KR101446711B1 - 간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주 및 그의 용도 - Google Patents

간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간세포 성장인자(HGF) 유전자 및 염기성 나선-고리-나선(bHLH) 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주, 상기 성체 줄기세포주의 제조 방법, 상기 성체 줄기세포주를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 신경계 질환 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포를 사용하면, 뇌졸중 후 수반되는 세포사멸에 의한 만성적인 신체장애를 극복할 수 있으므로 새로운 치료제로서 개발되거나, 뇌졸중을 비롯하여 파킨슨병, 알츠하이머병, 척수손상 등의 신경계 질환에 적용가능한 세포 대체 요법 및 유전자 치료 요법의 근간이 되는 등 임상 및 각종 연구를 위해 폭넓게 이용될 수 있다.

Description

간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주 및 그의 용도 {An adult stem cell transfected with hepatocyte growth factor gene and neurogenic transcription factor gene with basic helix-loop-helix motif and uses thereof}
본 발명은 간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF) 유전자 및 염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix; bHLH) 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주, 상기 성체 줄기세포주의 제조 방법, 상기 성체 줄기세포주를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 신경계 질환 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수(bone marrow)에서 조혈작용을 돕는 지지세포(stroma)로서 미분화상태를 유지하면서 뼈, 연골, 지방, 및 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포(mesodermal lineage cell)로 분화하는 특성을 가지기 때문에 인공조직을 개발하기 위한 재료로서 매우 유용하다.
중간엽 줄기세포가 뇌에서 신경교세포로 분화하는 잠재력을 지닌다고 보고되면서(Azizi., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4080-4085(1998); 및 Kopen., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10711-10716(1999)) 중간엽 줄기세포를 이용하여 중추신경계의 질병을 치료할 수 있다는 가능성이 제기된 바 있다(Li et al., Neurosci. Lett., 315, 67-70(2001); 및 Chen., et al., Stroke 32, 1005-1011(2001)).
이러한 미분화 세포들을 이용하여 인공 신경세포를 만들기 위한 분화방법으로는 성장인자 또는 호르몬을 사용하는 방법이 알려져 있으나, 이는 신경세포 이외의 다른 세포들이 추가로 생겨난다는 문제점이 있으며(Sanchez-Ramos., et al., Exp. Neurol., 164, 247-256(2000); Woodbury., et al., J. Neurosci. Res., 61, 364-370(2000); 및 Deng., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 282, 148-152(2001)), 이러한 현상은 특히 동물모델에 뇌이식시 두드러진다고 보고된 바 있다(Azizi., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4080-4085(1998); 및 Kopen., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10711-10716(1999)). 따라서, 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화되도록 유도하는 직접적인 방법의 개발이 계속 요구되고 있는 실정이다.
뉴로제닌(Neurogenin), 뉴로 D(NeuroD)는 신경계 형성에 있어 핵심적인 역할을 하는 염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix; bHLH) 계열의 전사인자로서 E12 또는 E47과 같은 bHLH 구조를 갖는 단백질과 복합체를 이루어, E-box(CANNTG) 또는 드물게는 N-box를 포함하는 DNA 서열에 결합한다. 이러한 결합은 bHLH 구조의 전사인자들이 신경세포의 분화를 증진시키는 조직 특이적인 유전자의 발현을 활성화하는데 필수적임이 밝혀져 있다(Lee, Curr. Opni. Genet. Dev., 7, 13-20(1997)).
이에 본 발명자들은 안정성이 높은 중간엽 줄기세포를 효과적으로 신경세포로 분화시키는 물질을 개발하기 위해 계속 연구한 결과, 중간엽 줄기세포에 뉴로제닌 또는 뉴로 D와 같은 bHLH 계열의 전사인자를 도입하여 이러한 전사인자를 지속적으로 발현하는 중간엽 줄기세포를 제조하고, 이를 동물모델의 뇌에 이식하였을 때 높은 비율로 신경세포로의 분화가 유도되는 것을 확인하였고(한국특허등록 제10-0519227호), 이를 토대로 뇌졸중 동물모델에서 신경세포로 분화 유도된 중간엽 줄기세포가 분화 유도되지 않은 중간엽 줄기세포에 비해 월등한 치료 효능을 나타낸다는 내용의 논문을 발표하였다(Kim., et al., Stem Cells. 26(9) 2217-2228 (2008)).
중간엽 줄기세포를 이용한 신경계 질환 치료방법의 가장 큰 장점은 다른 사람의 세포가 아닌 자가 세포를 이용한 치료가 가능하다는 것이다. 하지만, 실제 치료과정에서는 뇌졸중 발병 후 자가세포치료제의 투여까지 자가세포를 분리 및 배양하고, 유전자를 이입하기 위해서는 2 내지 4주간의 시간이 소요된다는 단점이 존재한다. 따라서, 임상에서 뇌졸중 이후 자가세포를 이식할 때 발생할 수 있는 시간소요적인 문제점을 극복하기 위해서는, 이러한 만성적인 손상에 대한 자가세포의 치료 효능을 검증 및 극대화할 수 있는 방안을 모색해야만 한다.
간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)는 분산인자(scatter factor)라고도 불리우는 헤파린 결합 당단백질로서 간 또는 신장과 같은 장기에서 섬유화를 강하게 억제하는 것으로 알려졌다(Silver et al., Nat. Rev. Neurosci 2004 5, 146-56 (2004)). 신경계 질환에서 아교섬유로 구성된 반흔(glial scar)은 손상에 의한 축삭 재생에 물리적으로 방해가 되는 것으로 알려져 있다 (Liu et al., Kidney Int 70, 238-40 (2006), Liu et al., Am. J. Phyiol. Renal. Physiol 287, 7-16 (2004)). 하지만 현재까지 간세포 성장인자를 이용한 뇌졸중 및 척수손상을 비롯한 신경계 질환에 관한 연구는 일부 진행된 사항이 있으나, 그 효과는 모두 급성 질환에 관한 것이고, 섬유화, 반흔과 관련하여 아직까지 간세포 성장인자에 의한 만성 손상 치료에 대한 시도는 발표된 바가 없다(Shimamura et al., Circulation 109, 424-31 (2004), Zhao et al., J. Cereb. Blood Flow Met. 26, 1176-88 (2006), Shi et al., Anesthesiology 113, 1109-1117 (2010)).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 간세포 성장인자가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 만성 뇌졸중 치료용 조성물을 개발하기 위해 예의노력한 결과, 중간엽 줄기세포에 bHLH 계열의 전사인자인 뉴로제닌 1을 도입하여 이러한 전사인자를 지속적으로 발현하는 중간엽 줄기세포를 제조하고, 상기 세포에 간세포 성장인자를 도입하여 이를 뇌졸중 동물모델에 이식하였을 때, 간세포 성장인자가 도입된 뉴로제닌 1을 발현하는 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF) 유전자 및 염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix; bHLH) 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 성체 줄기세포주의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 성체 줄기세포주를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명을 실시하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF) 유전자 및 염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix; bHLH) 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 제공한다.
