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Fachgebiet
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf die Verwendung von HGF (Hepatocytenwachstumsfaktor) zur
Herstellung eines Medikaments zur Linderung von Nebenwirkungen,
die durch Immunosuppressiva verursacht sind.
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Technischer
Hintergrund
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Ein Immunosuppressivum wird herkömmlicherweise
zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit und von malignen Tumoren
sowie zur Unterdrückung
der Transplantatsabstoßungsreaktion
bei der Organtransplantation verwendet.
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Ein Immunosuppressivum ist ein Medikament,
das eine übermäßig auftretende
Immunantwort unterdrückt,
und wird je nach der Spezifität
der Immunosuppression grob in unspezifische Immunosuppressiva oder spezifische
Immunosuppressiva unterteilt.
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Beispiele für die unspezifischen Immunosuppressiva
sind ein Nebennierenrindenhormon (zum Beispiel Cortison und Dexamethason),
Antimetabolikum (zum Beispiel 6-Mercaptopurin, Azathiopurin, 5-Fluoruracil
und Methotrexat), Alkylierungsmittel (zum Beispiel Cyclophosphamid
und Busulfan), Alkaloid (zum Beispiel Vinblastin und Vincristin)
und Antibiotikum (zum Beispiel Cyclosporin A und G, FK506 (Tacrolimus),
Mitomycin C und Daunorubicin).
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Beispiele für die spezifischen Immunosuppressiva
sind ein Anti-Lymphocyten-Globulin,
monoklonale Antikörper
(zum Beispiel Anti-CD3-Antikörper
und Anti- CD4-Antikörper) gegen
verschiedene Antigene, die auf der Oberfläche eines Lymphocyten exprimiert
werden.
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Unter den oben beschriebenen Immunosuppressiva
haben Cyclosporin und FK506 eine starke immunosuppressive Wirkung
und erzielen bei der Unterdrückung
der Transplantatsabstoßungsreaktion
bei der Organtransplantation von Niere, Leber, Herz, Pancreas und
dergleichen ausgezeichnete Ergebnisse und sind daher bekannte Medikamente.
Sowohl Cyclosporin als auch FK506 sind antibiotische Immunosuppressiva
mit einer cyclischen Peptidstruktur, und vermutlich üben sie
ihre immunosuppressive Wirkung aus, indem sie einen intrazellulären Signalübermittlungsweg
blockieren, der die Expression eines Cytokin-Gens, wie IL-2, über die
Aktivierung eines T-Zell-Antigen-Rezeptors (TCR) aufgrund der Antigenstimulation
in einem T-Zell-System induziert. Insbesondere ist bekannt, dass
sowohl Cyclosporin als auch FK506 in einer Zelle an ein Bindungsprotein
dafür gebunden
werden, und Cyclosporin wird an Cyclophilin gebunden, und FK506
wird an ein FK506-bindendes Protein gebunden. Diese Bindungsproteine
werden Immunophiline genannt, einschließlich ihrer Familien. Die folgende
Studie zeigte, dass ein Komplex von Immunophilin mit FK506 oder
Cyclosporin an ein Serin/Threonin-Dephosphorylierungsenzym, Calcineurin,
gebunden wird und dessen enzymatische Aktivität hemmt. Und nun glaubt man,
dass Cyclosporin und FK506 eine immunosuppressive Wirkung ausüben, weil ihr
Komplex mit Immunophilin die enzymatische Aktivität von Calcineurin
hemmt. Diese Theorie wird durch die Tatsache gestützt, dass
es eine Korrelation zwischen der Stärke der Hemmung der enzymatischen
Aktivität von
Calcineurin durch ein Derivat von Cyclosporin und FK506 und der
Stärke
der Hemmung der IL-2-Synthese in ihren T-Zellen gibt.
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Wie oben beschrieben, werden viele
Immunosuppressiva verwendet, doch hat jedes Medikament auch Nebenwirkungen.
