EA035158B1 - Пептиды и композиции для лечения повреждений суставов - Google Patents

Пептиды и композиции для лечения повреждений суставов Download PDF

Info

Publication number
EA035158B1
EA035158B1 EA201591661A EA201591661A EA035158B1 EA 035158 B1 EA035158 B1 EA 035158B1 EA 201591661 A EA201591661 A EA 201591661A EA 201591661 A EA201591661 A EA 201591661A EA 035158 B1 EA035158 B1 EA 035158B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
polypeptide
amino acid
arthritis
cartilage
Prior art date
Application number
EA201591661A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591661A1 (ru
Inventor
Кристен Джонсон
Цзянь Ши
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of EA201591661A1 publication Critical patent/EA201591661A1/ru
Publication of EA035158B1 publication Critical patent/EA035158B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1891—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/59—Compounds containing 9, 10- seco- cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems
    • A61K31/593—9,10-Secocholestane derivatives, e.g. cholecalciferol, i.e. vitamin D3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/014—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from connective tissue peptides, e.g. gelatin, collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/225—Calcitonin gene related peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/17—Angiopoietin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

Изобретение относится к выделенному полипептиду с хондрогенной активностью и его вариантам, к фармацевтической композиции для лечения или профилактики артрита или повреждения хряща у пациента, содержащей указанный выделенный полипептид, к способу лечения, способу индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты.

Description

Предпосылки изобретения
Остеоартроз (ОА) представляет собой наиболее распространенное расстройство опорнодвигательного аппарата. В настоящее время им страдают приблизительно 40 миллионов американцев; число увеличится до 60 миллионов человек в ближайшие двадцать лет в результате старения населения и увеличения средней продолжительности жизни, что делает ОА четвертой по значимости причиной инвалидности. ОА характеризуется медленным дегенеративным разрушением сустава, включая как суставной хрящ (содержащий клетки и матрикс, которые производит смазывание и амортизацию для сустава), так и субхондральную кость, лежащую в основе суставного хряща. ОА можно считать следствием различных этиологических факторов. Например, он может быть вызван патологическим биомеханическим стрессом или генетически обусловленной или приобретенной патологией суставного хряща или костной ткани. Современные способы лечения ОА включают облегчение боли при помощи пероральных НПВП или селективных ингибиторов циклооксигеназы 2 (СОХ-2), внутрисуставной (IA) инъекции средств, таких как кортикостероиды и гиалуронан, а также хирургические подходы.
Повреждение сустава, например сильное повреждение сустава, такое как разрыв мениска или связок, или внутрисуставной перелом, может также привести к артриту, например, посттравматическому артриту. Поскольку суставной хрящ обладает ограниченной способностью восстановления, даже небольшое незаметное повреждение часто может усугубляться со временем и приводить к возникновению ОА. Современные способы лечения повреждений суставов могут включать в себя операции и другие инвазивные процедуры, направленные на регенерацию поврежденных суставов, а также лечение с использованием средств для ослабления боли и воспаления.
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) присутствуют в зрелом суставном хряще и при выделении могут быть запрограммированы in vitro на дифференцировку в хондроциты и мезенхимальные клетки других линий и могут быть использованы для регенерации хряща. Отчасти этот процесс регулируется факторами роста (бета-трансформирующие факторы роста, морфогенетические протеины кости), составом сыворотки и межклеточным контактом. В WO 2011/008773 описаны пептидные композиции и применение этих композиций для лечения или профилактики артрита и повреждений суставов и для индуцирования дифференцировки мезенхимальных клеток в хондроциты. Кроме того, в WO 2012/129562 описаны низкомолекулярные соединения, композиции и применение этих композиций для улучшения состояния при артрите и поражении сустава и для индуцирования дифференцировки мезенхимальных клеток в хондроциты.
Несмотря на определенный прогресс в способах хирургического вмешательства и в регенеративных методиках в плане восстановления хрящевой ткани, замедления процесса дегенерации и улучшения восстановления поврежденных суставов существует постоянная необходимость в совершенствовании композиций и способов для эффективной регенерации хряща, для лечения повреждения суставов и улучшения состояния или профилактики ОА.
Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение относится к обнаружению новых вариантов полипептидов и белков ангиопоэтинподобного белка 3 (ANGPTL3), которые имеют улучшенные фармацевтические свойства, например более стабильны, менее подвержены протеолизу и ферментативной деградации, чем ANGPTL3 дикого типа. Также изобретение относится к фармацевтическим композициям и способам лечения повреждения суставов или травмы сустава и к способам улучшения состояния при артрите или к способам профилактики артрита, повреждения суставов или травмы сустава у млекопитающего.
