JPH115752A

JPH115752A - 赤血球内に生物学的活性薬剤をカプセル内封入する方法およびそのための装置

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Publication number: JPH115752A
Application number: JP10123228A
Authority: JP
Inventors: Mauro Magnani; マウロ・マグナーニ; Ivo Panzani; イーヴォ・パンツァーニ; Leonardo Bigi; レオナルド・ビギ; Andrea Zanella; アンドレア・ツァネラ
Original assignee: Dideco SpA
Current assignee: Dideco SpA
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 1999-01-12
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: EP0882448B1; US6139836A; DE69732225D1; DE69732225T2; JP4620192B2; EP0882448A1

Abstract

(57)【要約】【課題】赤血球（ＲＢＣｓ）内に生物学的に活性な薬
剤をカプセル内封入するための方法および装置であっ
て、得られたキャリヤーＲＢＣｓは、生理条件下で、長
期間安定であり、さらに、患者に治療上有効な量の一つ
またはそれより多くの生物活性薬剤を組織的に配達する
あるいは標的に配達するために用いることができる、上
記の方法および装置を開発する。【解決手段】個々の患者より赤血球を収集し、その赤
血球を部分的に溶解し、部分溶解された赤血球を濃縮
し、濃縮された部分溶解赤血球を一つまたはそれより多
くの生物学的に活性な薬剤と接触させ、そして、部分的
に溶解された赤血球を封入することによって、赤血球内
に少なくとも一つの生物活性薬剤をカプセル内封入す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、赤血球内に生物学
的に活性な薬剤を取り込ませるための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、患者の特定部位を標的として医薬
品の配達方法の開発に、多くの努力が払われている。適
当な標的部位に能率的に到達した場合に薬剤効力を増加
させうること、および、全薬剤投与量を最少にした場合
に薬剤毒性を減少させうることが、知られている。薬剤
配達システムの興味は、その多くが比較的単純な有機分
子である慣用的薬剤、ならびにオリゴペプチド、タンパ
ク質および核酸等のより複雑な薬剤の両方に向けられて
いる。最近興味を持たれている一つの領域は、患者の標
的部位へ治療投与量の薬剤を配達するための赤血球［以
後、赤血球およびＲＢＣｓ］の使用に関連する。赤血球
は、赤血球の細胞膜を溶解し、そして一つまたはそれよ
り多くの薬剤を赤血球に加え、その後細胞膜を再密封す
る(reseal)方法によって、生物学的に活性な薬剤を「負
荷」("loaded")することができる。そのような「負荷」
または「キャリヤー」赤血球は、それらが生分解可能で
あるために、薬剤配達および標的化システムを、長期
間、循環システム内に維持することができ、さらに、例
えばマクロファージのような細胞を選択するように標的
化することができるので、数多くの利益を提供する。し
かしながら、薬剤配達システムとしての赤血球の使用
は、多くの研究者によって研究されているが、その方法
は、臨床的設置(clinical setting)に日常的に適用でき
る点までには、未だ開発されてはいない。

【０００３】生理溶液内に負荷細胞の懸濁液を調製する
方法は、ドイツ特許第２３２６２４４号およびドイツ特
許出願Ｎｏｓ．（ＯＳ）２３２６１６１および２４９５
１９９に開示されており、それらの特許中で、赤血球細
胞膜は、それぞれ、浸透圧あるいは電場によって溶解さ
れる。

【０００４】米国特許第４，２２４，３１３号（Ｚｉｍ
ｍｅｒｍａｎｎら）は、浸透圧または電気場、またはそ
の両方を外部から導入することを通して、細胞膜の透過
率を増加させることによって、溶液内に懸濁された負荷
細胞集団を調製する方法について、開示している。負荷
される物質には、細胞内に取り込まれた場合に、細胞膜
を成熟前に破壊する能力を持つ医薬品、および、細胞膜
と医薬品の反応を阻害する能力を持つ安定化剤が含まれ
る。

【０００５】米国特許第４，２６９，８２６号（Ｚｉｍ
ｍｅｒｍａｎｎら）は、負荷細胞内に磁気物質を取り込
み、この負荷細胞を外部磁場の適用によって生体の特定
の部分に配置することができる、方法について開示して
いる。

【０００６】米国特許第４，２８９，７５６号（Ｚｉｍ
ｍｅｒｍａｎｎら）は、生体の脾臓および肝臓内に負荷
細胞を優先的に蓄積する方法を、開示している。

【０００７】米国特許第４，４７８，８２４号（Ｆｒａ
ｎｃｏら）は、細胞膜を通過することができ、拡散によ
って細胞に入ることのできるＤＭＳＯおよびグリセロー
ルのような化学薬品の作用によってＲＢＣｓの内部浸透
圧を変化させることによって、赤血球内に物質を取り込
む方法を開示している。