본 발명에서 용어, "성체 줄기세포(adult stem cell)"는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화되는 미분화 상태의 세포를 의미하며, 상기 성체 줄기세포주는 골수, 지방조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 또는 낙태아로부터 유래한 줄기세포일 수 있다. 바람직하게 성체 줄기세포주는 골수 유래 성체 줄기세포주이고, 더욱 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포이다. 골수 유래 성체 줄기세포는 혈액 및 임파구를 생산할 수 있는 조혈모세포를 비롯하여 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC) 등 여러 종류의 성체 줄기세포를 가지고 있으며, 그 중 중간엽 줄기세포는 체외에서 증식이 용이하며 여러 가지 세포 형태(지방세포, 연골세포, 근육세포, 및 뼈세포)로 분화 가능한 세포로서(Caplan, A.I., J. Orthop. Res., 9:641-650, 1991; Beresford, J. N., et al., J. Cell Sci., 102:341-351, 1992; Pittenger, M.F., et al., Science, 284:143-147, 1999; Patricia, A. Z., et al., Tissue engineering, 7:211-227, 2001), 유전자 치료 및 세포 치료에 있어서 유용한 타겟(target)으로 이용될 수 있다(Banfi, A., et al., Exp. Hematology, 28:707-715, 2000).
본 발명에서 용어, "간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)"는 SF(scatter factor; 산란인자)라고도 하며, 중간엽 세포(mesenchymal cell)에 의해 생산되는 다기능성 이종이량체(heterodimer) 폴리펩티드를 의미한다. 상기 간세포 성장인자는 N-말단 핑거 도메인(finger domain) 및 4개의 크링글 도메인(Kringle domain)을 포함하는 69 kDa의 알파-체인, 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 프로테아제 도메인과 유사성을 갖는 34 kDa 베타-체인을 포함하는 구조로 이루어져 있다(Nakamura et al., 1989; Donate et al., 1994; Rawlings et al., 2002). 인간 간세포 성장인자는 생물학적으로 비활성인, 단일 체인 형태의 728개의 아미노산을 갖는 전구체로 합성되고, R494 잔기가 특이적 혈청 세린 프로테아제에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 간세포 성장인자가 된다. 활성 간세포 성장인자는 69 kDa의 알파-체인과 34 kDa의 베타-체인이 이황화결합으로 연결된 이종이량체이다. 본 발명에서는 이러한 간세포 성장인자를 성체 줄기세포주에 도입함으로써, 형질전환된 세포주를 수득하였다. 바람직한 간세포 성장인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다(GenBank Accession No. NM_000601.4 166~2352, 또는 BC130286.1 (76~2262).
본 발명에서 용어, "염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix; bHLH)"은 전사인자의 모양을 나타내는 말로서, 꽈배기(helix)처럼 꼬인 두 개의 분자가 고리(loop)로 연결되어 있는 것을 의미하며, 염기성 나선-고리-나선 계열의 전사인자는 다세포 동물의 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.
본 발명에서 bHLH 계열의 전사인자로는 신경형성 전사인자가 사용될 수 있으며, 신경형성 전사인자 유전자로는, 예를 들어, 뉴로제닌 1 유전자(GenBank Accession No. U63842, GenBank Accession No. U67776), 뉴로제닌 2 유전자(GenBank Accession No. 76207, GenBank Accession No. AF303001), 뉴로 D1 유전자(GenBank Accession No. U24679, GenBank Accession No. AB018693), MASH1 유전자(GenBank Accession No. M95603, GenBank Accession No. L08424), MATH3 유전자(GenBank Accession No. D85845), 및 E47 유전자(GenBank Accession No. M65214, GenBank Accession No. AF352579) 등의 염기서열 정보로부터 얻어지는 cDNA를 클로닝하거나 합성하여 사용할 수 있으며, 이와 동등하거나 유사한 활성을 나타낼 수 있다면 이들 서열의 일부가 변형, 결실, 치환된 것도 사용될 수 있다.
상기 bHLH 계열의 전사인자 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 뼈, 근육, 지방, 및 연골세포의 분화능은 억제되는 대신 신경세포의 잠재적 분화능을 갖게 되어, in vitro 상의 특정한 조건에서 신경세포로 분화될 수 있으며, 실험동물의 뇌조직에 이식되었을 때는 효과적으로 신경세포로 분화되는 것을 확인하였다(도 3).본 발명의 바람직한 실시예에서는 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 제조하였다.
본 발명에서 용어, "간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주"는 상기 서술한 간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자, 바람직하게는 서열번호 1의 간세포 성장인자 유전자 및 서열번호 2의 뉴로제닌1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 의미한다.
본 발명의 구체적인 하나의 양태로서, 간세포 성장인자 유전자는 벡터에 클로닝되어 성체 줄기세포에 도입되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus), MSV (Murine sarcoma virus) 및 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 뉴로제닌1 유전자의 도입을 위해 도면 2의 진뱅크 수탁번호 U63842의 유전자서열 중 coding region (55~768bp)을 pMSCV-puro 플라스미드에 클로닝하였다. 그 결과 얻은 pMSCV/puro-hNgn1를 레트로바이러스를 생산하는 세포주에 감염시켜 레트로바이러스벡터로 얻은 후 그 벡터를 성체 줄기세포주에 형질전환시켰다. 바람직하게 상기 벡터가 삽입된 성체 줄기세포주는 골수 유래 중간엽 줄기세포주이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 간세포 성장인자 유전자의 도입을 위해 진뱅크 수탁번호 NM_000601.4의 유전자서열 중 coding region (166~2352 bp)을 pShuttle-CMV에 클로닝한 후 pAdEasy-1과 재조합을 통하여 pAd-HGF를 얻었다. 상기 플라스미드를 PacI 제한효소를 이용하여 선형화 한 후(linearize) 아데노바이러스를 생산하는 세포주에 도입하여 얻은 Adeno-HGF 벡터로 성체 줄기세포주를 형질전환시켰다. 바람직하게 상기 벡터가 삽입된 성체 줄기세포주는 골수 유래 중간엽 줄기세포주이다.
