CN101610783A

CN101610783A - 脊髓损伤治疗剂

Info

Publication number: CN101610783A
Application number: CNA2008800046510A
Authority: CN
Inventors: 冈野荣之; 户山芳昭; 中村雅也; 岩波明生; 北村和也; 中村敏一; 船越洋; 花田敬吾
Original assignee: Osaka University NUC; Keio University; Kringle Pharma Inc
Current assignee: Osaka University NUC; Keio University; Kringle Pharma Inc
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2008-02-28
Publication date: 2009-12-23
Anticipated expiration: 2028-02-28
Also published as: ES2412388T3; KR20150138413A; EP2116255A4; US20120021040A9; EP2116255A1; CN105311620A; CA2675953A1; CA2675953C; CN101610783B; HK1134445A1; DK2116255T3; KR101670677B1; KR20090118078A; US20100081617A1; US8518880B2; EP2116255B1; WO2008105507A1; WO2008105088A1; PT2116255E

Abstract

本发明公开了对根本上治疗脊髓损伤和脱髓鞘疾病有效的治疗剂。具体地说，公开了都含有HGF蛋白质作为有效成分的脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂。

Description

脊髓损伤治疗剂

技术领域

本发明涉及脊髓损伤治疗剂，更具体地说，涉及以肝细胞生长因子(以下简称为“HGF”)蛋白质作为有效成分的脊髓损伤治疗剂。本发明还涉及以HGF蛋白质作为有效成分的脱髓鞘疾病治疗剂。

背景技术

术语“脊髓损伤”(SCI、spinal cord injury)指的是在由于例如交通事故或从高处跌落引起的脊椎脱臼骨折等外伤对脊髓实质造成损伤的部位以下呈现末梢的运动、感觉和植物性神经系统麻痹的临床状态。

目前，脊髓损伤患者的数量在日本约为100,000人，在美国约为250,000人。每年，此类患者的数量在日本至少增加5,000人，在美国至少增加10,000人。

随着近年医疗的进步，损伤后的存活率升高，为了抑制障碍的发展而进行的脊髓损伤的重建手术的方法也取得显著进步。因此，在抑制继发性神经学恶化方面开始取得成功。进一步地，由于康复技术的进步和支持装置(电动轮椅等)的开发，患者的日常生活活动(ADL)得到改善。然而，由于缺乏从根本上治疗脊髓损伤自身(即，保护神经防止神经损伤和神经再生)的有效方法，目前存在众多不能自主排尿、排便、进行体力劳动或步行的患者。

HGF最初被确定为对成熟肝细胞强的丝裂原，在1989年被基因克隆(非专利文献1、2)。尽管HGF作为肝细胞生长因子被发现，但根据在包括基因敲除/基因敲入小鼠技术的表达和机能分析上的近来的大量研究，还发现HGF为新的神经营养因子(非专利文献3、4)。

在专利文献1中，公开了在行为学和组织学上对于HGF基因对帕金森病模型大鼠的效果的实施例。其中呈现出的实验结果表明，HGF基因的在先给药对保护中脑黑质中的多巴胺神经元免受神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)的影响具有效果。该专利文献1还表明，基于这些实验结果，HGF基因不仅能够用于帕金森病的治疗，还可用于包括阿尔茨海默病、脊髓小脑退行性变、多发性硬化、纹状体黑质变性(SND)、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、夏伊-德雷格综合征、腓骨肌萎缩症(CMT)、弗里德赖希共济失调、重症肌无力、烟雾病、淀粉样变性、皮克病、亚急性脊髓视神经病、皮肌炎/多肌炎、克-雅氏病、白塞综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、结节病、结节性动脉外膜炎(PN)、后纵韧带骨化、弥漫性脊椎管狭窄、混合性结缔组织病(MCTD)、糖尿病末梢神经炎和缺血性脑血管病(例如脑梗死、脑出血)的其它神经疾病的治疗，作为这种神经疾病之一，还举出脊髓损伤。

然而，6-OHDA为对合成儿茶酚胺类的神经细胞(具体地说，为去甲肾上腺素产生神经细胞、肾上腺素产生神经细胞和多巴胺产生神经细胞)具有特异性的效果的特殊的合成毒素，而且对在以上列出的大多数疾病中据报导被变性或杀死的神经细胞不表现出任何毒性。因此，不可能根据6-OHDA具有神经细胞死亡抑制效果来预测对包括脊髓损伤的上述疾病产生的效果。此外，上述专利文献1未记载给予HGF蛋白质带来的治疗效果。

非专利文献5中记载了，将整合HGF基因(HGF表达病毒载体)的病毒载体注入到大鼠第十胸椎的脊髓内，然后在相同部位制造脊椎挤压伤，之后，在运动机能的评价时观察下肢运动机能的恢复。

然而，尽管脊髓损伤通常由事故等中受到的外伤引起，但在非专利文献5中，在胸椎挤压伤之前3天注入HGF表达病毒载体。明显不可能以这种方式预测事故的发生和损伤部位、并预先局部给予HGF表达病毒载体。

此外，脊髓损伤患者的状态在受伤后72小时有可能不稳定，可能很难插入用于鞘内给药的导管。因此，决定适当的给药时间是重要的。

进一步地，还存在许多可想象的问题，例如控制在通常的基因治疗中蛋白质表达量的困难性、由于重复给药而使一部分基因表达载体存在触发免疫应答的危险、以及一部分基因表达载体存在将基因导入到基因组中的可能性。