Zum Beispiel wurde über
multiple organische (mehrere Organe betreffende) oder systemische
Nebenwirkungen berichtet, wie Knochenmarksuppression, Leukopenie,
Thrombocytopenie, schwere Infektionskrankheiten, Leberstörungen,
Nierenstörungen,
Neuropathie, Lungenstörungen,
Magen-Darm-Störungen,
Appetitlosigkeit, Übelkeit,
Erbrechen, Durchfall, Anämie,
Gingivostomatitis, Haarausfall, Haaraufrichtung, Chromatose, Hypotonie,
Arrhythmie, Fieber, Konvulsion, Sterilität, Azoospermie und Unwohlsein.
Die zur Zeit verwendeten Immunosuppressiva haben also die Probleme,
dass ihre Nebenwirkungen stark sind, ihre Dosis beschränkt ist
und bei der Verwendung große
Sorgfalt notwendig ist.
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Insbesondere verursacht ein Immunosuppressivum
mit starker Knochenmarksuppression Leukopenie und manifestiert sich
leicht in einer schweren Infektionskrankheit, und daher muss seine
Dosis beschränkt
werden. Weiterhin kommt es häufig
zu akuten Abstoßungsreaktionen,
die sich leicht bei einer Organtransplantation manifestieren, und
zu einer Dysfunktion transplantierter Organe. Cyclosporin und FK506,
die bei der Organtransplantation im Allgemeinen verwendet werden,
sind Medikamente, die die IL-2-Synthese durch Wirkung auf T-Zellen
unterdrücken,
da sie die kritische Rate der akuten Abstoßungsreaktion nach einer Organtransplantation
merklich reduzieren können.
Daher haben Cyclosporin und FK506 die Vorteile, dass die Manifestationsrate
der Knochenmarksuppression gering ist, eine Manifestation schwerer
Infektionskrankheiten nach einer Leukopenie verhindert werden kann
und die Behandlung nach einer Organtransplantation leichter ist.
Außerdem
kann aufgrund dieser Wirkungen das Ergebnis der Organtransplantation
merklich verbessert werden.
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Weiterhin werden selbst bei Cyclosporin
und FK506 Nebenwirkungen beobachtet. Bei Cyclosporin wurde zum Beispiel über multiple
organische oder systemische Nebenwirkungen berichtet, wie Nephrotoxizität, Hepatotoxizität, Neuropathie,
Hypertonie, Hüftkopfnekrose,
Katarakt, Diabetes, akute Pankreatitis und Cytomegalovirus-Infektionskrankheit,
und seine Dosis ist daher beschränkt.
Insbesondere bei einer Nierentransplantation haben Nierenstörungen auf
der Grundlage von Nephrotoxizität
einen starken Einfluss auf die Nachsorge der transplantierten Niere,
und weiterhin ist in der frühen
Zeit nach der Transplantation eine Nierenstörung auf der Grundlage von
Nephrotoxizität
schwierig von einer Niereninsuffizienz aufgrund einer akuten Abstoßungsreaktion
nach der Transplantation zu unterscheiden. Daher ist es unerlässlich,
die Cyclosporinkonzentration im Blut ständig zu überwachen und die Dosis sorgfältig zu
steuern, und wenn Nebenwirkungen durch Cyclosporin erkannt werden,
sollte die Dosis des Cyclosporins reduziert oder seine Verabreichung
abgebrochen werden, und eine Nachtransplantationsbehandlung gegen
Nebenwirkungen ist notwendig. Weiterhin kann die Dosis des FK506
reduziert werden, da FK506 100 mal so aktiv ist wie Cyclosporin,
und daher können
die durch FK506 verursachten Nebenwirkungen im Vergleich zu Cyclosporin
reduziert werden. Als Nebenwirkungen, die durch FK506 verursacht
werden, wurde jedoch über
multiple organische oder systemische Nebenwirkungen berichtet, zum
Beispiel Nierenstörungen,
Appetitlosigkeit, Erbrechen, Pankreatitis, Hyperkaliämie und
Hyperurikämie.
