DE2655801C2

DE2655801C2 - Injizierbare Suspension von Membranvesikeln aus Erythrozyten und Verfahren zur Herstellung der Suspension

Info

Publication number: DE2655801C2
Application number: DE2655801A
Authority: DE
Inventors: Karin 5100 Aachen Bock; Hermann Josef 5170 Jülich Buers; Günter Dr. 5170 Jülich Pilwat; Ulrich Prof. Dr. Zimmermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1976-12-09
Filing date: 1976-12-09
Publication date: 1986-06-26
Also published as: SE7713944L; CH632927A5; SE445294B; FR2373289A1; IL53594A; DE2655801A1; FR2373289B1; GB1560165A; US4224313A; JPS5372890A

Abstract

Es hat sich gezeigt, dass eine Vielzahl von in beladenen Zellen eingechlossenen Stoffen in Wechselwirkung mit der Zellmembran tritt und diese Wechselwirkung eine Zerstoerung der Zellmembran zur Folge hat. Da bei den nach den bekannten Verfahren hergestellten beladenen Zellen auf den Fortgang der Zerstoerung der Zellmembran kein Einfluss genommen werden kann, sind die nach den bekannten Verfahren hergestellten beladenen Zellen in solchen Faellen entweder nur ueber eine sehr begrenzte Zeit oder ueberhaupt nicht einsetzbar. Bei Stoffen, die nach alleinigem Einschluss in den beladenen Zellen zur vorzeitigen Zerstoerung der Zellmembran fuehren, wird angegeben, diese in die fuer den Stoffaustausch vorgesehene physiologische Loesung in einer solchen Dosierung einzugeben, dass nach Einschluss dieser und weiterer Stoffe in den beladenen Zellen die Wechselwirkung der Stoffe mit der Zellmembran fuer eine vorbestimmte Zeit verhindert wird. Die vorgesehene Wirkung der Stoffe wird jedoch nicht beeintraechtigt. ...U.S.W

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf eine injizierbare Suspension von Membranvesikeln aus Erythrozyten mit dem darin enthaltenen Wirkstoff Methotrexat, 6-Fluorouracil oder Arginase.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung der Suspension, bei dem die Erythrozyten in einer zellverträglichen Wirkstofflösung suspendiert und der Einwirkung von osmotischem Druck oder eines elektrischen Feldes derart ausgesetzt werden, daß der Wirkstoff im Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der Erythrozyten gelangt, die nach Regenierung der durch den osmotischen Druck oder das elektrische Feld bewirkten Veränderungen der Zellmembran von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in einer physiologischen Lösung mit einer Osmolarität, die derjenigen des Inhalts der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden.

Verfahren zur Herstellung von Membranvesikeln mit eingeschlossenen Wirkstoffen sind aus der DT-PS

23 26 224, aus der DT-OS 23 26 161 und aus der DT-OS

24 05 119 bekannt. Dabei bezieht sich das aus der erstgenannten Patenschrift bekannte Verfahren auf den Einschluß von Komplexbildnern in Membranvesikeln und das aus der DT-OS 23 26 161 bekannte Verfahren auf den Einschluß von katalytisch wirkenden Stoffen, wobei die beiden bekannten Verfahren die Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran durch Einwirkung osmotischen Druckes auf die Zellmembran erzielt wird. Bei dem aus der DT-OS 24 05 119 bekannten Verfahren wird dagegen die Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran durch Einwirkung eines elektrischen Feldes erreicht.

Neben der Bezeichnung »Membranvesikel« sind für die nach den bekannten Verfahren hergestellten Gebilde auch die Bezeichnungen »Ghost-Zellen« oder »Geister-Zellen« auch »membrane-envelope« sowie die Bezeichnung »beladene Zellen« oder »loaded cells« bekannt geworden, die zum Ausdruck bringen sollen, daß es sich um Zellen handelt, die mit sich vom Zellinhalt unterscheidenden Substanzen »beladen« worden sind.

