ITBO20100256A1 - Metodo per incapsulare almeno un composto ad uso terapeutico e/o diagnostico all'interno di eritrociti - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

"METODO PER INCAPSULARE ALMENO UN COMPOSTO AD USO TERAPEUTICO E/O DIAGNOSTICO ALL'INTERNO DI ERITROCITI"

SETTORE TECNICO

La presente invenzione è relativa ad un apparato, un kit, un uso e un metodo per l'inserimento di almeno un composto all'interno di eritrociti.

CONTESTO DELL'INVENZIONE

Molti sforzi sono stati recentemente focalizzati sullo sviluppo di procedure per il rilascio mirato di agenti farmaceutici in siti specifici in un paziente o per realizzare un lento rilascio di farmaci nel paziente. È noto che l'efficacia di un farmaco può aumentare quando l'appropriato sito bersaglio viene raggiunto efficientemente dal farmaco stesso, oppure questo venga preferibilmente rilasciato nell'organo da trattare o nella cellula da trattare. Inoltre, la tossicità di un farmaco può essere ridotta quando la quantità totale di farmaco somministrato viene resa minima pur conservando la sua azione terapeutica grazie al rilascio lento del farmaco stesso. L'interesse relativo a sistemi di somministrazione di farmaci riguarda sia agenti convenzionali, parecchi dei quali sono molecole organiche relativamente semplici, sia agenti farmacologicamente attivi più complessi come peptidi, proteine, enzimi, anticorpi, oligonucleotidi antisenso, oligonucleotidi decoy, citochine, acidi nucleici, e combinazione degli stessi, eccetera.

Un'area di recente interesse riguarda l'impiego di globuli rossi (qui di seguito "eritrociti" e "RBC") come vettori per rilasciare i dosaggi terapeutici di farmaci in circolo a basse dosi oppure in un sito mirato in un paziente. Gli eritrociti possono essere "caricati" con agenti biologicamente attivi e mediante un procedimento in cui le membrane cellulari degli eritrociti vengono rese permeabili e agli eritrociti si aggiungono uno o più agenti, effettuando poi la ri-sigillatura delle membrane cellulari. Tali eritrociti, "caricati" o "trattati" offrono numerosi vantaggi come sistemi di rilascio di farmaci e di attacco mirato in quanto sono biodegradabili, possono essere mantenuti nel sistema circolatorio per lunghi periodi di tempo e possono essere mirati verso cellule scelte come, per esempio, macrofagi.

Procedimenti per la preparazione di una sospensione di cellule caricate in una soluzione fisiologica sono descritti nel brevetto tedesco No. 23 26 244 e nelle domande di brevetto tedesco pubblicate No. (OS) 2326 161 e 24 95 119, in cui le membrane cellulari di eritrociti vengono U sate mediante la pressione osmotica e un campo elettrico, rispettivamente.

Il brevetto USA No. 4.224.313, (Zimmermann e al), descrive un metodo per preparare una massa di cellule caricate in sospensione in una soluzione facendo aumentare la permeabilità delle membrane cellulari mediante pressione osmotica indotta esternamente o un campo elettrico o entrambi. Il materiale da caricare include un agente farmaceutico che ha la capacità, quando incorporato in una cellula, di distruggere prematuramente le membrane cellulari, e un agente stabilizzante capace di inibire la reazione dell'agente farmaceutico con le membrane cellulari.

Il brevetto USA No. 4.478.824 (Franco e al.) descrive un metodo per incorporare sostanze entro eritrociti facendo cambiare la pressione osmotica interna di RBC mediante l'azione di agenti chimici, come DMSO e glicerolo, che possono passare attraverso la membrana cellulare e entrare nelle cellule mediante diffusione.

Il brevetto USA No. 4.652.449, (Ropars e al.), descrive un metodo e un'apparecchiatura per incorporare materiali all'interno eritrociti impiegando la pressione osmotica . Il metodo e l'apparecchiatura sono stati impiegati e sperimentati soltanto con elevati volumi di sangue, e questo limita parecchie applicazioni all'impiego di sangue autologo, cioè sangue ottenuto dallo stesso paziente al quale sarà poi re-infuso dopo caricamento del farmaco .

Il brevetto USA No. 4.931.276, (Franco e al.), descrive un metodo per l'incapsulamento di agenti nonionici entro eritrociti. Il metodo è di limitata efficacia quando l'agente desiderato da incorporare non è anionico, o è anionico o polianionico ma non è presente nel mezzo acquoso quasi isotonico ad una concentrazione sufficiente a provocare gli aumenti necessari della permeabilità delle cellule senza la distruzione delle cellule.

Heubsch e al., J. Celi. Physiol., 122:266-272 (1985), dimostrano che in cellule osmoticamente rigonfiate si verifica un distacco del doppio strato lipidico che costituisce la membrana dal citoscheletrico della stessa cellula, con variazioni estreme di dimensione della cellula e assunzione di una forma sferica che non è presente in condizioni normali.

Rassegne di metodi per l'incorporazione di sostanze dentro cellule vengono presentate da Franco e al. in Life Science 32:2763-2768 (1983), Am. J. Hematol. 17:393-400 (1984), e J. Celi. Physiol. 129:221-229 (1986).

Sebbene l'impiego di eritrociti come sistemi di rilascio di farmaci sia stato investigato da parecchi, le metodologie ed i dispositivi che implementano tali metodologie non sono stati ancora sviluppati al punto da poter essere applicati abitualmente nella pratica clinica, nella diagnostica e nella ricerca.

Inoltre, le metodologie ed i dispositivi finora sviluppati non sono sufficientemente flessibili da permettere di ottenere degli eritrociti pronti per qualunque tipo di utilizzazione in campo terapeutico, diagnostico o di ricerca.

Un recente esempio di un apparato per l'incapsulamento di un composto in eritrociti è anche descritto nel brevetto US6139836. Questo apparato sebbene rappresenti un notevole miglioramento rispetto allo stato della tecnica precedente è relativamente complesso, costoso e difficile da usare. A questo riguardo, è importante sottolineare che il funzionamento dell'apparato del brevetto US6139836 richiede la presenza ed il continuo intervento di un operatore specializzato che deve azionare nella corretta successione i diversi componenti dell'apparato stesso. Pertanto, il trattamento (caricamento) degli eritrociti risulta essere relativamente lungo e con il rischio che l'operatore possa commettere degli errori.

Gli apparati noti non presentano un'adeguata portabilità. A causa della loro sostanziale inamovibilità è, pertanto, necessario eseguire la procedura in strutture dedicate e non è possibile operare in siti più accessibili ai pazienti. Inoltre, gli apparati noti necessitano del continuo intervento di personale specializzato.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire un apparato, un kit, un uso ed un metodo, i quali permettano di superare, almeno parzialmente, gli inconvenienti dello stato dell'arte e siano, nel contempo, di facile ed economica realizzazione.

SOMMARIO

Secondo la presente invenzione, vengono forniti un apparato, un kit, un uso ed un metodo secondo quanto licitato nelle rivendicazioni indipendenti che seguono e, preferibilmente, in una qualsiasi delle rivendicazioni dipendenti direttamente od indirettamente dalle rivendicazioni indipendenti.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

L'invenzione viene di seguito descritta con riferimento ai disegni annessi, che ne illustrano alcuni esempi d'attuazione non limitativi, in cui:

la figura 1 è uno schema di un apparato realizzato in accordo con la presente invenzione;

la figura 2 è uno schema di una seconda forma d'attuazione di un apparato realizzato in accordo con la presente invenzione;

la figura 3 è uno schema di una terza forma d'attuazione di un apparato realizzato in accordo con la presente invenzione;

la figura 4 è una vista prospettica parziale con particolari asportati per chiarezza di un dispositivo riutilizzabile del apparato della figura 1;

la figura 5 è una vista dall'alto con particolari asportati per chiarezza dell'apparato della figura 1;

le figure 6 e 7 sono viste laterali prospettiche con particolari asportati per chiarezza dell'apparato della figura 5;

la figura 8 illustra schematicamente alcune parti dell'apparato della figura 1; e

la figura 9 illustra schematicamente un dispositivo usa e getta (disposable) dell'apparato della figura 1.

FORME D'ATTUAZIONE DELL'INVENZIONE

In accordo con un primo aspetto della presente invenzione, viene fornito un apparato per l'inserimento di almeno un composto all'interno di eritrociti.

