WO2023027613A1 - Устройство и способ для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа - Google Patents

Устройство и способ для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа Download PDF

Info

Publication number
WO2023027613A1
WO2023027613A1 PCT/RU2022/050261 RU2022050261W WO2023027613A1 WO 2023027613 A1 WO2023027613 A1 WO 2023027613A1 RU 2022050261 W RU2022050261 W RU 2022050261W WO 2023027613 A1 WO2023027613 A1 WO 2023027613A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
erythrocytes
dialyzer
erythrocyte
suspension
biologically active
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/050261
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Фазоил Иноятович АТАУЛЛАХАНОВ
Дарья Валерьевна БОРСАКОВА
Елизавета Андреевна БОВТ
Акоп Дживанович ДАНИЕЛЯН
Азер Мамедович ЗЕЙНАЛОВ
Лариса КОЛЕВА
Никита Сергеевич КУШНИР
Евгений Сергеевич ПРОТАСОВ
Елена Ивановна Синауридзе
Анна Сергеевна СУВОРОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Рбк-Фармэко"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2021125401A external-priority patent/RU2772209C1/ru
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Рбк-Фармэко" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Рбк-Фармэко"
Publication of WO2023027613A1 publication Critical patent/WO2023027613A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61J—CONTAINERS SPECIALLY ADAPTED FOR MEDICAL OR PHARMACEUTICAL PURPOSES; DEVICES OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR BRINGING PHARMACEUTICAL PRODUCTS INTO PARTICULAR PHYSICAL OR ADMINISTERING FORMS; DEVICES FOR ADMINISTERING FOOD OR MEDICINES ORALLY; BABY COMFORTERS; DEVICES FOR RECEIVING SPITTLE
    • A61J3/00—Devices or methods specially adapted for bringing pharmaceutical products into particular physical or administering forms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/10—Apparatus for enzymology or microbiology rotatably mounted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C12M1/38—Temperature-responsive control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/02—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with means providing suspensions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the invention relates to medicine and biology, in particular to devices and methods for creating dosage forms for various enzyme preparations, as well as other biologically active components (BAC) based on erythrocytes, which can be used both in the treatment of a number of diseases and for the purposes of diagnostics.
  • BAC biologically active components
  • Enzymes included in erythrocytes can be used both in enzyme replacement and antitumor therapy, and for removing a number of low-molecular toxic compounds such as ammonia, cyanide, ethyl and methyl alcohol, acetaldehyde, etc. from the bloodstream.
  • L-asparaginase is an integral part of the complex therapy of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in children and adults [2], as well as some other types of cancer [3].
  • Asparaginase is an enzyme that hydrolyzes the amino acid asparagine to aspartic acid and ammonia.
  • Asparaginase has a particularly effective effect on the cells of some tumors, which, unlike normal cells, cannot independently synthesize asparagine (for example, in ALL) [4].
  • intravenous administration of asparaginase is limited by the existence of many side effects, the main of which are the occurrence of severe allergic reactions, as well as a short lifetime of asparaginase in the bloodstream [5,6].
  • asparaginase included in erythrocytes improves its pharmacological properties, tk. greatly increases the lifetime of asparaginase in the bloodstream [7,8]. This is because asparaginase conducts its reaction while inside red blood cells, which protects it. from plasma-derived antibodies and proteases capable of destroying it.
  • the substrate with which asparaginase works - asparagine is able to penetrate from the plasma into the erythrocyte through the erythrocyte membrane [9].
  • Asparaginase for therapeutic use is obtained from bacteria (Esherichia coH.
  • BACs in erythrocytes for example, the low molecular weight anthracycline antibiotic doxorubicin or the terpene-indole alkaloids vincristine and vinblastine, which are also widely used in the treatment of a number of oncological diseases [10-12], makes it possible to create a depot of these drugs in erythrocytes, which are gradually released from erythrocytes. carriers, maintaining a sufficient therapeutic concentration of the drug in the bloodstream for a long time.
  • the low molecular weight anthracycline antibiotic doxorubicin or the terpene-indole alkaloids vincristine and vinblastine which are also widely used in the treatment of a number of oncological diseases [10-12]
  • Russian patent RU 2 595 844 publication date of the PCT application 03.11.2011, A61K 9/50, A61M 1/36, VO 1J 4/00) [17]; V). Mambrini D., Benatti L., Capogrossi D., Mandolini M. Method for producing red blood cells loaded with one or more substances of pharmaceutical interest and thus obtained red blood cells (EryDel SpA, Italy). Russian patent RU 2 670 070, publication date of the PCT application 11/13/2014, A61K 9/50) [18].
  • Godfrin Y Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France).
  • All of these devices are used to incorporate enzymes and other BACs into erythrocytes by various variants of the hypoosmotic method, the principle of which is that the erythrocytes are brought into contact with a hypoosmotic solution (i.e., a solution having a sub-physiological osmolality of 300 mOsm/kg).
  • a hypoosmotic solution i.e., a solution having a sub-physiological osmolality of 300 mOsm/kg.
  • the erythrocyte gradually swells as a result, after reaching the maximum possible volume (while maintaining a constant surface area of the erythrocyte), bursting defects (pores) with a diameter of 8 to 50 nm appear in its membrane, through which hemoglobin and other compounds can leave the erythrocyte, and components can enter the erythrocyte (including asparaginase or other enzymes and low molecular weight compounds, as well as nanoparticles loaded with BAA) present in the external solution.
  • the pore diameter was measured experimentally and ranged from 8 to 50 nm [20–23], while it was found that the formation of pores with a diameter of about 10 nm is sufficient for the release of hemoglobin from an erythrocyte [23, 24].
  • erythrocytes may contain 2 compartments separated by only one flat semi-permeable membrane, or a plurality of semi-permeable membrane hollow fibers surrounded by an outer compartment.
  • a suspension of erythrocytes circulates, and in the second, a hypoosmotic solution to ensure the lysis of erythrocytes.
  • the substance to be included in the erythrocytes is injected with a pump into the tube through which the erythrocyte suspension is fed into the dialysis element (before this suspension passes through the heat exchange device, which provides the temperature required for cell dialysis).
  • the sealing of the resulting carrier erythrocytes can be carried out by sealing the pores in the membranes of these erythrocytes, while restoring normal osmoticity in a suspension of erythrocytes lysed in the presence of the included drug, by incubating them at a temperature of 20 ° C to 40 ° C with a hyperosmotic solution (i.e. a solution with osmolality higher than physiological, component 300 mOsm/kg) both in a separate tank and in the second dialysis element, in the first compartment of which a suspension of lysed erythrocytes circulates, and in the second - a hyperosmotic solution.
  • a hyperosmotic solution i.e. a solution with osmolality higher than physiological, component 300 mOsm/kg
  • the same dialysis element can be used, after appropriate replacement of the buffer in the second compartment and setting the temperature corresponding to each of the processes (from about 0 ° C to 10 ° C for lysis and about 20°C to 40°C to seal red blood cells).
  • the device has a number of standard devices for measuring the temperature in its individual parts, as well as the pressure of the liquid (or erythrocyte suspension) at the inlet to the dialysis elements and the osmotic pressure of the liquid (or erythrocyte suspension) to ensure optimal conditions for all processes.
  • dialyzer parameters are required (dialysis membrane area and dialyzer throughput, which is determined, among other things, by the rate of flow of erythrocyte suspension and lysing solution through individual compartments of the dialysis element), as well as a strict selection of the ratios of the membrane areas of dialysis elements for cell lysis and for their sealing, which cannot always be provided by currently existing models of dialysis elements.
  • the device does not include a cell washer and is not fully automatic.
  • Said device additionally includes a washing unit, which makes it possible to obtain a suspension of washed erythrocytes based on whole blood or erythromass.
  • the inclusion of inositol hexaphosphate in erythrocytes is described, which is added to the medium already at the second and third stages of washing the original erythrocytes.
  • the device also consists of a module for lysis of erythrocytes, in which the temperature is maintained below 10°C (optimally 4°C), and a module for sealing the obtained erythrocyte carriers, in which the temperature is maintained above 20°C (optimally 37°C). All elements of the lysis and sealing modules that come into contact with erythrocytes are disposable (easily replaceable and low cost).
  • any known erythrocyte washer such as the Haemonetics V50®, PCS or Cell Saver® devices, can be used as the RBC washing element in this device.
  • the addition of the included substance to the erythrocyte suspension is proposed to be carried out at the stage of washing the original erythrocytes. This washing consists of three successive steps, the first of which is carried out with saline, and the next two with the same solution containing added IHF. Blocks for the lysis of erythrocytes and sealing of the resulting erythrocyte carriers have a fundamentally similar structure.
  • Each of them contains a container for bringing the suspension of erythrocytes to the desired temperature (4 ° C or 37 ° C, respectively), as well as a container in which dialysis takes place in the presence of IHF thermostated erythrocytes with the addition of a hypoosmotic solution or incubation of a suspension of lysed erythrocytes with a hyperosmotic solution .
  • the lysis block also contains a separate container, in which the erythrocytes already lysed in the presence of BAC are additionally incubated at 4°C before moving on to the sealing block.
  • the vessel for dialysis of erythrocytes (dialysis cartridge) consists of 2 compartments separated by a semi-permeable membrane, through one of which a suspension of washed erythrocytes is pumped in the presence of BAC (from bottom to top), and through the other - a lysing hypoosmotic buffer (from top to bottom).
  • Heat exchange units for temperature control of erythrocyte suspension are mounted on temperature-controlled stainless steel plates, on the reverse side of which there are electric coils to provide the necessary temperature.
  • the device as a whole contains several peristaltic pumps for pumping through the system of lines (that is, tubes connecting individual elements of the device) a suspension of red blood cells, lysing and hyperosmotic buffers, as well as optical or vacuum devices for determining the presence of liquid in the lines, and a device for determining transmembrane pressure in a dialysis cartridge. All peristaltic pumps are controlled automatically by a process-controlling electronic unit, taking into account data received from various sensors. The transmembrane pressure in the dialysis cartridge is maintained at 300 mm Hg. Art.
  • Patents EP 0 882 448 (Dideco Sri, Italy), as well as RU 2 595 844 and RU 2 670 070 C2 (EryDel SpA, Italy) disclose device options for incorporating BAC into erythrocytes isolated from small volumes (usually 50 ml, rarely up to 100 ml) of whole autologous blood of the patient [16,17,18].
  • the original blood is centrifuged to separate the erythrocytes from the plasma, and the erythrocytes are washed with iso-osmotic (i.e., having a physiological osmolality of 300 mOsm/kg) saline using a erythrocyte washing centrifuge bell, which is part of the device.
  • the method of preliminary gradual swelling is used, when erythrocytes are placed sequentially in two hypoosmotic solutions (the osmolality of the second solution is lower than the osmolality of the first one).
  • the osmolality of hypoosmotic solutions is chosen so that after contact with the first solution, erythrocytes swell and spherulate, and after adding the second hypoosmotic solution, erythrocytes are lysed (or partially lysed), with the formation of erythrocyte membrane of temporary pores.
  • the erythrocyte suspension is strongly diluted with a hypoosmotic solution each time (up to a final hematocrit of about 4% - 2.5%), therefore, after the incubation stage with hypoosmotic solutions, the suspension of lysed erythrocytes is concentrated.
  • a dialysis device for example, a cartridge with hollow fibers made of a semipermeable membrane, in which a suspension of lysed (or partially lysed) erythrocytes is pumped along the internal circuit of the dialyzer, and the lysing solution is partially pumped out of the external circuit into an external receiving device.
  • an aqueous solution of the included BAC is added to the concentrated suspension of lysed cells, which begins to enter the erythrocytes through the pores formed in the erythrocyte membrane.
  • the osmolality of the external environment is restored to a normal value by adding a hyperosmotic solution to the cell suspension, as a result of which the pores in the erythrocyte membrane close and part of the included component remains inside the carrier erythrocytes.
  • Most of the process steps are controlled automatically by a special electronic unit.
  • the washing of the original erythrocytes and the resulting erythrocyte carriers is carried out automatically by the device, however, the input of the included component and the hyperosmotic solution into the erythrocyte suspension is performed manually by the operator.
  • the disadvantage of the device is the relatively large loss of intracellular content of erythrocytes, due to the strong dilution of erythrocytes during incubation and lysis in the presence of hypoosmotic solutions, which in turn leads to a decrease in the content of intracellular substances in erythrocytes after their membrane becomes partially lysed.
  • the content of low molecular weight glycolysis metabolites should decrease when the aqueous solution is pumped out of the external circuit of the dialyzer, because these metabolites first enter a large volume of hypoosmotic solutions at the stage of lysis, and then easily pass through the dialysis membrane at the stage of erythrocyte concentration.
  • the device has an oscillating platform heated to a certain temperature for the bag in which the sealing of lysed erythrocytes with the included drug, however, all stages of swelling and lysis of erythrocytes take place at room temperature without cooling solutions and suspensions to about 4 ° C, which causes a decrease in the yield of inclusion of the drug, because It is known that the lifetime of pores formed in the membrane decreases as the temperature rises to room temperature.
  • the device does not have dialyzer pressure sensors during concentration and hematocrit sensors.
  • a device for incorporating BAC into erythrocytes does not differ from the device previously described in patents [16,17], however, it describes a variant of the method for obtaining BAC, in which the loss of intracellular content is reduced, and the efficiency of BAC incorporation increased relative to the method previously described in patents [16,17] due to the fact that the osmoticity of the second hypoosmotic solution is chosen such that lysis of swollen erythrocytes does not occur upon contact with the second hypoosmotic solution.
  • the osmoticity of the suspension of swollen erythrocytes after the addition of the first hypoosmotic solution is 250-200 mOsm/kg
  • the osmoticity of the suspension of swollen erythrocytes after the addition of the second hypoosmotic solution is 200-170 mOsm/kg
  • the osmoticity of the suspension of erythrocytes after two stages of swelling and the addition of the included biologically active component is about 150-110 mOsm/kg.
  • the erythrocytes loaded with BAC are sealed, restoring, as in other methods, the osmolality of the external environment.
  • the lack of full automation of the process and the impossibility of carrying out all stages of the method on one device does not include devices for washing erythrocytes (initial and obtained after the drug is switched on) and works only with erythrocytes previously washed on some external device.
  • the volume of this erythromass can be from 10 ml to 250 ml of packed erythrocytes.
  • the parameters of the lysis process in the dialyzer are set manually by the operator, in accordance with the previously measured osmotic fragility of the erythrocytes used for drug incorporation.
  • the osmotic fragility of RBCs is also measured in an external device. This does not allow fully automating the process of incorporation of the BAC into erythrocytes, since the coefficients in the equations relating various parameters of lysis with individual indicators of the osmotic fragility of the original erythrocytes should be set separately for each type of dialyzers used, because depend on the parameters of the dialyzer itself.
  • the method disclosed in US patent 8,617,840 (EryTech Pharma, France) [19] is chosen, in which to reduce the osmolality of the medium outside the erythrocytes, the process of dialysis of the erythrocyte suspension against a hypoosmotic solution using a dialyzer is used, in which the erythrocyte suspension flows along the inner contour, and the hypoosmotic solution flows countercurrently along its outer contour.
  • the BAC which should be included in the erythrocytes, is placed either in the initial suspension of washed erythrocytes (ie, in the internal circuit), or in the suspension of already lysed erythrocytes after they exit the dialyzer. Then, the erythrocytes loaded with BAC are sealed, restoring, as in other methods, the osmolality of the external environment.
  • the features of this method are such that only washed erythromass can be used as the initial component, work with whole blood is not provided.
  • the volume of this erythromass can be from 10 ml to 250 ml of packed erythrocytes.
  • the steps of the method are also separated by different devices: shortly before the lysis step, the osmotic fragility of erythrocytes is measured, based on the results of which the lysis conditions are selected (osmolarity of the lysing solution and/or or the rate of flow of the cell suspension through the dialyzer), the measurement of cell fragility is carried out on an external device on the sample, the initial temperature of which is from +1 to +8°C. The process takes 20-30 minutes.
  • the cell flow rate in the dialyzer or the osmolarity of the dialysate solution is calculated using the following formulas:
  • Erythrocyte flow rate [A x (H so )] + [ x (I)] + ⁇ (1), where Hzo is the osmolarity at which 50% of the erythrocytes are lysed, V is the volume of the erythrocyte suspension, A and B are variables that are regulated depending on the parameters of the dialyzer and the osmolarity of the lysing solution; K is an adjustable constant.
  • Osmolarity of the lyse solution [C x (I 50 )] + [D x (I)] + K (2), where C and D are variables that are regulated depending on the parameters of the dialyzer and the flow rate of erythrocytes in the dialyzer; K is an adjustable constant.
  • the calculated parameters of the lysis process in the dialyzer are set manually by the operator, because the coefficients in the equations relating various parameters of lysis with individual indicators of the osmotic fragility of the original erythrocytes should be set separately for each type of dialyzers used, because depend on the parameters of the dialyzer itself.
  • This method of adjusting and setting the parameters of the lysis process is long and laborious, and cannot be easily used in any laboratory. In addition, its use increases the likelihood of establishing incorrect values due to the likelihood of operator error.
  • the technical problem that the present invention solves is to eliminate the shortcomings of the known devices.
  • the technical problem solved by the present invention is the creation of a device and method aimed at providing a high and reproducible efficiency (degree) of the inclusion of various BAC in erythrocytes and reducing the loss of intracellular content.
  • the technical result of the present invention is to obtain a high and reproducible degree of incorporation of various BACs into erythrocytes, which is ensured by using the same volume of solution supplied to the input and pumped out at the outlet of the external circuit of the dialyzer at the dialysis stage, achieving the desired hematocrit value of the erythrocyte suspension, maintaining sterile conditions, maintaining transmembrane pressure and pressure in the internal circuit of the dialyzer in the ranges specified for each stage of the process, maintaining the specified temperature regime and the ability to work with the required volume of blood or pre-washed erythromass without loss of quality of the obtained BAC.
  • the degree of incorporation of various BAC into erythrocytes exceeds the degree of incorporation of BAC into erythrocytes for known devices and methods.
  • the invention relates to the creation of a fully automated device for turning on the BAC by conducting hypoosmotic flow dialysis of erythrocytes in the presence of a biologically active component (or components) under sterile conditions, followed by sealing of the obtained carrier erythrocytes, which is the subject of this application.
  • a device for incorporating at least one biologically active component into erythrocytes includes an erythrocyte washing unit, an erythrocyte suspension lysis and concentration unit, an erythrocyte-carrier sealing unit, and a control unit, the erythrocyte washing unit comprising '. device for washing erythrocytes; block lysis and concentration of suspension of erythrocytes contains'.
  • the equipment for temperature control as well as at least one container for erythrocytes connected to the internal circuit of the dialyzer and with a device for washing erythrocytes;
  • the elements of the device are interconnected by lines, and the control unit is configured to synchronize the operation of the elements of the device by receiving signals from sensors and transmitting control signals to valves located on the lines and pumps of the device.
  • a container filled with the blood of a patient or a donor, connected to a device for washing erythrocytes through a line with valves and serving at subsequent stages for collecting and incubating with a hyperosmotic solution of erythrocytes lysed in the presence of a biologically active component, is placed in the erythrocyte-carrier sealing unit.
  • a device for washing erythrocytes is placed in the erythrocyte washing unit.
  • This device is characterized by the presence of a centrifuge, replaceable a centrifuged container, in a particular case, for example, a replaceable centrifuge cone for washing erythrocytes, the necessary pumps and containers with the initial and spent solution for washing erythrocytes.
  • a centrifuge, replaceable a centrifuged container in a particular case, for example, a replaceable centrifuge cone for washing erythrocytes
  • the necessary pumps and containers with the initial and spent solution for washing erythrocytes to operate the device according to the invention.
  • both any known devices for washing erythrocytes can be used, for example, devices from Haemonetics V50®, Cell Saver®, APC 215, etc., as well as specially designed units for washing erythrocytes included in the claimed device.
  • all the devices used make it possible to fill and empty the centrifuged container without removing it
  • Dialyzer a container for collecting a suspension of erythrocytes washed from whole blood, or pre-washed erythrocytes in the case of working with an erythrocyte mass, a container for collecting washed sealed carrier erythrocytes, containers for physiological solution, a container for a hypoosmotic solution, connected to each other and to the dialyzer by means of pipelines with valves, as well as pumps installed at different inlets of the dialyzer, syringe pumps, sensors for pressure and the presence of fluid in the lines, and sensors for measuring hematocrit are located in the lysis and concentration unit.
  • a container with the whole blood of a patient or a donor which is also a container for collecting and sealing erythrocytes lysed in the presence of biologically active components, containers with a suspension of washed erythrocytes and a suspension of sealed carrier erythrocytes are installed on shakers that provide mixing of their contents in the indicated containers at the required temperature.
  • the steps are carried out at room temperature, and in the block for lysis and concentration of the erythrocyte suspension, the temperature is maintained from +2°C to +10°C, preferably from +4°C to +6°C.
  • the whole blood of the patient or donor at the beginning of the procedure and the suspension of erythrocytes lysed in the presence of the biologically active component at the stage of its collection in this container are kept at room temperature, and the subsequent stage of sealing the erythrocytes lysed in the presence of the biologically active component is carried out at a temperature from +25° ⁇ to +40° ⁇ .
  • Bacterial filters can be installed on the lines extending from syringe pumps, from containers with physiological and hypoosmotic solutions.
  • the pumps installed on the external circuit of the dialyzer are configured to pump physiological solution along the external circuit of the dialyzer, wherein one of these pumps is configured to pump saline at a constant speed, and the other pump is with the possibility of pumping saline at a variable rate, maintaining a constant transmembrane pressure in the dialyzer when concentrating at a level of 90-120 mm Hg. Art.
  • the pumps installed on the external circuit of the dialyzer are configured to pump the hypoosmotic solution along the external circuit at the same speed.
  • the pump installed at the inlet to the internal circuit of the dialyzer is configured to pump a suspension of erythrocytes along the internal circuit of the dialyzer at a variable speed, and at the stage of concentration, the speed of the said pump gradually decreases when the pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer exceeds atmospheric by 120 mm Hg. Art., and at the stage of dialysis, the specified pump operates at a variable speed to maintain the transmembrane pressure in the dialyzer at the level of 160-180 mm. rt. Art.
  • Sensors for the presence of liquid in the lines provide control over the end of one stage of the process by transmitting a signal to the control unit, which decides whether it is necessary to switch the corresponding valves in the device to move to the next stage. This contributes to the complete automation of the entire process without the need for operator intervention.
  • the control unit receiving signals from pressure sensors, regulates the transmembrane pressure in the dialyzer and the pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer by changing the speed of the operating pumps, preventing this pressure from increasing above the permissible value, which can lead to the destruction of erythrocytes passing through the dialyzer in these data. conditions.
  • Pressure sensors contribute to obtaining a high yield of carrier erythrocytes, as well as improving their properties, which are close to the properties of the original native erythrocytes.
  • the device uses hematocrit sensors.
  • the presence of these sensors makes it possible to control the achievement of the desired hematocrit value of the suspension obtained in the process of concentrating the erythrocyte suspensions diluted after the washing process (initial or sealed after lysis in the presence of BAC).
  • the device according to the invention is characterized by ease of installation and mobility.
  • the invention relates to the creation of a method for incorporating at least one biologically active component into erythrocytes by the method of flow hypoosmotic dialysis, comprising the following steps: adding at least one biologically active component to a suspension of concentrated erythrocytes washed from whole blood or to preliminarily received erythromass; lysis of erythrocytes in the presence of at least one biologically active component using hypoosmotic flow dialysis; incubating a suspension of erythrocytes lysed in the presence of at least one biologically active component with a hyperosmotic solution to form sealed carrier erythrocytes containing at least one biologically active component; washing sealed erythrocyte carriers containing at least one biologically active component; concentrating, using a dialyzer, sealed carrier erythrocytes containing at least one biologically active component; washing out the sealed carrier erythrocytes remaining there from the dialyzer and adding them to previously obtained sealed carrier eryth
  • the biologically active component (or components) is added to the original erythrocytes or, in the case when whole blood was used as the starting material, to washed from the original whole blood and then concentrated erythrocytes.
  • the step of adding at least one biologically active component to the suspension of concentrated erythrocytes washed from whole blood is preceded by the step of washing erythrocytes from the original whole blood and the step of their subsequent concentration.