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Es wird auch berichtet, dass Calciumkanal-Blocker
und Prostaglandin zur Prävention
von durch Cyclosporin verursachter Nephrotoxizität geeignet sind (Transplantation
51, 293–295,
1991; Clin. Nephrol. 25 [Suppl. 1], S89–S94, 1986). Diese Medikamente
haben jedoch eine unzureichende Wirkung und können multiple organische oder
systemische Nebenwirkungen nicht unterdrücken.
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Wie oben beschrieben, haben die zur
Zeit verwendeten Immunosuppressiva schwere multiple organische oder
systemische Nebenwirkungen, und daher gibt es viele Einschränkungen
in Bezug auf ihre Verwendung und Dosis, und es ist dringend ein
Medikament erforderlich, das die multiplen organischen oder systemischen
Nebenwirkungen der Immunosuppressiva merklich reduzieren kann.
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Der Erfinder hat intensive Studien über Medikamente
angestellt, die die Nebenwirkungen der Immunosuppressiva reduzieren
können,
um die oben genannten Probleme zu lösen. Als Ergebnis hat der Erfinder herausgefunden,
dass HGF die multiplen organischen oder systemischen Nebenwirkungen
der Immunosuppressiva merklich reduzieren kann.
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Insbesondere ist HGF ein Protein,
das der vorliegende Erfinder et al. als Faktor gefunden haben, der die
Proliferation von reifen Leberparenchymzellen in vitro verstärkt, und
aus dem Serum von Ratten mit regenerierender Leber gereinigt haben
(Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450, 1984). Weiterhin ist
es dem Erfinder et al. gelungen, HGF aus Rattenblutplättchen zu
isolieren (Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 6489, 1986; FEBS Letters,
22, 311, 1987), und sie haben seine partielle Aminosäuresequenz
bestimmt. Weiterhin ist es dem Erfinder et al. gelungen, HGF als
Protein zu erhalten, indem sie HGF-cDNA aus Mensch und Ratte klonierten,
wobei die gelöste
HGF-Aminosäuresequenz
verwendet wurde, und die cDNA durch Rekombinationstechnik in Tierzellen
einführten
(Human-HGF: Nature,
342, 440, 1989; Ratten-HGF: Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 3200, 1990).
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Von diesem HGF, das sich als Faktor
erwies, der Leberparenchymzellen spezifisch proliferiert, wurde bei
neueren Studien durch viele Forscher einschließlich des Erfinders bewiesen,
dass es in vivo verschiedene physiologische Aktivitäten zeigt
und auf eine Therapie der Verletzung verschiedener Organe und Gewebe
einwirkt. Es wird erwartet, dass HGF nicht nur ein Forschungsobjekt
ist, sondern auch ein Medikament, dass auf Therapeutika für Mensch
und Tier angewendet werden kann.
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Im Hinblick auf eine solche Wirkung
von HGF glaubt der Erfinder, dass HGF für die Reduktion von durch Immunosuppressiva
verursachten Nebenwirkungen geeignet sein muss, und hat die Wirkung
von HGF gegen Nebenwirkungen von Immunosuppressiva untersucht. Als
Ergebnis hat sich gezeigt, dass HGF durch Immunosuppressiva verursachte
multiple organische oder systemische Nebenwirkungen merklich reduzieren kann.
Dies ist eine neue Erkenntnis und eine bisher unbekannte Wirkung
von HGF, dass HGF bei der Reduktion von durch Immunosuppressiva
verursachten Nebenwirkungen effektiv ist.
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Die vorliegende Erfindung wurde auf
der Grundlage dieser Erkenntnisse fertiggestellt, und ein Ziel der vorliegenden
Erfindung besteht darin, ein Mittel bereitzustellen, um durch Immunosuppressiva
verursachte Nebenwirkungen zu lindern.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung gibt die
Verwendung von HGF zur Herstellung eines Medikaments zur Linderung
von Nebenwirkungen, die durch Cyclosporin oder FK506 verursacht
sind, an.
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Das oben genannte HGF kann aus menschlichem
oder tierischem Gewebe oder Blut stammen, oder es kann durch Gentechnik
hergestellt sein.
