KR101431650B1

KR101431650B1 - 아르기닌 디이미나아제를 함유한 적혈구

Info

Publication number: KR101431650B1
Application number: KR1020077027105A
Authority: KR
Inventors: 얀 고드프랭; 삐에르-올리비에 구아노
Original assignee: 에리테끄 파르마
Priority date: 2005-04-25
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2014-08-20
Also published as: ATE432711T1; DE602006007122D1; EP1874341B1; SI1874341T1; AU2006238917C1; AU2006238917A1; US20080274092A1; EP1874341A1; PL1874341T3; CA2606420A1; US20160030532A1; DK1874341T3; FR2884717A1; CA2606420C; JP5339899B2; KR20080000678A; AU2006238917B2; JP2008538761A; US9125876B2; US9968663B2

Abstract

인 비보에서 아르기닌의 혈장 농도를 낮추는 의약 제품의 제조를 위한 아르기닌 디이미나아제의 용도에 관한 것이다. 상기 용도는 특히, 간암 및 악성 흑색종과 같은 아르기닌-의존성 종양의 치료, 또는 일산화질소의 합성의 억제, 및 패혈성 쇼크의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다.

아르기나아제, 아르기닌 디이미나아제(ADI), 적혈구, 패혈성 쇼크, 흑색종

Description

아르기닌 디이미나아제를 함유한 적혈구{Erythrocytes containing arginine deiminase}

본 발명은 혈장 아르기닌의 고갈(depletion), 상기 고갈을 제공하는 조성물 및 상기 고갈 및 그 효과, 예를 들면, 일산화질소의 합성에 대한 효과로부터 이득을 얻을 수 있는 질병의 치료에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 악성 흑색종 및 간암(hepatocarcinoma)과 같은 특정한 종양의 치료, 및 패혈성 쇼크(septic shock)의 예방 및 치료에 관한 것이다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 논문 및 특허 또는 특허 출원은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

아르기닌은 비필수 아미노산이다. 아르기닌은 우레아 사이클의 과정에서 아르기노숙시네이트 신테타아제(arginosuccinate synthetase) 및 아르기노숙시네이트 리아제(arginosuccinate lyase)의 작용에 의해, 시트룰린으로부터 두 단계로 합성된다. 제1 효소는 시트룰린의 아르기노숙시네이트로의 전환을 촉매하고 제2 효소는 아르기닌으로의 전환을 수행한다. 아르기닌은 아르기나아제의 작용에 의해 오르니틴으로 대사되고, 오르니틴은 오르니틴 트랜스카르바모일라아제(ornithine transcarbamoylase)에 의해 촉매된 반응에 의해 시트룰린으로 전환될 수 있다.

그러나, 특정한 종류의 종양 세포는 아르기닌이 공급되어야 하고, 이는 아르기닌-영양요구형(arginine-auxotrophic)이라 불리는 이와 같은 종류의 암의 가능한 치료법으로서 아르기닌 결핍(arginine depression)을 고려하게 했다. 아르기닌 디이미나아제의 항종양 활성은 다수의 반포된 자료의 주제였다. 따라서, 악성 흑색종 및 간암에 대해 인 비보 활성이 입증되었다. 그러나, 이 효소는 일부 주요한 단점을 갖는다.

아르기닌 디이미나아제는 포유동물에서는 생산되지 않으나 미생물로부터 수득되므로, 포유동물에 대해서는 고도의 항원성 화합물로 작용한다.

또한, 이 효소는 포유동물에서 약 5시간 정도의 매우 짧은 반감기(half-life)를 가지며, 효과적이기 위해서는 매일 고 투여량으로 투여되어야 한다. 이와 같은 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 이 효소의 페길화된(pegylated) 제형, 즉, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 아르기닌 디이미나아제를 제안했고, 이는 보다 긴 반감기(7 내지 9일)를 갖는 항원성이 더 낮은 제제를 생성했다. 이 주제를 다루는 연구들 중에서, 본 발명자들은 흑색종 및 간암의 치료에 관한 하기 연구들을 언급할 수 있다: F. Izzo et al., J. Clin. Oncol. 2004, 22: 1815-1822; CM. Ensor et al., Cancer Research 2002, 62: 5443-5450; F.W. Holtsberg et al. J. Control. Release 2002, 80: 259-271; J.S. Bomalaski et al., Preclinica, Research Article Nov/Dec 2003, 1, 5: 284-293; Curley S. A. et al., Hepatogastroenterology, 50, 1214-6, 2003.

미국특허 제4,965,857호는 아르기닌 디이미나아제가 체외 순 환(extracorporeal circulation)에 대해 작용하는 것인 반응기를 이용한 혈액의 체외 처리를 포함하는 완전히 상이한 방법을 제안한다.

페길화된 아르기닌 디이미나아제에 기반한 현재의 치료법들은 흥미로우나, 반감기가 여전히 짧기 때문에 비교적 큰 투여량을 짧은 간격으로 반복 투여해야 하는 필요성, 고 투여량에 의한 반복적인 투여와 연관된 독성, 및 장기적으로 알레르기 효과 및 활성 물질의 저해를 초래할 수 있는 수준의 활성 물질(active principle)에 대한 항체를 유도하는 위험과 관련된 일부 한계를 갖는다.

따라서, 보다 우수한 생체이용률(bioavailability)(보다 우수한 생물학적 활성, 연장된 반감기)을 갖는 활성 제품을 가져서, 투여되는 효소의 양을 최적화하고, 반복적인 치료의 경우에도 그 독성을 경감시키고, 면역 반응 및 임상적 알레르기의 위험을 제한할 수 있는 것은 상당히 유용할 것이다.

의약 제품의 벡터로서 적혈구를 이용하는 장점은 오래 전에 시사되었다. 적혈구는 천연의 생체 적합성(biocompatibility)을 가지며, 수혈 후에, 공지된 방법에 의해 완전히 생분해가능하고 인 비보에서 비교적 긴 반감기를 갖는다(사람의 경우, 약 30일 수준의 반감기).

우레아 사이클의 천연 효소인 아르기나아제의 캡슐화가 적혈구에서 이 효소의 결핍을 보이는 고아르기닌혈증 환자의 치료법의 범위 내에서 제안되고 테스트되었다(C.G. Millan, J. Controlled Release 2004, 95: 27-49; K. Adriaenssens et al., Int. J. Biochem. 1984, 16, 7: 779-786). 그 목적은 내인성 아르기나아제 결핍과 연관된 대사성 결핍 및 효소 결핍을 보완하는 것이었다.

아르기나아제는 pH 약 9.5의 알칼리 최적 pH를 가지며, 그 활성은 생리적 pH에서 낮다. 이와 대조적으로, 아르기닌 디이미나아제는 pH 약 6.5의 최적 pH를 가지며, 생리적 pH에서 70%보다 높은 비율의 활성을 유지하고, 아르기닌에 대한 친화도가 아르기나아제보다 1000배 더 크다: B.J. Dillon et al., Med. Sci . Monit. 2002, 8, 7: 248-253. 일산화질소 NO의 합성의 억제에 대한 연구에서, 저자들은 세포외 아르기닌에 대한 아르기닌 디이미나아제의 강한 활성을 보고했으나, 세포내 아르기닌에 대한 활성은 없는 것으로 보고했다(대식세포).

NO는 생매개체(biomediator)이고 본질적으로 세포외 아르기닌으로부터 합성되는 것으로 사료된다. 패혈성 쇼크(septic shock)는 NO 및 종양 괴사 인자 TNFα에 의해 매개된다. NO 합성의 억제는 패혈성 쇼크에 대한 치료법으로 파악되었고, 따라서, Dillon et al . supra 및 J.B. Thomas, Biochem. J. 2002, 363, 581-587의 연구가 수행되었다. Linds DS. Arginine and cancer, J. Nutr. 2004: 2837S-41에서 보고된 바와 같이, NO는 또한 암화(cancerization) 과정에 관여하는 것으로 보인다.

아르기닌 디이미나아제는 아르기나아제보다 훨씬 큰 아르기닌의 분해 및 NO 합성의 억제에 대한 능력을 갖는 것으로 보인다. 그러나, 이 효소는 세포내 효소 활성을 갖지 않고, 생리적 pH가 그의 최적 pH가 아니며, 짧은 반감기를 갖고, 면역반응을 유도할 것으로 보인다.

이 복잡한 상황으로부터 출발하여, 본 발명자들은 혈장 아르기닌의 효과적인 분해 및/또는 일산화질소 NO의 합성 억제를 제공하는 기술적인 해결안을 제한하고 자 하였다.

