DE69732225T2

DE69732225T2 - Verfahren zur Verkapselung von biologisch aktiven Stoffen in Erythrocyten und Gerät dafür

Info

Publication number: DE69732225T2
Application number: DE69732225T
Authority: DE
Inventors: Magnani Mauro; Panzani Ivo; Bigi Leonardo; Zanella Andrea
Original assignee: Dideco SpA
Current assignee: Sorin Group Italia SRL
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2017-05-06
Also published as: JP4620192B2; JPH115752A; DE69732225D1; EP0882448B1; EP0882448A1; US6139836A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Aufnahme von biologisch aktiven Agenzien in rote Blutzellen.
Hintergrund der Erfindung
In letzter Zeit wurden erhebliche Anstrengungen auf die Entwicklung von Verfahren für die gezielte Abgabe von pharmazeutischen Agenzien an spezifische Orte in einem Patienten gerichtet. Es ist bekannt, dass die Wirksamkeit eines Medikaments erhöht werden kann, wenn der entsprechende Zielort wirksam erreicht wird, und die Toxizität des Medikaments kann reduziert werden, wenn die absolute Menge des verabreichten Medikaments minimiert wird. Das Interesse an Systemen zur Verabreichung von Medikamenten richtet sich sowohl auf konventionelle Agenzien, von denen viele relativ einfache organische Moleküle sind, als auch auf komplexere Agenzien, wie z. B. Oligopeptide, Proteine und Nukleinsäuren, etc. Ein Bereich des jüngsten Interesses bezieht sich auf die Verwendung von roten Blutzellen (im folgenden Erythrocyten und RBZ) zur Verabreichung von therapeutischen Arzneimitteldosen an einen Zielort in einem Patienten. Die Erythrocyten können mittels eines Prozesses mit biologisch aktiven Substanzen „beladen" werden, in welchem die Zellmembranen der Erythrocyten lysiert werden und ein oder mehrere Agenzien zu den Erythrocyten hinzugefügt werden, woraufhin die Zellmembranen wieder verschlossen werden. Solche „gefüllten" oder „Carrier-" Erythrocyten bieten als Systeme für die gezielte Verabreichung von Medikamenten eine Anzahl von Vorteilen, da sie biologisch abbaubar sind, im Kreislaufsystem für lange Zeit aufrechterhalten werden können, und auf ausgewählte Zellen, wie z. B. Makrophagen, gezielt ausgerichtet werden können. Jedoch hat sich, obwohl die Verwendung von Erythrocyten als System für die Verabreichung von Medikamenten von vielen untersucht worden ist, das Verfahren noch nicht bis zu dein Punkt entwickelt, ab welchem es routinemäßig in einer klinischen Umgebung verwendet werden kann.
Verfahren für die Herstellung einer Suspension von gefüllten Zellen in einer physiologischen Lösung sind im deutschen Patent Nr. 23 26 244 und in den deutschen offengelegten Patentanmeldungen Nr. 23 26 161 und 24 95 119 offenbart, in welchen die Erythrocyten-Zellmembranen entweder durch osmotischen Druck oder aber durch ein elektrisches Feld lysiert werden.
Das US-Patent Nr. 4224313 (Zimmermann et al.) offenbart ein Verfahren für die Herstellung einer Menge von gefüllten Zellen, die in einer Lösung suspendiert sind, durch Erhöhung der Permeabilität der Zellmembranen durch von außen induzierten osmotischen Druck oder ein elektrisches Feld, oder beides. Das einzuschließende Material umfasst ein pharmazeutisches Agens mit der Eigenschaft, dass es, wenn es in eine Zelle aufgenommen ist, frühzeitig Zellmembranen zerstört, und ein stabilisierendes Agens, das geeignet ist, die Reaktion des pharmazeutischen Agens mit den Zellmembranen zu verhindern.
Das US-Patent Nr. 4269826 (Zimmermann et al.) offenbart ein Verfahren für die Aufnahme von magnetischen Substanzen in gefüllte Zellen, die durch Anwendung eines externen magnetischen Feldes in einen bestimmten Bereich eines lebenden Körpers gebracht werden kann.
Das US-Patent Nr. 4289756 (Zimmermann et al.) offenbart ein Verfahren zur vorzugsweisen Anreicherung von gefüllten Zellen innerhalb der Milz und Leber eines lebenden Körpers.
Das US-Patent Nr. 4478824 (Franco et al.) offenbart ein Verfahren für die Aufnahme von Substanzen in Erythrocyten durch Änderung des internen osmotischen Drucks der RBZ durch die Wirkung chemischer Agenzien, wie DMSO und Glyzerin, die die Zellmembran passieren und durch Diffusion in die Zellen gelangen können.