Nelle figure 1, 5, 6, 7 e 8, con 1 è indicato nel suo complesso un apparato per l'inserimento di almeno un composto all'interno di eritrociti. In particolare, l'apparato 1 è atto a ricevere un campione di sangue contenente gli eritrociti; lavare il campione con una soluzione fisiologica in modo da separare il plasma ed altre cellule del sangue dagli eritrociti; gonfiare (swell) gli eritrociti e U sarli; caricare il composto all'interno degli eritrociti; e richiudere gli eritrociti caricati in modo da ottenere degli eritrociti trattati

In particolare, la soluzione fisiologica è salina ed ad esempio è una soluzione acquosa di NaCl al 0,9% peso/volume. Secondo alternative forme d'attuazione, è un'altra soluzione idonea al lavaggio del sangue.

Più in particolare, quando il campione lavato viene messo in contatto con una prima soluzione, gli eritrociti si gonfiano. Gli eritrociti gonfiati vengono, quindi, esposti ad una seconda soluzione, che fa sì che essi diventino completamente o parzialmente U sati. Successivamente, gli eritrociti U sati o parzialmente U sati vengono concentrati in un emoflitro. Gli eritrociti U sati o parzialmente U sati risultanti vengono messi a contatto con almeno un composto. Facendo questo, il composto si distribuisce sia all'interno degli eritrociti U sati o parzialmente U sati sia all'esterno degli stessi. In altre parole, alcune delle molecole del composto vengono inserite all'interno degli eritrociti. Gli eritrociti, che (a questo stadio della procedura) contengono il composto, vengono poi esposti ad una soluzione di sigillatura.

L'esposizione alla soluzione di sigillatura fa sì che le membrane cellulari si ri-sigillino, incapsulando così il composto entro la cellula. Il cosiddetto "RBC vettore" o "eritrocita trattato" risultante viene poi lavato (con la stessa soluzione fisiologica indicata precedentemente). Ciò viene fatto per rimuovere quanto non sia stato incapsulato negli RBC durante la procedura.

In particolare, i composti sono incapsulati impiegando i metodi della presente invenzione.

Secondo alcune forme d'attuazione, il composto è scelto in un gruppo consistente di: un agente biologicamente attivo, un agente farmacologicamente attivo, nano particelle fino a 500 nm di diametro, un mezzo di contrasto per diagnostica, una sostanza che renda gli eritrociti identificabili con rivelatori di fluorescenza, ottici, magnetici e/o ecografici (e/o con qualsiasi altra metodica adeguata ad evidenziare il mezzo di contrasto incorporato dalla procedura negli eritrociti). In particolare, il composto è un farmaco, una sonda molecolare o un "profarmaco" (cioè un precursore di un agente biologicamente o farmacologicamente attivo).

Secondo alcune forme d'attuazione, il composto è scelto nel gruppo consistente di: peptidi, oligopeptidi, polipeptidi, proteine, enzimi, ormoni, corticosteroidi, glucocorticoidi, agenti anti-infiammatori non steroidei, inibitori di proteasi, glutatione, citochine, tossine, oligonucleotidi e altri acidi nucleici e analoghi nucleosidici che sono ben noti come agenti terapeutici utili. Questi includono 6-mercaptopurina (6-MP) o azatiopurina e fludarabina fosfato che vengono comunemente impiegati come agenti immunosoppressivi e inibitori della crescita di cellule maligne, e azidotimidina fosforilata (AZT), didesossicitosina (ddC) e didesossiinosina (ddl), che sono utili come agenti anti-virali, in particolare nel trattamento dell'AIDS.

Ad esempio, in RBC vettori si può incapsulare il dexametasone21-fosfato (d-21P) e, quando gli RBC caricati vengono introdotti nel sistema circolatorio di un mammifero, il d-21P viene lentamente convertito nel farmaco dexametasone . Poiché il dexametasone può attraversare la membrana cellulare degli eritrociti vettore (mentre d-21P non può) , questo procedimento assicura che al mammifero venga fornito un livello costante dell'agente biologicamente attivo (in questo caso dexametasone) per un certo periodo di tempo.

Secondo specifiche forme d'attuazione, il composto è scelto nel gruppo consistente di: amminoacidi, oligopeptidi (2-10 amminoacidi), polipeptide (10-20 amminoacidi), proteine (più di 20 amminoacidi), ormoni, corticosteroidi, glucorticoidi , FANS, glutatione, citochine, tossine, oligonucleotidi (fino a 20 nucleotidi), polinucleotidi (più di 20 nucleotidi). Gli oligonucleotidi ed polinucleotidi possono contenere uno o più nucleotidi modificati, o analoghi di nucleotidi. Gli amminoacidi, gli oligopeptidi e i polipeptidi possono contenere uno o più aminoacidi modificati o analoghi di aminoacidi. In particolare, il composto è scelto nel gruppo consistente di: amminoacidi, oligopeptidi (2-10 amminoacidi), polipeptide (10-20 amminoacidi), proteine (più di 20 amminoacidi), ormoni, corticosteroidi, glucorticoidi, FANS, glutatione, citochine, tossine, oligonucleotidi (fino a 20 nucleotidi) , desametasone sodio fosfato e betametasone sodio fosfato, glutatione, verde di indocianina (ICG).

Secondo alcune forme d'attuazione, il composto è scelto nel gruppo consistente di: agenti farmacologicamente attivi, peptidi, proteine, ormoni, desametasone sodio fosfato e betametasone sodio fosfato, glutatione, tossine, oligonucleotidi in singolo o doppio filamento(anche incorporanti analoghi di nucleotidi), nano particelle fino a 500 nm di diametro, agenti fluorescenti, verde di indocianina (ICG), altri agenti rilevabili con apparati ottici, ecografici, o per risonanza magnetica, altri agenti di contrasto utilizzabili come mezzi diagnostici di qualsiasi natura e tipologia.

L'apparato 1 comprende un sistema 2 di canali di collegamento; un'unità di inserimento 3 per portare il campione contenente gli eritrociti all'interno dell'apparato 1 stesso; un'unità di separazione 4 per separare tra loro diverse componenti del campione (in particolare il plasma ed altre cellule dagli eritrociti); ed un'unità di combinazione 5, la quale comprende un serbatoio (reservoir) 6 (in particolare, una sacca di raccolta) ed in corrispondenza della quale gli eritrociti ed il composto vengono tra loro combinati in modo da ottenere eritrociti trattati. Si noti che, vantaggiosamente, l'apparato 1 presenta un peso inferiore a 35 Kg è, pertanto, facilmente trasportabile.

L'apparato 1 comprende, inoltre, un ingresso 7 (in particolare un setto perforabile del serbatoio 6) per portare il composto nel serbatoio 6; ed un'unità di alimentazione 8, la quale comprende un canale 9 per alimentare la prima soluzione ed un canale 10 per alimentare la seconda soluzione.

La prima soluzione è atta, quando messa a contatto con gli eritrociti, a gonfiare gli eritrociti stessi ed, in particolare, consiste di una soluzione acquosa di uno o più sali inorganici con un Osmolalità complessiva (vale dire sommando le concentrazioni di tutti i sali disciolti) da circa 100 mOsm/Kg a circa 300 mOsm/Kg . Più in particolare, la prima soluzione consiste di 6 volumi di soluzione fisiologica (soluzione acquosa di NaCl al 0,9% peso/volume) e 4,5 volumi di acqua distillata (o deionizzata).

La seconda soluzione è atta, quando messa a contatto con gli eritrociti, a U sare gli eritrociti stessi ed, in particolare consiste di una soluzione acquosa di uno più sali inorganici con un Osmolalità complessiva (vale dire sommando le concentrazioni di tutti i sali disciolti) da circa 10 mOsm/Kg a circa 150 mOsm/Kg. Più in particolare, la prima soluzione consiste di 6 volumi di soluzione fisiologica (soluzione acquosa di NaCl al 0,9% peso/volume) e 8 volumi di acqua distillata (o deionizzata).

Si noti che l'ingresso 7 premette non solo di inserire il composto all'interno del serbatoio 6, ma anche di portare la soluzione di sigillatura nel serbatoio 6 stesso. La soluzione di sigillatura è atta, quando messa a contatto con gli eritrociti, a risigillare gli eritrociti in modo da incapsulare almeno parzialmente il composto. In particolare, l'ingresso 7 comprende un setto perforabile.