따라서, 본 발명은 인 비보(in vivo)에서 혈장 아르기닌의 농도를 낮추는 의약 제품의 제조를 위한 아르기닌 디이미나아제를 함유한 적혈구의 용도에 관한 것이다.

아르기닌 디이미나아제는 IUBMB 효소 명명법(Enzyme Nomenclature)에 따라 EC 3.5.3.6으로 표시됩니다. 사용되는 아르기닌 디이미나아제는 천연, 합성 또는 인공(artificial) 기원일 수 있거나, 또는 유전 공학에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, 상기 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 벡터의 삽입 후에, 숙주 세포, 예를 들면, 대장균에서 상기 효소의 생산). 사용될 수 있는 아르기닌 디이미나아제는 예를 들면, EP-A-1 011 717, EP-A-O 414 007, US-A-5 372 942, JP-A-6062867, JP-A-2053490, 및 JP-A-2035081에 기재된다. 동등한 방식으로, 본 발명은 효소 활성을 증가시키기 위해 변형된 효소일 수 있는 아르기닌 디이미나아제의 유사체의 사용을 포함한다(EP-A-O 981 607).

본 발명의 목적은 혈장 아르기닌 고갈이고, 이는 혈장에서 아르기닌의 농도를 낮추는 것을 의미한다. 이론에 의해 한정되지 않고, 혈장 아르기닌은 수동 확산에 의해 처리된 적혈구로 들어가는 것으로 사료된다. 본 발명의 적혈구는 들어간 아르기닌이 아르기닌 디이미나아제에 의해 분해되는 생물반응기(bioreactor)로서 작용한다. 본 발명은 다른 장점들을 제공한다. 수명의 완료 시에, 적혈구는 본질적으로 간, 비장 및 골수 및 폐에서 대식세포에 의해 파괴된다. 이는 아르기닌 디이미나아제의 표적화된(targeted) 분비를 초래하여, 혈장 아르기닌의 국소적인 고갈을 유발한다. 이 효과는 이와 같은 기관에 영향을 미치는 질병, 특히, 간암(hepatocarcinoma)과 같은 종양의 치료에서 이용된다.

본 발명에 의해 채택된 해결안은 탁월한 방식으로 수개의 결정적인 장점들을 조합할 수 있게 하고, 즉, 장시간의 작용을 허용하는 적혈구의 수명, 한편으로는, 효소가 80%보다 높은 비율의 효소 활성을 보이는 pH 7.4 미만의 pH에 의해 유리하고, 다른 한편으로는 반복적인 치료법의 경우 매우 유리한 것인, 효소가 면역계로부터 분리되어 상기 효소에 대한 면역반응을 일으킬 수 있는 위험을 감소시키는 것인 환경에서의 효소의 보관을 조합할 수 있게 한다. 효소는 적혈구의 막에 의해 항-아르기닌 디이미나아제 항체로부터 보호되고, 따라서, 치료대상인 환자의 혈액에 항체가 존재하는 경우에도 그 효소 활성은 보존된다. 또한, 그 효소가 세포내 아르기닌에는 작용하지 않기 때문에, 건강한 세포들이 보존된다.

따라서, 본 발명은 혈장 아르기닌 고갈의 유리한 효과가 입증된, 아르기닌-의존성 종양에서 특히 유용하게 적용된다(예를 들면, 앞서 인용된 F. Izzo et al., 2004, C.M. Ensor et al., 2002, F. W. Holtsberg et al., 2002, J.S. Bomalaski et al., 2003, 및 Curley S.A. et al., 2003을 참조함).

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 의약 제품은 아르기닌-의존성 종양의 치료를 위해 의도된다. 아르기닌-의존성(arginine-dependent)에 의해, 본 발명자들은 복제를 위해 아르기닌을 요구하고, 그들이 필요로 하는 아르기닌의 일부 또는 전부를 합성할 수 없고, 따라서 아르기닌의 공급을 필요로 하는 종양 세포를 포함하는 종양을 의미한다. 혈장 아르기닌 고갈은 이 세포들로부터 그들의 발달에 필수적인 아르기닌을 결핍시켜, 이 세포들의 표적화 사멸, 종양 성장의 억제 또는 종양 매스의 퇴행(regression)을 초래할 것이다.

제1 특징에 따르면, 본 발명은 간암 또는 원발성 간암(primary liver cancer)을 치료하는 의약 제품의 제조를 위한 이 적혈구들의 용도에 관한 것이다.

제2 특징에 따르면, 본 발명은 다양한 형태의 악성 흑색종, 예를 들면, 확산되는 표재성 흑색종(superficial spreading melanoma) 및 결절성 흑색종(nodular melanoma)을 치료하는 의약 제품의 제조를 위한 이 적혈구들의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 제2 구체예에 따르면, 본 발명은 일산화질소의 합성을 억제하는 의약 제품의 제조를 위한 이 적혈구들의 용도에 관한 것이다. 상기 의약 제품은 앞서 인용된 Dillon et al., 2002에서 개시된 바와 같이, 적어도 부분적으로는 혈장 아르기닌의 분해를 통해 작용한다.

이 구체예의 일 특징에 따르면, 본 발명은 패혈성 쇼크의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제품의 제조를 위한 이 적혈구들의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하기의 형태의 암 중 하나의 치료:

-유방암(Shen Wei-Chiang et al., California Breast cancer research: http://www.cbcrp.org/research/PageGrant.asp?grant_id=1954)

-신경모세포종(Gong H. et al., Int. J. Cancer 2003, 106: 723-8)

-백혈병(Gong H. et al. Leukemia 2000, Vol. 14, 826-9; Noh E.J. et al., Int. J. Cancer 2004, 112:502-8) ;

또는 혈관신생(angiogenesis)의 억제 및 하기와 같은 관련 질환의 치료를 위한 의약 제품의 제조를 위한 이 적혈구들의 용도에 관한 것이다: 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 신생혈관 녹내장, 각막질환, 갱년기 황반변성 및 기타 황반변성, 익상편(pterygium), 망막변성, 수정체 후부 섬유증식증, 건선, 모세관확장증, 화농성 육아종, 지루 피부염, 여드름, 암 및 혈관신생 관련 전이(WO0209741; Park I. S. et al., Br. J. Cancer 2003, 89: 907-14).

본 발명은 또한 아르기닌 디이미나아제를 함유한 적혈구에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 약학적으로 허용가능한 식염수(일반적으로 적혈구용 표준 배지, NaCl 및, 글루코오스, 덱스트로오스, 아데닌 및 만니톨로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 용액; 예를 들면, SAG-만니톨 또는 ADsol)에 담긴 이 적혈구들의 현탁액에 관한 것이다. 상기 용액은 적혈구의 보존을 제공하고, L-카르니틴과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 상기 현탁액은 즉시 사용되거나, 또는 사용 전 희석을 위한 상태로 포장될 수 있다. (필요한 경우, 사용 전 희석 후에) 즉시사용형(ready-to-use) 제품의 최종 적혈구 용적률(hematocrit) 값은 바람직하게는 40 내지 70%이다. 상기 제품은 정맥내로, 바람직하게는 관류(perfusion)에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 적혈구를 포함하는 그와 같은 현탁액 또는 투여가능한 제제는 그 자체로 본 발명에 의해 포괄되는 의약 제품 또는 약학적 조성물을 구성한다. 상기 의약 제품 또는 조성물은 명백하게 전술된 다양한 응용을 위해 의도될 수 있다. 예를 들면, 관류용 유연성 있는 백 또는 주사에 의한 투여를 위한 다른 제형으로 포장될 수 있다.

본 발명의 일 특징에 따르면, 의약 제품은 40 내지 70%의 적혈구 용적률 값, 바람직하게는 45% 내지 55%, 및 보다 바람직하게는 50%의 적혈구 용적률 값을 갖는 적혈구 현탁액을 포함한다. 상기 의약 제품은 바람직하게는 10 내지 250 ml의 용량으로 포장된다. 의약 처방에 상응하는 캡슐화된 효소의 양은 바람직하게는 전체가 혈액 백(bag of blood)에 담긴다. 의약 처방은 체중 1 kg 당 1 내지 200 IU로 다양할 수 있다.

본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 의약 제품의 유효량을 명백하게 정맥내 경로에 의해, 주사 또는 관류에 의해, 및 바람직하게는 관류에 의해 투여하는 단계를 포함하는, 간암 및 악성 흑색종과 같은 암의 아르기닌-의존성 형태, 또는 전술된 암성(cancerous) 또는 비-암성 질환 중 하나의 치료방법에 관한 것이다.

흥미로운 양상(modaltiy)에 따르면, 환자는 종양의 외과적 절제 후에 치료된다.