Das US-Patent Nr. 4652449 (Ropars et al.) offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Aufnahme von Materialien in Erythrocyten unter Verwendung von osmotischem Druck. Das Verfahren und die Vorrichtung wurden nur mit großen Volumnina Blut verwendet und getestet, wodurch viele Anwendungen auf die Verwendung von homologem Blut limitiert werden, d. h. auf Blut, das aus verschiedenen individuellen Quellen stammt und zu einer Probe vereinigt wurde. Das US-Patent Nr. 4931276 (Franco et al.) offenbart ein Verfahren für den Einschluß nicht-ionischer Agenzien in Erythrocyten. Das Verfahren weist dann eine begrenzte Wirksamkeit auf, wenn das gewünschte Agens, dass eingeschlossen werden soll, nicht anionisch ist, oder wenn es anionisch oder polyanionisch ist, aber in dem nahezu isotonischen wässrigen Medium nicht in ausreichenden Konzentrationen vorliegt, um die erforderlichen Erhöhungen der Zell-Permeabilität ohne Zerstörung der Zellen zu verursachen.
Das Patent Nr. FR 2529463 offenbart ein Verfahren für den Einschluss mindestens einer biologisch aktiven Substanz in Erythrocyten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine wässrige Erythrozyten-Suspension kontinuierlich in das erste Kompartiment mindestens eines ersten Dialyse-Bauteils eingespeist wird, wobei deren zweites Kompartiment eine im Verhältnis zur erwähnten wässrigen Erythrocyten-Lösung hypotonische wässrige Lösung enthält, um die Lyse der Erythrocyten zu bewirken, sodass das Lysat der Erythrocyten in Kontakt mit der genannten Substanz mit einer biologischen Aktivität gebracht wird, und wobei dann der osmotische und/oder onkotische Druck des Erythrocyten-Lysats erhöht wird, um die Membranen der Erythrocyten wieder zu versiegeln. Das Patent Nr. FR 2678512 offenbart eine Vorrichtung für die Aufnahme eines oder mehrerer biologisch aktiver Materialien in rote Blutkörperchen durch Lyse und Wiederversiegeln.
Heubsch et al., J. Cell. Physiol., 122: 266–272 (1985) zeigen, dass in osmotisch geschwollenen Zellen ein Abbau des Cytoskeletts einsetzt, und dass bei extremen Größenänderungen die doppellagige Membran die Beschränkungen der Verformbarkeit, die unter Normalbedingungen vorherrschen, aufgibt.
Besprechungen verschiedener Verfahren zur Aufnahme von Substanzen in Zellen wurden vorgestellt durch Franco et al. in Life Science 32: 2763–2768 (1986), Am. J. Hematol. 17: 393–400 (1984) und J. Cell. Physiol. 129: 221–229 (1986).
Ziele und Zusammenfassung der Erfindung
Trotz der aufwendigen Arbeit auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung ist aus dem Stand der Technik bislang noch kein Verfahren bekannt, das die Aufnahme von einem oder mehreren biologisch aktiven Agenzien in RBZ bei akzeptablen physiologischen Konzentrationen und ohne Verdünnung oder Verlust des endogenen Inhalts der Erythrocyten ermöglicht. Ein vorrangiges Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das dieses Bedürfnis erfüllt. Das heißt, das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Aufnahme eines oder mehrerer biologisch aktiver Agenzien (d. h. Medikamente) in Erythrocyten bei gewünschten physiologischen Konzentrationen, und ohne Verdünnung oder Verlust eines wesentlichen Anteils des zellulären Inhalts, was unerwünschter Weise die Integrität, die Lebensfähigkeit und die Lebensdauer der Carrier-RBZ vermindern würde.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Carrier- (das heißt medikamentengefüllte) Erythrocyten bereitzustellen, die die Fähigkeit besitzen, unter für Säugetiere physiologischen Bedingungen für eine längere Dauer als bereits früher beschriebene Carrier-RBZ beständig zu sein und biologisch aktive Agenzien zu entlassen. Carrier-RBZ, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, entlassen ihr eingeschlossenes biologisch aktives Agens bzw. Agenzien durch Diffusion aus den RBZ oder durch aktiven Transport über die Erythrocyten-Zellmembran.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, durch welche das Verfahren der Erfindung wirksam und reproduzierbar ausgeführt werden kann.
So bezieht sich die Erfindung auf die Aufnahme einer großen Vielfalt von therapeu tisch nützlichen biologisch aktiven Agenzien in Säugetiere-Erythrocyten, was bislang nicht ohne inakzeptabele Verdünnung der endogenen Erythrocyten-Inhalte und/oder des Agens oder der Agenzien, die in die Erythrocyten aufgenommen werden sollen, bewerkstelligt werden konnte.
Genauer ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Einfuhr oder Aufnahme verschiedener Agenzien, einschließlich Polypeptiden, in Erythrocyten. Diese und andere biologisch aktive Substanzen können entweder alleine oder in Kombination mit anderen ähnlichen Agenzien in Erythrocyten eingeschlossen werden, die auf diese Weise Carrier-Erythrocyten für dieses oder diese Agenzien werden. Die Carrier-Erythrocyten werden verwendet um eine gewünschte, langsame kontinuierliche Abgabe des oder der eingeschlossenen biologisch aktiven Agenzien zu erreichen, wenn die Carrier-Erythrocyten später in ein Säugetier eingeführt werden. Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung die schnelle Herstellung solcher Carrier-Erythrocyten aus relativ kleinen Blutproben. Das Verfahren der Erfindung ist besonders nützlich wenn sie mit einer Vorrichtung benutzt wird wie sie hier beschrieben wird.