包括脊髓神经的有髓神经的神经纤维被由称为髓磷脂的脂蛋白的层形成的鞘覆盖。该髓鞘发挥作为神经纤维的绝缘体的作用，通过有髓神经能够进行跳跃传导。将该髓鞘的破坏称为脱髓鞘。当发生脱髓鞘时，由于神经传递的显著缓慢而引起多种神经症状。伴有这种脱髓鞘的疾病通常称作脱髓鞘疾病，代表性地包括例如多发性硬化。脊髓损伤也通常伴有脱髓鞘。

多发性硬化为以弥漫性脱髓鞘斑的形成为特征的缓慢发展的中枢神经系统疾病。多发性硬化的发病率在欧洲和美国为每100,000人中约50～100个病例，在日本为每100,000人中约1～5个病例。症状因人而异，可包括视觉丧失、复视、眼球震颤、发音障碍、虚弱、感觉异常、膀胱问题和心境不稳。该疾病随着反复这种症状缓解和重新开始而发展。虽然怀疑病因为免疫异常，但是还未确定。因此，与其它脱髓鞘疾病相同，目前还没有根本性治疗方法。

如上所述，尽管已知包括注入整合HGF基因的病毒载体(HGF表达病毒载体)的方法，也已知当诸如疱疹病毒(HSV)或腺病毒等病毒引入到脑内时，在脑中产生浓度依赖性炎症反应，引起脱髓鞘(专利文献2)。

因此，同样根据此观点，包括使用整合HGF基因的病毒载体的治疗方法明显不会成为脱髓鞘疾病的根本性治疗方法。由此要求确立不引起脱髓鞘的治疗方法。

专利文献1：WO2003/045439号小册子

专利文献2：WO2005/100577号小册子

非专利文献1：Biochem.Biophys.Res.Commun.，122，1450-1459(1984)

非专利文献2：Nature，342，440-443(1989)

非专利文献3：Nat.Neurosci.，2，213-217(1999)

非专利文献4：Clin.Chim.Acta.，327，1-23(2003)

非专利文献5：日本整形外科学会杂志、2005.08.25、Vol.79，No.8，pS764

发明内容

本发明的目的在于，提供不使用基因，通过简便的方法就可以治疗脊髓损伤和脱髓鞘疾病的药剂。

为了解决上述课题，本发明人进行了广泛的调查研究。结果他们发现，HGF蛋白质在包括脱髓鞘抑制效果和5HT神经再生效果的脊髓损伤治疗中具有最期待的机能再生效果，HGF蛋白质作为脊髓损伤的治疗剂是有用的。而且，本发明人还发现，HGF蛋白质作为脱髓鞘疾病的治疗剂是有用的。基于这些发现，最终完成了本发明。

因此，本发明涉及：

(1)脊髓损伤治疗剂，含有HGF蛋白质作为有效成分；

(2)根据上述(1)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号1或2的氨基酸序列的蛋白质，具有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具有活性与HGF实质上相同的蛋白质，或者为具有活性与HGF实质上相同的所述蛋白质之一的部分肽；

(3)根据上述(1)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质；

(4)根据上述(1)～(3)中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂适于局部用于脊髓损伤部位；

(5)根据上述(4)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为鞘内给药用注射剂的剂型；

(6)根据上述(4)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为通过缓释泵进行的鞘内给药用注射剂的剂型；

(7)根据上述(1)～(6)中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为脊髓神经的脱髓鞘抑制剂；

(8)脊髓损伤治疗剂，所述治疗剂含有HGF蛋白质作为有效成分，且在刚脊髓损伤后两周内给药；

(9)脊髓损伤治疗剂，所述治疗剂含有HGF蛋白质作为有效成分，且在刚脊髓损伤后4天内给药；

(10)脊髓损伤治疗方法，所述方法包括对脊髓损伤患者给予有效量的HGF蛋白质；

(11)HGF蛋白质在制备脊髓损伤治疗剂中的应用；

(12)脊髓损伤治疗用HGF蛋白质；

(13)脱髓鞘疾病治疗剂，含有HGF蛋白质作为有效成分；

(14)根据上述(13)所述的治疗剂，其中，所述脱髓鞘疾病为选自多发性硬化、视神经脊髓炎、Balo同心圆性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、希尔德(Schilder)病、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、进行性多灶性白质脑病(PML)、宾斯旺格病、缺氧性脑病、脑桥中央髓鞘溶解、格-巴二氏综合征、费希尔综合征和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)中的疾病；

(15)根据上述(13)或(14)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号1或2的氨基酸序列的蛋白质，为具有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具有活性与HGF实质上相同的蛋白质，或者为具有活性与HGF实质上相同的所述蛋白质之一的部分肽；

(16)根据上述(13)或(14)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质；

(17)根据上述(13)～(16)中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂适于局部用于疾病部位；

(18)根据上述(17)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为鞘内给药用注射剂的剂型；

(19)根据上述(17)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为通过缓释泵进行的鞘内给药用注射剂的剂型；

(20)脱髓鞘疾病治疗方法，所述方法包括对脱髓鞘疾病的患者给予有效量的HGF蛋白质；

(21)HGF蛋白质在制备脱髓鞘疾病治疗剂中的应用；以及

(22)脱髓鞘疾病治疗用HGF蛋白质。

本发明的治疗剂对脊髓损伤和脱髓鞘疾病发挥非常优异的治疗效果。本发明的治疗剂还具有不存在与基因治疗相关的问题的优点。进一步地，本发明的治疗剂具有以下优点，即有效地抑制和治疗在脊髓损伤和脱髓鞘疾病(例如多发性硬化)产生的有髓神经的脱髓鞘。而且，由于本发明的治疗剂无需使用例如HSV或腺病毒等病毒载体，所以不会引起脱髓鞘。本发明的治疗剂的进一步优点在于，与基因治疗不同，可以容易地调节有效成分HGF的供给量或给药量，还可以调节给药时间，并可以反复或连续地进行给药。