【０００８】米国特許第４，６５２，４４９号（Ｒｏｐ
ａｒｓら）は、浸透圧を用いて赤血球内に物質を取り込
む方法および装置を開示している。方法および装置は、
大容量の血液でのみ用いられ試験され、このことは、多
くの適用を、相同な血液、即ち、多くの個体起源からプ
ールした血液、の使用に限定する。米国特許第４，９３
１，２７６号（Ｆｒａｎｃｏら）は、赤血球内に非イオ
ン性薬剤をカプセル内封入する方法を開示している。こ
の方法は、取り込まれるに望ましい薬剤が、アニオンで
ないか、またはアニオンあるいはポリアニオンであるが
細胞を破壊することなく細胞透過率の必要な増加を引き
起こす原因となる充分な濃度の等張に近い水性媒質内に
は存在しないという有効性に限りのある方法である。

【０００９】Ｈｅｕｂｓｃｈら、Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙ
ｓｉｏｌ．，１２２：２６６−２７２（１９８５）は、
細胞骨格の解離が浸透圧で膨張した細胞内で起こるこ
と、および大きさの極端な変化に伴い、二重層膜が正常
条件下で存在する変形抑圧(deformational constraint)
から解放されることを、証明している。

【００１０】細胞内に物質を取り込む方法の概説は、Ｆ
ｒａｎｃｏら、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，３２：２７
６３−２７６８（１９８３）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．，１７：３９３−４００（１９８４）およびＪ．Ｃ
ｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，１２９：２２１−２２９
（１９８６）に示されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の分野の仕事が
広範囲にわたって行われているにもかかわらず、赤血球
の内因性内容物を希釈または損失することなく、受け入
れ可能な生理濃度で、ＲＢＣｓ内への一つまたはそれよ
り多くの生物活性薬剤の導入を提供する方法は、従来技
術では未だ知られていない。本発明の主要な目的は、こ
の必要性を満たす方法を提供することにある。即ち、本
発明の方法は、キャリヤーＲＢＣｓの完全性、生活能力
および寿命を不本意にも減少させる、細胞内容物の本質
部分の希釈または損失を伴わずに、望ましい生理濃度
で、赤血球内への一つまたはそれより多くの生物学的に
活性な薬剤［即ち、薬剤(drugs)］の導入を提供する。

【００１２】より特別には、本発明の目的は、小容量の
血液を用い、そうすることによって自己由来のキャリヤ
ーＲＢＣｓを個々の患者で調製でき、かつ方法のいかな
る段階でも血液を冷却する必要がない、そのような方法
を提供することにある。

【００１３】本発明のさらなる目的は、前述されたキャ
リヤーＲＢＣｓより長い期間、哺乳動物の生理的条件下
で、生物学的に活性な薬剤を保持する、および遊離す
る、能力を持つ、キャリヤー［即ち薬剤負荷(durg-load
ed)］赤血球を提供することにある。本発明に記載の方
法に従って作成されたキャリヤーＲＢＣｓは、ＲＢＣｓ
から外への拡散によって、または赤血球細胞膜を越えて
の能動輸送によって、カプセル内封入された生物活性薬
剤を放出する。

【００１４】本発明のさらなる目的は、本発明の方法を
有効に且つ再現できるように実行することのできる装置
を提供することにある。より特別には、本発明の目的
は、自己由来のキャリヤーＲＢＣｓを、個々の患者から
の小容量の血液から時間内に調製することのできる装置
を提供することにある。

【００１５】このように、本発明は、内因性赤血球内容
物および／または赤血球内に取り込まれる薬剤の許容し
えない希釈なしには、以前には成し遂げることのできな
かった、哺乳動物赤血球内への治療上有効な生物活性薬
剤の広範囲な取り込みに関する。より特別には、本発明
の方法は、ポリペプチド含む様々な薬剤の、赤血球内へ
の導入または取り込みを可能にする。これらおよびその
他の生物活性薬剤は、単独またはその他のそのような薬
剤との組み合わせのいずれかで、赤血球内にカプセル内
封入することができ、そうすることによって赤血球は薬
剤のキャリヤー赤血球となる。キャリヤー赤血球を用い
ると、キャリヤー赤血球を後に哺乳動物に導入する場
合、カプセル内封入された生物活性薬剤を所望のように
ゆっくりと継続的に分配することができる。さらに、本
発明は、比較的少量の血液サンプルからのそのようなキ
ャリヤー赤血球の迅速な調製を提供し、それによって、
個々の患者からの自己由来のキャリヤー赤血球の調製が
可能になる。本発明の方法は、本明細書中に記載された
ような装置と共に用いた場合に、特に有用である。

