WO2006077675A1 - 移植臓器の線維化抑制剤 - Google Patents

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WO2006077675A1
WO2006077675A1 PCT/JP2005/016653 JP2005016653W WO2006077675A1 WO 2006077675 A1 WO2006077675 A1 WO 2006077675A1 JP 2005016653 W JP2005016653 W JP 2005016653W WO 2006077675 A1 WO2006077675 A1 WO 2006077675A1
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WO
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peptide
dna
seq
amino acid
hgf
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PCT/JP2005/016653
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English (en)
French (fr)
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Jun Amano
Ken-Ichi Ito
Kazuhiro Yamaura
Kunio Matsumoto
Toshikazu Nakamura
Original Assignee
Kringle Pharma Inc.
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Publication date
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a drug containing a hepatocyte growth factor (hereinafter abbreviated as HGF) and suppressing fibrosis of a transplanted organ following long-term administration of an immunosuppressive agent.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the present invention also relates to an immunotolerant that includes a 5-amino acid-deficient HGF among HGFs and can acquire immune tolerance in organ transplant patients.
  • Organ transplantation has become established as a medical treatment when there is no treatment other than replacing an organ.
  • organ transplantation due to the increase in the number of engrafted organ transplants and the follow-up survey of patients after organ transplantation, it has become a problem that the transplanted organs gradually become fibrotic after many years after organ transplantation.
  • immunosuppressive agents are used to suppress rejection of grafts or transplanted tissues. Except for autotransplantation, immunosuppressants must be taken for a lifetime, and fibrosis is observed in transplanted organs if the immunosuppressant is taken continuously.
  • the causal relationship between the immunosuppressive agent and the fibrosis of the transplanted organ is not clear, there is no known means for suppressing the fibrosis of the transplanted organ under the administration of the immunosuppressant.
  • immunosuppressive agents have been essential for the establishment of grafts or transplanted tissues, and have to be taken for a lifetime.
  • cyclosporine and FK5 06 tacrolimus
  • FK5 06 tacrolimus
  • cyclosporine, etc. which is widely used for organ transplantation, has a low incidence of bone marrow suppression, leading to the development of serious infections associated with leukopenia This has the advantage of facilitating management after organ transplantation, and this effect has also made it possible to significantly improve the results of organ transplantation.
  • side effects are also observed in cyclosporine, etc., such as nephrotoxicity, hepatotoxicity, neuropathy, hypertension, femoral head necrosis, cataract, diabetes, acute splenitis, cytomegalo Sites that are different from the transplant site such as rovirus infection and systemic side effects have been reported.
  • HGF can reduce systemic side effects caused by such immunosuppressive agents (see Patent Document 1).
  • HGF is a protein that Nakamura et al. Found as a factor for proliferating mature liver parenchymal cells in vitro from regenerated liver rat serum (see Non-Patent Document 1).
  • Nakamura et al. also succeeded in isolating HGF from rat platelets (see Non-Patent Documents 2 and 3) and partially determined the amino acid sequence thereof.
  • HGF suppresses fibrosis of the transplanted organ.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 08-89869
  • Non-patent literature 1 Biochemical and biophysical research communations (Biochemical ana Biophysical Research Communications, 1984, 122, p. 1450-1459)
  • Non-Patent Document 2 Proceedings ⁇ Ob ⁇ The ⁇ National ⁇ Academy ⁇ Ob ⁇ Science ⁇ Ob United State of America ( Proc . Natl. Acad. Sci), 1986, 83rd ⁇ , p. 6489
  • Non-Patent Document 3 FEBS Letters, 1987, Vol. 22, p. 311
  • Non-Patent Document 4 Nature, 1989, No. 342, p. 440-443 Disclosure of the Invention
  • the present invention relates to a drug that suppresses progressive transplantation of a transplanted organ and induces organ failure in an organ transplant patient who has been administered an immunosuppressive agent for a long period of time.
  • the present invention also relates to an agent for obtaining immune tolerance (taransplantation tolerance) that allows a patient to acquire immune tolerance against organ rejection when a donor organ that provides an organ is provided to a recipient recipient.
  • immune tolerance taransplantation tolerance
  • the present inventors have shown that the administration of HGF suppresses fibrosis of the transplanted organ of the animal transplanted with the organ, and that the organ transplanted animal administered with the 5-amino acid deficient HGF gives the transplant to the transplanted organ. It was found that immune tolerance was acquired. Based on these findings, the present inventors have further studied and completed the present invention.
  • the present invention provides:
  • HGF is a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a peptide comprising substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, acting as HGF
  • the agent for inhibiting fibrosis of a transplanted organ according to the above (1) which is a peptide or a partial peptide thereof and acts as HGF,
  • a fibrosis inhibitor for transplanted organs according to (3) above which is a DNA that encodes a peptide that hybridizes under stringent conditions with a DNA that acts as HGF,
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 a peptide comprising substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and acting as HGF, or these
  • An immunological tolerance acquiring agent comprising a partial peptide and a peptide acting as HGF, and
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or DNA having the base sequence ability complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and Contain DNA encoding a peptide that acts as HGF
  • An immunological tolerance acquiring agent characterized by
  • the present invention also provides:
  • a method for suppressing fibrosis of a transplanted organ comprising administering HGF to a mammal transplanted into an organ to which an immunosuppressant is administered,
  • HGF is a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a peptide comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, acting as HGF
  • a method for suppressing fibrosis of a transplanted organ comprising administering a DNA encoding HGF to a mammal transplanted into an organ to which an immunosuppressant is administered,
  • a method for obtaining immune tolerance comprising administering a peptide that acts as HGF or a partial peptide thereof that acts as HGF,
  • a DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA represented by SEQ ID NO: 4 is stringent to a mammal to be transplanted into an organ.
  • a method for obtaining immune tolerance characterized by administering DNA encoding a peptide that hybridizes under conditions and acts as HGF,
  • the present invention also provides:
  • HGF is a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a peptide comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, acting as HGF
  • HGF is a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a peptide comprising substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and acting as HG F Or the use according to (20) above, which is a peptide that acts as HGF, which is a partial peptide thereof,
  • fibrosis refers to a pathological condition in which an extracellular matrix such as collagen fibers (collagen) accumulates excessively in the transplanted organ, and as a result, the transplanted organ becomes hard.
  • immune tolerance refers to the recipe of donor cells and tissues during organ transplantation. This refers to suppressing the destruction of the recipient's immune system so that it is not attacked by the recipient's immune system.
  • the transplanted organ fibrosis inhibitor of the present invention suppresses fibrosis of the transplanted organ in an organ transplanted animal that has been administered an immunosuppressive agent for a long time, so that the transplanted organ gradually becomes fibrotic. , Can eventually prevent organ failure.
  • the immunological tolerance acquiring agent of the present invention by administering the immunological tolerance acquiring agent of the present invention to an animal (patient) that is a force recipient immediately after transplanting a donor organ, immunity to the transplanted organ in the organ transplanted animal (patient) is achieved. Since tolerance can be obtained, rejection of the transplanted organ can be suppressed. Furthermore, an organ transplanted animal that has acquired immune tolerance against a donor by administration of the immunological tolerance acquiring agent of the present invention can induce a state without responsiveness to an immune response against a subsequent donor or donor organ. The dose of the suppressor can be reduced or administration of the immunosuppressant can be discontinued.
  • a tissue other than the donor's transplanted organ (for example, a tissue involved in immunity described later) is transplanted, and the immune tolerance-acquiring agent of the present invention is administered to the recipient.
  • Immunity tolerance can be acquired by the recipient.
  • the recipient's tissue (for example, a tissue involved in immunity described below) is transplanted into the donor and the immune tolerance acquiring agent of the present invention is administered before organ transplantation to allow the donor to acquire immune tolerance against the recipient. You can also.
  • rejection after organ transplantation The reaction can be suppressed or reduced. Suppression or reduction of the rejection allows the immunosuppressant to be stopped or the dose of the immunosuppressant to be reduced.
  • mammals such as humans are of course included in the present invention.
  • Figure 1 shows the pathology of the transplanted heart of a mouse surviving 60 days after heart transplantation (A) and the transplanted coronal shape. It is a figure which shows the ratio (B) of the fibrosis part area with respect to the total area of a section.
  • FIG. 2 is a diagram showing that the white hair of a BALBZc mouse has settled on the black hair of a C3HZHe mouse.
  • the HGF used in the present invention is a known substance, and any substance prepared by various methods can be used as long as it has been purified to the extent that it can be used as a medicine.
  • a method for producing HGF for example, primary cultured cells or cell lines that produce HGF can be cultured, separated from the culture supernatant, and purified to obtain the HGF.