附图说明

图1为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的脊髓组织的苏木精-曙红(HE)染色图像，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的苏木精-曙红(HE)染色图像；

图2为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的脊髓组织的勒克司坚牢蓝(LFB)染色图像，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的勒克司坚牢蓝(LFB)染色图像；

图3为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的脊髓组织的5-羟色胺(5HT)染色图像，以及对照组的脊髓组织的5-羟色胺(5HT)染色图像；

图4为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的脊髓组织的5HT和生长相关蛋白-43(GAP43)的染色图像；

图5为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；

图6为表示脊髓损伤后立即以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；

图7为表示脊髓损伤后4天以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；

图8为表示脊髓损伤后2周以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及于对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；和

图9为表示脊髓损伤后8周以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间。

具体实施方式

本发明中使用的HGF蛋白质为已知物质。若被纯化成可以作为药物使用的程度，则可使用通过各种方法的任何一种制备的HGF蛋白质。HGF蛋白质例如可以通过对产生HGF蛋白质的原代培养细胞或来自株化细胞的细胞进行培养，随后从培养上清分离纯化HGF蛋白质来制备。或者，可使用通过基因工程方法制备的HGF蛋白质，基因工程方法中，将编码HGF蛋白质的基因整合到适当的载体中，将该载体插入到适当的宿主细胞中进行转化，从该转化体的培养上清得到目标重组HGF蛋白质(例如参照日本特开平5-111382号公报、Biochem.Biophys.Res.Commun.1989年、第163卷，p.967等)。对上述宿主细胞不特别限制。例如，可使用一直以来在基因工程方法中使用的各种宿主细胞的任意一种，例如大肠杆菌、酵母或动物细胞。只要如此得到的HGF蛋白质具有与天然型HGF蛋白质实质上相同的活性，则可以在其氨基酸序列中具有一个或多个(例如1～8个，以下相同)被置换、缺失或附加的氨基酸，或者同样具有被置换、缺失或附加的糖链。这种HGF蛋白质的实例包括下述的5个氨基酸缺失型HGF蛋白质。在此，对于氨基酸序列，“一个或多个被置换、缺失或附加的氨基酸”指的是，通过例如基因工程方法或位点专一诱变等已知技术方法，或者天然地产生的被置换、缺失或附加的氨基酸的数(一个～多个)。具有被置换、缺失或附加的糖链的HGF蛋白质例如可以为用酶等对附加到天然HGF蛋白质上的糖链进行处理得到的HGF蛋白质，改变糖链附加部位的氨基酸序列以不附加糖链的HGF蛋白质，或者改变氨基酸序列以使糖链附加到与天然的糖链附加部位不同的部位的HGF蛋白质。

进一步地，可包括与HGF蛋白质的氨基酸序列具有至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％的同源性且实质上作为HGF发挥作用的蛋白质。对于上述氨基酸序列，“同源”指的是与蛋白质的一级结构相比，构成各自的氨基酸序列的氨基酸残基的一致程度。

上述HGF蛋白质的实例包括序列号1和2的氨基酸序列。序列号2的HGF蛋白质为序列号1所示的氨基酸序列中的第161位～165位氨基酸的5个氨基酸残基缺失的5个氨基酸缺失型HGF蛋白质。具有序列号1或2的氨基酸序列的蛋白质为来源于人的天然HGF蛋白质，具有HGF的丝裂原活性和运动因子活性。

含有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白质为含有与序列号1或2的氨基酸序列具有至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％同源性的氨基酸序列的蛋白质。优选的实例包括作为HGF发挥作用且相对于序列号1或2的氨基酸序列，具有一个～多个氨基酸残基已被插入或缺失的氨基酸序列、一个～多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基置换的氨基酸序列、或者一个～多个氨基酸残基已被修饰的氨基酸序列的蛋白质。被插入或置换的氨基酸可为通过基因编码的20种氨基酸以外的非天然氨基酸。非天然氨基酸可为具有氨基和羧基的任意化合物，例如γ-氨基丁酸。这些蛋白质可单独使用，或者以它们的混合物形式使用。含有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白质包括但不限于，记录在NCBI数据库(NCBI-GenBank Flat File Release 164.0)中的Accession No.BAA14348和AAC71655的人HGF。

可在本发明中使用的HGF蛋白质适用于人时优选为上述来源于人的蛋白质，但是也可使用来源于人以外的哺乳动物(例如猴、母牛、马、猪、绵羊、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、仓鼠、豚鼠和黑猩猩)的HGF蛋白质。这种HGF蛋白质的示例性实例包括但不限于，例如记录在NCBI数据库中的：小鼠HGF(例如Accession No.AAB31855、NP_034557、BAA01065、BAA01064)、大鼠HGF(例如Accession No.NP_58713(具有序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质))、母牛HGF(例如Accession No.NP_001026921、BAD02475)、猫HGF(例如Accession No.NP_001009830、BAC10545、BAB21499)、狗HGF(例如Accession No.NP_001002964、BAC57560)和黑猩猩HGF(例如Accession No.XP_519174)。