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Da Zellen, auf die HGF als wirksame
Komponente einwirkt, in einem äußerst weiten
Bereich von Organen und Geweben vorkommen, können durch Immunosuppressiva
verursachte multiple organische oder systemische Nebenwirkungen
reduziert werden.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnung
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1 ist
eine Graphik, die den Versuchsaufbau und die Überlebensrate von Mäusen zeigt.
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Beste Modi
zur Durchführung
der Erfindung
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Was HGF, den Wirkstoff der Erfindung,
betrifft, so kann jedes beliebige HGF in der Erfindung unabhängig von
den Herstellungsverfahren für
das HGF verwendet werden, solange es gereinigt wird, so dass es
zur Verwendung als Medikament geeignet ist. Zur Herstellung von
HGF sind viele Verfahren bekannt, und zum Beispiel kann HGF durch
Extraktion und Reinigung aus Organen wie Leber, Milz, Lunge, Knochenmark,
Hirn, Niere und Placenta, Blutzellen, wie Blutplättchen und Leucocyten, Plasma
und Serum von Säugern,
wie Ratte, Rind, Pferd und Schaf, erhalten werden. Außerdem ist
es möglich,
HGF durch Kultivierung von Primärkulturzellen
oder Zelllinien, die HGF produzieren, und anschließende Abtrennung
und Reinigung aus dem Kulturprodukt (z. B. Kulturüberstand,
kultivierte Zellen) zu erhalten. Weiterhin kann HGF durch ein gentechnisches
Verfahren erhalten werden, das das Klonieren des HGF codierenden
Gens mit einem geeigneten Vektor, das Einschleusen in eine geeignete
Wirtszelle unter Bildung einer Transformanten und das Abtrennen
des gewünschten
rekombinanten HGF aus dem Kulturüberstand
der Transformanten umfasst (z. B. Nature, 342, 440, 1989, Japanische
Offenlegungsschrift Nr. 111383/1993, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
163, 967, 1989). Die Wirtszelle unterliegt keiner speziellen Einschränkung, und
es können
verschiedene Wirtszellen verwendet werden, die herkömmlicherweise
bei gentechnischen Verfahren verwendet werden, wie zum Beispiel
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe, Fadenpilze und Pflanzen-
oder Tierzellen.
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Insbesondere besteht das Verfahren
des Extrahierens und Reinigens von HGF aus lebenden Geweben zum
Beispiel darin, einer Ratte intraperitoneal Tetrachlorkohlenstoff
zu verabreichen, die Leber aus der Ratte mit Hepatitis zu entnehmen,
sie zu mahlen und HGF mit der gewöhnlichen Proteinreinigungstechnik,
wie Gel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von S-Sepharose® und
Heparin-Sepharose® sowie HPLC, zu reinigen.
Weiterhin wird nach dem gentechnischen Verfahren das Gen, das die
Aminosäuresequenz
von humanem HGF codiert, in einem Vektor, wie Rinderpapillomvirus-DNA,
kloniert, wobei man einen Expressionsvektor erhält, und unter Verwendung dieses
Expressionsvektors werden Tierzellen, wie Eierstockzellen Chinesischer
Hamster (CHO-Zellen), Maus-C127-Zellen oder Affen-COS-Zellen, transformiert,
und HGF kann aus dem Kulturüberstand
der Transformanten erhalten werden.
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Was das so erhaltene HGF betrifft,
so gibt es die Möglichkeiten,
dass ein Teil der Aminosäuresequenz deletiert
oder durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt ist, dass eine
andere Aminosäuresequenz partiell
insertiert ist, dass 1, 2 oder mehr Aminosäuren an den C- und/oder N-Terminus
gebunden sind oder dass Zucker in ähnlicher Weise deletiert oder
substituiert sind. Solche HGF-Analoga
sind in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 130091/1992 sowie
in WO 90/10651 offenbart, und sie können ebenfalls in der Erfindung
verwendet werden.