본 발명은 환자에게 정맥내 경로에 의해, 주사 또는 관류에 의해 및 바람직하게는 관류에 의해 상기 의약 제품의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 일산화질소의 합성을 억제하고 및/또는 패혈성 쇼크를 예방 및/또는 치료하도록 의도된 방법에 관한 것이다.

이와 같은 다양한 치료 방법에 대한 특별히 유리한 양상에 따르면, 환자는 자신의 적혈구가 효소의 캡슐화를 위해 처리된 후, 그 자신의 적혈구로 치료된다. 변형으로, 적혈구가 하나 이상의 공여자로부터 수득된다.

따라서, 본 발명의 방법은 환자 또는 하나 이상의 공여자로부터 하나 이상의 혈액 시료, 예를 들면, 혈액 백을 채취하는 단계, 적혈구의 침적물(deposit) 또는 농축물, 본 발명에 따른 효소의 포접(incorporation)을 준비하는 단계 및 상기 효소를 내포한 적혈구의 배치(batch)를 제조하는 단계, 및 현탁액(의약 제품)을 정맥내 경로에 의해 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

통상적으로, 체중 1 kg 당 1 내지 200 IU에 해당하는 처리된 적혈구의 현탁액의 용량이 투여된다. 본 발명의 일 특징에 따르면, 40 내지 70%, 바람직하게는45% 내지 55%, 및 보다 바람직하게는 50%의 적혈구 용적률 값을 갖는 적혈구 현탁액 10 내지 250 ml가 투여된다.

특정한 양상에 따르면, 그와 같은 현탁액은 15일 내지 3개월의 빈도로, 바람직하게는 매월 충분한 시간 동안 투여된다.

적혈구에 활성 물질을 캡슐화하는 기법이 알려져 있으며, 본 발명에서 바람직한 용해-재밀봉(lysis-resealing)에 의한 기본적 기법이 본 발명이 속하는 기술이 속한 분야의 당업자가 참조할 수 있는 특허 EP-A-IOl 341 및 EP-A-679 101에 기재된다. 이 기법에 따르면, 투석기(dialyzer)의 제1 구획에 적혈구 현탁액이 지속적으로 공급되고, 제2 구획은 적혈구를 용해시키기 위해 상기 적혈구 현탁액보다 저장성인 수용액을 포함하고; 재밀봉 유닛에서, 삼투압 및/또는 교질 삼투압(oncotic pressure)을 증가시키는 것에 의해 효소의 존재 하에 상기 적혈구의 재밀봉이 유도되고, 그 후, 상기 효소를 함유한 적혈구의 현탁액이 회수된다.

현재까지 기술된 변형들 중에서, 선호되는 것은 효소의 효율적이고, 재현가능하며, 신뢰성있고, 안정한 캡슐화를 제공하는 프랑스 특허출원 제0408667호에 기재된 방법일 것이다. 이 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

1 - 집합된(packed) 적혈구(PRBC)(또는 적혈구 농축물(globular concentrate))을 +1 내지 +8℃의 냉장 조건에서 65% 이상의 적혈구 용적률 값으로 등장액에 현탁시키는 단계,

2 - 동일한 PRBC로부터의 적혈구 시료의 삼투압 취약성(osmotic fagility) 을 측정하는 단계로서, 상기 단계 1 및 단계 2는 임의의 순서(병행 수행 포함)로 수행될 수 있으며,

3 - +1 내지 +8℃로 일정하게 유지된 온도에서 용해 및 상기 효소의 내재화(internalization)의 절차로서, 투석 카트리지를 통해, 65% 이상의 적혈구 용적률 값의 적혈구 현탁액 및 +1 내지 8℃로 냉장된 저장 용해 용액(hypotonic lysis solution)을 통과시키는 단계를 포함하고, 용해 파라미터는 앞서 측정된 삼투압 취약성의 함수로서 조정되는 것인 절차를 수행하는 단계; 및

4 - 고장성 용액의 존재 하에, +30 내지 +40℃의 온도에서 재밀봉(resealing) 절차를 수행하는 단계(특히, 제2 챔버에서 수행됨).

"내재화(internalisation)"는 적혈구의 내부로의 효소의 투과를 의미한다.

본 발명의 제1 특징에 따르면, PRBC는 65% 이상, 및 바람직하게는 70% 이상의 높은 적혈구 용적률 값으로 등장액에 현탁되고, 이 현탁액은 +1 내지 +8℃, 바람직하게는 +2 내지 +6℃, 및 통상적으로 약 +4℃에서 냉장된다. 특정한 양상에 따르면, 적혈구 용적률 값은 65 내지 80%, 바람직하게는 70 내지 80%이다.

본 발명의 중요한 특징에 따르면, 적혈구의 삼투압 취약성은 용해 단계 직전에 측정된다. 적혈구 또는 적혈구를 포함하는 현탁액은 유리하게는 용해를 위해 선택된 온도에 근접한 온도 또는 그와 동일한 온도이다. 본 발명의 또 다른 유리한 특징에 따르면, 삼투압 취약성의 측정값이 수득된 후, 신속하게 이용되어야 하며, 즉, 시료를 채취한 후 즉시 용해 절차가 수행된다. 시료의 채취와 용해의 개시 간의 시간 지연은 바람직하게는 30분 이하, 훨씬 더 바람직하게는 25분 이하 또는 심지어 20분 이하이다.

투석이 제어될 수 있게 하는 두 개의 파라미터는 투석기에서 세포의 체류(dwell) 시간(후자의 특징의 함수) 및 투석물(dialyzate)의 삼투압 농도(osmolarity)이다. 이 두 개의 파라미터는 용해/재밀봉 단계를 수행하기 위해 처리될 적혈구의 삼투압 내성(osmotic resistance)의 특성에 대해, 또는 반대로 취약성에 대해 조정되어야 한다. 이 삼투압 내성은 하나 이상의 하기의 파라미터를 특징으로 한다:

a. 용혈, 즉 소공(pore) 형성의 개시가 나타나는 매질의 삼투압 농도(osmolarity).

b. 곡선 % 용혈=f(매질의 삼투압 농도)의 선형 부분의 기울기로부터 결정된, 용혈 속도 V.

c. 주어진 삼투압 농도에 대한 용혈의 백분율.

d. 50%의 용혈(H₅₀)이 수득되는 삼투압 농도.

e. 특정 백분율(예를 들면, 50%)의 용혈을 얻기 위해 소요된 시간.

바람직한 구체예에 따르면, 삼투압 내성은 파라미터 b, d, 또는 b 및 d에 의해 기술된다.

따라서, 삼투압 취약성은 시료의 채취와 용해의 개시 간의 짧은 시간 지연과 조화될 수 있는, 단시간 내에 측정되어야 한다. 본 발명의 일 특징에 따르면, 이와 같은 하나 이상의 용혈 파라미터는 반투과막(semipermeable membrane)을 통해, 알려진 등장성의 저장성 용액, 예를 들면, 물(증류수 등)에 대해 측정된다. 수동적인 방법이 고려될 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 삼투압 취약성은 적혈구 시료의 삼투압 취약성을 15분 미만으로, 보다 특별하게는 12분 미만으로, 및 바람직하게는 10분 미만으로 측정하도록 설계된 자동 측정 장치를 이용하여 측정되고, 수득된 결과는 용해 파라미터를 조정하고 용해를 개시하기 위해 짧은 시간 기연으로 이용된다.

삼투압 취약성은 Practical Haematology, 2nd edition, Churchill, London 1956에서 J.V. Dacie에 의해 기술된 수동 기법을 적어도 부분적으로 자동화한 장치를 이용하여 측정될 수 있다. 그와 같은 장치의 예는 Didelon et al., Clinical Hemorheology and Microcirculation 23(2000) 31-42에 기재된다. 원칙은 평가 대상인 적혈구 현탁액의 시료, 및 적합한 용량의 공지된 등장성의 저장성 용액, 예를 들면, 증류수를 각각 반투과성 막의 한쪽에 배치하여, NaCl 이온이 상기 용액, 예를 들면, 증류수를 향해 확산되면서 서서히 적혈구의 용혈이 일어날 수 있게 하는 장치의 이용을 기반으로 한다. 시간의 경과에 따른 용혈의 진행은 808 nm의 파장의 레이저 조사를 이용하여 투과율(transmittance)(J. Didelon et al., Biorheology 37, 2000: 409-416 참조)을 측정하는 것에 의해 모니터링된다. 광전지( photoelectric cell)가 현탁액을 통해 투과된 광의 변화를 측정한다. 예를 들면, 측정은 10분간 이루어진다. 상기 장치는 하나 이상의 전술된 파라미터 a-e를 제공한다.