  • concentration of a suspension of erythrocytes washed from whole blood makes it possible to avoid their strong dilution before adding the BAC and, thus, to carry out the process of subsequent hypoosmotic lysis at a higher hematocrit and concentration of the BAC, which further increases the efficiency of the inclusion of the BAC and reduces the loss of intracellular content in during dialysis.
  • An additional advantage of the claimed method is the ability to work not only with washed erythrocyte mass, but also with the whole blood of a patient or a donor.
  • the erythrocyte washing step is carried out at room temperature.
  • the stage of lysis and concentration of the erythrocyte suspension is carried out while maintaining the temperature from +2°C to +10°C, preferably from +4°C to +6°C.
  • the stage of sealing lysed in the presence of a biologically active component or components of erythrocytes is carried out at a temperature of from +25°C to +40°C.
  • Such temperature ranges are standard for most methods of BAC incorporation into erythrocytes, and are dictated by the physiological characteristics of the erythrocyte membrane. It is known that the deformability of an erythrocyte changes with temperature [25]. To create stable pores in the membrane at the dialysis stage, it is necessary to ensure a minimum fluidity of the erythrocyte membrane, which is facilitated by low temperature. However, too low a temperature can lead to erythrocyte aggregation [26], so the above range is considered optimal.
  • a constant transmembrane pressure in the dialyzer is maintained at 170 mm Hg. Art, and at the stage of concentration maintain a constant transmembrane pressure of 100 mm Hg. Art.
  • the stage of concentration of the washed erythrocytes is carried out until the hematocrit value of the erythrocyte suspension is 75% - 80%.
  • the method is carried out under sterile conditions.
  • the RBC solution can be saline, Bio-Wash, or other iso-osmotic RBC solutions.
  • hypoosmotic and hyperosmotic solutions are used, respectively.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a variant of the claimed device.
  • FIG. 2 shows a diagram of the flow of erythrocyte suspension in the claimed device.
  • FIG. 3 shows the algorithm of the control unit.
  • FIG. Figure 4 shows the dependence of the hemoglobin concentration in the erythrocyte suspension, which passed through the internal circuit of the dialyzer during the stage of concentration of the erythrocyte suspension, on the level of transmembrane pressure in the external and internal circuits of the dialyzer. Shown are the results of experiments on erythrocytes from two different blood samples, in which the concentration of 10% suspension of erythrocytes was carried out for 8 min at different transmembrane pressures in the dialyzer.
  • FIG. Figure 5 shows the dependence of the degree of asparaginase encapsulation on the level of transmembrane pressure in the dialyzer at the stage of hypoosmotic dialysis of erythrocytes in the presence of asparaginase.
  • FIG. 6 shows electron micrographs of the original erythrocytes, as well as carrier erythrocytes obtained from them using the proposed method, containing either asparaginase or combined glutamate dehydrogenase and alanine aminotransferase.
  • FIG. 7 shows hematological parameters (erythrocyte indices) of initial erythrocytes and carrier erythrocytes loaded with various BAC, obtained using the proposed method.
  • FIG. 8 shows the osmotic resistance of the original erythrocytes and carrier erythrocytes loaded with various BAC, obtained using the proposed method.
  • FIG. 9 shows the parameters characterizing the filterability of the original erythrocytes and erythrocytes-carriers of various BAC obtained using the proposed method.
  • BAC is a biologically active component.
  • a biologically active component for incorporation into erythrocytes a number of substances can be used that have any medicinal or biological activity.
  • a wide variety of compounds belonging to various classes of substances and microparticles that have biological activity and can be retained inside the erythrocyte can be included in erythrocytes.
  • the specific examples of molecules given here are not intended to limit the method of the invention, but merely demonstrate the possibilities of specific embodiments.
  • BAAs include (but are not limited to) the following substances and classes of compounds: various proteins, including enzymes (eg, asparaginase, glutamate dehydrogenase, alanine aminotransferase, or combinations thereof); peptides, oligopeptides and polypeptides, amino acids; nucleic acids, nucleotides, oligonucleotides, nucleotide phosphates, including di- and triphosphates; nucleoside analogues used as therapeutic agents (immunosuppressants and tumor cell growth inhibitors) such as 6-mercaptopurine, azathiopurine, fludarabine phosphate; antiviral agents such as phosphorylated azidothymidine (AZT), dideoxycytosine (ddC), natural and synthetic immunomodulators (activators and suppressors), for example muramyl dipeptide (MDP) derivatives; substances with anticarcinogenic activity (methatrexate, vincristine
  • various artificial nanoparticles can be included as a biologically active component in erythrocytes, with included biologically active drugs or compounds. This makes it possible, for example, to use a carrier erythrocyte as a depot form in the case of nanoparticles, which, due to the composition of their surface, have a short circulation time in the bloodstream.
  • such nanoparticles can have, for example, strong fluorescence or magnetic properties, which can be used to create biosensors, concentrate the drug component in the desired organ using magnets, or enhance contrast when creating biological images, for example, in magnetic resonance imaging (MRI), etc.
  • Room temperature - temperature from 20°C to 25°C;
  • Working solutions - solutions used at different stages of operation of the proposed device to include biologically active components in erythrocytes which include saline solution, Bio-Wash solution or other iso-osmotic solutions for washing erythrocytes, hypoosmotic and hyperosmotic solutions, etc.;
  • Erythrocyte mass erythromass, packed erythrocytes
  • concentrated suspension of washed erythrocytes with high hematocrit 60-80%
  • Carrier erythrocytes (EN) - erythrocytes containing included biologically active component (or components);
  • Lysed erythrocytes - erythrocytes obtained as a result of reversible hypoosmotic lysis, for example, by dialysis of a suspension of erythrocytes against a hypoosmotic buffer using a dialysis device (dialyzer), in the membrane of which temporary pores have formed;
  • Lysed carrier erythrocytes - erythrocytes lysed in the presence of BAC for example, by dialysis against a hypoosmotic buffer containing BAC, in the membrane of which temporary pores have formed and part of the BAC has entered the erythrocytes;
  • Bioreactor erythrocytes are a special case of erythrocytes loaded with BAC. Erythrocytes loaded with an enzyme preparation capable of carrying out its reaction inside the cells in which it is included;
  • Efficiency (degree or output) of inclusion of the BAC (E) - the percentage of the total amount introduced into the BAC system, which turned out to be sealed inside the erythrocyte carriers as a result of the procedure for incorporating the BAC into erythrocytes (percentage or encapsulation yield);
  • the relative efficiency of BAC incorporation is the percentage that the actual concentration (or activity) of the BAC actually obtained in carrier erythrocytes from the maximum possible under the given conditions, which is taken as the concentration (or activity) of the BAC in the suspension washed from whole blood or initial pre-washed erythrocytes;
  • Trunks - plastic or silicone flexible tubes connecting various components of the device Trunks - plastic or silicone flexible tubes connecting various components of the device
  • PBS - saline containing 10 mm phosphate buffer having a pH of 7.4.
  • PN1 - peristaltic pump through which, at different stages of the process, a suspension of erythrocytes or saline enters the internal circuit of the dialyzer;
  • PN2 and PNZ - peristaltic pumps through which saline or hypoosmotic solution from the respective bags enter the external circuit of the dialyzer and are pumped out of this circuit, respectively;
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 - syringe pumps for supplying the included biologically active component (or components) and hyperosmotic solution, respectively; EN - obtained carrier erythrocytes containing BAC.
  • each stage is marked with a separate index.
  • either whole blood or pre-washed erythromass is used as the starting material (indicated as steps al or a2 in Fig. 2, respectively, which correspond to the introduction of the starting material into the system).
  • the movement of the suspension of erythrocytes along the lines of the device at each stage of the method is indicated as follows: al and a2 - introduction of the starting material (initial blood or initial washed erythrocytes, respectively) into the system; b - supply of whole blood from the original bag for washing; c - collection of washed erythrocytes in a bag for suspension of washed erythrocytes; d - concentration of washed erythrocytes; f - hypoosmotic dialysis and collection of erythrocytes lysed in the presence of BAC into a bag located in the sealing unit, followed by incubation of a suspension of lysed EN in this bag with a hyperosmotic sealing solution; f - submission of sealed EN for laundering; g - collection of sealed carrier erythrocytes after washing them into a bag for EN suspension; h is the concentration of the obtained EN after their washing.
  • both the whole blood of a patient or a donor with a similar blood group, and pre-washed packaged erythrocytes can be used as a starting material.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a variant of the claimed device, which can be conditionally divided into blocks that perform the following functions:
  • a sealing block in which, in one of the special cases of the embodiment of the device, when whole blood is used as the starting material, a bag with this blood is first placed, and then during the subsequent stages, in any of the special cases of the device, in the same bag is collected from a suspension of erythrocytes lysed in the presence of the BAC, and from the initial stage of operation of the device until the complete completion of the collection of these erythrocytes in this bag, it is at room temperature, and after collection is completed, the stage of sealing the erythrocytes lysed in the presence of the BAC is performed at a temperature of +25 ° ⁇ to + 40° ⁇ .
  • Blocks II and III, to maintain the desired temperature can be located, for example, in thermostatic chambers, where it is possible to maintain the required temperature (not shown in the diagram). Maintaining the required temperature in blocks II and III can also be carried out by other means.
  • Containers are placed in each specified block, preferably standard plastic bags (containers): for example, bag 1 in one of the special cases of the embodiment of the device is designed to contain the source material - the patient's whole blood or donor's blood with the corresponding blood type, and then, after implementation of the dialysis stage, in any of the special cases of embodiment of the device, the bag 1 serves to collect and then seal the lysed erythrocyte carriers containing BAC; bag 2 - a bag in which, in one of the special cases of the embodiment of the device, the initial material is placed - pre-washed erythrocytes, or, in another particular case of the embodiment of the device, a suspension of erythrocytes obtained from the original whole blood at the washing stage is collected in it;
  • lines which are tubes, for example, flexible plastic or silicone tubes.
  • Bacterial filters can be installed on the lines extending from syringe pumps 11 and 12, as well as from bags 4.1, 4.2, 5 and 6 (with physiological and hypoosmotic solutions) (not indicated by numbers in Fig. 1).
  • the device includes a dialyzer 13, the inner contour of which is enclosed within hollow fibers of a semi-permeable membrane and surrounded by an outer contour, and a device 21 for washing erythrocytes, including a centrifuge cone, which is a replaceable element of the proposed device.
  • the dialyzer 13, the syringes in the syringe pumps, the inlet lines and the centrifuge cone in the device 21, as well as the bacterial filters, constitute a disposable set used to operate the proposed device.
  • a device for washing erythrocytes, pumps, including syringe pumps, pressure sensors, sensors for the presence of liquid in the lines and hematocrit sensors make up a reusable set used to operate this device.
  • the device includes a number of sensors.
  • the number of sensors can be increased.
  • any known device for such washing can be used, for example, a device from Haemonetics APC-215 (Haemonetics SA, Switzerland), or a specially designed washing unit built into the unit, containing a centrifuge, a replaceable centrifuged container, necessary pumps and bags with initial and waste solution for washing erythrocytes.
  • a device from Haemonetics APC-215 Haemonetics SA, Switzerland
  • a specially designed washing unit built into the unit containing a centrifuge, a replaceable centrifuged container, necessary pumps and bags with initial and waste solution for washing erythrocytes.
  • Shakers 22, 23 and 24, respectively, are used to gently mix the erythrocyte suspension in bags 1, 2 and 3.
  • the shaker 22 is placed in block III, which is maintained at the desired temperature, or the shaker 22 can be combined with a device capable of maintaining different temperatures.
  • Mixing in the bag 1 of whole blood at the stage of washing erythrocytes from it or collecting into this bag 1 a suspension of erythrocytes lysed in the presence of BAC is carried out at room temperature.
  • the temperature in block III is maintained between +25°C and +40°C.
  • Shakers 23 and 24, which provide mixing of the suspension in bags 2 and 3, are located in thermostatically controlled block II, where the temperature is maintained from +2°C to +10°C, preferably from +4°C to +6°C.
  • Fig. 2 The scheme of the successive stages of moving the erythrocyte suspension during the operation of the device is shown in Fig. 2, where the following notation is used:
  • PN1 - peristaltic pump 25 through which the erythrocyte suspension enters the internal circuit of the dialyzer 13, PN2 and PNZ - peristaltic pumps 26 and 27, through which physiological solution from bag 5 or hypoosmotic solution from bag 6 enters the external circuit of dialyzer 13 and is pumped out of this contour, respectively; ⁇ 1 and ⁇ 2 - a syringe pump 11 for supplying the included biologically active component (or components) and a syringe pump 12 for a hyperosmotic solution, respectively; EN - obtained carrier erythrocytes containing BAC.
  • each stage of the device operation is indicated by a separate index.
  • either whole blood or pre-washed erythromass is used as the starting material (indicated as steps al or a2 in Fig. 2, respectively, which correspond to the introduction of the starting material into the system).
  • the movement of the erythrocyte suspension along the lines of the device at each stage of the device operation is indicated as follows: al and a2 - introduction of the starting material (initial blood or initial washed erythrocytes, respectively) into the system; b - supply of whole blood from bag 1 for washing; c - collection of washed erythrocytes in bag 2 for suspension of washed erythrocytes; d - concentration of washed erythrocytes; f - dialysis and collection of erythrocytes lysed in the presence of BAC in block III for sealing; f - submission of sealed EN for laundering; g - collection of sealed carrier erythrocytes after their washing into bag 3 for EN suspension; h is the concentration of the obtained EN after their washing.
  • steps b-h are performed sequentially; if pre-washed erythromass is used as starting material, then steps e-h are carried out after step a2.
  • All of these elements of the proposed device operate in automatic mode and are regulated by means of a control unit, which is made with the ability to synchronize the operation of the device elements by receiving and transmitting control signals to all device elements.
  • the specified control unit is connected to a computer on which the software developed for the claimed device is installed.
  • the computer may be connected to the claimed device or integrated into the device.
  • the device can be made in a single housing.
  • Step 1 Flushing the dialyzer, lines and filling the original blood bag with additional saline
  • the barcode of the source material (original whole blood or initial erythromass) is read, which is loaded into the device.
  • control unit To implement the incorporation of biologically active components into erythrocytes by the method of flow dialysis, the control unit first opens all the valves of the device and waits for a command to successfully load a replaceable disposable set, after which it closes all valves except 28, 36, 38. The dialyzer and the entire system of lines are flushed to avoid the formation of air bubbles in them.
  • the control unit includes a pump 25 and, for flushing the pipeline system, physiological solution from the bags 4.1 and 4.2 is fed through the pump 25 into the internal circuit of the dialyzer 13, while the valves 28 and 38 are open. The spent physiological solution is removed into the bag 10.
  • the control unit turns on the pumps 26 and 27 and the physiological solution from the bag 5 is supplied to the external circuit of the dialyzer 13 by means of the pump 26. 2-5 min at maximum speed of pumps 25, 26 and 27 (100 ml/min).
  • the whole blood of a patient or a donor with the corresponding blood type (from 50 to 400 ml) is used as a starting material, it is placed in bag 1, which is sterile attached in block III, for example, by soldering, to the channel of the disposable line system leading to the valve 39.
  • the erythrocyte-washing device 21 can be any known device containing a replaceable centrifuged container, such as a centrifuge cone. It is preferable to have a cone with a volume close to the volume of the blood contained in the bag 1. Many well-known washing devices have a fairly large cone volume.
  • the Haemonetics ACP-215 device may have a cone volume of 275 ml, so if the volume of the initial whole blood in bag 1 is less than this volume, for example, from 50 to 200 ml, before washing the erythrocytes, the bag must be refilled with additional saline to the specified volume of the cone.
  • the control unit shuts off valves 36, 38, turns off pumps 26 and 27, opens valve 31, and saline solution from bags 4.1 and 4.2 is pumped into bag 1 through pump 25 at a rate of 100 ml/min for 1-2 minutes . After reaching a total volume of 275 ml in the bag 1, the control unit turns off the pump 25 and closes the valves 28 and 31.
  • the amount of physiological solution added to the bag 1 is determined by the volume of blood in the bag 1 and the volume of the selected cone of the device 21 for washing erythrocytes.
  • erythrocyte mass when using pre-washed packed erythrocytes (erythrocyte mass) as the starting material, before the start of operation of the device, it is placed in bag 2, which is sterilely attached, for example, by soldering, to three channels of the disposable system of device lines in the block II, one of which leads to valve 29 and sensor 16 for determining hematocrit, the second leads to valve 32 and sensor 18 for the presence of fluid in the line and the third leads to valve 30 and sensor 17 for determining hematocrit, and bag 1 remains empty at this stage not used (see Fig. 1 and Fig. 2).
  • Step 2 Washing of erythrocytes from the original whole blood
  • the device when whole blood of a patient (or a donor with the corresponding blood group) is used as a starting material, which is placed in bag 1 in block III, it is first necessary to obtain a suspension of erythrocytes from this blood for further inclusion of biologically active components in them. For this, the stage of washing erythrocytes from the blood placed in bag 1 is carried out.
  • the control unit opens the valve 39 and turns on the device pump 21. With the valve 39 open, the blood from the bag 1 enters this device 21 through the pump, which is part of the device 21 for washing erythrocytes (not shown in Fig. 1).
  • the cone of the erythrocyte washer 21 receives the erythrocyte washer solution, which can be saline solution, Bio-Wash solution, which is a saline solution with added glucose (0.2%), or other saline solutions with normal osmoticity.
  • the spent washing solution is then removed into the bag 8.
  • the control unit closes the valve 39 opens valves 40 and 32, and the washed erythrocytes through the operation of the said pump of the device 21 enter the bag 2 for washed erythrocytes through the open valve 32.
  • the flow of washed erythrocytes into the bag 2 is fixed by the sensor 18 for the presence of liquid in the line leading to the bag 2.
  • any sensors for the presence of liquid in the lines can be used, for example, detecting this presence optically, by vacuum discharge in the line, or by electrical resistance, etc.
  • the control unit turns off the pump of the device 21 and closes the valves 32, 40.
  • the volume and hematocrit of the resulting suspension of washed erythrocytes are determined by the volume of the original blood in the bag 1, as well as the volume of the cone of the device 21 for washing erythrocytes. If the volume of the original blood is small (for example, 50-100 ml), and the volume of the cone of the device 21, such as the APC-215 device, is, for example, 275 ml, then after the washing step, a sufficiently diluted suspension of erythrocytes is obtained. To prevent a large loss of intracellular content during the subsequent dialysis of erythrocytes, washed erythrocytes must first be concentrated. The concentration of the washed erythrocytes is carried out by means of the dialyzer 13.
  • the control unit opens the valves 29, 30, 36 and turns on the pumps 25, 26, 27.
  • the suspension of the washed erythrocytes from the bag 2 through the open valve 29 is pumped through the pump 25 into the internal circuit of the dialyzer 13 at a rate of 10-30 ml/min, after which the suspension of washed erythrocytes that has passed through the dialyzer 13 is returned to the bag 2 through the open valve 30.
  • a saline solution is pumped through pump 26 (operating at a constant rate of 20 ml/min) and pump 27.
  • the initial speed of the pump 27, which operates at a variable speed, is higher than that of the pump 26, but through the operation of the control unit, it is reduced so as to maintain a constant transmembrane pressure of 90-120 mm in the dialyzer 13. rt. Art. (preferably 100 mmHg).
  • the indicated transmembrane pressure is determined by the difference between the readings of pressure sensors 14 and 15, the signal from which allows the control unit to control the pressure in the dialyzer circuits 13 and determine the operating mode of the pump 27.
  • the control unit does not allow the absolute pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer (pressure sensor 15) to exceed atmospheric more than 120 mm Hg. st, for which the control unit gradually reduces the speed of the pump 25 ..
  • the suspension is concentrated due to the higher speed of the pump 27, which pumps out a larger volume of solution from the external circuit of the dialyzer than that that was pumped into this circuit by pump 26.
  • the suspension of washed erythrocytes is pumped "around the ring" until the speeds of the pumps 26 and 27 are the same.
  • the concentration process stops, because. at equal rates of supply and pumping out of the solution from the external circuit of the dialyzer, further concentration of the suspension in the internal circuit of the dialyzer no longer occurs.
  • the hematocrit of the suspension of washed erythrocytes during the concentration is monitored at the exit from the bag 2, as well as after leaving the internal circuit of the dialyzer 13 by means of sensors 16 and 17 (for example, optical) to measure hematocrit, respectively.
  • the readings of these sensors are recorded in the protocol of the experiment. If the level of the obtained hematocrit is much lower than the required one (65-80%), the control unit signals about violated conditions and the light turns on, which signals a violation of the conditions necessary for the procedure of incorporating the BAC into erythrocytes (i.e. that this experiment is unsuccessful) . After the end of the concentration procedure, the control unit turns off pumps 26 and 27 and closes valve 36.
  • the control unit closes valve 29 and opens valve 28, while through valve 28 through pump 25 through the internal circuit of the dialyzer 13 physiological solution from bags 4.1 and 4.2 (approximately 30 -40 ml) continues to be pumped into bag 2 at the maximum possible speed at which the pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer does not exceed atmospheric pressure by more than 120 mm Hg. st, so that the washed erythrocytes remaining in the dialyzer 13 were collected in bag 2.
  • the control unit turns on the pump 11, and by means of the syringe pump 11, the included biologically active component (or a mixture of several components) is added to the line leading to the bag 2. Then the control unit shuts off valves 28 and 30.
  • the hematocrit value of the suspension in bag 2 after concentration and flushing of the cells remaining in the dialyzer is from 65 to 80%. It is recorded by a hematocrit 16 sensor immediately after the start of the dialysis procedure.
  • the control unit when the initial material is a pre-washed erythrocyte mass (from 25 to 250 ml), which is placed in bag 2 and sterile connected to the pipeline system, the control unit turns on the pump 11 and into the pipeline leading to the bag 2, by means of syringe pump 11 immediately after dialyzer rinsing is completed (see step 1), the included biologically active component is added, after which the control unit turns on pump 25, which pumps 5 ml of saline from bags 4.1 and 4.2 into bag 2 in order to completely flush the added BAC solution. If several BACs are used for inclusion in erythrocytes, all of them can either be pre-mixed and simultaneously introduced into the system using a single syringe pump 11, or several separate syringe pumps 11 can be used for injection.
  • All subsequent stages of operation of the device are carried out in the same way when using as a starting material, both the whole blood of a patient or a donor with the corresponding blood group, and pre-washed packaged erythrocytes.
  • the 13 cells remaining in the dialyzer are washed into the bag 2 with an additional 30-40 ml of saline, as well as adding a certain volume of the included BAC solution.
  • the real value of the hematocrit of the erythrocyte suspension supplied for dialysis is recorded by the sensor 16 for measuring hematocrit, installed at the outlet of the bag 2.
  • the control unit turns on pumps 26, 27, opens valve 37, and through the external circuit of the dialyzer, through pumps 26 and 27, a hypoosmotic solution is pumped from bag 6 for 1 minute (at a rate of 30 ml/min), which is drained into bag 9.
  • the control unit turns on the pump 25, opens the valves 29 and 31, and from the bag 2 the suspension of erythrocytes containing the included biologically active component (BAC), gently stirred by the shaker 23, is pumped through the pump 25 through the internal circuit of the dialyzer 13 and collected in the bag 1 Simultaneously, in the external circuit of the dialyzer 13, a hypoosmotic solution is pumped out of the bag 6, which is collected in the bag 9, in the countercurrent of the erythrocyte suspension containing the BAC, by means of pumps 26 and 27.
  • BAC biologically active component
  • the pump 27 pumps out the solution from the dialyzer 13 at the same speed with which pump 26 delivers a hypoosmotic solution to the external circuit of the dialyzer (20-30 ml / min), which prevents strong dilution 13.
  • the control unit maintains a constant transmembrane pressure of 160-180 mm Hg. Art. This is achieved by regulating the speed of the pump 25, which is first set within 1.5-10 ml/min (optimally 6-7 ml/min), but then, using the readings of the pressure sensors 14 and 15, the control unit, if necessary, changes the speed of the pump 25, to maintain the transmembrane pressure in the dialyzer 13 at the selected level of 160-180 mm Hg. Art.
  • the control unit detects the completion of pumping out of the bag 2 suspension of erythrocytes containing included biologically active component, by means of a sensor 20 for the presence of liquid in the line.
  • the control unit closes the valve 29 and stops the operation of the shaker 23 with the bag 2.