Die obengenannten Ziele werden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Einfuhr mindestens eines gewünschten Agens in Säugetier-Erythrocyten (RBZ) erreicht, welches die Konzentration lysierten oder teilweise lysierten Erythrocyten- Materials vor Hinzufügung eines oder mehrerer biologisch aktiver, einzuschließender Agenzien umfasst, und welches die Einschluss-Ausbeute bedeutend verbessert. Die Konzentration der lysierten oder teilweise lysierten Erythrocyten wird durch Hämofiltration erreicht. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird als Konzentrationseinrichtung in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Einweg-Hämofilterpatrone verwendet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
2 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsformn einer Vorrichtung, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Einführung mindestens eines gewünschten Agens in rote Blutzellen von Säugetieren. Das Verfahren beinhaltet die Konzentration lysierten oder teilweise lysierten Erythrocyten-Materials, bevor ein oder mehrere biologisch aktive, einzuschließende Agenzien hinzugefügt werden, und es zeigte sich, dass es die Einschluss-Ausbeute wesentlich verbesserte. So wie der Begriff „Einschluss-Ausbeute" hier verwendet wird, bezieht er sich auf den Anteil eines biologisch aktiven Agens, der in Carrier-RBZ eingeschlossen ist, der üblicherweise als Prozentsatz des eingeschlossenen Agens im Verhältnis zu der Gesamtmenge des während des Einschluss-Prozesses hinzugefügten Agens ausgedrückt wird. Das Erythrocyten-Material wird durch Hämofiltration konzentriert. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird als Konzentrationseinrichtung in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Einweg-Hämofilterpatrone verwendet.
So wie der Begriff „Carrier-RBZ" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Erythrocyten, die ein oder mehrere biologisch aktive Agenzien einschließen. In einigen Fällen werden hier Carrier-RBZ, die ein hinzugefügtes biologisch aktives Agens enthalten, im Hinblick auf das spezifische Agens bezeichnet. Z. B. bezieht sich „d-21P Carrier-RBZ" auf Erythrocyten, die lysiert und mit dem Agens Dexamethason-21-Phosphat beladen worden sind, und Dexamethason freisetzen. Carrier-RBZ für eine Vielzahl solcher Agenzien, entweder alleine oder in Kombination, können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten werden.
So wie der Begriff „biologisch aktive Agenzien" hier verwendet wird, bezieht er sich auf Materialien, die sich für den Einschluss mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen. Diese umfassen, sind aber nicht limitiert auf Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine, Hormone, Kortikosteroide, Glucokortikoide, nicht-steroide entzündungshemmende Substanzen, Glutathion, Cytokine, Toxine, Oligonucleotide und andere Nukleinsäuren, und Nukleosid-Analoga, die als nützliche therapeutische Agenzien wohlbekannt sind. Diese umfassen 6-Mercaptopurin (6-MP) oder Azathiopurin und Fludarabinphosphat, die gewöhnlicher Weise als Immunsuppressiva und Inhibitoren bösartigen Zellwachstums verwendet werden, phosphoryliertes Azidothymidin (AZT), Dideoxycytosin (ddC) und Dideoxyinosin (ddI), die als antivirale Agenzien verwendbar sind, insbesondere in der Behandlung von AIDS, und Prednisolon-21-Phosphat. Carrier-RBZ, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, haben die gewünschten Eigenschaften verbesserter Unversehrtheit, Lebensfähigkeit und Lebensdauer unter physiologischen Bedingungen.

Die folgenden Abkürzungen werden durchweg verwendet:

BS³	Bissulfosuccinimidylsuberat
d-21P	Dexamethason-21-Phosphat
PIGPA	Phosphat-Inosin-Glucose-Pyruvat-Adenin
RBZ	Rote Blutzelle(n), Erythrocyten
CPD	Natriumcitrat Dihydrat-Zitronensäure Monohydrat- Natriumphosphat monobasisches Bihydrat-Glukose
PBS	Phosphat-gepufferte Salzlösung

In einer Ausgestaltung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung von Erythrocyten aus einem individuellen Patienten, die Konzentration der Erythrocyten, das Waschen der Erythrocyten mit einer ersten Lösung einer physiologischen Salzlösung, das Waschen der Erythrocyten mit einer zweiten hypotonischen Lösung bestehend aus 6 Volumenanteilen einer physiologischen Salzlösung und 4,5 Volumenanteilen destillierten, sterilen H₂Os, das Verdünnen der Erythrocyten mit einer Lösung bestehend aus 6 Volumenanteilen einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) und 8 Volumenanteilen destillierten, sterilen H₂Os, das Konzentrieren der Erythrocyten in einer Hämofilter-Patrone, die Zugabe des oder der biologisch aktiven einzuschließenden Agenzien, dass Wiederverschließen der Erythrocyten durch Hinzufügung einer Phosphat-Inosin-Glucose-Pyruvat-Adenin-Lösung (PIGPA), das Inkubieren der resultierenden Erythrocyten bei 37°C für 30 Minuten, und das Waschen der Erythrocyten mit einer physiologischen Salzlösung. Die PIGPA-Lösung enthält bevorzugt 33 mM NaH₂PO₄, 1.606 M KCl, 0.194 M NaCl, 0.1 M Inosin, 5 mM Adenin, 20 mM ATP, 0.1 M Glukose, 0.1 M Pyruvat und 4 mM MgCl₂. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden 5 ml der PIGPA-Lösung für das Wiederverschliessen eines Volumens von ungefähr 70–90 ml lysierter Erythrocyten verwendet.