제1 양상에 따르면, 삼투압 취약성은 최초 온도가 +1 내지 +8℃인 시료를 대상으로 바람직하게는 이 온도의 증류수로, 온도 변화가 측정에 영향을 미치지 않는 조건에서 측정된다. 제2 양상에 따르면, 삼투압 취약성은 +1 내지 +8℃의 온도에서 유지된 시료에 대해 측정된다. 따라서, J. Didelon et al.(supra)에서 기술된 측정 장치는 온도 조절을 허용하기 위해 변형될 수 있다. 상기 온도는 바람직하게는 용해 온도에 근접하거나 이와 동일하다.

하나 이상의 상기 파라미터들이 결정되면, 투석기 내의 세포들의 유속, 또는 효소를 캡슐화한 적혈구를 얻기에 충분한 투석물의 삼투압 농도 및/또는 후자의 적합한 양을 결정하기 위해 상기 파라미터 또는 파라미터들을 고려한 관계가 적용될 수 있다:

적혈구의 유속 = [A x (H₅₀)] + [B x (V)] + K

- A 및 B = 투석기 및 용해 용액의 삼투압 농도에 대해 조화시킬 수 있는 변수

- K = 조정을 위한 상수.

투석물의 삼투압 농도 = [C x (H₅₀)] + [D x (V)] + K

- C 및 D = 투석기 및 용해 용액의 삼투압 농도에 대해 조화시킬 수 있는 변수

- K = 조정을 위한 상수.

본 발명의 일 양태에 따르면, 용해 절차는 적혈구 현탁액의 온도가 +1 내지 +8℃이고, 삼투압 취약성이 측정되고, 용해 파라미터가 기록되었을 때 개시된다.

바람직한 구체예에 따르면, 50% 용혈을 일으키는 g/L로 표시된 NaCl의 농도가 측정되고(파라미터 d) 투석 카트리지의 적혈구 현탁액의 유속이 측정된 농도 값에 따라 조정된다.

유리한 특징에 따르면, 처리될 초기 현탁액이 전술된 용해-내재화 챔버에 배치된다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 방법은 온도 조절을 갖춘 냉장 모듈을 이용하고, 이 모듈에 투석 카트리지, 상기 카트리지를 백 및 용해 용액에 연결하는 튜브를 포함하는 1회용의 멸균된 제거가능한 조립체에 이미 연결되었거나 또는 연결될, +1 내지 +8℃로 냉장된 적혈구 현탁액의 백이 배치되고, 또한, 상기 모듈은 상기 적혈구 현탁액 및 상기 용해 용액의 순환을 제공하기 위한 수단을 가지며, 상기 모듈 내의 온도는 +1 내지 +8℃의 온도에서 안정화된다. 냉장 모듈은 상기 백 및 상기 1회용의 제거가능한 조립체를 수용할 수 있는 크기이다. 상기 단일의 냉장 모듈 내에서, 다양한 튜브에 의해 연결된, 백, 투석 카트리지 및 용해 용액의 배열은 본 발명에 따른 방법의 유리한 특징이다.

용어 "백(bag)"은 혈액 수혈 및 혈액 유도체 분야에서 통상적으로 사용되는 유연성있는 백 또는 파우치를 의미한다.

본 발명의 중요한 양태에 따르면, 투석기를 통해 통과되는 현탁액의 안정적인 적혈구 용적률 값을 유지하기 위해, 백 내에서 적혈구를 균질적인 현탁액으로 유지하기 위한 단계들이 취해진다. 본 발명의 특징에 따르면, 따라서, 백에는 백의 내외부로의 현탁액의 순환을 제공하는 루프 형태의 외부 순환이 제공된다.

"투석 카트리지(Dialysis cartridge)"는 투석 벽(dialysis partition)에 의해 분리된 두 개의 구획을 포함하고, 상기 벽을 통해 이온 교환이 일어날 수 있어서, 상기 구획들 중 하나에 위치한 수용액의 삼투압이 다른 구획에 염을 포함하는 수용액을 도입하는 것에 의해 제어된 방식으로 변형될 수 있게 하는 것인 요소를 의미한다. 이 종류의 카트리지는 의학 분야에서 널리 이용된다. 바람직한 양상에 따르면, 중공사 투석 카트리지(hollow-fiber dialysis cartridge), 예를 들면, 하기의 특징을 갖는 카트리지가 이용된다: 100 내지 400 ㎛의 섬유 내경, 0.3 내지 2 m²의 섬유의 총 외부 표면적, 10 내지 40 cm의 섬유 길이, 1.5 내지 8 ml/h.mmHg의 한외여과 계수(coefficient of ultrafiltration).

전술된 바와 같이, 용해 절차는 백 내의 현탁액의 온도가 +1 내지 +8℃일 때, 개시될 수 있다. 흥미로운 양상에 따라, 현탁액의 온도는 외부 루프 순환상에 위치한 센서에 의해 조절된다.

결정된 삼투압 취약성에 따라, 두 개의 주요한 파라미터, 투석 카트리지 내의 적혈구 현탁액의 유속 및 용해 용액의 삼투압 농도에 대해 조치가 취해질 수 있고, 양 경우 모두에, 용해 용액에 대해 일정한 유속을 설정하는 것이 바람직하다. 유속의 값은 결정적이지 않다. 통상적으로, 전술된 바와 같은 중공사 투석 카트리지의 경우, 용해 용액의 유속은 50 내지 300 ml/분, 및 바람직하게는 150 내지 250 ml/분으로 설정된다.

용해 용액은 적혈구 현탁액에 비해 저장성인 식염수(saline solution)이다. 용해 용액의 삼투압 농도가 일정한 값으로 설정되는 경우, 그 삼투압 농도는 20 내지 120 mOsm, 바람직하게는 70 내지 110 mOsm, 예를 들면, 90 mOsm 수준일 수 있다.

일 예로서, 용해 용액은 Na₂HPO₄ 및/또는 NaH₂PO₄ 및 글루코오스와 같은 당을 포함한다.

제1 양상에 따르면, 투석 카트리지를 통한 적혈구 현탁액의 유속은 조정되고, 반면에, 용해 완충액의 유속 및 삼투압 농도는 고정된다. 보다 높은 삼투압 취약성은 현탁액의 보다 높은 유속을 의미한다. 통상적으로, 전술된 규격을 갖는 카트리지의 경우, 유속은 5 내지 200 ml/분, 바람직하게는 10 내지 40 ml/분의 범위 내에서 변경되는 것이 필요할 것이다.

제2 양상에 따르면, 용해 용액의 삼투압 농도는 조정되고, 반면에, 현탁액 및 용해 용액의 유속은 고정된다. 보다 높은 삼투압 취약성은 용해 용액의 삼투압 농도를 증가시키는 것을 의미한다. 통상적으로, 삼투압 농도는 10 내지 200 mOsm/l, 바람직하게는 20 내지 150 mOsm/l의 범위에서 변경되는 것이 필요할 것이다.

제3 양상에 따르면, 투석 카트리지를 통한 적혈구 현탁액의 유속 및 용해 용액의 삼투압 농도가 모두 조정된다.

캡슐화될 효소는 현탁액의 백에 존재할 수 있거나 또는 투석 카트리지의 상류 또는 하류의 현탁액의 순환에 바람직하게는 점진적으로, 도입될 수 있다. 도입되는 용량이 작기 때문에, 효소의 냉장은 선택적이다.

바람직하게는, 적혈구의 현탁액은 예를 들면, 500 ml의 백에 존재하는, 열거된 병원균을 포함하지 않는, 적혈구가 제거된(deleukocytized), 수혈자와 융화될 수 있는 혈액형의 PRBC로부터 생성될 수 있다. 적혈구는 이식편/숙주 면역 반응을 보이기 쉬운 고도로 면역이 저하된(immunodepressed) 환자를 대상으로 의도되는 경우, 방사선 조사된 것일 수 있다(R.J. Davey, Immunol. Invest. 1995, 24 (1-2): 143-149).

본 발명의 특정한 특징에 따르면, 현탁액을 제조하기 위해 이용된, 최초의 PRBC는 적혈구 이외의 요소들을 혈액으로부터 제거하기 위해 사전에 처리되었다. 이와 같은 유형의 처리, 예를 들면, 혈장 또는 보존 용액을 제거하기 위해 식염수로 세척하는 단계는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 알려져 있다.

특정한 양상에 따르면, 세척은 캡슐화될 효소의 존재 하에 수행된다.