  • the control unit opens the valve 28 and by means of the pump 25 the physiological solution (30-40 ml) from the bags 4.1 and 4.2 continues to be pumped through the internal circuit of the dialyzer 13 for 3-15 min ( depending on the flow rate of the erythrocyte suspension through the internal circuit of the dialyzer 13, which is selected by the control unit so that the pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer 13 does not exceed atmospheric by more than 120 mm Hg), the erythrocytes remaining in the dialyzer 13 are collected into bag 1 placed in block III at room temperature.
  • the control unit turns off the pumps 25, 26 and 27 and closes the valves 28, 31 and 37.
  • the steps carried out in block II, namely dialysis and concentration are carried out at temperatures from +2° C to +10° C, preferably from +2° C to +6° C.
  • Step 5 Incubation of a suspension of lysed carrier erythrocytes for their sealing
  • the control unit includes a syringe pump 12 and by means of this pump 12, a calculated amount of hyperosmotic solution is added to the line leading to the bag 1 containing erythrocytes lysed in the presence of the BAC.
  • a calculated amount of hyperosmotic solution is added to the line leading to the bag 1 containing erythrocytes lysed in the presence of the BAC.
  • erythrocytes containing BAC carrier erythrocytes
  • Sealing of erythrocytes containing BAC is carried out by incubation of erythrocytes lysed in the presence of BAC, which are in bag 1, for 20-40 minutes (preferably 30 minutes) at a temperature of +25°C to +40°C (preferably 37 ° C) with smooth mixing of the contents of the bag 1 with a shaker 22.
  • Step 6 Washing of sealed RBC-carriers containing BAC and flushing of the dialyzer and its lines
  • the dialyzer 13 Before the subsequent use of the dialyzer 13 for the concentration of the obtained sealed carrier erythrocytes, the dialyzer 13 is washed again, and the sealed carrier erythrocytes obtained and collected in the bag 1, containing BAC are washed by means of the erythrocyte washer 21 by repeating steps 1 and 2 previously described.
  • the washed sealed carrier erythrocytes are collected in a free clean bag 3, for which the control unit opens valves 33 and 40 and closes valve 32. Filling the bag with 3 washed carrier erythrocytes is detected by a sensor 19 for the presence of liquid in the line leading to the bag 3. After filling the bag 3 control unit closes valve 33.
  • the sealed carrier erythrocytes collected in bag 3 are concentrated in it in the same way as as described earlier in step 3.
  • the control unit opens valves 34, 35 and 36 and turns on pumps 25, 26 and 27. through the internal circuit of the dialyzer 13, after which it returns to the bag 3 again.
  • pumps 26 and 27 pump saline from bag 5 to bag 9 through the external circuit of the dialyzer 13.
  • the control unit stops the operation of these pumps and closes valves 34 and 36.
  • the control unit opens valve 28 and by means of pump 25 operation on the maximum possible speed at which the pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer 13 does not exceed atmospheric by more than 120 mm Hg. st, approximately 30-40 ml of physiological saline is pumped through the internal circuit of the dialyzer 13 from bags 4.1 and 4.2, so that the sealed carrier erythrocytes remaining in the dialyzer are collected in bag 3.
  • the control unit turns off the pump 25 and closes valves 28 and 35.
  • the device stops its operation and the bag 3 containing the received carrier erythrocytes is sterilely disconnected from the system of disposable lines.
  • Example 1 The inclusion of asparaginase in erythrocytes using the proposed device
  • Asparaginase (L-asparagine-amidohydrolase, ASP) is an enzyme of the hydrolase class that catalyzes the hydrolysis of L-asparagine with the formation of L-aspartic acid and ammonium ion according to reaction (1):
  • Asparaginase is an integral part of a complex course of therapy for a number of oncological diseases, for example, ALL in adults and children. Since direct intravenous administration of a free enzyme has serious disadvantages (the main of which are severe allergic reactions, a short lifetime of the enzyme in the bloodstream, a decrease in the effectiveness of the drug with repeated injections due to the formation of antibodies to this enzyme in the plasma, the effect of high peak concentrations of the enzyme at the time administration to the blood coagulation system, pancreas, liver and a number of other body systems, etc.), asparaginase included in erythrocytes is used as a dosage form of asparaginase, which has improved pharmacological properties [7].
  • asparaginase into erythrocytes was carried out using the inventive device by the inventive method, strictly following the algorithm described above.
  • whole blood of donors was used as a starting material, which was taken by puncture of the cubital vein into a standard solution of tribasic sodium citrate dihydrate (3.2%, 0.109 M), at a ratio of citrate: blood of 1:9, as well as lyophilized L- asparaginase from E. coli Vero-asparaginase (VeroPharm OOO, Russia) 10,000 IU/vial, which additionally contains mannitol 50 mg and glycine 50 mg (per 10,000 IU).
  • the volume of the initial blood was 100 ml
  • the volume of the added asparaginase solution was 0.4 ml (with an activity of 4000 IU/ml).
  • the dialyzer was first flushed. Flushing was carried out for 2 minutes by pumping through the operation of the pumps through the internal and external circuit of the dialyzer at a rate of 100 ml/min, 200 ml of saline from the bags for saline into the bags for collecting waste solutions.
  • the volume of RBC suspension in the starting material bag should be equal to the volume of the centrifuge bell of the device used to wash RBCs (approximately 275 ml).
  • the blood from the bag with the starting material through the operation of the internal pump of the device for washing erythrocytes, entered the centrifuge bell, where, through the operation of another internal pump of this device, the solution for washing erythrocytes from the bags for solutions used for washing erythrocytes.
  • the standard Bio-Wash solution was used as a washing solution, which is a saline solution with the addition of glucose (0.2%).
  • the spent solution for washing entered the waste bag, and the erythrocytes washed from the blood entered the bag for the suspension of washed erythrocytes, which was at a temperature of +4 ° C.
  • the stage of washing the erythrocytes continued until the sensor for the presence of liquid in the line recorded the end of the suspension from the washer to the bag for washed red blood cells.
  • the volume of the obtained suspension of washed erythrocytes is equal to the volume of the centrifuge bell of the device for washing erythrocytes, i.e. the resulting suspension of washed erythrocytes was sufficiently strongly diluted; before the start of the dialysis stage, the stage of concentration of the washed erythrocytes was carried out.
  • saline was pumped from the bag for saline into the bag for collecting waste solutions.
  • the pump supplying saline to the external circuit of the dialyzer operated at a constant rate of 20 ml/min, while the speed of the second pump pumping the solution out of the external circuit of the dialyzer was initially higher, but changed so that a constant transmembrane pressure of 100 mmHg was maintained in the dialyzer. . st, which was determined by the difference in pressure recorded by pressure sensors on the internal and external contours of the dialyzer.
  • the suspension of washed erythrocytes was pumped through the dialyzer until the speeds of the pumps on the external circuit of the dialyzer became equal.
  • the hematocrit measurement sensor recorded the hematocrit value of the erythrocyte suspension at the outlet of the internal circuit of the dialyzer equal to 75% -80%.
  • the concentration stage was completed, the pumps on the external circuit of the dialyzer stopped working, and through the internal circuit of the dialyzer, through the operation of the pump on the internal circuit of the dialyzer, another 35 ml of saline solution was supplied to the bag with a suspension of erythrocytes from the bags for saline solution to collect the remaining red blood cells in the dialyzer.
  • the speed of the pump on the internal circuit of the dialyzer was automatically maintained as high as possible, at which the pressure at the inlet to the internal circuit of the dialyzer did not exceed atmospheric pressure by more than 120 mm Hg. Art.
  • an asparaginase solution (0.4 ml, 4000 IU/ml) was supplied to the line leading to the bag with the suspension of washed erythrocytes by means of a syringe pump. The valves were then closed.
  • hypoosmotic solution 5 mM KH2PO4/K2HPO4, 2 mM MgCh, 5 mM glucose, 37 mM NaCl, 60 mOsm/kg, pH 7.4
  • a hypoosmotic solution 5 mM KH2PO4/K2HPO4, 2 mM MgCh, 5 mM glucose, 37 mM NaCl, 60 mOsm/kg, pH 7.4
  • the suspension of erythrocytes with asparaginase was pumped through the internal circuit of the dialyzer by means of a pump and collected in a bag for the collection and subsequent sealing of lysed carrier erythrocytes containing BAC (approximately 10–20 min).
  • the hypoosmotic solution was pumped from the bag for the hypoosmotic solution into the bag for collecting waste solutions by means of the operation of pumps on the external circuit of the dialyzer in the countercurrent of the suspension of erythrocytes with asparaginase coming from the bag with erythrocytes.
  • the speed of the pumps on the external circuit of the dialyzer was the same and amounted to 30 ml/min.
  • a constant transmembrane pressure of 170 mm Hg was maintained.
  • the rate of supply of the hypoosmotic solution to the outer circuit of the dialyzer be close to or equal to the rate of pumping this solution out of this circuit, which does not allow excess fluid to enter the inner circuit of the dialyzer and dilute the erythrocyte suspension located there.
  • an additional increase in the efficiency of BAC inclusion and a decrease in the loss of intracellular content are achieved by reducing the dilution of the erythrocyte suspension during dialysis.
  • the proximity of the velocities implies a discrepancy within 1 rel. %, preferably within 0.5 Rel. %.
  • the remaining erythrocytes from the dialyzer were collected into a bag for collection and subsequent sealing of the lysed carrier erythrocytes by pumping another 30 ml of saline through the internal circuit of the dialyzer using a pump.
  • the pump on the internal circuit of the dialyzer was running at a rate of 30 ml/min for about 1 minute.
  • 9 ml of a hyperosmotic solution (1 M NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, 5 mM ATP, 50 mM glucose, 50 mM pyruvate sodium salt, pH 7.4, 2240 mOsm/kg).
  • the calculation of the required volume of the hyperosmotic solution was made in advance in accordance with formula (4):
  • Vzunep (ml Vcycn * (OsMcelev ⁇ OsMdialysis susp) AosMhyper OsMcelev) (4), where Utr is the volume of hyperosmotic solution to be added, Vusp is the volume of the dialyzed erythrocyte suspension, Osmdialysis susp is the initial osmolality of the dialyzed suspension, Osm tar is the final osmolality suspension to be achieved (equal to approximately 300 mOsm/kg) and Inspection. - osmolality of the hyperosmotic solution (2240 mOsm/kg).
  • the resulting highly diluted suspension of washed, sealed carrier RBCs was then concentrated by repeating the step described above for the concentration of RBCs washed from the original blood, except that the concentrated carrier RBCs were collected in a bag for the resulting sealed and washed carrier RBCs.
  • the pump pumped the suspension through the inner circuit of the dialyzer at a rate of 20 ml/min, and the pumps on the outer circuit of the dialyzer pumped saline from the saline bag into the waste collection bag (the speed of one pump on the outer circuit of the dialyzer was constant at 20 ml/min). min, and the speed of the other pump on the external circuit of the dialyzer was variable and set at a level that provided a constant transmembrane pressure of 100 mmHg).
  • the relative incorporation efficiency was estimated as the percentage that the specific activity of the enzyme obtained in erythrocytes is from the maximum possible specific activity of the enzyme that can be obtained under given conditions (formula (7)).
  • Specific activity refers to the amount of enzyme activity per ml of carrier cells (at 100% hematocrit).
  • the activity of the included substance in the suspension of initial erythrocytes was taken as the maximum possible included specific activity immediately after the introduction of asparaginase into the suspension of erythrocytes washed from the initial blood (before the start of the inclusion procedure), because it is this activity that must be established in the cells and the environment if the substance is completely balanced between these phases.
  • Asparaginase activity was measured by the indooxin method using aspartate P-hydroxamate (ANA) as the asparaginase substrate and the resulting hydroxylamine was determined spectrophotometrically at a wavelength of 705 nm after its conversion to indooxin in the presence of 8-hydroxyquinoline [27].
  • ANA aspartate P-hydroxamate
  • hyperammonemia increased ammonium concentration in the blood
  • urea cycle enzyme deficiencies chronic and acute liver pathologies (cancer, cirrhosis, etc.)
  • cirrhosis chronic and acute liver pathologies
  • AAT GLU + PIR AKG + ALA (9), where AKG is a-ketoglutarate, GLU is glutamate, PIR is pyruvate, ALA is alanine, NH 4 is the ammonium ion, and NADP and NADPH are the oxidized and reduced forms of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, respectively.
  • this enzyme was preliminarily diluted with buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 7.4) to obtain a solution with an activity of 250 IU/mL.
  • buffer 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4
  • the volume of addition of this enzyme to the erythrocyte suspension in different experiments ranged from 0.319 to 14.84 ml.
  • the total volume of the addition of the enzyme mixture varied in different experiments, as a result of which the total volume of the suspension of erythrocytes with the addition of enzymes also varied.
  • a mixture of solutions of included enzymes (in different experiments from 0.384 ml to 15.624 ml) was introduced into the line leading to the bag with erythromass by means of a syringe pump, and after that, by means of pump operation, for 15 sec at a rate of 20 ml/min another 5.0 ml of physiological saline was passed through the internal circuit of the dialyzer into the bag in order to completely flush the introduced mixture of enzymes into the bag. After that, the valves were closed.
  • the activities of the enzymes added to the initial suspension of erythrocytes were also different and ranged from 2.11 to 18.74 IU/ml for GDH suspension and from 1.33 to 45.6 IU/ml for AAT suspension.
  • Example 2 Comparison of the results obtained in Examples 1 and 2 showed that the yield of cells when using washed erythromass as a starting material was higher. This can be explained by the fact that all the old and fragile cells present in the original blood in this case were washed out at the stage of preparation of the erythromass.
  • the second fact that can be observed in Example 2 is that the percentage of incorporation of the two enzymes used is different.
  • GDH from Proteus sp. similar to the well-studied bovine liver GDH, which is known to have an ellipsoidal molecule with a molecular weight of 340 kDa, a length of 13.6 nm, and a diameter of 4.3 nm [30,31].
  • the globular AAT molecule has an elongated shape, but a slightly lower molecular weight (300 kDa) [32].
  • the globular AAT molecule has a molecular weight of only 150 kDa and a diameter of about 4 nm [33].
  • the size of the GDH molecule is much larger than that of AAT, which reduces the rate of penetration of this enzyme into the cell through the pores of the erythrocyte membrane, which have a diameter of about 8-10 nm.
  • BAC incorporation into erythrocytes In addition to the effectiveness of BAC incorporation into erythrocytes, to check the quality of BAC-carrier erythrocytes in comparison with the properties of the original erythrocytes, such properties as the shape of cells after the inclusion of BAC, erythrocyte indices of cells, their osmotic resistance and ability to deform were studied.
  • Method 3 shows incorporation data for dexamethasone-21-phosphate, and incorporation data for the hexokinase enzyme, which is similar in size to asparaginase. Data on the efficiency of switching on the LHC using method 2 could not be found. It should be noted that the yields when including low molecular weight substances, as a rule, should be higher than for high molecular weight enzymes.
  • the shape of the resulting carrier erythrocytes can indicate the physical state of the cells after the enzyme is switched on.
  • this form was studied by differential interference-contrast (confocal) microscopy.
  • erythrocytes were first fixed. To do this, they were incubated in PBS with albumin (10 mg/ml) and glutaraldehyde (2.5%) for 1 hour at room temperature. The hematocrit of the cell suspension at fixation was 25%. This suspension was then diluted to a hematocrit of about 0.1%.
  • the photographs were taken with a Zeiss Axio Observer Z. l microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany), 100x immersion objective, 1.3 NA, QuantEm 512sc camera.
  • FIG. 6 shows micrographs of the original erythrocytes (A), as well as carrier erythrocytes with included asparaginase (B) or GDH from Proteus sp. and AAT from pig heart (B).
  • the average erythrocyte volume (MCV, in fl) the average hemoglobin content in the erythrocyte (MCH, in ih) and the average hemoglobin concentration in the erythrocyte (MCHC, in g/dl).
  • MCV average erythrocyte volume
  • MH average hemoglobin content in the erythrocyte
  • MCHC average hemoglobin concentration in the erythrocyte
  • glycolytic enzyme molecules Since the size of glycolytic enzyme molecules is close to the size of hemoglobin molecules, it can be assumed that the concentration of these enzymes during hypoosmotic dialysis and opening of pores in the cell membrane will decrease by no more than 30%, as in the case of Hb. Such a decrease cannot affect the rate of glycolytic reactions in the erythrocyte, because all the necessary enzymes are present in it in significant excess. As a result, it can be assumed that the level of cell energy supply will not change significantly, which will allow carrier erythrocytes to survive in the bloodstream for a sufficiently long time [36].
  • Lysis of 50% of the original (native) cells occurs already at an osmolality of 135 mOsm/kg, while in carrier erythrocytes at this osmolality, only 25-30% of lysed cells are observed.
  • This can be explained by the fact that erythrocytes resistant to osmotic stress were removed during the procedure of switching on the BAC at the stage of cell washing, and also by the fact that carrier erythrocytes have a reduced hemoglobin content, which affected the overall curve of osmotic resistance.
  • the osmotic resistance of carrier erythrocytes almost does not differ from the osmotic resistance of the original erythrocytes.
  • BAC-carrier erythrocytes pharmacocytes
  • the viability of BAC-carrier erythrocytes is largely determined by their ability to deform and easily pass through narrow capillary vessels.
  • the deformability of erythrocytes can be determined using filtration methods, tk. the rate of filtration of a suspension of erythrocytes or carrier erythrocytes through an artificial membrane filter with pores 3–5 ⁇ m in diameter, close to the diameter of erythrocytes ( ⁇ 3–5 ⁇ m) and 10 ⁇ m long, directly depends on this ability of the cells.
  • Cell filterability was assessed by the following parameters: the percentage of non-filterable erythrocytes in suspension (Z) and the filterability index (F), which were determined by successive passage through an artificial polyethylene terphthalate filter (Joint Institute for Nuclear research, Dubna, RF) with pores with a diameter of 3.5 ⁇ m of a fixed volume (250 ⁇ l) first with PBS buffer, and then with a cell suspension with a hematocrit of 0.1%. Then, after washing the filter after passing the suspension, the same volume of PBS was passed through it again. The calculation was carried out according to formulas (10,11) in accordance with [39]:
  • tb is the time of flow through the filter of 250 ⁇ l of buffer (PBS)
  • t s is the time of flow through the same filter of 250 ⁇ l of 0.1% cell suspension (initial erythrocytes or erythrocytes-carriers containing BAC)
  • t is the total number of cells placed on the filter
  • N is the number of pores that were blocked by non-filtered cells when the suspension was passed through the filter.
  • N The value of N was determined according to formula (12):
  • N No x (tbi-tb)/tbi (12), where No is the known total number of pores on the filter, and tbi is the time to re-flow 250 ⁇ l of buffer through the filter, which was washed after passing the erythrocyte suspension through it.
  • mean values ⁇ SD are given.
  • Trybeca-1 a randomized, phase 3 study of eryaspase in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone as second-line treatment in patients with pancreatic adenocarcinoma (NCT03665441). J.Clin. oncol. 2019, 37(4), suppl. TPS471. DOI: 10.1200/JC0.2019.37.4_suppl.TPS471. Batool T., Makku EA, Jalal M., Yusoff MM A Comprehensive review on L-asparaginase and its applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 178(5), 900-923. DOI: 10.1007/S12010-015-1917-3. Van Den Berg H. Asparaginase revisited. Leuk.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и биологии, в частности к устройствам и способам для создания лекарственных форм на основе эритроцитов для различных ферментных препаратов и биологически активных компонентов. Изобретение обеспечивает автоматическое стерильное включение в эритроциты одного или нескольких биологически активных компонентов, и направлено на получение высокой и воспроизводимой степени их включения в эритроциты способом проточного диализа.

Description

УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ В ЭРИТРОЦИТЫ СПОСОБОМ ПРОТОЧНОГО ДИАЛИЗА
Область изобретения
Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к устройствам и способам для создания лекарственных форм для различных ферментных препаратов, а также других биологически активных компонентов (БАК) на основе эритроцитов, которые могут быть использованы как в лечении ряда заболеваний, так и в целях диагностики.
Предшествующий уровень техники
Ферменты, включенные в эритроциты, могут быть использованы как в фермент- заместительной и противоопухолевой терапии, так и для удаления из кровотока ряда низкомолекулярных токсичных соединений таких как аммиак, цианид, этиловый и метиловый спирт, ацетальдегид и т.д. [1]. В настоящее время фермент L-аспарагиназа (аспарагиназа) является неотъемлемой частью комплексной терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей и взрослых [2], а также некоторых других видов онкологических заболеваний [3]. Аспарагиназа - это фермент, гидролизующий аминокислоту аспарагин до аспарагиновой кислоты и аммиака. Механизм ее противоопухолевого действия связан с уменьшением концентрации аспарагина в плазме, так как эта аминокислота необходима для синтеза белка и ее отсутствие приводит к замедлению деления опухолевых клеток из-за невозможности такого синтеза. Особенно эффективное действие аспарагиназа оказывает на клетки некоторых опухолей, которые, в отличие от нормальных клеток, не могут самостоятельно синтезировать аспарагин (например, при ОЛЛ) [4]. Однако внутривенное введение аспарагиназы ограничено существованием многих побочных эффектов, основными из которых являются возникновение сильных аллергических реакций, а также короткое время жизни аспарагиназы в кровотоке [5,6]. Создание новой лекарственной формы аспарагиназы (аспарагиназы, включенной в эритроциты) улучшает ее фармакологические свойства, т.к. сильно увеличивает время жизни аспарагиназы в кровотоке [7,8]. Это происходит потому, что аспарагиназа проводит свою реакцию, находясь внутри эритроцитов, что защищает ее от находящихся в плазме антител и протеаз, способных ее разрушить. Субстрат, с которым работает аспарагиназа - аспарагин, способен проникать из плазмы внутрь эритроцита через эритроцитарную мембрану [9]. Аспарагиназу для терапевтического применения получают из бактерий (Esherichia соН. либо из фитопатогенной Erwinia chryzanlhemi . те. она является для организма человека чужеродным белком. Однако если такая аспарагиназа спрятана внутри собственных клеток организма, это предупреждает развитие аллергических реакций на введенный чужеродный белок. Аналогично обстоит дело и с другими ферментными препаратами, которые включены в эритроциты и могут быть использованы для терапии ряда заболеваний.
Включение в эритроциты других БАК, например, низкомолекулярного антрациклинового антибиотика доксорубицина или терпено-индольных алкалоидов винкристина и винбластина, которые также широко используются в терапии ряда онкологических заболеваний [10-12], позволяет создать в эритроцитах депо этих лекарственных препаратов, которые постепенно выходят из эритроцитов-носителей, поддерживая в кровотоке достаточную терапевтическую концентрацию лекарства в течение долгого времени. Это важно, т.к., несмотря на высокую эффективность этих препаратов при прямом внутривенном введении, дозы препаратов, которые могут быть введены в организм, лимитируются их высокой токсичностью, например, их супрессивным действием на костный мозг [12], кардио- и нефротоксичностью [13]. При введении этих препаратов в эритроциты удается избавиться от их высоких пиковых концентраций в плазме в момент введения, которые и определяют, в большой степени, токсичность препаратов. Таким образом, включение ряда лекарственных ферментов и других биологически активных компонентов в эритроциты может обеспечивать улучшение фармакологических свойств данных БАК (их фармакокинетики и фармакодинамики), а также снижение их токсических эффектов. Несмотря на это, на данный момент существует мало установок, пригодных для рутинного применения для получения подобных эритроцитов-носителей фармакологических препаратов (фармакоцитов) для клинического использования.
В настоящее время наиболее мягкими, эффективными и щадящими способами, которые позволяют получить эритроциты-носители лекарственных препаратов со свойствами близкими к свойствам исходных эритроцитов, являются способы, основанные на обратимом гипоосмотическом воздействии на клетки. Из современного уровня техники известно несколько автоматизированных устройств-аналогов для включения аспарагиназы и других ферментов, а также низкомолекулярных БАК, в эритроциты использующих прием обратимого гипоосмотического воздействия:
1. Ropars С., Nicolau Y.C., Chassaigne М. Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes, US Patent 4,752,586, June 21, 1988, C12M 1/00 [14].
2. Pages E., Ropars C., Bailleul C. Apparatus for causing medical products to penetrate into red blood cells. US Patent 5,589,389, December 31, 1996, C12M 1/12, C12M 3/06) [15].