在本发明中使用的HGF蛋白质可在C末端具有羧基(-COOH)、羧酸盐(-COO^-)、酰胺基(-CONH₂)或酯基(-COOR)。其中，酯中的R例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基等C_1-6烷基，例如环戊基和环己基等C_3-8环烷基，例如苯基和α-萘基等C_6-12芳基，包括诸如苯甲基和苯乙基等苯基-C_1-2烷基以及诸如α-萘甲基等α-萘基-C_1-2烷基等的C_7-14芳烷基，以及新戊酰氧甲基。本发明的HGF蛋白质在羧基被酰胺化或酯化时，还可包括在C末端以外的位置上具有羧基(或羧酸盐)的HGF蛋白质。这种情况下的酯例如可为上述C末端酯。可在本发明中使用的HGF蛋白质还包括上述N末端的蛋氨酸残基的氨基被保护基团(例如包括甲酰基和诸如乙酰基等C_2-6烷酰基的C_1-6酰基)保护的蛋白质、N末端的通过体内断裂形成的谷氨酰基转化为焦谷氨酸的蛋白质、或者分子内的氨基酸的侧链上的官能团(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基)被适当的保护基团(例如包括甲酰基和诸如乙酰基等C_2-6烷酰基的C_1-6酰基)保护的蛋白质中的任何一种以及诸如通过糖链键合得到的糖蛋白类等的复合蛋白质类。

在本发明中使用的HGF蛋白质可为其部分肽(以下有时简称为“部分肽”)的形式。这种部分肽的实例包括为上述HGF蛋白质的部分肽且具有与HGF实质上相同的活性的任何一种蛋白质。在本发明中，优选的部分肽包括，在构成上述HGF蛋白质的氨基酸序列中，含有至少约20个、优选至少约50个、更优选至少约100个氨基酸的氨基酸序列的肽类。特别优选的实例包括在序列号1的人HGF氨基酸序列的N末端侧开始具有第32位氨基酸到第210位氨基酸的氨基酸序列(从HGF上的N末端发夹环到第一kringle结构域的序列)的肽、以及在序列号1的人HGF氨基酸序列的N末端侧开始具有第32位氨基酸到第288位氨基酸的氨基酸序列(从HGF上的N末端发夹环到第二kringle结构域的序列)的肽。在本发明的部分肽中，C末端可为羧基(-COOH)、羧酸盐(-COO^-)、酰胺基(-CONH₂)或酯基(-COOR)。而且，与上述HGF蛋白质相同地，部分肽包括N末端的蛋氨酸残基上的氨基被保护基团保护的部分肽、N末端的通过体内断裂形成的Gln(谷氨酰基)转化为焦谷氨酸的部分肽、分子内的氨基酸的侧链上的官能团被适当的保护基团保护的部分肽、以及诸如通过糖链键合得到的糖肽类等的复合肽类。

可在本发明中使用的HGF蛋白质(包括部分肽形式的蛋白质)的盐为与酸或碱的生理学上可容许的盐。特别优选为生理学上可容许的酸加成盐。这种盐的示例包括与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐、与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐。

在本发明中使用的HGF蛋白质为部分肽的形式时，此部分肽可根据已知的肽合成方法制备，或者用适当的肽酶裂解HGF蛋白质来制备。适当的肽合成方法的实例包括固相合成和液相合成。在可以构成HGF蛋白质的部分肽或氨基酸与残余部分缩合，得到的产物具有保护基团时，可以通过脱去保护基团制备目标肽。已知的缩合方法和脱去保护基团的方法包括例如M.Bodanszky和M.A.Ondetti、ペプチド·シンセシス(Peptide Synthesis、肽合成)，(Interscience Publishers，New York(1966年)中记载的方法、以及Schroeder和Luebke、ザ·ペプチド(The Peptide、肽)，Academic Press，NewYork(1965年)中记载的方法。反应后，HGF蛋白质中的部分肽可以通过常规的纯化方法，例如溶剂抽提、蒸馏、柱色谱法、液相色谱法和重结晶的组合进行纯化分离。通过上述方法得到的部分肽为游离酸或碱时，可以用已知方法转化为适当的盐。相反地，以盐的形式得到时，可以用已知方法转化为适当的游离酸或碱。

在本发明中使用的HGF蛋白质适用于人时优选使用来源于人的HGF蛋白质，也可使用来源于人以外的哺乳动物的HGF蛋白质。来源于大鼠的适当的HGF蛋白质的实例为序列号3所示的蛋白质。

本发明的治疗剂，即脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂可用于伴随有脊髓损伤或脱髓鞘的所有神经疾病。具体实例包括多发性硬化(MS)、视神经脊髓炎、Balo同心圆性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、希尔德(Schilder)病、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、进行性多灶性白质脑病(PML)、宾斯旺格病、缺氧性脑病、脑桥中央髓鞘溶解、格-巴二氏综合征、费希尔综合征和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。还包括伴随有脱髓鞘的脊髓损伤。

本发明的治疗剂(脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂)不仅可用于人，还可用于人以外的哺乳动物(例如猴、母牛、马、猪、绵羊、狗和猫)。

将本发明的治疗剂(脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂)给予患者或患畜时，它们可以以任何一种剂型制备，例如液体制剂和固体制剂。通常，HGF蛋白质自身或与常规载体一起例如以注射剂、喷雾剂或缓释制剂(例如，长效制剂(depot preparation))的形式制备。注射剂可为水性注射剂或油溶注射剂。如果注射剂为水性注射剂，则可根据已知方法进行制备，例如通过将HGF蛋白质溶解在通过适当添加可药用的添加剂到水性溶剂(例如，注射用水、纯化水)中得到的溶液中，然后用过滤器等进行过滤将其灭菌，然后填充到无菌容器内来制备，可药用的添加剂例如为等渗剂(例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、葡萄糖、丙二醇)、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、谷氨酸盐缓冲液、ε-氨基己酸盐缓冲液)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯代丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、乙二胺四乙酸钠、硼酸、硼砂)、增稠剂(例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇)、稳定剂(例如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯)、pH调节剂(例如盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸)。还可使用适当的溶解助剂，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)或非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油50)。如果注射剂为油溶注射剂，则可使用芝麻油或豆油作为油质溶剂，且可使用苯甲酸苄酯或苯甲醇作为溶解助剂。已制备的注射剂通常填充到安瓿或西林瓶中。注射剂中的HGF蛋白质含量通常调节为约0.0002～约2.0w/v％，优选为约0.001～约1.0w/v％，更优选为约0.01～约0.5w/v％。而且，对于诸如注射剂等液体制剂，优选通过冷冻进行保存或在通过冷冻干燥等除去水分后进行保存。冷冻干燥制剂在使用时，添加注射用蒸馏水等，并再溶解来使用。