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Das oben beschriebene HGF kann verschiedene
durch Immunosuppressiva verursachte multiple organische oder systemische
Nebenwirkungen reduzieren, wie in den später genannten Beispielen gezeigt
wird. Insbesondere werden Nephrotoxizität, Hepatotoxizität, Magen-Darm-Störungen (zum
Beispiel Appetitlosigkeit und Durchfall), Neuropathie (zum Beispiel
Schwächezustand,
Reizung und Konvulsion) sowie Verletzungen von Organen verhindert,
und die Erholung der Organe wird gefördert, und weiterhin kann die
Todesrate aufgrund von Nebenwirkungen reduziert werden.
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Zellen, auf die HGF einwirkt, kommen
in einem äußerst weiten
Bereich von Organen und Geweben vor, wie zum Beispiel Leberzellen,
Nierenkanälchen-Epithelzellen, Areolus-Epithel,
Magenschleimhautepithel, Blutgefäßendothel
und Hautkeratinocyten. Daher kann HGF verschiedene durch Immunosuppressiva
verursachte multiple organische oder systemische Nebenwirkungen
effektiv reduzieren.
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Ein weiterer wichtiger Punkt bei
der Betrachtung des praktischen Nutzens von HGF als Medizin ist, dass
nur geringe Nebenwirkungen festgestellt werden, wenn HGF Tieren
längere
Zeit verabreicht wird. Es ist auch ein gutes Merkmal, dass HGF das
Wachstum von Zellen nur in der Phase G1 fördert, das heißt, nur
die Zellen in der Wachstumsphase und keine Zellen in der Phase G0,
das heißt
in der stationären
Zeit. Es bedeutet, dass es das Wachstum und die Regeneration verletzter
Gewebe fördert,
auf intakte Gewebe aber überhaupt
nicht wirkt. Wenn HGF im Übermaß verabreicht
wird oder wenn HGF durch das Blut Stellen, die nicht krank sind,
erreicht, induziert es daher keine carcinogene Wirkung oder übermäßiges Wachstum
in normalen Geweben.
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Das Medikament der vorliegenden Erfindung
zur Linderung von Nebenwirkungen wird angewendet, um Nebenwirkungen
zu lindern, die durch die oben genannten unspezifischen Immunosuppressiva
oder spezifischen Immunosuppressiva bei Säugern (zum Beispiel Rind, Pferd,
Schwein, Schaf, Hund und Katze) einschließlich des Menschen verursacht
werden, und zeigt bemerkenswerte Wirkungen bei der Reduktion von Nebenwirkungen,
die insbesondere durch Cyclosporin und FK506 verursacht werden.
Da, wie oben beschrieben, die Wirkung von HGF einen weiten Bereich
von Organen und Geweben erreicht, kann eine multiple organische
oder systemische Linderung von Nebenwirkungen über die topische Linderung
von Nebenwirkungen hinaus erreicht werden. Das Medikament der vorliegenden
Erfindung zur Linderung von Nebenwirkungen kann in verschiedenen
Darreichungsformen (zum Beispiel Flüssigkeit, Tablette, Kapsel)
hergestellt werden, und im Allgemeinen wird es in Form einer Injektion,
die HGF als Wirkstoff allein oder zusammen mit einem üblichen Träger enthält, oder
in Form eines oralen Präparats
zusammen mit einem üblichen
Träger
hergestellt. Die Injektion kann nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt
werden, und zum Beispiel wird HGF in einem geeigneten Lösungsmittel
(zum Beispiel sterilisiertes Wasser, Pufferlösung, physiologische Kochsalzlösung) gelöst, filtriert
und sterilisiert und aseptisch in einem Behälter eingeschlossen. Der Gehalt
an HGF in der Injektion kann gewöhnlich
0,0002 bis 0,2% (w/v), vorzugsweise 0,001 bis 0,1% (w/v), betragen.