Um zu verhindern, dass die Erythrocyten während des Prozesses koagulieren, können Sie während oder anschliessend an den Gewinnungsschritt wahlweise mit einem Antikoagulanz kontaktiert werden. Eine bevorzugte Antikoagulanz-Lösung, die hier als CPD-Lösung bezeichnet wird, enthält 26.3 g Natriumcitrat Dihydrat, 3.3 g Zitronensäure Monohydrat, 2.5 g Natriumphosphat monobasisches Bihydrat, und 23.2 g Glukose in einem Liter sterilen Wassers.
Besonders bevorzugt beinhaltet das Verfahren der vorliegenden Erfindung das Abtrennen der Erythrocyten von anderen Blutzellen und Bestandteilen, das Suspendieren der Erythrocyten in einer ersten hypotonischen Lösung bei einer Konzentration von 0.04 bis 0.05 ml Erythrocyten pro ml der ersten Lösung (wobei das Volumen und die Osmolalität der ersten Lösung bekannt ist oder bestimmt wird), das Lysieren der Erythrocyten durch Suspendieren in einer zweiten hypotonischen Lösung (mit einer Osmolalität, die 30 bis 60 mOsm niedriger liegt als die der ersten Lösung), um ein Lysat zu erhalten, das Anpassen der Konzentration des Lysats, so dass sein Volumen 0.1 bis 0.067 des Volumens der ersten Lösung beträgt, das Hinzufügen eines biologisch aktiven Agens, das in das Lysat eingeschlossen werden soll, und das Wiederverschließen der lysierten RBZ durch Hinzufügung einer konzentrierten Salzlösung zu den Lysat, um die Osmolalität des Lysats auf einen Bereich zwischen dem 1.9- bis 2.1-fachen der ersten Lösung einzustellen.
Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in 1 schematisch dargestellt. In 1 sind Erythrocyten 10 als eine Membran 12 dargestellt, die viele kleine gefüllte Kreise enthält. Die kleinen gefüllten Kreise sollen in den unlysierten RBZ vorkommendenn biologische Moleküle 14 darstellen. Nach der ersten hypotonischen Verdünnung erkennt man, dass die Erythrocyten 10 anschwellen (dargestellt als 20). Die angeschwollenen Erythrocyten 20 werden einer zweiten hypotonischen Verdünnung ausgesetzt, was bewirkt, dass diese vollständig oder teilweise lysiert werden. Sowohl die lysierten als auch die teilweise lysierten Erythrocyten 30 enthalten und sind umgeben von biologischen Molekülen 14, die in den unlysierten RBZ vorkommen. Im nächsten Schritt werden die lysierten oder teilweise lysierten Erythrocyten 30 in einem Hämofilter 40 konzentriert. Die resultierenden lysierten oder teilweise lysierten Erythrocyten 30 werden mit biologisch aktiven Agenzien 50, die durch die großen gefüllten Kreise dargestellt sind, in Kontakt gebracht. Auf diese Weise werden einige der biologisch aktiven Agenzien in den Erythrocyten eingeschlossen. Die eingeschlossenen biologisch aktiven Agenzien sind schematisch dargestellt als 50. Die Erythrocyten, die nun biologisch aktive Agenzien enthalten, werden dann einer konzentrierten Salzlösung ausgesetzt. Die Aussetzung bewirkt, dass sich die Zellmembranen 12 wieder verschließen, wodurch biologisch aktive Agenzien 50 in die Zellen aufgenommen und eingeschlossen werden. Die resultierende sogenannte Carrier-RBC oder Carrier-Erythrocyte 60 wird dann gewaschen.