Secondo alcune forme d'attuazione, la soluzione di sigillatura è una soluzione fosfato-inosina-glucosiopiruvato-adenina (PIGPA). La soluzione di PIGPA comprende, in particolare, NaE^PCU circa 33 mM; KC1 circa 1,606 M, NaCl circa 0,194 M; inosina circa 0,1 M; adenina circa 5 mM; ATP circa 20 mM; glucosio circa 0,1 M; piruvato circa 0,1 M; e MgCl2circa 4 mM. Secondo altre forme la soluzione di sigillatura è costituita da una soluzione acquosa di uno o più sali inorganici che abbia caratteristiche di Osmolalità uguali o superiori a quelle del sangue (ovvero uguali o superiori a 280 mOsm/kg) . In una forma di realizzazione vantaggiosa, si impiegano circa dai 5 mi ai 7ml della soluzione di sigillatura per risigillare un volume di circa 50-90 mi di eritrociti lisati.

L'apparato 1 comprende, inoltre, un'unità di concentrazione 11 per concentrare il contenuto del serbatoio 6; ed un'unità di raccolta 12, la quale comprende un serbatoio (reservoir) 13 (in particolare una sacca di raccolta) per raccogliere eritrociti trattati.

Il sistema 2 di canali collega (vale a dire permette il passaggio di fluido tra) l'unità di inserimento 3, l'unità di separazione 4, l'unità di combinazione 5, l'unità di alimentazione 8, l'unità di concentrazione 11 e l'unità di raccolta 12.

In particolare, il sistema 2 canali consiste di uno o più canali. Più in particolare, il sistema 2 comprende un canale 14 di collegamento tra l'unità di separazione 4 e l'unità di combinazione 5.

Secondo vantaggiose forme d'attuazione, nel presente testo, a meno che non sia specificato il contrario, per canale si intende un condotto in materiale elasticamente deformabile e, secondo alcune forme d'attuazione, almeno in alcune parti sostanzialmente trasparente. In particolare, il condotto è in silicone, PVC od altri polimeri, inoltre, può anche contenere inserti tessili per migliorare la tenacità.

L'apparato 1 comprende un'unità di controllo 15, la quale è atta a regolare il funzionamento dell'apparato 1 stesso. Nelle figure 1-3 sono illustrati con linee sottili i collegamenti elettrici (o mediante onde elettromagnetiche) tra l'unità di controllo e le diverse componenti dell'apparato 1. Vantaggiosamente, l'unità di controllo 15 comprende una centralina elettronica ed un'interfaccia operatore (HMI), la quale è dotata ad esempio uno schermo e/o di una tastiera ed attraverso cui l'operatore può modificare e/o visualizzare i parametri operativi e le specifiche di funzionamento.

Secondo alcune forme d'attuazione, l'unità di inserimento 3 comprende un setto 16 perforabile (o comunque di connessione), attraverso il quale è possibile iniettare, (o collegare), (ad esempio mediante una siringa 17) il campione di sangue all'interno di un canale 18 (in particolare, un condotto) del sistema 2 di canali. L'unità di inserimento 3 comprende, inoltre, dei mezzi di regolazione 19 (in particolare, una valvola), i quali sono disposti lungo il canale 18 e sono atti a regolare il flusso lungo il canale 18 stesso. Secondo alcune forme d'attuazione, il canale 18 è collegato al canale 14 tra l'unità di separazione 4 l'unità di combinazione 5.

In particolare, i mezzi di regolazione 19 sono atti a occludere completamente il canale 18 (in modo da sostanzialmente impedire il passaggio di fluido lungo il canale 18) ed a lasciare libero il passaggio di fluido attraverso il canale 18. Più in particolare, i mezzi di regolazione 19 comprendono degli elementi a morsa (clamp) che sono atti a deformare il canale 18 in modo da occludere completamente il lume del canale 18 stesso. I mezzi di regolazione 19 sono azionabili dall'unità di controllo 15.

Secondo alcune forme d'attuazione, l'unità di separazione 4 comprende un gruppo a centrifuga 20 per separare gli eritrociti e/o gli eritrociti trattati da altri componenti del campione. Un serbatoio (reservoir) 21 (in particolare, una sacca di raccolta) è atto a raccogliere quanto separato dagli eritrociti dall'unità di separazione 4 (in particolare) gruppo a centrifuga 20. Il serbatoio 21 è collegato al gruppo a centrifuga 20 mediante un canale (in particolare un canale del sistema 2) 22.

Secondo alcune forme d'attuazione, il gruppo a centrifuga 20 comprende un piatto 23 (sostanzialmente orizzontale) atto a ruotare ed una coppa (bowl) di separazione 24 montata sul piatto 23. Più in particolare, il gruppo a centrifuga 20 comprende un motore 25 (in particolare, un motore DC con sensori per il rilevamento di velocità, direzione e corrente), il quale è atto a ruotare il piatto 23 attorno da un asse sostanzialmente verticale.

L'apparato 1 comprende, inoltre, un sensore (o più sensori) 26 per rilevare aria, pressione parziale di ossigeno, anidride carbonica, emoglobina, ciano emoglobina, ematocrito, osmolarità, sensori ottici per la misura di assorbanza/trasmittanza, misura di fluorescenza, risonanza magnetica, misurazione di onde acustiche (ecografia) e/o altri parametri a monte dell'unità di separazione 4 rispetto all'unità di inserimento 3. In particolare, il sensore 26 è disposto lungo il canale 14 tra il canale 18 ed il gruppo a centrifuga 20. Il sensore 26 è collegato all'unità di controllo 15 ed è atto a comunicare quanto rilevato lungo il canale 14 all'unità di controllo 15 stessa. Secondo specifiche forme d'attuazione, il sensore 26 è atto a rilevare ossigeno a monte dell'unità di separazione 4 rispetto all'unità di inserimento 3.

L'unità di alimentazione 8 comprende un serbatoio (reservoir) 27 (in particolare una sacca), il quale è collegato al sistema 2 attraverso il canale 9 del sistema 2 stesso. Il serbatoio 27 contiene la menzionata prima soluzione.

L'unità di alimentazione comprende un ulteriore serbatoio (reservoir) 28 (in particolare una sacca), il quale è collegato al sistema 2 attraverso il canale 10 del sistema 2 stesso. Il serbatoio 28 contiene la menzionata seconda soluzione.

L'unità di alimentazione 8 comprende dei mezzi di regolazione 29 (in particolare, una valvola), i quali sono disposti lungo il canale 9 e sono atti a regolare il flusso lungo il canale 9 stesso.

L'unità di alimentazione 8 comprende dei mezzi di regolazione 30 (in particolare, una valvola), i quali sono disposti lungo il canale 10 e sono atti a regolare il flusso lungo il canale 10 stesso.

In particolare, i mezzi di regolazione 29 e 30 sono atti ad occludere completamente i canali 9 e, rispettivamente, 10 (in modo da sostanzialmente impedire il passaggio di fluido lungo i canali 9 e 10, rispettivamente) ed a lasciare libero il passaggio di fluido attraverso i canali 9 e 10, rispettivamente. Più in particolare, i mezzi di regolazione 29 e 30 comprendono dei relativi elementi a morsa (clamp) che sono atti a deformare i canali 9 e, rispettivamente, 10 in modo da occluderne completamente il lume. I mezzi di regolazione 29 e 30 sono azionabili (tra loro in modo indipendente) dall'unità di controllo 15.

L'unità di alimentazione 8 comprende, inoltre, mezzi di pompaggio 31, i quali sono atti a movimentare la prima e/o seconda soluzione verso l'unità di combinazione 5 (oppure l'unità di separazione 4). In particolare, i mezzi di pompaggio 31 sono disposti lungo un canale 32 (del sistema 2) per movimentare la prima e/o la seconda soluzione attraverso il canale 32 stesso. Il canale 32 collega i canali 9 e 10 al canale 14.

Secondo alcune forme di attuazione, i mezzi di pompaggio 31 comprendono una pompa peristaltica. Più in particolare, i mezzi di pompaggio 31 comprendono un rotore, su cui sono montati uno o più rulli che deformano (strozzano) il canale 32 muovendosi ripetutamente lungo un tratto del canale 32 stesso.