3. Устройство итальянской фирмы EryDel SpA (Societa per azioni) (до января 2010 г фирма Dideco (Sorin Group Italia, Sri): а). Magnani M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus thereof (Dideco Sri, Italy). Европейский патент ЕР 0 882 448, дата публикации 12.01.2005, бюллетень 2005/02, А61К 9/50) [16]; б). Мамбрини Д., Серафини С. Устройство и набор для инкапсуляции в эритроцитах по меньшей мере одного соединения для терапевтического и диагностического применения (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 595 844, дата публикации заявки РСТ 03.11.2011, А61К 9/50, А61М 1/36, ВО 1J 4/00) [17]; в). Мамбрини Д., Бенатти Л., Капогросси Д., Мандолини М. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 670 070, дата публикации заявки РСТ 13.11.2014, А61К 9/50) [18].
4. Godfrin Y. Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France). Устройство французской фирмы EryTech Pharma. US Patent 10,273,444 B2, data of prior publication 5.06.2014, data of patent 30.04.2019, A61K 9/50, C12M 1/00, A61K 35/38, A61K 31/6615 [19].
Все указанные устройства используют для включения ферментов и других БАК в эритроциты различные варианты гипоосмотического способа, принцип которого состоит в том, что эритроциты приводят в контакт с гипоосмотическим раствором (те. раствором, имеющим осмоляльность ниже физиологической, составляющей 300 мОсм/кг). В результате этого возникает разница в осмотическом давлении по обе стороны эритроцитарной мембраны. Для уравновешивания осмотического давления внутри и снаружи эритроцита в него начинает поступать вода. Эритроцит постепенно набухает, в результате чего, после достижения максимально возможного объема (при сохранении постоянной площади поверхности эритроцита), в его мембране появляются разрывные дефекты (поры) диаметром от 8 до 50 нм, через которые из эритроцита может выходить гемоглобин и другие соединения, а внутрь эритроцита могут поступать компоненты (в том числе аспарагиназа или другие ферменты и низкомолекулярные соединения, а также нагруженные БАК наночастицы), присутствующие во внешнем растворе. Диаметр пор был измерен экспериментально и составлял от 8 до 50 нм [20-23], при этом было установлено, что для выхода гемоглобина из эритроцита достаточно образования пор диаметром около 10 нм [23,24].
В устройстве, описанном в патенте US 4,752,586 (Ropars С., et al.) [14], для включения биологически активных веществ в эритроциты могут быть использованы различные частные случаи выполнения устройства, которые позволяют работать с широким диапазоном объемов упакованных эритроцитов (от 200 мл до нескольких мл), которые должны быть сначала выделены из соответствующего объема исходной крови (от 450 мл до 10 мл). Общими чертами всех вариантов выполнения устройства является использование диализного элемента (диализатора) для лизиса эритроцитов, состоящего из двух отсеков (компартментов), разделенных диализной мембраной. Устройство диализных элементов может быть различным. Они могут содержать 2 отсека, разделенных только одной плоской полупроницаемой мембраной, или множество полых волокон из полупроницаемой мембраны, окруженных внешним отсеком. В первом отсеке циркулирует суспензия эритроцитов, а во втором - гипоосмотический раствор для обеспечения лизиса эритроцитов. Вещество, которое должно быть включено в эритроциты вводится с помощью насоса в трубку, через которую суспензия эритроцитов подается в диализный элемент (до прохождения этой суспензии через теплообменное устройство, обеспечивающее нужную для диализа клеток температуру). Запечатывание полученных эритроцитов-носителей может быть проведено путем запечатывания пор в мембранах этих эритроцитов, при восстановлении нормальной осмотичности в суспензии лизированных в присутствии включаемого препарата эритроцитов, путем их инкубации при температуре от 20°С до 40°С с гиперосмотическим раствором (те. раствором с осмоляльностью выше физиологической, составляющей 300 мОсм/кг) как в отдельном резервуаре, так и во втором диализном элементе, в первом отсеке которого циркулирует суспензия лизированных эритроцитов, а во втором - гиперосмотический раствор. В отдельных частных случаях выполнения устройства для целей лизиса и запечатывания эритроцитов может быть использован один и тот же диализный элемент, после соответствующей замены буфера во втором отсеке и установления температуры, соответствующей каждому из процессов (примерно от 0°С до 10°С для лизиса и примерно от 20°С до 40°С для запечатывания эритроцитов). Устройство имеет целый ряд стандартных приспособлений для измерения температуры в отдельных его частях, а также давления жидкости (или суспензии эритроцитов) на входе в диализные элементы и осмотического давления жидкости (или суспензии эритроцитов), чтобы обеспечивать оптимальные условия прохождения всех процессов.
В качестве недостатков данного устройства следует отметить, что оно работает только с суспензией отмытых эритроцитов, а наиболее простым и реально используемым его воплощением является то, которое работает с большими объемами этой суспензии (полученными из объемов крови от 200 до 450 мл), тогда как работа с малыми объемами суспензии эритроцитов (в несколько мл) осложнена. Примеры такого использования устройства отсутствуют. Устройство не предусматривает концентрирования клеток после лизиса, а кинетика процесса изменяется при существенном разбавлении исходной суспензии эритроцитов, которое происходит в этом случае. Требуется строгий подбор параметров диализаторов (площади диализной мембраны и пропускной способности диализатора, которая определяется, в том числе, скоростью протекания суспензии эритроцитов и лизирующего раствора через отдельные компартменты диализного элемента), а также строгий выбор отношений площадей мембран диализных элементов для лизиса клеток и для их запечатывания, которые не всегда могут быть обеспечены существующими на сегодняшний день моделями диализных элементов. Устройство не включает приспособления для отмывания клеток и не является полностью автоматическим.
В устройстве, раскрытом в патенте US 5,589,389 (Pages Е., Ropars С. и Bailleul С., 1996), которое фактически является вариантом выполнения устройства по патенту US 4,752,586, для включения БАК (инозитолгексафосфата, ИГФ) используют большой объем исходной крови (1 трансфузионная единица, те. ~ 450 мл крови) [15]. Указанное устройство включает дополнительно блок отмывания, который позволяет получить суспензию отмытых эритроцитов, исходя из цельной крови или эритромассы. В данном варианте выполнения устройства для включения БАК в эритроциты используется тот же принцип обратимого гипоосмотического лизиса исходных эритроцитов, отмытых при 4° С, инкубация их с включаемым веществом (при 4° С) и последующее запечатывание полученных эритроцитов-носителей путем возвращения эритроцитарной суспензии нормальной осмоляльности при инкубации с гиперосмотическим раствором (при 37°С).
В данном осуществлении изобретения в качестве примера описано включение в эритроциты инозитолгексафосфата, который добавляют в среду уже на второй и третьей ступени отмывания исходных эритроцитов. Устройство состоит также из модуля лизиса эритроцитов, в котором поддерживается температура ниже 10°С (оптимально 4°С), и модуля запечатывания полученных эритроцитов-носителей, в котором поддерживается температура выше 20°С (оптимально 37°С). Все элементы модулей лизиса и запечатывания, которые контактируют с эритроцитами, являются одноразовыми (легко заменяемыми и имеющими низкую стоимость).
В качестве элемента для отмывания эритроцитов в данном устройстве могут быть использованы любые известные устройства для отмывания эритроцитов, например, устройства фирмы Haemonetics V50®, PCS или Cell Saver®. Кроме того, в данном способе добавление включаемого вещества в суспензию эритроцитов предложено проводить еще на стадии отмывания исходных эритроцитов. Это отмывание состоит из трех последовательных ступеней, первую из которых проводят физиологическим раствором, а две следующих тем же раствором, содержащим добавленный ИГФ. Блоки для лизиса эритроцитов и запечатывания полученных эритроцитов-носителей, имеют принципиально схожее строение. В каждом из них присутствует емкость для доведения суспензии эритроцитов до нужной температуры (4° С или 37° С, соответственно), а также емкость, в которой проходит диализ в присутствии ИГФ термостатированных эритроцитов с добавлением гипоосмотического раствора или инкубация суспензии лизированных эритроцитов с гиперосмотическим раствором. Блок лизиса содержит также отдельную емкость, в которой уже лизированные в присутствии БАК эритроциты дополнительно инкубируются при 4°С, прежде, чем перейти в блок запечатывания. Емкость для диализа эритроцитов (диализный картридж) состоит из 2 отсеков, разделенных полупроницаемой мембраной, через один из которых прокачивается суспензия отмытых эритроцитов в присутствии БАК (снизу вверх), а через другой - лизирующий гипоосмотический буфер (сверху вниз). Теплообменные блоки для термостатирования суспензии эритроцитов смонтированы на терморегулируемых пластинах из нержавеющей стали, с обратной стороны которых имеются электрические катушки для обеспечения необходимой температуры. Устройство в целом содержит несколько перистальтических насосов для обеспечения прокачки по системе магистралей (те. трубок, соединяющих отдельные элементы устройства) суспензии эритроцитов, лизирующего и гиперосмотического буферов, а также оптические или вакуумные устройства для определения наличия жидкости в магистралях, и устройство для определения трансмембранного давления в диализном картридже. Все перистальтические насосы управляются автоматически с помощью контролирующего процесс электронного блока с учетом данных, получаемых с различных датчиков. Трансмембранное давление в диализном картридже поддерживается на уровне 300 мм рт. ст.
В качестве недостатка данного устройства можно отметить то, что оно работает только с большим объемом исходной крови (примерно 450 мл). Это связано с тем, что устройство не имеет приспособления для концентрирования разбавленной суспензии эритроцитов, которая всегда получается при отмывании эритроцитов из малых объемов исходной крови на стандартных отмывающих эритроциты устройствах. Данные об эффективности включения БАК в эритроциты в данном патенте не представлены. Кроме того, добавление включаемого вещества (ИГФ) в раствор для отмывания эритроцитов сильно увеличивает расход этого вещества. Однако авторы пишут о том, что добавление включаемого вещества можно делать в суспензию и после отмывания эритроцитов (до подачи их в термостатирующий блок).
В патентах ЕР 0 882 448 (Dideco Sri, Italy), а также RU 2 595 844 и RU 2 670 070 С2 (EryDel SpA, Italy) раскрываются варианты устройства для включения БАК в эритроциты, выделенные из небольших объемов (обычно 50 мл, реже до 100 мл) цельной аутологичной крови пациента [16,17,18]. Исходную кровь центрифугируют, чтобы отделить эритроциты от плазмы, и отмывают эритроциты изоосмотическим (те. имеющим физиологическую осмоляльность равную 300 мОсм/кг) солевым раствором с помощью центрифужного колокола для отмывания эритроцитов, являющегося частью устройства. Для достижения открытия пор в эритроцитарной мембране используют способ предварительного постепенного набухания (pre-swelling), когда эритроциты помещают последовательно в два гипоосмотических раствора (причем осмоляльность второго раствора ниже осмоляльности первого из них). В патентах [16,17] осмоляльности гипоосмотических растворов выбраны так, что после контакта с первым раствором эритроциты набухают и сферулируются, а после добавления второго гипоосмотического раствора эритроциты лизируются (или частично лизируются), с образованием в эритроцитарной мембране временных пор. При этом суспензия эритроцитов каждый раз сильно разбавляется гипоосмотическим раствором (до финального гематокрита около 4%- 2.5%), поэтому после этапа инкубации с гипоосмотическими растворами суспензию лизированных эритроцитов концентрируют. Для этого используют диализное устройство (например, картридж с полыми волокнами из полупроницаемой мембраны), в котором суспензия лизированных (или частично лизированных) эритроцитов прокачивается по внутреннему контуру диализатора, а из внешнего контура осуществляется частичная откачка лизирующего раствора во внешнее приемное устройство. Затем в сконцентрированную суспензию лизированных клеток добавляют водный раствор включаемого БАК, который начинает поступать внутрь эритроцитов через образовавшиеся в мембране эритроцита поры. После окончания процесса инкубации осмоляльность внешней среды восстанавливают до нормальной величины, добавляя в суспензию клеток гиперосмотический раствор, в результате чего поры в мембране эритроцита закрываются и часть включаемого компонента остается внутри эритроцитов-носителей. Большинство стадий процесса регулируется автоматически с помощью специального электронного блока.
В качестве недостатков устройства можно отметить, что оно не является полностью автоматическим. В данном устройстве отмывание исходных эритроцитов и полученных эритроцитов-носителей осуществляется с помощью устройства автоматически, однако ввод включаемого компонента и гиперосмотического раствора в суспензию эритроцитов производится оператором вручную. Недостатком устройства является относительно большая потеря внутриклеточного содержимого эритроцитов, обусловленная сильным разбавлением эритроцитов при инкубации и лизисе в присутствии гипоосмотических растворов, что в свою очередь приводит к снижению содержания внутриклеточных веществ в эритроцитах после того, как их мембрана становится частично лизированной. И хотя макромолекулы не могут уйти из гемофильтра (диализатора), в котором затем проводят концентрирование, содержание низкомолекулярных метаболитов гликолиза (с молекулярным весом меньше 10000 дальтон) должно снижаться при откачке водного раствора из внешнего контура диализатора, т.к. эти метаболиты сначала выходят в большой объем гипоосмотических растворов на стадии лизиса, а затем легко проходят через диализную мембрану на стадии концентрирования эритроцитов. В устройстве имеется качающаяся платформа с подогревом до определенной температуры для мешка, в котором происходит запечатывание лизированных эритроцитов с включенным препаратом, однако все стадии набухания и лизиса эритроцитов идут при комнатной температуре без охлаждения растворов и суспензии до примерно 4°С, что вызывает снижение выхода включения препарата, т.к. известно, что время жизни образующихся в мембране пор уменьшается при повышении температуры до комнатной. В устройстве отсутствуют датчики давления в диализаторе при концентрировании и датчики гематокрита.
В патенте RU 670 070 [18], устройство для включения БАК в эритроциты не отличается от устройства, ранее описанного в патентах [16,17], однако в нем описан вариант способа получения БАК, при котором потеря внутриклеточного содержимого снижена, а эффективность включения БАК увеличена относительно ранее описанного в патентах [16,17] способа за счет того, что осмотичность второго гипоосмотического раствора выбрана такой, что лизиса набухших эритроцитов при контакте со вторым гипоосмотическим раствором не происходит. Эритроциты, набухшие после двух последовательных ступеней обработки гипоосмотическими растворами, где осмоляльность второго раствора ниже, чем осмоляльность первого гипоосмотического раствора, сначала концентрируются, а потом к ним добавляется водный раствор включаемого вещества, что и приводит к лизису набухших эритроцитов (уже в присутствии БАК). При этом осмотичность суспензии набухших эритроцитов после добавления первого гипоосмотического раствора составляет 250-200 мОсм/кг, осмотичность суспензии набухших эритроцитов после добавления второго гипоосмотического раствора составляет 200-170 мОсм/кг, а осмотичность суспензии эритроцитов после двух ступеней набухания и добавления включаемого биологически активного компонента составляет примерно 150-110 мОсм/кг.
Еще в одном известном устройстве, раскрытом в патенте US 10,273,444 (фирмы EryTech Pharma, France) [19], выбранном нами в качестве ближайшего аналога, для снижения осмоляльности среды снаружи эритроцитов используют процесс диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического раствора с помощью диализатора, в котором суспензия эритроцитов протекает по внутреннему контуру, а гипоосмотический раствор протекает противотоком по его внешнему контуру. БАК, который должен быть включен в эритроциты, при этом помещают либо в исходную суспензию отмытых эритроцитов (т.е. во внутренний контур), либо в суспензию уже лизированных эритроцитов после их выхода из диализатора. Затем загруженные БАК эритроциты запечатывают, восстанавливая, как и в других методах, осмоляльность внешней среды. В качестве недостатков устройства надо отметить отсутствие полной автоматизации процесса и невозможность проведения на одном устройстве всех стадий способа. Данное устройство не включает приспособлений для отмывания эритроцитов (исходных и полученных после включения препарата) и работает только с предварительно отмытой на каком-либо внешнем устройстве эритромассой. При этом объем этой эритромассы может быть от 10 мл до 250 мл упакованных эритроцитов.
Параметры процесса лизиса в диализаторе (скорость протекания суспензии эритроцитов по внутреннему контуру диализатора и/или осмоляльность лизирующего раствора) устанавливаются оператором вручную, в соответствии с предварительно измеренной осмотической хрупкостью используемых для включения лекарственного препарата эритроцитов. Измерение осмотической хрупкости эритроцитов также производится во внешнем устройстве. Это не позволяет полностью автоматизировать процесс включения БАК в эритроциты, т.к. коэффициенты в уравнениях, связывающих различные параметры проведения лизиса с отдельными показателями осмотической хрупкости исходных эритроцитов должны быть установлены для каждого вида используемых диализаторов отдельно, т.к. зависят от параметров самого диализатора.
В качестве ближайшего аналога способа по изобретению выбран способ, раскрытый в патенте US 8,617,840 (фирмы EryTech Pharma, France) [19], в котором для снижения осмоляльности среды снаружи эритроцитов используют процесс диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического раствора с помощью диализатора, в котором суспензия эритроцитов протекает по внутреннему контуру, а гипоосмотический раствор протекает противотоком по его внешнему контуру. БАК, который должен быть включен в эритроциты, при этом помещают либо в исходную суспензию отмытых эритроцитов (т.е. во внутренний контур), либо в суспензию уже лизированных эритроцитов после их выхода из диализатора. Затем загруженные БАК эритроциты запечатывают, восстанавливая, как и в других методах, осмоляльность внешней среды.
Особенности данного способа таковы, что в качестве исходного компонента может быть использована только отмытая эритромасса, работа с цельной кровью не предусматривается. При этом объем этой эритромассы может быть от 10 мл до 250 мл упакованных эритроцитов.
Стадии способа также разнесены по разным устройствам: незадолго до стадии лизиса проводят измерение осмотической хрупкости эритроцитов, на основании результатов которого выбирают условия лизиса (осмолярность лизирующего раствора и/ или скорость протекания суспензии клеток через диализатор), измерение хрупкости клеток проводят на внешнем устройстве на образце, начальная температура которого составляет от +1 до +8°С. Процесс занимает 20-30 минут.
На основании полученных данных рассчитывают скорость потока клеток в диализаторе или осмолярность диализующего раствора с применением следующих формул:
Скорость потока эритроцитов = [ А х ( Н so )] + [ х ( И)] + ^ (1), где Нзо - осмолярность, при которой лизировано 50% эритроцитов, V - объем суспензии эритроцитов, А и В - переменные, которые регулируются в зависимости от параметров диализатора и осмолярности лизирующего раствора; К - регулируемая константа.
Осмолярность лизирующего раствора = [ С х ( Я 50 )] + [ D х ( И)] + К (2), где С и D - переменные, которые регулируются в зависимости от параметров диализатора и скорости потока эритроцитов в диализаторе; К - регулируемая константа.
Рассчитанные параметры процесса лизиса в диализаторе (скорость протекания суспензии эритроцитов по внутреннему контуру диализатора и/или осмолярность лизирующего раствора) устанавливаются оператором вручную, т.к. коэффициенты в уравнениях, связывающих различные параметры проведения лизиса с отдельными показателями осмотической хрупкости исходных эритроцитов должны быть установлены для каждого вида используемых диализаторов отдельно, т.к. зависят от параметров самого диализатора.
Такой способ корректировки и установления параметров процесса лизиса является длительным и трудоемким, и не может быть легко использован в любой лаборатории. Кроме того, его использование повышает вероятность установления некорректных значений ввиду вероятности ошибки оператора.
На основании анализа известного уровня техники можно сделать вывод, что проблема создания устройств и способов, позволяющих с высокой эффективностью, быстротой, точностью и воспроизводимостью включать в эритроциты необходимые биологически активные компоненты, остается нерешенной.
Существо заявляемого изобретения
Техническая задача, которую решает настоящее изобретение, заключается в устранении недостатков известных устройств. Технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является создание устройства и способа, направленных на обеспечение высокой и воспроизводимой эффективности (степени) включения различных БАК в эритроциты и снижение потери внутриклеточного содержимого.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение высокой и воспроизводимой степени включения различных БАК в эритроциты, что обеспечивается использованием одинакового объема раствора, поданного на вход и откачиваемого на выходе из внешнего контура диализатора на этапе диализа, достижением нужной величины гематокрита суспензии эритроцитов, поддержанием стерильных условий, поддержанием трансмембранного давления и давления во внутреннем контуре диализатора в заданных для каждой стадии процесса диапазонах, поддержанием заданного температурного режима и возможностью работы с необходимым объемом крови или предварительно отмытой эритромассы без потери качества получаемых БАК.
Степень включения различных БАК в эритроциты превосходит степень включения БАК в эритроциты для известных устройств и способов.
Технический результат достигается посредством создания настоящего изобретения.
В одном из аспектов изобретение относится к созданию полностью автоматизированного устройства для включения БАК путем проведения в стерильных условиях гипоосмотического проточного диализа эритроцитов в присутствии биологически активного компонента (или компонентов) с последующим запечатыванием полученных эритроцитов-носителей, являющегося предметом настоящей заявки.
Устройство для включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, включает блок отмывания эритроцитов, блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, блок запечатывания эритроцитов-носителей и блок управления, при этом блок отмывания эритроцитов содержит'. устройство для отмывания эритроцитов; блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов содержит'. по меньшей мере одну емкость для физиологического раствора, по меньшей мере один диализатор, внешний и внутренний контуры которого соединены с по меньшей мере одной емкостью для физиологического раствора, по меньшей мере три насоса, один из которых предназначен для перемещения растворов и эритроцитов через внутренний контур диализатора, а два других предназначены для перемещения растворов по внешнему контуру диализатора, по меньшей мере один насос для БАК, по меньшей мере один насос для гиперосмотического раствора, по меньшей мере один датчик измерения гематокрита, по меньшей мере два датчика давления, по меньшей мере один из которых установлен на входе во внутренний контур диализатора и по меньшей мере один из которых установлен на выходе из внешнего контура диализатора, по меньшей мере три датчика наличия жидкости, оборудование для термостатирования, по меньшей мере две емкости для эритроцитов, соединенные с внутренним контуром диализатора и устройством для отмывания эритроцитов, по меньшей мере одну емкость для гипоосматического раствора, соединенную с внешним контуром диализатора, блок запечатывания эритроцитов-носителеи содержит'. оборудование для термостатирования, а также по меньшей мере одну емкость для эритроцитов, соединенную с внутренним контуром диализатора и с устройством для отмывания эритроцитов; элементы устройства соединены между собой магистралями, а блок управления выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством приема сигналов с датчиков и передачи сигналов управления на клапаны, расположенные на магистралях, и насосы устройства.
Элементы заявляемого устройства являются существенными признаками, и их совокупность оказывает влияние на достижение заявленного результата.
Согласно изобретению емкость, заполненная кровью пациента или донора, соединенная с устройством для отмывания эритроцитов посредством магистрали с клапанами и служащая на последующих этапах для сбора и инкубации с гиперосмотическим раствором эритроцитов, лизированных в присутствии биологически активного компонента, размещена в блоке запечатывания эритроцитов- носителей.
В блоке отмывания эритроцитов размещено устройство для отмывания эритроцитов. Данное устройство характеризуется наличием центрифуги, сменной центрифугируемой емкости, в частном случае, например, сменного центрифужного конуса для отмывания эритроцитов, необходимых насосов и емкостей с исходным и отработанным раствором для отмывания эритроцитов. Для работы устройства по изобретению могут быть использованы как любые известные устройства для отмывания эритроцитов, например, устройства фирмы Haemonetics V50®, Cell Saver®, АРС 215 и др., так и специально сконструированные и включенные в состав заявляемого устройства узлы для отмывания эритроцитов. При этом все применяемые устройства позволяют наполнять и опорожнять центрифугируемую емкость, без извлечения из центрифуги, что обеспечивается наличием соответствующего сочленения вращающейся и неподвижной частей устройства для отмывания.
Диализатор, емкость для сбора суспензии отмытых из цельной крови эритроцитов, или предварительно отмытых эритроцитов в случае работы с эритроцитарной массой, емкость для сбора отмытых запечатанных эритроцитов- носителей, емкости для физиологического раствора, емкость для гипоосмотического раствора, соединенные между собой и с диализатором посредством магистралей с клапанами, а также насосы, установленные на разных входах диализатора, шприцевые насосы, датчики давления и наличия жидкости в магистралях и датчики измерения гематокрита размещены в блоке лизиса и концентрирования.
Емкость с цельной кровью пациента или донора, являющаяся также емкостью для сбора и запечатывания лизированных в присутствии биологически активных компонентов эритроцитов, емкости с суспензией отмытых эритроцитов и с суспензией запечатанных эритроцитов-носителей установлены на шейкерах, обеспечивающих перемешивание в указанных емкостях их содержимого при требуемой температуре.