【００１６】上記の目的は、本発明に従って、哺乳動物
の赤血球（ＲＢＣｓ）内に少なくとも一つの望ましい薬
剤を導入する方法であって、この方法は、カプセル内封
入される一つまたはそれより多くの生物活性薬剤を加え
る前に、溶解したまたは部分溶解した赤血球材料を濃縮
することを含み、またカプセル内封入効率を有意に改善
する、前記の方法で達成される。溶解されたまたは部分
溶解された赤血球材料の濃縮は、限外ろ過効率の高い中
空糸透析器のような高流量の血液透析器を用いる、血液
ろ過を含む様々な手段で行うことができる。好ましい実
施態様では、血液ろ過のディスポーザブルカートリッジ
を、本発明の方法の濃縮手段として用いる。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明の方法は、哺乳動
物の赤血球内への少なくとも一つの所望の薬剤の導入を
提供する。方法は、カプセル内封入される一つまたはそ
れより多くの生物活性薬剤を加える前に溶解したまたは
部分溶解した赤血球材料を濃縮することを含み、カプセ
ル内封入収率の有意の改善が認められた。本明細書中に
用いられる、「カプセル内封入収率」とは、キャリヤー
ＲＢＣｓ内にカプセル内封入される生物活性薬剤のフラ
クションをさし、通常、カプセル内封入過程の間に加え
られた薬剤の全体量に対するカプセル内封入された薬剤
の百分率（％）として表される。赤血球材料は、高速限
外ろ過の中空糸透析器のような高流量の血液透析器を用
いる、血液ろ過を含む様々な手段によって濃縮すること
ができる。望ましい実施態様では、ディスポーザブルの
血液フィルターカートリッジが、本発明の方法の濃縮手
段として用いられる。

【００１８】本明細書中に用いられる用語「キャリヤー
ＲＢＣｓ」は、一つまたはそれより多くの生物学的に活
性な薬剤をカプセル内封入する赤血球をさす。いくつか
の場合、加えられた生物活性薬剤を含むキャリヤーＲＢ
Ｃｓは、具体的な薬剤に関して、本明細書中に記載され
ている。例えば、”ｄ−２１ＰキャリヤーＲＢＣｓ”
は、溶解され、薬剤デキサメタゾン−２１−リン酸（ｄ
ｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−２１−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ）（ｄ−２１Ｐ）を負荷され、デキサメタゾンを放出
する、赤血球をさす。単独または組み合わせのいずれか
で、様々なそのような薬剤を含むキャリヤー赤血球は、
本発明の方法によって調整することができる。

【００１９】本明細書中に用いられる用語「生物学的に
活性な薬剤」とは、本発明の方法を用いてカプセル内封
入することのできる材料をさす。これらには、限定する
わけではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプ
チド、タンパク質、ホルモン、コルチコステロイド、グ
ルココルチコイド、非ステロイド抗炎症剤、グルタチオ
ン、サイトカイン、トキシン、オリゴヌクレオチドおよ
びその他の核酸、ならびに有効な治療薬として周知のヌ
クレオシド類似体が含まれる。これらには、免疫抑制剤
および悪性の細胞増殖の阻害剤として一般に用いられて
いる６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）またはアザチオ
プリンおよびリン酸フルダラビン、ならびに、抗ウイル
ス剤として、特にＡＩＤＳの治療に有用な、リン酸化さ
れたアジドチミジン（ＡＺＴ）、ジデオキシシトシン
（ｄｄＣ）およびジデオキシイノシン（ｄｄＩ）が含ま
れる。本発明の方法に従って作成されたキャリヤーＲＢ
Ｃｓは、生理条件下で、完全性、生活能力および寿命を
強化する望ましい特性を持つ。

【００２０】本明細書中に用いられる略語を以下に示
す：ＢＳ３ビススルホスクシンイミジルスベレート(b
issulfosuccinimidilsuberate）ｄ−２１Ｐデキサメタゾン−２１−ホスフェート(dex
amethasone-21-phosphate) ＰＩＧＰＡホスフェート−イノシン−グルコース−ピ
ルベート−アデニン(Phosphate-Inosine-Glucose-Pyruv
ate-Adenine) ＲＢＣｓ赤血球[red blood cell(s)、erhtyrocyte
s] ＣＰＤクエン酸ナトリウム二水和物−クエン酸一
水和物−リン酸二水素ナトリウム二水和物−グルコース
(Sodium citrate dihydrate-Citric acid monohydrate-
Sodium phosphate monobasic bihydrate-Glucose) ＰＢＳ（１）リン酸塩緩衝液添加塩類溶液(phosphate b
uffered saline) （１）生理食塩水（ＮａＣｌ０．９％ｗ／ｖ）を、Ｐ
ＢＳの代わりとすることができる。