Eine Ausgestaltung einer Vorrichtung zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens wird in 2 schematisch gezeigt. In 2 ist ein Beutel 100, der bevorzugt mindestens 50 ml Blut enthält, mit einer Blut-Zuleitung 102 verbunden. Das Blut wird durch eine Pumpe 104 in eine Separator-Schüssel 106, die bevorzugt bei ungefähr 5600 rpm rotiert, transferiert. Erythrocyten, die in der Schüssel 106 enthalten sind, werden mittels einer physiologischen Salzlösung (NaCl 0.6%), die durch eine Zuleitung 108 für physiologische Salzlösung herangeführt wird, gewaschen. Die physiologische Salzlösung wird bevorzugt mit einer Rate von ungefähr 150 ml/min hinzugefügt. Der Waschschritt trennt Plasma und die anderen Blutzellen ab, die in einen Abfall-Sammelbeutel 110 überführt werden. Nach dem Waschen werden die Erythrocyten aus der Separator-Schüssel 106 in einen Transfer-Beutel 112 gepumpt. Ungefähr 400 ml einer ersten hypotonischen Lösung (6 Volumenanteile physiologische Salzlösung und 4.5 Volumenanteile destilliertes Wasser) werden dem Transferbeutel 112 über eine Zuleitung 114 für eine erste hypotonische Lösung hinzugefügt und mit den Erythrocyten vermischt. Die resultierende Suspension wird dann bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten unter sanftem Rühren inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt sind die Erythrocyten angeschwollen (Referenzzeichen 20 in 1), aber sie sind noch nicht lysiert. Eine zweite hypotonische Lösung wird dann über eine Zuleitung 116 für eine zweite hypotonische Lösung in den Transferbeutel 112 eingeleitet. Die zweite hypotonische Lösung besteht bevorzugt aus 200 ml einer Lösung mit 6 Volumenanteilen physiologischer Salzlösung und 8 Volumenanteilen destilliertem Wasser. Im diesem Stadium setzt die Hämolyse der Erythrocyten ein. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wird das resultierende Lysat durch den Hämofilter 118 gepumpt. Während des Filtrationsprozesses sind die Klemmen 120, 122, 124 und 126 geöffnet, und die Klemmen 128, 130, 132, 134, 136, 138 und 140 geschlossen. Um den Filtrationsprozess zu unterstützen, kann eine optionale Vakuumpumpe 142, die ein Vakuum von –100 bis –150 mmHg zieht, eingesetzt werden. Das Hämolysat wird in einem Ultrafiltrat-Reservoir 144 gesammelt. Wenn das gewünschte Volumen erreicht ist, werden die konzentrierten Erythrocyten in dein Transferbeutel 112 gesammelt. Dies wird erreicht durch das Schließen der Klemme 124 und das Öffnen der Klemme 128. Die biologisch aktive Substanz wird dann in den Transferbeutel 112 eingebracht woraufhin diese in Kontakt mit den konzentrierten, lysierten Erythrocyten gerät und von diesen eingeschlossen wird. Nach 10–15 Minuten sanften Rührens wird dem Transferbeutel 112 5 ml der PIGPA Versiegelungslösung hinzugefügt, und der Beutel wird für 30 min bei 37°C auf einem Heizer 146 angeordnet. Nach Vollendung der gewünschten Heizdauer wird der Transferbeutel 112, der nun wieder versiegelte Erythrocyten enthält, wieder angeschlossen, und die Erythrocyten werden zurück in die Separa tor-Schüssel 106 gepumpt. Wenn sie in der Schüssel sind, werden die Erythrocyten mit 2 Litern physiologischer Salzlösung (die mit 150–200 ml/min hinzugefügt wird) gewaschen, während die Schüssel mit ungefähr 5600 rpm rotiert. Schließlich werden die gewaschenen, gefüllten Erythrocyten in den Beutel 148 für gefüllte Erythrocyten überführt. Dies wird durch Schließen der Klemme 122 und Öffnen der Klemme 134 erreicht, wobei die Erythrocyten mit einer Rate von 150 ml/min aus der Schüssel gepumpt werden.
Für den Fall, dass medikamentengefüllte Erythrocyten weiter verarbeitet werden müssen, um ihnen die Eigenschaft zu verleihen, dass sie schnell von Makrophagen erkannt werden, werden die gefüllten Erythrocyten, bevor sie in dein Beutel 148 gepumpt werden, einem zusätzlichen Waschschritt mit einer physiologischen Salzlösung unterworfen, die 1 mM ZnCl₂ enthält. Nachdem sie mit ZnCl₂ in Kontakt gebracht worden sind, werden die Erythrocyten in den Transferbeutel 112 überführt, wo sie mit BS³ (1–1.5 mM endgültige Konzentration) in Kontakt gebracht werden. Nach 15 Minuten werden die Erythrocyten erneut in der rotierenden Separator-Vorrichtung 106 unter Verwendung von ungefähr 1 Liter physiologischer Salzlösung gewaschen. Sie werden dann in den Beutel 148 für gefüllte Erythrocyten überführt.
Wenn die gefüllten Erythrocyten vor der Infusion länger als 12–24 Stunden aufbewahrt werden sollen, sollte der endgültige Sammelbeutel ein Konservierungsmittel enthalten. Ein bevorzugtes Konservierungsmittel ist die oben beschriebene CPD-Lösung. So können ungefähr 10 ml der CPD-Lösung in den endgültigen Sammelbeutel gegeben werden. Die Ausführungsform der 1 und 2 wird besonders bevorzugt für die Herstellung von Carrier-RBZ aus einem kleinen Volumen (weniger als 100 ml) Blutes.
Wegen der höheren Konzentrationen von hinzugefügten Agenzien in den mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Carrier-Erythrocyten werden diese Agenzien in den Carrier-RBZ nicht so schnell verbraucht wie in solchen, die durch bereits bekannte Verfahren hergestellt worden sind. Darüber hinaus verlieren Carrier-Erythrocyten, die mit dein Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, wegen des höheren Anteils von endogenen biologischem Molekülen, die aus den lysierten RBZ freigesetzt werden, die aber nichtsdestotrotz durch das erfindungsgemäße Verfahren in die Carrier-RBZ in hohen Konzentrationen wieder aufgenommen werden, ihre endogenen Moleküle, die für deren Langzeit-Aufrechterhaltung erforderlich sind, nicht, so wie es für Carrier-RBZ, die mit bereits bekannten Verfahren hergestellt werden, der Fall ist. Als Folge davon besitzen die Carrier-RBZ der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, über einen längeren Zeitraum als früher beschriebene Carrier-RBZ zu existieren und aktive Agenzien unter physiologischen Bedingungen freizusetzen.