При этом в блоке отмывания эритроцитов осуществляют этапы при комнатной температуре, а в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов поддерживается температура от +2°С до +10°С, предпочтительно, от +4°С до +6°С.
В блоке запечатывания полученных эритроцитов-носителей цельную кровь пациента или донора в начале процедуры и суспензию лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов на этапе ее сбора в данной емкости содержат при комнатной температуре, а последующий этап запечатывания лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов осуществляют при температуре от +25°С до +40°С. На магистралях, отходящих от шприцевых насосов, от емкостей с физиологическим и гипоосмотическим растворами могут быть установлены бактериальные фильтры. В блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе концентрирования, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру диализатора физиологического раствора, причем один из указанных насосов выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с постоянной скоростью, а другой насос выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с переменной скоростью, поддерживая постоянное трансмембранное давление в диализаторе при концентрировании на уровне 90-120 мм рт. ст.
В блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе диализа, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру гипоосмотического раствора с одинаковой скоростью.
Насос, установленный на входе во внутренний контур диализатора, выполнен с возможностью прокачивания по внутреннему контуру диализатора суспензии эритроцитов с переменной скоростью, причем на этапе концентрирования скорость указанного насоса постепенно уменьшается, когда давление на входе во внутренний контур диализатора превышает атмосферное на 120 мм рт. ст., а на этапе диализа указанный насос функционирует с переменной скоростью для поддержания трансмембранного давления в диализаторе на уровне 160-180 мм. рт. ст.
Все емкости присоединены к системе магистралей стерильно и удаляются из нее только после остановки работы устройства.
Датчики наличия жидкости в магистралях обеспечивают контроль за окончанием одной стадии процесса за счет передачи сигнала на блок управления, который принимает решение о необходимости переключения соответствующих клапанов в устройстве для перехода на следующую стадию. Это способствует полной автоматизации всего процесса без необходимости вмешательства оператора. Блок управления, получая сигналы с датчиков давления, регулирует трансмембранное давление в диализаторе и давление на входе во внутренний контур диализатора, путем изменения скоростей работающих насосов, не допуская повышения величины этого давления свыше допустимой, что может привести к разрушению эритроцитов, проходящих через диализатор в данных условиях. Датчики давления способствуют получению высокого выхода эритроцитов- носителей, а также улучшению их свойств, которые приближены к свойствам исходных нативных эритроцитов.
Наличие двух насосов, работающих на внешнем контуре диализатора, один из которых расположен на входе во внешний контур диализатора и подает в него на стадии диализа эритроцитов в присутствии БАК гипоосмотический раствор, а второй расположен на выходе из внешнего контура диализатора и откачивает прошедший через внешний контур диализатора гипоосмотический раствор, причем объем откачиваемого раствора точно соответствует объему раствора, поданного во внешний контур диализатора, не позволяет избыточной воде входить во внутренний контур диализатора, что снижает разбавление суспензии во внутреннем контуре диализатора в ходе диализа и способствует увеличению эффективности включения БАК в эритроциты.
В устройстве используются датчики гематокрита. Наличие указанных датчиков позволяет контролировать достижение нужной величины гематокрита суспензии, получаемой в процессе концентрирования разбавленных после процесса отмывания суспензий эритроцитов (исходных или запечатанных после лизиса в присутствии БАК).
Устройство по изобретению характеризуется простотой монтажа и мобильностью.
В следующем аспекте изобретение относится к созданию способа включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента методом проточного гипоосмотического диализа, содержащего следующие стадии: добавление, по меньшей мере, одного биологически активного компонента к суспензии сконцентрированных отмытых из цельной крови эритроцитов или к предварительно полученной эритромассе; лизис эритроцитов в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента с помощью гипоосмотического проточного диализа; инкубация суспензии эритроцитов, лизированных в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, с гиперосмотическим раствором с образованием запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; отмывание запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; концентрирование с помощью диализатора запечатанных эритроцитов- носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; вымывание из диализатора оставшихся там запечатанных эритроцитов- носителей и добавление их к ранее полученным запечатанным эритроцитам- носителям, содержащим, по меньшей мере, один биологически активный компонент; при этом, стадию лизиса эритроцитов в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, проводят при поддержании постоянного трансмембранного давления в диализаторе 160-180 мм рт. ст. и давлении на входе во внутренний контур диализатора, не превышающем атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, а концентрирование эритроцитов осуществляют при поддержании постоянного трансмембранного давления в диализаторе 90-120 мм рт. ст. с учетом измеряемых показателей давления во внешнем и внутреннем контурах диализатора.
Концентрирование суспензии эритроцитов позволяет откачать из суспензии лишнюю жидкость, максимально сохранив число целых клеток в образце. Для выбора трансмембранного давления на стадии концентрирования суспензии эритроцитов было исследовано, как повышение этого давления влияет на гемолиз эритроцитов, находящихся в диализаторе. На фиг. 4 представлены результаты экспериментов на эритроцитах из двух различных образцов крови. Как видно на представленной фигуре, при трансмембранном давлении выше 120 мм рт. ст. уже наблюдается увеличение содержания гемоглобина в сливаемой из диализатора жидкости, что соответствует увеличению гемолиза в ходе процесса концентрирования. С другой стороны, трансмембранное давление ниже 90 мм рт. ст. допустимо, но сильно увеличивает длительность процедуры концентрирования. Таким образом, оптимальным для стадии концентрирования суспензии эритроцитов был выбран интервал трансмембранного давления 90-120 мм рт. ст. По той же причине, чтобы не терять эритроциты в результате их гемолиза, давление на входе во внутренний контур диализатора, по которому проходит суспензия эритроцитов, не должно превышать атмосферное более, чем на 120 мм. рт. ст.
Так как лизированные в результате гипоосмотического диализа эритроциты имеют в своей мембране временные поры, они способны выдержать более высокие трансмембранные давления без полного разрушения клеток. Чтобы выбрать оптимальный интервал трансмембранного давления в диализаторе на стадии лизиса, были проведены опыты, в которых был определен процент инкапсуляции аспарагиназы при различном трансмембранном давлении (фиг. 5). На основании проведенных экспериментов было установлено, что поддержание во время диализа трансмембранного давления в диализаторе 160-180 мм рт. ст. обеспечивает стабильно высокий процент включения вещества в эритроциты. Более низкое давление недостаточно для эффективного включения, а слишком высокое давление приводит к уменьшению эффективности включения, по-видимому, в результате более сильного гемолиза клеток. Таким образом, как оптимальный интервал трансмембранного давления в ходе гипоосмотического диализа эритроцитов был выбран диапазон 160-180 мм рт. ст.
Биологически активный компонент (или компоненты) добавляется в исходную эритромассу или, в случае, когда в качестве исходного материала использовали цельную кровь, в отмытые из исходной цельной крови и затем сконцентрированные эритроциты.
Если в качестве исходного материала использована цельная кровь, стадии добавления, по меньшей мере, одного биологически активного компонента к суспензии сконцентрированных отмытых из цельной крови эритроцитов предшествуют стадия отмывания эритроцитов из исходной цельной крови и стадия их последующего концентрирования. В частности, концентрирование суспензии эритроцитов, отмытых из цельной крови, позволяет избежать их сильного разбавления перед добавлением БАК и, таким образом, проводить процесс последующего гипоосмотического лизиса при более высоком гематокрите и концентрации БАК, что дополнительно повышает эффективность включения БАК и снижает потерю внутриклеточного содержимого в ходе диализа.
Дополнительным преимуществом заявленного способа является возможность работать не только с отмытой эритроцитарной массой, но и цельной кровью пациента или донора.
Для способа по изобретению предпочтительны представленные ниже температурные режимы.
Стадию отмывания эритроцитов осуществляют при комнатной температуре.
Стадию лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов осуществляют при поддержании температуры от +2°С до +10°С, предпочтительно, от +4°С до +6°С.
Стадию запечатывания лизированных в присутствии биологически активного компонента или компонентов эритроцитов осуществляют при температуре от +25°С до +40°С. Такие диапазоны температур стандартны для большинства способов включения БАК в эритроциты, и продиктованы физиологическими особенностями мембраны эритроцита. Известно, что деформируемость эритроцита меняется с температурой [25]. Для создания стабильных пор в мембране на стадии диализа необходимо обеспечить минимальную текучесть мембраны эритроцита, чему способствует низкая температура. Однако, слишком низкая температура может приводить к агрегации эритроцитов [26], поэтому оптимальным считается диапазон, приведенный выше. На стадии запечатывания лизированных эритроцитов необходимо обеспечить оптимальную текучесть мембраны эритроцита для быстрого закрытия пор в мембране. Так как текучесть мембраны эритроцитов повышается с повышением температуры, для восстановления формы эритроцита логично создавать температуру близкую к физиологической. Температура выше 40°С может приводить к денатурации белков в мембране клетки и, как следствие, к гемолизу эритроцитов.
Предпочтительными, но не ограничивающими, являются следующие варианты реализации способа.
В частном варианте реализации способа на стадии лизиса эритроцитов с помощью гипоосмотического диализа поддерживают постоянное трансмембранное давление в диализаторе 170 мм рт. ст, а на стадии концентрирования поддерживают постоянное трансмембранное давление 100 мм рт. ст.
В частном варианте реализации способа стадию концентрирования отмытых эритроцитов проводят до достижения величины гематокрита суспензии эритроцитов 75%- 80%.
Способ проводят в стерильных условиях.
В качестве раствора для отмывания эритроцитов можно использовать физиологический раствор, раствор Bio-Wash или другие изоосмотические растворы для отмывания эритроцитов. Для лизиса эритроцитов и последующего их запечатывания используют гипоосмотический и гиперосмотический растворы, соответственно.
Краткое описание фигур
Заявляемое изобретение может быть проиллюстрировано следующими фигурами:
На фиг. 1 представлено схематическое изображение варианта заявляемого устройства. На фиг. 2 представлена диаграмма потоков суспензии эритроцитов в заявляемом устройстве.
На фиг. 3 представлен алгоритм работы блока управления.
На фиг. 4 представлена зависимость концентрации гемоглобина в суспензии эритроцитов, прошедших через внутренний контур диализатора в ходе стадии концентрирования суспензии эритроцитов, от уровня трансмембранного давления во внешнем и внутреннем контурах диализатора. Показаны результаты экспериментов на эритроцитах из двух различных образцов крови, в которых концентрирование 10% суспензии эритроцитов проводили в течение 8 мин при различных трансмембранных давлениях в диализаторе.
На фиг. 5 представлена зависимость степени инкапсуляции аспарагиназы от уровня трансмембранного давления в диализаторе на стадии гипоосмотического диализа эритроцитов в присутствии аспарагиназы.
На фиг. 6 представлены электронные микрофотографии исходных эритроцитов, а также полученных из них с помощью предлагаемого способа эритроцитов-носителей, содержащих либо аспарагиназу, либо совместно включенные глутаматдегидрогеназу и аланинаминотрансферазу.
На фиг. 7 представлены гематологические показатели (эритроцитарные индексы) исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей, нагруженных различными БАК, полученных с помощью заявляемого способа.
На фиг. 8 представлена осмотическая резистентность исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей, нагруженных различными БАК, полученных с помощью заявляемого способа.
На фиг. 9 представлены параметры, характеризующие фильтруемость исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей различных БАК, полученных с помощью заявляемого способа.
Термины и определения
Для лучшего понимания заявляемой сущности изобретения ниже приведены основные термины и определения, используемые в дальнейшем описании.
БАК - биологически активный компонент.
В качестве биологически активного компонента для включения в эритроциты может быть использован целый ряд веществ, обладающих какой-либо лекарственной или биологической активностью. В эритроциты могут быть включены самые разнообразные соединения, относящиеся к различным классам веществ, и микрочастицы, обладающие биологической активностью и способные быть удержанными внутри эритроцита. Приведенные здесь конкретные примеры молекул не являются ограничивающими способ по изобретению, а лишь демонстрируют возможности конкретных вариантов реализации. Ряд используемых БАК включает (но не ограничивается) следующие вещества и классы соединений: различные белки, в том числе ферменты (например, аспарагиназа, глутаматдегидрогиназа, аланинаминотрансфераза или их комбинации); пептиды, олигопептиды и полипептиды, аминокислоты; нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, олигонуклеотиды, фосфаты нуклеотидов, в том числе ди- и трифосфаты; аналоги нуклеозидов, используемые как терапевтические агенты (иммуносупрессанты и ингибиторы роста опухолевых клеток), такие как 6-меркаптопурин, азатиопурин, флударабинфосфат; противовирусные агенты, такие как фосфорилированный азидотимидин, (AZT), дидезоксицитозин (ddC), природные и синтетические иммуномодуляторы (активаторы и супрессоры), например, производные мурамилдипептида (MDP); вещества с антикарциногенной активностью (метатрексат, винкристин, винбластин, доксорубицин и т.п.); гормоны (например, кортикостероиды и глюкокортикостероиды); нестероидные противовоспалительные агенты; аллостерические регуляторы гемоглобина (например, инозитолгексафосфат или пиридоксальфосфат); вещества, защищающие гемоглобин или эритроциты (например, криопротекторы); простагландины; лейкотриены (например, лейкотриен II); цитокины; антитела; а-, Р- и у- интерфероны; глутатион; токсины; и другие вещества, имеющие фармакологическую активность.
Кроме того, в качестве биологически активного компонента в эритроциты могут быть включены различные искусственные наночастицы, с включенными биологически активными препаратами или соединениями. Это позволяет, например, использовать эритроцит-носитель как депо-форму в случае наночастиц, которые из-за состава своей поверхности обладают коротким временем циркуляции в кровотоке. Кроме того, такие наночастицы могут обладать, например, сильной флюоресценцией или магнитными свойствами, которые могут быть использованы для создания биосенсоров, концентрирования лекарственного компонента в нужном органе с использованием магнитов или для усиления контрастности при создании биологических изображений, например, при магнитно-резонансной томографии (МРТ) и т.п. Комнатная температура - температура от 20°С до 25°С;
Рабочие растворы - растворы, используемые на разных этапах работы заявляемого устройства для включения биологически активных компонентов в эритроциты, к которым относятся физиологический раствор, раствор Bio-Wash или другие изоосмотические растворы для отмывания эритроцитов, гипоосмотический и гиперосмотический растворы и т.п.;
Исходный материал - цельная кровь пациента или соответствующая по группе цельная кровь донора (исходная кровь), или предварительно отмытые эритроциты (исходные эритроциты);
Эритроциты - красные клетки крови;
Эритроцитарная масса (эритромасса, упакованные эритроциты) - концентрированная суспензия отмытых эритроцитов с высоким гематокритом (60-80%);
Эритроциты-носители (ЭН) - эритроциты, содержащие включенный биологически активный компонент (или компоненты);
Лизированные эритроциты - эритроциты, полученные в результате обратимого гипоосмотического лизиса, например, путем диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического буфера с помощью диализного устройства (диализатора), в мембране которых образовались временные поры;
Лизированные эритроциты-носители - эритроциты, лизированные в присутствии БАК, например, путем диализа против гипоосмотического буфера, содержащего БАК, в мембране которых образовались временные поры и часть БАК поступила внутрь эритроцитов;
Эритроциты-биореакторы - частный случай эритроцитов, нагруженных БАК. Эритроциты, нагруженные ферментным препаратом, способным проводить свою реакцию внутри клеток, в которые он включен;
Запечатанные эритроциты-носители - эритроциты, загруженные БАК, с восстановленной целостностью мембраны клетки, получаемые путем восстановления осмотичности в суспензии лизированных эритроцитов-носителей при добавлении к ней гиперосмотического раствора;
Эффективность (степень или выход) включения БАК (Е) - процент от общего количества, введенного в систему БАК, оказавшийся запечатанным внутри эритроцитов- носителей в результате проведения процедуры включения БАК в эритроциты (процент или выход инкапсуляции); Относительная эффективность включения БАК (R) - процент, который составляет реально полученная в эритроцитах-носителях концентрация (или, в случае включения ферментов, активность) БАК от максимально возможной в данных условиях, за которую принимают концентрацию (или активность) БАК в суспензии отмытых из цельной крови или исходных предварительно отмытых эритроцитов;
Фармакоциты - эритроциты с включенным фармакологическим компонентом;
Магистрали - пластиковые или силиконовые гибкие трубки, соединяющие различные узлы устройства;
PBS - физиологический раствор, содержащий 10 мМ фосфатного буфера, имеющий pH 7.4.
На приведенных выше фигурах использованы следующие обозначения.
ПН1 - перистальтический насос, посредством которого на разных стадиях процесса во внутренний контур диализатора поступает суспензия эритроцитов или физиологический раствор;
ПН2 и ПНЗ - перистальтические насосы, посредством которых физиологический раствор или гипоосмотический раствор из соответствующих мешков поступают во внешний контур диализатора и откачиваются из этого контура, соответственно;
ШН1 и ШН2 - шприцевые насосы для подачи включаемого биологически активного компонента (или компонентов) и гиперосмотического раствора, соответственно; ЭН - полученные эритроциты-носители, содержащие БАК.
Каждый этап обозначен отдельным индексом. В различных частных случаях выполнения изобретения в качестве исходного материала используется либо цельная кровь, либо предварительно отмытая эритромасса (указано, как этапы al или а2 на фиг. 2, соответственно, которые соответствуют введению в систему исходного материала). Перемещения суспензии эритроцитов по магистралям устройства на каждом этапе осуществления способа обозначены следующим образом: al и а2 - введение исходного материала (исходной крови или исходных отмытых эритроцитов, соответственно) в систему; b - подача цельной крови из исходного мешка на отмывание; с - сбор отмытых эритроцитов в мешок для суспензии отмытых эритроцитов; d - концентрирование отмытых эритроцитов; е - гипоосмотический диализ и сбор лизированных в присутствии БАК эритроцитов в мешок, находящийся в блоке для запечатывания, с последующей инкубацией суспензии лизированных ЭН в этом мешке с гиперосмотическим раствором для из запечатывания; f - подача запечатанных ЭН на отмывание; g - сбор запечатанных эритроцитов-носителей после их отмывания в мешок для суспензии ЭН; h - концентрирование полученных ЭН после их отмывания.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленные ниже сведения приведены для лучшего понимания принципа работы заявленного изобретения. Эти сведения не являются ограничивающими, а лишь иллюстрируют общие принципы работы устройства.
Для получения эритроцитов-носителей биологически активного компонента (компонентов) в качестве исходного материала может быть использована как цельная кровь пациента или донора с аналогичной группой крови, так и предварительно отмытые упакованные эритроциты (эритроцитарная масса, эритромасса).
На фиг. 1 представлено схематическое изображение варианта заявляемого устройства, которое можно условно разбить на блоки, выполняющие следующие функции:
- блок I - блок отмывания эритроцитов из исходной крови и отмывания полученных запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих включенный БАК, работающий при комнатной температуре;
- блок II - блок лизиса эритроцитов и концентрирования суспензии отмытых из исходной крови эритроцитов, а также суспензии запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих включенный БАК, температура внутри которого поддерживается постоянной в пределах от +2°С до +10°С (предпочтительно +4°С до +6°С);
- блок III - блок запечатывания, в котором в одном из частных случаев воплощения устройства, при использовании в качестве исходного материала цельной крови, помещается сначала мешок с этой кровью, а затем в ходе выполнения последующих стадий, в любом из частных случаев воплощения устройства, в этот же мешок собирается суспензия лизированных в присутствии БАК эритроцитов, причем от начального этапа работы устройства до полного окончания сбора этих эритроцитов в данном мешке он находится при комнатной температуре, а после завершения сбора, выполняется стадия запечатывания лизированных в присутствии БАК эритроцитов при температуре от +25°С до + 40°С.
Блоки II и III, для поддержания заданной температуры, могут находиться, например, в термостатируемых камерах, где возможно поддержание необходимой температуры (на схеме не показаны). Поддержание необходимой температуры в блоках II и III также может осуществляться за счет других средств. В каждом указанном блоке размещаются емкости, предпочтительно, стандартные пластиковые мешки (контейнеры): так мешок 1 в одном из частных случаев воплощения устройства, предназначен для размещения в нем исходного материала - цельной крови пациента или крови донора с соответствующей группой крови, а затем, после осуществления стадии диализа, в любом из частных случаев воплощения устройства, мешок 1 служит для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов- носителей, содержащих БАК; мешок 2 - мешок, в который в одном из частных случаев воплощения устройства помещают исходный материал - предварительно отмытые эритроциты, либо, в другом частном случае воплощения устройства, в него собирается суспензия эритроцитов, полученных из исходной цельной крови на стадии отмывания; мешок 3 - для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей, мешки 4.1, 4.2 и 5 - для физиологического раствора; мешок 6 - для гипоосмотического раствора; мешки 7.1 и 7.2 - для растворов, используемых на стадии исходного и финального отмывания эритроцитов; а также мешки 8, 9 и 10 - для сбора отработанных растворов. В качестве емкостей для раствора включаемого биологически активного компонента (компонентов) и гипертонического раствора используются шприцы, являющиеся сменным элементом шприцевых насосов 11 и 12, соответственно.
Элементы заявляемого устройства соединены магистралями, представляющими собой трубки, например, гибкие пластиковые или силиконовые трубки. На магистралях, отходящих от шприцевых насосов 11 и 12, а также от мешков 4.1, 4.2, 5 и 6 (с физиологическим и гипоосмотическим растворами), могут быть установлены бактериальные фильтры (на фиг. 1 номерами не обозначены).
Устройство включает диализатор 13, внутренний контур которого заключен внутри полых волокон из полупроницаемой мембраны и окружен внешним контуром, и устройство 21 для отмывания эритроцитов, включающее центрифужный конус, являющийся сменным элементом заявляемого устройства.
Диализатор 13, шприцы в шприцевых насосах, подводящие магистрали и центрифужный конус в устройстве 21, а также бактериальные фильтры, составляют одноразовый набор, используемый для работы заявляемого устройства.
Устройство для отмывания эритроцитов, насосы, в том числе и шприцевые, датчики давления, датчики наличия жидкости в магистралях и датчики гематокрита составляют набор многоразового использования, применяемый для работы данного устройства. Устройство включает ряд датчиков. Датчики 14 и 15 - для измерения давления, на выходе из внешнего и входе во внутренний контур диализатора 13, соответственно, в качестве которых могут быть использованы любые известные датчики давления, например, манометр дифференциальный цифровой DT-8890 производства СЕМ (Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Everett, WA, USA), датчик давления Honeywell 26PCDFA6D (Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA) и т.п.; датчики 16 и 17 - для измерения гематокрита, например, оптические; датчики 18, 19 и 20, которые фиксируют наличие жидкости (растворов и суспензии эритроцитов) в соответствующих магистралях, в качестве которых могут быть использованы, например, ультразвуковой датчик компании Dongguan Lidit Electronics Со., Ltd (Dongguan, China), датчики Sonocheck® ADB Air Bubble Sensors (например, ADB05) (SONOTEC Ultraschallsensorik Halle (Saale) GmbH, Germany) и т.п.
При необходимости количество датчиков может быть увеличено.
В качестве устройства 21 для отмывания эритроцитов может быть использовано любое известное устройство для такого отмывания, например, устройство фирмы Haemonetics АРС-215 (Haemonetics SA, Швейцария), или специально сконструированный встроенный в установку узел для отмывания, содержащий центрифугу, сменную центрифугируемую емкость, необходимые насосы и мешки с исходным и отработанным раствором для отмывания эритроцитов.
Для мягкого перемешивания суспензии эритроцитов в мешках 1, 2 и 3 используются шейкеры 22, 23 и 24, соответственно. Шейкер 22 размещен в блоке III, в котором поддерживается требуемая температура, или шейкер 22 может быть объединен с устройством, способным поддерживать различную температуру. Перемешивание в мешке 1 цельной крови на стадии отмывания из нее эритроцитов или сбор в данный мешок 1 суспензии лизированных в присутствии БАК эритроцитов осуществляется в условиях комнатной температуры. На стадии инкубации для запечатывания эритроцитов-носителей температура в блоке III поддерживается в пределах от +25°С до +40°С. Шейкеры 23 и 24, обеспечивающие перемешивание суспензии в мешках 2 и 3, расположены в термостатируемом блоке II, где поддерживается температура от +2°С до +10°С, предпочтительно от +4° С до +6° С.