【００２１】一つの実施態様では、本発明の方法は、個
々の患者から赤血球を集め、赤血球を濃縮し、生理食塩
水の第一溶液で赤血球を洗浄し、６容量の生理食塩水溶
液および４容量の蒸留された無菌Ｈ₂Ｏからなる第二の
低張液で赤血球を洗浄し、６容量のリン酸緩衝化塩類溶
液（ＰＢＳ）および８容量の蒸留された無菌Ｈ₂Ｏから
なる溶液で赤血球を希釈し、血液フィルターカートリッ
ジで赤血球を濃縮し、カプセル内封入される生物活性薬
剤または薬剤類を加え、密封溶液(sealing solution)を
加えることによって赤血球を密封(seal)し、得られた赤
血球を３７゜Ｃで約３０分間インキュベートし、そし
て、生理食塩水溶液で赤血球を洗浄することを含む。密
封溶液は、好ましくは、約３３ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄；約
１．６０６ＭのＫＣｌ；約０．１９４ＭのＮａＣｌ；約
０．１Ｍのイノシン；約５ｍＭのアデニン；約２０ｍＭ
のＡＴＰ；約０．１Ｍのグルコース；約０．１Ｍのピル
ベート；および約４ｍＭのＭｇＣｌ₂：を含む、ホスフ
ェート−イノシン−グルコース−ピルベート−アデニン
（ＰＩＧＰＡ）である。好ましい実施態様では、約５ｍ
ｌのＰＩＧＰＡ溶液が、約７０−９０ｍｌの容量の溶解
赤血球を密封するために用いられる。

【００２２】過程の間の凝集から赤血球を保護するため
に、赤血球は、所望であれば、収集段階の間またはその
後に抗凝集剤と接触させることができる。一つの好まし
い抗凝集剤溶液は、本明細書中ではＣＰＤ溶液と呼ば
れ、２６．３ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、３．３
ｇのクエン酸一水和物、２．５ｇのリン酸二水素ナトリ
ウム二水和物、および２３．２ｇのグルコース／１リッ
トルの無菌水を含む。

【００２３】より特別には、本発明の方法は、他の血液
細胞および成分から赤血球を分離し、第一低張溶液１ｍ
ｌ当たり約０．０４から約０．０５ｍｌの赤血球濃度
（第一溶液の容量および容量オスモル濃度は既知である
か、または定量される）で第一低張液に赤血球を懸濁
し、それらを第二の低張液（第一溶液のそれより低い約
３０から約６０ｍＯｓｍの容量オスモル濃度を持つ）に
懸濁することによって赤血球を溶解して溶解液を得、溶
解液の濃度を調製してその結果その容量が第一溶液の容
量の約０．１から約０．０６７になり、溶解液にカプセ
ル内封入される生理活性薬剤を加え、そして、第一溶液
の約１．９倍から約２．１倍の範囲に溶解液の容量オス
モル濃度を調製するために、濃縮した食塩溶液を溶解液
に加えることによって溶解したＲＢＣｓを密封すること
を含む。

【００２４】本発明の方法の好ましい実施態様を、図１
に略図で示す。図１では、赤血球１０は、多数の小さな
黒丸を含む膜１２として表される。小さな黒丸は、溶解
されていないＲＢＣｓに固有な生物分子１４を示すつも
りである。最初の低浸透圧希釈後、赤血球１０は膨張す
る（略図で２０と示す）ように見える。膨張した赤血球
２０は、それらを全体的にまたは部分的に溶解する原因
となる、第二の低浸透圧希釈に晒される。溶解されたま
たは部分溶解された赤血球３０は両方共、溶解されてい
ないＲＢＣｓに固有な生物分子１４を包囲し、そしてそ
れによって包囲されている。次の段階では、溶解された
または部分溶解された赤血球３０を、その後、血液フィ
ルター４０で濃縮する。得られた溶解または部分溶解赤
血球３０を、大きな黒丸で示された生物活性薬剤５０と
接触させる。そうすることで、生物活性薬剤のあるもの
は、赤血球内にカプセル内封入される。カプセル内封入
された生物活性薬剤を略図に５０と示す。赤血球は、こ
の段階で生物活性薬剤を含み、次いで、濃縮された塩類
溶液に晒される。晒すことは、細胞膜１２を密封する原
因となり、そうすることによって細胞内に生物活性薬剤
５０を捕獲しそしてカプセル内封入する。次いで、そう
して得られた、いわゆるキャリヤーＲＢＣまたはキャリ
ヤー赤血球６０を、洗浄する。