세척은 적혈구의 세척을 위한 4중-백(quadruple-bag) 또는 4-백 기법과 같은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다(MacoPharma 방법 및 전이(transfer) 백). 또한, COBE 2991 Cell Processor 타입의 자동 적혈구 세척기를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 적혈구는 그들의 삼투압 내성을 증가시키고 및/또는 균질화시키기 위한 용액으로 사전에 처리될 수 있다. 그와 같은 용액은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자게 의해 알려져 있다. 예를 들면, L-카르니틴을 함유하는 용액은 적혈구의 삼투압 내성의 개선을 제공할 수 있다. 다른 예로서, 본 발명자들은 헤파린 용액, 시트레이트-포스페이트-덱스트로오스(CPD) 용액 및 만니톨 용액을 언급할 수 있다.

용해 단계 동안 온도는 바람직하게는 +2 내지 +6℃로, 훨씬 더 바람직하게는 약 +4℃로 유지된다.

재밀봉 과정은 바람직하게는 용해된 현탁액을 가열하고 고장성 재밀봉 용액을 첨가하는 것에 의해 수행된다. 재밀봉 온도는 +30 내지 +40℃일 수 있다. 바람직하게는 +35 내지 +38℃, 예를 들면, 약 37℃일 수 있다. 인큐베이션은 통상적으로 15 내지 45분간 지속될 수 있다.

바람직하게는, 투석 카트리지로부터 나오는 현탁액 및 고장성 재밀봉 용액은 중간 백으로, 바람직하게는 연속적으로 도입된다. 투석 카트리지에서, 현탁액이 가열되고 재밀봉을 위해 충분한 시간 동안 바람직한 온도에서 인큐베이션된다. 특정한 양태에 따라, 중간 백은 그 내부 온도가 선택된 온도로 조절되는 가열된 모듈 또는 용기에 배치된다.

변형으로서, 현탁액 및 재밀봉 용액이 중간 백으로 도입된다. 모든 현탁액이 이 백에 수집되면, 백은 밀봉되고 가열 및 바람직한 온도에서의 인큐베이션을 위한 모듈로 이전된다.

그 후, 재밀봉된 적혈구의 현탁액은 불량하게 재밀봉되거나 또는 재밀봉되지 않은 세포, 잔류물 및 세포외 헤모글로빈을 제거하기 위해, 식염수에 의한 1회 이상의 세척 단계를 거칠 수 있다.

또 다른 특징에 따르면, 적혈구는 적혈구 저장 용액, 예를 들면, L-카르니틴을 함유한 용액으로 패키징된다.

생성된 적혈구는 바람직하게는 +1 내지 +8℃, 바람직하게는 +2 내지 +6℃, 통상적으로 +4℃의 온도에서 보관된다. 생성물의 최종 적혈구 용적률 값은 바람직하게는 40 내지 80%, 통상적으로 40 내지 70%이다.

본 발명은 하기를 포함하는 용해-재밀봉 장치를 이용하여 구현될 수 있다:

- 냉장 수단 및 온도 조절 수단을 포함하는, +1 내지 +8℃의 온도로 냉장될 수 있는 모듈,

- 상기 모듈에 맞춰질 수 있도록 설계되고, 한편으로는 용해 용액의 공급(feed)에 연결되고, 다른 한편으로는 적혈구 현탁액의 공급에 연결될 수 있는 투석 카트리지를 포함하는, 1회용의 멸균된 제거가능한 조립체, 및

- 상기 용해 카트리지를 통한 적혈구 현탁액의 유속을 조절하고 및/또는 처리될 적혈구의 삼투압 취약성의 함수로, 용해 용액의 삼투압 농도를 조정하는 수단.

일 구체예에 따르면, 제거가능한 조립체는 1회용 키트이고 적혈구 현탁액을 담은 백 및 상기 백을 투석 카트리지에 연결시키는 튜브, 및 적혈구 현탁액을 상기 백으로부터 상기 카트리지를 통해 순환시키기 위해 상기 튜브와 함께 작용하는 펌프를 포함하고, 상기 펌프는 선택적으로 유속 조절 수단과 결합되는 것인 모듈을 포함한다. 상기 조립체는 무균상태(sterility)가 유지될 수 있게 한다.

유리한 특징에 따르면, 백은 추가적으로 그의 양 단부가 루프로 백에 연결된 튜브를 갖추며, 상기 모듈은 백의 내용물의 상기 백의 내외부로의 순환을 제공하기 위해 상기 튜브와 함께 작용하는 펌프를 포함한다.

또 다른 유리한 특징에 따르면, 온도 센서는 상기 튜브의 루프 상에 배열된다.

또 다른 특징에 따르면, 효소 주입 튜브가 상기 백을 투석 카트리지의 "혈액" 유입구(inlet)에 연결하는 튜브에 연결된다.

또 다른 특징에 따르면, 투석 카트리지는 용해 용액을 담을 수 있는 병에 튜브에 의해 연결되고 냉장 모듈은 상기 병을 수용하는 수단 및 상기 투석 카트리지로 및 이를 통하여 용해 용액을 순환시키기 위해 상기 튜브와 함께 작동할 수 있는 튜브를 포함한다.

일 특징에 따르면, 냉장 수단 및 온도 조절 수단은 모듈 내의 온도를 +2 내지 +6℃로, 및 바람직하게는 약 +4℃로 유지시킬 수 있다.

또 다른 특징에 따르면, 투석 카트리지로부터의 "혈액" 유출구(outlet)는 모듈의 외부로 이어지거나 또는 이어질 수 있는 유출 튜브에 연결된다. 또 다른 특징에 따르면, 활성 물질의 주입을 위한 튜브가 상기 유출 튜브에 연결된다. 유출 튜브는 용해 후의 적혈구 현탁액 및 재밀봉 용액(바람직하게는 중간 백으로의 개구부보다 약간 상류에 있는 유출 튜브로 개방된 제2의 튜브를 통해 도입됨)을 수집할 수 있는 제2의 백에 연결될 수 있다. 상기 백은 유리하게는 모듈 내의 온도를 +30 내지 +40℃, 바람직하게는 +35℃ 내지 +38℃로 조절하는 수단을 갖춘 제2의 모듈에 배열된다.

유리한 구체예에 따르면, 1회용의 제거가능한 조립체는 하기의 요소들을 모두 포함한다: 백, 순환 튜브, 주입 튜브(주입 장치 또는 그와 같은 장치와 함께 작동하도록 의도된 용기(receptacle)을 갖춤), 투석 카트리지, 및 바람직하게는 용해 용액를 담은 병.

바람직하게는, 제거가능한 조립체는 그 자체로는 냉장 또는 가열을 위해 의도된 특정한 수단을 갖지 않는다. 이 기능들은 조립체의 두 부분들이 배치된 모듈 또는 챔버에 의해서만 제공된다.

본 발명의 방법 및 장치에서 사용되는 펌프는 바람직하게는 연동식 펌프(peristaltic pump)이고; 일 구체예에 따르면, 현탁액의 최초 백의 내외부로의 재순환을 제공하는 펌프 및 용해 완충액의 순환을 위한 펌프는 사전에 정해진 일정한 회전 속도를 가지며, 반면에, 현탁액을 투석 카트리지로 보내는 펌프는 처리될 적혈구의 삼투압 취약성의 함수로서 제어될 수 있는 회전 속도를 갖는다.

효소는 선택적으로 구동되고, 상응하는 주입 튜브에 연결된, 적합한 수단, 예를 들면, 정속(fixed-rate) 시린지 펌프에 의해 도입된다. 변형으로서, 시린지 펌프는 연동식 펌프로 대체될 수 있다.

본 발명의 장치는 처리될 적혈구의 삼투압 취약성의 함수로서, 용해 카트리지를 통한 적혈구 현탁액의 유속을 조절하고 및/또는 용해 용액의 삼투압 농도를 조정하는 수단을 포함한다.

일 특징에 따르면, 유속 조절 수단은 현탁액을 투석 카트리지로 보내는 펌프를 조절할 수 있도록 설계된다. 또 다른, 대안적인 특징에 따르면, 상기 조절 수단은 희석에 의해 삼투압 농도를 낮추거나, 또는 적합한 용질의 도입에 의해 상기 삼투압 농도를 증가시키는 것에 의해 용해 용액의 삼투압 농도를 조절하도록 설계된다. 변형으로서, 처리될 적혈구의 삼투압 취약성으로 조정된 삼투압 농도의 용해 용액이 모듈로 도입된다.