Vantaggiosamente, l'unità di raccolta 12 comprende dei mezzi di regolazione 33, i quali sono azionabili dall'unità di controllo 15 per regolare il flusso verso il serbatoio 13 dal sistema 2. In particolare, i mezzi di regolazione 33 sono disposti lungo un canale 34 (del sistema 2), il quale è collegato al serbatoio 13.

I mezzi di regolazione 33 sono strutturalmente sostanzialmente identici ai mezzi di regolazione 29 e 30 e funzionano sul canale 34 in modo sostanzialmente identico a come funzionano i mezzi di regolazione 29 e 30 sui canali 9 e 10.

Vantaggiosamente, l'unità di combinazione 5 comprende un dispositivo 35 di mescolamento azionabile dall'unità di controllo 15 per muovere il serbatoio 6 in modo da mescolarne il contenuto. In particolare, l'unità di combinazione 5 comprende un piatto 36 di supporto per alloggiare il serbatoio 6; ed un attuatore (di tipo noto e non illustrato) per muovere (vale a dire fare basculare) il piatto 36 e quindi mescolare il contenuto del serbatoio 6.

Il menzionato attuatore comprende un motore stepper e 4 sensori di posizione per potere controllare la posizione orizzontale del piatto 36, l'oscillazione per un angolo fino a /- 30° ed il mantenimento di un angolo fino a 45° (questa posizione maggiormente inclinata viene assunta durante lo svuotamento del serbatoio 6).

Vantaggiosamente, l'unità di combinazione 5 comprende, inoltre, un elemento riscaldante (di tipo noto e non illustrato - ad esempio una resistenza elettrica) comandabile dall'unità di controllo 15 per scaldare il contenuto del serbatoio 6. Il funzionamento dell'elemento riscaldante è controllato da sonde di temperatura di tipo noto e non illustrato al fine di retro-azionarne il funzionamento tramite l'unità di controllo 15.

Vantaggiosamente, l'unità di combinazione 5 comprende, inoltre, un elemento che ne misura di continuo il peso (di tipo noto e non illustrato - ad esempio una cella di carico) comandabile dall'unità di controllo 15 per misurare il peso (o volume) contenuto del serbatoio 6.

Secondo alcune forme d'attuazione, l'unità di concentrazione 11 comprende un filtro 37 (in particolare, un emofiltro o filtro da dialisi) per separare almeno parzialmente gli eritrociti trattati da un liquido (in particolare, una soluzione acquosa come ad esempio la prima e la seconda soluzione, la soluzione di sigillatura e/o una soluzione fisiologica).

L'unità di concentrazione 11 comprende un aspiratore 38 (in particolare, una pompa per il vuoto che può anche funzionare, al contrario come compressore in particolari soluzioni della presente invenzione, qui non dettagliate), il quale è comandato dall'unità di controllo 15 ed è atto ad aspirare almeno parte del liquido attraverso il filtro 37. L'aspiratore 38 è controllato da uno o più sensori di pressione di tipo noto e qui non illustrati.

Secondo alcune forme d'attuazione della presente invenzione l'aspiratore 38 è in grado di inserire aria all'interno del sistema di canali 2, per testarne la tenuta idraulica e verificare il suo corretto posizionamento rispetto ai mezzi di regolazione sui quali esso è posizionato.

L'unità di concentrazione 11 comprende, inoltre, un serbatoio (reservoir) 39 (in particolare, una sacca o un contenitore rigido) per raccogliere il liquido passato attraverso il filtro 37.

Sono anche previsti dei mezzi di pompaggio 40 per portare il contenuto del serbatoio 6 a contatto con il filtro 37. In particolare, il sistema 2 comprende un canale 41, attraverso cui, in uso, il materiale da filtrare e già sottoposto a filtrazione passa dal serbatoio 6 al filtro 37 e viceversa; e, secondo alcune forme d'attuazione, un canale 42 di aspirazione, il quale collega il filtro 37 al serbatoio 6 ed in corrispondenza del quale viene creata la pressione necessaria al movimento dei fluidi lungo il canale 41.

I mezzi di pompaggio 40 sono disposti lungo il canale 42 e, vantaggiosamente, comprendono una pompa peristaltica. Più in particolare, i mezzi di pompaggio 40 comprendono un rotore, su cui sono montati uno o più rulli che deformano (strozzano) il canale 42 muovendosi ripetutamente lungo un tratto del canale 42 stesso.

II sistema 2 di canali comprende, inoltre, un canale 43, che collega il filtro 37 al serbatoio 39; ed un canale 44 che collega il serbatoio 39 all'aspiratore 38.

L'apparato 1 comprende, inoltre, un'ulteriore unità di alimentazione 45 per alimentare una terza soluzione (in particolare, una soluzione fisiologica) . In particolare, l'unità di alimentazione 45 comprende dei mezzi di regolazione 46, i quali sono azionabili dall'unità di controllo 15 per regolare il flusso dall'unità di alimentazione 45 stessa.

Secondo la forma d'attuazione illustrata, i mezzi di regolazione 46 sono disposti lungo un canale 47 (del sistema 2). I mezzi di regolazione 46 sono strutturalmente sostanzialmente identici ai mezzi di regolazione 29 e 30 e funzionano sul canale 47 in modo sostanzialmente identico a come funzionano i mezzi di regolazione 29 e 30 sui canali 9 e 10.

Vantaggiosamente, l'unità di alimentazione 45 comprende un serbatoio (reservoir) 48 (in particolare, una sacca), il quale contiene la soluzione fisiologica, ed è collegato al sistema 2 di canali, in particolare, attraverso il canale 47.

L'apparato 1 comprende, inoltre, mezzi di pompaggio 49, i quali sono azionabili dall'unità di controllo 15 e sono atti a movimentare fluidi almeno tra le unità di inserimento, separazione, combinazione e raccolta 3, 4, 5 e 12. Vantaggiosamente, i mezzi di pompaggio 49 sono atti a movimentare fluidi tra le unità di inserimento, separazione, combinazione, raccolta ed alimentazione 3, 4, 5, 12 e 45.

I mezzi di pompaggio 49 sono disposti lungo il canale 14. Secondo alcune forme d'attuazione, i mezzi di pompaggio 49 comprendono una pompa peristaltica. Più in particolare, i mezzi di pompaggio 49 comprendono un rotore, su cui sono montati uno o più rulli che deformano (strozzano) il canale 14 muovendosi ripetutamente lungo un tratto del canale 14 stesso.

Vantaggiosamente, l'unità di inserimento 3 e l'unità di raccolta 12 e sono collegate al canale di collegamento 14 tra i mezzi di pompaggio 49 e l'unità di combinazione 5. Anche l'unità di alimentazione 8 (ed eventualmente l'unità di alimentazione 45) è collegata al canale di collegamento 14 tra i mezzi di pompaggio 49 e l'unità di combinazione 5.

Secondo alcune forme d'attuazione, l'apparato comprende, inoltre, dei mezzi di regolazione 50, i quali sono azionabili dall'unità di controllo 15 e sono disposti lungo il detto canale 14. In particolare, i mezzi di regolazione 50 sono disposti tra l'unità di alimentazione 8 e l'unità di separazione 4.

I mezzi di regolazione 50 sono strutturalmente sostanzialmente identici ai mezzi di regolazione 29 e 30 e funzionano sul canale 14 in modo sostanzialmente identico a come funzionano i mezzi di regolazione 29 e 30 sui canali 9 e 10.

Secondo alcune forme d'attuazione, i mezzi di regolazione 50 sono disposti tra l'unità di separazione 4 e l'unità di alimentazione 8. Secondo specifiche forme d'attuazione, i mezzi di regolazione 50 sono disposti tra l'unità di inserimento 3 e l'unità di raccolta 12 (ed eventualmente l'unità di alimentazione 45) da una parte e l'unità di combinazione 5 dall'altra parte. Secondo le forme d'attuazione illustrate, i mezzi di regolazione 50 sono disposti tra i mezzi di pompaggio 49 e l'unità di combinazione 5.

Secondo alcune forme d'attuazione non illustrate, l'apparato 1 è privo dei mezzi di regolazione 50.