【００２５】上記の方法を遂行するための装置の一つの
実施態様を、図２に略図で示す。図２では、好ましくは
（患者から集められた）少なくとも５０ｍｌの血液を含
むバッグ１００を血液供給ライン１０２に接続する。血
液を、ポンプ１０４によって分離ボール１０６に移し、
好ましくは約５６００ｒｐｍで回転させる。生理食塩水
供給ライン１０８によって提供される生理食塩水溶液
（ＮａＣｌ０．６％）で、ボール１０６に含まれる赤
血球を洗浄する。好ましくは、生理食塩水は、約１５０
ｍｌ／分の速度で供給される。洗浄処置は、血漿とその
他の血液細胞を分離し、後者は廃棄物収集バック１１０
に移される。洗浄後、赤血球を、分離ボール１０６から
運搬バック(transfer bag)１１２にポンプで移す。約４
００ｍｌの第一低張液（６容量の生理食塩水および４．
５容量の蒸留水）を第一低張液供給ライン１１４を通し
て運搬バック１１２に加え、そして赤血球と混合する。
次いで、得られた懸濁液を穏和に攪拌しながら室温に約
５−１０分間保つ。この時点で、赤血球は膨張する（参
照数字、図１の２０）が、それらはまだ溶解していな
い。次いで、第二低張液供給ライン１１６を通して、第
二の低張液を運搬バック１１２内に導入する。好ましく
は、第二の低張液は、６容量の生理食塩水および８容量
の蒸留水を持つ約２００ｍｌの溶液である。赤血球の血
液溶解が起こるのは、この段階である。室温で約１５分
後、得られた溶解液はポンプで血液フィルター１１８を
通す。ろ過過程の間、クランプ１２０、１２２、１２４
および１２６を開け、そしてクランプ１２８、１３０、
１３２、１３４、１３６、１３８および１４０を閉じ
る。ろ過過程を強化するために、所望により、約１００
から約１５０ｍｍＨｇの真空度になる真空ポンプ１４２
を用いることができる。血液溶解液は、ろ過容量が約１
７０から１９０ｍｌの範囲になるまで、限外ろ過リザー
バー１４４内に集められる。ひとたび、所望の容量に到
達したならば、濃縮された赤血球は運搬バック１１２に
集められる。これは、クランプ１２４を閉じ、クランプ
１２８を開けることによって、成し遂げられる。次い
で、生物活性物質を、運搬バック１１２内に導入し、そ
の時点で、生理活性物質は、濃縮され溶解された赤血球
と接触し、それによってカプセル内封入される。約１０
から１５分間の穏和な攪拌の後、５ｍｌのＰＩＧＰＡ密
封溶液を運搬バック１１２に加え、バックを約３０分
間、約３７゜Ｃのヒーター１４６内に置き、赤血球をイ
ンキュベートする。所望の加熱時間の完了時点で、再密
封された赤血球を含む運搬バック１１２を再接続し、そ
して赤血球を分離ボール１０６内にポンプで戻す。いっ
たんボール内に入ったならば、ボールを約５６００ｒｐ
ｍで回転しながら、赤血球を約２リットルの生理食塩水
（約１５０から２００ｍｌ／分で供給する）で洗浄す
る。最後に、洗浄された負荷赤血球を、負荷赤血球バッ
ク１４８内に移す。このことは、ボールから赤血球を約
１５０ｍｌ／分の速度でポンプで移す間、クランプ１２
２を閉じ、クランプ１３４を開けることによって、成し
遂げられる。赤血球懸濁液は、この時点で患者に重力点
滴される準備が整う。上記のように、患者は、処理され
た血液を供給した患者か、または別の患者かのいずれで
あっても良い。

【００２６】また、少なくとも一つの生物活性薬剤をカ
プセル内封入した赤血球を、標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎ
ｇ）薬剤で処理し、そうすることによって、処理された
赤血球は、選択的に特定の組織または細胞型に向けられ
る。例えば、マクロファージによるそれらの迅速な認識
を導入するために薬剤負荷赤血球を処理すべき場合、バ
ッグ１４８内に負荷赤血球をポンプで移す前に、それら
は、１ｍＭＺｎＣｌ₂を含む生理食塩水溶液でのさら
なる洗浄段階に委ねられる。いったんＺｎＣｌ₂と接触
させたならば、赤血球を運搬バック１１２に移し、そこ
でＢＳ³（最終濃度１−１．５ｍＭ）と接触させる。約
１５分後、再度、分離エレメント１０６を回転させなが
ら、おおよそ１リットルの生理食塩水を用いて、赤血球
を洗浄する。次いで、それらを負荷赤血球バック１４９
に移し、そこから、負荷赤血球を患者に注入することも
できる。

【００２７】負荷赤血球を、注入前、１２から２４時間
より長く保存するつもりであるならば、最終の収集バッ
クは、防腐剤を含むべきである。一つの好ましい防腐剤
は、上記のＣＰＤ溶液である。このように、おおよそ１
０ｍｌのＣＰＤ溶液を、最終の収集バック内に提供する
ことができる。

【００２８】図１および２の実施態様は、特に、室温
で、即ち、全血液または任意の血液の細胞成分あるいは
分子成分のいかなる加熱も冷却も必要とせずに、個々の
患者の小容量（１００ｍｌより少ない）の血液から、自
己由来のキャリヤーＲＢＣｓを調製するために、適して
いる。本明細書に用いられる「個々の患者」とは、ヒト
に限定されるわけではなく、キャリヤーＲＢＣｓを投与
したい任意の哺乳動物をさす。さらに、本明細書に用い
られる「自己由来キャリヤーＲＢＣｓ」とは、インビト
ロで修飾されて一つまたはそれより多くの生物活性薬剤
（類）をカプセル内封入された、赤血球が単離された本
来の個々の患者内に再導入するつもりの、個々の患者か
ら単離された赤血球をさす。個々の患者を治療するため
の自己由来キャリヤーＲＢＣｓの使用には多くの利点が
あり、特に、例えば、インビボでキャリヤーＲＢＣｓの
生存時間を短くするであろう望ましくない免疫応答は、
個々の患者から誘導された赤血球を用いることによって
避けられる。