喷雾剂也可通过制剂上的常规方法制备。作为喷雾剂进行制备的情况下，可使用通常在吸入用制剂中使用的添加剂。例如，除了抛射剂以外，可使用上述溶剂、防腐剂、稳定剂、等渗剂和pH调节剂。可使用的抛射剂包括液化气体抛射剂和压缩气体。液化气体抛射剂的实例包括氟化烃(例如HCFC22、HCFC-123、HCFC-134a和HCFC-142等氟碳化合物(CFC)的替代物)、液化石油和二甲醚。压缩气体的示例包括可溶性气体(例如二氧化碳、一氧化二氮)和不溶性气体(例如氮气)。

在本发明中使用的HGF蛋白质可与生物可降解聚合物一起制备为缓释制剂(例如长效制剂)。特别是制备作为长效制剂的HGF蛋白质时，可以期待许多期望效果，例如给药次数的减少、治疗效果良好的持续时间和副作用降低。这种缓释制剂可用已知方法制备。在此缓释制剂中使用的生物可降解聚合物可从以下已知的生物可降解聚合物中适当选择：例如包括淀粉、葡聚糖、透明质烷(透明质酸)及其盐等多糖类；例如端胶原、胶原和明胶等蛋白质；例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚亮氨酸、聚丙氨酸和聚蛋氨酸等聚氨基酸；聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己酸内酯、聚-β-羟基丁酸和聚苹果酸；例如富马酸-聚乙二醇-乙烯基吡咯烷酮共聚物等聚酯和聚原酸酯；例如聚甲基-α-氰基丙烯酸等聚烷基氰基丙烯酸；例如聚碳酸乙二醇酯和聚碳酸丙二醇酯等聚碳酸酯。优选为聚酯，特别优选为乳酸-乙醇酸共聚物。使用乳酸-乙醇酸共聚物时，其组成比(乳酸/乙醇酸)(摩尔％)根据预期的缓释时间变化而变化。例如，对于约2周～约3个月、优选约2周～约1个月的缓释时间，组成比为约100/0～约50/50。该乳酸-乙醇酸共聚物的重均分子量通常为约5,000～约20,000。乳酸-乙醇酸共聚物可用已知的制备方法，例如日本特开昭61-28521号公报中记载的制备方法进行制备。生物可降解聚合物与HGF蛋白质的配比没有任何特别限制。例如，HGF蛋白质与生物可降解聚合物的配比通常为约0.01～约30w/w％。

在注射剂或喷雾剂的情况下，给药优选通过直接注射(例如鞘内给药、通过缓释泵进行的鞘内连续给药)或喷雾到受脊髓损伤或脱髓鞘疾病影响的组织，或者在缓释制剂(长效制剂)的情况下，给药优选植入到受脊髓损伤或脱髓鞘疾病影响的组织附近的部位。给药量可根据剂型、疾病的程度、患者年龄等因素适当地选择，通常每1次给予1μg～500mg，优选为10μg～50mg。给药方法也可根据剂型、疾病的程度、患者年龄和其它因素适当地选择。例如，治疗剂可单次一次性给药，单次在约30分钟～约几周的时间内(优选在约24小时～2周的时间内)持续给药。或者，上述一次性给药或持续给药可在间隔周期内重复给药。重复给药时，给药间隔可以为每天一次～几个月一次。例如，在作为缓释制剂(长效制剂)给药时，或者在通过缓释泵(例如渗透泵)进行局部(例如鞘内)持续给药时，给药间隔可以为几周～几个月一次。这种持续给药的优点在于，因为HGF蛋白质长期逐渐地释放到脊髓损伤或脱髓鞘疾病的部位，所以HGF长期发挥作用，能够得到更好的治疗效果。进一步的优点在于，由于给药次数少，减轻对患者的负担。更进一步的优点在于，根据需要，可以将HGF蛋白质追加给予到皮下植入的渗透泵。如上所述，作为给药方法优选为局部给药，但是也可以为诸如肌内给药、皮下给药或点滴注射等其它给药方法。给药时间可根据剂型、疾病的程度、患者年龄等因素适当地选择。例如，脊髓损伤的情况下，优选在刚损伤后14天内，更优选在7天内，最优选在4天内进行给药。特别是对于脊髓损伤患者，考虑到患者的状态在受伤后72小时内难以稳定，特别优选在刚损伤后约72小时～4天内给药。上述给药时间包括持续给药时的给药开始时，或重复给药时的初次给药时。

实施例

以下使用实施例对本发明进行说明，但是本发明不被这些实施例所限定。在以下的实施例中使用的HGF蛋白质为5个氨基酸缺失型重组HGF蛋白质(序列号2)。

[实施例1]

(脊髓损伤动物的制备和HGF蛋白质的给药)