Таким образом, изобретение относится к протеазо-устойчивым полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности или по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% идентична по аминокислотной последовательности любой аминокислотной последовательности, выбранной из одной или нескольких последовательностей табл. 1, и как далее описано в настоящем документе. Модифицированные полипептиды табл. 1 включают аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, как определено по отношению к полипептидную последовательность полноразмерного ANGPTL3 с последовательностью SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, представляет собой Q или S. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, представляет собой S. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 423 делетирована, как определено по отношению к SEQ ID NO:1. Кроме того, предоставленные полипептиды обладают хондрогенной активностью.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит последовательность, которая по
- 1 035158 меньшей мере на 95% идентична или по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% любой последовательности из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична или по меньшей мере на 96, 97, 98, 99 или 100% любой последовательности из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:64. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит любую последовательность табл. 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит любую последовательность из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит любую последовательность из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:64. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой любую последовательность из табл. 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой любую последовательность из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой любую последовательность из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:64.
Полипептиды по изобретению могут включать одну или несколько химических модификаций (например, ПЭГилирование). В некоторых вариантах осуществления полипептиды по изобретению могут содержать гетерологичный пептид в качестве белка слияния, который может быть необязательно слит с амино- или карбоксиконцом полипептида. Также предоставлены полинуклеотиды, кодирующие полипептиды по изобретению; векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие полипептиды; и клеткихозяева, которые включают такие векторы.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептиды по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такие композиции можно использовать в способах, предусмотренных в этом документе для лечения, улучшения или профилактики артрита или повреждения суставов у пациента, где способ включает введение в сустав пациента терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. Неограничивающие примеры состояний, для которых такие способы могут иметь преимущество, включают артрит (например, остеоартрит, травматический артрит) и повреждения суставов (например, сильная травма сустава).
Настоящее изобретение также относится к способам лечения индивидуума, включающим введение терапевтически эффективного количества полипептида по изобретению.
Предоставленные способы включают лечение индивидуума, страдающего повреждением сустава и/или артритом или имеющего риск их развития, включающие введение индивидууму терапевтически эффективного количества одного или более полипептидов по изобретению или их фармацевтической композиции. Также изобретение относится к способам индуцирования дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хрящевые клетки, включающим приведение мезенхимальных стволовых клеток в контакт с эффективным количеством полипептида по изобретению для индуцирования дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты.
Эти и другие аспекты изобретения, включая дополнительные признаки, преимущества и варианты осуществления изобретения, будут описаны и освещены более подробно в нижеследующем подробном описании и в формуле изобретения, приложенной к настоящему документу.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует схему белков hANGPTL3, сконструированных для повышения стабильности белков и повышения протеолитической устойчивости. Во время продуцирования последовательностей белка дикого типа и пептидов между Lys423 и Ser424 наблюдалось 100% расщепление. Для уменьшения протеолиза были получены различные мутантные пептиды, в которых Lys423 был заменен на Gln или Ser; или Ser424 был заменен на Thr или Lys423 был делетирован;
фиг. 2А и В - графические представления экспрессии специфических белков хряща в присутствии или при отсутствии ANGPTL3 и инженерных конструкций. Фиксированные клетки окрашивали 2А для квантификации на проколлаген типа 2А (PIIANP) или 2В для квантификации на коллаген типа II для определения процента клеток, дифференцирующихся в хондроциты после обработки, как описано в пояс