  • the gene encoding HGF is incorporated into an appropriate vector by genetic engineering techniques, inserted into an appropriate host cell, and transformed, and the desired recombinant HGF is obtained from the culture supernatant of the transformant. You can also. (See, for example, JP-A-5-111382, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, No. 163, p. 967).
  • the above host cells are not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, such as colon bacteria, yeast or animal cells, can be used.
  • HGF thus obtained has substantially the same action as that of the natural HGF, one or more of its amino acid sequences [for example, several (for example, 1 to 8; hereinafter the same). ;)] Amino acid may be substituted, deleted or added, and the sugar chain may be similarly substituted, deleted or added.
  • Examples of such HGF include the following 5-amino acid deficient HGF.
  • “one or more amino acids are deleted, substituted or added” means that it occurs by a well-known technical method such as genetic engineering method, site-directed mutagenesis method, or the like It means that a sufficient number (1 to several) is deleted, substituted or added.
  • HGF substituted, deleted, or added to a sugar chain is, for example, HGF that has been added to natural HGF! ⁇
  • the amino acid sequence of the glycosylation site has been mutated, and some ⁇ has the amino acid sequence mutated so that the sugar chain is added to a site different from the natural glycosylation site.
  • a protein having at least about 80% homology with the amino acid sequence of HGF preferably a protein having about 90% or more homology, more preferably about 95% or more homology.
  • a protein that acts as HGF preferably a protein having about 90% or more homology, more preferably about 95% or more homology.
  • “Homologous” in the above amino acid sequences means the degree of coincidence of amino acid residues constituting the respective sequences between the sequences by comparing the primary structures of the proteins.
  • Examples of the HGF include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the HGF represented by SEQ ID NO: 2 is a 5-amino acid deficient HGF in which the 5th amino acid residue at positions 161 to 165 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been deleted.
  • the proteins having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 are both human-derived natural HGF, and have mitogenic activity, motogenic activity, etc. as HGF.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is at least about 80% or more, preferably about 90% or more More preferably, 1 to several amino acid residues are inserted or deleted from a peptide comprising an amino acid sequence having about 95% or more identity, such as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the amino acid to be inserted or substituted may be a non-natural amino acid other than the 20 amino acids encoded by the gene.
  • the unnatural amino acid may be any compound as long as it has an amino group and a carboxyl group, and examples thereof include ⁇ -aminobutyric acid.
  • peptides may be used alone or as a mixed peptide thereof.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (—CONH), or an ester (COOR).
  • R in the ester is, for example, a C alkyl group such as methyl, ethyl, ⁇ -propyl, isopyl pill, or ⁇ -butyl, such as cyclopentyl or cyclohexyl.
  • C cycloalkyl groups such as syl, eg C aryl such as phenol, a naphthyl
  • ferro-alkyl group such as benzyl, phenethyl, etc.
  • C aralkyl groups such as ⁇ -naphthyl-C alkyl groups such as butylmethyl
  • a bivalyloxymethyl group or the like generally used as an oral ester is used.
  • the present invention HGF force used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, and those having a carboxyl group amidized or esterified are also included in the HGF in the present invention.
  • the ester in this case for example, the C-terminal ester described above is used.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C acyl group such as a formyl group, a C alkanoyl group such as acetyl), and the like.
  • N-terminal side is living body
  • Daltamyl group cleaved in the molecule forms pyroglutamic acid, and substituents on the side chain of amino acids in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group, guazino group, etc. )
  • substituents on the side chain of amino acids in the molecule for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group, guazino group, etc.
  • suitable protecting groups for example, C alkano such as formyl, acetyl, etc.
  • a partial peptide of HGF used in the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as partial peptide).
  • the number of amino acids of the partial peptide is at least about 20 or more, preferably about 50 or more, more preferably about 100 or more amino acid sequences among the above-mentioned amino acid sequences of HGF. Etc. are preferred.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO_), an amide (—CON H), or an ester (one COOR).
  • partial peptides include
  • the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group
  • the N-terminal side is cleaved in vivo
  • the Gin is pyroglutamic acid
  • the amino acid in the molecule include those in which a substituent on the side chain is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • Examples of the salt of HGF or a partial peptide thereof used in the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid
  • succinic acid malic acid
  • the partial peptide of HGF or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving HGF with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, when the partial peptide or amino acid capable of constituting HGF is condensed with the remaining part and the product has a protecting group, the desired peptide can be produced by removing the protecting group.
  • Known condensation methods and protecting group removal include, for example, M.
  • a partial peptide of HGF can be purified and isolated by a combination of usual purification methods such as solvent extraction 'distillation' force chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
  • solvent extraction 'distillation' force chromatography liquid chromatography
  • recrystallization recrystallization and the like.
  • the present invention can also contain DNA encoding HGF as its active ingredient.
  • Examples of the DNA encoding HGF include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or DNA having a nucleotide sequence complementary to the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, and stringent DNA that hybridizes under various conditions, such as DNA encoding a protein having substantially the same quality as HGF, such as mitogenic activity, motogenic activity, and the like.
  • the DNA that hybridizes with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is, for example, the above-mentioned DNA as a probe, the “mouth-to-one” hybridization method, and the plaque “hybridization method”. It means DNA obtained by using the method or Southern blot hybridization method.
  • the DNA that hybridizes with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 above is about 80% or more, preferably about 80% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Examples thereof include DNA having a base sequence having a homology of 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • Hybridization can be performed by a known method such as molecular cloning, A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001: hereinafter, molecular cloning. -Abbreviated as 3rd edition.) In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA encoding the HGF of the present invention is not limited to the above, and as long as the expressed protein is a DNA having substantially the same action as HGF, it is used as the DNA encoding the HGF of the present invention. it can.
  • DNA encoding a partial peptide of HGF is included in the category of DNA encoding HGF of the present invention as long as it encodes a partial peptide having an action as HGF.
  • the DNA encoding the HGF partial peptide may be any DNA as long as it has a base sequence encoding the above partial peptide.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cell 'tissue, cDNA library derived from the above-mentioned cell' tissue, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, it can also be directly amplified by RT-PCR using an mRNA fraction prepared from the cell 'tissue described above.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention include (a) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, and (b) SEQ ID NO: 3 or 4 A DNA having a base sequence represented by a DNA having a base sequence that is complementary to a DNA having a partial base sequence and DNA that is hybridized under stringent conditions and has substantially the same activity as HGF. Examples thereof include DNA encoding a protein having DNA, or DNA having the partial base sequence of (a) or (b) above.
  • the DNA can be easily obtained by, for example, a usual hybridization method or PCR method, and the DNA is specifically obtained with reference to the basic document such as the Molecular Cloning. it can.
  • RNA encoding HGF or the partial peptide used in the present invention can also be used in the present invention as long as it can express HGF or the partial peptide by a reverse transcription enzyme.
  • the RNA can also be obtained by known means.
  • transplanted organ fibrosis inhibitor or immune tolerance-acquiring agent of the present invention can be applied to mammals (eg, rabbits, horses, pigs, hidges, nu, cats, etc.) in addition to humans.
  • mammals eg, rabbits, horses, pigs, hidges, nu, cats, etc.
  • transplanted organs to which the transplanted organ fibrosis inhibitor is applied examples include heart, kidney, liver, small intestine, spleen, skin, and cornea.
  • the heart is particularly preferable.
  • the immunological tolerance acquiring agent of the present invention can be applied to transplantation of hematopoietic cells and the like in addition to the transplanted organ.
  • the transplanted organ fibrosis inhibitor or immune tolerance-acquiring agent of the present invention is capable of taking various preparation forms, for example, liquids, solids, capsules, etc. Generally, only HGF or a conventional carrier
  • an injection, an inhalant, a suppository, or an oral preparation is used.
  • the injection may be either an aqueous injection or an oily injection.
  • an aqueous injection according to a known method, for example, an aqueous solvent (water for injection, purified water, etc.) is added to a pharmaceutically acceptable additive, for example, an isotonic agent (salt sodium, salt water).
  • solubilizers such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol etc.) or nonionic surfactants (polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50 etc.) can be used. Good.
  • oil-based solvent for example, sesame oil or soybean oil may be used, and benzyl benzoate or benzyl alcohol may be used as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule or vial.
  • liquid preparations such as injections are preferably stored after removing water by freezing or lyophilization.
  • the freeze-dried preparation is used by re-dissolving it with distilled water for injection at the time of use.
  • oral preparations include dosage forms such as tablets, granules, fine granules, powders, capsules, solutions, emulsions, suspensions or syrups. These preparations are produced by known methods.
  • pharmaceutically acceptable additives such as excipients (lactose, sucrose, glucose, starch, crystalline cellulose, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, stearic acid, Calcium stearate, etc.), disintegrating agents (dampening, carmellose sodium, calcium carbonate, etc.) or binders (starch glue solution, hydroxypropylcellulose solution, carmellose solution, gum arabic solution, gelatin solution, sodium alginate solution, etc.) It can be manufactured by using.