(1)脊髓损伤动物的制备

首先，无菌准备渗透泵(Osmotic Pump)。将HGF蛋白质(浓度：1mg/mL，溶解在PBS中)或PBS(对照)注入到Alzet小型渗透泵(miniosmotic pump)(ALZA Corporation制，Model 2002)中。将用HGF蛋白质或PBS充满内腔的内径为0.3mm、外径为0.7mm的硅胶管(株式会社ィマムラ制，导管)与泵排出部连接，用另一内径为1.0mm、外径为2.0mm的硅胶管(株式会社ィマムラ制)覆盖连接部，接着在37℃下培养泵和管部件12小时，然后用于实验。

通过14w/v％的水合氯醛的腹腔内给药，将成年雌性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley、SD)大鼠(周龄约10～12周，体重约250g)麻醉，将第十胸椎和第十二胸椎椎板切除。然后将渗透泵(用上述方法预先填充有HGF蛋白质溶液)植入到右背侧皮下，导管从皮下区域通过肌肉层。之后，导管的顶端到达第十二胸椎椎弓。然后，用IH冲击器(Precision Systems制)在第十胸部脊髓节段制造200k达因(kDyne)的挤压伤。之后，在头尾向的轴的方向上使第十二胸部脊髓的硬膜和蛛网膜一起裂开，由此将导管插入到蛛网膜下腔且导管的顶端到达损伤脊髓点。使用外科用粘接剂ァロンァルファA“三共”(三共株式会社制)将导管固定在肌肉层的内侧和外侧。粘接剂充分干燥后，分别缝合肌肉层和皮肤，完成手术。

(2)HGF蛋白质的给药

手术后(挤压伤后)，通过上述渗透泵将HGF蛋白质溶液鞘内给药2周(HGF蛋白质的给药量，200μg/2周)。对照组仅给予PBS。

[实施例2]

(组织分析和结果)

在固定的手术后期间后，通过14w/v％水合氯醛的腹腔内给药对大鼠进行深度麻醉，接着，依次用PBS、用4w/v％的多聚甲醛/PBS从心脏的左心室进行灌注。取出脊髓断片，随后在4℃下固定在4w/v％的多聚甲醛/PBS中24小时。将组织样品在4℃下先后浸渍在10w/v％的蔗糖/PBS溶液和30w/v％的蔗糖/PBS溶液各24小时，之后植入到OCT复合物(サクラファィンテクニカル社)中。立即在液氮中冷冻植入的组织，制备20μm的冷冻切片。然后，用苏木精和曙红(HE)对组织切片进行染色，进行组织检查。其结果如图1所示，与对照组相比，在HGF蛋白质组中，由于运动神经的退化和细胞死亡引起的的腔形成得到显著抑制，由此表明，挤压引起的脊髓退化得到抑制。

[实施例3]

(髓鞘染色和结果)

用95v/v％乙醇处理通过实施例2记载的方法制备的切片，之后，在60℃下，于勒克司坚牢蓝(Luxor Fast Blue、LFB)溶液中培养2小时。从培养器取出后，放置切片直至冷却至室温，用95v/v％乙醇和蒸馏水进行洗涤。然后，重复进行用碳酸锂溶液和70v/v％乙醇进行的分馏以及用蒸馏水进行的洗涤，直至得到适当的对照，之后，将切片脱水、密封，并观察髓鞘。如图2所示，与对照组相比，在HGF蛋白质组中的LFB-阳性髓鞘表面积大，表明由于脊髓损伤引起的脱髓鞘得到抑制。

[实施例4]

(免疫组织化学分析和结果)

用多克隆5HT抗体(1∶100稀释)和多克隆抗-GAP43抗体(1∶1000稀释)对通过实施例2记载的方法制备的切片进行染色。即，在室温下用含有5v/v％山羊血清和0.1w/v％曲通(Triton)X-100的PBS封闭1小时后，在4℃下，于上述抗体溶液中培养切片一整夜。用PBS洗涤这些切片，然后在室温下，于用Alexa 488(绿)和Alexa 546(红(1∶1000稀释))进行荧光标记的二次抗体内培养1小时，密封到载玻片上，在荧光显微镜下观察5HT阳性神经纤维和GAP43阳性神经纤维。其结果如图3所示发现，与对照组相比，在HGF蛋白质组中，5HT阳性神经纤维在距离损伤部位4mm尾侧显著多。而且，如图4所示，在5HT阳性信号与GAP43阳性信号的局部具有良好的一致性。5HT阳性神经纤维负责脊髓损伤后的运动机能以及GAP43在成体中仅在再生神经纤维中表达，表明通过HGF蛋白质的给药使与运动机能相关的神经纤维的再生得到促进。

[实施例5]

(运动机能评价和结果)

通过旷场试验观察通过实施例1记载的方法刚产生脊髓损伤后，开始用HGF蛋白质(200μg/2周)治疗动物的运动机能。由多个观察者目视观察动物的行为，用BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分系统进行评价，其中以0(完全瘫痪)～21(正常)的21等级评价运动机能。手术后6周评价后肢运动机能。结果如图5所示。

由图5明显可知，在HGF蛋白质组中，脊髓损伤4天后开始观察到机能恢复，与5周后观察到的对照组相比，具有显著的机能恢复效果(p＜0.05)。

[实施例6]

以与实施例1同样的方法制备脊髓损伤动物，随后进行充满有HGF蛋白质(2mg/mL，溶解于PBS中)或PBS(对照)的渗透泵的植入和导管的插入。手术后(挤压伤后)，通过渗透泵将HGF蛋白质溶液鞘内给药4周(HGF蛋白质的给药量，400μg/4周)。对照组仅给予PBS。直至手术后9周通过实施例5所述的方法进行运动机能评价。其结果如图6所示。