【００２９】本発明の方法によって作成されたキャリヤ
ー赤血球内に加えられた活性薬剤がより高濃度であるた
め、キャリヤーＲＢＣｓは、以前から知られている方法
によって作成されたそれらほど、そのような薬剤が急速
に涸渇することはない。さらに、溶解したＲＢＣｓから
放出されるが、それにもかかわらず、本発明の方法によ
って、キャリヤーＲＢＣｓ内に高濃度で再導入される、
内在性生物分子の割合がより高いため、本発明の方法に
従って作成されたキャリヤー赤血球は、以前から知られ
ている方法によって作成されたキャリヤーＲＢＣｓほ
ど、長期間の維持に必要とされる内在性分子を放出しな
い。結果として、本発明のキャリヤーＲＢＣｓは、以前
に記載されていたキャリヤーＲＢＣｓより長期間、生理
条件下で、活性薬剤を持続して放出する能力を持つ。

【００３０】本発明のキャリヤーＲＢＣｓは、さらに巧
妙に取り扱う必要なく、より長期間、哺乳動物にそのカ
プセル内封入された生物活性薬剤を提供するために、哺
乳動物へ注射を通して投与される。系統的配達が必要と
されるならば、次いで、キャリヤーＲＢＣｓを哺乳動物
の循環系内に注射する。キャリヤーＲＢＣｓの標的配達
は、標的の近辺に、筋肉内注射することによって達成さ
れる。

【００３１】本発明のその他の実施態様では、「薬剤前
駆体」("predrug")（即ち、生物活性薬剤に対する前駆
体）をキャリヤーＲＢＣｓ内に取り込み、次いで哺乳動
物内に注射する。いくつかの薬剤前駆体では、哺乳動物
の血液内に存在する内因性活性化作因が、薬剤前駆体を
ゆっくりとではあるが安定した速度で生物活性薬剤に変
えるであろう。例として、デキサメタゾン−２１−ホス
フェート（ｄ−２１Ｐ）をキャリヤーＲＢＣｓ内にカプ
セル内封入し、負荷ＲＢＣｓを哺乳動物の循環系内に導
入した場合、ｄ−２１Ｐは、ゆっくりと化学療法薬であ
るデキサメタゾンに変わる。デキサメタゾンは、キャリ
ヤー赤血球の細胞膜を通過できるため（これに対してｄ
−２１Ｐは通過できない）、この方法は哺乳動物に、
（デキサメタゾンの場合には）ある期間以上、一定レベ
ルの生物活性薬剤を提供することが、確実である。変わ
りに、内在性活性化作因が存在しない薬剤前駆体では、
活性化作因を、所望の時点で、哺乳動物の血液に加える
ことができる。活性化作因は負荷赤血球に入り、例え
ば、薬剤前駆体と反応させて生物活性薬剤を形成させる
ことによって、または薬剤前駆体を転化する化学反応を
触媒することによって、薬剤前駆体を活性化する。関係
する実施態様では、活性化作因を、患者に導入される赤
血球内にカプセル内封入し、次いで、患者に薬剤前駆体
を導入することもできる。

【００３２】本発明の方法に従って作成されたキャリヤ
ーＲＢＣｓを用いると、その中にカプセル内封入された
治療上有効な量の生物活性薬剤が、個々の患者に配達さ
れる。用語「治療上有効な量」は、本発明の目的では、
計画された目的に到達するに有効な生理活性薬剤の量を
指す。個々の必要性は異なるが、そのような薬剤の治療
上有効な量の最適範囲の決定は、当業者の内にある。一
般的には、治療上有効な量の組成物を提供するために必
要とされる投薬量は、当業者が決定することができ、年
齢、健康状態、身体条件、体重、個人の病気の範囲、治
療の頻度および所望する効果の形態および範囲に依存し
て、異なるであろう。適当な場所に、治療上有効な量
を、キャリヤーＲＢＣｓの多様な投与を通して、適当な
期間以上、配達することができる。