- 2 035158 няющих примерах. Фиг. 2С иллюстрирует графическое представление количественной оценки анализов на ангиогенез в присутствии или при отсутствии ANGPTL3 или генно-инженерной конструкции по сравнению с белком положительного контроля, bFGF. Общая длина трубки и число точек ветвления представляли собой количественные измерения ангиогенеза. Несмотря на то что другими сообщалось об ангиогенной активности у ANGPTL3, и это исследование подтверждает активность, а также таковую у FGF, результаты продемонстрировали, что для конструкции С-терминального ANGPTL3 значительной активности не сохраняется;
фиг. 3 представляет собой графические представления, демонстрирующие увеличение экспрессии специфических белков хряща в присутствии ANGPTL3 или генно-инженерных конструкций. 3A. Клетки оценивали десять дней после лечения с помощью количественной ПЦР в реальном времени для определения экспрессии РНК для специфических белков хряща после обработки, как описано. Лубрицин, аггрекан и Sox9 представляют белки, родственные хрящевым; IGF и IFITM1 представляют потенциал дифференциации, и остеокальцин и коллаген X типа представляют белки, родственные костно/фиброзным белкам. 3B. Клетки оценивали три дня после обработки, как описано. Увеличенная экспрессия аггрекана была отмечена после лечения полипептидом С-концевой области генно-инженерной конструкции или ANGPTL1 дикого типа;
фиг. 4 иллюстрирует графическое представление хондрозащитной активности ANGPTL3 и генноинженерных конструкций. 4А: высвобождение гликозаминогликана (ГАГ), индикатора повреждения матрикса, ингибировалось с ростом количества ANGPTL3 и мутантных конструкций. Анализы ингибирования высвобождения ГАГ ex vivo (индикатор повреждения матрикса) проводили с использованием бычьего хряща, обработанного в присутствии или при отсутствии конструкций, как описано. 4В и 4С: нормализованное высвобождение ингибировалось с увеличением количества ANGPTL3 и генноинженерных конструкций, как указано. Хрящевые клетки обрабатывали в присутствии или при отсутствии конструкций, как описано, с последующими тестами реакции Грейсса, чтобы определить ингибирование нормализованного высвобождения как показателя хондрозащиты;
фиг. 5 - графическое представление, демонстрирующее ингибирование экспрессии коллагена типа X (показатель активности формирования фиброзных хрящей) в присутствии конструкций при гипертрофических условиях. Первичные хондроциты обрабатывали при наличии или отсутствии конструкций при гипертрофических условиях, как описано, с последующим определением экспрессии коллагена типа X, оцениваемой способом иммунофлюоресценции, как определение формирования фиброзного и гипертрофического хряща/дифференциации хондроцитов. 5А иллюстрирует результаты для С-терминального ANGPTL3 дикого типа или генно-инженерной конструкции. 5В иллюстрирует результаты для Сконцевого ANGPTL3 (WT) или генно-инженерных конструкций 242KQ или 242Kdel или С-концевого ANGPTL1;
фиг. 6 - схематическое представление парадигмы дозирования (6А) с последующим графическим представлением (6В) уменьшения степени тяжести заболевания сустава после лечения мышиным ANGPTL3 (17-460), как определено путем балльной оценки эрозии хряща латерального мыщелка бедра;
фиг. 7. является графическим представлением инкапаситантных измерений (показатель боли) у мышей после хирургической индукции повреждения хряща и последующего лечения ANGPTL3конструкциями один раз в неделю в течение трех недель (начало в день 7). 7А представляет инкапаситантные измерения на 35-й день после операции; и 7В представляет измерения, проведенные на 56-й день после операции;
фиг. 8 - графическим представлением балльной оценки общей степени тяжести заболевания сустава и улучшения степени тяжести повреждения хрящевой ткани, индуцированной коллагеназой у мышей после 3 процедур лечения один раз в неделю (дни 7, 14 и 21) ANGPTL3-конструкциями (указывается);
фиг. 9 иллюстрирует результаты повреждения суставов в модели разрыва мениска на крысах после лечения генно-инженерной ANGPTL3-конструкцией. Фиг. 9А является графическим представлением содержания протеогликанов в суставах через пять недель после лечения; фиг. 9В является графическим представлением балльной оценки степени тяжести бедренного сустава через пять недель после лечения. Результаты иллюстрируют улучшение состояния хрящевых повреждений, индуцированных хирургическим разрывом мениска у крыс, после 3 лечебных процедур один раз в неделю (дни 7, 14 и 21) с ANGPTL3 -конструкциями (указывается);
фиг. 10 - результаты повреждения суставов в модели разрыва мениска на крысах после лечения генно-инженерной ANGPTL3-конструкцией. Фиг. 10А является графическим представлением процентов восстановления in vivo, измеряемого по степени тяжести, интенсивности сафранина О, хрящевой области и толщине хряща. Фиг. 10В является графическим представлением инкапаситантных измерений (показатель боли) у крыс после хирургической индукции повреждения хряща и последующего лечения;
фиг. 11 является графическим представлением балльной оценки общей валового тяжести для иллюстрации улучшения в состоянии хрящевых повреждений, индуцированных хирургическим разрушением медиального мениска у собак после двухнедельных дозирования, начатого в 4-й день (каждая по 1,5 мкг/дозу или 15 мкг/дозу), или однократной 30 мкг-дозы, вводимой в 7-й день только.