Die Carrier-RBZ der vorliegenden Erfindung werden einem Säugetier durch Injektion verabreicht, um das oder die eingeschlossenen biologisch aktiven Agenzien an das Säugetier ohne weitere Manipulationen über einen verlängerten Zeitraum abzugeben. Wenn eine systematische Verabreichung erforderlich ist, werden die Carrier-RBZ in das Kreislaufsystem des Säugetiers injiziert. Die gezielte Verabreichung der Carrier-RBZ wird durch intramuskuläre Injektion im den interessierenden Bereich erzielt.
In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird ein „prä-Medikament" (d. h. ein Vorläufer eines biologisch aktiven Agens) in Carrier-RBZ aufgenommen, die dann in ein Säugetier injiziert werden. Für einige prä-Medikamente werden endogene aktivierende Agenzien, die im Blut des Säugetiers vorkommen, das prä-Medikament mit einer langsamen, aber stetigen Rate in ein biologisch aktives Agens umwandeln. Als ein Beispiel kann Dexamethason-21-Phosphat (d-21P) in Carrier-RBZ eingeschlossen werden, so dass, wenn die gefüllten RBZ in das Kreislaufsystem eines Säugetiers eingebracht werden, das d-21P langsam in das chemotherapeutische Medikament Dexamethason umgewandelt wird. Da Dexamethason die Zellmembran des Carrier-Erythrocyten passieren kann (während d-21P dies nicht kann), stellt dieser Prozess sicher, dass das Säugetier mit einer konstanten Dosis des biologisch aktiven Agents (in diesem Fall Dexamethason) über eine bestimmte Zeitdauer versorgt wird. Alternativ kann für prä-Medikamente, für die kein endo genes aktivierendes Agens existiert, dem Blut des Säugetiers zu einem gewünschten Zeitpunkt ein aktivierendes Agens verabreicht werden. Das aktivierende Agens gelangt in die gefüllten Erythrocyten und aktiviert das prä-Medikament, z. B. durch Reaktion mit dem prä-Medikament, um ein biologisch aktives Agens zu bilden, oder durch Katalyse einer chemischen Reaktion, die das prä-Medikament umwandelt. In einer verwandten Ausführungsform kann das aktivierende Agents in Erythrocyten eingeschlossen sein, die dein Patient im Anschluss an die vorhergegangene Verabreichung des prä-Medikaments verabreicht werden.
Carrier-RBZ, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind, werden verwendet, um einem individuellen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge des oder der darin eingeschlossenen biologisch aktiven Agenzien zu verabreichen. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auf die Menge des oder der biologisch aktiven Agenzien, die ausreicht, um den gewünschten Zweck zu erreichen. Während individuelle Bedürfnisse variieren, gehört die Bestimmung von optimalen Bereichen für therapeutisch wirksame Mengen solcher Agenzien zum Können des Fachmanns. Generell kann die Dosierung, die erforderlich ist, um eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung bereitzustellen, durch jemanden mit gewöhnlichen Fähigkeiten auf seinem Fachgebiet bestimmt werden, und variiert in Abhängigkeit vom Alter, der Gesundheit, der körperlichen Kondition, dein Gewicht, dein Ausmaß der Erkrankung des Individuums, der Häufigkeit der Behandlungen, und der Art und dem Umfang des gewünschten Effektes. Wo es angebracht ist, kann eine therapeutisch wirksame Menge durch mehrfache Verabreichung von Carrier-RBZ über einen geeigneten Zeitraum verabreicht werden.
Die Carrier-RBZ der Erfindung können in eine pharmazeutische Zusammensetzung aufgenommen werden, die außerdem zusätzliche Substanzem aufweist, wie z. B. konventionelle Arzneistoffträger, d. h. pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Carrier-Substanzen zur Verabreichung an ein Säugetier mittels Injektion, die nicht schädlich mit den aktiven Bestandteilen reagieren. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Carrier beinhalten Wasser, Salzlösungen, Polyethylenglyko le, Gelatine, etc, sind aber nicht darauf limitiert. Zusätzlich oder alternativ können pharmazeutische Präparate, die die erfindungsgemäßen Carrier-RBZ enthalten, überdies Hilfs-Agenzien, wie z. B. Gleitmittel, Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Feuchthaltemittel, Emulgatoren, Salze für die Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffer und ähnliche, nicht schädlich mit den aktiven Bestandteilen reagierende Stoffe enthalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Carrier-RBZ enthalten, können auch wahlweise stabilisierende Agenzien enthalten.
