 4

Zunächst wurden unter Anwendung der in Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972, 46, 1660 von C. Huang und J. P. Charlton beschriebenen Methode Liposomenteilchen hergestellt. Dazu wurde zu b mg Lecithin 1 ml einer Lösung gegeben, die 0,15 M KCl, 0,01 M Tris-Puffer und 1 mM mit Tritium markiertes Methotrexat enthielt. Der pH-Wert der zugegebenen Lösung betrug 8. Die Liposomenteilchen, in denen Methotrexat enthalten war, wurden anschließend durch Anwendung von Ultraschall gebildet.

Wie in Ausführungsbeispiel 1 wurden daraufhin Erythrozyten einem elektrischen Feld zur Erhöhung der Permeabilität der Membran der Zellen ausgesetzt. Etwa eine Minute nach Applizierung des elektrischen Feldes wurde die die Liposomenteilchen enthaltende Lösung im Verhältnis 1 : 10 der die Erythrozyten enthaltenden Lösung zugesetzt und die beladenen Zellen gebildet.

Wie in Ausführungsbeispiel 1 wurden 200 .ul einer physiologischen Lösung, die die beladenen Zellen enthielt.

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in die Schwanzvene einer Maus injiziert. 10 Minuten nach der Injektion wurden praktisch 100 % der Methotrexatdosis in der Leber festgestellt, nach einer Stunde noch etwa 60 %.

Ausführungsbeispiel 5

Es wurde von einer Erythrozyten enthaltenden Suspension der in Ausführungsbeispiel 1 angegebenen Zusammensetzung ausgegangen und - wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben - 10 ml der Suspension elektrischen Impulsen ausgesetzt. Sofort nach der Applizierung des elektrischen Feldes wurden der Suspension 25 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung zugegeben

63 mM KCl; 12 ml NaCl; 2,4 mM MgCl₂; 4,56 mM Na₃HPO₄; 1,44 mM NaH₂PO₄; 6 mM Glucose und 5 mM Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,2.

Nach weiteren 5 Minuten bei 0⁰C wurden 10 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung zugefügt:

210 mM KCl; 40 mM NaCl; 8 mM MgCl₃; 15,2 mM Na₃HPO₄; 4,8 mM NaH₂PO₄; 20 mM Glucose und 5 mM Methotrexat.

Die Temperatur der Lösung wurde sodann für 20 Minuten auf 37°C erhöht.

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Nach zweimaligem Waschen der gebildeten beladenen Zellen in isotoner NaCl-Lösung wurden die beladenen Zellen im Volumenverhältnis von 1 : 20 in eine isotone, phosphatgepufferte NaCl-Lösung, die 5 mM Glutadialdehyd enthielt, für 5 Minuten inkubiert.

Nach Abzentrifugieren und zweimaligem Waschen der Zellen wurden 300 ,ul der Zellen in 5000 ,ul physiologischer Lösung der im Ausführungsbeispiel 1 angegebenen Zusammensetzung inkubiert und 200 ,ul dieser Suspension in die Schwanzvene einer Maus injiziert. Nach 10 Minuten wurden 95 % der beladenen Zellen in der Leber der Maus nachgewiesen.

Die beladenen Zellen konnten bei einer Temperatur von etwa 4°C über eine längere Zeit gelagert werden als die nach dem Ausführungsbeispiel 1 gebildeten beladenen Zellen. Nach 7 Tagen wurden noch 85 % der beladenen zellen im Zellsediment nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 6

Zur Herstellung von beladenen Zellen durch Einwirkung osmotischen Druckes wurden Erythrozyten im Volumenverhältnis von 1 : 1 in isotoner, phosphat-gepufferter NaCl-Lösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na₂HPO₄; 2,7 mM NaH₂PO₄. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4.

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Von der so gebildeten Suspension wurde 1 ml zur Erhöhung der Permeabilität der Membran der Zellen zu 10 ml einer Lösung unter Rühren zugegeben, die 5 mM Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, 4 mM MgSO. und 50 mM Saccharose enthielt. Die so gebildete Lösung wurde 5 Minuten bei 0⁰C belassen.

Im Anschluß daran wurde die Osmolarität der ursprünglichen Lösung wieder hergestellt, indem eine entsprechende Menge einer 2 molarenJKCl-Lösung zugegeben wurden. Die Lösung wurde darauf 5 Minuten bei 0⁰C belassen und sodann die Temperatur der Lösung für 20 Minuten auf 37 C erhöht, um das Ausheilen der Membranen zu beschleunigen. Nach Abzentrifugieren der so gebildeten beladenen Zellen aus der Lösung wurden die Zellen in eine isotone, phosphatgepufferte NaCl-Lösung der vorgenannten Zusammensetzung inkubiert.