  • suitable coating agents for granules or tablets, suitable coating agents (gelatin, sucrose, gum arabic, carnaparou etc.) or enteric coating agents (eg cellulose acetate phthalate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropyl cellulose phthalate, carboxymethyl ester) are used. It may be coated with chilled cellulose or the like.
  • enteric coating agents eg cellulose acetate phthalate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropyl cellulose phthalate, carboxymethyl ester
  • It may be coated with chilled cellulose or the like.
  • known excipients such as magnesium stearate, calcium stearate, talc or light anhydrous key acid to improve fluidity and lubricity, crystals for pressurized fluidity Cellulose, lactose, or the above disintegrant can be selected as appropriate.
  • HGF is mixed evenly with the above excipients, or granulated or granulated or coated with an appropriate coating agent to fill it into capsules, with an appropriate capsule base (such as gelatin).
  • an appropriate capsule base such as gelatin.
  • Glycerin or sorbitol In addition, it may be encapsulated with a capsule base with increased plasticity.
  • These capsules may contain colorants or preservatives (sulfur dioxide, methyl noroxybenzoate, ethyl oxyraxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, etc.) as desired. it can.
  • Capsules may be enteric coating capsules, gastroresistant capsules or controlled release capsules in addition to normal capsules.
  • an ordinary capsule is filled with HGF coated with an enteric coating agent or HGF added with the above-mentioned appropriate excipient.
  • capsules coated with an enteric coating agent, or capsules molded using an enteric polymer as a base can be filled with HGF or HGF supplemented with the above-mentioned appropriate excipients.
  • a stabilizer sodium edetate, etc.
  • a suspending agent such as sodium arabic, carmellose, etc.
  • a corrigent simple syrup, glucose, etc.
  • a fragrance is appropriately selected.
  • suppositories can also be prepared by conventional methods on pharmaceutical preparations using conventional bases (for example, cacao butter, laurin butter, glyce gelatin, macrogol, witepsol, etc.).
  • bases for example, cacao butter, laurin butter, glyce gelatin, macrogol, witepsol, etc.
  • Inhalants can also be adjusted by conventional means in the preparation.
  • the additive may be any additive generally used in inhalable preparations.
  • the above-mentioned excipients, binding Agents, lubricants, preservatives, stabilizers, tonicity agents, pH adjusting agents or flavoring agents are used.
  • a propellant a liquefied gas propellant or a compressed gas is used.
  • liquefied gas propellant examples include fluorinated hydrocarbons (alternative fluorocarbons such as HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a, and HCFC142), liquefied petroleum, dimethyl ether, and the like.
  • fluorinated hydrocarbons alternative fluorocarbons such as HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a, and HCFC142
  • compressed gas examples include soluble gases (carbon dioxide, nitrous acid, nitrogen gas, etc.) or insoluble gases (nitrogen gas, etc.).
  • the HGF used in the present invention can be made into a sustained-release preparation together with the biodegradable polymer.
  • HGF can be expected to have effects such as maintaining blood concentration, reducing the number of doses, and reducing side effects, especially by making it a sustained-release preparation.
  • the sustained-release preparation is produced according to a known method described in, for example, Drug Delivery System, Chapter 3 (CMC, 1986). Can.
  • the biodegradable polymer used in the sustained-release preparation can be appropriately selected from the strengths of known biodegradable polymers. For example, polysaccharides such as starch, dextran or chitosan, collagen, gelatin, etc.
  • Protein polyglutamic acid, polylysine, polyleucine, polyalanine or polymethionine, etc., polyamino acid, polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid'glycolic acid polymer or copolymer, poly force prolatatone, poly j8-hydroxybutyric acid, polyapple Polyesters such as acid, polyanhydride or fumaric acid 'polyethylene glycol' butyl pyrrolidone copolymer, polyalkyl cyanoacrylic acid such as polyorthoester or polymethyl-aminoacrylic acid, polycarbonate such as polyethylene carbonate or polypropylene carbonate, etc. It is.
  • Polyester is preferable, and polylactic acid or lactic acid'glycolic acid polymer or copolymer is more preferable.
  • the composition ratio (lactic acid Z glycolic acid) (mol%) varies depending on the sustained release period, for example, the sustained release period is about 2 weeks to 3 months, It is preferably about 100ZO to 50Z50 for about 2 weeks to 1 month.
  • the weight average molecular weight of the polylactic acid-glycolic acid polymer or copolymer is generally about 5,000 to 20,000.
  • the polylactic acid-glycolic acid copolymer can be produced according to a known production method, for example, the production method described in JP-A-61-28521.
  • the blending ratio of the biodegradable polymer and HGF is not particularly limited. For example, ⁇ GF is about 0.01 to 30 wZw% with respect to the biodegradable polymer.
  • the HGF content in each of the above-mentioned preparations can be appropriately adjusted according to the dosage form, applicable disease, degree of disease, age, or the like.
  • HGF-encoding DNA can be achieved by conventional methods, for example, separate experimental medicine, basic gene therapy technology, Yodosha, 1996, separate experimental medicine, gene transfer & expression analysis experimental methods. , Yodosha, 1997, Gene Therapy Research Handbook edited by the Japanese Society of Gene Therapy, ENTS, 1999, and the like.
  • various known preparation forms suitable for each of the above administration forms can be used.
  • a microcapsule for example, host cells into which an expression plasmid containing DNA encoding HGF or DNA encoding HGF is introduced as a core substance, this is used as a known method (for example, coacervation method, interfacial weight).
  • Legal or double The fine particles having a diameter of about 1 to 500, and preferably about 100 to 400 m can be produced by covering with a coating material according to the method such as the sulphur method.
  • the coating material examples include carboxymethyl cellulose, sennellose acetate phthalate, ethyl cellulose, anoleic acid or its salt, gelatin, gelatin 'gum arabic, nitrocellulose, polybulal alcohol or hydroxypropyl cellulose, polylactic acid, polyglycol.
  • High film-forming properties such as acid, chitosan alginate, cellulose sulfate monopoly (dimethyldiallyl) monoammonium chloride, hydroxyethyl methacrylate methyl methacrylate, chitosan carboxymethyl cellulose, alginate-polylysine-alginate Molecule.
  • the DNA content in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but the daily dose is usually about 0.0001-10 mg as the DNA of the present invention, preferably Is about 0.001-10 mg.
  • DNA encoding HGF and HGF can be used independently, or both can be used in combination.
  • the immunosuppressive agent includes all of the immunosuppressive agents used for organ transplantation.
  • the immunosuppressive agent include cyclosporin-tacrolimus (FK 506); IL-2 antibody, which is a calciurin inhibitor.
  • FK 506 cyclosporin-tacrolimus
  • IL-2 antibody which is a calciurin inhibitor.
  • a certain zenapax, simlect TOR (target of rapamycin: a factor that constitutes a signal transduction pathway that regulates physiological functions related to cell growth according to nutritional state) inhibitors, etc .
  • TOR target of rapamycin: a factor that constitutes a signal transduction pathway that regulates physiological functions related to cell growth according to nutritional state
  • an antimetabolite For example, sellcept.
  • the transplanted organ fibrosis inhibitor of the present invention is particularly useful for the prevention, improvement or treatment of transplanted organ fibrosis caused by long-term administration of tacrolimus.
  • the transplanted organ fibrosis inhibitor or immune tolerance-acquiring agent of the present invention may appropriately contain other pharmaceutically active ingredients as long as they are not contrary to the purpose of the present invention.
  • Such pharmaceutically active ingredients include, for example, coronary vasodilators (amyl nitrite, isosorbide nitrate, -to-glycerin, trapidil, etc.),
  • 8 blockers oxprenolol, carteolol, bucmolol, bufetrol, propranolol) , Pindolol, etc.
  • calcium antagonists diiltiazem, verapamil, diphdidipine, dicardipine, etc.
  • peripheral circulatory disorders alprostadil alpha detas, caridinogenase, tocopherol, nicomol, etc.
  • antiarrhythmic drugs azimarin) , Pro-powered inamide, lidocaine, etc.
  • antihypertensive drugs
  • the transplanted organ fibrosis-suppressing agent of the present invention can be administered by an appropriate administration route according to the preparation form.
  • it can be administered in the form of an injection into veins, arteries, subcutaneous or intramuscular.
  • the dosage is appropriately adjusted according to the patient's symptoms, age or weight, etc.
  • HGF it is about 0.001 to 1000 mg, preferably about 0.01 to 100 mg per adult. It is appropriate to administer several divided doses.
  • the transplanted organ fibrosis inhibitor of the present invention may be administered after organ transplantation, at the same time as administration of the immunosuppressive agent, before administration of the immunosuppressive agent, or immediately after administration.
  • the transplanted organ fibrosis inhibitor of the present invention may begin to administer pre-organ transplant force.