본 발명의 "유전자가 도입된 성체 줄기세포"에서 유전자 도입은 형질전환 방법을 이용한다. 상기 간세포 성장인자 유전자를 도입하기 위한 형질전환 방법은 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 외부DNA 또는 외부DNA를 함유하는 바이러스벡터가 숙주에 도입되어 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해, 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 레트로바이러스와 아데노바이러스를 이용한 감염방법, DNA의 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 환원물질인 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민을 포함한 리포좀 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 실시예에서는 뉴로제닌이 함유된 레트로바이러스 벡터와 간세포 성장인자 유전자가 함유된 Adeno-HGF 벡터를 줄기세포에 감염시켜 형질전환시켰다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 서술한 바와 같이, 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주는 그 종류가 제한되지 않으며, 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 분화능을 가진 세포주이면 어떠한 세포주라도 본 발명의 세포주가 될 수 있다.
바람직하게 성체 줄기세포주는 골수, 지방조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 또는 낙태아로부터 유래한 성체 줄기세포주일 수 있다. 더욱 바람직하게 성체 줄기세포주는 골수 유래 성체 줄기세포주이다. 더욱 더 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포주이다.
특정 유전자를 줄기세포주에 도입하는 것은 형질전환의 방법을 이용한다. 상기 서술한 바와 같이, 형질전환의 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 공지의 방법에 따라 제한없이 사용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 MSCV-puro/hNgn1 및 Adeno-HGF를 감염시켜 얻은 형질전환된 세포주를 제조하였다. MSCV-puro/hNgn1 유전자는 중간엽 줄기세포에 감염시킨 후 puromycin으로 선별하였으며, Adeno-HGF는 중간엽줄기세포에 감염 후, HGF에 대한 항체를 이용하여 발현을 확인하여 m.o.i.(multiplicity of infection)를 선정하여 사용하였다. 바람직하게 본 발명에서는 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 골수 유래의 성체 줄기세포주를 생산하기 위하여 다음과 같은 과정을 거친다.
(a) 성체 줄기세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 성체 줄기세포에 서열번호 2의 염기서열을 가지는 뉴로제닌 1 유전자를 도입하는 단계;
(c) 상기 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포를 선별하는 단계;
(d) 상기 선별된 성체 줄기세포에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 간세포 성장인자 유전자를 도입하는 단계;
(e) 상기 뉴로제닌 1 유전자와 간세포 성장인자 유전자가 함께 도입된 성체 줄기세포를 선별하는 단계; 및
(f) 상기 선별된 성체 줄기세포를 선택적으로 배양하는 단계.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 성체 줄기세포 중 골수 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였으며, 상기 분리된 중간엽 줄기세포를 10% FBS, 10 ng/㎖ bFGF,, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하며, 4번 계대배양된 세포주를 실험에 사용하였다.
뉴로제닌 1 유전자로 형질전환하는 단계는 pMSCV-puro 벡터에 T4 DNA 리가제(Roche사)를 이용하여 결합시킨 후 대장균 DH5a에 형질도입시켜 최종적으로 pMSCV-puro 벡터에 인간 뉴로제닌 1(human neurogenin 1; hNgn1) 유전자가 삽입된 pMSCV-puro/hNgn1 벡터를 제작하여, 계대배양된 세포주에 뉴로제닌 1 유전자를 도입하였다. 뉴로제닌 1이 도입된 세포는 계대배양시 퓨로마이신(puromycin, Sigma사)을 2㎍/㎖이 되도록 배지에 첨가하여 뉴로제닌 1이 도입된 세포만이 살아남을 수 있도록 2주간 선별하였다. 상기 과정을 거쳐 최종적으로 뉴로제닌 1의 발현이 지속적으로 발현되는 세포주를 제작하였다.
간세포 성장인자 유전자로 형질전환하는 단계는 간세포 성장인자가 클로닝된 pShuttle-CMV-HGF와 pAdEasy-1을 대장균 (BJ 5183 균주)에 전기천공법으로 동시 도입시킨 후 카나마이신(50㎍/㎖)을 함유한 배지에서 배양시켜 콜로니를 형성시켰다. 각 콜로니에서 플라스미드를 얻은 후 표준화된 제한 효소를 이용하여 후보 콜로니를 선정한 후 염기서열을 확인하여 pAd-HGF를 얻었다. 상기 pAd-HGF를 PacI 제한효소를 이용하여 선형화 한 후, CaCl2 침전법으로 HEK293 세포에 도입하여 Adeno-HGF 바이러스를 포함하는 배양액을 얻어 사용하였다. 간세포 성장인자가 성공적으로 도입된 중간엽 줄기세포주를 선별하기 위하여, 간세포 성장인자의 항체를 이용하여 면역세포화학 염색법을 통해 간세포 성장인자 단백질 발현을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "신경계 질환"은 신경 특히, 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 용어를 의미한다. 상기 신경계 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer disease), 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 간질(epilepsy), 정신분열증(schizophrenia), 급성 뇌졸중(acute stroke), 만성 뇌졸중(chronic stroke) 또는 척수손상(spinal cord injuries) 일 수 있으며, 바람직하게는 만성 뇌졸중이다.
본 발명에서 용어, "예방"은 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 이용하여 신경계 질환과 관련된 모든 질병의 발병을 억제 또는 지연하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 상기 세포주를 사용하여 신경계 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 형질전환된 줄기세포를 이용하여 만성 뇌졸중을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 치료를 위해 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및/또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
또한, 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 간세포 성장인자 유전자 및 염기성 나선-고리-나선 계열의 신경형성 전사인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포를 사용하면, 뇌졸중 후 수반되는 세포사멸에 의한 만성적인 신체장애를 극복할 수 있으므로 새로운 치료제로서 개발되거나, 뇌졸중을 비롯하여 파킨슨병, 알츠하이머병, 척수손상 등의 신경계 질환에 적용가능한 세포 대체 요법 및 유전자 치료 요법의 근간이 되는 등 임상 및 각종 연구를 위해 폭넓게 이용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 중간엽 줄기세포의 지방세포, 연골세포 및 뼈세포로의 분화능을 확인한 사진으로, 도 1a는 오일 레드 O에 의해 염색된, 중간엽 줄기세포에서 분화된 지방세포를 나타내는 사진이고, 도 1b는 알시안 블루로 염색된, 중간엽 줄기세포에서 분화된 연골세포를 나타내는 사진이며, 도 1c와 1d는 각각 알칼라인 포스파타제와 본 코사로 염색된, 중간엽 줄기세포에서 분화된 뼈세포를 나타내는 사진이다.
도 2는 인간 뉴로제닌 1 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터(상위 패널)가 도입된 293T 세포에서 발현되는 인간 뉴로제닌 1을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과(하위 패널)를 나타낸 사진이다.
도 3은 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 GFP를 발현하는 아데노바이러스로 감염시켜 흰 쥐의 선조체(striatum)에 이식 2주 후, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 수준을 신경세포 마커인 Tuj1(Beta-Tubulin-III)에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 인간 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포의 세포 내부(cell lysate) 및 세포 외부(conditioned medium; CM)에서 간세포 성장인자의 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 인간 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스 벡터가 순차적으로 희석되어 도입된 중간엽 줄기세포에서의 간세포 성장인자의 발현 수준을 면역세포화학 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 뇌졸중 동물모델에서 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 Adhesive Removal Test(좌측 패널) 및 Rotarod Test(우측 패널) 동물행동분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 뇌졸중 동물모델에서 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 자기공명영상을 통해서 확인한 결과(좌측 패널)를 나타낸 사진(상위 패널)이고, 이로 인한 경색 부위를 정량화한 결과(하위 패널)를 나타낸 그래프이다.
도 8은 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포에 의한 경색부위에서의 신경교세포 및 신경세포의 발현 분포를 GFAP 및 MAP2에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 뇌졸중 동물모델에서 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 세포 이식 시기별로 정리하여 나타낸 모식도(상위 패널) 및 그래프(하위 패널)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
실시예 1-1: 중간엽 줄기세포의 분리
멸균된 15 ㎖ 시험관에 4 ㎖의 HISTOPAQUE 1077(Sigma사) 및 골수은행(사단법인 한국골수은행협회(KMDP))으로부터 제공받은 골수 4 ㎖를 조심스럽게 넣은 후, 원심분리기를 이용해서 실온에서 400 × g로 30분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 파스퇴르 피펫을 이용하여 중간의 혈액연층(buffy coat) 0.5 ㎖를 조심스럽게 채취하여 멸균된 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline; PBS) 10 ㎖이 담긴 시험관에 옮겼다. 옮겨진 혈액연층을 다시 250 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고, 10 ㎖의 인산염 완충용액을 첨가하여 부드럽게 현탁시킨 후, 10분 동안 250 × g에서 원심분리 하였다.
상기 과정을 2회 반복실시한 후, 최종 침전물에 10% FBS(GIBCO사)를 함유하는 DMEM 배지(GIBCO사)를 첨가하여 100㎜ 동물세포 배양용기에 1 × 107 세포가 되도록 분주하였다. 상기 세포를 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2 및 95% 공기를 공급하면서 4시간 동안 배양하였다. 배양용기의 바닥에 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 상층액을 제거하고, 새로운 배지를 첨가하여 배양기에서 배양하였다.
실시예 1-2: 중간엽 줄기세포의 배양
상기 실시예 1-1에서 분리한 중간엽 줄기세포를 CO2 인큐베이터에서 37℃를 유지하면서 2일 간격으로 중간엽 줄기세포 배지(10% FBS + 10 ng/㎖ bFGF(Sigma사) + 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO사) + 89% DMEM)로 교체하면서 배양하였다. 세포가 배양용기 면적의 약 80% 정도의 밀도로 증식한 뒤에는 0.25% 트립신/0.1 mM EDTA(GIBCO사)를 이용하여 배양용기에 부착한 세포를 부유시킨 후 배지를 첨가하여 1:20으로 희석한 다음 새로운 배지에서 계대배양하였다. 세포 중 일부는 10% DMSO (Sigma사)가 첨가된 배지를 이용하여 동결보관하였으며, 이들의 지방세포, 연골세포 및 뼈세포로의 분화능을 다음과 같이 확인하였다.
실시예 1-3: 지방세포로의 분화
중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 배지에서 일정 기간 배양한 후, 지방세포 분화유도 배지(1 μΜ 덱사메타손(dexamethasone, Sigma사), 0.5 μM 메틸-이소부틸잔틴(Sigma사), 10㎍/㎖ 인슐린(GIBCO사), 100 nM 인도메타신(indomethacin, Sigma사), 및 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지)에서 48시간 동안 배양하고, 지방세포 유지배지(10㎍/㎖ 인슐린 및 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지)에서 1주일 동안 배양한 후, 오일 레드 O(oil red O) 염색을 실시하였다(도 1a). 도 1a는 오일 레드 O에 의해 염색된, 중간엽 줄기세포에서 분화된 지방세포를 나타내는 사진이다. 도 1a에서 보듯이 세포 내에 붉게 염색된 지방방울(lipid droplet)을 관찰함으로써 중간엽 줄기세포가 지방세포로 분화되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 1-4: 연골세포로의 분화
중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 배지에서 일정 기간 배양한 후, 트립신을 이용해 세포를 부유시킨 다음 2 × 105 세포를 시험관에 옮겨 원심분리한 후, 0.5 ㎖의 무혈청 연골세포 분화유도 배지(50 ㎖ 하이-글루코스 DMEM(GIBCO사), 0.5 ㎖ 100 × ITS(0.5㎎/㎖ 소 인슐린, 0.5㎎/㎖ 인간 트랜스페린, 0.5㎎/㎖ 셀렌산 나트륨; Sigma사), 50㎕ 리놀렌산-알부민(Sigma사), 0.2 mM 100 nM 덱사메타손, 및 10 ng/㎖ TGF-β1(Sigma사))를 첨가하여 배양하였다. 상기 배지를 3일 간격으로 교체하면서 3주일 동안 배양한 후, 4% 파라포름알데히드 용액을 이용해 상기 세포를 고정하였고, 마이크로톰으로 절편을 만든 후 알시안 블루(alcian blue) 염색을 실시하였다(도 1b). 도 1b는 알시안 블루로 염색된, 중간엽 줄기세포에서 분화된 연골세포를 나타내는 사진이다. 도 1b에서 보듯이, 와세포 외부의 연골기질성분이 파랗게 염색되었고, 연골소강(lacuna) 내에 연골세포가 존재하는 것을 관찰함으로써 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 1-5: 뼈세포로의 분화
중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 배지에서 일정 기간 배양한 후, 3일 간격으로 뼈세포 분화유도 배지(10 mM β-글리세롤 포스페이트(Sigma사), 0.2 mM 아스코르베이트-2-포스페이트(Sigma사), 10 nM 덱사메타손 및 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지)로 교체하면서 2주일 동안 배양한 후, 파라포름알데히드 용액으로 고정하였고, 폰 코사(Von Kossa) 및 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase; AP) 염색을 실시하였다(도 1c 및 1d). 도 1c와 1d는 각각 알칼라인 포스파타제와 본 코사로 염색된, 중간엽 줄기세포에서 분화된 뼈세포를 나타내는 사진이다. 도 1c 및 1d에서 보듯이, 세포 외부에 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 형태의 칼슘이 염색되고, 세포 내 알칼린 포스파타아제 활성이 증가함을 확인함으로써, 중간엽 줄기세포가 뼈세포로 분화될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 인간 신경전사인자 뉴로제닌 1의 레트로바이러스 제작 및 발현
실시예 2-1: 인간 뉴로제닌 1 레트로바이러스 벡터 제작
U63842의 유전자 서열 중 코딩영역(55~768bp)에 해당하는 서열번호 2의 서열을 pMSCV-puro 벡터(Clontech사)에 T4 DNA 리가제(Roche사)를 이용하여 결합시킨 후, 대장균 DH5a에 형질도입시켜 최종적으로 pMSCV-puro 벡터에 인간 뉴로제닌 1(human neurogenin1; hNgn1) 유전자가 삽입된 pMSCV-puro/hNgn1 벡터를 제작하였다. 제작된 pMSCV-puro/hNgn1 벡터는 293T 세포에 칼슘 포스페이트 침전법에 도입한 후 웨스턴 블롯을 통해 그 발현을 확인하였다(도 2). 도 2는 인간 뉴로제닌 1 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터(상위 패널)가 도입된 293T 세포에서 발현되는 인간 뉴로제닌 1을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과(하위 패널)를 나타낸 사진이다.
실시예 2-2: 뉴로제닌 1을 포함하는 레트로바이러스 제작
pMSCV-puro/hNgn1 벡터를 칼슘 포스페이트 침전법으로 레트로바이러스 포장(packaging) 세포인 PA317(ATCC CRL-9078) 또는 PG13(ATCC CRL-10686) 세포에 형질도입하여 48시간 경과 후, 배양액만을 취하여 0.45㎛ 크기의 여과막으로 여과하여 레트로바이러스 용액을 수득하였다. 레트로바이러스 용액은 분주하여 -70℃에 보관하여 사용하였다.
실시예 3: 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 제작 및 생체 내에서 신경세포로의 분화
실시예 3-1: 중간엽 줄기세포로 뉴로제닌 1의 도입
중간엽 줄기세포를 100 mm 배양용기에 70%정도 차도록 배양한 후, 실시예 2-2에서 얻은 4 ㎖의 뉴로제닌 1 레트로바이러스 용액에 폴리브렌(polybrene, Sigma사) 8㎍/㎖을 첨가한 용액을 가하여 8 시간 동안 배양하였다. 이어서 레트로바이러스 용액을 제거하고 10 ㎖의 간엽 줄기세포 배지를 가하여 24 시간 동안 배양한 후, 다시 레트로바이러스를 감염시켰다. 이 과정을 1-4회 반복한 후, 최종적으로 간엽 줄기세포를 트립신으로 떼어내어 배지로 1:20으로 희석하여 계대배양하였다. 계대배양 시 퓨로마이신(puromycin, Sigma사)을 2㎍/㎖이 되도록 배지에 첨가하여 레트로바이러스가 감염된 세포만이 살아남을 수 있도록 2주간 선별하였다. 최종적으로 퓨로마이신에 저항성을 갖는 중간엽 줄기세포를 뉴로제닌 1을 발현하는 세포로 사용하였다.
실시예 3-2: 이식용 세포의 표식
뉴로제닌 1 유전자가 중간엽 줄기세포의 생체내 이식률 및 신경세포로의 분화를 증가시키는지 여부를 확인하기 위하여, 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 GFP를 발현하는 아데노바이러스로 감염시켰다.
아데노바이러스를 감염시키는 과정은 1 ×108 pfu/㎖의 역가를 갖는 아데노바이러스 용액이 100 M.O.I.(multiplicity of infection)로 희석되도록 배양용액에 첨가한 후 3시간 동안 배양함으로써 수행하였다. 아데노바이러스 감염 후 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 0.25% 트립신/0.1% EDTA를 이용하여 부유시킨 후 1㎕당 3 ×103 세포를 포함하도록 PBS로 희석하여 생체이식에 사용하였다.
실시예 3-3: 생체이식( Transplantation )
스프라그-다울리(Sprague-Dawley)계 성숙한 흰쥐 암컷(250g)((주)대한바이오링크)을 이용하여 다음과 같은 이식실험을 수행하였다.
먼저, 흰쥐에 75㎎/㎏의 케타민(ketamine) 및 5㎎/㎏의 럼펀(rumpun)을 복강 내 주입하여 마취시킨 후, 절개할 부위의 털을 제거하였으며, 세포 주입시에 흰쥐가 움직이지 않도록 입체 정위 프레임(stereotaxic frame)에 귀와 입을 고정시켰다. 절개할 머리 부분을 70% 에탄올로 소독하고, 정수리 부분을 수직으로 약 1 ㎝ 절개하였다. 이어서, 10㎕ 헤밀턴 주사기에 인간 뉴로제닌 1을 발현하는 중간엽 줄기세포(MSC/hNgn1) 3 × 103 세포가 포함된 PBS 1㎕를 넣고, 헤밀턴 주사기 걸이에 부착시켰다. 정수리점(bregma)을 찾아 정수리점 AP, + 1.0; ML 3.0; LV, +4.0 좌표 위치를 표시하였고, 드릴을 이용하여 표시된 부위의 두개골만을 뚫어 경질막(dura)을 노출시킨 후, 정확한 좌표에 헤밀턴 주사기로 1㎕의 세포를 0.2㎕/분의 속도로 주입하였다. 주입 20분 후 주사기를 아주 천천히 제거하였고, 절개부분을 소독된 봉합실과 바늘을 이용하여 봉합하였으며, 소독약으로 소독하였다. 상기 부위로부터 뇌를 꺼내기 전까지 하루에 한 번씩 면역억제제인 사이클로스포린 A(cyclosporin A, Sigma사) 5㎎/㎏을 복강내 주사하였다.
실시예 3-4: 조직절편 제작
생체이식 2주 후, 흰쥐에 75㎎/㎏의 케타민 및 5㎎/㎏의 럼펀(rumpun)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 가슴을 열고 좌심실에 주사바늘을 삽입하여 생리식염수로 관류 세척(perfusion wash-out)하였고, 0.1M 인산염 완충액(pH 7.4)에 녹인 파라포름알데히드 용액으로 관류 고정(perfusion fixation)한 다음, 뇌를 적출하여 동일한 고정액에 담아 4℃에서 16시간 동안 후고정(post-fixation)하였다. 후고정된 뇌를 30% 수크로오스에 넣어 24시간 이상 침적시킨 후, 슬라이딩 마이크로톰(sliding microtome)를 이용해 35㎛ 두께로 조직을 연속절단하여 이를 실란(Silane)이 코팅된 슬라이드(MUTO PURE CHEMICAS CO.,LTD사, Japan)에 부착시키고, 4℃의 PBS에 저장하였다. 조직절편이 부착되어있는 슬라이드를 1 × PBS/0.1% Triton X-100에 30분 동안 담가두었다.
실시예 3-5: 면역조직화학염색
면역염색의 첫 단계로서 10% 정상 말 혈청(normal horse serum; NHS)을 이용해 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 반응을 감소시켰다. 일차 항체는 각각 1:200으로 희석한 MAP2(Microtubule-associated protein-2) 항체 및 GFP 항체를 사용하였으며, 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1 × PBS/0.1% Triton X-100을 이용해 15분씩 3회 세척하였다. 상기 GFP 일차 항체를 검출하기 위하여 FITC-표지된 마우스 면역글로불린-G에 대한 이차 항체(Vector사)를 1:200으로 희석하여 염색하였고, 상기 MAP2 일차 항체를 검출하기 위하여 텍사스 레드(Texas red)-표지된 마우스 면역글로불린-G에 대한 이차 항체(Vector사)를 1:200으로 희석하여 염색하였다(도 3). 도 3은 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 GFP를 발현하는 아데노바이러스로 감염시켜 흰 쥐의 선조체(striatum)에 이식 2주 후, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 수준을 신경세포 마커인 Tuj1(Beta-Tubulin-III)에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 상기 도 3에서 보듯이, GFP를 발현하는 세포와 MAP2를 발현하는 세포가 겹치는 것을 관찰하였다. 상기 결과로부터, 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화되었음을 확인하였다.
실시예 4: 간세포 성장인자 유전자가 도입된 아데노바이러스 벡터 제작 및 발현 확인
실시예 4-1: 간세포 성장인자 아데노바이러스 벡터 제작
간세포 성장인자는 GenBank Accession No. NM_000601.4의 유전자서열 중 코딩영역(166~2352 bp)에 해당하는 서열번호 1의 염기서열을 pShuttle-CMV 벡터에 도입하여 pShuttle-CMV-HGF를 제작하였다. 이 벡터와 pAdEasy-1을 대장균 (BJ 5183 균주)에 전기천공법으로 동시 도입시킨 후 Kanamycin (50㎍/㎖) 을 함유한 배지에서 배양시켜 콜로니를 형성시켰다. 각 콜로니에서 플라스미드를 얻은 후 표준화된 제한 효소를 이용하여 후보 콜로니를 선정한 후 염기서열을 확인하여 간세포 성장인자가 들어간 pAd-HGF 벡터를 얻었다. 상기 pAd-HGF를 PacI 제한효소를 이용하여 선형화 한 후, CaCl2 침전법으로 HEK293 세포에 도입하여 Adeno-HGF 바이러스를 포함하는 배양액을 얻어 사용하였다.
실시예 4-2: 웨스턴 블랏을 이용한 간세포 성장인자 아데노바이러스의 발현 확인
간세포 성장인자 유전자가 도입된 아데노바이러스에서 간세포 성장인자가 정상적으로 발현되는지 확인하기 위하여, 상기 아데노바이러스를 농도별로 중간엽줄기세포에 2시간 동안 감염시킨 후 생성된 간세포 성장인자를 웨스턴 블롯을 통해 세포내 단백질(cell lysate) 및 세포외 단백질(conditioned-medium; CM) 수준에서 분석하였다(도 4). 도 4는 인간 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포의 세포 내부(cell lysate) 및 세포 외부(conditioned medium; CM)에서 간세포 성장인자의 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 4에서 보듯이, 중간엽 줄기세포에 감염시킨 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스의 농도에 비례하여 간세포 성장인자가 세포 내부에 생성되는 것을 확인하였다.
실시예 4-3: 면역세포화학 염색법을 이용한 간세포 성장인자 아데노바이러스 의 발현 확인
세포내 간세포 성장인자의 발현 분포를 확인하기 위하여 면역세포화학 염색법을 실시하였다. 중간엽 줄기세포에 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스를 농도별로 감염시킨 후, 상기 세포를 4% 포르말린으로 10분 동안 고정하였고, 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum; NGS)을 이용해 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적인 반응을 감소시켰다. 일차 항체는 1:200으로 희석한 간세포 성장인자 항체를 사용하였으며, 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1 × PBS/0.1% Triton X-100을 이용해 15분씩 3회 세척하였다. 상기 간세포 성장인자 일차 항체를 검출하기 위하여 Alexa 488-표지된 마우스 면역글로불린-G에 대한 이차 항체(Invitrogen사)를 1:250으로 희석하여 염색하였고, Hoechst를 이용하여 세포핵을 교차염색하였다(도 5). 도 5는 인간 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스 벡터가 순차적으로 희석되어 도입된 중간엽 줄기세포에서의 간세포 성장인자의 발현 수준을 면역세포화학 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 5에서 보듯이, 중간엽 줄기세포에 감염시킨 간세포 성장인자를 발현하는 아데노바이러스의 농도에 비례하여 간세포 성장인자가 세포 내부에 생성되는 것을 확인하였다.
실시예 5: 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포에 간세포 성장인자 유전자 도입 및 이의 뇌졸중 동물모델에 이식
실시예 5-1: 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포에 간세포 성장인자 유전자 도입
인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포가 100㎜ 배양용기 면적의 약 70%의 밀도로 증식한 후, 상기 실시예 4에서 수득한 간세포 성장인자를 포함하는 아데노바이러스 용액을 2시간 동안 50 M.O.I.로 감염시켰으며 PBS를 이용해 3차례 세척한 후, 트립신을 이용해 배양용기에 부착된 중간엽 줄기세포를 부유시켰다.
실시예 5-2: 뇌졸중 동물모델 제작
200g 내지 250g 무게의 성체 수컷 SD-랫트를 70% N2O 및 30% O2가 포함된 5% 이소플루란(isofluran) 마취가스로 마취하였다. 이후, 목근육을 절제하여 우측 총경동맥(right common carotid artery; CCA), 우측 외경동맥(right external carotid artery; ECA), 및 우측 내경동맥(right internal carotid artery; ICA)을 노출시키고, 4-0 나일론 봉합사(nylon suture)를 CCA로부터 ICA쪽으로 약 20㎜ 내지 22㎜ 정도 밀어 넣어 우측 중간 대뇌동맥(right middle cerebral artery; MCA)를 결찰시켰으며, 120분 후에 나일론 봉합사를 제거하였다. 수술이 진행되는 동안 쥐의 체온을 37.8℃로 일정하게 유지하였고, 모든 수술 도구는 멸균하여 사용하였다.
실시예 5-3: 뇌졸중 동물모델에 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 이식
뇌졸중 유도 4주 후, 입체 정위 고정장치(stereotaxic apparatus)로 흰쥐를 고정시키고, 25-가우스 해밀톤 시린지를 이용하여 브레그마(bregma)로부터 AP= + 0.5㎜, ML = 3.5㎜, DV = 5.0㎜ 위치 및 AP = - 1.0㎜. ML = 3.0, DV = 2.5㎜ 위치에 각각 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포 5.0 ×105 개를 분당 0.5㎕의 속도로 이식하였다.
세포이식 종료 약 5분 후, 해밀톤 시린지를 제거하였다. 이식 세포로는 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포 이외에, 정상 중간엽 줄기세포, 간세포 성장인자 유전자가 도입된 정상 중간엽 줄기세포, 인간 뉴로제닌 1이 도입된 중간엽 줄기세포, 및 PBS를 사용하였다.
실시예 6: 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포에 간세포 성장인자 유전자 도입 및 뇌졸중 동물모델에서의 유효성 평가
실시예 6-1: 뇌졸중 동물모델에서 중간엽 줄기세포의 유효성 평가를 위한 기준 확립
뇌손상을 갖는 동물에 이식한 중간엽 줄기세포의 유효성을 평가하기 위하여, 자기공명영상기법 및 동물행동분석을 실시하였다. 흰쥐에서 중간 대뇌동맥폐색(Middle cerebral artery occlusion) 방법으로 뇌졸중을 유도하고, 4주 후에 3.0T MRI인 자기공명영상 및 행동분석을 토대로 균질한 뇌손상을 갖는 동물만 선별하여 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 이식하였다.
흰쥐에 75㎎/㎏의 케타민 및 5㎎/㎏의 럼펀(rumpun)을 복강내 주입하여 마취시킨 후, 35 millitesla/m이 가능한 경사자장 시스템(gradient system)이 구비되어 있는 3.0T MRI인 자기공명영상장비를 이용해 뇌경색 부위의 영상을 촬영하였다. 패스트 스핀-에코 기법(Fast spin echo sequence)을 이용하였고, T2 강조(T2-weighted) 영상을 획득하였으며 영상을 획득하기 위해 사용한 파라미터는 반복 시간(repetition time), 4,000㎳; 유효 에코 시간(effective echo time), 96㎳; 시야(field of view), 55 × 55㎟; 이미지 매트릭스(image matrix), 256 × 256; 슬라이스 두께(slice thickness), 1.5㎜; 숙임각(flip angle), 90°흥분수(number of excitations). 2; 픽셀 치수(pixel size), 0.21 × 0.21㎟ 이다.
동물의 행동을 분석하기 위하여, 부착물 제거 테스트(Adhesive removal test) 및 로타로드 테스트(Rotarod test)의 행동분석을 실시하였다. 부착물 제거 테스트는 실험동물의 양 손 등에 10㎜ ×10㎜의 테이프를 붙이고, 양 손등의 테이프를 제거하는 데에 걸리는 시간을 측정하는 테스트이고, 로타로드 테스트는 5분 동안 4에서 40rpm까지 가속되는 원통형 장비 위에서 실험동물이 뛰는 시간을 측정하는 테스트이다. 모든 동물은 뇌졸중을 유도하기 2주 전부터 부착물 제거 테스트는 10초 이내, 로타로드 테스트는 300초 이상을 수행하는 동물들만 선별하여 사용하였다.
실시예 6-2: 뇌졸중 동물모델에서 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능에 대한 유효성 평가
뇌졸중 유도 4주 후에 동물행동분석 및 자기공명영상을 통해 균질한 손상을 갖는 동물만을 선별하였다. 상기 뇌졸중 동물모델에 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 비롯하여 대조군인 PBS, 정상 중간엽 줄기세포, 간세포 성장인자 유전자가 도입된 정상 중간엽 줄기세포, 및 인간 뉴로제닌 1이 도입된 중간엽 줄기세포 등 총 5그룹의 세포를 이식하여, 상기 중간엽 줄기세포의 뇌졸중 동물모델에서의 유효성을 동물행동분석 및 자기공명영상을 토대로 평가하였다(도 6). 도 6은 뇌졸중 동물모델에서 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 부착물 제거 테스트(좌측 패널) 및 로타로드 테스트(우측 패널)의 동물행동분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, PBS, 간세포 성장인자 유전자가 도입된 정상 중간엽 줄기세포, 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 뇌졸중 유도 4주 후에 이식하였을 때, 치료 효능이 전혀 관찰되지 않았던 반면, 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 이식하였을 때는 뚜렷한 치료 효능이 관찰되었다.
상기 결과로부터, 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 뇌졸중 동물모델에의 이식은 뇌졸중 모델에서 뇌손상에 의한 운동 및 감각능력 소실에 대해 높은 치료 효능을 갖는다는 것을 확인하였다.
또한, 뇌졸중 동물모델에서 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 자기공명영상을 통해서 확인하였다(도 7). 도 7은 뇌졸중 동물모델에서 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 자기공명영상을 통해서 확인한 결과(좌측 패널)를 나타낸 사진(상위 패널)이고, 이로 인한 경색 부위를 정량화한 결과(하위 패널)를 나타낸 그래프이다. 도 7에서 보듯이, 뇌졸중 유도 28일 후에 PBS 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 주입하였을 때, 뇌경색 부위가 줄어들지 않았던 반면, 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 주입하였을 때는 뇌경색 부위가 줄어드는 것을 관찰하였다.
상기 결과로부터, 간세포 성장인자 유전자가 도입되지 않은 인간 뉴로제닌 1을 발현하는 중간엽 줄기세포에 비해, 간세포 성장인자 유전자가 도입된 인간 뉴로제닌 1을 발현하는 중간엽 줄기세포는 뇌경색 치료에 높은 효능을 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 7: 뇌졸중 동물모델에서 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능 기전 분석
경색 부위에 대한 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능 기전을 확인하기 위하여, 조직절편을 제작한 후 면역조직화학 염색법을 통해 분석하였다.
실시예 7-1: 조직절편 제작
생체이식 8주 후, 흰쥐를 실시예 3-4와 같이 마취시켜 뇌를 적출하였다. 적출한 뇌를 고정액에 담아 4℃에서 16시간 동안 후고정하였고, 후고정된 뇌를 2㎜ 두께로 절편한 후 자동 조직 가공기(automated tissue processor)에서 탈수시켰으며, 조직 내로 자일렌(Xylene, Duksan사) 및 파라핀(Paraffin, Merk사)을 침투시켰다. 파라핀이 침투된 조직을 파라핀으로 다시 감싸고(embedding), 로타리 마이크로톰(Rotary microtome, Leica사)를 이용하여 5㎛ 두께로 절편하여 이를 실란(Silane)이 코팅된 슬라이드(MUTO PURE CHEMICAS CO.,LTD사, Japan)에 부착시켰다. 면역염색의 첫 단계로서 조직의 항원성을 부활시키기 위하여 10mM 시트르산 나트륨(sodium citrate, Sigma사)에 조직을 담그고, 마이크로웨이브(microwave)를 이용하여 99℃에서 10분간 가열하고 상온에서 20분간 냉각하였다.
실시예 7-2: 면역조직화학염색
상기 실시예 7-1의 조직절편이 부착되어 있는 슬라이드를 1X PBS/0.1% Triton X-100에 30분 동안 담가두었다. 면역염색의 첫 단계로 정상 염소 혈청을 이용해 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 반응을 감소시켰다. 일차 항체는 각각 1:200으로 희석한 MAP2 및 GFAP 항체를 사용하였으며, 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1X PBS/0.1% Triton X-100을 이용해 15분씩 3회 세척하였다. 상기 MAP2 일차 항체를 검출하기 위하여 Alexa 488-표지된 마우스 면역글로불린-G에 대한 이차 항체(Invitrogen사)를 1:250로 희석하여 염색하였고, 상기 GFAP 일차 항체를 검출하기 위하여 Alexa 568-표지된 마우스 면역글로불린-G에 대한 이차 항체(Invitrogen사)를 1:250로 희석하여 염색하였다.
우선, 뇌의 섬유화를 담당하는 세포인 신경교세포 마커 GFAP의 발현 분포를 확인하였다(도 8). 도 8은 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포에 의한 경색부위에서의 신경교세포 및 신경세포의 발현 분포를 GFAP 및 MAP2에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 8에서 보듯이, 뇌졸중 유도(MCAo) 4주 후에 뇌경색 부위에 PBS, 간세포 성장인자 유전자가 도입된 정상 중간엽 줄기세포, 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 이식하였을 때, 뇌졸중 유도(MCAo) 12주차에 신경교세포의 밀집에 변화가 없었던 반면, 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 이식하였을 때는 신경교세포의 밀집이 분산되는 것을 관찰하였다.
다음으로, 신경세포 마커인 MAP2의 발현 분포를 확인한 결과, PBS 및 간세포 성장인자 유전자가 도입된 정상 중간엽 줄기세포에 비해, 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포, 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 이식하였을 때, 신경세포가 보다 많이 발현되는 것을 관찰하였다.
상기 결과로부터, 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 신경세포로의 분화가 이루어졌음을 확인하였고, 그 중에서도 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 뇌에서 경화섬유 생성에 관여하는 신경교세포의 군집을 저해한다는 것을 확인함으로써, 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 만성 뇌손상에 대한 치료적 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 8: 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 만성 뇌손상에 대한 치료적 효과
상술한 실험결과를 종합하여, 간세포 성장인자 유전자 및 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 만성 뇌손상에 대한 치료적 효과를 확인하였다(도 9). 도 9는 뇌졸중 동물모델에서 인간 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료 효능을 세포 이식 시기별로 정리하여 나타낸 모식도(상위 패널) 및 그래프(하위 패널)이다. 도 9에서 보듯이, 뇌졸중 동물모델에서 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포의 치료효능을 세포 이식 시기별로 확인한 결과, 급성시기인 뇌손상후 3일째에 세포를 이식했을 때와, 부급성시기인 2주째에 세포를 이식했을 경우, 이식하지 않은 PBS 그룹에 비해 향상된 운동능력을 나타냈지만, 4주째에 세포를 이식했을 경우에는 그 효능이 관찰되지 않았다. 그러나, 뉴로제닌 1 유전자 및 간세포 성장인자 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포를 이식하였을 경우에는 뇌졸중 만성시기인 4주 후에도 높은 치료효능이 관찰되었다.
따라서, 상기 결과로부터 간세포 성장인자 유전자 및 인간 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 만성 뇌손상에 대한 치료적 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
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Claims (11)

  1. 성체 줄기세포주에 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF) 유전자, 및 염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix; bHLH) 계열의 신경형성 전사인자인 뉴로제닌 1(Neurogenin 1), 뉴로제닌 2(Neurogenin 2), 뉴로 D1(neuro D1), MASH1 및 MATH3로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자가 도입된 형태인 변이된 성체 줄기세포주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포주는 골수, 혈액, 제대혈, 지방조직, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조직으로부터 유래한 줄기세포인 것인 변이된 성체 줄기세포주.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포주는 중간엽 줄기세포주인 것인 변이된 성체 줄기세포주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 bHLH 계열의 신경형성 전사인자는 뉴로제닌 1인 것을 특징으로 하는 변이된 성체 줄기세포주.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 뉴로제닌 1은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이된 성체 줄기세포주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 HGF 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 변이된 성체 줄기세포주.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 HGF 유전자는 아데노바이러스 벡터에 의해 성체 줄기세포주에 도입되는 것인 변이된 성체 줄기세포주.
  8. (a) 성체 줄기세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양된 성체 줄기세포에 서열번호 2의 염기서열을 가지는 뉴로제닌 1 유전자를 도입하는 단계;
    (c) 상기 뉴로제닌 1 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 선별하는 단계;
    (d) 상기 선별된 성체 줄기세포에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 간세포 성장인자 유전자를 도입하는 단계;
    (e) 상기 뉴로제닌 1 유전자와 간세포 성장인자 유전자가 함께 도입된 변이된 성체 줄기세포주를 선별하는 단계; 및
    (f) 상기 변이된 성체 줄기세포를 선택적으로 배양하는 단계를 포함하는 변이된 성체 줄기세포주의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포주는 골수, 혈액, 제대혈, 지방조직, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조직으로부터 유래한 줄기세포인 것인 방법.
  10. 제 1항 내지 제 3항 및 제 7항 중 어느 한 항의 변이된 성체 줄기세포주 또는, 제 8항 또는 제 9항의 방법으로 제조된 변이된 성체 줄기세포주를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중(stroke) 또는 알츠하이머병(Alzheimer disease) 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 뇌졸중은 급성 뇌졸중(acute stroke) 또는 만성 뇌졸중(chronic stroke)인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 또는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물.

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