바람직한 양상에 따르면, 본 발명의 장치는 삼투압 취약성에 관하여, 작동자에 의해 입력된 명령어(예를 들면, 적혈구 현탁액의 유속에 관한 데이터는 작동자에 의해 직접 입력됨), 또는 작동자에 의해 입력된 데이터에 따라 용해 프로세스 및 선택적으로 재밀봉 프로세스를 조절하기 위한 전자적 수단을 포함한다(상기 전자적 수단은 용해 파라미터, 예를 들면, 적혈구 현탁액의 유속을 결정하고 조절하도록 설계됨). 상기 전자적 수단은 바람직하게는 (모듈 내의 온도 및/또는 적혈구 현탁액에 대한 온도 센서의 온도를 조절하는) 온도 센서에 연결된다. 상기 수단은 펌프, 예를 들면, 투석 카트리지를 통한 현탁액의 압력 및 유속을 조절하고 작동시킬 수 있다.

바람직하게는, 상기 모듈은 적어도 한 면에, 유리 표면을 갖추어서, 장치(installation) 및 용액과 현탁액의 순환에 대한 육안 제어를 가능하게 한다.

본 발명은 하기에서 도면을 참조하여, 비-한정적인 예로 이용된 구체예에 근거하여 보다 상세하게 설명된다:

- 도 1은 본 발명에 따른 용해-재밀봉 장치의 개략적인 표현이고;

- 도 2는 본 발명에 따른 방법의 흐름도이며;

- 도 3은 ADI(아르기닌 디이미나아제)를 포함하거나 또는 포함하지 않는 적혈구 현탁액에서 아르기닌 대 시트룰린의 농도를 도시하는 그래프이고;

- 도 4 및 도 5는 아르기닌 및 시트룰린 농도에 대한 적혈구의 약동학(pharmacokinetics)의 그래프를 나타내며; 하기와 같이 처리된 3 그룹의 마우스에 대하여, 도 4는 주어진 시간 동안(처리 후 48시간 까지) 아르기닌 농도의 변화를 보여주고 도 5는 주어진 시간 동안(처리 후 48시간 까지) 시트룰린 농도의 변화를 보여준다: ADILE (아르기닌 디이미나아제가 적재된 적혈구) , ADI(유리 아르기닌 디이미나아제) + RBC, 또는 RBC.

본 명세서에서 RBC 또는 BC는 적혈구를 표시하기 위해 사용된다.

실시예 1 : 장치(installation)

먼저 도 1을 참조한다. 점선으로 표시된 제1 박스는 개폐가 가능하도록 배열 된 유리로 덮인 전면(도시되지 않음)을 가진 평행육면체의 전체적인 형태를 가진 제1 모듈을 표시한다. 이 모듈의 뒤에는, 연동식 펌프(P1, P2 및 P3), 및 기술되지 않을 제거가능한 조립체를 수용하는, 도시되지 않은 수단이 존재한다. 펌프(P1 및 P3)은 사전에 정해진, 일정한 전달(delivery)을 갖는다. 펌프(P2)는 그 전달이 변화되도록 조절된다.

제거가능한 조립체는 용해될 적혈구 현탁액을 담은, 그 용량이 유연하게 조정되는(flexible) 백(2)을 포함한다. 상기 백(2)은 적혈구를 현탁 상태로 유지하기 위해 상기 백으로부터 및 상기 백으로의 순환을 제공하기 위해 펌프(P1)과 함께 작동하는, 루프 형태인 유연성 있는 튜브(3)를 갖추고 있다. 상기 백은 또한 그의 기부(base)에서 투석 카트리지(5)의 "혈액" 구획의 유입구로 연결된 유연성 있는 튜브(4)에 연결된다. 상기 튜브(4)는 펌프(P2)와 함께 작동하며, 이는 상기 백으로부터 상기 카트리지로 현탁액의 순환을 제공한다. 구동형(driven) 시린지 펌프(PS1)는 카트리지(5)의 상류에 있는 튜브(4)에 연결되고, 상기 시린지 펌프는 효소가 적혈구의 순환 내로 도입될 수 있게 한다. 카트리지(5)의 "혈액" 구획의 유출구는 모듈(1)의 외부로 개방되는 유연성 있는 유출 튜브(6)에 연결된다. 제2의 구동형 시린지 펌프(PS2)는 튜브(6)에 연결되고, 이 시린지 펌프는 효소가 용해된 적혈구의 순환으로 도입될 수 있게 한다. 용해 용액을 담은 병(7)은 모듈(1)에 배열되고, 카트리지(5)를 통한 상기 용해 용액의 순환을 제공하기 위해 펌프(P3)와 함께 작동하는 유연성 있는 튜브(8)에 의해 카트리지(5)의 "투석물" 유입구에 연결된다. 최종적으로, 카트리지로부터 유출되는 용해 용액은 모듈(1)의 외부에 위치한 병(10)에 서 종류되는 유연성 있는 배출(discharge) 튜브(9)에 의해 모듈(1)로부터 제거된다.

유출 튜브(6)는 개폐가 가능하도록 배열된 유리로 덮인 전면(도시되지 않음)을 가진 평행육면체의 전체적인 형태를 가진 제2 모듈(11)로 들어간다. 이 모듈의 뒤에는 도시되지는 않았으나, 부분적으로 기술된 제거가능한 조립체의 일부를 형성하는 요소를 수용하는 수단이 존재한다. 상기 요소들은 튜브(6)에 연결되고, 용해된 현탁액이 보관될 유연성 있는 백(12)을 포함한다. 구동형 시린지 펌프 (PS3)은 재밀봉 생성물을 주입하기 위해 튜브(6)에 연결된다.

제거가능한 조립체는 그 과정이 완전히 보일 수 있도록, 유연성 있고 투명한 플라스틱으로 제조된다.

상기 장치에는 또한 도시되지 않은 다양한 수단들이 더 제공된다:

- 튜브(3) 상에 위치한 그 내부에서 순환하는 현탁액의 온도를 측정하기 위한 온도 센서, 및 모듈(1) 내부의 온도 T1을 측정하기 위한 온도 센서를 포함하는, 모듈(1)의 내부를 냉각시키고 그 온도를 +2 내지 +4℃로 조절하는 수단,

- 모듈(11)에 더 제공된, 모듈(11)의 내부를 가열하고 온도 T2를 +37 내지 +38℃로 조절하고, 온도 센서가 상기 모듈의 내부에 존재하는 것인 수단,

- 튜브 내의 적혈구의 존재를 검출하는 수단(D1 및 D2)(예를 들면, 초음파 또는 비색(colorimetric)),

- 투석 카트리지의 유입구에서 압력을 측정하는 수단(PRl),

- 한편으로는 온도 센서 및 압력 센서 및 검출수단으로부터 도달하는 데이터 를 수용하고, 다른 한편으로는 용해 파라미터의 설정에 관한 데이터를 수용하고, 상기 데이터에 근거하여, 펌프(P1, P2 및 P3)을 조절하는 전자 장치. 공정 흐름도가 도 2에 도시된다.

전자 장치는 전술된 흐름도를 실행하도록 설계된 컴퓨터를 포함한다.

상기 장치의 실행(12)은 효소를 함유한 적혈구의 현탁액을 담은 백의 회수를 가져온다.

실시예 2 : 아르기닌 디이미나아제를 캡슐화한 적혈구의 생성

환자로부터 400 ml의 혈액을 채취했다. 4℃로 유지된 혈액에서 적혈구를 제거하고 식염수 용액으로 세척하여 혈장을 제거하고 250 ml 용량의 유연성 있는 백에 80%로 조정된 적혈구 용적률로 넣었다.

1ml 당 400 IU의 효소 농도 및 70%의 적혈구 용적률을 수득하기 위해 아르기닌 디이미나아제 수용액을 적혈구 현탁액에 첨가하였다.

4℃의 현탁액 1 ml를 취하여 앞서 인용된 J. Didelon et al. 2000에 기술된, 그 작동 원리가 전술된 바와 같은 삼투압 취약성을 측정하는 장치에 넣었다. 10분간 측정값을 취했다. 상기 장치는 50%의 용혈을 일으키는 염도(salinity)를 결정할 수 있게 한다. 이 염도는 일반적으로 리터 당 3 내지 5.5 g NaCl이다.

적혈구 및 효소의 현탁액을 담은, 250-ml 용량의 유연성 있는 백(2)을 실시예 1의 장치에 배치하고, 상기 현탁액 및 저장성 용해 용액을 투석 카트리지의 개별적인 구획 내로 점진적으로 넣었다. 투석기에서 적혈구 현탁액의 유속은 이전 단 계에서 결정된 염도 파라미터(삼투압 취약성 또는 삼투압 내성)의 함수로, 15 내지 30 ml/분으로 조절하였다.