  • the immunological tolerance acquiring agent of the present invention is administered to a recipient patient at the same time as organ transplantation or before organ transplantation, and ⁇ is administered to a recipient patient after organ transplantation. It should be administered for at least about 2 weeks after transplantation.
  • donor tissue different from the organ to be transplanted for example, when the transplanted organ is the heart, transplant the donor animal, such as lymphocytes, to the heart transplant recipient, together with the immunosuppressant.
  • the tolerogenic agent of the present invention may be administered for at least about 2 weeks.
  • the latter method allows recipients to be transplanted with donor organs that have acquired tolerance to the recipient. The rejection of transplanted organs can be suppressed.
  • the administration route, dosage and administration method of the immunological tolerance acquiring agent of the present invention are the same as the administration route, dosage and administration method of the transplanted organ fibrosis inhibitor of the present invention described above.
  • the “tissue” in this tissue refers to an organization involved in immunity, for example, bones, thymus, spleen, lymph nodes, tonsils, blood vessels, skin, intestine and other organs and tissues, or white blood cells, macrophages, lymphocytes (NKZ natural killer cells, TZ helper cells, TZ killer cells, B cells), immune cells such as rod-shaped cells, cyto force-in, or antibodies (immunoglobulin (Ig) G, IgA, IgM, IgD, IgE, etc.), Granulocytes (neutrophils, eosinophils, basophils) and the like.
  • HGF 5-amino acid deletion HGF (HGF represented by SEQ ID NO: 2) was used as HGF.
  • BALBZc mice and C3HZHe mice Two male mice (BALBZc mice and C3HZHe mice), 8 weeks old, weighing approximately 20 g, were used.
  • BALBZc mice were used as donors and anesthetized with a combination of ketamine (100 gZkg) and xylazine (10 g Zkg). Under the anesthesia, the heart of a BALBZc mouse was perfused to 7.5% by mass with lmL of physiological saline containing palin, and then the heart was removed to obtain a heart for transplantation.
  • C3H / He mice were anesthetized with a combination of ketamine (100 ⁇ g / kg) and xylazine (10 ⁇ g / kg), then opened, and the heart for transplantation, in which the BALBZc mouse force was also removed, was placed in the abdominal aorta and lower abdomen of C3HZHe mice. Ectopic transplantation was performed under the microscope into the vena cava.
  • Prograf injection solution 5 mg (containing tacrolimus 5 mg ZmL; manufactured by Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) was used.
  • tacrolimus was administered once a day for 27 gauge. It was administered subcutaneously for 60 days using a shooting needle.
  • animals in the HGF-administered group were treated with a solution (0.2 mL; HGF250 gZkg) of HGF lmg added with saline 20 mL every 12 hours (500 gZkgZ day) for 14 days, and for control animals.
  • Saline (0.2 mL) was similarly administered subcutaneously for 14 days using a 27 gauge needle every day.
  • the day of transplantation surgery was defined as day 0, and the transplanted heart was excised on the 14th day, and formalin-fixed and paraffin-embedded according to a standard method to prepare heart tissue sections. Tissue sections were stained with matsuson trichrome. The stained tissue image is taken into a computer with a microscope CCD camera (OLYMPUS), and the NIH image analysis software (free software) is used. The ratio of was calculated.
  • the fibrosis rate of the transplanted heart in the control animals was 22.3 ⁇ 7.7%, whereas in the HGF group, the fibrosis rate was suppressed to 15.6 ⁇ 1.3% (Fig. See 1;)).
  • BALBZc mice were used as donors, and the heart for transplantation of BALBZc mice was transplanted into the abdominal aorta and inferior vena cava of C3HZHe mice.
  • a solution 0.2 ⁇ ; ⁇ 250 ⁇ g / kg
  • 20 mL of physiological saline in HGFlmg was dissolved every 12 hours (500 / z gZkgZ day) for 14 days, using a 27-gauge needle every day.
  • Administered Sixty days after transplantation, the dorsal skin of surviving heart transplanted mice was excised, and skin lcm 2 collected from BALB / c mice or C57BLZ10 mice was transplanted.
  • C3HZHe mice that survived 60 days after heart transplantation were transplanted with the skin of the heart donor BALBZc mouse.
  • C3HZHe mice transplanted with skin the black hair of C3HZHe mice and the white hair skin of BALBZc mice, although no immunosuppressant was administered.
  • transplanted organ fibrosis inhibitor and immune tolerance acquiring agent of the present invention are useful in the fields of organ transplantation and regenerative medicine.

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Abstract

　本発明は肝細胞増殖因子又はそれをコードするＤＮＡ等を含有する製剤は、臓器移植後の移植臓器における線維化を抑制する。本発明は、臓器移植の分野、再生医療分野に有用である。  

Description

明 細 書
移植臓器の線維化抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は肝細胞増殖因子 (以下、 HGFと略記する。）を含有し、免疫抑制剤の長 期投与に伴い移植臓器が線維化するのを抑制する薬剤に関するものである。また、 本発明は HGFの中でも、特に 5アミノ酸欠損 HGFを含み、臓器移植患者が免疫耐 性を獲得し得る免疫寛容剤に関する。
背景技術
[0002] 臓器移植が、臓器を代替する以外に治療法がない場合の医療として定着してきて いる。しかし、近年、臓器移植の生着数の増加及び臓器移植後の患者の追跡調査 等により、臓器移植後長年の経過後に、移植された臓器が、徐々に線維化すること が問題となってきている。臓器移植において、移植片又は移植組織の拒絶反応の抑 制等に免疫抑制剤が使用されている。自己移植を除き免疫抑制剤は一生涯に渡り 服用を続けなければならず、移植臓器に線維化が見られるのは免疫抑制剤を服用し 続けて 、る場合である。免疫抑制剤と移植臓器の線維化との因果関係は明らかでは ないが、免疫抑制剤投与下における移植臓器の線維化を抑制する手段は知られて いない。
[0003] 従来から、免疫抑制剤は、移植片又は移植組織の定着には、必須であり、一生涯 に渡り服用を続ける必要がある。前記免疫抑制剤において、シクロスポリン及び FK5 06 (タクロリムス)は強い免疫抑制作用を有し、腎臓、肝臓、心臓、脾臓等の臓器移 植後における移植片拒絶反応の抑制にすばらしい成績を収めており、注目されてい る薬剤である。臓器移植後の急性拒絶反応の発症率を著しく低減できることから、臓 器移植の際に汎用されるシクロスポリン等は、骨髄抑制の出現頻度が少ないため、 白血球減少症に伴う重篤な感染症の発症を防止でき、臓器移植後の管理が容易に なるという利点を有し、この効果からも臓器移植の成績を著しく向上させることが可能 になった。しかし、シクロスポリン等においても副作用は認められ、例えば、腎毒性、 肝毒性、神経障害、高血圧、大腿骨頭壊死、白内障、糖尿病、急性脾炎、サイトメガ ロウィルス感染症等移植部位とは異なる部位や全身的な副作用が報告されて 、る。 HGFは、このような免疫抑制剤による全身的な副作用を軽減し得ることが知られてい る (特許文献 1参照)。 HGFは、本発明者の中村らが再生肝ラット血清中から成熟肝 実質細胞を in vitroで増殖させる因子として見出した蛋白質である（非特許文献 1参 照)。中村らは更に、 HGFをラット血小板より単離することに成功し (非特許文献 2, 3 参照）、そのアミノ酸配列を一部決定した。さらに、中村らは解明された HGFアミノ酸 配列をもとにヒト及びラット由来の HGFcDNAクロー-ングを行い、この cDNAを動 物細胞に糸且換え技術により導入して HGFを蛋白質として得ることに成功した (例えば 、非特許文献 4参照)。
しかし、上記文献の 、ずれにも HGFが移植臓器の線維化を抑制すると 、うことに ついての言及はない。
特許文献 1：特開平 08— 89869号公報
非特許文献 1：バイオケミカル ·アンド ·バイオフィジカル ·リサーチ ·コミュー-ケーショ ンズ (Biochemical ana Biophysical Research Communicationsノ、 1984年 、第 122卷、 p. 1450- 1459
非特許文献 2：プロシーディングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス •ォブ.ユナイテッド.ステート.ォブ.アメリカ（proc. Natl. Acad. Sci)、 1986年、第 83卷、 p. 6489
非特許文献 3 :エフ'ィ一'ビ一'エス'レターズ (FEBS Letters) , 1987年、第 22卷 、 p. 311