Ein Beispiel für ein Protein, das geeignet ist für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung, ist Ubiquitin, ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 8600 Dalton. Ubiquitin ist dafür bekannt, dass es Proteine für den anschließenden proteolytischen Abbau markiert. Typischerweise beträgt der Prozentsatz der Polypeptide, die in die Carrier-Erythrocyten eingeschlossen werden können (Einschluss-Ausbeute), 30%. In solchen Fällen wurden 40%–60% der zu Beginn vorliegenden Erythrocyten wiederhergestellt.
Ein Beispiel für ein prä-Medikament, dass sich für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung eignet, ist d-21P. Wie bei dein Polypeptid beträgt der Prozentsatz des d-21P, das in die Carrier-Erythrocyten eingeschlossen werden kann (Einschluss-Ausbeute) ungefähr 30%. Wiederum wurden 40%–60% der zu Beginn vorliegenden Erythrocyten wiederhergestellt.
Für den Fall, in welchem es erwünscht ist, gegen Makrophagen gerichtete Carrier-RBZ zu gewinnen, können die folgende Schritte angewandt werden. Zunächst werden die wiederhergestellten (d. h. die befüllten) RBZ mit Salzlösung gewaschen, die 1 mM ZnCl₂ enthält. Das ZnCl₂ agiert als Komplexierungs-Agens, indem es Komplexbildungen zwischen den Transmembran-Proteinen der RBZ induziert Als nächstes wird eine Lösung hinzugefügt, die 1 mM Bissulfosuccinimidylsuberat (BS³) enthält. BS³ agiert als quervernetzendes Agens, das dafür sorgt, dass durch ZnCl₂ induzierte Proteinkomplexe irreversibel werden, auch wenn ZnCl₂ entfernt wird. Zur Inkubation mit BS³ wird eine Dauer von 15 Minuten eingeräumt. Die re sultierenden quervernetzten Erythrocyten werden dann mit Salzlösung gewaschen und mit konventionellen Verfahren konzentriert.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Medikaments mit mindestens einer biologisch aktiven Substanz, die in Erythrocyten eingeschlossen ist, aufweisend folgende Schritte: 1) Mindestens teilweises Lysieren der Erythrocyten; 2) Konzentration der mindestens teilweise lysierten Erythrocyten durch Hämofiltration; 3) Kontaktieren der konzentrierten, mindestens teilweise lysierten Erythrocyten mit einer oder mehreren biologisch aktiven Substanzen; und 4) Verschließen der mindestens teilweise lysierten Erythrocyten, um so die biologisch aktiven Substanzen in mindestens einen Teil der Erythrocyten einzuschließen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Erythrocyten vor dem Lysierungsschritt zum Anschwellen gebracht werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei mindestens einige der Erythrocyten vollständig lysiert werden.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments mit mindestens einer biologisch aktiven Substanz, die in Erythrocyten eingeschlossen ist, aufweisend folgende Schritte: 1) Aussetzen der Erythrocyten zu einer ersten hypotonischen Lösung, um zu bewirken, dass die die Erythrocyten anschwellen; 2) Aussetzen der geschwollenen Erythrocyten zu einer zweiten hypotonischen Lösung, um zu bewirken, dass die Erythrocyten mindestens teilweise lysiert werden; 3) Konzentration der lysierten Erythrocyten durch Hämofiltration; 4) Kontaktieren der konzentrierten, mindestens teilweise lysierten Erythrocyten mit einer oder mehreren biologisch aktiven Substanzen; und 5) Aussetzen der mindestens teilweise lysierten Erythrocyten zu einer Versiegelungs-Lösung, um so mindestens einige der biologisch aktiven Substanzen in mindestens einen Teil der Erythrocyten einzuschließen.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei mindestens einige der Erythrocyten vollständig lysiert werden, wenn sie mit der zweiten hypotonischen Lösung kontaktiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die erste hypotonische Lösung 6 Volumenanteile einer physiologischen Salzlösung und ungefähr 4,5 Volumenanteile destilliertes, steriles H₂O aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die zweite hypotonische Lösung 6 Volumenanteile einer physiologischen Salzlösung und ungefähr 8 Volumenanteile destilliertes, steriles H₂O aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Erythrocyten unter Verwendung eines Hämofilters konzentriert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die eine oder mehreren biologisch aktiven Substanzen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Peptiden, Oligopeptiden, Polypeptiden Proteinen, Hormonen, Kortikosteroiden, Glucokortikoiden, nicht-steroide entzündungshemmende Substanzen, Glutathion, Cytokinen, Toxinen, Oligonucleotiden und andere Nukleinsäuren, und Nukleosid-Analoga besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die eine oder mehreren biologisch aktiven Substanzen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Dexamethason-21-Phosphat, Prednisolon-21-Phosphat, 6-Mercaptopurin, Azidothymidin, Dideoxycytosin, und Dideoxyinosin besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Versiegelungs-Lösung eine Phosphat-Inosin-Glucose-Pyruvat-Adenin-Lösung enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei 5 ml der Versiegelungs-Lösung für jedes Aliquot von 70–90 ml lysierter Erythrocyten verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die mindestens teilweise lysierten Erythrocyten während der Kontaktierung mit der Versiegelungs-Lösung bei 37°C für 30 Minuten inkubiert werden.