Die so gebildeten beladenen Zellen enthielten - bezogen auf die Volumeneinheit - praktisch die gleiche Menge an Methotrexat wie das Außenmedium,nämlich 98 % der in dem Außenmedium vorhandenen Konzentration an Methotrexat.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit außerhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen, bei dem die Permeabilität von tierischen oder menschlichen, eine Zellmembran aufweisende, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten, lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der sich so bildenden beladenen Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirkung des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des INhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch

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gekennzeichnet , daß zusammen mit zur Wechselwirkung mit in der Milz und/oder der Leber des tierischen oder menschlichen Körpers befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen zur Aufnahme in die zu beladenden Zellen osmotisch aktive, mit der Membran verträgliche Substanzen organischer oder anorganischer Art mit einem auf die Membran der Zellen bezogenen Reflexionskoeffizienten von möglichst nahe an 1 in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, daß nach Einschluß der Stoffe und der osmotisch aktiven Substanzen in den beladenen Zellen die Größe und/oder die Form der beladenen Zellen sich von der Größe und/oder der Form der ursprünglich eingegebenen Zellen soweit unterscheidet, daß die beladenen Zellen nach Injizieren in die Blutbahn eines tierischen oder menschlichen Körpers von dem System der Organe Milz und Leber aus dem Blut abgesondert und abgebaut werden.

2. Verfahren zur Herstellung einer Masse von in einer physiologischen Lösung suspendierten beladenen Zellen mit einer Anreicherung von zur chemischen oder physikalischen Wechselwirkung mit außerhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen, bei dem die Permeabilität von tierischen oder mensch-

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lichen, eine Zellmembran aufweisende, in einer zellverträglichen Lösung suspendierten, lebenden Zellen durch Einwirkung von osmotischem Druck oder durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erhöht wird und bei dem die Stoffe aus die Zellen umgebender zellverträglicher Lösung durch Permeation durch die die erhöhte Permeabilität aufweisenden Zellmembranen bei gleichzeitigem Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der sich so bildenden beladenen Zellen gelangen und in diesen nach durch Regeneration der Zellen bewirktem Ausheilen der durch Einwirkung des osmotischen Druckes oder des elektrischen Feldes bewirkten Veränderungen der Zellmembran eingeschlossen werden, wonach die beladenen Zellen von der die Stoffe enthaltenden zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in eine physiologische Lösung mit einer Osmolarität, die der Osmolarität des Inhaltes der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch gekennzeichnet , daß in das Innere der sich bildenden beladenen Zellen Stoffe eingeschlossen werden, die zur Wechselwirkung mit in der Milz und/oder der Leber des tierischen oder menschlichen Körpers befindlichen Substanzen vorgesehen sind und daß die gebildeten beladenen Zellen in eine isotone Lösung gegeben werden, in der Substanzen organischer Art enthalten sind, die durch Reaktion mit der Lipid- oder Protein-Schicht der Membran

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ohne Zerstörung der beladenen Zellen die Membran verändern, wobei die beladenen Zellen in der isotonen Lösung solange belassen und die Konzentration der mit der Lipid- oder Protein-Schicht reagierenden Substanzen so gewählt werden, daß die beladenen Zellen nach Injizieren in die Blutbahn eines tierischen oder menschlichen Körpers von dem System der Organe Milz und Leber aus dem Blut abgesondert und abgebaut werden.

Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluß in die beladenen Zellen durch Wechselwirkung mit der Zellmembran zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würden, zur Aufnahme in das Innere der zu beladenden Zellen zusammen mit den Stoffen, den osmotisch aktiven Substanzen und den die Zellmembran mit der erhöhten Permeabilität aufweisenden Zellen weitere Stoffe, die mit den zur Wechselwirkung mit den außerhalb der beladenen Zellen befindlichen Substanzen vorgesehenen Stoffen Wasserstoffbrücken bilden oder kovalente Bindungen eingehen, so daß die Stoffe nicht mit der Membran reagieren können, ihre vorgesehene Wirkung jedoch nicht beeinträchtigt wird, in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung in einer solchen Dosierung eingegeben werden, daß nach Einschluß sämtlicher Stoffe in die beladenen

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Zellen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran für eine vorbestimmte Zeit verhindert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekenn ze lehnet _r daß die Stoffe mit einer aus Liposomen bestehenden Umhüllung eines Durchmessers im Bereich von 5 bis 20 nm in die für den Stoffaustausch vorgesehene zellverträgliche Lösung eingegeben werden.