非特許文献 4 :ネイチヤー（Nature) , 1989年、第 342卷、 p. 440— 443 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、免疫抑制剤を長期投与している臓器移植患者において、移植臓器が 漸次線維化し、臓器不全を誘発するのを抑制する薬剤に関するものである。また、本 発明は、臓器を提供するドナーの臓器を患者であるレシピエントに提供した時に、臓 器拒絶反応に対する免疫寛容を患者が獲得し得る免疫寛容 (taransplantation t olerance)獲得剤に関する。 課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、 HGFの投与により臓器移植された動物の移植臓器の線維化が抑 制されること、また、 5アミノ酸欠損 HGFを投与された臓器移植動物が移植臓器に対 し免疫寛容を獲得することを知見した。本発明者らはこれら知見に基づきさらに研究 を進め、本発明を完成した。
[0006] すなわち、本発明は、
(1) HGFを含有することを特徴とする、免疫抑制剤投与に伴う移植臓器の線維化 抑制剤、
(2) HGFが、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 1 又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであつ て HGFとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用 するペプチドであることを特徴とする上記（1)に記載の移植臓器の線維化抑制剤、
(3) HGFをコードする DNAを含有することを特徴とする免疫抑制剤投与に伴う移 植臓器の線維化抑制剤、
(4) HGFをコードする DNA力 配列番号 3又は 4で表される塩基配列からなる DN A、ある 、は配列番号 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配 列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作用 するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする上記（3)に記載の移植臓器の 線維化抑制剤、
(5) 免疫抑制剤が、タクロリムスであることを特徴とする上記（1)〜 (4)のいずれかに 記載の線維化抑制剤、
(6) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって HGFとして作用す るペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用するペプチドを含有 することを特徴とする免疫寛容獲得剤、及び
(7) 配列番号 4で表される塩基配列からなる DNA又は配列番号 4で表される塩基 配列からなる DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件下でノ、 イブリダィズし、かつ HGFとして作用するペプチドをコードする DNAを含有すること を特徴とする免疫寛容獲得剤、
に関する。
[0007] また、本発明は、
(8) 免疫抑制剤が投与されている臓器移植された哺乳動物に HGFを投与すること を特徴とする、移植臓器の線維化を抑制する方法、
(9) HGFが、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 1 又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであつ て HGFとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用 するペプチドであることを特徴とする上記（8)に記載の方法、
(10) 免疫抑制剤が投与されている臓器移植された哺乳動物に HGFをコードする DNAを投与することを特徴とする、移植臓器の線維化を抑制する方法、
(11) HGFをコードする DNA力 配列番号 3又は 4で表される塩基配列からなる D NA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基 配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作 用するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする上記（10)に記載の方法、
(12) 免疫抑制剤が、タクロリムスであることを特徴とする上記（8)〜（11)のいずれ かに記載の方法、
(13) 臓器移植される哺乳動物に、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むぺプ チド、配列番号 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むぺプ チドであって HGFとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGF として作用するペプチドを投与することを特徴とする、免疫寛容の獲得方法、
(14) 臓器移植される哺乳動物に、配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNA、 あるいは配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作用するぺプチ ドをコードする DNAを投与することを特徴とする、免疫寛容の獲得方法、
に関する。
[0008] また、本発明は、
(15) 免疫抑制剤投与に伴う移植臓器の線維化を抑制する医薬を製造するための HGFの使用、
(16) HGFが、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであつ て HGFとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用 するペプチドであることを特徴とする上記（15)に記載の使用、
(17) 免疫抑制剤投与に伴う移植臓器の線維化を抑制する医薬を製造するための HGFをコードする DNAの使用、
(18) HGFをコードする DNA力 配列番号 3又は 4で表される塩基配列からなる D NA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基 配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作 用するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする上記（17)に記載の使用、
(19) 免疫抑制剤が、タクロリムスであることを特徴とする上記（15)〜（18)のいずれ かに記載の使用、
(20) 移植臓器に対する免疫寛容を獲得する医薬を製造するための HGFの使用、
(21) HGFが、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって HG Fとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用するぺ プチドであることを特徴とする上記（20)に記載の使用、
(22) 移植臓器に対する免疫寛容を獲得する医薬を製造するための HGFをコード する DNAの使用、及び
(23) HGFをコードする DNA力 配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA、あ るいは配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列力 なる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作用するペプチド をコードする DNAであることを特徴とする上記（22)に記載の使用、
に関する。
なお、本発明において、線維化とは、移植臓器に膠原線維 (コラーゲン)等の細胞 外マトリックス（extracellular matrix)が過剰に蓄積し、その結果、移植臓器が硬く なる病態をいう。また、免疫寛容とは、臓器移植時にドナーの細胞、組織等がレシピ ェントの免疫系に攻撃されないよう、レシピエントの免疫系の破壊的行為を抑制する ことをいう。
発明の効果
[0010] 本発明の移植臓器の線維化抑制剤は、免疫抑制剤を長期に投与されている臓器 移植動物において、移植された臓器の線維化を抑制するので、移植臓器が漸次線 維化され、終局的に臓器不全に陥るのを防止できる。
また、ドナーの臓器を移植された直後力 レシピエントである動物 (患者）に本発明 の免疫寛容獲得剤を投与することにより、臓器移植された動物 (患者）において該移 植された臓器に対する免疫寛容を獲得できるので、該移植臓器に対する拒絶反応を 抑制し得る。さらに、本発明の免疫寛容獲得剤の投与によりドナーに対する免疫寛 容を獲得した臓器移植動物は、その後のドナー又はドナー臓器に対する免疫応答 に対して反応性を示さな 、状態を誘導できるので、免疫抑制剤の投与量を減少又は 、免疫抑制剤の投与を中止し得る。また、臓器移植前に、ドナーの移植臓器以外の 組織 (例えば、後記する免疫に関与する組織等)を移植するとともに本発明の免疫寛 容獲得剤をレシピエントに投与し、ドナーの移植臓器に対する免疫寛容をレシピエン トに獲得させることができる。あるいは、ドナーにレシピエントの組織 (例えば、後記す る免疫に関与する組織等)を移植するとともに本発明の免疫寛容獲得剤を臓器移植 前に投与し、ドナーにレシピエントに対する免疫寛容を獲得させることもできる。前記 いずれかの方法により免疫寛容を獲得させることにより、従来ドナーとレシピエントと の組織適合抗原が一致せず、移植が不可能であったドナーとレシピエントとの臓器 の移植も可能となり得る。また、ドナーに対する免疫寛容を獲得したレシピエントにド ナ一の臓器を移植、又はレシピエントの免疫寛容を獲得したドナーの臓器を移植さ れたレシピエントにお 、ては、臓器移植後の拒絶反応を抑制又は減少させることがで きる。前記拒絶反応の抑制又は減少は、免疫抑制剤の中止又は免疫抑制剤の投与 量の減少を可能とする。なお、本発明における動物はもちろんヒト等の哺乳動物を含 む。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は心臓移植後 60日生存したマウスの移植心臓の病理像 (A)と移植心冠状 断の総面積に対する線維化部面積の比率 (B)を示す図である。
[図 2]図 2は C3HZHeマウスの黒毛に、 BALBZcマウスの白毛の皮膚が定着したこ とを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される HGFは公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製さ れたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。 HGFの製造 方法としては、例えば HGFを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上 清等から分離、精製して該 HGFを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法に より HGFをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞 に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え HGFを 得ることもできる。（例えば、特開平 5— 111382号公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989年、第 163卷， p. 967等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定さ れず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸 菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られた HGFは、天 然型 HGFと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数個 〔例えば、数個（例えば 1〜8個；以下同様である。；)〕のアミノ酸が置換、欠失若しくは 付加されていてもよぐまた同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。 そのような HGFとして、下記する 5アミノ酸欠損型 HGFを挙げることができる。ここで、 アミノ酸配列について、「1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは 、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、 又は天然に生じうる程度の数（1〜数個）が、欠失、置換若しくは付加等されているこ とを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加した HGFとは、例えば天然の HGFに 付加して!/ヽる糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させた HGF、また糖鎖が付加しな!ヽ 様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、ある ヽは天然の糖鎖付加 部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をい さらに、 HGFのアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上の相同性を有する蛋白質、好 ましくは約 90%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 95%以上の相同性 を有する蛋白質であって、かつ HGFとして作用する蛋白質も含まれる。上記アミノ酸 配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配 列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