Als orales Präparat
wird es in verschiedenen Darreichungsformen hergestellt, einschließlich Tabletten,
Granulat, Feingranulat, Pulver, Weich- oder Hartkapsel, Flüssigkeit, Emulsion, Suspension
oder Sirup, und diese Präparate
können
nach dem herkömmlichen
Verfahren hergestellt werden. Der HGF-Gehalt in dem Präparat kann
je nach der Darreichungsform und der zu behandelnden Krankheit richtig
eingestellt werden.
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Bei der Herstellung des Präparats wird
vorzugsweise ein Stabilisator hinzugefügt, und Beispiele für den Stabilisator
sind Albumin, Globulin, Gelatine, Mannit, Glucose, Dextran und Ethylenglycol.
Außerdem
kann das Präparat
der Erfindung noch weitere Additive enthalten, die für das pharmazeutische
Präparat
notwendig sind, wie eine Trägersubstanz,
ein Auflösungshilfsmittel,
ein Antioxidans, ein schmerzlinderndes Mittel und ein Isotoniemittel.
Bei einem flüssigen
Präparat
ist es vorzuziehen, es im gefrorenen Zustand oder nach Entfernung
des Wassers durch ein Verfahren wie Gefriertrocknen zu lagern. Das
gefriergetrocknete Präparat
wird verwendet, indem man es vor der Verwendung wiederum in destilliertem
Wasser für
die Injektion und dergleichen löst.
Das Medikament der vorliegenden Erfindung zur Linderung von Nebenwirkungen
kann je nach der Darreichungsform über verschiedene Wege verabreicht
werden. Zum Beispiel kann die Injektion intravenös, intraarteriell, subkutan
oder intramuskulär
verabreicht werden. Die Dosis wird je nach den Symptomen, dem Alter
und Körpergewicht
des Patienten in geeigneter Weise angepasst, und im Allgemeinen
werden 0,01 mg bis 100 mg HGF einmal oder mehrmals am Tag verabreicht.
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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In der vorliegenden Erfindung kann
HGF als wirksame Komponente durch Immunosuppressiva verursachte
Nebenwirkungen merklich reduzieren. Da die Wirkung von HGF einen
weiten Bereich von Organen und Geweben erreicht, kann insbesondere
eine multiple organische oder systemische Linderung von Nebenwirkungen über die
topische Linderung von Nebenwirkungen hinaus erreicht werden. Daher
werden gemäß der vorliegenden
Erfindung Einschränkungen
der Verwendung und der Dosis von Immunosuppressiva aufgrund von
Nebenwirkungen reduziert, die Erfolgsrate von Organtransplantationen
und die Heilungsrate verschiedener Patienten, denen die Immunosuppressiva
verabreicht werden, kann verbessert werden, und gleichzeitig kann
die Belastung der Patienten merklich reduziert werden.
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Beispiel
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Die folgenden Testbeispiele und Beispiele
erläutern
die vorliegende Erfindung näher.
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Das humane rekombinante HGF (im folgenden
als hr-HGF bezeichnet), das hier in den Testbeispielen verwendet
wurde, wurde aus dem Kulturüberstand
von CHO-Zellen gereinigt, die durch Transfektion von humaner rekombinanter
HGF-cDNA erhalten
wurden (Nakamura et al., Nature 342, 440–443, 1989; Seki et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 172, 321–327,
1990).
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Testbeispiel 1
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Die lindernde Wirkung von HGF gegen
Nebenwirkungen von Cyclosporin wurde nach dem folgenden Verfahren
getestet.
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1. Verfahren
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Der Versuchsaufbau dieses Tests ist
in 1 gezeigt. Eine akute
organische Störung
wurde durch die tägliche
intraperitoneale Verabreichung von 100 mg/kg Cyclosporin A (im folgenden
als CsA bezeichnet) an ICR-Mäuse
vorbereitet. hr-HGF
(5 μg für ein Individuum
pro Dosis) oder eine physiologische Kochsalzlösung als Kontrolle (0,1 ml)
wurde 30 Minuten vor der ersten CsA-Verabreichung und dann alle
12 Stunden durch eine Schwanzvene verabreicht. In 1 sind die Zeiten für die Dosen der oben genannten
Medikamente durch Markierung mit schwarzen Dreiecken (CsA) und Markierung
mit weißen
Dreiecken (hr-HGF/physiologische Kochsalzlösung) angezeigt.