Für die bekannten Herstellungsverfahren sind sowohl Zellen, die als Einzelzellen in einer physiologischen Lösung vorkommen, wie beispielsweise Erythrozyten, Lymphozyten, Thrombozyten oder Leukozyten, als auch solche Zellen verwendbar, die — wie beispielsweise Leberzellen — in Geweben als Verbänden von miteinander zusammenhängenden Zellen angeordnet sind. Denn der Zellverband eines Gewebes ist durch biochemische oder biophysikalische Maßnahmen auflösbar, so daß auf diese Weise in eine Lösung suspendierbare Zellen erhalten werden. Dabei wird bei der Durchführung der bekannten Verfahren, insbesondere beim Einschluß der Stoffe in die Membranvesikel, eine spezifische Eigenschaft der Membran lebender Zellen avsgenutzt, nämlich die, daß eine in Grenzen vorgenommene Permeabilitätserhöhung durch Regeneration der Zellen wieder ausheilbar ist. Die ausgeheilte Membran der iviCniLrranvesiicei eriangt uSuer wiener nie semipcrmcablen Eigenschaften der Membran der ursprünglichen Zellen. Dadurch ist es — abgesehen von der Verwendung von Stoffen, die nach ihrem Einschluß in die beladenen Zellen die Membran zerstören und dadurch freigesetzt werden — möglich, die in den Membranvesikeln eingeschlossenen Stoffe mit in einer physiologischen Lösung außerhalb der Membranvesikel befindlichen Substanzen in Wechselwirkung zu bringen, ohne daß die eingeschlossenen Stoffe in die physiologische Lösung gelangen. Das geschieht dadurch, daß die Membranvesikel in die physiologische Lösung eingegeben werden und die Substanz durch Permeation durch die semipermeable Membran der Membranvesikel gelangen. Dadurch ist es beispielsweise möglich, durch das in Membranvesikeln eingeschlossene Enzym Invertase den in einer physiologischen Lösung befindlichen Rohrzucker zu Glucose und Fructose umzusetzen, da sowohl der Rohrzucker als auch Glucose und Fructose durch die Membran gelangen, während das Enzym Invertase in den Membranvesikel eingeschlossen bleibt. Auch ist es beispielsweise möglich, Zellen mit Urease zu beladen, die gebildeten Membranvesikel in die Blutbahn eines menschlichen Körpers zu injizieren und, ohne daß die Urease aus den Membransikeln in das Blut freigesetzt wird, den im Blut befindlichen und in die Membranvesikel eindringenden Harnstoff abzubauen.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß eine Vielzahl von in den Membranvesikeln eingeschlossenen Stoffen in Wechselwirkung mit der Zellmembran tritt und diese Wechselwirkung eine Zerstörung der Zellmembran zur Folge hat. Da bH den nach den bekannten Verfahren hergestellten Membranvesikeln auf den Fortgang der Zerstörung der Zellmembran kein Einfluß genommen werden kann, sind die Membranvesikel in solchen Fällen entweder nur über eine sehr begrenzte Zeit, die je nach der Art der Wechselwirkung sehr kurz bemessen sein kann, oder überhaupt nicht einsetzbar.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine injizierbare Suspension von Membranvesikeln aus Erythrozyten mit einem darin enthaltenen, die Zerstörung der Zellmembran bewirkenden Wirkstoff sowie ein Herstellungsverfahren hierfür zu schaffen, das es erlaubt, die Wirkstoffe für eine vorbestimmte Zeit in den Membranvesikeln einzuschließen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch eine injizierbare Suspension der vorgenannten Art gelöst, bei der in den Membranvesikeln zusammen

mit dem Wirkstoff zusätzlich Albumin, Saccharose oder Pronase, Phosphoüpase oder Trypsin eingeschlossen sind.

Die Freigabe des Wirkstoffes wird dabei dadurch gesteuert, daß Stoffe wie Albumin oder Saccharose Wasserstoffbrücken mit dem membranaggressiven Wirkstoff bilden oder kovalente Bindungen mit diesem eingehen und damit dessen membranzerstörende Wirksamkeit hemmen oder daß Stoffe wie Pronase, Phospholipase oder Trypsin selbst durch Einwirkung auf die Zellmembran deren Zerstörung zu einem bestimmten Zeitpunkt herbeiführen.

Die Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art dadurch gelöst, daß in die zellverträgliche Wirkstofflösung Albumin oder Saccharose und/ oder Pronase, Phospholipase oder Trypsin eingegeben werden.

Bei Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird somit beispielsweise der zur Tumorbehandlung vorgesehene, jedoch die Zellmembran angreifende Stoff Methotrexat zusammen mit einem Protein, beispielsweise Albumin oder einem Zucker, beispielsweise Saccharose, in den Membranvesikeln eingeschlossen und dadurch eine injizierbare Suspension geschaffen, bei der die Membranen der Membranvesikel etwa doppelt so lange stabil bleiben. Durch das Verfahren gemäß der Erfindung wird somit der Anwendungsbereich der bekannten Verfahren in vorteilhafter Weise erweitert