[0013] 上記 HGFとしては、例えば配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列等が挙げられ る。配列番号 2で表される HGFは、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 161〜165 番目の 5個のアミノ酸残基が欠失している 5アミノ酸欠損型 HGFである。配列番号 1 又は 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然 HGFであ つて、 HGFとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む ペプチドとしては、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上 、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列 を含むペプチド、例えば配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列から、 1〜数個のァ ミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、 1〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ 酸残基と置換させたアミノ酸配列又は 1〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸 配列等を含むペプチドであって HGFとして作用するペプチドであることが好ましい。 挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる 20種類のァ ミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、ァミノ基とカルボキシ ル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えば γ—ァミノ酪酸等が挙げられ る。
これらのペプチドは、単独であっても、これらの混合ペプチドであってもよい。
[0014] 本発明に用いられる HGFは、 C末端がカルボキシル基（― COOH)、カルボキシレ ート（― COO-)、アミド（― CONH )又はエステル（ COOR)のいずれであってもよ
2
い。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 η—プロピル、イソプ 口ピルもしくは η—ブチル等の C アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキ
1-6
シル等の C シクロアルキル基、例えば、フエ-ル、 a ナフチル等の C ァリー
3-8 6-12 ル基、例えば、ベンジル、フエネチル等のフエ-ルー C アルキル基もしくは aーナ
1-2
フチルメチル等の α ナフチルー C アルキル基等の C ァラルキル基のほか、
1-2 7-14
経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基等が用いられる。本発明 で用いられる HGF力 C末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有し て 、る場合、カルボキシル基がアミドィ匕又はエステルイ匕されて 、るものも本発明にお ける HGFに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステ ル等が用いられる。さらに、本発明に用いられる HGFには、上記した蛋白質におい て、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル等の C アルカノィル基等の C ァシル基等)で保護されているもの、 N末端側が生体
2-6 1-6
内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基 (例えば、— OH、— SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基 、グァ-ジノ基等）が適当な保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル等の C アルカノ
2-6 ィル基等の c ァシル基等)で保護されて 、るもの、ある 、は糖鎖が結合した 、わゆ
1-6
る糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
[0015] 本発明で用いる HGFの部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある。
)としては、上記した HGFの部分ペプチドであればいずれのものであってもよい。本 発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した HGFの構成アミノ酸配列の うち少なくとも約 20個以上、好ましくは約 50個以上、より好ましくは約 100個以上のァ ミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。本発明の部分ペプチドにおいては、 C 末端がカルボキシル基（— COOH)、カルボキシレート（— COO_)、アミド（— CON H )又はエステル（一COOR)のいずれであってもよい。さらに、部分ペプチドには、
2
上記した HGFと同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されて いるもの、 N端側が生体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸ィ匕したもの、分 子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
[0016] 本発明に用いられる HGF又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生 理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫 酸）との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン 酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベン ゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。 [0017] 本発明に用いられる HGFの部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成 法に従って、あるいは HGFを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造する ことができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいず れでも良い。すなわち、 HGFを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のぺ プチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、 M. Bodanszky 及び M. A. Ondetti、ペプチド ·シンセシス（Peptide Synthesis ) , Interscience Publisners, New York (19o6年)、； schroeder及び Luebke、 ザ ·ペプチド（The Peptide) , Academic Press, NewYork(1965年）等に記 載された方法が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出 '蒸留'力 ラムクロマトグラフィー.液体クロマトグラフィー.再結晶等を組み合わせて HGFの部 分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体 である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得 られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
[0018] 本発明は、 HGFをコードする DNAをその有効成分として含有することもできる。
HGFをコードする DNAとしては、例えば、配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列 を有する DNA、又は配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAと相補 的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAで あって、 HGFと実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有 する蛋白質をコードする DNA等が挙げられる。なお、配列番号 3又は 4で表わされる 塩基配列を有する DNAとハイブリダィズする DNAとは、例えば上記 DNAをプロ一 ブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法ある いはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意 味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定ィ匕したフィルター を用いて、約 0. 7〜1. 0M程度の塩化ナトリウム存在下、約 65°C程度でノヽイブリダィ ゼーシヨンを行った後、約 0. 1〜2倍程度の濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液 の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムよりなる。）を用い、 約 65°C程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAを挙げること ができる。
[0019] 上記の配列番号 3又は 4で表される塩基配列を有する DNAとハイブリダィズする D NAとして具体的には、配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列と約 80%以上、好ま しくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を有する DNA等が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法、例えば、モレキュラー 'クローニンク (Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001 :以下、モレ キユラ一'クロー-ング第 3版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。ま た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って 行うことができる。
[0020] さらに、本発明の HGFをコードする DNAは上記に限定されず、発現するタンパク 質が HGFと実質的に同じ作用を有する DNAである限り、本発明の HGFをコードす る DNAとして使用できる。例えば HGFの部分ペプチドをコードする DNA等も HGF としての作用を有する部分ペプチドをコードするものであれば、本発明の HGFをコー ドする DNAの範疇に含まれる。 HGFの部分ペプチドをコードする DNAとしては、上 記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有する DNAであればいかなるものであ つてもよい。また、上記の HGFをコードする DNAと同様に、ゲノム DNA、ゲノム DN Aライブラリー、上記した細胞'組織由来の cDNA、上記した細胞'組織由来の cDN Aライブラリー、合成 DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バ クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上 記した細胞'組織より mRNA画分を調製したものを用いて、直接 RT— PCR法によつ て増幅することもできる。具体的な本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては 、例えば、（a)配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配 列を有する DNA、 (b)配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAの部 分塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条 件下でノ、イブリダィズする DNAであって、 HGFと実質的に同質の活性を有する蛋白 質をコードする DNA、又は上記 (a)或 、は (b)の部分塩基配列を有する DNA等が 挙げられる。 該 DNAは、例えば通常のハイブリダィゼーシヨン法や PCR法等により容易に得るこ とができ、該 DNAの取得は具体的には前記 Molecular Cloning等の基本書等を 参考にして行うことができる。
[0021] また、本発明で用いられる HGF又は部分ペプチドをコードする RNAも、逆転写酵 素により HGF又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用い ることができ、本発明の範囲内である。また該 RNAも公知の手段により得ることができ る。
[0022] 本発明の移植臓器の線維化抑制剤又は免疫寛容獲得剤は、ヒトの他、哺乳動物（ 例えば、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ等）に適用できる。
また、移植臓器の線維化抑制剤が適用される移植臓器としては、心臓、腎臓、肝臓 、小腸、脾臓、皮膚又は角膜が挙げられる。とりわけ心臓が好ましい。また、本発明の 免疫寛容獲得剤は、前記移植臓器の他、造血細胞等の移植にも適用ができる。