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Weiterhin wurden die Mäuse 60 Stunden
und 108 Stunden nach der ersten CsA-Verabreichung getötet und einer Blutuntersuchung,
pathologischen Gewebeuntersuchung und Untersuchung der Organregeneration unterzogen.
In 1 sind die Zeiten
der Tötung
durch Sternmarkierungen angezeigt.
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2. Ergebnisse
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(1) Überlebensrate
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Die Überlebensrate von Testmäusen ist
in der unteren Kurve von 1 gezeigt.
In der Kontrollgruppe überlebten
83,3% der Mäuse
3 Tage lang, und 50% der Mäuse überlebten
5 Tage lang. Dagegen überlebten in
der mit hr-HGF behandelten Gruppe alle Mäuse. Zwischen den Überlebensraten
dieser beiden Gruppen gab es einen signifikanten Unterschied mit
einem Signifikanzniveau von 5% im Logrank-Test.
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Auf diese Weise wurde gefunden, dass
die Verabreichung von hr-HGF die Überlebenszeit von Mäusen, die
eine durch CsA verursachte akute Organstörung hatten, merklich verlängerte.
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(2) Phänomen und Symptom
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Eine Zusammenfassung der Phänomene und
Symptome der Gruppe, der hr-HGF verabreicht wurde, und der Kontrollgruppe
sind in Tabelle 1 gezeigt. In der Kontrollgruppe wurde bei jedem
Beispiel ab dem ersten Tag nach der CsA-Verabreichung ein mittlerer bis schwerer
Durchfall erkannt. Und bei den meisten Mäusen wurden nach vorübergehender
Akrokinese Haaraufrichtung, Hypokinese und Schwächezustände gleichzeitig erkannt. Danach
fraßen
die Mäuse
nichts, und mehrere Mäuse
starben unter intensiven Konvulsionen.
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Andererseits war der Durchfall bei
der mit hr-HGF behandelten Gruppe mild im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Außerdem
wurden keine Schwächezustände, Haaraufrichtung
und Konvulsion erkannt, und die Mäuse fraßen gut, und der aktive Zustand
wurde aufrechterhalten.
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In Bezug auf die Änderung des Körpergewichts
wurde das Körpergewicht
in der Kontrollgruppe auf 93,6 ± 9,6% des Anfangskörpergewichts
reduziert, während
das Körpergewicht
in der mit hr-HGF behandelten Gruppe auf 102,5 ± 3,0% des Anfangskörpergewichts
stieg, und im ungepaarten Wilcoxon-Test gab es einen signifikanten
Unterschied mit einem Signifikanzniveau von 5%.
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Auf diese Weise zeigte sich, dass
die Verabreichung von hr-HGF die Phänomene und Symptome von Nebenwirkungen
durch CsA lindern konnte.
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Tabelle
1 (Phänomene
und Symptome
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(3) Blutuntersuchung
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In der Kontrollgruppe wurden leichte
Erhöhungen
des GPT-Werts (Glutamat-Pyruvat-Transaminase) und
des Gesamtbilirubinwerts erkannt, und es trat eine milde Leberstörung auf.
In Bezug auf den Blutharnstoffstickstoffwert und den Kreatininwert
in Blut wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen
den Werten der Kontrollgruppe und denen der mit hr-HGF behandelten
Gruppe erkannt.
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(4) Histopathologische
Beobachtung
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Wie oben beschrieben, wurde in Bezug
auf den Blutharnstoffstickstoffwert und den Kreatininwert in Blut
zwar kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe
und der mit hr-HGF behandelten Gruppe erkannt, doch wurde ein histologischer
Unterschied festgestellt. In der Kontrollgruppe wurde 3 Tage danach
bei jeder Maus eine schwache bis mittlere Vakuolisierung im weiten
Bereich in proximalen Tubuli erkannt, und eine solche Veränderung
wurde auch bei drei Mäusen
erkannt, die bis zu 5 Tagen danach überlebten.