Перемещение растворов и суспензии эритроцитов по системе магистралей обеспечивается работой насосов 25, 26 и 27, например, перистальтических, а направление, по которому перемещаются растворы и суспензия эритроцитов на каждом из этапов работы заявляемого устройства, обеспечивается открытием или перекрыванием соответствующих клапанов: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 и клапанов 39, 40 устройства 21 для отмывания эритроцитов. В термостатируемых блоках II и III, расположены датчики температуры (на фиг. 1 не показаны).
Схема последовательных этапов перемещения суспензии эритроцитов в ходе работы устройства представлена на фиг. 2, где используются следующие обозначения:
ПН1 - перистальтический насос 25, посредством которого суспензия эритроцитов поступает во внутренний контур диализатора 13, ПН2 и ПНЗ - перистальтические насосы 26 и 27, посредством которых физиологический раствор из мешка 5 или гипоосмотический раствор из мешка 6 поступают во внешний контур диализатора 13 и откачиваются из этого контура, соответственно; ШН1 и ТТГН2 - шприцевой насос 11 для подачи включаемого биологически активного компонента (или компонентов) и шприцевой насос 12 для гиперосмотического раствора, соответственно; ЭН - полученные эритроциты-носители, содержащие БАК.
Каждый этап работы устройства обозначен отдельным индексом. В различных частных случаях выполнения устройства в качестве исходного материала используется либо цельная кровь, либо предварительно отмытая эритромасса (указано, как этапы al или а2 на фиг. 2, соответственно, которые соответствуют введению в систему исходного материала). Перемещения суспензии эритроцитов по магистралям устройства на каждом этапе работы устройства обозначены следующим образом: al и а2 - введение исходного материала (исходной крови или исходных отмытых эритроцитов, соответственно) в систему; b - подача цельной крови из мешка 1 на отмывание; с - сбор отмытых эритроцитов в мешок 2 для суспензии отмытых эритроцитов; d -концентрирование отмытых эритроцитов; е - диализ и сбор лизированных в присутствии БАК эритроцитов в блок III для запечатывания; f - подача запечатанных ЭН на отмывание; g - сбор запечатанных эритроцитов-носителей после их отмывания в мешок 3 для суспензии ЭН; h - концентрирование полученных ЭН после их отмывания.
Если в качестве исходного материала используют цельную кровь, то после этапа al последовательно осуществляются этапы b-h; если в качестве исходного материала используют предварительно отмытую эритромассу, то после этапа а2 осуществляются этапы e-h.
Все указанные элементы заявляемого устройства работают в автоматическом режиме и регулируются посредством блока управления, который выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством приема и передачи сигналов управления на все элементы устройства. Указанный блок управления соединен с компьютером, на котором установлено разработанное для заявляемого устройства программное обеспечение. Компьютер может быть соединен с заявленным устройством или встроен в устройство.
Устройство может быть выполнено в едином корпусе.
Описание этапов работы устройства
Дополнительно для понимания работы устройства представлены этапы его работы.
Этап 1. Промывка диализатора, магистралей и заполнение мешка с исходной кровью дополнительным физиологическим раствором
Перед началом работы устройства с помощью сканера, соединенного с устройством, производится считывание штрих-кода исходного материала (исходной цельной крови или исходной эритромассы), который загружается в устройство.
Для осуществления включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа, блок управления сначала открывает все клапаны устройства и ожидает команды об успешной загрузке сменного одноразового набора, после чего закрывает все клапаны кроме 28, 36, 38. Проводится промывка диализатора и всей системы магистралей, чтобы избежать возможности образования в них воздушных пузырей.
Блок управления включает насос 25 и, для промывки системы магистралей, физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 посредством насоса 25 подается во внутренний контур диализатора 13, при этом клапаны 28 и 38 открыты. Отработанный физиологический раствор удаляется в мешок 10. Одновременно, блок управления включает насосы 26 и 27 и физиологический раствор из мешка 5 посредством насоса 26 подается во внешний контур диализатора 13. Отработанный физиологический раствор посредством насоса 27 удаляется в мешок 9. Промывка диализатора 13 осуществляется в течение 2-5 мин при максимальной скорости работы насосов 25, 26 и 27 (100 мл/мин).
В одном из частных случаев воплощения заявляемого устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента или донора с соответствующей группой крови (от 50 до 400 мл), ее помещают в мешок 1, который стерильно присоединяют в блоке III, например, посредством припаивания, к каналу одноразовой системы магистралей, ведущему к клапану 39. В качестве отмывающего эритроциты устройства 21 может использоваться любое известное устройство, содержащее сменную центрифугируемую емкость, например, центрифужный конус. Предпочтительно иметь конус с объемом близким к объему крови, находящейся в мешке 1. Многие известные отмывающие устройства имеют достаточно большой объем конуса. В частности, устройство фирмы Haemonetics АСР-215, может иметь объем конуса 275 мл, поэтому если объем исходной цельной крови, находящейся в мешке 1, меньше этого объема, например, от 50 до 200 мл, перед началом отмывания эритроцитов, мешок необходимо дозаполнить дополнительным физиологическим раствором до указанного объема конуса. По окончании промывки диализатора 13 блок управления перекрывает клапаны 36, 38, выключает насосы 26 и 27, открывает клапан 31, и физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 посредством насоса 25 закачивается в мешок 1 со скоростью 100 мл/мин в течение 1-2 мин. После достижения в мешке 1 общего объема 275 мл, блок управления отключает насос 25, и перекрывает клапаны 28 и 31.
Количество добавляемого в мешок 1 физиологического раствора определяется объемом крови в мешке 1 и объемом выбранного конуса устройства 21 для отмывания эритроцитов.
В другом частном случае воплощения устройства, при использовании в качестве исходного материала предварительно отмытых упакованных эритроцитов (эритроцитарной массы), перед началом работы устройства ее помещают в мешок 2, который стерильно присоединяют, например, посредством припаивания, к трем каналам одноразовой системы магистралей устройства в блоке II, один из которых ведет к клапану 29 и датчику 16 для определения гематокрита, второй ведет к клапану 32 и датчику 18 наличия жидкости в магистрали и третий ведет к клапану 30 и датчику 17 для определения гематокрита, а мешок 1 остается незаполненным и на данном этапе не используется (см. фиг. 1 и фиг. 2).
Этап 2. Отмывание эритроцитов из исходной цельной крови
В частном случае выполнения устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента (или донора с соответствующей группой крови), которую помещают в мешок 1 в блоке III, необходимо сначала получить из этой крови суспензию эритроцитов для дальнейшего включения в них биологически активных компонентов. Для этого осуществляют этап отмывания эритроцитов из крови, помещенной в мешок 1. Блок управления открывает клапан 39 и включает насос устройства 21. Кровь из мешка 1 при открытом клапане 39 посредством насоса, являющегося частью устройства 21 для отмывания эритроцитов (на фиг. 1 не показан), поступает в данное устройство 21. Из мешков 7.1 и 7.2 в конус устройства 21 для отмывания эритроцитов поступает раствор для отмывания эритроцитов, в качестве которого может быть использован физиологический раствор, раствор Bio-Wash, представляющий собой физиологический раствор с добавленной глюкозой (0.2%), или другие солевые растворы с нормальной осмотичностью. Отработанный отмывающий раствор затем удаляется в мешок 8. После завершения отмывания эритроцитов блок управления перекрывает клапан 39 открывает клапаны 40 и 32, и отмытые эритроциты посредством работы упомянутого насоса устройства 21 поступают в мешок 2 для отмытых эритроцитов через открытый клапан 32. Поступление отмытых эритроцитов в мешок 2 фиксируется датчиком 18 наличия жидкости в магистрали, ведущей в мешок 2.
Для установления наличия жидкости в магистралях могут быть использованы любые датчики наличия жидкости в магистралях, например, фиксирующие это наличие оптически, по вакуумному разряжению в магистрали, либо по электрическому сопротивлению и т.д.
По окончанию поступления отмытых эритроцитов в мешок 2, блок управления выключает насос устройства 21 и перекрывает клапаны 32, 40.
В другом частном случае воплощения устройства, когда в качестве исходного материала используют предварительно отмытую эритроцитарную массу (от 25 до 250 мл), которую перед началом работы устройства помещают в мешок 2 и стерильно присоединяют к системе соответствующих магистралей, этап отмывания эритроцитов не проводят, а мешок 1, размещенный в блоке III, остается на этом этапе незаполненным.
Этап 3. Концентрирование отмытых эритроцитов
В частном случае выполнения устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента или донора с соответствующей группой крови, которую помещают в мешок 1 в блоке III, суспензия отмытых эритроцитов после этапа отмывания поступает в мешок 2.
Объем и гематокрит полученной суспензии отмытых эритроцитов определяются объемом исходной крови, находящейся в мешке 1, а также объемом конуса устройства 21 для отмывания эритроцитов. Если объем исходной крови небольшой (например, 50-100 мл), а объем конуса устройства 21 такого, как устройство АРС-215, составляет, например, 275 мл, то после этапа отмывания получают достаточно разбавленную суспензию эритроцитов. Чтобы предотвратить большую потерю внутриклеточного содержимого в ходе последующего диализа эритроцитов, отмытые эритроциты необходимо предварительно сконцентрировать. Концентрирование отмытых эритроцитов осуществляется посредством диализатора 13. Блок управления открывает клапаны 29, 30, 36 и включает насосы 25, 26, 27. При мягком перемешивании суспензии эритроцитов в мешке 2 для поддержания ее однородности посредством работы шейкера 23, суспензия отмытых эритроцитов из мешка 2 через открытый клапан 29 посредством насоса 25 закачивается во внутренний контур диализатора 13 со скоростью 10-30 мл/мин, после чего прошедшая диализатор 13 суспензия отмытых эритроцитов возвращается в мешок 2 через открытый клапан 30. Одновременно, во внешнем контуре диализатора 13 из мешка 5 в мешок 9 посредством насоса 26 (работает с постоянной скоростью 20 мл/мин) и насоса 27 прокачивается физиологический раствор. Исходная скорость работы насоса 27, который работает с переменной скоростью, выше, чем у насоса 26, но посредством работы блока управления она снижается так, чтобы поддерживать в диализаторе 13 постоянное трансмембранное давление 90-120 мм. рт. ст. (предпочтительно 100 мм рт. ст.). Указанное трансмембранное давление определяется разностью показаний датчиков давления 14 и 15, сигнал с которых позволяет блоку управления контролировать давление в контурах диализатора 13 и определять режим работы насоса 27. Одновременно блок управления не позволяет абсолютному давлению на входе во внутренний контур диализатора (датчик давления 15) превышать атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, для чего блок управления постепенно снижает скорость работы насоса 25.. Концентрирование суспензии происходит за счет более высокой скорости работы насоса 27, откачивающего из внешнего контура диализатора больший объем раствора, чем тот, что был закачан в этот контур насосом 26. Таким образом, в ходе концентрирования суспензия отмытых эритроцитов прокачивается «по кольцу» до тех пор, пока скорости работы насосов 26 и 27 не станут одинаковыми. После этого процесс концентрирования прекращается, т.к. при равных скоростях подачи и выкачивания раствора из внешнего контура диализатора дальнейшего концентрирования суспензии во внутреннем контуре диализатора уже не происходит. Гематокрит суспензии отмытых эритроцитов в ходе концентрирования контролируется на выходе из мешка 2, а также после выхода из внутреннего контура диализатора 13 посредством датчиков 16 и 17 (например, оптических) для измерения гематокрита, соответственно. Показания этих датчиков фиксируются в протоколе эксперимента. Если уровень полученного гематокрита гораздо ниже необходимого (65-80%), блок управления сигнализирует о нарушенных условиях и включается лампочка, которая сигнализирует о нарушении условий, необходимых для проведения процедуры включения БАК в эритроциты (т.е. о том, что данный эксперимент неудачен). После окончания процедуры концентрирования блок управления выключает насосы 26 и 27 и перекрывает клапан 36. Далее блок управления перекрывает клапан 29 и открывает клапан 28, при этом через клапан 28 посредством насоса 25 через внутренний контур диализатора 13 физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 (примерно 30-40 мл) продолжает прокачиваться в мешок 2 с максимально возможной скоростью, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышает атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, чтобы в мешок 2 были собраны оставшиеся в диализаторе 13 отмытые эритроциты. Одновременно блок управления включает насос 11, и посредством шприцевого насоса 11 в магистраль, ведущую в мешок 2, добавляется включаемый биологически активный компонент (или смесь нескольких компонентов). Затем блок управления перекрывает клапаны 28 и 30. Величина гематокрита суспензии в мешке 2 после окончания концентрирования и смыва туда оставшихся в диализаторе клеток составляет от 65 до 80%. Она фиксируется датчиком гематокрита 16 сразу после начала процедуры диализа.
В частном случае воплощения устройства, когда исходным материалом является предварительно отмытая эритроцитарная масса (от 25 до 250 мл), которую помещают в мешок 2 и стерильно присоединяют его к системе магистралей, блок управления включает насос 11 и в магистраль, ведущую в мешок 2, посредством шприцевого насоса 11 сразу после окончания промывки диализатора (см. этап 1) добавляется включаемый биологически активный компонент, после чего блок управления включает насос 25, который прокачивает 5 мл физиологического раствора из мешков 4.1 и 4.2 в мешок 2, чтобы полностью смыть в этот мешок добавленный раствор БАК. Если для включения в эритроциты используют несколько БАК, все они могут быть либо предварительно смешаны и одновременно введены в систему с помощью одного шприцевого насоса 11, либо для введения могут быть использованы несколько отдельных шприцевых насосов 11.
Все последующие этапы работы устройства осуществляются одинаково при использовании в качестве исходного материала, как цельной крови пациента или донора с соответствующей группой крови, так и предварительно отмытых упакованных эритроцитов.
Этап 4. Диализ Величина гематокрита суспензии отмытых эритроцитов из мешка 2, которая поступает в диализатор 13 для прохождения процесса диализа, отличается от величины гематокрита, использованной исходной предварительно отмытой эритромассы или величины гематокрита, фиксированной датчиком гематокрита 17 на выходе из диализатора 13, при которой было закончено концентрирование суспензии эритроцитов, отмытых из исходной цельной крови (65-80%). Если в качестве исходного материала используется предварительно отмытая эритромасса, то в мешок 2 добавляется 5 мл физиологического раствора для полного смыва из магистрали, ведущей в мешок 2, БАК, добавленного в эту эритромассу. В случае отмывания эритроцитов из исходной цельной крови, после завершения этапа их концентрирования производится смыв в мешок 2 оставшихся в диализаторе 13 клеток дополнительными 30-40 мл физиологического раствора, а также добавление определенного объема раствора включаемого БАК. Реальная величина гематокрита суспензии эритроцитов, поступающей на диализ, фиксируется датчиком 16 для измерения гематокрита, установленным на выходе из мешка 2.
Перед началом диализа блок управления включает насосы 26, 27, открывает клапан 37 и через внешний контур диализатора посредством насосов 26 и 27 из мешка 6 в течение 1 минуты прокачивается гипоосмотический раствор (со скоростью 30 мл/мин), который сливается в мешок 9. Затем на этапе диализа блок управления включает насос 25, открывает клапаны 29 и 31, и из мешка 2 суспензия эритроцитов, содержащая включаемый биологически активный компонент (БАК), мягко перемешиваемая шейкером 23, посредством насоса 25 прокачивается через внутренний контур диализатора 13 и собирается в мешке 1. Одновременно, во внешнем контуре диализатора 13 в противоток суспензии эритроцитов, содержащей БАК, посредством насосов 26 и 27 прокачивается гипоосмотический раствор из мешка 6, который собирается в мешок 9. При этом насос 27 выкачивает раствор из диализатора 13 с той же скоростью, с которой насос 26 подает гипоосмотический раствор во внешний контур диализатора (20-30 мл/мин), что препятствует сильному разбавлению суспензии эритроцитов во внутреннем контуре диализатора 13. Во время диализа блок управления поддерживает постоянное трансмембранное давление 160-180 мм рт. ст. Это достигается регулированием скорости насоса 25, которая сначала устанавливается в пределах 1.5-10 мл/мин (оптимально 6-7 мл/ мин), но затем, используя показания датчиков давления 14 и 15, блок управления, при необходимости, меняет скорость насоса 25, чтобы поддерживать трансмембранное давление в диализаторе 13 на выбранном уровне 160-180 мм рт. ст. Блок управления фиксирует завершение откачивания из мешка 2 суспензии эритроцитов, содержащей включаемый биологически активный компонент, посредством датчика 20 наличия жидкости в магистрали. Блок управления перекрывает клапан 29 и останавливает работу шейкера 23 с мешком 2. Блок управления открывает клапан 28 и посредством насоса 25 физиологический раствор (30-40 мл) из мешков 4.1 и 4.2 продолжает прокачиваться по внутреннему контуру диализатора 13 в течение 3-15 мин (в зависимости от скорости потока суспензии эритроцитов через внутренний контур диализатора 13, которую выбирает блок управления таким образом, чтобы давление на входе во внутренний контур диализатора 13 не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст.), оставшиеся в диализаторе 13 эритроциты собираются в мешок 1, размещенный в блоке III при комнатной температуре. По окончании сбора в мешке 1 лизированных эритроцитов-носителей, содержащих включаемый биологически активный компонент (компоненты), блок управления выключает насосы 25, 26 и 27 и перекрывает клапаны 28, 31 и 37. Этапы, осуществляемые в блоке II, а именно диализ и концентрирование, проводятся при температуре от +2° С до +10° С, предпочтительно от +2° С до +6° С.
Этап 5. Инкубация суспензии лизированных эритроцитов-носителей для их запечатывания
Блок управления включает шприцевой насос 12 и посредством этого насоса 12 в магистраль, ведущую в мешок 1, содержащий лизированные в присутствии БАК эритроциты, добавляется рассчитанное количество гиперосмотического раствора. После окончания сбора лизированных в присутствии БАК эритроцитов в мешке 1, температура в блоке III повышается (или осуществляется подогрев шейкера 22), что обеспечивает в блоке III выбранную температуру в пределах от +25°С до +40°С. Запечатывание эритроцитов, содержащих БАК (эритроцитов-носителей) осуществляется посредством инкубации лизированных в присутствии БАК эритроцитов, находящихся в мешке 1, в течение 20-40 мин (предпочтительно 30 мин) при температуре от +25°С до +40°С (предпочтительно 37° С) при плавном перемешивании содержимого мешка 1 шейкером 22.
Этап 6. Отмывание запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих БАК, и промывка диализатора и его магистралей
Перед последующим использованием диализатора 13 для концентрирования полученных запечатанных эритроцитов-носителей проводится повторная промывка диализатора 13, а полученные и собранные в мешке 1 запечатанные эритроциты-носители, содержащие БАК, отмываются посредством устройства 21 для отмывания эритроцитов путем повторения описанных ранее этапов 1 и 2.
Сбор отмытых запечатанных эритроцитов-носителей осуществляется в свободный чистый мешок 3, для чего блок управления открывает клапаны 33 и 40 и перекрывает клапан 32. Заполнение мешка 3 отмытыми эритроцитами-носителями фиксируется датчиком 19 наличия жидкости в магистрали, ведущей в мешок 3. После заполнения мешка 3 блок управления перекрывает клапан 33.
Этап 7. Концентрирование запечатанных эритроцитов-носителей
Чтобы обеспечить в полученной суспензии эритроцитов-носителей после их отмывания гематокрит приемлемый для непосредственного введения этой суспензии пациенту без ее дополнительной обработки (те. гематокрит от 45 до 70%), запечатанные эритроциты-носители, собранные в мешке 3, концентрируются в нем аналогично тому, как описано ранее на этапе 3. Для этого блок управления открывает клапаны 34, 35 и 36 и включает насосы 25, 26 и 27. Суспензия отмытых запечатанных эритроцитов-носителей, находящаяся в мешке 3, при мягком встряхивании шейкером 24, посредством работы насоса 25 прокачивается через внутренний контур диализатора 13, после чего она снова возвращается в мешок 3. При этом насосы 26 и 27 прокачивают через внешний контур диализатора 13 физиологический раствор из мешка 5 в мешок 9. По достижении одинаковой скорости работы насосов 26 и 27 блок управления останавливает работу этих насосов и перекрывает клапаны 34 и 36. Блок управления открывает клапан 28 и посредством работы насоса 25 на максимальной возможной скорости, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора 13 не превышает атмосферное более чем на 120 мм рт. ст, через внутренний контур диализатора 13 прокачивается примерно 30-40 мл физиологического раствора из мешков 4.1 и 4.2, чтобы оставшиеся в диализаторе запечатанные эритроциты-носители собрать в мешок 3. После сбора оставшихся в диализаторе запечатанных эритроцитов-носителей в мешке 3 блок управления выключает насос 25 и перекрывает клапаны 28 и 35. Устройство прекращает свою работу и мешок 3, содержащий полученные эритроциты-носители, стерильно отсоединяется от системы одноразовых магистралей.
Ниже приведены примеры включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа с помощью заявленного устройства.
Примеры Пример 1. Включение аспарагиназы в эритроциты с помощью заявляемого устройства
Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза, АСП) - фермент класса гидролаз, катализирующий гидролиз L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и иона аммония согласно реакции (1):
АСП: аспарагин+ Н2О <-> аспарагиновая к-та + NHC (1)
Аспарагиназа является неотъемлемой частью комплексного курса терапии при ряде онкологических заболеваний, например, ОЛЛ у взрослых и детей. Так как прямое внутривенное введение свободного фермента имеет серьезные недостатки (главные из которых, сильные аллергические реакции, короткое время жизни фермента в кровотоке, снижение эффективности лекарства при повторных введениях из-за образования в плазме антител к данному ферменту, влияние высоких пиковых концентраций фермента в момент введения на систему свертывания крови, поджелудочную железу, печень и ряд других систем организма, и т.п.), в качестве лекарственной формы аспарагиназы, имеющей улучшенные фармакологические свойства, используют аспарагиназу, включенную в эритроциты [7].
Включение аспарагиназы в эритроциты было проведено с помощью заявляемого устройства заявляемым способом, строго следуя описанному выше алгоритму. Для включения аспарагиназы в эритроциты в качестве исходного материала была использована цельная кровь доноров, которую забирали с помощью пункции локтевой вены в стандартный раствор дигидрата трехосновного цитрата натрия (3.2%, 0.109 М), при соотношении цитратжровь составляющем 1 :9, а также лиофилизованная L-аспарагиназа из Е. coli Веро-аспарагиназа (ВероФарм ООО, Россия) по 10000 МЕ/флакон, в состав субстанции которой входят дополнительно маннитол 50 мг и глицин 50 мг (на 10000 ME). Для проведения проточного диализа были использованы стандартные педиатрические диализаторы фирмы Fresenius (FX Paed) объемом 18 мл. Раствор аспарагиназы готовили путем разведения лиофилизата ферментного препарата буфером (0.015 М Трис-НС1, 0.015% бычьего сывороточного альбумина (BSA), pH 7.3) до конечной активности 4000 МЕ/мл.
В проведенных экспериментах (n=l 1) объем исходной крови составлял 100 мл, а объем добавляемого раствора аспарагиназы - 0.4 мл (с активностью 4000 МЕ/мл).
В каждом эксперименте 100 мл исходной цельной крови донора (с гематокритом от 39.4% до 45.2%) было помещено в находящийся при комнатной температуре мешок, который стерильно соединяли (припаивали) с устройством для отмывания эритроцитов. В качестве устройства для отмывания эритроцитов было использовано устройство АСР-215 (Haemonetics, SA, Швейцария) с объемом центрифужного колокола 275 мл.
Для удаления из системы магистралей воздуха сначала была проведена промывка диализатора. Промывка проводилась в течение 2 мин, путем прокачивания посредством работы насосов через внутренний и внешний контур диализатора со скоростью 100 мл/ мин по 200 мл физиологического раствора из мешков для физиологического раствора в мешки для сбора отработанных растворов. Для проведения отмывания эритроцитов объем суспензии эритроцитов в мешке с исходным материалом должен быть равен объему центрифужного колокола устройства, используемого для отмывания эритроцитов (примерно 275 мл). Чтобы увеличить объем материала в мешке с исходной кровью до этого объема, после окончания промывки диализатора, когда клапаны и насосы на внешнем контуре диализатора прекращали работу, открывался клапан, через который физиологический раствор из мешков для физиологического раствора посредством насоса на внутреннем контуре диализатора прокачивался в мешок с исходной кровью со скоростью 100 мл/мин в течение 2 мин.