【００３３】本発明のキャリヤーＲＢＣｓは、慣用の補
助剤、即ち、活性化合物と有害な反応を起こさない注射
を通しての哺乳動物への投与に適した薬学上受容しうる
有機または無機のキャリヤー物質のような、さらなる物
質をも含む医薬組成物内に含ませることができる。薬学
上許容しうる適当なキャリヤーには、これらに限定され
るわけではないが、水、塩溶液、ポリエチレングリコー
ル、ゼラチン等が含まれる。さらに、または代わりに、
本発明のキャリヤーＲＢＣｓを含む医薬調製物は、活性
化合物と有害な反応を起こさない、補助剤、例えば、潤
滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響
する塩、バッファー、およびその類似物等、をされに含
むことができる。また、本発明のキャリヤーＲＢＣｓを
含む医薬組成物は、所望により、安定化剤を含むことも
できる。

【００３４】本発明での使用に適したポリペプチドの一
例として、８，６００ダルトンの分子量を持つポリペプ
チドであるユビキチンが挙げられる。ユビキチンは、続
いて起こるタンパク質分解への影響タンパク質（ｍａｒ
ｋｐｒｏｔｅｉｎｓ）として知られている。典型的に
は、キャリヤー赤血球内にカプセル内封入することので
きるポリペプチドの％（カプセル内封入収率）は、約３
０％である。そのような場合、初発赤血球の約４０％か
ら約６０％が回収された。

【００３５】本発明での使用に適した薬剤前駆体の一つ
の例は、ｄ−２１Ｐである。ポリペプチドと同様に、キ
ャリヤー赤血球内にカプセル内封入されうるｄ−２１Ｐ
の％（カプセル内封入収率）は、約３０％である。この
場合も、初発赤血球の約４０％から約６０％が回収され
た。

【００３６】マクロファージ−標的化キャリヤーＲＢＣ
ｓを得ることを所望する場合には、次のような段階を用
いることができる。第一に、再構築（即ち負荷）された
ＲＢＣｓを、１ｍＭＺｎＣｌ₂を含む塩類溶液で洗浄
する。ＺｎＣｌ₂は、ＲＢＣｓのトランスメンブランタ
ンパク質のクラスター化（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を誘
導することによって、クラスター化薬剤として作用す
る。次に、１ｍＭのビスルホスクシンイミジルスベレー
ト（ＢＳ³）を含む溶液を加える。ＢＳ³は、ＺｎＣｌ₂
によって誘導されたタンパク質クラスターが、ＺｎＣｌ
₂除去時でさえ不可逆になるための架橋剤として作用す
る。ＢＳ³と共に、インキュベーションを約１５分間続
ける。その結果得られた架橋された赤血球を、次に、塩
類溶液で洗浄し、慣用の方法によって濃縮する。

【００３７】本発明の様々な修正および変更は、本発明
の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明ら
かになるであろう。本発明が、本明細書中に示した例示
的実施態様および実施例によって不当に制限されること
を意図するものではないこと、ならびに、そのような実
施例および実施態様は、本明細書中、以下に示したクレ
イムによってのみ制限されることを意図する本発明の範
囲でのみ、実施例として示されること、を理解すべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法の好ましい実施態様の一つを、
示す略図である。