[0023] 本発明の移植臓器の線維化抑制剤又は免疫寛容獲得剤は、種々の製剤形態、例 えば液剤、固形剤又はカプセル剤等をとりうる力 一般的には HGFのみ又はそれと 慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされる。上記注射剤は、水性 注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に 従って、例えば、水性溶媒 (注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例 えば等張化剤 (塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、グリセリン、マン-トール、ソルビトール 、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩 衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝 液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤 (パラォキシ安息香酸メチル、パラ ォキシ安息香酸ェチル、ノ ラオキシ安息香酸プロピル、ノ ラオキシ安息香酸ブチル 、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ-ゥム、デヒドロ酢酸ナトリ ゥム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシェチルセルロース、ヒ ドロキシプロピルセルロース、ポリビュルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安 定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナト リウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又は pH調整剤（塩酸、水酸 化ナトリウム、リン酸、酢酸等)などを適宜添加した溶液に、 HGFを溶解した後、フィ ルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製すること ができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等）、ポリアルコー ル (プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソ ルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等）などを使用してもよい。油性注 射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解 補助剤として安息香酸ベンジル又はべンジルアルコール等を使用してもよ ヽ。調製さ れた注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。注射剤中の HGF 含量 ίま、通常約 0. 0002〜0. 2w/v0/0程度、好ましく ίま約 0. 001〜0. lw/v0/0程 度に調整される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水 分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加 え、再溶解して使用される。
また、経口剤としては、例えば錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳 剤、懸濁剤又はシロップ剤等の剤形が挙げられる。これら製剤は公知の方法によつ て製造される。顆粒又は錠剤として製造する場合には、医薬上許容される添加剤、 例えば賦形剤 (乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース等）、滑沢剤 (ステ アリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム等）、崩壊剤（デ ンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等)又は結合剤（デンプン糊液、ヒドロ キシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸 ナトリウム液等)などを用いることにより製造することができる。また、顆粒剤又は錠剤 には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナパロウ等)又は腸 溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒド ロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルェチルセルロース等）などで 剤皮を施してもよい。カプセル剤として製造する場合には、公知の賦形剤、例えば流 動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム 、タルク又は軽質無水ケィ酸、加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖、あるい は上記崩壊剤等を適宜選択できる。 HGFは前記賦形剤と共に均等に混和し、又は 粒状化し、若しくは粒状ィ匕としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施し、カプセル に充填する力、適当なカプセル基剤（ゼラチン等）にグリセリン又はソルビトール等を 加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよ ヽ。これらカプセル剤には所 望に応じて、着色剤又は保存剤（二酸化イオウ、ノ ラオキシ安息香酸メチル、ノラオ キシ安息香酸ェチル、パラォキシ安息香酸プロピル、パラォキシ安息香酸ブチル等） などをカ卩えることができる。カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティン グカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤又は放出制御カプセル剤とすることもできる。 腸溶性カプセル剤とする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした HGF又は H GFに上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填する。あるいは、 腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル、若しくは腸溶性高分子を基剤とし て成形したカプセルに HGF又は HGFに上記の適当な賦形剤を添カ卩したものを充填 することができる。シロップ剤として製造する場合には、例えば安定剤（ェデト酸ナトリ ゥム等）、懸濁化剤 (アラビアゴム、カルメロース等）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖等） 又は芳香剤等を適宜選択して使用することができる。
[0025] また、坐剤も慣用の基剤（例えばカカオ脂、ラウリン脂、グリセ口ゼラチン、マクロゴー ル、ウイテツプゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。
[0026] また、吸入剤も製剤上の常套手段によって調整することができる。吸入剤として製 造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であれば いずれのものであってもよぐ例えば、噴射剤の他、上記した賦形剤、結合剤、滑沢 剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、 PH調整剤又は矯味剤 (タエン酸、メントール、グ リチルリチンアンモ-ゥム塩、グリシン、香料等)などが用いられる。噴射剤としては、 液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フ ッ化炭化水素（HCFC22、 HCFC- 123, HCFC—134a、 HCFC142等の代替フ ロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば 、可溶性ガス (炭酸ガス、亜酸ィ匕窒素ガス等)又は不溶性ガス（窒素ガス等)などが挙 げられる。
[0027] また、本発明で用いられる HGFは、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤とする こともできる。 HGFは特に徐放性製剤とすることにより、血中濃度の維持、投薬回数 の低減及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は例えばドラッグデ リバリーシステム、第 3章 (CMC, 1986年)等に記載の公知の方法に従って製造す ることができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内 分解性高分子のな力から適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキト サン等の多糖類、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、 ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチォニン等のポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコー ル酸、乳酸'グリコール酸重合体又は共重合体、ポリ力プロラタトン、ポリ j8—ヒドロ キシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸'ポリエチレングリコール 'ビュル ピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエステル又はポリメチルー aーシァ ノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカーボネート又はポリプ ロピレンカーボネート等のポリカーボネート等である。好ましくはポリエステル、更に好 ましくはポリ乳酸又は乳酸 'グリコール酸重合体又は共重合体である。ポリ乳酸 ダリ コール酸重合体又は共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸 Zグリコール酸）（ モル％)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約 2週間ないし 3力月、好 ましくは約 2週間ないし 1力月の場合には、約 100ZOないし 50Z50である。該ポリ乳 酸ーグリコール酸重合体又は共重合体の重量平均分子量は、一般的には約 5, 000 ないし 20, 000である。ポリ乳酸—グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば 特開昭 61— 28521号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分 子と HGFの配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、 Η GFが約 0. 01〜30wZw%程度である。
[0028] 上記した各製剤中の HGF含量は、剤形、適用疾患、疾患の程度又は年齢等に応 じて適宜調整することができる。
[0029] HGFをコードする DNAを患者に投与することは、常法、例えば別冊実験医学，遺 伝子治療の基礎技術，羊土社， 1996、別冊実験医学，遺伝子導入 &発現解析実 験法，羊土社， 1997、 日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、 ェヌ'ティー'エス， 1999等に記載の方法に従って、行うことができる。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態をとり得る ことができる。例えば、マイクロカプセル剤とする場合、例えば HGFをコードする DN A若しくは HGFをコードする DNAを含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯 物質としてこれを公知の方法 (例えばコアセルべーシヨン法、界面重合法又は二重ノ ズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約 1〜500、好ましくは約 100〜40 0 mの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセ ルロース、セノレロースアセテートフタレート、ェチルセルロース、ァノレギン酸又はその 塩、ゼラチン、ゼラチン 'アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビュルアルコール又はヒ ドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン アルギン酸塩、 硫酸セルロース一ポリ（ジメチルジァリル）一アンモ -ゥムクロライド、ヒドロキシ一ェチ ルメタクリレートメチルメタタリレート、キトサン カルボキシメチルーセルロース、アル ギン酸塩—ポリリジン—アルギン酸塩等の膜形成性高分子が挙げられる。
製剤中の DNAの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節 することができるが、 1日の投与量として通常、本発明の DNAとして約 0. 0001 - 10 Omg、好ましくは約 0. 001— 10mgである。
また、 HGFをコードする DNAと HGFは独立して使用することもできれば、両者を併 用して用いることもできる。
[0030] 免疫抑制剤は臓器移植に使用される免疫抑制剤のすべてが含まれる、免疫抑制 剤としては例えば、カルシ-ユーリン阻害剤である、シクロスポリンゃタクロリムス（FK 506) ;IL—2抗体であるゼナパックスや、シムレクト； TOR(target of rapamycin: 栄養状態に応じて細胞成長に関わる生理機能を調節するための情報伝達経路を構 成する因子）阻害剤であるラバマイシン等;又は代謝拮抗薬であるセルセプト等が挙 げられる。本発明の移植臓器の線維化抑制剤は、とりわけタクロリムスの長期投与に より発生する移植臓器の線維化の予防、改善又は治療に有用である。