Vantaggiosamente, l'apparato 1 comprende, inoltre, un dispositivo di pesatura 51 il quale è atto a rilevare il peso dei serbatoi 27 e 28. Il dispositivo di pesatura 51 è anche atto a rilevare il peso del serbatoio 39. Vantaggiosamente, il dispositivo di pesatura 51 è atto a rilevare il peso del serbatoio 21. Secondo alcune forme d'attuazione non illustrate, il dispositivo di pesatura 51 è atto a rilevare il peso del serbatoio 48. Secondo forme d'attuazione non illustrate,

Secondo alcune forme d'attuazione non illustrate, il dispositivo di pesatura 51 è atto a rilevare il peso dell'unità di inserimento 3.

Il dispositivo di pesatura 51 è atto a trasmettere i dati rilevati all'unità di controllo 15. In particolare, l'unità di controllo 15 è atta a regolare il funzionamento dei mezzi di regolazione 29 e 30 dei mezzi di pompaggio 31 e dell'aspiratore 38 in funzione dei pesi dei serbatoi 27, 28 e 39 rilevati dal dispositivo di pesatura 51.

Secondo alcune forme d'attuazione, l'aspiratore 38 è in grado di inserire aria all'interno del sistema 2 di canali prima che l'operatore inserisca la siringa 17 contenente il sangue, per testarne la tenuta idraulica e verificare il suo corretto posizionamento rispetto ai mezzi di regolazione sui quali esso è posizionato.

Viene qui di seguito riportata una breve descrizione del funzionamento dell'apparato 1 a partire da un istante, in cui un operatore inserisce un campione di sangue attraverso il setto 16 mediante la siringa 17 (che potrebbe anche essere sostituita da una sacca). Si specifica che nella descrizione che segue, a meno che non sia esplicitamente indicato il contrario, le diverse parti dell'apparato 1 sono comandate dall'unità di controllo 15.

Durante l'iniezione del campione, i mezzi di regolazione 50, 33 e 46 vengono mantenuti chiusi mentre i mezzi di regolazione 19 vengono mantenuti aperti ed i mezzi di pompaggio 49 movimentano il campione verso l'unità di separazione 4. Il motore 25 viene azionato in modo da ruotare il piatto 23 (e la coppa di separazione 24). Quando tutto il campione è entrato nella coppa di separazione 24, il sensore 26 rileva la presenza di composti (in particolare, ossigeno) lungo il canale 14, i mezzi di regolazione 19 vengono chiusi ed i mezzi di regolazione 46 aperti in modo che della soluzione fisiologica raggiunga la coppa di separazione 24.

A questo punto la coppa di separazione 24 separa gli eritrociti dal plasma ed altre cellule, che vengono portati nel serbatoio 21.

Dopo la separazione del plasma, il motore 25 viene arrestato ed gli eritrociti vengono portati nel serbatoio 6 azionando i mezzi di pompaggio 49 e mantenendo i mezzi di regolazione 19, 46 e 33 chiusi ed i mezzi di regolazione 50 aperti.

A questo punto, i mezzi di pompaggio 49 vengono arrestati ed i mezzi di pompaggio 31 azionati in modo da portare la prima soluzione nel serbatoio 6. Durante il trasferimento della prima soluzione all'interno del serbatoio 6 i mezzi di regolazione 30 e 50 (in particolare, anche i mezzi di regolazione 19, 33 e 46) vengono mantenuti chiusi mentre i mezzi di regolazione 29 vengono mantenuti aperti.

L'azionamento dei mezzi di pompaggio 31 (e quindi la quantità della prima soluzione portata nel serbatoio 1) viene regolata dall'unità di controllo 15 sulla base del peso (in particolare, della variazione del peso) del serbatoio 27 rilevato da dispositivo di pesatura 51.

Secondo alternative forme d'attuazione, i mezzi di regolazione 50 vengono mantenuti aperti in modo che parte della prima soluzione raggiunga la coppa di separazione 24 in modo da lavare la coppa di separazione 24 stessa. In questo caso, la porzione della prima soluzione che viene portata nella coppa di separazione 24 viene trasferita al serbatoio 6 azionando i mezzi di pompaggio 49.

Una volta che la prima soluzione è stata inserita nel serbatoio 6, i mezzi di pompaggio 31 vengono bloccati e l'attuatore del piatto 36 viene azionato in modo da impartire un gentile basculamento al serbatoio 6. Il basculamento ha una durata di circa 5-20 minuti. In questo modo, gli eritrociti vengono almeno parzialmente rigonfiati .

Dopo il basculamento, il contenuto del serbatoio 6 viene portato nella coppa di separazione 24 azionando i mezzi di pompaggio 49 e mantenendo aperti i mezzi di regolazione 50.

Nella coppa di separazione 24 (quando i mezzi di pompaggio 49 sono stati arrestati) gli eritrociti almeno parzialmente gonfiati vengono concentrati mediante l'azionamento del motore 25.

Dopo avere concentrato gli eritrociti, il motore 25 viene arrestato ed i mezzi di pompaggio 49 vengono attivati in modo da riportare gli eritrociti almeno parzialmente gonfiati nel serbatoio 6.

A questo punto, i mezzi di regolazione 50 vengono chiusi ed i mezzi di pompaggio 31 vengono nuovamente azionati mantenendo aperti i mezzi di regolazione 29 e chiusi i mezzi di regolazione 30 in modo da portare la seconda soluzione nel serbatoio 6.

Secondo alternative forme d'attuazione, i mezzi di regolazione 50 vengono mantenuti aperti in modo che parte della seconda soluzione raggiunga la coppa di separazione 24 in modo da lavare la coppa di separazione 24 stessa. In questo caso, la porzione della seconda soluzione che viene portata nella coppa di separazione 24 viene trasferita al serbatoio 6 azionando i mezzi di pompaggio 49.

L'azionamento dei mezzi di pompaggio 31 (e quindi la quantità della seconda soluzione portata nel serbatoio 1) viene regolata dall'unità di controllo 15 sulla base del peso (in particolare, della variazione del peso) del serbatoio 28 rilevato da dispositivo di pesatura 51.

Una volta che la seconda soluzione è stata inserita nel serbatoio 6, i mezzi di pompaggio 31 vengono bloccati e l'attuatore del piatto 36 viene azionato in modo da impartire un gentile basculamento al serbatoio 6. Il basculamento ha una durata di circa 1-30 minuti, vantaggiosamente 5-20 minuti. In questo modo, gli eritrociti vengono almeno parzialmente U sati. Durante l'agitazione del serbatoio 6, i mezzi di regolazione 50 vengono tenuti chiusi.

A questo punto, vengono azionati i mezzi di pompaggio 40 per portare il contenuto del serbatoio 6 al filtro 37 attraverso il canale 41. Quando gli eritrociti hanno raggiunto il filtro 37, i mezzi di pompaggio 40 vengono arrestati e l'aspiratore 38 viene, quindi, azionato in modo da concentrare gli eritrociti almeno parzialmente U sati. La concentrazione viene effettuata fintantoché viene recuperata nel serbatoio 39 un'adeguata quantità di fluido. Il corretto contenuto del serbatoio 39 viene misurato rilevando la variazione del peso del serbatoio 39 stesso mediante il dispositivo di pesatura 51.

In altre parole, l'azionamento dell'aspiratore 38 (e quindi la quantità di soluzione acquosa portata nel serbatoio 39) viene regolata dall'unità di controllo 15 sulla base del peso (in particolare, della variazione del peso) del serbatoio 39 rilevato da dispositivo di pesatura 51.

Dopo che gli eritrociti almeno parzialmente U sati sono stati concentrati, l'aspiratore 38 viene arrestato ed i mezzi di pompaggio 40 azionati in modo da riportare gli eritrociti nel serbatoio 6.

L'operatore inietta, quindi, il composto attraverso l'ingresso 7 e successivamente, il piatto 36 viene fatto basculare per circa 1-45 minuti.

Dopo il basculamento, l'operatore inietta la soluzione di sigillatura nel serbatoio 6 attraverso l'ingresso 7. A questo punto, il serbatoio viene fatto basculare per circa 10-40 minuti ad una temperatura di circa 25-40°C in modo da ottenere gli eritrociti almeno parzialmente trattati.