由图6明显可知，与对照动物相比，用HGF蛋白质治疗的动物的机能恢复明显得到改善。自脊髓损伤4天后明显不同。而且，甚至在HGF蛋白质给药结束后，BBB评分还持续升高。

[实施例7]

通过14w/v％的水合氯醛的腹腔内给药，将成年雌性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley、SD)大鼠(周龄约10～12周，体重约250g)麻醉，用IH冲击器(Precision Systems制)在第十胸部脊髓节段制造200k达因的挤压伤，由此提供脊髓损伤动物。为了植入渗透泵，在挤压伤后4天、2周或8周对脊髓损伤动物进行再手术。通过与实施例1相同的方法皮下植入充满有HGF蛋白质(2mg/mL，溶解于PBS中)或PBS(对照)的渗透泵，将导管插入到蛛网膜下腔，然后导管的顶端到达受损脊髓点，最终固定导管。在挤压伤后4天、2周或8周开始，通过渗透泵将HGF蛋白质溶液鞘内给药4周(HGF蛋白质的给药量，400μg/4周)。对照组仅给予PBS。通过与实施例5相同的方法随时间变化对运动机能进行评价。其结果如图7、图8和图所示。

由图7明显可知，在挤压伤后4天开始进行HGF治疗的动物组中，观察到机能恢复比对照组动物快。

由图8明显可知，与对照组相比，在挤压伤后2周开始进行HGF治疗的动物组中，观察到在开始HGF治疗2周后(挤压伤4周后)机能恢复的促进效果。

由图9明显可知，在挤压伤后8周开始进行HGF治疗的动物组中，观察到给予HGF蛋白质的动物与对照动物之间的机能恢复没有差异。

[制剂实施例1]

将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，重均分子量＝10,000，和光纯药工业株式会社制)1.9g溶解在3.0mL的二氯甲烷中。接着，向该有机溶剂溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末100mg，使用混合磨(株式会社レツチェ)精细研磨，由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌3小时使二氯甲烷蒸发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微囊用400mL蒸馏水洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除去残留溶剂，在40℃下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF相对于生物高分子的配比：5.3w/w％)。

[制剂实施例2]

将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，重均分子量＝10,000，和光纯药工业株式会社制)1.89g和氧化锌10mg溶解在3.0mL的二氯甲烷中。接着，向该有机溶剂溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末100mg，使用混合磨(株式会社レツチェ)精细研磨，由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌3小时使二氯甲烷蒸发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微囊用400mL蒸馏水洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除去残留溶剂，在40℃下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF相对于生物高分子的配比：5.3w/w％)。

[制剂实施例3]

将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量＝15,000，和光纯药工业株式会社制)1.7g溶解在2.7mL的二氯甲烷中。接着，向该有机溶剂溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末300mg，使用混合磨(株式会社レツチェ)精细研磨，由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌3小时使二氯甲烷蒸发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微囊用400mL蒸馏水洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除去残留溶剂，在40℃下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF相对于生物高分子的配比：17.6w/w％)。

[制剂实施例4]

将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量＝15,000，和光纯药工业株式会社制)1.69g和氧化锌10mg溶解在2.7mL的二氯甲烷中。接着，向该有机溶剂溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末300mg，使用混合磨(株式会社レツチェ)精细研磨，由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌3小时使二氯甲烷蒸发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微囊用400mL蒸馏水洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除去残留溶剂，在40℃下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF相对于生物高分子的配比：17.8w/w％)。

[制剂实施例5]

将DL-乳酸聚合物(乳酸/乙醇酸＝100/0，重均分子量＝5,000，和光纯药工业株式会社制)5g溶解在50mL的二氯甲烷中，由此制备10w/v％的溶液。接着，向该溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末2.5mg。然后将制得的混合物加入另外加热至40℃的0.5w/v％壳聚糖水溶液中，之后，使用均相混合机在1000rpm的搅拌速度下搅拌使其乳化。得到的乳液在室温下进行再搅拌3小时以使二氯甲烷蒸发，之后，收集通过离心分离(约2,000rpm)生成的微球体。将该微球体使用预先加热至40℃的蒸馏水洗涤5次，然后在室温下真空干燥，由此得到含HGF蛋白质的微球体(HGF相对于生物高分子的配比：0.05w/w％)。

[制剂实施例6]

将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量＝5,000，和光纯药工业株式会社制)10g溶解在200mL的二氯甲烷/乙醇(4∶1)中，由此制备5w/v％的溶液。接着，向该溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末2.5mg。使用均相混合机在500rpm的速度下搅拌，将制得的混合物每次少量地加入另外加热至40℃的1w/v％明胶水溶液中，由此实现乳化。对得到的乳液在室温下进行再搅拌3小时以使二氯甲烷和乙醇蒸发，之后，收集通过离心分离(约2,000rpm)生成的微球体。将该微球体使用预先加热至40℃的蒸馏水洗涤5次，在室温下真空干燥，由此得到含HGF蛋白质的微球体(HGF相对于生物高分子的配比：0.025w/w％)。

[制剂实施例7]

将2w/v％的HGF蛋白质水溶液0.2mL与2％端胶原的磷酸盐缓冲剂溶液2mL混合，进行冷冻干燥。使用液氮、将冷冻干燥材料在低温下粉碎后，放入模具内进行压缩成型以得到圆柱状的含HGF的缓释制剂(HGF相对于生物高分子的配比：10w/w％)。

[制剂实施例8]