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments mit mindestens einer biologisch aktiven Substanz, die in Erythrocyten eingeschlossen ist, aufweisend folgende Schritte: 1) Suspendieren der Erythrocyten in einem Volumen der ersten hypotonischen Lösung, um zu bewirken, dass die Erythrocyten anschwellen, wodurch eine erste Suspension erhalten wird, in der die Erythrocyten in der ersten hypotonischen Lösung in einer Konzentration von 0,04–0,05 ml Erythrocyten pro ml Lösung vorliegen, wobei die genannte erste hypotonische Lösung 6 Volumenanteile einer physiologischen Salzlösung und 4,5 Volumenanteile destilliertes, steriles H₂O aufweist; 2) Hinzugabe der genannten ersten Erythrocyten-Suspension zu einer zweiten hypotonischen Lösung mit einer Osmolalität, die 30–60 Milliosmol geringer ist als die der ersten Lösung, um zu bewirken, dass die Erythrocyten mindestens teilweise lysiert werden, wobei die genannte zweite hypotonische Lösung 6 Volumenanteile einer physiologischen Salzlösung und 8 Volumenanteile destilliertes, steriles H₂O aufweist; 3) Konzentration der in Schritt 2 erhaltenen Suspension durch Hämofiltration, um so ein Volumen von Erythrocyten zu erhalten, das dem 0.1–0,067-fachen des Volumens der ersten hypotonischen Lösung entspricht; 4) Kontaktieren der konzentrierten mindestens teilweise lysierten Erythrocyten mit einer oder mehreren biologisch aktiven Substanzen; und 5) Aussetzen der mindestens teilweise lysierten Erythrocyten zu einer Versiegelungs-Lösung, um so mindestens einige der biologisch aktiven Substanzen in mindestens einen Teil der Erythrocyten einzuschließen, wobei die Versiegelung-Lösung eine konzentrierte Salzlösung aufweist, die eine solche Konzentration hat, dass die Osmolalität der resultierenden Lösung auf das 1,9–2,1-fache der ersten hypotonischen Lösung gebracht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Erythrocyten-Suspension unter Verwendung eines Hämofilters konzentriert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die eine oder mehreren biologisch aktiven Substanzen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Peptiden, Oligopeptiden, Polypeptiden Proteinen, Hormonen, Kortikosteroiden, Glucokortikoiden, nicht-steroide entzündungshemmende Substanzen, Glutathion, Cytokinen, Toxinen, Oligonucleotiden und andere Nukleinsäuren, und Nukleosid-Analoga besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die eine oder mehreren biologisch aktiven Substanzen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Dexamethason-21-Phosphat, Prednisolon-21-Phosphat, 6-Mercaptopurin, Azidothymidin, Dideoxycytosin, und Dideoxyinosin besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 14, das darüber hinaus einen Schritt zur Behandlung der Erythrocyten, die mindestens eine biologisch wirksame Substanz einschließen, mit einer Target-Substanz aufweist, um so behandelte Erythrocyten zu erhalten, die dazu geeignet sind, vorzugsweise zu einem spezifischen Gewebe oder Zelltypus geleitet zu werden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Target-Substanz ZnCl₂ und Bissulfosuccinimidylsuberat ist, und die behandelten Erythrocyten dazu geeignet sind, vorzugsweise zu Makrophagen geleitet zu werden
Carrier-Erythrocyten, die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–19 erhalten werden können.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die Erythrocyten enthält, die mindestens eine biologisch aktive Substanz einschließen, und die durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–19 erhalten werden können.
Vorrichtung für die Ausführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1–19, aufweisend einen Beutel (100) für die Aufbewahrung von Blut, der mit einer Blut-Zuleitung (102) verbunden ist, eine Pumpe (104) zum Transport von Blut aus dem Beutel (100) in eine Separator-Schüssel (106), eine Zuleitung für physiologische Salzlösung (108) zur Lieferung von physiologischer Salzlösung in die Schüssel (106), einen Abfall-Sammelbeutel (110), der mit der Schüssel (106) verbunden ist, zur Aufnahme von abgetrenntem Plasma und anderen Blutzellen, einen Transfer-Beutel (112) zur Aufnahme von Erythrocyten, die aus der Schüssel (106) gepumpt werden, eine Zuleitung (114) für eine erste hypotonische Lösung zur Einleitung einer ersten hypotonischen Lösung in den Transfer-Beutel (112), eine Zuleitung (116) für eine zweite hypotonische Lösung zur Einleitung einer zweiten hypotonischen Lösung in den Transfer-Beutel (112), einen Hämofilter (118) zur Konzentration von mindestens teilweise lysierten Erythrocyten, der mit den Transfer-Beutel (112) verbunden ist, ein Reservoir (144), dass mit dem Filter (118) verbunden ist, für die Aufnahme eines Hämolysats aus dem Hämofilter (118), einen Heizer (146) zum Heizen des Transfer-Beutels (112) mit lysierten Erythrocyten, die zurück in die genannte Schüssel (106) transferiert werden, und einen Beutel (148) für gefüllte Erythrocyten zur Aufnahme von gefüllten Erythrocyten aus der genannten Schüssel (106).