Далее для осуществления стадии отмывания эритроцитов из исходной цельной крови, кровь из мешка с исходным материалом посредством работы внутреннего насоса устройства для отмывания эритроцитов поступала в центрифужный колокол, куда посредством работы другого внутреннего насоса этого устройства поступал также раствор для отмывания эритроцитов из мешков для растворов, используемых для отмывания эритроцитов. В качестве раствора для отмывания был использован стандартный раствор Bio-Wash, который представляет собой физиологический раствор с добавкой глюкозы (0.2%). Отработанный раствор для отмывания поступал в мешок для отходов, а отмытые из крови эритроциты поступали в мешок для суспензии отмытых эритроцитов, находящийся при температуре +4° С. Стадия отмывания эритроцитов продолжалась до тех пор, пока датчик наличия жидкости в магистрали не зафиксировал окончание перемещения суспензии из отмывающего устройства в мешок для отмытых эритроцитов.
Так как объем полученной суспензии отмытых эритроцитов равен объему центрифужного колокола устройства для отмывания эритроцитов, т.е. полученная суспензия отмытых эритроцитов была достаточно сильно разбавлена, перед началом стадии диализа проводилась стадия концентрирования отмытых эритроцитов. Для этого суспензия эритроцитов из мешка для отмытых эритроцитов, находящегося на шейкере и постоянно перемешиваемая, посредством работы насоса, через открытый клапан перемещалась по внутреннему контуру диализатора со скоростью 20 мл/мин и собиралась вновь в том же мешке. Одновременно, посредством работы двух насосов, по внешнему контуру диализатора, прокачивали физиологический раствор из мешка для физиологического раствора в мешок для сбора отработанных растворов. Насос, подающий физиологический раствор во внешний контур диализатора, работал с постоянной скоростью 20 мл/мин, а скорость второго насоса, выкачивающего раствор из внешнего контура диализатора, была исходно выше, но менялась таким образом, чтобы в диализаторе поддерживалось постоянное трансмембранное давление 100 мм рт. ст, которое определялось по разности давлений, зафиксированных датчиками давления на внутреннем и внешнем контуре диализатора. При приближении величины гематокрита, фиксируемой датчиком гематокрита, к величине порядка 70%-75%, снижение скорости насоса на внешнем контуре диализатора уже не могло поддерживать постоянное трансмембранное давление в диализаторе на уровне 100 мм рт. ст. При этом давление на входе во внутренний контур диализатора начинало расти. Когда разность давлений на входе во внутренний контур диализатора и выходе из него (где давление равно атмосферному) становилась выше 120 мм рт. ст, насос на внутреннем контуре диализатора начинал снижать скорость, чтобы сохранить уровень трансмембранного давления 100 мм рт. ст. Суспензию отмытых эритроцитов прокачивали через диализатор до тех пор, пока скорости работы насосов на внешнем контуре диализатора не становились равными. При этом датчик измерения гематокрита фиксировал на выходе из внутреннего контура диализатора величину гематокрита суспензии эритроцитов равную 75%-80%. После выравнивания скоростей работы насосов на внешнем контуре диализатора стадия концентрирования завершалась, насосы на внешнем контуре диализатора прекращали работу, а через внутренний контур диализатора посредством работы насоса на внутреннем контуре диализатора, в мешок с суспензией эритроцитов из мешков для физиологического раствора поступало еще 35 мл физиологического раствора, чтобы собрать в нем оставшиеся в диализаторе эритроциты. Скорость работы насоса на внутреннем контуре диализатора при этом автоматически поддерживалась максимально возможной, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст. Одновременно посредством шприцевого насоса в магистраль, ведущую в мешок с суспензией отмытых эритроцитов, поступал раствор аспарагиназы (0.4 мл, 4000 МЕ/мл). Затем клапаны перекрывались.
Далее осуществлялась стадия лизиса, при этом сначала через внешний контур диализатора посредством работы насосов на внешнем контуре диализатора в течение 1 мин прогоняли гипоосмотический раствор (5 мМ КН2РО4/К2НРО4, 2 мМ MgCh, 5 мМ глюкозы, 37 мМ NaCl, 60 мОсм/кг, pH 7.4) со скоростью 30 мл/мин из мешка для гипоосмотического раствора в мешок для сбора отработанных растворов. Затем из мешка с отмытыми эритроцитами (постоянно мягко перемешиваемого шейкером) суспензия эритроцитов с аспарагиназой посредством работы насоса прокачивалась через внутренний контур диализатора и собиралась в мешке для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей, содержащих БАК (примерно за 10-20 мин). Одновременно, во внешнем контуре диализатора в противоток суспензии эритроцитов с аспарагиназой, поступающей из мешка с эритроцитами, посредством работы насосов на внешнем контуре диализатора прокачивали гипоосмотический раствор из мешка для гипоосмотического раствора в мешок для сбора отработанных растворов. Величина скорости работы насосов на внешнем контуре диализатора была одинаковой и составляла 30 мл/мин. Во время диализа поддерживалось постоянное трансмембранное давление 170 мм рт. ст. Это достигалось в автоматическом режиме регулировкой скорости насоса на внутреннем контуре диализатора, которая сначала была установлена как 6.4 мл/мин, но потом насос на внутреннем контуре диализатора изменял скорость, с учетом показаний датчиков давления, чтобы поддерживать трансмембранное давление в диализаторе на выбранном уровне 170 мм рт. ст. при максимальной возможной скорости работы насоса на внутреннем контуре диализатора, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст.
Предпочтительно чтобы скорость подачи гипоосмотического раствора во внешний контур диализатора была близкой или равной скорости откачки этого раствора из данного контура, что не позволяет избыточной жидкости входить во внутренний контур диализатора и разбавлять находящуюся там суспензию эритроцитов. Как следствие достигается дополнительное увеличение эффективности включения БАК и снижение потери внутриклеточного содержимого за счет снижения разбавления суспензии эритроцитов в ходе диализа. Близость скоростей подразумевает расхождение в пределах 1 отн. %, предпочтительно в пределах 0.5 отн. %. После полного прохождения суспензии эритроцитов через диализатор, остатки эритроцитов из диализатора были собраны в мешок для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей путем прокачивания через внутренний контур диализатора с помощью насоса еще 30 мл физиологического раствора. Насос на внутреннем контуре диализатора при этом работал со скоростью 30 мл/мин примерно 1 мин. Посредством шприцевого насоса в магистраль, ведущую в мешок для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей, было введено 9 мл гиперосмотического раствора (1 М NaCl, 50 мМ КН2РО4/К2НРО4, 5 мМ АТФ, 50 мМ глюкозы, 50 мМ натриевой соли пирувата, pH 7.4, 2240 мОсм/кг). Расчет необходимого объема гиперосмотического раствора был сделан заранее в соответствии с формулой (4):
Vzunep (мл Vcycn * (ОсМцелев ~ ОсМдиализ сусп)АОсМгипер ОсМцелев) (4), где Угитр - объем гиперосмотического раствора, который необходимо добавить, Усусп - объем диализированной суспензии эритроцитов, Осмдиализ сусп - исходная осмоляльность диализированной суспензии, ОсмцеЛев - конечная осмоляльность суспензии, которой требуется достичь (равная примерно 300 мОсм/кг) и Осмотр. - осмоляльность гиперосмотического раствора (2240 мОсм/кг).
Чтобы рассчитать объем необходимой добавки гиперосмотического раствора, в проведенных экспериментах, где объем исходной цельной крови составлял 100 мл, предварительно были измерены получаемые в аналогичных условиях объемы суспензии эритроцитов после диализа (Усусп) и осмоляльность этой суспензии (Осмдшишз сусп) при осмоляльности гипоосмотического раствора 60 мОсм/кг, которые составляли в среднем 92.8±14.5 мл, и 112.11±5.64 мОсм/кг, соответственно (п=9). На основании этих измерений было рассчитано, что для восстановления нормальной осмоляльности в суспензии лизированных в присутствии аспарагиназы клеток необходимо использовать добавку гиперосмотического раствора (с осмоляльностью 2240 мОсм/кг) равную 9 мл на каждые 100 мл объема исходной крови.
Только после того, как вся суспензия лизированных эритроцитов-носителей была собрана в мешке для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов- носителей, был включен термостат, который обеспечил температуру равную 37°С, и мешок с суспензией лизированных в присутствии аспарагиназы эритроцитов был проинкубирован при 37° С и постоянном перемешивании с помощью шейкера в течение 30 мин, чтобы обеспечить запечатывание полученных эритроцитов-носителей. Далее полученные запечатанные эритроциты-носители, содержащие аспарагиназу, были отмыты с помощью устройства для отмывания эритроцитов раствором Bio-Wash и собраны в чистый мешок для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов- носителей. Для этого сначала они посредством работы внутреннего насоса АСР-215 поступали в центрифужный колокол устройства для отмывания эритроцитов (АСР-215). Одновременно посредством работы насоса на внутреннем контуре диализатора из мешков для физиологического раствора через внутренний контур диализатора в мешок для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей поступили дополнительные 200 мл физиологического раствора (скорость работы насоса на внутреннем контуре диализатора составляла 100 мл/мин). Запечатанные эритроциты- носители были отмыты, и собраны в чистый мешок для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей. Полученная сильно разбавленная суспензия отмытых запечатанных эритроцитов-носителей была затем сконцентрирована с помощью повторения стадии, описанной выше для концентрирования эритроцитов, отмытых из исходной крови, за исключением того, что сконцентрированные эритроциты-носители были собраны в мешок для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей. Насос прокачивал суспензию через внутренний контур диализатора со скоростью 20 мл/ мин, а насосы на внешнем контуре диализатора прокачивали физиологический раствор из мешка для физиологического раствора в мешок для сбора отработанных растворов (скорость работы одного насоса на внешнем контуре диализатора была постоянна и составляла 20 мл/мин, а скорость другого насоса на внешнем контуре диализатора была переменная и устанавливалась на уровне, который обеспечивал постоянное трансмембранное давление 100 мм рт. ст).
Во всех проведенных экспериментах были рассчитаны выходы инкапсуляции фермента (Е) и выход клеток после проведения процедуры включения ферментов (С), согласно формулам (5) и (6), соответственно:
Е (в %) А сусп. ЭНХ Vcycn. ЭНХ 100/ (Аисх. сусп. ЭР х Vucx. сусп. ЭР) (^),
С (в %) Vcycn. 3HxEItcycn. ЭНХ 100/(V tex. сусп. 3P xEItucx. сусп. ЭР) б), где Аисх. сусп. ЭР и Асусп. эн - активности фермента в исходной суспензии отмытых эритроцитов и в конечной суспензии эритроцитов-носителей с включенным ферментом, соответственно, V cx. сусп. ЭР И Vcycn. эн - объемы, a HtUCx. сусп. ЭР И HtcyCn. эн — гематокриты этих суспензий соответственно. Кроме того, еще один показатель эффективности включения - относительная эффективность включения (R), был оценен как процент, который полученная в эритроцитах удельная активность фермента составляет от максимально возможной удельной активности фермента, которая может быть получена в данных условиях (формула (7)). Под удельной активностью понимается величина активности фермента в расчете на мл клеток-носителей (при гематокрите 100%). При этом за максимально возможную включенную удельную активность принимали активность включаемого вещества в суспензии исходных эритроцитов сразу после внесения аспарагиназы в суспензию отмытых из исходной крови эритроцитов (до начала процедуры включения), т.к. именно такая активность должна установиться в клетках и окружающей среде, если вещество полностью уравновешивается между этими фазами.
R (в %) — Асусп. ЭНХ 100/(Аисх. сусп. 3P HtCycn. Эн)
Figure imgf000044_0001
Активность аспарагиназы измеряли индооксиновым методом, используя в качестве субстрата аспарагиназы аспартат-Р-гидроксамат (АНА) и определяя образовавшийся при этом гидроксиламин спектрофотометрически на длине волны 705 нм после его превращения в индооксин в присутствии 8-гидроксихинолина [27]. Для измерения активности аспарагиназы, включенной в эритроциты, клетки сначала лизировали, разбавляя водой в 200 раз, а затем определяли активность фермента в лизатах (для удобного измерения, активность аспарагиназы в растворе должна составлять примерно 100 МЕ/л). Полученные результаты представлены в Таблице 1.
Пример 2. Совместное включение в эритроциты глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы
Состояние гипераммониемии (повышение концентрации аммония в крови) является опасным осложнением многих патологических состояний, связанных с дефицитами ферментов цикла мочевины, хроническими и острыми патологиями печени (рак, цирроз и т.д.), а также некоторыми инфекциями желудочно-кишечного тракта.
Избыточный аммоний обладает сильным нейротоксическим действием, что может вызывать ряд когнитивных расстройств и даже летальный исход [28]. Поскольку избыточный аммоний очень токсичен, его необходимо быстро убирать из кровотока, однако существующие медикаментозные средства недостаточно эффективны. Чтобы вернуть концентрацию аммония к нормальному уровню (<60 цМ), требуется от 2 до 7 дней. Ранее было установлено [29], что совместное включение в эритроциты двух ферментов - глутаматдегидрогеназы (ГДГ) и аланинаминотрансферазы (ААТ), позволяет создать эритроциты-биореакторы, достаточно эффективно убирающие из кровотока избыточный аммоний, согласно реакциям (8) и (9):
ГДГ: АКГ + NH4 + +Н+ + НАДФН ГЛУ + НАДФ + Н2О (8),
ААТ: ГЛУ + ПИР АКГ + АЛА (9), где АКГ - а-кетоглутарат, ГЛУ - глутамат, ПИР - пируват, АЛА - аланин, NH4 - ион аммония, а НАДФ и НАДФН - окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата, соответственно.
Для получения эритроцитов-носителей, нагруженных совместно ГДГ и ААТ, в качестве исходного материала были использованы предварительно отмытые упакованные эритроциты, полученные стандартным образом на станции переливания крови, а также растворы с различными активностями бактериальной ГДГ из Proteus, sp. (Toyobo Со. Ltd., Osaka, Japan) и ААТ из сердца свиньи (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, USA). Исходный водный раствор ГДГ имел активность 1945 МЕ/мл (при pH 7.4). Объем его добавки составлял от 0.065 до 0.784 мл. Исходная ААТ была лиофильно высушена и имела активность примерно 75 МЕ/мг белка. Для добавления в систему этот фермент был предварительно разбавлен буфером (0.1 М Трис-НС1, pH 7.4) для получения раствора с активностью 250 МЕ/мл. Объем добавки этого фермента в суспензию эритроцитов в разных экспериментах составлял от 0.319 до 14.84 мл. Таким образом, суммарный объем добавки смеси ферментов варьировал в разных экспериментах, в результате чего варьировал и суммарный объем суспензии эритроцитов с добавками ферментов.
Во всех экспериментах (п=17) для включения ферментов в эритроциты использовали способ проточного гипоосмотического диализа, описанный в Примере 1 для аспарагиназы, за исключением первых стадий способа, т.к. в качестве исходного материала в данном примере использовали предварительно отмытую эритроцитарную массу, описанную выше.
В мешок помещали от 52.5 до 60 мл суспензии эритроцитов в физиологическом растворе с гематокритом 80%, предварительно отмытых путем стандартного центрифугирования. Мешок затем был стерильно присоединен (припаян) к магистралям, ведущим к трем каналам одноразовой системы магистралей устройства в блоке запечатывания, ведущим к датчику для определения гематокрита, датчику наличия жидкости в магистрали и клапану, открывающему доступ в мешок из внутреннего контура диализатора. В течение 2 мин была проведена промывка диализатора, для этого посредством работы насосов через внутренний и внешний контуры диализатора пропустили по 200 мл физиологического раствора со скоростью 100 мл/мин. В конце промывки посредством шприцевого насоса в магистраль, ведущую в мешок с эритромассой была введена смесь растворов включаемых ферментов (в разных экспериментах от 0.384 мл до 15.624 мл), а после этого, посредством работы насоса, в течение 15 сек со скоростью 20 мл/мин через внутренний контур диализатора в мешок пропустили еще 5.0 мл физиологического раствора, чтобы полностью смыть в мешок введенную смесь ферментов. После этого клапаны были перекрыты. Расчетный гематокрит полученной после этого в мешке суспензии эритроцитов с добавленными ферментами колебался от 59.0 до 70% (в среднем 66.6±4.6%, п=17). Активности ферментов, добавленных в исходную суспензию эритроцитов, тоже были различны и составляли от 2.11 до 18.74 МЕ/мл суспензии для ГДГ и от 1.33 до 45.6 МЕ/мл суспензии для ААТ.
Все последующие стадии способа (гипоосмотический диализ эритроцитов в присутствии добавленных ферментов, запечатывание полученной суспензии лизированных в присутствии ферментов эритроцитов, отмывание запечатанных эритроцитов-носителей и их последующее концентрирование) были проведены строго по протоколу, описанному в Примере 1 и при тех же условиях.
Как и в Примере 1 , были определены эффективности включения Е и /? (раздельно для каждого фермента) по формулам (5) и (7), а также выход клеток в результате процедуры включения ферментов (по формуле (6)). Полученные результаты также представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Эффективность включения различных ферментов в эритроциты с помощью заявляемого способа проточного гипоосмотического диализа*.
Figure imgf000046_0001
* - Представлены средние величины и стандартные отклонения (Mean ± SD).
Сравнение результатов, полученных в Примерах 1 и 2, показало, что выход клеток при использовании в качестве исходного материала отмытой эритромассы оказался выше. Это можно объяснить тем, что все старые и хрупкие клетки, присутствующие в исходной крови, в этом случае были отмыты еще на стадии приготовления эритромассы. Второй факт, который можно наблюдать в Примере 2, состоит в том, что процент включения двух использованных ферментов различен. ГДГ из Proteus sp. похожа на хорошо изученную ГДГ из печени быка, про которую известно, что ее эллипсоидальная по форме молекула имеет молекулярный вес 340 кДа, длину 13.6 нм и диаметр 4.3 нм [30,31]. Молекула ГДГ из Proteus sp. также имеет вытянутую форму, но немного меньший молекулярный вес (300 кДа) [32]. В тоже время глобулярная молекула ААТ имеет молекулярный вес только 150 кДа и диаметр около 4 нм [33]. Таким образом размер молекулы ГДГ гораздо больше, чем у ААТ, что снижает скорость проникновения этого фермента внутрь клетки через поры эритроцитарной мембраны, имеющие диаметр около 8-10 нм.
Эффективность включения БАК в эритроциты способом проточного гипоосмотического диализа по настоящему изобретению была также сравнена с эффективностью включения БАК в эритроциты с помощью обратимого гипоосмотического воздействия в соответствие с другими существующими способами. В Таблице 2 представлены такие показатели, приведенные в опубликованных работах или рассчитанные нами самостоятельно из опубликованных данных по включению БАК, с помощью каждого из известных способов.
В качестве показателя включения в разных работах авторы рассчитывали либо относительную эффективность включения (А) (те. какой процент включенная в клетки удельная активность составляет от максимально возможной в данных условиях), либо суммарный процент инкапсуляции вещества (Е) (те. суммарный процент вещества, включенный в эритроциты с помощью использованного способа), рассчитанные по формулам (7) и (5).
Представленные в Таблице 2 данные демонстрируют, что эффективность включения БАК с помощью заявляемого способа превосходит аналогичные эффективности, получаемые в других способах. Чтобы оценить качество эритроцитов-носителей, полученных заявляемым способом, были исследованы их свойства, которые были сравнены с аналогичными свойствами исходных эритроцитов.
Свойства эритроцитов-носителей, полученных согласно изобретению
Кроме эффективности включения БАК в эритроциты, для проверки качества эритроцитов-носителей БАК по сравнению со свойствами исходных эритроцитов, были исследованы такие свойства, как: форма клеток после включения БАК, эритроцитарные индексы клеток, их осмотическая резистентность и способность деформироваться.
Таблица 2. Эффективность включения БАК в эритроциты с помощью различных способов*).
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
*) Для способов 1, 4 и 5 приведены данные по включению L-аспарагиназы. Для способа 3 приведены данные по включению дексаметазон-21 -фосфата, и данные по включению фермента гексокиназы, который по размеру похож на аспарагиназу. Данных об эффективности включения БАК с помощью способа 2 найти не удалось. Необходимо отметить, что выходы при включении низкомолекулярных веществ, как правило, должны быть выше, чем для высокомолекулярных ферментов.
А. Форма клеток после проведения процедуры включения фермента в эритроциты
О физическом состоянии клеток после включения фермента может говорить форма полученных эритроцитов-носителей. В настоящей работе эта форма была исследована методом дифференциальной интерференционно-контрастной (конфокальной) микроскопии. Для получения микрофотографий эритроциты сначала фиксировали. Для этого их инкубировали в PBS с альбумином (10 мг/мл) и глутаровым альдегидом (2.5%) 1 час при комнатной температуре. Гематокрит суспензии клеток при фиксации составлял 25%. Затем данную суспензию разводили до гематокрита около 0.1%. Фотографии были получены с помощью микроскопа Zeiss Axio Observer Z. l (Carl Zeiss, Иена, Германия), иммерсионный объектив 100х, 1,3 NA, камера QuantEm 512sc.
На фиг. 6 представлены микрофотографии исходных эритроцитов (А), а также эритроцитов-носителей с включенной аспарагиназой (Б) или совместно включенными ГДГ из Proteus sp. и ААТ из сердца свиньи (В).
Из анализа фотографий можно сделать вывод, что для обоих видов эритроцитов- носителей, содержащих различные БАК, большинство полученных клеток возвращает после восстановления осмоляльности среды свою двояковогнутую форму, которая благоприятствует способности эритроцитов деформироваться и проходить сквозь узкие капиллярные сосуды в организме. Размер большей части эритроцитов с включенными ГДГ и ААТ практически не отличался от размера исходных эритроцитов, тогда как для эритроцитов, нагруженных аспарагиназой, он очень незначительно уменьшился.
Б. Гематологические показатели эритроцитов-носителей, полученных заявленным способом Основные стандартные гематологические показатели клеток (эритроцитарные индексы) были исследованы для исходных эритроцитов (п=9), а также эритроцитов- носителей, нагруженных глутаматдегидрогеназой из Proteus sp. совместно с аланинаминотрансферазой из сердца свиньи (ГДГ + ААТ) (п=6) или аспарагиназой (п=9). В качестве основных показателей были исследованы: средний объем эритроцита (MCV, в фл), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН, в иг) и средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС, в г/дл). Измерение гематологических показателей проводили на гематологическом анализаторе Micros ОТ (ABX-France, Франция).
Полученные результаты представлены на фиг. 7. После включения различных ферментов в эритроциты наблюдалось умеренное изменение эритроцитарных индексов. Средний объем клеток, среднее содержание и средняя концентрация в них гемоглобина всегда достоверно снижались (ANOVA, р <0.05). Это полностью согласуется с данными, полученными ранее в других работах [35]. Несмотря на то, что концентрация и содержание гемоглобина в эритроцитах-носителях снижены по сравнению с исходными эритроцитами, а, следовательно, снижена и их способность переносить кислород, это не влияет критически на выполнение функции газообмена эритроцитами в целом, т.к. вводимый объем эритроцитов-носителей не будет превышать 10% от общего объема эритроцитов в крови человека. Поэтому, даже если концентрация гемоглобина в них будет снижена на 50%, суммарное содержание гемоглобина в организме снизится несущественно (примерно на 5%).
Поскольку размер молекул гликолитических ферментов близок к размеру молекул гемоглобина, можно предполагать, что концентрация этих ферментов в ходе гипоосмотического диализа и открытия пор в клеточной мембране снизится также, как и для НЬ не более чем на 30%. Такое снижение не может повлиять на скорость гликолитических реакций в эритроците, т.к. все необходимые ферменты присутствуют в нем в существенном избытке. В результате, можно полагать, что уровень энергообеспечения клетки существенно не изменится, что позволит эритроцитам- носителям выживать в кровотоке достаточно долго [36].
В. Осмотическая резистентность эритроцитов-носителей
Для измерения осмотической резистентности различных эритроцитов, суспензии исходных эритроцитов или полученных эритроцитов-носителей разводили в PBS до гематокрита 5%. Измерения проводили в растворах с разной осмоляльностью по методике, описанной в [37]. Кривую осмотической резистентности строили как зависимость процента нелизированных эритроцитов от осмоляльности использованных растворов. Кривые осмотической резистентности исходных эритроцитов (п=13) и эритроцитов- носителей, полученных методом проточного гипоосмотического диализа, с включенными совместно ГДГ из Proteus sp. и ААТ из сердца свиньи (п=9), а также с включенной аспарагиназой (п=13) представлены на фиг. 8 (для каждой точки представлены средние величины ± средняя ошибка среднего, Mean ± SEM).