백(12)의 상류에서 용해된 적혈구의 현탁액에 10% v/v로 라인을 통해 재밀봉 용액을 첨가하였다. 현탁액을 백에서 37℃로 30분간 인큐베이션하였다. 그 후, 식염수 용액으로 세척하고 보존 용액을 첨가하고(SAG-만니톨), 사용할 때까지 백을 +4℃에 보관하였다.

상기 방법은 순수한 적혈구 1 ml 당 80 내지 180 IU의 효소 활성을 갖는 적혈구를 수득할 수 있게 한다.

통상적인 수혈 방법에 따라, 현탁액의 총 용량을 정맥내 관류에 의해 환자에게 투여하였다.

실시예 3 : 인 비트로 분석법

아르기닌 디이미나아제는 아르기닌을 시트룰린 및 암모니아로 전환시키는 아르기나아제 이화 효소(arginase catabilizing enzyme)이다. 본 연구의 목적은 적혈구로 캡슐화된 후, 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 수득된 아르기닌 디이미나아제의 고갈 활성을 관찰하고 확인하는 것이었다. 이 목적을 위해, 아르기닌 디이미나아제-적재된 적혈구를 아르기닌 함유 완충액과 인큐베이션하였다. 뒤이어, HPLC MS 방법에 의해 시트룰린 및 아르기닌 수준을 평가하였다.

아르기닌 디이미나아제가 적재된 적혈구(RBC)의 제조

재조합 SeMet-함유 L-아르기닌 디이미나아제(ADI)(120 Ul/ml)의 용액은 슈도모나스 에어로기노사로부터 유래되었다.

Charles River laboratories로부터 신선한 헤파린처리(heparinized) OFl 마우스 혈액을 수득하고 혈장 및 백혈구 연층(buffy coat)을 제거하기 위해 원심분리하였다(800 g, 4℃에서 10분). PRBC를 NaCl 0.9%로 3회(1:1 v/v) 세척하였다(800 g, 4℃에서 10분). 최종 세척 후에, 적혈구를 20 Ul/ml 아르기닌 디이미나아제와 함께(CGR-ADI) 또는 아르기닌 디이미나아제 없이(CGR- LR) 혼합하고, RBC 현탁액의 적혈구 용적률을 (ADI 용액 또는 식염수 용액을 이용하여) 70%로 조정하였다.

투석 백(컷오프 10 Kd)으로의 연속적인 유동 투석(flow dialysis) 방법에 의해 적혈구의 용해물(lysis)를 수득하였다. 저장액 단계는 적합한 용량의 40 mOsm/l의 용해 완충액(NaH₂PO₄, 2H₂O 0.73 g/l ; NaHPO₄, 12H₂O 5.035 g/l; 글루코오스 0.36 g/l)에 대해 4℃에서 60분간 수행하였다. 도입된 1 ml의 적혈구에 대해 100 ml의 저장 용액을 첨가하였다. 채취 후에, 용해된 적혈구의 현탁액을 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 그 후, 세포들을 l/l0(v/v)의 재밀봉 용액(아데닌 0.39 g/l; 이노신 15.6 g/l; 소듐 피루베이트 6.4 g/l; NaH₂PO₄, H₂O 4.9 g/1; NaHPO₄, 12H₂O 10.9 g/l, 글루코오스 11.5 g/l; NaCl 50 g/l)에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 재밀봉시키고 어닐링시켰다. 재밀봉 후에, 적혈구를 트리스 310 mOsm/1 pH 7.4, BSA 4 %로 3회 세척하였다(800 g, 4℃에서 10분).

투석 단계의 전 및 후에 Cobas Micros 601 CS 14/12 세포 카운터를 이용하 여, 전혈 및 RBC 현탁액을 대상으로 적혈구 용적률(Ht), 평균 세포 용량(MCV), 평균 세포 헤모글로빈(MCHC) 및 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC)를 모니터링하였다. 투석 후에 CGR-ADI 및 CGR-LR 현탁액은 25 %의 적혈구 용적률이었다.

추후의 ADI 활성 측정을 위해, 투석 단계 전 및 후에 RBC 현탁액(ADI 포함 또는 불포함)의 분획을 채취하였다.

ADI 활성의 분석

투석의 전 및 후에 채취된 RBC 현탁액(CGR-ADI 및 CGR-LR)의 분획에 대해 ADI 활성의 분석을 수행하였다. 투석 전에 CGR-ADI 및 CGR-LR 분획의 적혈구 용적률을 NaCl 0.9%에 의한 적합한 희석으로 70% 로부터 40%까지 조정하였다. 투석 후에 CGR-ADI 및 CGR-LR 분획의 적혈구 용적률은 25%였고, 변하지 않았다. ADI 캡슐화의 속도는 전혈 또는 상층액에서의 ADI 활성의 측정에 의해 결정하였다. 전혈에서 ADI 활성을 결정하기 위해, RBC 현탁액 분획의 1/3을 5분간 액체 질소로 동결시키고 37℃에서 보온하고 동결된 RBC의 50 mM MES에서의 10배 희석액 10 ㎕를 사용하여 효소 활성 분석을 위해 이용하였다. 적혈구 외부의 효소 활성을 결정하기 위해, 나머지 2/3의 RBC 현탁액을 4℃에서 10분간 원심분리하고 상층액의 50 mM MES에서의 2배 희석액 10 ㎕를 효소 분석에 사용하였다. 10분간 형성된 시트룰린의 양을 Prescott and Jones의 비색 분석법에 의해 정량하였다. 표준 분석 혼합물은 900 ㎕ MES 완충액 0.1M pH 6.0, MgCl₂ 20 mM 및 10 ㎕의 상층액 또는 동결된 RBC 시료 를 포함했다. 1 ml의 10 mM L-아르기닌의 첨가에 의해 반응을 개시시키고 37℃에서 5, 10, 15 또는 20분간 반응이 지속되게 하였다. 1 ml의 안티피린-디아세틸모녹심(antipyrine-diacetylmonoxime) 용액의 첨가에 의해 이와 같은 상이한 시점에 중단시켰다. 상기 혼합물을 20분간 가열하고 466 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 시트룰린의 스톡 용액을 적합하게 희석하여 표준 곡선을 작성하였다. 15 내지 20분에서의 ADI 활성을 1분당 효소에 의해 형성된 시트룰린의 마이크로몰로 정의하였다. 모든 측정은 2회 반복하였다.

인 비트로 기능 분석(in vitro functionality assay)

아르기닌을 함유한 완충액에서 아르기닌 디이미나아제-적재된 적혈구(CGR-ADI)를 인큐베이션하고 아르기닌 및 시트룰린 아미노산의 수준을 관찰하는 것에 의해 인 비트로 분석을 완료하였다. 동일한 조건에서 인큐베이션시킨 아르기닌 디이미나아제가 적재되지 않은 적혈구(CGR-LR)로 반응의 대조구를 실현시켰다.

1 ml의 미리 보온된 아르기닌 디이미나아제-적재된 적혈구(CGR-ADI)를 300 μM 아르기닌, Tris pH 7.4에 담긴 2OmM MgCl₂를 포함하는 완충액 1 ml와 혼합하였다. 트리스 완충액을 pH 7.4, 320 mOsm/kg로 제조하였다. 동일한 조건에서 동일 양의 CGR-LR을 아르기닌 함유 완충액과 혼합하는 것에 의해 대조구 분석을 수행하였다. 상하 운동(upside down movement)에 의해 혼합을 수행하였다. 0 시간차(time 0)를 대표하는, 400 ㎕의 시료를 에펜도르프 튜브에 즉시 채취하고 4℃에서 보관하 였다. 나머지 혼합물을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 반응의 완료 시에, 30분차를 대표하는(30분간) 400 ㎕를 에펜도르프 튜브에 채취하고 4℃에서 보관하였다. 모든 시료의 채취된 400 ㎕에 대해, 3/4(300 ㎕)를 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후에, 100 ㎕의 상층액 분획을 채취하고 -20℃에서 동결시켰다. 나머지 1/4을 5분간 액체 질소로 직접 동결시켰다. 37℃에서 보온한 후, 50 ㎕의 시료 분획을 채취하고 -20℃에서 동결시켰다.

그 후, 각 시료에서 아르기닌과 시트룰린 수준을 HPLC/MS/MS 방법에 의해 평가하였다.