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Andererseits wurde in der mit hr-HGF
behandelten Gruppe drei Tage danach bei vier Individuen von 5 Individuen
eine wenn auch schwache Vakuolisierung erkannt, und 5 Tage danach
war die Niere im Normalzustand, außer dass bei zwei Mäusen eine
histologisch leichte topische Nekrose der Nierenkanälchen erkannt wurde.
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Hier sind eine mittlere bis schwere
Vakuolisierung und eine Änderung
der Fokalzellen in Tabelle 2 gezeigt.
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Wie in der obigen Beschreibung und
im Ergebnis von Tabelle 2 gezeigt ist, zeigte sich, dass die Verabreichung
von hr-HGF die durch CsA verursachte organische Störung verhindern
konnte.
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Tabelle
2 (histopathologische Beobachtung von proximalen Tubuli)
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(5) Untersuchung der Organregeneration
(DNA-Synthese)
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Um zu untersuchen, ob HGF Regenerationen
von Niere und Leber förderte
oder nicht, wurde einer Maus BrdU (5-Brom-2'-desoxyuridin) injiziert, und anschließend wurden
die Niere und die Leber mit einem BrdU-spezifischen immunocytochemischen
Verfahren angefärbt,
und die DNA-Synthesen in der Niere und der Leber wurden gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
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Das Verhältnis der Zellen im DNA-Synthesezeitraum
(Markierungsindex) in der Niere war 3 Tage danach in der Kontrollgruppe
auf 0,4% gegenüber
0,14% und in der mit hr-HGF behandelten Gruppe auf 0,88% erhöht.
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In der Leber war der Markierungsindex
in der Kontrollgruppe 3 Tage danach nicht größer als 0,1%, und dieser Wert
war ungefähr
der gleiche wie bei einer normalen Maus. Andererseits stieg er in
der mit hr-HGF behandelten Gruppe auf 0,55%. Im ungepaarten Wilcoxon-Test
gab es einen signifikanten Unterschied mit einem Signifikanzniveau
von 5%.
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Auf diese Weise wurde bewiesen, dass
in der mit hr-HGF behandelten Gruppe eine Erhöhung des Markierungsindex beobachtet
wurde, die DNA-Synthese aktiv durchgeführt wurde, und die Regenerationen von
Niere und Leber gefördert
wurden.
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Hier wurde die Messung des Markierungsindex
nach einem Verfahren von Ishiki et al. durchgeführt (Hepatology 16, 1227–1235, 1992).
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Beispiel 1
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Eine Lösung, die 1 mg HGF, 1 g Mannit
und 10 mg Polysorbate 80 in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung enthielt,
wurde aseptisch hergestellt. In jedes Gläschen wurde 1 ml der Lösung gegossen
und lyophilisiert, und dann wurde das Gläschen verschlossen, so dass
man ein gefriergetrocknetes Präparat
erhielt.
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Beispiel 2
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Eine Lösung, die 1 mg HGF und 100
mg Humanserumalbumin in 100 ml 0,02 M Phosphatpuffer (der 0,15 M
NaCl und 0,01% Polysorbate 80, pH 7,4, enthielt) enthielt, wurde
aseptisch hergestellt. In jedes Gläschen wurde 1 ml der Lösung gegossen
und lyophilisiert, und dann wurde das Gläschen verschlossen, so dass man
ein gefriergetrocknetes Präparat
erhielt.
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Beispiel 3
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Eine Lösung, die 1 mg HGF, 2 g Sorbit,
2 g Glycin und 10 mg Polysorbate 80 in 100 ml destilliertem Wasser
für die
Injektion enthielt, wurde aseptisch hergestellt. In jedes Gläschen wurde
1 ml der Lösung
gegossen und lyophilisiert, und dann wurde das Gläschen verschlossen,
so dass man ein gefriergetrocknetes Präparat erhielt.