Il contenuto del serbatoio 6 viene, quindi, trasferito al serbatoio 13 azionando i mezzi di pompaggio 49, mantenendo aperti i mezzi di regolazione 50 e 33 e chiusi i mezzi di regolazione 46 e 19 (in particolare anche i mezzi di regolazione 29 e 30).

Secondo una forma d'attuazione non illustrata, l'apparato 1 è privo dei mezzi di pompaggio 31. In questo caso, la prima e la seconda soluzione vengono movimentati grazie ai mezzi di pompaggio 49 e comandando adeguatamente i menzionati mezzi di regolazione.

La figura 3 illustra una variante dell'apparato 1 che differisce dall'apparato 1 delle figure 1 e 8 solamente perché l'apparato 1 è privo dei mezzi di pompaggio 40, comprende mezzi di regolazione V (in particolare, disposti lungo il canale 14 tra i mezzi di pompaggio 49 e l'unità di separazione 4) ed il canale 42 è collegato al canale 14 di collegamento (in particolare, tra i mezzi di pompaggio 49 e l'unità di separazione 4). In questo caso, il trasferimento del contenuto del serbatoio 6 al filtro 37 viene effettuato azionando i mezzi di pompaggio 49 e mantenendo aperti i mezzi di regolazione 50 e chiusi i mezzi di regolazione V.

I mezzi di regolazione V sono strutturalmente sostanzialmente identici ai mezzi di regolazione 29 e 30 e funzionano sul canale 14 in modo sostanzialmente identico a come funzionano i mezzi di regolazione 29 e 30 sui canali 9 e 10.

La figura 2 illustra una variante dell'apparato 1 che permette concentrare gli eritrociti trattati prima del trasferimento al serbatoio 13. La variante della figura 2 differisce dalla variante delle figure 1 e 8 esclusivamente per il fatto di comprendere un ulteriore filtro 52 (in particolare un emofiltro o filtro dializzatore) e mezzi di regolazione 53 e 54 (azionabili dall'unità di controllo 15). Il filtro 52 ed i mezzi di regolazione 53 sono montati tra i canali 41 e 42 e sono atti a concentrare gli eritrociti almeno parzialmente trattati (e lavati) prima che gli eritrociti stessi vengano trasferiti al serbatoio 13. I mezzi di regolazione 54 sono disposti lungo il canale 41 tra il serbatoio 6 ed il filtro 37.

I mezzi di regolazione 53 e 54 sono strutturalmente sostanzialmente identici ai mezzi di regolazione 29 e 30 e funzionano in modo sostanzialmente identico a come funzionano i mezzi di regolazione 29 e 30.

In uso, in particolare, dopo che sono stati ottenuti gli eritrociti almeno parzialmente trattati all'interno del serbatoio 6, il contenuto del serbatoio 6 viene portato al filtro 52 azionando i mezzi di pompaggio 40 e mantenendo chiusi i mezzi di regolazione 54 ed aperti i mezzi di regolazione 53. Quando gli eritrociti hanno raggiunto il filtro 52, i mezzi di pompaggio 40 vengono arrestati e l'aspiratore 38 viene, quindi, azionato in modo da concentrare gli eritrociti almeno parzialmente trattati. La concentrazione viene effettuata fintantoché viene recuperata nel serbatoio 39 un'adeguata quantità di fluido. Dopo che gli eritrociti almeno parzialmente trattati sono stati concentrati, l'aspiratore 38 viene arrestato ed i mezzi di pompaggio 40 azionati in modo da riportare gli eritrociti nel serbatoio 6.

Vantaggiosamente, l'apparato 1 comprende un dispositivo 55 usa e getta (disposable) (si veda in particolare la figura 9) il quale comprende tutte le parti dell'apparato che entrano in contatto diretto con gli eritrociti. In particolare, il dispositivo 55 e comprende il sistema 2 di canali, i serbatoi 6 e 13 e l'ingresso 7. Secondo alcune forme d'attuazione, (ad esempio quella illustrata nella figura 9) il dispositivo 55 comprende, inoltre, i/l filtri/o 37 e/o 52, i serbatoi 27, 28 e 48 e la coppa di separazione 24. Vantaggiosamente, il dispositivo 55 comprende inoltre i serbatoi 21 e 39.

Si noti che il dispositivo 55 comprende le uniche parti che vengono a contatto o potenzialmente potrebbero venire a contatto con il sangue. Il fatto che il dispositivo 55 sia usa getta semplifica notevolmente l'utilizzo dell'apparato 1 e migliora la sicurezza e la velocità di uso.

L'apparato 1 comprende, inoltre, un dispositivo 56 riutilizzabile, il quale è atto a fungere da supporto sul quale viene montato il dispositivo 55. Alcuni particolari di una forma d'attuazione del dispositivo 56 sono illustrati nella figura 4.

Il dispositivo 56 comprende i mezzi di pompaggio 49 ed i mezzi di regolazione 29, 30 e 33. Secondo alcune forme d'attuazione, (come quella illustrata nella figura 4) il dispositivo 56 comprende, inoltre, i mezzi di pompaggio 49, i mezzi di regolazione 19 e 46, il motore per ruotare il piatto 36 (e, vantaggiosamente, il piatto 36 stesso). Il dispositivo 56, vantaggiosamente, comprende anche l'aspiratore 38 (e vantaggiosamente, il sensore 26 ed il dispositivo di pesatura 51) . Secondo specifiche forme d'attuazione, il dispositivo 56 comprende anche i mezzi di regolazione 50. In particolare, il dispositivo 56 comprende anche i mezzi di pompaggio 31 e/o 40.

Nella figura 4, con i numeri 57 e 58 sono rappresentati un braccio di bloccaggio ed un alloggiamento per la coppa di separazione 24, rispettivamente.

L'apparato 1 sopra descritto presenta diversi vantaggi rispetto allo stato dell'arte. In particolare, l'apparato 1 permette di automatizzare quasi tutte le fasi di lavorazione per ottenere gli eritrociti trattati. In questo modo i tempi e le possibilità che l'operatore commetta errori durante la procedura vengono notevolmente ridotti.

L'apparato 1 è anche relativamente semplice, facilmente trasportabile e poco costoso. L'utilizzo dell'apparato 1 viene ulteriormente semplificato e la sicurezza viene ulteriormente migliorata dal fatto che l'apparato 1 comprenda il dispositivo 55 di tipo usa e getta.

A questo riguardo, si noti che, secondo vantaggiose forme d'attuazione, l'apparato comprende non più di tre mezzi di pompaggio (in particolare, da due a tre) ed almeno quattro mezzi di regolazione (vantaggiosamente 5).

Inoltre, l'apparato 1 sopra descritto è estremamente flessibile permettendo, tra l'altro, di ottenere eritrociti trattati a differenti concentrazioni di composto introdotto ed anche a differenti ematocriti e volumi finali.

L'apparato 1 sopra descritto permette un elevato grado di automatizzazione e di controllo (senza necessità di un controllo umano di un operatore) di tutte le sequenze di azioni che permettono di introdurre almeno un composto nei globuli rossi.

In accordo con un secondo aspetto della presente invenzione, viene fornito un kit usa e getta per l'apparato 1; il kit comprende il dispositivo 55 come sopra definito oppure parti del dispositivo 55 da assemblare per ottenere il dispositivo 55 stesso.

In accordo con un terzo aspetto della presente invenzione, viene fornito il dispositivo 56 come sopra definito.

In accordo con un quarto aspetto della presente invenzione, viene fornito un metodo per l'inserimento di almeno un composto (in particolare, come sopra definito) all'interno di eritrociti. Il metodo comprende una fase di lisi, durante la quale qli eritrociti venqono almeno parzialmente U sati venendo sospesi in una seconda soluzione (in particolare, come sopra definita) ipotonica; ed una prima fase di concentrazione, la quale è successiva alla fase di lisi e durante la quale qli eritrociti almeno parzialmente U sati venqono concentrati mediante emofiltrazione .

Vantaqqiosamente, il metodo comprende una fase di inqrossamento, la quale è precedente alla fase di lisi e durante la quale qli eritrociti venqono riqonfiati venendo sospesi in una prima soluzione (in particolare, come sopra definita) ipotonica in modo da ottenere una sospensione; la prima soluzione ipotonica presenta una maqqiore concentrazione di soluti rispetto alla seconda soluzione ipotonica.