Werden beispielsweise nach dem Verfahren gemäß der Erfindung Membranvesikel hergestellt, in denen das bei Enzym-Mangelkrankheiten verwendete Enzym Arginase zusammen mit einer vorbestimmten Dosis eines proteolytische Enz>me und Lipid abbauenden Stoffes wie Pronase, Phospholipsse oder Trypsin eingeschlossen ist, so wird nach Injizieren der Mci.ibranvesikel in die Blutbahn des tierischen oder menschlichen Körpers das Medikament im Körper nach einer vorbestimmten Zeit freigesetzt und zur Wirkung gebracht. Dabei ist es selbstverständlich möglich, eine Mischung von Membranvesikel mit unterschiedlicher Dosis des die Zeilmembran zerstörenden Wirkstoffes in die Blutbahn zu injizieren und so den Verlauf der Freisetzung des Medikaments im Körper in vorbestimmter Weise zu steuern.

Werden in die Membranvesikel zusätzlich zu den Stoffen, die die Zerstörung der Zellmembran hemmen, die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Wirkstoffe eingegeben, so wird je nach der Dosierung dieser Stoffe erreicht, daß die Zellmembranen nach einer vorbestimmten Zeit zerstört werden. Die nicht gewünschte zerstörende Wirkung des lediglich für die Wechselwirkung außerhalb der Zellmembran vorgesehenen Stoffes — beispielsweise des zur Krebsbekämpfung einsetzbaren Mittels 6-Fluorouracil — wird abgebaut und die vorgesehene Zerstörung der Zellmembran allein durch die Wirkung des hierfür vorgesehenen Wirkstoffes herbeigeführt. Damit ist eine bessere zeitliche Steuerung der gewünschten Zerstörung der Zellmembran verbunden.

Ausführungsbeispiel 1

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Erythrozyten, die aus Citratbiut durch zweimaliges Zentrifugieren gewonnen worden waren, wurden in einer Lösung im Verhältnis von etwa 1 Volumenteil Erythrozyten zu 10 Volumenteilen Lösung suspendiert, wobei die Lösung

105 mM
2OmM

KCI;
NaCl:

4 mM MgCl₂;

7.6 mM Na₂HPO₄;
2,4 mM NaH₂PO₄ und

10 mM ' Glucose

enthielt Der pH-Wert der Lösung betrug 7,2.

Von der so gebildeten Suspension wurden 10 ml in einer hierfür geeigneten Apparatur für 40psec bei "C einer elektrischen Feldstärke von 12 kV/cm ausgesetzt Etwa 1 Minute nach Anwendung des elektrischen Feldes, auf die die Hämolyse erfolgte, wurden 5 mM pro Liter Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war und 0,1 Volumen % Albumin der Lösung zugegeben. Nach der Hämolyse, die etwa 5 Minuten dauerte, wurie die Lösung für weitere 5 Minuten auf 0⁰C gehalten, um einen Ausgleich des Zellinneren mit der Außenlösung, die das Methotrexat enthielt zu erreichen. Im Anschluß daran wurde die Temperatur der Lösung auf 37°C erhöht um das Ausheilen der in den Membranen durch das elektrische Feld bewirkten Veränderungen zu beschleunigen. Der Ausheilvorgang war dabei nach etwa 20 Minuten abgeschlossen. Die beladenen Zellen wurden sodann bei einer Beschleunigung, die dem lOOOOfachen Wert der Erdbeschleunigung entspricht 10 Minuten lang abzentrifugiert und das so erhaltene Sediment an beladenen Zellen in einer physiologischen Lösung suspendiert die wie folgt zusammengesetzt war:

138,6 mM NaCl;
123 mM Na₂HPO₄;

2.7 mM NaH₂PO₄.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4, die Suspensionsdichte der Lösung 6%. Um die Wirkung des eingeschlossenen Albumins festzustellen, wurden nach 20 Stunden die beiadenen Zellen von der Lösung abzer.-trifugiert und die Radioaktivität in der Lösung und in den noch intakten beladenen Zellen gern 'ssen. Die gleichen Messungen wurden an beladenen Zellen durchgeführt, die auf gleiche Weise wie oben beschrieben, jedoch ohne Einschluß von Albumin, hergestellt worden waren. Ein Vergleich der Meßwerte zeigte, daß nach 20 Stunden 33% mehr intakte Zellen mit eingeschlossenem Albumin vorhanden waren als solche ohne eingeschlossenes Albumin.

Ausführungsbeispiel 2

Die beladenen Zellen wurden, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt. Anstelle der Zugabe von Methotrexat und Albumin in die die Erythrozyten enthaltende Lösung wurde jedoch noch vor der Applizierung des elektrischen Feldes in die die Erythrozyten enthaltende Lösung Saccharose, das mit dem Radionuklid C 14 markiert worden war, und Pronase P zugegeben. Der Anteil an Saccharose in der Lösung betrug 10 mM.der an Pronase/Ό.01 mg pro 100 ml.

Die Wirkung der in den beladenen Zellen eingeschlossenen Pronase P wurde, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, durch Messung der Radioaktivität in den beiadenen Zellen und Vergleich mit beladenen Zellen, in denen zwar Saccharose, nicht aber Pronase P eingeschlossen worden war, festgestellt. Nach 20 Stunden betrug die Menge an Pronase Fernhaltenden intakten Zellen nur noch 11% der Menge an intakten beladenen Zellen, in denen keine Pronase P eingeschlossen war.

Ausführungsbeispiel 3

Die beladenen Zellen wurden, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt Anstelle der Zugabe von Methotrexat und Albumin in die die Erythrozyten enthaltende Lösung wurden jedoch noch vor der Applizierung des elektrischen Feldes in die Lösung Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war. Albumin und Phospholiphase C zugegeben. Der Anteil an Methotrexat betrug 5 mM, der Anteil an Albumin 0,1 Volumen % und der Anteil an Phospholiphase CO₁Ol mg pro 100 ml.

Wie eine Vergleichsmessung, bei der keine Phospholiphase C eingeschlossen wurde, zeigte, waren nach 20 Stunden nur noch 17% der auf die Vergleichsmessung bezogenen Zahl der intakten beladenen Zellen vorhanden.

Ausführungsbeispiel 4

Zur Herstellung von beladenen Zellen durch Einwirkung osmotischen Druckes wurden Erythrozyten im Volumenverhältnis von 1 :1 in isotoner, ι hosphat-gepufferter NaCl-Lösung der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

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133,6 mM NaCl;
123 mM Na₂HPO₄;
2,7 mM NaH₂PO₄.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4.

Von der so gebildeten Suspension wurde 1 ml zur Erhöhung der Permeabilität der Membran der Zellen zu 10 ml einer Lösung gegeben, die 5 mM Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, 4 mM MgSO₄ und 50 mM Saccharose enthielt, unter Rühren zugegeben. Diese Lösung wurde 5 Minuten lang bei 0⁰C belassen.

Im Anschluß daran wurde die Osmolarität der ursprünglichen Lösung wieder hergestellt, indem eine entsprechenc'2 Menge einer 2 molaren KCI-Lösung zügegeben wurde. Die Lösung wurde daraufhin weitere 5 Minuten bei 0⁰C belassen und im Anschluß daran die Temperatur für 20 Minuten anf 37°C erhöht, um das Ausheilen der Membranen zu beschleunigen. Nach Abzentrifugieren der so gebildeten beladenen Zellen aus der Lösu.ig wurden die Zellen in et.ie isotone, phosphatgepufferte Natriumchlorid-Lösung der obengenannten Zusammensetzung inkubiert.

Die so gebildeten beiadenen Zellen enthielten praktisch die gleiche Konzentration an Methotrexat wie das Außetimedium, nämlich 98%.

Eine Vergleichsmessung zur Überprüfung der Haltbarkeit der der gebildeten beladenen Zellen ergab etwa das gleiche Ergebnis wie in Ausführungsbeispiel 1.

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•5

Claims

Patentansprüche:

1. Injizierbare Suspension von Membranvesikeln aus Erythrocyten mit dem darin enthaltenen Wirkstoff Methotrexat, 6-Fluorouracil oder Arginase, dadurch gekennzeichnet, daß in den Membranvesikeln zusammen mit dem Wirkstoff zusätzlich Albumin, Saccharose oder Pronase, Phospholipase oder Trypsin eingeschlossen sind.

2. Verfahren zur Herstellung einer Suspension nach Anspruch 1, bei dem die Erythrocyten in einer zellverträglichen Wirkstofflösung suspendiert und der Einwirkung von osmotischem Druck oder eines elektrischen Feldes derart ausgesetzt werden, daß der Wirkstoff im Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das innere der Erythrocyten gelangt, die nach Regenerierung der durch den osmotischen Druck oder das elektrische Feid bewirkten Veränderungen der Zellmembran von der zellverträglichen Lösung ab-

gCiiCiiul Ui)U £>ui nuiuCndinuiig in CUlCl yiljai\Jl\Jgl~ schen Lösung mit einer Osmolarität, die derjenigen des Inhalts der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß in die zellverträgliche Wirkstofflösung Albumin oder Saccharose und/oder Pronase, Phospholipase oder Trypsin eingegeben werden.