【図２】本発明の方法を遂行するに有効な装置の実施
態様の一つを示す略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レオナルド・ビギイタリア国41037 ミランドラ，ヴィア・アー・サフィ 15 (72)発明者アンドレア・ツァネライタリア国41037 ミランドラ，ヴィア・デイ・ミレ 30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも一つの生物学的に活性な薬剤
を赤血球サンプル内にカプセル内封入する方法であっ
て、ａ）一容量の赤血球を提供すること；ｂ）赤血球を少なくとも部分的に溶解すること；ｃ）少なくとも部分溶解された赤血球を濃縮するこ
と；ｄ）濃縮された、少なくとも部分溶解された赤血球
を、一つまたはそれより多くの生物学的に活性な薬剤と
接触させること；およびｅ）少なくとも部分的に溶解された赤血球を密封し、
それによって少なくとも赤血球の一部分内に生物学的に
活性な薬剤をカプセル内封入すること：を含む、上記の
カプセル内封入方法。
【請求項２】赤血球を溶解段階の前に膨潤させる、請
求項１記載の方法。
【請求項３】少なくともある程度の赤血球を完全に溶
解する、請求項１記載の方法。
【請求項４】少なくとも一つの生物学的に活性な薬剤
を赤血球サンプル内にカプセル内封入する方法であっ
て、ａ）第一の低張溶液に赤血球を晒して、赤血球を膨潤
させること；ｂ）第二の低張溶液に赤血球を晒して、赤血球を少な
くとも部分的に溶解させること；ｃ）赤血球を濃縮すること；ｄ）濃縮された、少なくとも部分的に溶解された赤血
球を、一つまたはそれより多くの生物学的に活性な薬剤
と接触させること；および、ｅ）少なくとも部分的に溶解された赤血球を密封溶液
に晒し、それによって少なくともある程度の生物活性薬
剤を少なくとも赤血球の一部分内にカプセル内封入する
こと：を含む、上記のカプセル内封入方法。
【請求項５】第一の低張溶液が約６容量の生理食塩水
および約４．５容量の蒸留した無菌Ｈ₂Ｏを含む、請求
項４記載の方法。
【請求項６】第二の低張溶液が約６容量の生理食塩水
および約８容量の蒸留した無菌Ｈ₂Ｏを含む、請求項４
記載の方法。
【請求項７】赤血球を血液フィルターを用いて濃縮す
る、請求項４記載の方法。
【請求項８】一つまたはそれより多くの生物学的に活
性な薬剤が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチ
ド、タンパク質、ホルモン、コルチコステロイド、グル
ココルチコイド、非ステロイド系抗炎症剤、グルタチオ
ン、サイトカイン、トキシン、オリゴヌクレオチドおよ
びその他の核酸、ならびにヌクレオシド類似体からなる
群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項９】一つまたはそれより多くの生物学的に活
性な薬剤が、デキサメタゾン−２１−ホスフェート、プ
レドニゾロン−２１−ホスフェート、６−メルカプトプ
リン、アジドチミジン、ジデオキシシトシンおよびジデ
オキシイノシンからなる群より選択される、請求項４記
載の方法。
【請求項１０】密封溶液がホスフェート−イノシン−
グルコース−ピルベート−アデニン溶液を含む、請求項
４記載の方法。
【請求項１１】約７０−８０ｍｌの少なくとも部分的
に溶解された赤血球のそれぞれのアリコートに、約５ｍ
ｌの密封溶液を用いる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】密封溶液と接触させる間、少なくとも
部分的に溶解された赤血球を約３７゜Ｃに約３０分間イ
ンキュベートする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】第二の低張溶液と接触させる時点で
は、少なくともある程度の赤血球は、完全に溶解されて
いる、請求項４記載の方法。
【請求項１４】赤血球サンプル内に少なくとも一つの
生物活性薬剤をカプセル内封入する方法であって：ａ）提供者からの赤血球のサンプルを提供すること；ｂ）赤血球が第一低張溶液内に約０．０４から約０．
０５ｍｌの赤血球／ｍｌ溶液の濃度で存在し、赤血球を
膨潤させるように、赤血球を第一の低張溶液内に懸濁す
ること；ｃ）赤血球を少なくとも部分的に溶解させるために、
第一の溶液のオスモル濃度より低い約３０から約６０ｍ
Ｏｓｍのオスモル濃度を持つ第二の低張溶液に、赤血球
を懸濁すること；ｄ）得られた懸濁液を濃縮し、その結果得られた赤血
球の容量が、第一の低張溶液の容量のそれの約０．０１
から約０．０６７倍であるようにすること；ｅ）濃縮され、少なくとも部分的に溶解された赤血球
を一つまたはそれより多くの生物活性薬剤と接触させる
こと；および、ｆ）少なくとも部分的に溶解された赤血球を密封溶液
に晒し、それによって少なくともある程度の生物活性薬
剤を、赤血球の少なくとも一部分にカプセル内封入する
ことであって、前記密封溶液は、得られた溶液のオスモ
ル濃度が第一低張溶液の約１．９から約２．１倍になる
ような濃度の濃縮された塩類溶液を含むこと：を含む、
前記カプセル内封入方法。
【請求項１５】血液フィルターを用いて赤血球懸濁液
を濃縮する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】一つまたはそれより多くの生物活性薬
剤が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タン
パク質、ホルモン、コルチコステロイド、グルココルチ
コイド、非ステロイド系抗炎症剤、グルタチオン、サイ
トカイン、トキシン、オリゴヌクレオチド、およびその
他の核酸、ならびにヌクレオシド類似体からなる群より
選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】一つまたはそれより多くの生物活性薬
剤が、デキサメタゾン−２１−ホスフェート、プレドニ
ソロン−２１−ホスフェート、６−メルカプトプリン、
アジドチミジン、ジデオキシシトシン、およびジデオキ
シイノシンからなる群から選択される、請求項１４記載
の方法。
【請求項１８】さらに、少なくとも一つの生物活性薬
剤を標的薬剤と共にカプセル内封入して、処理された赤
血球が具体的組織または細胞型に選択的に向けられるよ
うにする、赤血球の処理段階を含む請求項１４記載の方
法。
【請求項１９】標的化薬剤がＺｎＣｌ₂およびビスス
ルホスクシンイミジルスベレートを含み、そして処理さ
れた赤血球がマクロファージに選択的に向けられる、請
求項１８記載の方法。
【請求項２０】請求項１記載の方法によって作成され
たキャリヤー赤血球。
【請求項２１】請求項１記載の方法に従って作成され
た、少なくとも一つの生物活性薬剤をカプセル内封入し
た赤血球を含む医薬組成物。
【請求項２２】請求項１から１９のいずれか一項に記
載の方法を遂行するための装置。
【請求項２３】少なくとも部分的に溶解された赤血球
の濃縮が血液フィルターを用いて成し遂げられる、請求
項２２記載の装置。