Secondo alcune forme d'attuazione il metodo viene attuato con l'apparato in accordo con il primo aspetto della presente invenzione.

Il metodo comprende, inoltre, una fase di combinazione, la quale è contemporanea o successiva alla fase di concentrazione e durante la quale qli eritrociti almeno parzialmente U sati venqono combinati con il composto (oppure con più composti contemporaneamente); una fase di chiusura, la quale è successiva alla fase di combinazione e durante la quale qli eritrociti almeno parzialmente U sati venqono richiusi in modo da incapsulare almeno parzialmente il composto ed ottenere deqli eritrociti trattati; ed una seconda fase di concentrazione, la quale è successiva alla fase di chiusura durante la quale qli eritrociti trattati venqono concentrati.

Vantaqqiosamente, durante la seconda fase di concentrazione qli eritrociti trattati venqono concentrati utilizzando un emofiltro.

Secondo alcune forme d'attuazione, il metodo comprende una terza fase concentrazione, la quale è successiva alla fase di inqrossamento e precedente alla fase di lisi e durante la quale viene ridotto il contenuto d'acqua della sospensione aumentando, di consequenza, la concentrazione deqli eritrociti nella sospensione.

Secondo alcune forme d'attuazione, terza fase di concentrazione avviene utilizzando un'unità di separazione comprendente un gruppo a centrifuga (in particolare, come sopra definito) .

Vantaggiosamente, durante la fase di chiusura gli eritrociti almeno parzialmente lisi vengono posti a contatto con una soluzione di sigillatura (in particolare, come sopra definita).

Secondo alcune forme d'attuazione, il metodo comprende una fase di lavaggio, la quale è successiva alla fase di chiusura (ed eventualmente precedente alla seconda fase di concentrazione) e durante la quale gli eritrociti trattati vengono lavati con una soluzione fisiologica. La fase di lavaggio è atta a rimuovere il composto che non è entrato negli eritrociti ed altre sostanze (es. proteine o soluzione di sigillatura) indesiderate.

In accordo con un quinto aspetto della presente invenzione, viene fornito un metodo per l'inserimento di almeno un composto (in particolare, come sopra definito) all'interno di eritrociti. Il metodo comprende una fase di lisi, durante la quale gli eritrociti vengono almeno parzialmente U sati venendo sospesi in una seconda soluzione (in particolare, come sopra definita) ipotonica; ed una prima fase di concentrazione, la quale è successiva alla fase di lisi e durante la quale gli eritrociti almeno parzialmente U sati vengono concentrati mediante emof iltrazione .

Vantaggiosamente, il metodo comprende una fase di ingrossamento, la quale è precedente alla fase di lisi e durante la quale gli eritrociti vengono rigonfiati venendo sospesi in una prima soluzione (in particolare, come sopra definita) ipotonica in modo da ottenere una sospensione; la prima soluzione ipotonica presenta una maggiore concentrazione di soluti rispetto alla seconda soluzione ipotonica.

Il metodo comprende, inoltre, una fase di combinazione, la quale è successiva alla fase di concentrazione e durante la quale gli eritrociti almeno parzialmente U sati vengono combinati con il composto (oppure con più composti contemporaneamente); una fase di chiusura, la quale è successiva alla fase di combinazione e durante la quale gli eritrociti almeno parzialmente lisi vengono richiusi in modo da incapsulare almeno parzialmente il composto (o i composti) ed ottenere degli eritrociti trattati; ed una seconda fase di concentrazione, la quale è successiva alla fase di ingrossamento e precedente alla fase di lisi e durante la quale viene ridotto il contenuto d'acqua della sospensione aumentando, di conseguenza, la concentrazione degli eritrociti nella sospensione.

Secondo alcune forme d'attuazione, il metodo in accordo con il quinto aspetto della presente invenzione presenta una o più delle caratteristiche del metodo del quarto aspetto della presente invenzione (in questo caso, si noti che la seconda fase di concentrazione del quinto aspetto corrisponde alla terza fase di concentrazione del quarto aspetto e vice versa).

In accordo con un sesto aspetto della presente invenzione, viene fornito un uso dell'apparato del primo aspetto della presente invenzione per l'inserimento di almeno un composto all'interno di eritrociti.

Vantaqqiosamente, il composto è definito in accordo con quanto sopra descritto.

Secondo alcune forme d'attuazione, l'uso dell'apparato avviene in accordo con quanto indicato per il quarto e/o quinto aspetto della presente invenzione.

A meno che non sia esplicitamente indicato il contrario, il contenuto dei riferimenti (articoli, libri, domande di brevetto ecc.) citati in questo testo è qui inteqralmente richiamato. In particolare i menzionati riferimenti sono qui incorporati per riferimento.

Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che seque di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi della realizzazione del sistema 1 microfluidico.

Esempio 1

Questo esempio descrive delle prove di funzionamento del dispositivo della fiqura 1. La metodoloqia usata ha seguito le indicazioni della descrizione del funzionamento dell'apparato 1 sopra riportato in relazione al primo aspetto della presente invenzione.

Sono state realizzate 8 prove di caricamento di Desametasone Sodio Fosfato (impiegando 500mg per ogni procedura) nei globuli rossi umani provenienti da 50 mi di sangue intero da donatori sani.

I materiali utilizzati per le prove sono:

• dispositivo della figura 4;

• dispositivo della figura 9;

• Soluzione Ipotonica 1 (400 mi a osmolalità di 180 mOsm/Kg), Soluzione Ipotonica 2 (200ml a osmolalità di 120 mOsm/Kg);

• Soluzione Ipertonica Risigillante (PIGPA) (NaE^PCU circa 33 mM; KC1 circa 1,606 M, NaCl circa 0,194 M; inosina circa 0,1 M; adenina circa 5 mM; ATP circa 20 mM; glucosio circa 0,1 M; piruvato circa 0,1 M; e MgCl2 circa 4 mM) (7 mi a 2500-3800 mOsm/kg).

• Desametasone Sodio Fosfato in soluzione acquosa 500mg/20 mi (utilizzati interamente)

• Soluzione salina fisiologica (soluzione acquosa di NaCl al 0,9% peso/volume) di grado iniettabile (sacche da 2L di cui utilizzati 1,8L; 0,8 litri per il primo lavaggio ed 1 L per il secondo lavaggio)

• 50 mi di sangue intero da donatore sano anti coagulato con 10'000 IU di Eparina Sodica

Risultati

I dati ottenuti dalle prove sono riportati nella tabella di seguito, dove è possibile verificare l'effettiva riproducibilità dei risultati tra i diversi test eseguiti tramite la deviazione standard.

Tabella 1

all'interno dei

globuli rossi (mg)

Efficienza recupero 43.1 10.3

globuli rossi

rispetto ad iniziali

<(>%<)>

Dati dopo fase Ematocrito (%) (dopo 60.7 7.2

di ulteriore concentrazione

concentrazione ulteriore )

finale Volume di raccolta 8.2 2.5

(dopo concentrazione

ulteriore) (mi)

Nella tabella 1 sono riportati i dati del sangue intero pre-procedure, i dati dopo la procedura di incapsulamento (incluso il caricamento del farmaco nei globuli rossi) ed infine l'effetto di aumento dell'ematocrito in conseguenza della concentrazione finale tramite un ulteriore filtro emoconcentratore (o dializzatore come illustrato nella figura 2).

Per efficienza della fase post procedura si intende, invece, la percentuale dei globuli recuperati rispetto a quelli iniziali che hanno cominciato il processo e pone in relazione il peso netto della sacca di raccolta ed il valore dell'ematocrito alla fine del processo rispetto al volume ed al valore dell'ematocrito iniziale del sangue utilizzato per la procedura.

I dati riportati dimostrano che quanto oggetto della presente invenzione consente di ottenere eritrociti caricate in modo estremamente efficiente, pratico e con ottime rese.