Вид кривой осмотической резистентности для эритроцитов-носителей обоих видов достаточно сильно отличался от вида кривой для исходных эритроцитов, что согласуется с результатами, полученными в других работах по измерению осмотической резистентности эритроцитов-носителей [35,38]. Кривые осмотической резистентности для эритроцитов-носителей стали более пологими и сместились в сторону низких осмоляльностей. Таким образом, эритроциты-носители более устойчивы чем исходные эритроциты к изменениям осмоляльности среды в области осмоляльностей ниже 150 мОсм/кг. Лизис 50% исходных (нативных) клеток происходит уже при осмоляльности 135 мОсм/кг, тогда как у эритроцитов-носителей при этой осмоляльности наблюдается только 25-30% лизированных клеток. Это можно объяснить тем, что во время процедуры включения БАК на стадии отмывания клеток были удалены неустойчивые к осмотическому стрессу эритроциты, а также тем, что эритроциты-носители имеют сниженное содержание гемоглобина, что и повлияло на общую кривую осмотической резистентности. С другой стороны, в области осмоляльностей близких к физиологическим, осмотическая резистентность эритроцитов-носителей почти не отличается от осмотической резистентности исходных эритроцитов.
Г. Деформируемость полученных эритроцитов-носителей БАК
Жизнеспособность эритроцитов-носителей БАК (фармакоцитов) в кровотоке во многом определяется их способностью деформироваться и легко проходить через узкие капиллярные сосуды. Деформируемость эритроцитов можно определить с помощью фильтрационных методов, т.к. скорость фильтрации суспензии эритроцитов или эритроцитов-носителей через искусственный мембранный фильтр с порами диаметром 3-5 мкм, близкими к диаметру эритроцитов (~ 3-5 мкм), и длиной 10 мкм, прямо зависит от этой способности клеток. Фильтруемость клеток была оценена по следующим параметрам: процентное содержание нефильтрующихся эритроцитов в суспензии (Z) и индекс фильтруемости (F), которые определяли методом последовательного пропускания через искусственный полиэтилентерфталатный фильтр (Объединенный Институт ядерных исследований, Дубна, РФ) с порами диаметром 3.5 мкм фиксированного объема (250 мкл) сначала буфера PBS, а затем суспензии клеток с гематокритом 0.1%. Затем, отмыв фильтр после пропускания суспензии, через него повторно пропускали тот же объем PBS. Расчет проводили по формулам (10,11) в соответствии с работой [39]:
F=tb/ts (10),
Z N* 100 т (11), где tb - время протекания через фильтр 250 мкл буфера (PBS), ts - время протекания через тот же фильтр 250 мкл 0.1% суспензии клеток (исходных эритроцитов или эритроцитов-носителей, содержащих БАК), т - общее число клеток, помещенных на фильтр, а N - число пор, которые были блокированы нефильтрующимися клетками при пропускании суспензии через фильтр.
Величина N была определена согласно формуле (12):
N = Nox(tbi-tb)/tbi (12), где No - известное общее число пор на фильтре, a tbi - время повторного протекания 250 мкл буфера через фильтр, который был отмыт после пропускания через него суспензии эритроцитов.
Параметры фильтруемости исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей представлены на фиг. 9, где представлено процентное содержание нефильтрующихся эритроцитов (Z) и индекс фильтруемости (F) для исходных эритроцитов (1) (п=8), свежеполученных эритроцитов-носителей, нагруженных совместно ГДГ из Proteus sp. и ААТ (2) (п=5), свежеполученных эритроцитов-носителей, нагруженных L-аспарагиназой (3) (п=3), и эритроцитов-носителей, нагруженных L-аспарагиназой, после их инкубации в буфере для хранения в течение 2 часов при комнатной температуре (4) (п=3). Во всех случаях приведены средние величины ± SD.
Процентное содержание нефильтрующихся клеток в суспензии свежеполученных эритроцитов-носителей обоих типов было достоверно выше по сравнению с данным параметром нативных (исходных) эритроцитов (ANOVA, /?<0.05). Чтобы понять, насколько необратимы эти изменения, для нагруженных аспарагиназой эритроцитов была измерена фильтруемость не только свежеприготовленных эритроцитов-носителей, но и их фильтруемость после 2 часовой инкубации при комнатной температуре в буфере для хранения клеток (137 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ КН2РО4, 1.3 мМ СаСЬ, 5 мМ MgCb, 10 мМ глюкозы, 5% (по массе) BSA, 30 мМ HEPES, 0.28 мМ аденина и 0.02 мг/мл ампициллина (pH 7.4)). Было показано, что после инкубации процентное содержание нефильтрующихся клеток в суспензии эритроцитов-носителей понижается (относительно суспензии свежеполученных эритроцитов-носителей) и не отличается достоверно от значений данного параметра для исходных эритроцитов (ANOVA, <0.05).
Литература Koleva L.D., Bovt E.A., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. Erythrocytes as carriers: from drug delivery to biosensors. Pharmaceutics 2020, 12(3), No 276 (44 pp.). DOE 10.3390/ pharmaceuticsl2030276. Halfon-Domenech C., Thomas X., Chabaud S., Baruchel A., Gueyffier F., Mazingue F., Auvrignon A., Corm S., Dombret H., Chevallier P, et al. L-asparaginase loaded red blood cells in refractory or relapsing acute lymphoblastic leukaemia in children and adults: results of the GRASPALL 2005-01 randomized trial. Br. J. Haematol. 2011, 153(1), 58-65. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2011.08588.x. Hammel P, Berardi R., Van Cutsem E., Feliu J., Greil R., Wasan H.S., Metges J.-P, Nygren P, Osterlund P.J., Parner V, et al. Trybeca-1 : a randomized, phase 3 study of eryaspase in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone as second-line treatment in patients with pancreatic adenocarcinoma (NCT03665441). J. Clin. Oncol. 2019, 37(4), suppl. TPS471. DOI: 10.1200/JC0.2019.37.4_suppl.TPS471. Batool T., Макку E.A., Jalal M., Yusoff M.M. A Comprehensive review on L-asparaginase and its applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 178(5), 900-923. DOI: 10.1007/ S12010-015-1917-3. Van Den Berg H. Asparaginase revisited. Leuk. Lymphoma 2011, 52(2), 168-178. DOI: 10.3109/10428194.2010.537796. Muller H., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit. Rev. Oncol .Hematol. 1998; 28(2), 97-113. DOI: 10.1016/sl040-8428(98)00015-8. Борсакова Д.В., Синауридзе Е.И. L-аспарагиназа: новые подходы к улучшению фармакологических свойств. Вопросы гематол., онкол. и иммунопатол. в педиатрии. 2018, 17(4), 80-97. DOI: 10.24287/1726-1708-2018-17-4-80-97. Kravtzoff R., Desbois I., Lamagnere J.P, Muh J.P, Valat C., Chassaigne M., Colombat P, Ropars, C. Improved pharmacodynamics of L-asparaginase loaded in human red blood cells. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1996, 49(6), 465-470. DOI: 10.1007/BF00195932. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий B.M., Жаботинский A.M., Пичугин А. В. Проницаемость эритроцитов человека для аспарагина. Биохимия 1985, 50(10), 1733-1737. Booser, D.J.; Hortobagyi, G.N. Anthracycline antibiotics in cancer therapy. Focus on drug resistance. Drugs 1994, 47(2), 223-258. DOI: 10.2165/00003495-199447020-00002. Moudi M., Go R., Yong C., Nazre M. Vinca alkaloids. Int. J. Prev. Med. 2013, 4(11), 1231-1235. DOI: 10.2165/00128415-200711380-00080. Arora R., Malhotra P, Mathur A., Mathur A., Govil C.M., Ahuja PS. Anticancer alkaloids of Catharanthus roseus: transition from traditional to modern medicine. In: Herbal Medicine: A Cancer Chemopreventive and Therapeutic Perspective, 1st ed., Arora, R. Ed., Jaypee Brothers Medical Publishers: New Delhi, India, 2010, Chapter: 21, pp. 292-309. ISBN 9788184488418. Sawyer D.B., Peng X., Chen B., Pentassuglia L., Lim C.C. Mechanisms of anthracycline cardiac injury: can we identify strategies for cardioprotection? Prog. Cardiovasc. Dis. 2010, 53(2), 105-113. DOI: 10.1016/j.pcad.2010.06.007. Ropars C., Nicolau Y.C., Chassaigne M. Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes. US Patent 4,752,586, June 21, 1988, C12M 1/00. Pages E., Ropars C., Bailleul C. Apparatus for causing medical products to penetrate into red blood cells. US Patent 5,589,389, December 31, 1996, C12M 1/12, C12M3/06. Magnani M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus thereof (Dideco Sri, Italy). EP 0 882 448 Bl, data of publication 12.01.2005, bulletin 2005/02, A61K 9/50. Мамбрини Д., Серафини С. Устройство и набор для инкапсуляции в эритроцитах по меньшей мере одного соединения для терапевтического и диагностического применения (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 595 844, дата публикации заявки РСТ 03.11.2011 , А 61 К 9/50, А61М 1/36, B01J 4/00. Мамбрини Д., Бенатти Л., Капогросси Д., Мандолини М. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 670 070, дата публикации заявки РСТ 13.11.2014, А61К 9/50. Godfrin Y. Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France). US Patent 10,273,444 B2, data of prior publication 5.06.2014, data of patent 30.04.2019, A61K 9/50, C12M 1/00, A61K 35/38, A61K 31/6615. Linderkamp O., Meiselman H.J. Geometric, osmotic, and membrane mechanical properties of density-separated human red cells. Blood 1982, 59(6), 1121-1127. Ponder E. Diffractometric measurements of the tonicity volume relations of human red cells in hypotonic systems. J. Gen. Physiol. 1951, 34 (5), 567-571. DOI: 10.1085/ jgp.34.5.567. Evans J., Gratzer W., Mohandas N., Parker K., Sleep J. Fluctuations of the red blood cell membrane: Relation to mechanical properties and lack of ATP dependence. Biophys. J. 2008, 94(10), 4134-4144. DOI: 10.1529/biophysj.l07.117952. Seeman P. Transient holes in the erythrocyte membrane during hypotonic hemolysis and stable holes in the membrane after lysis by saponin and lysolecithin. J. Cell Biol. 1967, 32(1), 55-70. DOI: 10.1083/jcb.32.1.55. Borsakova D.V, Protasov E.S., Nazarenko S.V., Alexandrovich Y.G., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. Ways to increase the activity of glutamate dehydrogenase in erythrocyte-bioreactors for the ammonium removal. Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 2019, 13(3), 212-224. DOI: 10.1134/S0233475519030046. Lanvers C., Pinheiro J., Hempel G. et al. Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal. Biochem. 2002; 309(1): 117-126. DOI: 10.1016/80003-2697(02)00232-4. Mangani M., Rossi L., D’ascenzo M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Erythrocyte engineering for drug delivery and targeting. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998; 28(1): 1-6. DOI: 10.1111/j .1470-8744.1998.tb00505.x

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Устройство для включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, включающее блок отмывания эритроцитов, блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, блок запечатывания эритроцитов-носителей и блок управления, при этом блок отмывания эритроцитов содержит'. устройство для отмывания эритроцитов; блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов содержит'. по меньшей мере одну емкость для физиологического раствора, по меньшей мере один диализатор, внешний и внутренний контуры которого соединены с по меньшей мере одной емкостью для физиологического раствора, по меньшей мере три насоса, один из которых предназначен для перемещения растворов и эритроцитов через внутренний контур диализатора, а два других предназначены для перемещения растворов по внешнему контуру диализатора, по меньшей мере один насос для БАК, по меньшей мере один насос для гиперосмотического раствора, по меньшей мере один датчик измерения гематокрита, по меньшей мере два датчика давления, по меньшей мере один из которых установлен на входе во внутренний контур диализатора и по меньшей мере один из которых установлен на выходе из внешнего контура диализатора, по меньшей мере три датчика наличия жидкости, оборудование для термостатирования, по меньшей мере две емкости для эритроцитов, соединенные с внутренним контуром диализатора и устройством для отмывания эритроцитов, по меньшей мере одну емкость для гипоосматического раствора, соединенную с внешним контуром диализатора, блок запечатывания эритроцитов-носителей содержит'. оборудование для термостатирования, а также по меньшей мере одну емкость для эритроцитов, соединенную с внутренним контуром диализатора и с устройством для отмывания эритроцитов; элементы устройства соединены между собой магистралями, а блок управления выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством прие-
55 ма сигналов с датчиков и передачи сигналов управления на клапаны, расположенные на магистралях, и насосы устройства.
2. Устройство по п. 1, в котором устройство для отмывания эритроцитов, содержит центрифугу, сменную одноразовую емкость для центрифугирования, по меньшей мере один насос для перемещения суспензии эритроцитов и по меньшей мере один насос для отмывающего раствора.
3. Устройство по п. 2, в котором по меньшей мере один насос для перемещения отмывающего раствора соединен с по меньшей мере одним мешком для отмывающего раствора, расположенным в блоке отмывания эритроцитов или в устройстве для отмывания эритроцитов.
4. Устройство по п. 2, в котором по меньшей мере один насос для перемещения суспензии эритроцитов соединен с емкостями для эритроцитов в блоке лизиса и концентрированная суспензии эритроцитов и блоке запечатывания эритроцитов-носителей.
5. Устройство по и. 2, в котором центрифуга соединена с по меньшей мере одним мешком для сбора отработанного отмывающего раствора, расположенным в блоке отмывания эритроцитов или в устройстве для отмывания эритроцитов.
6. Устройство по и. 1, в котором по меньшей мере один шприцевой насос для БАК соединен с мешком для эритроцитов в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов.
7. Устройство по и. 1, в котором по меньшей мере один шприцевой насос для гиперосмотического раствора соединен с мешком для эритроцитов в блоке запечатывания эритроцитов.
8. Устройство по и. 1, дополнительно содержащее соединенный с компьютером сканер штрих-кода на мешке с исходным материалом.
9. Устройство по и. 1, в котором насосы для перемещения биологически активного компонента и насосы для гиперосмотического раствора представляют собой шприцевые насосы.
10. Устройство по и. 1, в котором одна из емкостей для эритроцитов, размещенная в блоке лизиса и концентрирования, представляет собой емкость для отмытых эритроцитов, а другая - емкость для отмытых эритроцитов-носителей.
11. Устройство по и. 1, в котором емкость для эритроцитов в блоке запечатывания эритроцитов-носителей применяется для размещения цельной крови пациента или донора,
56 а также для сбора и запечатывания лизированных в присутствии биологически активных компонентов эритроцитов.
12. Устройство по и. 1, в котором емкости для эритроцитов установлены на устройствах, обеспечивающих перемешивание в указанных емкостях их содержимого.
13. Устройство по и. 12, в котором устройство, обеспечивающее перемешивание, представляет собой шейкер.
14. Устройство по и. 1, в котором в блоке отмывания суспензии эритроцитов осуществляют этапы при комнатной температуре.
15. Устройство по и. 1, в котором в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов осуществляют этапы при температуре от +2°С до +10°С.
16. Устройство по и. 14, в котором в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов осуществляют этапы при температуре от +4°С до +6°С.
17. Устройство по и. 1, в котором в блоке запечатывания полученных эритроцитов- носителей цельную кровь пациента или донора и суспензию лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов на этапе ее сбора в данной емкости содержат при комнатной температуре, а последующий этап запечатывания лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов осуществляют при температуре от +25°С до +40°С.
18. Устройство по и. 1, в котором на магистралях, отходящих от шприцевых насосов, от емкостей с физиологическим и гипоосмотическим растворами установлены бактериальные фильтры.
19. Устройство по и. 1, в котором в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе концентрирования, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру диализатора физиологического раствора, причем один из указанных насосов выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с постоянной скоростью, а другой насос выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с переменной скоростью, поддерживая постоянное трансмембранное давление в диализаторе при концентрировании на уровне 90-120 мм рт. ст.
20. Устройство по и. 1, в котором насос, установленный на входе во внутренний контур диализатора, выполнен с возможностью прокачивания по внутреннему контуру диализатора суспензии эритроцитов с переменной скоростью, причем на этапе концентрирования скорость указанного насоса постепенно уменьшается, когда давление на входе во
57 внутренний контур диализатора превышает атмосферное на 120 мм рт. ст, а на этапе диализа указанный насос функционирует с переменной скоростью для поддержания трансмембранного давления в диализаторе на уровне 160-180 мм. рт. ст.
21. Способ включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента методом проточного гипоосмотического диализа, содержащий следующие стадии: добавление, по меньшей мере, одного биологически активного компонента к суспензии сконцентрированных отмытых из цельной крови эритроцитов или к предварительно полученной эритромассе; лизис эритроцитов в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента с помощью гипоосмотического проточного диализа; инкубация суспензии эритроцитов, лизированных в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, с гиперосмотическим раствором с образованием запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; отмывание запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; концентрирование с помощью диализатора запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; вымывание из диализатора оставшихся там запечатанных эритроцитов-носителей и добавление их к ранее полученным запечатанным эритроцитам-носителям, содержащим, по меньшей мере, один биологически активный компонент; при этом, стадию лизиса эритроцитов в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, проводят при поддержании постоянного трансмембранного давления в диализаторе 160-180 мм рт. ст. и давлении на входе во внутренний контур диализатора, не превышающем атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, а концентрирование эритроцитов осуществляют при поддержании постоянного трансмембранного давления в диализаторе 90-120 мм рт. ст. с учетом измеряемых показателей давления во внешнем и внутреннем контурах диализатора.
22. Способ по п.21, дополнительно включающий стадии отмывания эритроцитов из цельной крови и их последующего концентрирования, предшествующие стадии добавления, по меньшей мере, одного биологически активного компонента к суспензии сконцентрированных отмытых из цельной крови эритроцитов.
58
23. Способ по п.21 или и.22, в котором на стадии лизиса эритроцитов путем гипо- осмотического диализа через внешний контур диализатора пропускают гипоосмотический раствор.
24. Способ по и.21 или и.22, в котором на стадии лизиса эритроцитов путем гипо- осмотического диализа через внутренний контур диализатора пропускают суспензию эритроцитов с, по меньшей мере, одним биологически активным компонентом.
25. Способ по и.21 или и.22, в котором стадию концентрирования отмытых из цельной крови эритроцитов и стадию концентрирования запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент, проводят до достижения величины гематокрита суспензии эритроцитов 75%-80%.
26. Способ по и.21 или и.22, в котором стадию отмывания эритроцитов из цельной крови и стадию отмывания запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент, осуществляют при комнатной температуре.
27. Способ по и.21 или и.22, в котором на стадии лизиса эритроцитов поддерживают постоянное трансмембранное давление в диализаторе 170 мм рт. ст.
28. Способ по и.21 или и.22, в котором на стадии концентрирования суспензии эритроцитов поддерживают постоянное трансмембранное давление в диализаторе 100 мм рт. ст.
29. Способ по п.21 или и.22, в котором, по меньшей мере, один биологически активный компонент выбран из группы: белков, в том числе ферментов, пептидов, олигопептидов, полипептидов, аминокислот; или нуклеиновых кислот, нуклеотидов, олигонуклеотидов, фосфатов нуклеотидов, аналогов нуклеозидов; или противовирусных агентов, природных или синтетических иммуномодуляторов, веществ с антикарциногенной активностью; гормонов; нестероидных противовоспалительных агентов; аллостерических регуляторов гемоглобина, веществ, защищающих гемоглобин или эритроциты, простагландинов, лейкотриенов; цитокинов; антител, а-, Р- или у-интерферонов, глутатиона, токсинов; или наночастиц, содержащих компоненты, имеющие фармакологическую или диагностическую значимость.
30. Способ по п. 29, в котором включаемый фермент представляет собой аспарагиназу, или пары совместно включенных ферментов глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы, или алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы.
31. Способ по п. 29, в котором аналог нуклеозида представляет собой 6-меркапто- пурин, азатиопурин или флударабинфосфат.
32. Способ по п. 29, в котором противовирусный агент представляет собой фосфорилированный азидотимидин или дидезоксицитозин.
33. Способ по и. 29, в котором природный или синтетические иммуномодулятор представляет собой производное мурамилдипептида.
34. Способ по и. 29, в котором вещество с антикарциногенной активностью представляет собой метатрексат, винкристин, винбластин или антрациклиновый антибиотик.
35. Способ по и. 29, в котором антрациклиновый антибиотик представляет собой доксорубицин, даунорубомицин или митоксантрон.
36. Способ по и. 29, в котором гормон представляет собой кортикостероид или глюкокортикостероид.
37. Способ по и. 29, в котором аллостерический регулятор гемоглобина представляет собой инозитолгексафосфат или пиридоксальфосфат.
38. Способ по и. 29, в котором вещество, защищающее гемоглобин или эритроциты представляет собой криопротектор.
PCT/RU2022/050261 2021-08-27 2022-08-24 Устройство и способ для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа WO2023027613A1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021125401 2021-08-27
RU2021125401A RU2772209C1 (ru) 2021-08-27 Устройство для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа
RU2021130947 2021-10-22
RU2021130947A RU2791817C1 (ru) 2021-10-22 Способ включения в эритроциты биологически активных компонентов методом проточного гипоосмотического диализа

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023027613A1 true WO2023027613A1 (ru) 2023-03-02

Family

ID=85322025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/050261 WO2023027613A1 (ru) 2021-08-27 2022-08-24 Устройство и способ для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023027613A1 (ru)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4752586A (en) * 1982-07-05 1988-06-21 Centre National De La Recherche Scientifique Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes
EP0882448B1 (en) * 1997-05-05 2005-01-12 DIDECO S.r.l. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus therefor
US20130101463A1 (en) * 2010-04-26 2013-04-25 Erydel S.P.A. Apparatus and Kit For Encapsulating At Least One Compound For Therapeutic and/or Diagnostic Use in Erythrocytes
US20140154797A1 (en) * 2004-08-05 2014-06-05 Erytech Pharma Lysis/Resealing Process and Device for Incorporating an Active Ingredient, in Particular Asparaginase or Inositol Hexaphosphate, in Erythrocytes
RU2670070C2 (ru) * 2013-05-10 2018-10-17 Эридел С.П.А. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты
RU2772209C1 (ru) * 2021-08-27 2022-05-18 Общество С Ограниченной Ответственностью "Рбк-Фармэко" Устройство для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4752586A (en) * 1982-07-05 1988-06-21 Centre National De La Recherche Scientifique Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes
EP0882448B1 (en) * 1997-05-05 2005-01-12 DIDECO S.r.l. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus therefor
US20140154797A1 (en) * 2004-08-05 2014-06-05 Erytech Pharma Lysis/Resealing Process and Device for Incorporating an Active Ingredient, in Particular Asparaginase or Inositol Hexaphosphate, in Erythrocytes
US20130101463A1 (en) * 2010-04-26 2013-04-25 Erydel S.P.A. Apparatus and Kit For Encapsulating At Least One Compound For Therapeutic and/or Diagnostic Use in Erythrocytes
RU2670070C2 (ru) * 2013-05-10 2018-10-17 Эридел С.П.А. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты
RU2772209C1 (ru) * 2021-08-27 2022-05-18 Общество С Ограниченной Ответственностью "Рбк-Фармэко" Устройство для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005270977B2 (en) Lysis/resealing process and device for incorporating an active ingredient in erythrocytes
US6139836A (en) Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes, and apparatus therefor
EP0101341B1 (fr) Procédé et dispositif pour l&#39;encapsulation dans les érythrocytes d&#39;au moins une substance à activité biologique, notamment des effecteurs allostériques de l&#39;hémoglobine et érythrocytes ainsi obtenus
CA2797194C (en) Apparatus and kit for encapsulating at least one compound for therapeutic and/or diagnostic use in erythrocytes
KR101431650B1 (ko) 아르기닌 디이미나아제를 함유한 적혈구
CN102421467B (zh) 生物人工肝
WO2023027613A1 (ru) Устройство и способ для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа
RU2772209C1 (ru) Устройство для включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа
RU2791817C1 (ru) Способ включения в эритроциты биологически активных компонентов методом проточного гипоосмотического диализа
WO2011135431A1 (en) Method for introducing at least one compound within erythrocytes for therapeutical and/or diagnostic use
Jain et al. Erythrocytes as drug delivery system: a boon to cure

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22861795

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE