KR101670677B1 - 척수 손상 치료제 - Google Patents

Abstract

척수 손상 및 탈수초성 질환의 근본적인 치료에 효과적인 치료제를 기술하고 있다. 구체적으로는 척수 손상을 위한 치료제 및 탈수초성 질환을 위한 치료제를 기술하고 있으며, 각각 HGF 단백질을 활성 성분으로 함유한다.

척수 손상, 탈수초, HGF, 다발성 경화증

Description

척수 손상 치료제{Therapeutic agent for spinal cord injury}

본 발명은 척수 손상을 위한 치료제, 더 구체적으로는 간세포 성장 인자 (이하, "HGF"라 함) 단백질이 활성 성분의 역할을 하는 척수 손상을 위한 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HGF 단백질이 활성 성분인 탈수성 질환을 위한 치료제에 관한 것이다.

"척수 손상" (SCI)이라는 용어는, 예를 들어 교통사고 또는 높은 곳에서의 추락으로 인한 척추의 탈구-골절과 같은 외상으로 인하여, 척추 실질 조직이 손상되어, 손상 부위의 하측에서 말초 운동 근육, 감각 및 자율 신경계의 마비를 나타내는 임상 상태를 가리킨다.

현재 척수 손상 환자의 수는 일본의 경우 약 100,000명, 미국은 약 250,000명이다. 매년, 당해 환자 수가 일본에서는 최소 5,000명, 미국은 최소 10,000명씩 증가하고 있다.

최근 건강관리의 향상에 의해, 손상 후 생존율이 증가하였으며, 장애의 진행을 억제하기 위한 척수 손상 재건 수술 방법 또한 눈에 띄는 진보를 보이고 있다. 이 때문에 2차 신경 저하를 저지하는 것 또한 성공적으로 이루어지기 시작하고 있다. 더불어, 물리치료에 의한 재활 기술의 개선 및 보조 장치들의 발전(예: 전동 휠체어)으로 환자의 일상생활 활동(ADL)들이 개선되었다. 그러나 근본적으로 척수 손상을 치료하는 효과적인 방법(예: 신경 손상에서의 신경 보호 및 신경 재생)이 존재하지 않기 때문에, 고통을 덜지 못하거나, 타인의 도움없이 육체 노동을 스스로 못하거나 걷지 못하는 환자들이 현재도 많다.

HGF는 처음 성숙 간세포에 효과적인 미토겐으로 밝혀졌으며, 1989년에는 유전자적으로 복제되었다 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 1450-1459 (1984) 및 Nature 342, 440-443 (1989)). HGF는 간세포 성장 인자로서 발견되었지만, 최근 녹아웃/녹인 마우스 기술을 포함한 발현 및 기능 분석의 여러 연구들에서, HGF가 또한 새로운 향신경성 인자임이 밝혀졌다 (Nat. Neurosci. 2, 213-217 (1999) 및 Clin. Chim Acta., 327, 1-23 (2003)).

WO 03/045439는 HGF 유전자가 파킨슨병 모델 랫트에 끼치는 영향들을 행동학적 및 조직학적으로 연구한 실시예들을 기술하고 있다. 거기에 개시된 실험 결과는, 이전의 HGF 유전자 투여가 중뇌 흑질의 도파민 뉴런들을 신경독 6-하이드록시도파민(6-OHDA)으로부터 보호하는 효과가 있다는 것을 가리킨다. WO 03/045439는 또한, 이 실험 결과를 바탕으로 하여, HGF 유전자가 파킨슨병뿐만 아니라, 이외의 신경 장애(예: 알츠하이머병, 척추 소뇌 변성, 다발성 경화증, 선조체 흑질 변성(SND), 척추 근육 위축증(SMA), 헌팅턴 무도병, 샤이-드래거 증후군, 샤르코-마리-투스병 (CMT), 프리드리히 운동 실조증, 중증 근무력증, 모야모야병, 아밀로이 드증, 피크병, 아급성 척수성 시각신경병, 피부근염/다발성근염, 크로이츠펠트 야콥병, 베체트 증후군, 전신 홍반성 낭창(SLE), 유육종증, 결절성 동맥 주위염(PN), 후종인대 골화증, 미만성 척추관 협착증, 혼합 결합 조직병(MCTD), 당뇨병성 말초신경염 및 허혈성 뇌혈관 장애 (예: 뇌경색, 뇌출혈))를 치료하는데 이용할 수 있다고 기술하고 있으며, 더욱이 척수 손상이 이런 신경 장애의 한 종류라고 기술하고 있다.

그러나, 6-OHDA는 카테콜아민을 합성하는 뉴런(특히, 노르아드레날린-, 아드레날린- 및 도파민-생성 뉴런)들에 특정한 효과를 가지는 특별한 합성 독소이며, 보고된 바에 의하면 상기 열거된 질환들의 대부분에서 뉴런을 변질시키거나 죽이는 어떠한 독성도 보이지 않는다. 따라서 6-OHDA의 신경 세포 죽음 억제 효과를 통하여 척수 손상을 포함하는 상기 장애들에 대한 효과를 예측하기는 불가능하다. 게다가, WO 03/045439는 HGF 단백질 투여의 치료 효과에 대해서는 언급하지 않고 있다.

일본 정형외과 협회 기관지 제79권 제8호 S764쪽 (2005년 8월 25일)은, HGF 유전자를 함유하는 바이러스 벡터(HGF-발현 바이러스 벡터)를 랫트 척추의 제10 흉추에 주입하고 동일 부위에 척추 압좌 부상을 일으켰을 때, 이후 운동 기능 평가에서 하지 운동 기능의 회복이 관찰되었다고 언급한다.

그러나, 척수 손상이 일반적으로 사고 등에서의 외상 때문에 발생함에도 불구하고, 일본 정형외과 협회 기관지 제79권 제8호 S764쪽 (2005년 8월 25일)에서는, HGF-발현 바이러스 벡터를 흉추 압좌 부상의 3일 전에 주입하였다. 명백하게, 이 방식대로 사고의 발생 및 부상 부위를 예측하고 미리 HGF-발현 바이러스 벡터를 부분적으로 투여하는 것은 불가능하다.

더욱이, 척수 손상 환자의 상태는 외상 이후 72시간 동안 불안정할 가능성이 있으며, 이로 인해 척수강내 투여를 위한 카테터를 주입하기 매우 어려울 수 있다. 따라서 적절한 투여 기간을 결정하는 것이 중요하다.

또한, 고려해야 할 문제가 다수 있는데, 예로는 통상적인 HGF 유전자 요법에서 발현되는 단백질의 양을 조정하는 데의 어려움, 특정 유전자 발현 벡터가 반복 투여로 면역 반응을 유발하는 위험성 및 특정 유전자 발현 벡터에서는 게놈에 유전자들을 도입시킬 가능성이 있다.

척수 신경을 포함하는 유수초 신경의 신경 섬유들은 미엘린이라 불리는 리포 단백질 층으로 이루어진 수초로 덮여있다. 이 수초는 신경 섬유의 절연체 기능을 하여, 유수초 신경의 약진적인 전도를 가능하게 한다. 상기 수초가 파괴되는 현상을 탈수초라 한다. 탈수초가 발생할 때, 신경 전달의 현저한 감속에 의하여 다양한 신경 증상들이 나타난다. 당해 탈수초와 동반되는 질환들을 일반적으로 탈수초성 질환이라 일컬으며, 대표적으로, 다발성 경화증을 포함한다. 척수 손상 또한 일반적으로 탈수초를 동반한다.

다발성 경화증은 척수의 파종성 탈수초 플라크의 형성을 특징으로 하는, 저속으로 진행되는 중추신경계 질환이다. 다발성 경화증의 발병률은 유럽 및 미국의 경우 100,000명당 약 50 내지 100명이고, 일본에서는 100,000명당 약 1 내지 약 5명이다. 개개인마다 증상들이 매우 다양한데, 시각 손실, 복시, 안구진탕증, 관절 장애, 허약, 이상 감각, 방광 이상 및 기분의 두드러진 변화를 포함할 수 있다. 본 질환은 당해 증상들이 완화 및 재개를 반복하면서 진행된다. 아직 확실히 밝혀지지는 않았지만, 질환의 원인은 면역의 이상일 것이라 짐작된다. 이 때문에 이 외의 탈수초성 질환들과 마찬가지로, 현재 근본적인 치료법은 존재하지 않는다.

상기 기술된 바와 같이, HGF 단백질 함유 바이러스 벡터 (HGF 발현 바이러스 벡터) 주입을 포함하는 방법들이 알려져 있지만, 또한 헤르페스 바이러스 (HSV) 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스들은 당해 바이러스가 두뇌 속으로 침투할 때 농도 의존적으로 염증 반응을 일으켜 탈수초를 초래하는 것으로 알려져 있다 (Wo 05/100577).

따라서 이러한 점에서, HGF 유전자 함유 바이러스 벡터 이용을 포함하는 치료 방법들은 탈수초성 질환의 근본적인 치료법이 될 수 없는 것은 명백하다. 이 때문에 탈수초를 초래하지 않는 치료 방법의 확립이 요구되어져 왔다.

본 발명이 해결하고자 하는 문제점들

본 발명의 목적은 척수 손상 및 탈수초성 질환들을 유전자를 이용하지 않는 단순하고 편리한 방법으로 치료할 수 있는 약품을 제공하는 것이다.

문제점들의 해결 수단

본 발명자들은 상기 문제점들을 극복하기 위하여 대규모의 연구를 실행하였다. 그 결과, HGF 단백질이 척수 손상 치료에서, 탈수초 억제 효과 및 5HT 신경 재생 효과를 포함하는, 가장 바람직한 기능성 재생 효과를 지니기 때문에, 척수 손상의 치료제로서 유용함이 밝혀졌다. 게다가, 본 발명자들은 또한 HGF 단백질이 탈수초성 질환의 치료제로도 유용하다는 것을 알아내었다. 이러한 발견들에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은:

(1) HGF 단백질을 활성 성분으로 포함하는, 척수 손상의 치료를 위한 치료제;

(2) 상기 (1)에 있어서, HGF 단백질이, SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열을 가진 단백질, SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 가지고 HGF와 실질적으로 같은 작용을 하는 단백질, 또는 상기 단백질 중 하나의 부분 펩티드이며 HGF와 실질적으로 같은 작용을 하는 펩티드인, 치료제;

(3) 상기 (1)에 있어서, HGF 단백질이 SEQ ID No: 2의 아미노산 배열을 가진 단백질인, 치료제;

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 치료제를 척수 손상 부위에 국소적으로 이용할 수 있게 개조한, 치료제;

(5) 상기 (4)에 있어서, 치료제가 척수강내 투여를 위한 주사제 제형인, 치료제;

(6) 상기 (4)에 있어서, 치료제가 서방성 펌프에 의한 척수강내 투여를 위한 주사제 제형인, 치료제;

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 치료제가 척수 신경의 탈수초를 억제하기 위한, 치료제;

(8) HGF 단백질을 활성 성분으로서 포함하고, 척수 손상 이후 2주 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 척수 손상의 치료를 위한 치료제;

(9) HGF 단백질을 활성 성분으로서 포함하고, 척수 손상 이후 4일 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 척수 손상의 치료를 위한 치료제;

(10) 유효량의 HGF 단백질을 포함하는 척수 손상 치료용 약제학적 조성물;

(11) 척수 손상 치료제의 제조에 HGF 단백질을 이용하는 방법;

(12) 척수 손상 치료용 HGF 단백질;

(13) HGF 단백질을 활성 성분으로서 포함하는, 탈수초성 질환의 치료를 위한 치료제;

(14) 상기 (13)에 있어서, 탈수초성 질환이, 다발성 경화증, 시속 신경수염, 발로 동심성 경화증, 급성 산재성 뇌척수염(ADEM), 쉴더병, 아급성 경화성 범뇌염(SSPE), 진행성 다초점 백색질뇌증(PML), 빈스완거병, 저산소성 뇌병증, 중심성 뇌교 탈수초증, 길랑-바레 증후군, 피셔 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP)으로 이루어진 군에서 선택된 치료제;

(15) 상기 (13) 또는 (14)에 있어서, HGF 단백질이, SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열을 가진 단백질, SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 가지고 HGF로서의 작용을 하는 단백질, 또는 상기 단백질 중 하나의 부분 펩티드이며 HGF로서의 작용을 하는 펩티드인, 치료제;

(16) 상기 (13) 또는 (14)에 있어서, HGF 단백질이 SEQ ID No: 2의 아미노산 배열을 가진 단백질인, 치료제;

(17) 상기 (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 치료제를 질환 부위에 국소적으로 이용할 수 있게 개조한, 치료제;

(18) 상기 (17)에 있어서, 치료제가 척수강내 투여를 위한 주사제 제형인, 치료제;

(19) 상기 (17)에 있어서, 치료제가 서방성 펌프에 의한 척수강내 투여를 위한 주사제 제형인, 치료제;

(20) 유효량의 HGF 단백질을 포함하는 탈수초성 질환 치료용 약제학적 조성물;

(21) 탈수초성 질환의 치료를 위한 치료제를 제조에 HGF 단백질을 이용하는 방법; 및

(22) 탈수초성 질환의 치료용 HGF 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 유용한 효과

본 발명의 치료제는 척수 손상 및 탈수초성 질환에 대하여 매우 우수한 치료 효과를 나타낸다. 본 발명의 치료제는 또한 유전자 요법과 관련된 문제점들로부터 자유롭다는 이점을 지닌다. 또한, 본 발명의 치료제는 척수 손상 및 탈수초성 질환 (예: 다발성 경화증)에서 발생하는 유수초 신경의 탈수초를 효과적으로 억제 및 치료한다는 이점도 있다. 더욱이, 본 발명의 치료제는 HSV 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터의 사용을 필요로 하지 않기 때문에, 탈수초를 초래하지 않는다. 본 발명의 치료제의 또 하나의 이점은, 유전자 요법과는 달리, 활성 성분 HGF의 공급량 또는 투여량을 용이하게 조절할 수 있고, 투여 시간 또한 조절할 수 있으며, 투여를 반복적 또는 지속적으로 실행할 수도 있는 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 척수 손상 직후 시작하여 2주에 걸쳐서 투여한 200 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 척수 조직의 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 상을 도시한다.

도 2는 척수 손상 직후 시작하여 2주에 걸쳐서 투여한 200 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 척수 조직의 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색 상을 도시한다.

도 3은 척수 손상 직후 시작하여 2주에 걸쳐서 투여한 200 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 척수 조직의 5-하이드록시트립타민(5HT) 염색 상을 도시한다.

도 4는 척수 손상 직후 시작하여 2주에 걸쳐서 투여한 200 ㎍의 HGF 단백질 투여군의 척수 손상 후 척수 조직의 5HT 및 성장 관련 단백질-43(GAP43) 염색 상을 도시한다.

도 5는 척수 손상 직후 시작하여 2주에 걸쳐서 투여한 200 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 바쏘-비티-브레스나한(BBB) 점수를 도시하는 선 그래프이다. 그래프에서 화살표는 HGF 단백질 또는 PBS 투여 기간을 가리킨다.

도 6은 척수 손상 직후 시작하여 4주에 걸쳐서 투여한 400 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 BBB 점수를 도시하는 선 그래프이다. 그래프에서 화살표는 HGF 단백질 또는 PBS 투여 기간을 가리킨다.

도 7은 척수 손상 4일 후부터 시작하여 4주에 걸쳐서 투여한 400 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 BBB 점수를 도시하는 선 그래프이다. 그래프에서 화살표는 HGF 단백질 또는 PBS 투여 기간을 가리킨다.

도 8은 척수 손상 2주 후부터 시작하여 4주에 걸쳐서 투여한 400 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 BBB 점수를 도시하는 선 그래프이다. 그래프에서 화살표는 HGF 단백질 또는 PBS 투여 기간을 가리킨다.

도 9는 척수 손상 8주 후부터 시작하여 4주에 걸쳐서 투여한 400 ㎍의 HGF 단백질 투여군 및 대조군의 척수 손상 후 BBB 점수를 도시하는 선 그래프이다. 그래프에서 화살표는 HGF 단백질 또는 PBS 투여 기간을 가리킨다.

바람직한 양태의 설명

본 발명에서 사용된 HGF 단백질은 공지 물질이다. 다양한 제조 방법 중 어느 한 방법으로 제조한 HGF 단백질을 사용할 수 있으나, 약제로서 이용할 수 있을 정도로 정제되어야 한다. HGF 단백질은, 예를 들어, 초대 배양 세포 또는 HGF 단백질을 생산하는 확립된 세포계의 세포들을 재배한 후, 배양 상청액에서 HGF 단백질을 분리 및 정제해서 제조할 수 있다. 또는, HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 벡터에 혼입시키는 것을 포함하는 유전자 공학 기술을 이용하여, 벡터를 적절한 숙주 세포에 주입하여 유전자의 형질 변환을 일으키고, 형질 변환체의 배양 상청액으로부터 목적하는 재조합형 HGF 단백질을 수득할 수 있다(예: 일본 공개 특허 출원 제H5-111382호; 및 Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 163, p. 967 (1989) 참조). 상기 숙주 세포는 특정한 제한이 없다. 예를 들어, 대장균, 효모 또는 동물 세포와 같이 유전자 공학 기술에서 사용하는 다양한 종류의 숙주 세포들 중 하나를 적절하게 이용할 수 있다. 이와 같이 수득한 HGF 단백질은, 천연 HGF 단백질과 실질적으로 동일한 작용을 하는 한, 이의 아미노산 배열 중 하나 이상의 아미노산(예: 1 내지 8개, 이는 아래에서도 적용된다)이 치환, 결실 또는 추가될 수 있거나, 유사하게 당쇄가 치환, 결실 또는 추가될 수 있다. 당해 HGF 단백질의 예로는 아래 기술된 5-아미노산-결실 타입 HGF 단백질이 있다. 여기서, 아미노산 배열에 관련하여, "하나 이상의 치환, 결실 또는 추가된 아미노산"이라는 표현은 유전자 공학 기술 또는 특정 부위 돌연변이 생성과 같은 주지의 기술적 방법에 의하여, 또는 자연적으로 하나 내지 다수의 아미노산이 치환, 결실 또는 추가되었다는 뜻이다. 치환, 결실 또는 추가한 당쇄를 가진 HGF 단백질은, 예를 들어, 천연 HGF 단백질에 첨가된 당쇄를 효소 등으로 처리해서 수득한 HGF 단백질, 당쇄 추가 부위에서 아미노산 배열이 변경되어 당쇄 추가가 이루어지지 않는 HGF 단백질, 또는 아미노산 배열이 변경되어 천연 당쇄 추가 부위와 다른 부위에 당쇄가 추가된 HGF 단백질일 수 있다.

추가로, HGF 단백질의 아미노산 배열과 최소 80%, 바람직하게는 최소 약 90%, 더욱 바람직하게는 최소 약 95%의 상동성을 가지며 HGF로서 실질적으로 작용하는 단백질들을 포함할 수 있다. 상기 언급한 아미노산 배열에 관하여, "상동"이란, 단백질의 1차 구조와 비교하여 상응하는 아미노산 배열을 구성하는 아미노산 잔기들의 일치의 정도를 뜻한다.

상기 HGF 단백질의 예는 SEQ ID No: 1 및 2의 아미노산 배열을 포함한다. SEQ ID No: 2의 HGF 단백질은 5-아미노산-결실-타입 HGF 단백질인데, 여기서 SEQ ID No: 1의 아미노산 배열의 제161번 내지 제165번 아미노산의 5개의 아미노산 잔기들이 결실된다. SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열을 지닌 단백질은 HGF의 미토겐 및 모토겐 작용을 하는 사람 천연 HGF 단백질이다.

SEQ ID No: 1 및 2의 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 갖는 단백질이란, SEQ ID No: 1 및 2의 아미노산 배열과 최소 약 80% 이상, 바람직하게 최소 약 90% 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 최소 약 95% 이상 일치하는 아미노산 배열을 포함하는 단백질이다. 바람직한 예로는 HGF로서 작용하고, SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열에 비교하였을 때, 하나 내지 다수의 아미노산 잔기들이 삽입 또는 결실된 아미노산 배열, 하나 내지 다수의 아미노산 잔기들이 다른 아미노산 잔기들로 치환된 아미노산 배열, 또는 하나 내지 다수의 아미노산 잔기들이 변형된 아미노산 배열을 가지는 단백질이 있다. 삽입 또는 치환된 아미노산 잔기들은 유전자에 의하여 암호화된 20종류의 아미노산 외의 비-천연 아미노산일 수 있다. 비-천연 아미노산은, γ-아미노부티르산과 같이 아미노기 또는 카복실기를 갖는 임의의 화합물일 수 있다. 상기 단백질들은 단독으로 또는 이들의 혼합물로서 이용할 수 있다. SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 가진 단백질의 예로는 NCBI 데이터베이스(NCBI-GenBank Flat File Release 164.0)에 Accession Nos. BAA14348 및 AAC71655로 저장된 사람 HGF가 있으나, 이에 한정되지 않는다.

사람 투여를 위해 본 발명에서 이용할 수 있는 HGF 단백질은 바람직하게는 상기 기술된 사람 단백질들이며, 사람 외의 포유류(예: 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 토끼, 햄스터, 기니피그 및 침팬지)의 HGF 단백질들 또한 이용할 수 있다. 당해 HGF 단백질의 실시예들은, 예를 들어, NCBI 데이터베이스에 저장된 다음을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: 마우스 HGF(예: Accession Nos. AAB31855, NP_034557, BAA01065, BAA01064), 랫트 HGF(예: Accession No. NP_58713 (SEQ ID No: 3이 나타내는 아미노산 배열을 가진 단백질)), 소 HGF(예: Accession Nos. NP_001026921, BAD02475), 고양이 HGF(예: Accession Nos. NP_001009830, BAC10545, BAB21499), 개 HGF(예: Accession Nos. NP_001002964, BAC57560) 및 침팬지 HGF(예: Accession No. XP_519174).

본 발명에서 이용하는 HGF 단백질은 C-말단에 카복실기(-COOH), 카복시산염기(-COO^-), 아미드기(-CONH₂) 또는 에스테르기(-COOR)를 가질 수 있다. 여기서, 에스테르의 R는 예를 들어, C_1-6 알킬기(예: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 n-부틸); C_3-8 시클로알킬기(예: 시클로펜틸 및 시클로헥실); C_6-12 아릴기(예: 페닐 및

-나프틸); 페닐-C_1-2 알킬기(예: 벤질 및 펜에틸) 및

-나프틸-C_1-2 알킬기(예:

-나프틸메틸)를 포함하는 C_7-14 아르알킬기; 및 피발로일옥시메틸기일 수 있다. 본 발명의 HGF 단백질은 또한 카복실기가 아미드화 또는 에스테르화 되었을 때 C-말단 외의 장소에 카복실기(또는 카복실산염)를 가진 HGF 단백질을 포함한다. 이 경우에 에스테르는, 예를 들어, 상기 언급한 C-말단 에스테르일 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 HGF 단백질은, N-말단 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기(예: 포르밀을 포함하는 C_1-6 아실기 및 아세틸과 같은 C_2-6 알칸노일기)로 보호된 것, N-말단이 생체내에서 절단되어 생성된 글루타밀기가 피로글루타민산으로 변환된 것, 또는 분자 내 아미노산의 측쇄의 작용기(예: -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니딘기)들이 적절한 보호기(예: 포르밀을 포함하는 C_1-6 아실기 및 아세틸과 같은 C_2-6 알칸노일기)로 보호된 것, 또는 당쇄들의 결합으로 수득한 글리코단백질과 같은 복합 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 HGF 단백질은 이의 부분 펩티드 형태(이하, "부분 펩티드"로 약칭하는 경우가 있음)를 취할 수 있다. 당해 부분 펩티드의 예로는 상기 HGF 단백질의 어느 한 부분 펩티드이고 HGF와 실질적으로 동일한 작용을 하는 단백질이 있다. 본 발명에서, 바람직한 부분 펩티드는, 상기 언급한 HGF 단백질을 구성하는 아미노산 배열 중, 최소 약 20개 이상, 바람직하게는 최소 약 50개 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 아미노산 배열을 가지는 펩티드를 포함한다. 구체적으로 바람직한 예로는, SEQ ID No: 1의 사람 HGF 아미노산 배열의 N-말단에서 시작했을 때 제32번 아미노산 내지 제210번 아미노산의 아미노산 배열(HGF의 N-말단 헤어핀 루프에서 제1 크링글 영역까지의 배열)을 갖는 펩티드 및 SEQ ID No: 1의 사람 HGF 아미노산 배열의 N-말단에서 시작했을 때 제32번 아미노산 내지 제288번 아미노산의 아미노산 배열(HGF의 N-말단 헤어핀 루프에서 제2 크링글 영역까지의 배열)을 가지는 펩티드가 있다. 본 발명의 부분 펩티드에서, C-말단은 카복실기(-COOH), 카복시산염기(-COO^-), 아미드기(-CONH₂) 또는 에스테르기(-COOR)일 수 있다. 또한, 상기 언급한 HGF 단백질처럼, 부분 펩티드는 N-말단 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기로 보호된 부분 펩티드, N-말단이 생체 내에서 절단되어 생성된 Gln이 피로글루타민산으로 변환된 부분 펩티드, 분자의 아미노산의 측쇄의 작용기들이 적절한 보호기로 보호된 부분 펩티드 및 당쇄들의 결합으로 수득한 글리코펩티드와 같은 복합 펩티드를 포함한다.

본 발명에서 이용할 수 있는 HGF 단백질의 염(부분 펩티드 형태인 것들도 포함)들은 산 및 염기와의 생리학적으로 허용되는 염들이다. 생리학적으로 허용되는 산 첨가 염들이 특히 바람직하다. 당해 염의 예로서 무기산염(예: 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 및 유기산염(예: 빙초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 호박산, 타르타르산, 구연산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산)을 포함한다.

본 발명에서 이용하는 HGF 단백질이 부분 펩티드 형태일 때, 부분 펩티드는 공지의 펩티드 합성 방법에 따라서 또는 HGF 단백질을 적절한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 적절한 펩티드 합성 방법의 예는 고상 합성법 및 액상 합성법을 포함한다. HGF 단백질을 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산을 잔여 부분과 축합시켜 생성물이 보호기를 함유하고 있는 경우, 표적 펩티드는 보호기들을 제거함으로써 제조할 수 있다. 공지의 축합 방법 및 보호기 제거 방법은, 예를 들어, M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti의 Peptide Synthesis(Interscience Publishers: New York, 1966) 및 Schroeder 및 Luebke의 The Peptide (Academic Press: New York, 1965)에 기술된 것들을 포함한다. 반응 이후, HGF 단백질의 부분 펩티드는 통상적으로, 용매 추출, 증류, 칼럼 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 재결정화, 또는 이의 혼합과 같은 정제 방법에 의하여 정제 및 단리시킬 수 있다. 상기 방법에 의해서 수득한 부분 펩티드가 유리산 또는 유리염기일 때, 공지의 방법으로 적절한 염으로 전환시킬 수 있다. 반대로, 염으로서 수득할 시에는, 공지의 방법으로 유리산 또는 유리염기로 전환시킬 수 있다.

본 발명에서 이용하는 HGF 단백질은, 바람직하게는 사람 투여를 위하여 사람 유래이나, 사람 외의 포유류에서 얻은 HGF 단백질 또한 사용 가능하다. SEQ ID No: 3는 랫트 기원의 적절한 HGF 단백질의 한 예를 보여주고 있다.

본 발명의 치료제들은, 척수 손상 치료제 또는 탈수초성 질환 치료제이며, 척수 손상 또는 탈수초를 수반하는 모든 신경 장애에 이용할 수 있다. 특정한 예로는 다발성 경화증(MS), 시속 신경수염, 발로 동심성 경화증, 급성 산재성 뇌척수염(ADEM), 쉴더병, 아급성 경화성 범뇌염(SSPE), 진행성 다초점 백색질뇌증(PML), 빈스완거병, 저산소성 뇌병증, 중심성 뇌교 탈수초증, 길랑-바레 증후군, 피셔 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP)이 있다. 여기서 관련 탈수초를 동반하는 척수 손상 또한 포함된다.

본 발명의 치료제(척수 손상 치료제 또는 탈수초성 질환 치료제)들은 사람뿐만 아니라, 사람 외의 포유류(예: 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개 및 고양이)들을 대상으로 또한 이용할 수 있다.

본 발명의 치료제(척수 손상 치료제 또는 탈수초성 질환 치료제)를 사람 또는 동물 대상체에게 투여하려 할 때, 이를 액체 약제 또는 고체 약제와 같은 다양한 투여 형태 중에서 아무 것으로 제조할 수 있다. 일반적으로 HGF 단백질은 독단으로 또는 통상적인 담체와 함께, 예를 들어, 주사제, 스프레이제, 또는 서방성 제제(예: 데포제)의 형태로 제조할 수 있다. 주사제는 수성 주사제 또는 유성 주사제일 수 있다. 주사제가 수성 주사제인 경우, 수성 용매 (예: 주사용 물, 정제수)에 약제학적으로 허용가능한 강장제(예: 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 붕산, 붕사, 포도당, 프로필렌 글리콜), 완충제(예: 인산염 완충제, 초산염 완충제, 붕산염 완충제, 탄산염 완충제, 구연산염 완충제, 트리스 완충제, 글루타민산염 완충제, 엡실론-아미노카프론산염 완충제), 방부제(예: 메틸 파라옥시벤조산염, 에틸 파라옥시벤조산염, 프로필 파라옥시벤조산염, 부틸 파라옥시벤조산염, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 염화벤잘코늄, 나트륨 디하이드로초산염, 에데트산염 나트륨, 붕산, 붕사), 증점제(예: 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜), 안정화제(예: 아황산수소나트륨, 티오황산나트륨, 에데트산나트륨, 구연산나트륨, 아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔) 및 pH 조정제(예: 염산, 수산화나트륨, 인산, 빙초산)를 선택적으로 첨가하여 수득한 용액에 HGF 단백질을 용해시킨 후, 여과기 등으로 여과 및 살균하고, 이를 살균 용기에 충진함으로써 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다. 알코올(예: 에탄올), 폴리알코올(예: 프로피렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 비-이온성 계면 활성제(예: 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌-경화 피마자유 50)와 같은 적절한 용해 보조제 또한 사용할 수 있다. 주사제가 유성 주사제라면, 참기름 또는 대두유를 유성 용매제로 사용하고, 벤질벤조산염 또는 벤질알코올을 용매 보조제로서 사용할 수 있다. 제조한 주사제는 일반적으로 앰풀 또는 바이알에 주입한다. 주사제 내의 HGF 단백질의 용량은 일반적으로 약 0.0002 내지 약 2.0 중량/용적%로 조절하고, 바람직하게는 약 0.001 내지 약 1.0 중량/용적%, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 약 0.5 중량/용적%이다. 또한, 주사제와 같은 액체 제제들은 냉동해서 보존하거나, 습기 제거 후 냉동 건조 등으로 보존하는 것이 바람직하다. 사용시, 주사용 증류수 등을 냉동 건조된 제제에 첨가하여 약제를 재용해시켜 사용할 수 있다.

또한 스프레이를 제제의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 스프레이로서 제조할 경우, 흡입 제제에 일반적으로 사용되는 첨가제들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 추진제 이외에, 상기 언급한 용매, 보존제, 안정화제, 강장제 및 pH 조정제 등을 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 추진제는 액화 가스 추진제 및 압축 가스를 포함한다. 액화 가스 추진제의 예는 플루오르 첨가 탄화수소 (예: HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a 및 HCFC142와 같은 CFC의 대체제), 액화 석유 및 디메틸 에테르를 포함한다. 압축 가스의 예는 가용성 가스(예: 이산화탄소, 아산화질소) 및 불용성 가스(예: 질소 가스)를 포함한다.

본 발명에서 사용하는 HGF 단백질은 생분해성 중합체와 함께 서방성 제제(예: 데포 제제)로서 제조할 수 있다. 특히 HGF 단백질을 데포 제제로서 제조함으로써, 투여 회수의 감소, 작용의 지속성 및 부작용의 경감과 같은 여러 바람직한 효과들을 기대할 수 있다. 당해 서방성 제제는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 상기 서방성 제제에 사용되는 생분해성 중합체는, 녹말, 덱스트란, 히알루로난 (히알루론산) 및 이들의 염들을 포함하는 다당류; 아텔로콜라겐, 콜라겐 및 젤라틴과 같은 단백질; 폴리글루타민산, 폴리리신, 폴리류신, 폴리알라닌 및 폴리메티오닌과 같은 폴리아미노산; 폴리젖산, 폴리글리콜산, 젖산-글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리-β-하이드록시부티르산 및 폴리말산; 푸마르산-폴리에틸렌 글리콜-비닐피롤리돈 공중합체와 같은 폴리에스테르 및 폴리오르토에스테르; 폴리메틸-a-시아노아크릴산과 같은 폴리알킬시아노아크릴산; 및 폴리에틸렌 탄삼염 및 폴리프로필렌 탄산염과 같은 폴리탄산염과 같은 공지의 생분해성 중합체들 중에서 적절하게 선택할 수 있다. 폴리에스테르가 바람직하며, 젖산-글리콜산 공중합체는 특히 바람직하다. 젖산-글리콜산 공중합체를 이용하는 경우, 이의 조성비(젖산/글리콜산)(mol%)는 서방 기간에 따라 변화한다. 예를 들어, 서방 기간이 약 2주 내지 약 3개월, 바람직하게는 약 2주 내지 약 1개월인 경우, 조성비는 약 100/0 내지 약 50/50의 범위 내이다. 젖산-글리콜산 공중합체의 중량-평균 분자량은 일반적으로 약 5,000 내지 약 20,000이다. 젖산-글리콜산 공중합체는, 일본 공개 특허 출원 제61-28521호에서 기술된 것과 같은 공지의 제조 방법으로 제조할 수 있다. 생분해성 중합체 및 HGF 단백질의 배합 비율은 특정한 제한되지 않는다. 예를 들어, HGF 단백질 대 생분해성 중합체의 비율은 전형적으로 약 0.01 내지 약 30 중량/중량%이다.

주사 가능 제제 및 스프레이의 경우, 투여는 바람직하게는 직접 주입(예: 척척수강내 투여, 서방성 펌프를 이용한 지속적 척수강내 투여) 또는 척수 손상 또는 탈수초성 질환의 영향을 받은 조직에 분무함으로써, 또는, 서방성 제제(데포 제제)의 경우, 척수 손상 또는 탈수초성 질환의 영향을 받은 조직의 주위 부분에 제제를 주입함으로써, 실행할 수 있다. 투여량은 투여 형태, 장애의 심각성 및 환자의 나이와 같은 요인들에 따라서 적절하게 선택하고, 일반적으로는 1회 투여 당 1 ㎍ 내지 500 mg, 바람직하게는 10 ㎍ 내지 50 mg이다. 투여 방법 또한 투여 형태, 장애의 심각성, 환자의 연령 및 이외의 요인들에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 치료제를 단독, 1회 투여로서, 또는 약 30분 내지 몇 주에 걸치는 기간 동안 (바람직하게는 약 24시간 내지 약 2주에 걸치는 기간 동안) 지속 투여로서 주어질 수 있다. 또한, 상기 1회 투여 또는 지속 투여는 간격을 두어 반복적으로 실행할 수 있다. 반복 투여의 경우, 투여 간격은 하루에 1회 내지 수개월에 1회일 수 있다. 예를 들어, 서방성 제제(데포 제제)로 투여되는 경우 또는 서방성 펌프(예: 삼투 펌프)를 이용한 부분적 (예: 척수강내) 서방성 투여의 경우, 투여 간격은 수주 내지 수개월일 수 있다. 당해 지속 투여는, HGF 단백질을 척수 손상 또는 탈수초성 질환의 부위에 연장된 기간에 걸쳐 점차로 방출하기 때문에, HGF가 연장된 기간에 걸쳐 작용하여서 더욱 좋은 치료 효과를 달성하는 것을 가능하게 한다는 이점이 있다. 다른 이점은 투여 회수가 적을수록 환자의 부담이 덜어진다는 것이다. 또 다른 이점은, 필요한 경우, 추가 HGF 단백질을 피하에 이식된 삼투 펌프에 제공할 수 있다는 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 부분 투여가 투여 방법으로서 바람직하나, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 점적 주입과 같은 다른 방법들 또한 가능하다. 투여 간격은 투여 형태, 장애의 심각성 및 환자의 연령와 같은 요인들에 따라서 적절하게 선택한다. 예를 들어, 척수 손상의 경우, 투여를 손상 발생 이후 바람직하게는 14일 내, 더 바람직하게는 7일 내, 가장 바람직하게는 4일 내에 실행해야 한다. 특히, 척수 손상 환자들은, 외상 이후 72시간 내에 환자의 상태를 안정시키는 것이 매우 어렵다는 것으로 미루어 보아, 투여를 손상 발생 이후 약 72시간 내지 약 4일 내에 하는 것이 특히 바람직하다. 상기 투여 간격은, 지속 투여의 경우는 투여의 시작을, 또는 반복 투여의 경우는 첫 투여를 포함한다.

하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해서 쓰이나, 본 발명은 이들 실시예들에 한정되지 않는다. 하기 실시예에서 이용한 HGF 단백질은 5-아미노산-결실-타입 재조합형 HGF 단백질 (SEQ ID No: 2)이었다.

실시예 1

(척수 손상 동물의 준비 및 HGF 단백질의 투여)

(1) 척수 손상 동물의 준비

먼저, 사용 준비를 위해 삼투 펌프를 살균하였다. HGF 단백질 (농도: 1 mg/mL; PBS에 용해) 또는 PBS (대조군)를 Alzet 소형 삼투 펌프(모델 2002, ALZA Corporation)에 투입하였다. 내부 지름이 0.3 mm이고 외부 지름이 0.7 mm이며 루멘이 HGF 단백질 또는 PBS로 채워진 실리콘 튜브(카테터 튜브, Imamura Co., Ltd.)를 펌프의 방출구에 연결하고 접합부는 내부 지름이 1.0 mm이고 외부 지름이 2.0 mm인 다른 실리콘 튜브(Imamura Co., Ltd.)로 덮은 다음, 펌프 및 튜브 조립품을 12시간 동안 약 37℃에서 배양하고, 실험에서의 이용을 위해 제공하였다.

성체, 암컷 스프라그-돌리 랫트(생후 약 10 내지 12주이고, 신체 중량은 약 250 g)들을 14 중량/용적%의 수산화클로랄의 복막내 투여로 마취시킨 후, 제10 및 제12 흉부 척추골을 절개하였다. 이후(상기 기술된 방법으로 HGF 단백질 용액을 미리 채운 것) 삼투 펌프를 등 우측의 피하(皮下)에 이식하고, 카테터 튜브를 근육층에서 피부 하측 부분으로 통과시켰다. 그 다음, 카테터 튜브의 끝을 제12 흉부 척추골의 아치의 위치로 전진시켰다. 다음으로 IH 충격기(제조원: Precision Systems)로 제10 흉부 척추골 체절에 200 kDyne의 압좌 손상을 생성하였다. 이후, 제12 흉부 척수의 경막 및 거미막을 상하 축 방향으로 함께 분리시키고, 여기서 카테터 튜브를 거미막 하측 공간에 삽입하고 카테터의 한쪽 끝을 손상된 척수의 지점으로 전진시켰다. 근육 층의 외측 및 내측에서 카테터를 수술용 접착제 Aron Alpha A Sankyo(Sankyo Co., Ltd.)로 고정시켰다. 접착제가 완전히 건조된 다음, 근육층 및 피부를 각각 봉합하여, 수술을 완료했다.

(2) HGF 단백질의 투여

수술 이후 (압좌 손상 이후), HGF 단백질 용액을 2주 동안 상기 기술된 삼투 펌프 (HGF 단백질 투여량: 200 ㎍/2주)의 수단을 통해서 척수강내로 투여하였다. 대조군에게는 오직 PBS만 투여하였다.

실시예 2

(조직 분석 및 결과)

수술 후 일정 기간 이후에, 랫트에 14 중량/용적%의 수산화클로랄을 복막내 투여하여 깊게 마취시킨 후, 처음은 PBS로, 그리고 나서는 4 중량/용적%의 파라포름알데히드/PBS로, 좌심실로부터 관류를 실행하였다. 척수의 한 조각을 추출하여 4 중량/용적%의 파라포름알데히드/PBS에 약 24시간 동안 4℃에서 두었다. 조직 샘플을 10 중량/용적% 자당/PBS 용액 및 30 중량/용적% 자당/PBS 용액에 차례대로 각각 4℃에서 약 24시간 동안 담근 후, OCT 화합물(Sakura Fine Technical)에 포함시켰다. 포함시킨 조직은 즉시 액체 질소로 냉동시키고, 20 ㎛의 냉동 부분들을 준비하였다. 조직 부분들을 이후 헤마톡실린 및 에오신 (HE)으로 착색한 후, 조직학적 조사를 실시하였다. 그 결과, 도 1이 도시하는 것과 같이, HGF 단백질 군의 운동 뉴런 퇴화 및 세포 죽음으로 인한 공동 생성이 대조군과 비교해보았을 때 뚜렷 하게 억제되었고, 이는 압좌에 따른 척수 퇴화가 억제되었다는 것을 가리킨다.

실시예 3

(수초 염색 및 결과)

실시예 2에서 기술된 방법으로 준비한 부분들을 95 용적/용적%의 에탄올로 처리한 후, 록솔 패스트 블루 (LFB) 용액에 60℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양기에서 제거한 후, 실온에서 식힌 다음 95 용적/용적% 에탄올 및 증류수로 세척하였다. 그 다음, 탄산리튬 용액 및 70 용적/용적% 에탄올로 분별 및 증류수로 세척을 적절한 명암 대비를 수득할 때까지 반복적으로 실행한 후, 절편을 탈수 및 봉인하고, 수초를 관찰하였다. 도 2에서 보이는 바와 같이, HGF 단백질 군의 LFB-양성 수초의 표면적이 대조군보다 컸으며, 이는 척수 손상에 의한 탈수초가 억제되었다는 것을 가리킨다.

실시예 4

(면역 조직 화학 분석 및 결과)

실시예 2에서 기술된 방법으로 준비한 부분들을 다클론성 5HT 항체 (1:100 희석) 및 다클론성 항-GAP43 항체 (1:1000 희석)로 염색하였다. 즉, PBS 함유 5 용적/용적% 염소 혈청 및 0.1 중량/용적% 트리톤 X-100으로 실온에서 1시간 동안 블로킹을 실시한 후, 상기 항체 용액 중 4℃에서 밤새 배양하였다. 상기 부분들을 PBS로 세척한 후, 실온에서 한 시간 동안 알렉사 488 (녹색) 및 알렉사 546 (적색 (1:1000 희석))으로 형광 라벨한 2차 항체에 배양한 다음, PBS로 세정하고 슬라이드에 주입한 후, 형광 현미경으로 5HT 양성 신경 섬유 및 GAP43 양성 신경 섬유들을 관찰하였다. 그 결과, 도 3에서 보이는 바와 같이, HGF 단백질 군의 손상 부위에서 4 mm 밑 5HT 양성 신경 섬유들이 대조군과 비교했을 때 두드러지게 더 풍부하였다. 게다가, 도 4가 도시하는 바와 같이, 5HT 양성 신호 및 GAP43 양성 신호의 병소 부위들 간에 좋은 조화가 있었다. 척수 손상 이후 5HT 양성 신경 섬유가 운동 기능을 담당한다는 사실 및, 성인의 경우 GAP43이 오직 재생된 신경 섬유에서만 발현된다는 점은, HGF 단백질의 투여가 운동 기능과 관련된 신경 섬유의 재생을 용이하게 했다는 것을 가리킨다.

실시예 5

(운동 기능 평가 및 결과)

척수 손상 직후부터 HGF 단백질로 치료를 한 동물들의 운동 기능을, 실시예 1에서 기술된 방법으로 오픈 필드 테스트를 통해서 관찰하였다. 다수의 관찰자들이 동물들의 행동을 주시하였고, 0 (완전 마비) 내지 21 (정상)점을 범위로 하는 21-단계 척도로 운동기능을 평가하는 바쏘-비티-브레스나한 (BBB) 점수 시스템을 이용하여 평가하였다. 뒷다리 운동 기능을 수술 후 6주 동안 평가하였다. 도 5가 결과를 보여주고 있다.

도 5에서, HGF 단백질 군에서 척수 손상 후 4일부터 기능 회복이 시작하는 것이 관찰되었고, 대조군과 비교하여 5주 후부터(p < 0.05)는 상당한 기능 회복 효 과가 관찰된다는 것이 명백하다.

실시예 6

척수 손상 동물들을 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 후, HGF 단백질 (2 mg/mL, PBS에 용해됨) 또는 PBS (대조군)로 채워진 삼투 펌프를 이식하고 카테터를 삽입하였다.

수술 후 (압좌 손상 이후), HGF 단백질 용액을 삼투 펌프로 4주의 기간 동안 복막내 투여하였다 (HGF 단백질 투여량: 400 ㎍/4주). 대조군에게는 PBS만 주어졌다. 실시예 5에서 설명한 방법으로 운동 기능 평가를 수술 후 9주까지 실시하였다. 도 6에서 결과들을 도시하고 있다.

도 6에서 명백한 것처럼, HGF 단백질로 치료를 한 동물들의 기능 회복이 대조군 동물들과 비교하여 상당히 증진되었다. 척수 손상 4일 후부터 차이가 뚜렷하였다. 더욱이, HGF 단백질의 투여 완료 후에도 BBB 점수가 지속적으로 증가하였다.

실시예 7

성체, 암컷 스프라그-돌리 랫트(생후 약 10 내지 12주이고, 신체 중량은 약 250 g)들을 14 중량/용적%의 수산화클로랄의 복막내 투여로 마취시킨 후, IH 충격기(Precision Systems)로 제10 흉부 척추골 체절에 200 kDyne의 압좌 손상을 생성하였다. 척수가 손상된 동물은 압좌 손상 후 4일, 2주 또는 8주에 삼투 펌프를 이식하기 위해 재수술하였다. HGF 단백질 (2 mg/mL, PBS에 용해됨) 또는 PBS (대조 군)로 채워진 삼투 펌프를 실시예 1과 같은 방법으로 이식하고 카테터를 거미막 하측 공간에 삽입한 후, 카테터 튜브의 한쪽 끝을 손상된 척수 지점으로 전진시키고 마지막으로 카테터를 고정시켰다. 압좌 손상 4일, 2주 또는 8주 후부터, 삼투 펌프에서 HGF 단백질 용액을 4주의 기간에 걸쳐서 복막내 투여하였다 (HGF 단백질 투여량: 400 ㎍/4주). 대조군에게는 PBS만 투여하였다. 실시예 5와 동일한 방법으로 시간이 지나면서 운동 기능을 평가하였다. 도 7, 8 및 9가 결과를 보여주고 있다.

압좌 손상 이후 4일부터 HGF 치료를 시작한 동물군의 경우, 도 7에서 명백한 것처럼, 대조군 동물들과 비교하여 더욱 신속한 기능 회복이 관찰되었다.

압좌 손상 이후 2주부터 HGF 치료를 시작한 동물군의 경우, 도 8에서 명백한 것처럼, 대조군 동물들과 비교했을 때, HGF 치료의 시작 (압좌 손상 4주 후)의 2주 후부터 기능 회복의 증진 효과가 관찰되었다.

압좌 손상 이후 8주부터 HGF 치료를 시작한 동물군의 경우, 도 9에서 명백한 것처럼, HGF 단백질이 주어진 동물들과 대조군 동물들의 기능 회복 간에 아무런 차이가 관찰되지 않았다.

제조 실시예 1

젖산-글리콜산 공중합체 (1.9 g; 젖산/글리콜산 = 50/50; 중량-평균 분자량 = 10,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 3.0 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 그 다음, 냉동-건조된 HGF 단백질 분말 100 mg을 이 유기 용매 용액에 첨가한 후 혼합 제분기(Retsch Technology)를 이용하여 곱게 제분하여서, HGF 분산을 제조하였다. 상기 분산액을 800 mL의 0.1 중량/용적% 수성 폴리비닐 알코올 용액에 첨가한 후, 호모믹서기 (homomixer)로 교반 및 균질화 하였다. 실온에서 3시간 동안 교반하여 디클로로메탄을 증발시켜 없앴고, 이후 약 2,000 rpm의 원심 분리에 의해 마이크로캡슐들을 수집하였다. 그 다음 마이크로캡슐들을 400 mL의 증류수로 세척한 후, 0.2 g의 D-만니톨을 첨가하고 냉동-건조를 실시하였다. 잔여 용매를 제거하기 위해서, 3일 동안 40℃에서 진공-건조를 실행하여서, HGF 단백질 함유 점진적 감소 마이크로캡슐들을 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 5.3 중량/중량 %).

제조 실시예 2

젖산-글리콜산 공중합체 (1.89 g; 젖산/글리콜산 = 50/50; 중량-평균 분자량 = 10,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 및 10 mg의 산화아연을 3.0 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 그 다음, 냉동-건조된 HGF 단백질 분말 100 mg을 이 유기 용매 용액에 첨가한 후 혼합 제분기(Retsch Technology)를 이용하여 곱게 제분하여서, HGF 분산을 제조하였다. 상기 분산을 800 mL의 0.1 중량/용적% 폴리비닐 알코올 수용액에 첨가한 후, 호모믹서기로 교반 및 균질화 하였다. 실온에서 3시간 동안 교반하여 디클로로메탄을 증발시켜 없앴고, 이후 약 2,000 rpm의 원심 분리에 의해 마이크로캡슐들을 수집하였다. 다음으로 마이크로캡슐들을 400 mL의 증류수로 2번 세척한 후, 0.2 g의 D-만니톨을 첨가하고 냉동-건조를 실시하였다. 잔여 용매를 제거하기 위해서, 3일 동안 40℃에서 진공-건조를 실행하여서, HGF 단백질 함유 점진적 감소 마이크로캡슐들을 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 5.3 중량/중량 %).

제조 실시예 3

젖산-글리콜산 공중합체 (1.7 g; 젖산/글리콜산 = 75/25; 중량-평균 분자량 = 15,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 2.7 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 그 다음, 냉동-건조된 HGF 단백질 분말 300 mg을 이 유기 용매 용액에 첨가한 후 혼합 제분기(제조원: Retsch Technology)를 이용하여 곱게 제분하여서, HGF 분산을 제조하였다. 상기 분산을 800 mL의 0.1 중량/용적% 수성 폴리비닐 알코올 용액에 첨가한 후, 호모믹서기로 교반 및 균질화 하였다. 실온에서 3시간 동안 교반하여 디클로로메탄을 증발시켜 없앴고, 이후 2,000 rpm의 원심 분리에 의해 마이크로캡슐들을 수집하였다. 다음으로 마이크로캡슐들을 400 mL의 증류수로 2번 세척한 후, 0.2 g의 D-만니톨을 첨가하고 냉동-건조를 실시하였다. 잔여 용매를 제거하기 위해서, 3일 동안 40℃에서 진공-건조를 실행하여서, HGF 단백질 함유 점진적 감소 마이크로캡슐들을 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 17.6 중량/중량 %).

제조 실시예 4

젖산-글리콜산 공중합체 (1.69 g; 젖산/글리콜산 = 75/25; 중량-평균 분자량 = 15,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 및 10 mg의 산화아연을 2.7 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 그 다음, 냉동-건조된 HGF 단백질 분말 300 mg을 이 유기 용매 용액에 첨가한 후 혼합 제분기(제조원: Retsch Technology)를 이용하여 곱게 제분하여서, HGF 분산액을 제조하였다. 상기 분산액을 800 mL의 0.1 중량/용 적% 수성 폴리비닐 알코올 용액에 첨가한 후, 호모믹서기로 교반 및 균질화하였다. 실온에서 3시간 동안 교반하여 디클로로메탄을 증발시켜 없앴고, 이후 2,000 rpm의 원심 분리에 의해 마이크로캡슐을 수집하였다. 다음으로 마이크로캡슐을 400 mL의 증류수로 2번 세척한 후, 0.2 g의 D-만니톨을 첨가하고 냉동-건조를 실시하였다. 잔여 용매를 제거하기 위해서, 3일 동안 40℃에서 진공-건조를 실행하여, HGF 단백질 함유 점진적 감소 마이크로캡슐을 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 17.8 중량/중량 %).

제조 실시예 5

DL-젖산 중합체 (5 g; 젖산/글리콜산 = 100/0; 중량-평균 분자량 = 5,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 50 mL의 염화메틸렌에 용해하여 10 중량/용적%의 용액을 준비하였다. 이후, 냉동-건조된 HGF 단백질 분말 2.5 mg을 용액에 첨가했다. 생성된 혼합물을 그 후 따로 40℃로 가열한 0.5 중량/용적% 키토산 수성 용액에 첨가한 후, 호모믹서기로 1000 rpm의 교반 속도에서 교반 및 유상화를 실시하였다. 생성된 유액을 실온에서 3시간 더 교반하여 염화메틸렌을 증발시켜 없앴고, 이후 2,000 rpm의 원심 분리에 의해 미소구체들을 수집하였다. 다음으로 미소구체들을 미리 40℃로 가열한 증류수로 5번 세척한 후, 실온에서 냉동-건조를 실시하여서, HGF 단백질 함유 미소구체들을 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 0.05 중량/중량 %).

제조 실시예 6

젖산-글리콜산 공중합체 (10 g; 젖산/글리콜산 = 75/25; 중량-평균 분자량 = 5,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 200 mL의 염화메틸렌/에탄올 (4:1)에 용해하여 5 중량/용적%의 용액을 준비하였다. 냉동-건조된 HGF 단백질 분말 2.5 mg을 상기 용액에 첨가했다. 결과 혼합물을 따로 40℃로 가열한 1 중량/용적% 수성 젤라틴 용액에 500 rpm의 속도에서 호모믹서기로 교반하면서 조금씩 첨가하여 유상화를 초래하였다. 생성된 유상액을 실온에서 3시간 더 교반하여 염화메틸렌 및 에탄올을 증발시켜 없앴고, 이후 형성된 미소구체들을 2,000 rpm의 원심 분리에 의해 수집, 미리 40℃로 가열한 증류수로 5번 세척 및 실온에서 냉동-건조하여, HGF 단백질 함유 미소구체들을 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 0.025 중량/중량 %).

제조 실시예 7

HGF 단백질 (0.2 mL)의 2 중량/용적% 수용액을 아텔로콜라겐의 2 % 인산염 완충액 2 mL와 혼합한 후, 냉동-건조하였다. 냉동-건조한 물질을 액체 질소를 사용해서 저온에서 분쇄시킨 후, 틀에 넣어 압축시켜서 원통형의 HGF-함유 서방성 제제를 형성하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 10 중량/중량 %).

제조 실시예 8

HGF 단백질 (100 mL)의 0.01 중량/용적% 수용액을 2 중량/용적% 콜라겐 수용액 50 g과 균일하게 혼합 및 교반한 후, 냉동-건조하였다. 냉동-건조한 물질을 액체 질소를 사용해서 저온에서 분쇄시킨 후, 분쇄된 물질을 막대기 모양 틀에서 압축 성형하여 HGF-함유 서방성 제제를 형성하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 1 중량/중량 %).

제조 실시예 9

HGF 단백질 (1 mg)을 2 중량/용적% 아텔로콜라겐 수용액 2 mL에 용해한 후, 냉동-건조를 실시하였다. 냉동-건조한 합성물을 저온에서 분쇄시킨 후, 원통형의 틀에 넣어 압축시켜서 HGF-함유 서방성 제제를 수득하였다 (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 2.5 중량 %).

제조 실시예 10

히알루로산의 나트륨 염 (0.58 g; 고유 점도: 4500 cc/g)을 20 mL의 물과 혼합하여 팽창하도록 하였다. 그 다음, 상기 혼합물에 2 mL의 2N 수산화나트륨을 첨가해서, 균일한 용액을 갖기 위하여 교반하였다. 2.4 mL의 물 중 디비닐설폰 (0.10 g)을 그 후 첨가하고 교반하였다. 결과 혼합물을 70분 동안 방치한 후, 생성된 겔을 223 mL의 바이오트리스 완충 용액 (0.15 M의 NaCl을 함유하고 pH가 약 7.2인 인산염 완충액)에 넣고, 3시간 동안 팽윤을 유도하였다. 그 다음, 상기 혼합물에 1 mL의 2N HCl을 첨가하였다. 1시간 후, 0.6 mL의 2N HCl을 첨가하였고, 혼합물을 16시간 동안 방치하였다. 이후 0.35 mL의 2N HCl을 첨가한 다음, 팽윤한 겔을 완충 용액에서 3일 동안 천천히 교반하였다. 균일한 점탄성 특징들을 지닌 부드러운 겔을 수득하였다. 겔은 5일 동안 0.15 M NaCl로 투석하였다. 그 후 겔을 완충된 염수 중 1 중량/용적%의 HGF 단백질과 혼합하여 최종 HGF 단백질 농도가 0.25 중량/용적%가 되도록 하여, HGF-함유 제제를 수득하였다. (생물 고분자 물질에 의한 HGF 비율: 25 중량/용적%).

본 발명은 척수 손상 및 탈수초성 질환을 치료하는데 유용한 약제를 제공한다.

<110> KEIO UNIVERSITY OSAKA UNIVERSITY KRINGLE PHARMA INC. <120> Therapeutic agent for spinal cord injury <130> 09-4068 <150> PCT/JP2007/053804 <151> 2007-02-28 <160> 3 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 2 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 180 185 190 Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr 195 200 205 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met 275 280 285 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln 290 295 300 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320 Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg 355 360 365 Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln 370 375 380 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln 385 390 395 400 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp 405 410 415 Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys 450 455 460 Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile 465 470 475 480 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr 485 490 495 Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His 500 505 510 Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg 515 520 525 Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly 530 535 540 Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu 545 550 555 560 Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu 565 570 575 Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile 580 585 590 Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser 595 600 605 Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu 610 615 620 Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His 625 630 635 640 His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala 645 650 655 Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 660 665 670 Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro 675 680 685 Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val 690 695 700 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val 705 710 715 720 Pro Gln Ser <210> 3 <211> 728 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Met Met Trp Gly Thr Lys Leu Leu Pro Val Leu Leu Leu Gln His Val 1 5 10 15 Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Val Thr Ile Pro Tyr Ala Glu Gly 20 25 30 Gln Lys Lys Arg Arg Asn Thr Leu His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 35 40 45 Thr Thr Leu Thr Lys Glu Asp Pro Leu Val Lys Ile Lys Thr Lys Lys 50 55 60 Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Lys Gly 65 70 75 80 Phe Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg 85 90 95 Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly 100 105 110 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn 115 120 125 Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr 130 135 140 Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn 165 170 175 Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr 180 185 190 Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser 195 200 205 Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Pro Met 210 215 220 Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Asp Gln Gln Thr 225 230 235 240 Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe 245 250 255 Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro Arg Pro Trp Cys 260 265 270 Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Met 275 280 285 Cys Ala His Ser Ala Val Asn Glu Thr Asp Val Pro Met Glu Thr Thr 290 295 300 Glu Cys Ile Lys Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Thr Asn Thr 305 310 315 320 Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His 325 330 335 Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu 340 345 350 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr 355 360 365 Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Lys Cys 370 375 380 Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr 385 390 395 400 Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp 405 410 415 Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp 420 425 430 Ala Ser Lys Leu Thr Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala 435 440 445 His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Val Pro Trp Asp Tyr 450 455 460 Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn 465 470 475 480 Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val 485 490 495 Val Asn Gly Ile Pro Thr Gln Thr Thr Val Gly Trp Met Val Ser Leu 500 505 510 Lys Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser 515 520 525 Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ala Arg Asn Lys Asp Leu 530 535 540 Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Glu Arg Gly 545 550 555 560 Glu Glu Lys Arg Lys Gln Ile Leu Asn Ile Ser Gln Leu Val Tyr Gly 565 570 575 Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro Ala Ile 580 585 590 Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly Cys Thr 595 600 605 Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly 610 615 620 Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met 625 630 635 640 Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr Leu Asn 645 650 655 Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys 660 665 670 Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys Met Arg 675 680 685 Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn 690 695 700 Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His 705 710 715 720 Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu 725

Claims (22)

1. 간세포 성장 인자(HGF) 단백질을 활성 성분으로서 포함하는, 척수 손상 환자의 운동기능 회복촉진을 위한 척수 손상 치료제로, 상기 간세포 성장 인자(HGF) 단백질을 0.0002 내지 2.0 중량/용적% 포함하고 척수강내 투여용 주사제의 제형이며 척수 손상 후로부터 2주 이내에 투여되는, 치료제.
2. 제1항에 있어서, 간세포 성장 인자(HGF) 단백질이,

   (i) SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열을 포함하는 단백질, 또는

   (ii) SEQ ID No: 1 또는 2의 아미노산 배열과 80 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열을 함유하는 단백질이며 HGF로서 작용하는 단백질인, 치료제.
3. 제1항에 있어서, 간세포 성장 인자(HGF) 단백질이 SEQ ID No: 2의 아미노산 배열을 함유하는 단백질인, 치료제.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 서방성 펌프에 의한 척수강내 투여용 주사제 제형인, 치료제.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 척수 손상 이후 4일 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는, 치료제.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제

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