결과: 도 3 참조

37℃에서 30분 이내에, ADI를 캡슐화한 RBC는 매질(상층액)에 함유된 아르기닌을 약 135 μmol/L로부터 약 42 μmol/L로 고갈시킬 수 있었다. 동시에, 매질(엑스트라-적혈구)의 시트룰린 농도는 약 17 μmol/L에서 약 110 μmol/L로 형성되었다. 상층액의 ADI 활성은 검출의 한계 미만이었다(< 0.1 UI/ml). RBC 펠렛에서 측정된 ADI 활성은 2.56 Ul/mL였다. 아르기닌 탈이민화(deimination)는 내부 적혈구 ADI에 의해 제공되고, 아르기닌은 소화되기 위해 적혈구로 들어간다는 것을 입증한다. 또한, 이는 적혈구 내로 생성된 시트룰린은 적혈구 막을 통해 외부의 RBC 매질로 들어갈 것이라는 것을 강하게 시사한다.

ADI가 식염수 용액으로 치환되도록 가공된 RBC인 대조구 RBC의 경우, 외부 RBC 매질로부터의 아르기닌은 37℃에서 30분간 약 165 μmol/L에서 약 157 μmol/L까지 감소되고, 시트룰린은 약 1 내지 약 2 μmol/L에 도달했다. 이와 같은 낮은 고갈은 RBC 내로 함유된 아르기나아제의 내인성 활성에 의해 설명될 수 있다. 본 발명자들은 아르기나아제는 아르기닌 소화 동안 ADI에 특이적인, 시트룰린을 생성하지 않는다는 것을 다시 강조한다.

실시예 4: 두 개의 아르기닌 디이미나아제 제제의 주사에 대응한 마우스 혈장의 아르기닌 농도의 동력학 연구

본 연구의 목적은 아르기닌 디이미나아제가 적재된 적혈구의 주사에 대응한 OF1 마우스에서 아르기닌 및 시트룰린의 혈장 약동학을 추적하는 것이었다.

테스트 물질 및 대조구 물질의 제조

재조합 SeMet-함유 L-아르기닌 디이미나아제(ADI)(120 UI/ml)는 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래되었다.

50%의 적혈구 용적률로 PRBC의 10 UI/ml의 최종 농도를 수득하기 위해, 유리 아르기닌 디이미나아제(ADI+RBC)를 세척된 마우스 적혈구(RBC) 및 Sag-만니톨 1/3(v/v)(Haemonetics)으로 희석하였다. Sag-만니톨은 첨가 전에 10 mM MgCl₂로 보강하였다.

테스트 물질(ADILE)은 아르기닌 디이미나아제가 적재된 적혈구(RBC)였다. 아르기닌 디이미나아제가 적재된 적혈구를 제조하는 절차는 ADI의 인 비트로 기능성 테스트에 대해 기술된 바와 같이 결정하였다. 투석 전에, 50 UI/ml의 최종 농도를 갖기 위해, ADI를 세척된 PRBC와 혼합하였다. 투석 후에, 캡슐화된 RBC를 10 mM MgCl₂로 보강된 Sag-만니톨 1/3(v/v)과 혼합하였다. 최종 적혈구 용적률을 50%로 조정하였다. 캡슐화후 수득된 ADI 활성은 50%의 적혈구 용적률에서 캡슐화된 RBC의 8.35 UI/ml였다.

효소를 포함하지 않는 제3 시료(CGR)를 50%의 최종 적혈구 용적률로 Sag 만니톨(10 mM MgCl₂로 보강됨)로 재현탁된 세척된 RBC로 제조하였다. ADI 대신에 식염수 용액을 첨가하였다.

전체 실험 동안, 투석 전 및 후에 전혈, RBC 현탁액을 대상으로 Cobas Micros 601 CS 14/12 세포 카운터를 이용하여 적혈구 용적률(Ht), 평균 세포 용량(MCV), 평균 세포 헤모글로빈(MCHC) 및 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC)를 모니터링하였다. 추후의 ADI 활성 측정을 위해 투석 단계의 전과 후에 RBC 현탁액의 분획을 채취하였다. ADI 활성 측정값은 전술된 바와 같이 결정하였다.

동물

18-22g 중량의 5-6주령인 64마리의 OFl 암컷 마우스를 Charles River Laboratories(L'Arbresle, France)로부터 수득하였다. 처리 전에 특이적-병원체-불포함(SPF) 동물 관리로 동물들을 7일간 관찰하였다. 실험 프로토콜은 프랑스의 농업연구부(the French Ministries of Agriculture and Research)로부터 허가받았다. 64마리의 건강한 OF1 마우스를 4마리의 마우스로 구성된 하나의 그룹 및 각각 20 마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹으로 랜덤화하였다. 처리된 마우스는 250 ㎕의 주사 용량으로 정맥내 경로에 의해 1회 주사를 맞았다.

처리 일정(Treatment schedule)

처리 일정은 하기와 같이 선택하였다: 그룹 1의 마우스는 처리하지 않았다; 그룹 2의 마우스는 50%의 적혈구 용적률(RBC)의 세척된 마우스 적혈구로 처리하였다; 그룹 3의 마우스에는 아르기닌 디이미나아제가 적재된 적혈구(ADILE)의 1회 주사를 적용했다; 그룹 4의 마우스에는 50%의 적혈구 용적률로 세척된 마우스 RBC에 현탁된 유리 아르기닌 디이미나아제(ADI+RBC)의 1회 주사를 적용했다. 상이한 생성물 시료를 이중 맹검(double blind)으로 투여하였다.

처리 후에, 심장 천자(cardiac puncture)에 의해 마우스를 희생시켰다. 희생 전에, 이소플루란 포렌(Centravet, Bondoufle, France)을 이용하여 마우스를 마취시켰다. 마우스의 희생은 하기의 표에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 약 800 ㎕의 전혈을 헤파린-리튬 유리 튜브에 채취하고, 채취 후에 즉시 얼음물 수조에서 유지시켰다. 혈장을 수득하기 위해 +4℃에서 2,500g로 10분간 혈액 시료를 원심분리시켰다. 약 200 ㎕의 혈장을 프로필렌 튜브로 옮기고 즉시 -2O℃에서 동결시켰다. 남은 혈액 세포 펠렛을 프로필렌 튜브로 옮기고 즉시 -2O℃에서 동결시켜 분석시까지 보관하였다. 혈장 및 혈액세포 펠렛의 하나의 바이알에서 아르기닌 및 시트룰린의 수준을 측정하였다.

아미노산 분석

아르기닌 및 시트룰린의 추출 후에, HPLC/MS/MS 방법에 의해 혈장 및 혈액 세포 펠렛의 아르기닌 및 시트룰린 농도를 측정하였다.

결과 : 도 4-5 참조

1) 혈액 세포 펠렛의 아르기닌 투여량을 고려할 때, 유리된 ADI 또는 포접된(entrapped) ADI를 투여받은 마우스에서 농도의 강력하고 신속한 감소를 관찰하였다. 정상적인 RBC를 투여받은 마우스의 경우, 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 유리된 ADI 그룹(ADI+RBC)의 경우, 12시간 내에, 아르기닌의 농도는 정상값으로 회복되었고 포접된 ADI(ADILE)의 경우, 48시간 이상동안 매우 낮게 유지되었다.

2) 아르기닌이 고갈되는 동일한 시간에, 시트룰린이 생성되었다. 그러나, ADILE의 경우, 높은 수준이 48시간 까지 유지되었으나, ADI+RBC 그룹의 경우, 24시간 내에 정상값으로 회복되는 것을 관찰하였다. 정상적인 RBC를 투여받은 마우스에서는 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다.

이는 ADI의 RBC로의 포접이 용해/재밀봉 단계에 의해 가능하고, RBC에 적재된 ADI는 유리 용액 상태의 ADI보다 훨씬 긴 시간 동안 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.

Claims

아르기닌 디이미나아제를 함유한 적혈구.
제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 액체에 현탁된 것인 적혈구.
삭제
제1항 또는 제2항에 따른 적혈구 또는 적혈구의 현탁액을 포함하는, 아르기닌-의존성 종양의 치료를 위한 의약 제품.
제4항에 있어서, 상기 아르기닌-의존성 종양은 악성 흑색종, 간암(hepatocarcinoma), 유방암, 신경모세포종 및 T-세포 림프모세포성 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 의약 제품.
제1항 또는 제2항에 따른 적혈구 또는 적혈구의 현탁액을 포함하는, 혈관신생의 억제, 또는 혈관신생과 관련된 질환의 치료를 위한 의약 제품으로서, 상기 혈관신생과 관련된 질환은 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 신생혈관 녹내장, 각막질환, 갱년기 황반변성 및 기타 황반변성, 익상편(pterygium), 망막변성, 수정체 후부 섬유증식증, 건선, 모세관확장증, 화농성 육아종, 지루 피부염, 여드름, 암 및 암 전이로부터 선택되는 것인 의약 제품.
제1항 또는 제2항에 따른 적혈구 또는 적혈구의 현탁액을 포함하는, 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 의약 제품.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제