将0.01w/v％的HGF蛋白质水溶液100mL与2w/v％胶原水溶液50g均匀地混合搅拌，然后进行冷冻干燥。使用液氮、将冷冻干燥材料在低温下粉碎后，粉碎的材料被压缩成型为棒状，由此得到含HGF的缓释制剂(HGF相对于生物高分子的配比：1w/w％)。

[制剂实施例9]

将HGF蛋白质1mg溶解在2mL的2w/v％端胶原溶液中后，进行冷冻干燥。将得到的复合体粉碎后，压缩成型为圆柱状，得到含HGF的缓释制剂(HGF相对于生物高分子的配比：2.5质量％)。

[制剂实施例10]

透明质烷的钠盐(特性粘度4500cc/g)0.58g与20mL的水混合，使其溶胀。接着，向该混合物中加入2mL的2N氢氧化钠，进行搅拌以形成均匀的溶液。然后加入2.4mL水中的二乙烯基砜0.10g并进行搅拌。将制得的混合物放置70分钟，之后，将得到的凝胶放入223mL的BioTris缓冲液(含0.15M的NaCl且pH约为7.2的磷酸盐缓冲液)，使其溶胀3小时。接着，向该混合物中加入1mL的2N HCl。1小时后，加入0.6mL的2N HCl，将该混合物放置16小时。随后加入0.35mL的2N HCl，之后，在缓冲液中缓慢地搅拌溶胀的凝胶3天。得到具有均匀的粘弹性的软凝胶。该凝胶用0.15M的NaCl透析5天。然后，将该凝胶与缓冲盐水中的1w/v％的HGF蛋白质混合，将HGF蛋白质的最终浓度调整为0.25w/v％，由此得到含HGF的制剂(HGF相对于生物高分子的配比：2.5w/w％)。

产业上的可利用性

本发明提供对脊髓损伤和脱髓鞘疾病的治疗有用的药剂。

序列表

<110>学校法人庆应义塾

国立大学法人大阪大学

克霖固鲁制药股份有限公司

<120>脊髓损伤治疗剂

<130>IP40-090286

<150>PCT/JP2007/053804

<151>2007-02-28

<160>3

<210>1

<211>728

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu

675 680 685

Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly

690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

725

<210>2

<211>723

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg

165 170 175

Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg

180 185 190

Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr

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210 215 220

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225 230 235 240

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325 330 335

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Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val

705 710 715 720

Pro Gln Ser

<210>3

<211>728

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>3

Met Met Trp Gly Thr Lys Leu Leu Pro Val Leu Leu Leu Gln His Val

1 5 10 15

Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Val Thr Ile Pro Tyr Ala Glu Gly

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Gln Lys Lys Arg Arg Asn Thr Leu His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys

35 40 45

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50 55 60

Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Lys Gly

65 70 75 80

Phe Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg

85 90 95

Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly

100 105 110

Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn

115 120 125

Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr

130 135 140

Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn

165 170 175

Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr

180 185 190

Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser

195 200 205

Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Pro Met

210 215 220

Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Asp Gln Gln Thr

225 230 235 240

Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe

245 250 255

Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro Arg Pro Trp Cys

260 265 270

Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Met

275 280 285

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305 310 315 320

Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Lys Cys

370 375 380

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385 390 395 400

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705 710 715 720

Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu

725

Claims

1、一种脊髓损伤治疗剂，含有HGF蛋白质作为有效成分。

2、根据权利要求1所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号1或2的氨基酸序列的蛋白质，具有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具有活性与HGF实质上相同的蛋白质，或者为具有活性与HGF实质上相同的所述蛋白质之一的部分肽。

3、根据权利要求1所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质。

4、根据权利要求1～3中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂适于局部用于脊髓损伤部位。

5、根据权利要求3所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为鞘内给药用注射剂的剂型。

6、根据权利要求3所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为通过缓释泵进行的鞘内给药用注射剂的剂型。

7、根据权利要求1～6中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为脊髓神经的脱髓鞘抑制剂。

8、一种脊髓损伤治疗剂，所述治疗剂含有HGF蛋白质作为有效成分，且在刚脊髓损伤后两周内给药。

9、一种脊髓损伤治疗剂，所述治疗剂含有HGF蛋白质作为有效成分，且在刚脊髓损伤后4天内给药。

10、一种脊髓损伤治疗方法，所述方法包括对脊髓损伤患者给予有效量的HGF蛋白质。

11、HGF蛋白质在制备脊髓损伤治疗剂中的应用。

12、一种脊髓损伤治疗用HGF蛋白质。

13、一种脱髓鞘疾病治疗剂，含有HGF蛋白质作为有效成分。

14、根据权利要求13所述的治疗剂，其中，所述脱髓鞘疾病为选自多发性硬化、视神经脊髓炎、Balo同心圆性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、希尔德病、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、进行性多灶性白质脑病(PML)、宾斯旺格病、缺氧性脑病、脑桥中央髓鞘溶解、格-巴二氏综合征、费希尔综合征和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)中的疾病。

15、根据权利要求13或14所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号1或2的氨基酸序列的蛋白质，为具有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具有活性与HGF实质上相同的蛋白质，或者为具有活性与HGF实质上相同的所述蛋白质之一的部分肽。

16、根据权利要求13或14所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质。

17、根据权利要求11～16中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂适于局部用于疾病部位。

18、根据权利要求17所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为鞘内给药用注射剂的剂型。

19、根据权利要求17所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为通过缓释泵进行的鞘内给药用注射剂的剂型。

20、一种脱髓鞘疾病治疗方法，所述方法包括对脱髓鞘疾病的患者给予有效量的HGF蛋白质。

21、HGF蛋白质在制备脱髓鞘疾病治疗剂中的应用。

22、一种脱髓鞘疾病治疗用HGF蛋白质。