Esempio 2

Nanoparticelle superparamagnetiche

Nanoparticelle superparamagnetiche sono già disponibili ed impiegate come agenti di contrasto in Risonanza Magnetica per Immagine (MRI). Tuttavia, una volta iniettate nel circolo per via intravenosa, le nanoparticelle vengono rapidamente ricoperte dai componenti plasmatici del sangue, processo conosciuto come opsonizzazione che risulta essere altamente critico nel determinare il destino delle nanoparticelle rendendole facilmente riconoscibili al maggior sistema di difesa del corpo, il sistema reticolo endoteliale (RES). È stato dunque ottenuto l'incapsulamento di nanoparticelle superparamagnetiche in eritrociti umani tramite il presente apparato, allo scopo di impedire la loro rapida rimozione dal circolo sanguigno e ottenere quindi finestre temporali di immagine più ampie nelle applicazioni di risonanza magnetica intravascolare (PCT/EP07/06349 Delivery of contrasting agents for magnetic resonance imaging). Come esempio, è stato effettuato il caricamento dell'agente di contrasto SHU555A tramite la procedura e l'apparecchiatura sopra descritte ed oggetto del presente brevetto, come in figura 1. La concentrazione di SHU555A all'interno degli eritrociti alla fine della procedura è stata determinata a seguito di misurazioni in NMR della relassività (TI e T2) dei campioni. La resa di incapsulamento così calcolata ha determinato concentrazioni di SHU555A negli eritrociti nel range di 1-2.1 mM Fe.

Al fine di verificare se le cellule caricate con le nanoparticelle magnetiche tramite l'apparato descritto in figura 1, mantenessero le proprietà degli eritrociti nativi, sono state effettuate misurazioni di alcune caratteristiche di integrità cellulare. In base a tali misurazioni è stato possibile stabilire che la procedura non comporta significative modifiche delle proprietà eritrocitarie quali il volume corpuscolare medio (MCV), l'emoglobina corpuscolare media (MCH) e la concentrazione di emoglobina corpuscolare media (MCHC) che risultano nei range descritti per l'esempio precedente (dex 21 P).In conclusione, le nanoparticelle superparamagnetiche selezionate sono state incapsulate con successo all'interno di globuli rossi tramite l'utilizzo del apparato illustrato in figura 1, fornendo quindi un prodotto con i requisiti necessari per l'utilizzo in clinica da utilizzarsi per scopi diagnostici in MRI (risonanza magnetica per immagini) .

Esempio 3

Agente di contrasto Verde di Indocianina (ICG) Un'ulteriore applicazione della tecnica innovativa relativa al trasporto di molecole esogene all'interno dei globuli rossi è rappresentata dall'incapsulamento di agenti di contrasto da usare in fluorangiograf ia o con altre metodiche di rilevazione, ottica e/o in fluorescenza. Come esempio riportiamo i risultati ottenuti con l'apparato come illustrato in figura 2, dell'incapsulamento dell'agente di contrasto verde di indocianina (ICG), che si propone come nuova strategia a fini diagnostici o terapeutici per la visualizzazione e/o la fotocoagulazione dei neovasi della coroide nelle patologie degenerative e vascolari della retina .

L'ICG è un agente di contrasto nell'infrarosso (IF) costituito da tricarbocianina e approvato dalla FDA in campo diagnostico per visualizzare la vascolarizzazione della retina e per la terapia fotodinamica. Il suo uso come agente di contrasto trae vantaggio dal fatto che la maggior parte delle biomolecole non assorbe né emette nella regione vicino all' IR, rendendo quindi la sua fluorescenza libera da interferenze. L'uso effettivo di ICG come marker fluorescente ed agente foto stabilizzante è però limitato da vari fattori: instabilità in acqua, degradazione per mezzo di luce e calore, breve emivita piasmatica (circa 2-4 min) e rapida escrezione epato-biliare a causa del legame con proteine piasmatiche. Inoltre, le molecole di ICG sono in grado di diffondere attraverso i vasi e il processo di diffusione potrebbe influenzare la semiologia angiografica. La veicolazione di ICG nel compartimento vascolare, utilizzando eritrociti come trasportatori, permette di ovviare a tali limitazioni. In tal modo la molecola, una volta dentro gli RBC, è infatti protetta da un lato dall'inattivazione da parte di fattori endogeni e, d'altro lato, il suo incapsulamento in RBC autoioghi comporta una protezione dell'organismo contro gli effetti tossici dell'agente stesso (nausea, vomito, orticaria, shock ipotensivo etc.). Alla luce di ciò e al fine di migliorare significativamente le caratteristiche dell'angiografia coroidale e della fotocoagulazione laser, è stato utilizzato l'apparato nella sua versione descritta in figura 2, al fine di caricamento di ICG in eritrociti umani autoioghi ed al termine della caricamento i globuli rossi sono stati nuovamente concentrati utilizzando un secondo emofiltro al fine di ottenere lo stesso quantitativo di ICG in un volume ridotto di sospensione di eritrociti ad ematocrito superiore e quindi una concentrazione di ICG superiore.

Al termine della procedura di incapsulamento di ICG impiegando l'apparato come definito in figura 2, quindi con una fase finale di ulteriore concentrazione degli eritrociti, si sono ottenuti mediamente 6 mi di globuli rossi contenenti ICG (0.3 pmoli/ml RBC) al 44% di ematocrito che può essere ulteriormente aumentato fino al 60% di ematocrito prolungando la fase di concentrazione.

Esempio 4

Targeting di eritrociti con incapsulate sostanze farmacologicamente attive e/o utili a fini diagnostici Il targeting a cellule macrofagiche di eritrociti contenenti farmaci e/o mezzi di contrasto può essere realizzato con l'apparato illustrato nella figura seguendo una procedura analoga a quella utilizzata nell'esempio 1. Quando viene impiegata Fludarabina come agente da incapsulare si ottiene una concentrazione finale pari a 0,8 mM. Gli eritrociti così trattati sono riconosciuti da IgG autologhe in percentuali superiori al 80% del numero totale di cellule processate.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1.- Metodo per l'inserimento di almeno un composto all'interno di eritrociti; il metodo comprende: una fase di gonfiamento (swelling), durante la quale gli eritrociti vengono rigonfiati venendo sospesi in una prima soluzione ipotonica in modo da ottenere una sospensione; una fase di lisi, la quale è successiva alla fase di gonfiamento e durante la quale gli eritrociti vengono almeno parzialmente U sati venendo sospesi in una seconda soluzione ipotonica, la quale presenta una minore concentrazione di soluti rispetto alla prima soluzione ipotonica; un prima fase di concentrazione, la quale è successiva alla fase di lisi e durante la quale gli eritrociti almeno parzialmente U sati vengono concentrati mediante emofiltrazione; una fase di combinazione, la quale è durante la quale gli eritrociti almeno parzialmente U sati vengono combinati con il composto; una fase di chiusura, la quale è successiva alla fase di combinazione e durante la quale gli eritrociti almeno parzialmente U sati vengono richiusi in modo da incapsulare almeno parzialmente il composto ed ottenere degli eritrociti trattati; il metodo è caratterizzato dal fatto di comprendere una seconda fase di concentrazione, la quale è successiva alla fase di chiusura durante la quale qli eritrociti trattati venqono concentrati. 2.- Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui durante la seconda fase di concentrazione qli eritrociti trattati venqono concentrati utilizzando un emofiltro o filtro dializzatore (37). 3.- Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, e comprendente una terza fase concentrazione, la quale è successiva alla fase di inqrossamento e precedente alla fase di lisi e durante la quale viene ridotto il contenuto d'acqua della sospensione aumentando, di consequenza, la concentrazione deqli eritrociti nella sospensione. 4.- Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui la terza fase di concentrazione avviene utilizzando un'unità di separazione (4) comprendente un qruppo a centrifuqa (20). 5.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui durante la fase di chiusura qli eritrociti almeno parzialmente lisi venqono posti a contatto con una soluzione di siqillatura. 6.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5, e comprendente una fase di lavaqqio, la quale è successiva alla fase di chiusura e precedente alla seconda fase di concentrazione e durante la quale gli eritrociti trattati vengono lavati con una soluzione fisiologica. 7.- Metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui il composto è scelto nel gruppo consistente di: agenti farmacologicamente attivi, peptidi, proteine, ormoni, desametasone sodio fosfato e betametasone sodio fosfato, glutatione, tossine, oligonucleotidi in singolo o doppio filamento (anche incorporanti analoghi di nucleotidi), nano particelle fino a 500 nm di diametro, agenti fluorescenti, verde di indocianina (ICG), altri agenti rilevabili con apparati ottici, ecografici, o per risonanza magnetica, altri agenti di contrasto utilizzabili come mezzi diagnostici di qualsiasi natura e tipologia.