[0031] また、本発明の移植臓器の線維化抑制剤又は免疫寛容獲得剤には、本発明の目 的に反しない限り、その他の医薬活性成分を適宜含有させてもよい。このような医薬 活性成分としては、例えば、冠状血管拡張薬 (亜硝酸ァミル、硝酸イソソルビド、 -ト 口グリセリン、トラピジル等）、 |8遮断薬 (オクスプレノロール、カルテォロール、ブクモ ロール、ブフエトロール、プロプラノロール、ピンドロール等）、カルシウム拮抗薬（ジル チアゼム、ベラパミル、二フヱジピン、二カルジピン等）、末梢循環障害治療薬 (アル プロスタジルアルファデタス、カリジノゲナーゼ、トコフエロール、ニコモール等）、抗不 整脈薬 (アジマリン、プロ力インアミド、リドカイン等）、降圧薬 (フロセミド、トリクロルメチ アジド、ヒドララジン、交感神経抑制薬、カルシウム拮抗剤等）、高脂血症薬 (クロフィ ブラート、プラバスタチン、シンパスタチン、口パスタチン、ニコモール等）、抗凝血薬（ へパリン、ヮルフアリン、ジクマロール、アスピリン等）、血栓溶解薬（ゥロキナーゼ等）、 糖尿病薬（トルプタミド、クロルプロパミド、ァセトへキサミド、ダリベンクラミド、メトホルミ ン、ァカルボース等）、抗炎症剤（ジクロフェナクナトリウム、イブプロフェン、インドメタ シン等）、抗菌剤（セフィキシム、セフジ-ル、オフロキサシン、トスフロキサシン等）又 は抗真菌剤（フルコナゾール、イトラコナゾール等)などが挙げられる。また、これらの 医薬活性成分を含む製剤を本発明の製剤と併用して使用することもできる。これらの 医薬活性成分は本発明の目的が達成される限り特に限定されず、適宜適当な配合 割合又は併用割合での使用が可能である。
[0032] 本発明の移植臓器の線維化抑制剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路に より投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下又は筋肉内等に 投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢又は体重等により適宜調整 される力 通常 HGFとして成人一人当たり約 0. 001〜1000mg、好ましくは約 0. 01 〜100mgであり、これを 1日 1回ないし数回に分けて投与するのが適当である。また 、本発明の移植臓器の線維化抑制剤は、臓器移植後、免疫抑制剤の投与と同時又 は、免疫抑制剤の投与前、あるいは投与直後に投与されるのがよい。また、本発明 の移植臓器の線維化抑制剤は、臓器移植前力も投与し始めてもょ 、。
[0033] 本発明の免疫寛容獲得剤は、臓器移植と同時、又は臓器移植前、ある!ヽは臓器移 植後にレシピエントである患者に投与され、該免疫寛容獲得剤の投与期間は、臓器 移植後から少なくとも約 2週間投与されるのがよい。また臓器移植に先立ち、移植さ れる臓器と異なるドナーの組織、例えば、移植臓器が心臓の場合、ドナーとなる動物 の例えば、リンパ球等を心臓移植されるレシピエントに移植し、免疫抑制剤と共に本 発明の免疫寛容獲得剤を少なくとも約 2週間投与されるのがよい。又は、レシピエント の組織、例えばリンパ球等を臓器移植前にドナーに移植し、免疫抑制剤と共に本発 明の免疫寛容獲得剤を投与することによってレシピエントに対する免疫寛容をドナー の臓器に獲得させることも可能である。後者の方法であればレシピエントに対する免 疫寛容を獲得したドナーの臓器をレシピエントに移植することにより、レシピエントに おける移植した臓器の拒絶反応を抑制できる。
本発明の免疫寛容獲得剤の投与経路、投与量及び投与方法は、上記した本発明 の移植臓器の線維化抑制剤における投与経路、投与量及び投与方法と同様である 上記ドナーの組織又はレシピエントの組織における「組織」とは、免疫に関与する組 織をいい、例えば骨随、胸腺、脾臓、リンパ節、扁桃、血管、皮膚、腸管等の各器官 や組織、あるいは白血球、マクロファージ、リンパ球 (NKZナチュラルキラー細胞、 T Zヘルパー細胞、 TZキラー細胞、 B細胞）、榭状細胞等の免疫細胞、サイト力イン、 又は抗体 (免疫グロブリン (Ig) G、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE等）、顆粒球 (好中球、好酸 球、好塩基球)等が挙げられる。
[0034] 以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるもので はない。
%は特にことわりのない限り質量％を示す。また、以下の実施例においては、 HGF としては、 5アミノ酸欠損 HGF (配列番号 2で示される HGF)を用いた。
実施例 1
[0035] 心臓移植マウスにおける心筋の線維化抑制効果
(1)心臓移植モデルの作成
8週齢、体重約 20g、雄のマウス 2種（BALBZcマウス及び C3HZHeマウス）を用 いた。 BALBZcマウスをドナーとし、ケタミン（100 gZkg)及びキシラジン（10 g Zkg)の合剤で麻酔した。前記麻酔下、 BALBZcマウスの心臓を 7. 5質量％へパリ ン加生理食塩水 lmLで灌流した後、心臓を摘出し、移植用心臓とした。 C3H/He マウスをケタミン（100 μ g/kg)及びキシラジン（10 μ g/kg)の合剤で麻酔した後、 開腹し、 BALBZcマウス力も摘出した移植用心臓を C3HZHeマウスの腹部大動脈 及び腹部下大静脈へ顕微鏡下に異所性移植を行った。
(2)免疫抑制剤及び HGFの投与
免疫抑制剤として、プログラフ注射液 5mg (タクロリムス 5mgZmL含有;藤沢薬品 工業株式会社製)を使用した。
上記（1)の移植直後より、タクロリムス 0. lmgZkgZ日を 1日 1回、 27ゲージの注 射針を用いて 60日間皮下投与した。また移植直後より、 HGF投与群の動物には、 H GFlmgに生理食塩水 20mLを加え溶解した溶液（0. 2mL;HGF250 gZkg)を 12時間ごと（500 gZkgZ日）に 14日間、対照動物には生理食塩水（0. 2mL)を 同様に 14日間、連日 27ゲージの注射針を用いて皮下投与した。
(3)組織学的解析
移植手術を行った日を 0日として、 14日目に移植心臓を摘出し、定法に従い、ホル マリン固定及びパラフィン包埋し、心臓の組織切片を作成した。組織切片は、マツソ ントリクローム染色を行った。染色した組織像を顕微鏡 CCDカメラ (OLYMPUS製） にてコンピューターに取り込み、 NIH画像解析用ソフトウェア（フリーソフト）を用い、 移植した心臓の冠状断像の総面積に対する線維化部を示す緑色染色部面積の比 率を算出した。
(4)結果
対照動物における移植心臓の線維化率は 22. 3± 7. 7%であったのに対して、 H GF投与群では、線維化率は 15. 6± 1. 3%に抑制された（図 1参照。；)。
このことは、ヒト組換え HGFは移植心臓の線維化を抑制することが明ら力となった。 実施例 2
免疫寛容の獲得
(方法）
実施例 1の（1)と同様に BALBZcマウスをドナーとし、 C3HZHeマウスの腹部大 動脈及び腹部下大静脈へ BALBZcマウスの移植用心臓を移植した。移植直後から HGFlmgに生理食塩水 20mLを加え溶解した溶液（0. 2πιΕ;ΗΟΡ250 ^ g/kg) を 12時間ごと（500 /z gZkgZ日）に 14日間、連日 27ゲージの注射針を用いて皮下 投与した。移植 60日後、生き残った心臓移植マウスの背部皮膚を切除し、 BALB/ cマウス又は C57BLZ10マウスから採取した皮膚 lcm2を移植した。
(結果）
心臓移植後 60日生存した C3HZHeマウスに心臓のドナーであった BALBZcマ ウスの皮膚を移植した。皮膚を移植された C3HZHeマウスでは、免疫抑制剤を投与 しなかったにも関わらず C3HZHeマウスの黒毛に、 BALBZcマウスの白毛の皮膚 が定着した。これは、 BALBZcマウスの心臓を移植された C3HZHeマウス力 BA LBZcマウスに対する免疫寛容を獲得したことを示すものである。
産業上の利用可能性
本発明の移植臓器の線維化抑制剤及び免疫寛容獲得剤は、臓器移植の分野、再 生医療分野に有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 肝細胞増殖因子を含有することを特徴とする、免疫抑制剤投与に伴う移植臓器の 線維化抑制剤。
[2] 肝細胞増殖因子が、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配 列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって HGFとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとし て作用するペプチドであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の移植臓器の 線維化抑制剤。
[3] 肝細胞増殖因子をコードする DNAを含有することを特徴とする、免疫抑制剤投与 に伴う移植臓器の線維化抑制剤。
[4] 肝細胞増殖因子をコードする DNAが、配列番号 3又は 4で表される塩基配列から なる DNA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ肝細胞増 殖因子として作用するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする請求の範囲 第 3項に記載の移植臓器の線維化抑制剤。
[5] 免疫抑制剤が、タクロリムスであることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 4項のい ずれかに記載の線維化抑制剤。
[6] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 2で表されるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって HGFとして作用するぺ プチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用するペプチドを含有するこ とを特徴とする免疫寛容獲得剤。
[7] 配列番号 4で表される塩基配列からなる DNA又は配列番号 4で表される塩基配列 力 なる DNAと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、かつ HGFとして作用するペプチドをコードする DNAを含有することを特 徴とする免疫寛容獲得剤。
[8] 免疫抑制剤が投与されている臓器移植された哺乳動物に HGFを投与することを特 徴とする、移植臓器の線維化を抑制する方法。
[9] 肝細胞増殖因子が、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配 列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって肝細胞増殖因子として作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであつ て肝細胞増殖因子として作用するペプチドであることを特徴とする請求の範囲第 8項 に記載の方法。
[10] 免疫抑制剤が投与されている臓器移植された哺乳動物に肝細胞増殖因子をコード する DNAを投与することを特徴とする、移植臓器の線維化を抑制する方法。
[11] 肝細胞増殖因子をコードする DNAが、配列番号 3又は 4で表される塩基配列から なる DNA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ肝細胞増 殖因子として作用するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする請求の範囲 第 10項に記載の方法。
[12] 免疫抑制剤が、タクロリムスであることを特徴とする請求の範囲第 8項〜第 11項の いずれかに記載の方法。
[13] 臓器移植される哺乳動物に、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドで あって HGFとして作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして 作用するペプチドを投与することを特徴とする、免疫寛容の獲得方法。
[14] 臓器移植される哺乳動物に、配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA、ある いは配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作用するペプチドを コードする DNAを投与することを特徴とする、免疫寛容の獲得方法。。
[15] 免疫抑制剤投与に伴う移植臓器の線維化を抑制する医薬を製造するための肝細 胞増殖因子の使用。
[16] 肝細胞増殖因子が、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配 列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むぺプチ ドであって肝細胞増殖因子として作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであつ て肝細胞増殖因子として作用するペプチドであることを特徴とする請求の範囲第 15 項に記載の使用。
[17] 免疫抑制剤投与に伴う移植臓器の線維化を抑制する医薬を製造するための肝細 胞増殖因子をコードする DNAの使用。
[18] 肝細胞増殖因子をコードする DNAが、配列番号 3又は 4で表される塩基配列から なる DNA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ肝細胞増 殖因子として作用するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする請求の範囲 第 17項に記載の使用。
[19] 免疫抑制剤が、タクロリムスであることを特徴とする請求の範囲第 15項〜第 18項の いずれかに記載の使用。
[20] 移植臓器に対する免疫寛容を獲得する医薬を製造するための肝細胞増殖因子の 使用。
[21] 肝細胞増殖因子が、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであつ て肝細胞増殖因子として作用するペプチド又はこれらの部分ペプチドであって肝細 胞増殖因子として作用するペプチドであることを特徴とする請求の範囲第 20項に記 載の使用。
[22] 移植臓器に対する免疫寛容を獲得する医薬を製造するための肝細胞増殖因子を コードする DNAの使用。
[23] 肝細胞増殖因子をコードする DNAが、配列番号 4で表される塩基配列力 なる D NA、あるいは配列番号 4で表される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列か らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ肝細胞増殖因子とし て作用するペプチドをコードする DNAであることを特徴とする請求の範囲第 22項に 記載の使用。
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