- 3 035158
Подробное описание
Изобретение основано, по меньшей мере, частично на идентификации ангиопоэтин-подобных 3 (ANGPTL3) полипептидов, которые стимулируют хондроцитную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток и которые устойчивы к расщеплению протеазами (например, трипсин-подобными протеазами). WO 2011/008773 описывает ANGPTL3-пептидные композиции и применение пептидных композиций для лечения или профилактики артрита и повреждений суставов и для индуцирования дифференцировки мезенхимных клеток в хондроциты. Мы обнаружили, что ANGPTL3-белки дикого типа подвергаются протеазному обрезанию и нестабильности, и идентифицировали варианты последовательности, чтобы уменьшить этот эффект. Настоящее изобретение, таким образом, предоставляет улучшенные пептидные композиции для восстановления хряща. В частности, предоставляются ANGPTL3-пептиды, модифицированные в соответствии с настоящим изобретением для увеличения протеаза-устойчивости по сравнению с полипептидом ANGPTL3 дикого типа. Также предлагаются композиции и способы введения ANGPTL3-полипептидов, чтобы предотвратить или смягчить артрит или травму сустава с помощью введения полипептида по изобретению в сустав, хрящевую ткань или хрящевую проксимальную ткань, или системно. Далее, изобретение предоставляет составы и способы для индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты.
Определения.
Термин протеаза-устоичивый в настоящем документе обозначает полипептид, включающий модификацию, которая предоставляет полипептид, менее чувствительный к расщеплению трипсинподобной протеазы, чем соответствующий немодифицированный полипептид дикого типа. В конкретных вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид представляет собой полипептид ANGPTL3, который имеет аминокислотную замену относительно природной пептидной последовательности дикого типа, на остаток R или K.
ANGPTL3 относится к члену семейства ангиопоетиновых белков. Аминокислотная последовательность ANGPTL3 (входящий номер GenBank No. NP_055310.1) изложена в SEQ ID NO:1; и соответствующая полинуклеотидная последовательность которой изложена как SEQ ID NO:2 (номер NCBI референсной последовательности NM014495.2, где кодирующая последовательности ANGPTL3 содержит нуклеотиды 52-1434 SEQ ID NO:2). Полипептид ANGPTL3 относится к природному экспрессируемому полипептиду. Для целей настоящего раскрытия нумерация аминокислоты, как правило, определяется с учетом полной длины полипептидной последовательности ANGPTL3 дикого типа человека (как SEQ ID NO:1). Таким образом, в вариантах осуществления, в которых полипептид по изобретению содержит только с-концевую часть полноразмерного ANGPTL3, но не N-концевую части, хотя пептид состоит менее чем 460 аминокислот в длину, нумерация положений основывается на SEQ ID NO:1. Например, ссылка на положение 423 полипептида ANGPTL3 по изобретению относится к положению 423 SEQ ID NO:1, хотя полипептид ANGPTL3 по изобретению сам по себе может составлять только 200 аминокислот в длину. При определении аминокислоты в представляющей интерес последовательности из, которая соответствует положению в референсной последовательности, такой как как SEQ ID NO:1, это осуществляется с помощью оптимального выравнивания последовательностей, например, используя по умолчанию параметры выравнивания CLUSTAL или по умолчанию параметры выравнивания BLAST 2 и сравнивания последовательности. Например, положение 423 в представляющей интерес последовательности, которое определяется по отношению к SEQ ID NO:1, или аминокислота, которая соответствует положению 423 SEQ ID NO:1, означает аминокислоту, которая согласуется с положением 423 из SEQ ID NO:1 в случае, если представляющая интерес последовательность проценты оптимально выровнена с SEQ ID NO:1.
Термины пептидомиметический и миметический относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладают в существенной степени теми же функциональными характеристиками, что и природный или не встречающийся в природе полипептид (например, ANGPTL3), но разными (хотя обычно подобными) структурными характеристиками. Пептидные аналоги обычно используются в области как непептидные активные соединения (например, лекарства) со свойствами, аналогичными тем, которые имеются у эталонного пептида. Такие непептидные соединения называются пептидные миметики или пептидомиметики (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)). Пептидные миметики, которые конструктивно сходны с терапевтически полезными пептидами, могут использоваться для того, чтобы произвести равноценный или усиленный терапевтический или профилактический эффект. Как правило, пептидомиметики структурно сходны с эталонным полипептидом (т.е. полипептидом, обладающим биологической или фармакологической активностью), например, обнаруженной у представляющего интерес полипептида, но имеют одну или несколько пептидных связей, необязательно замененных связью, выбранной из группы, включающей, например, -CH2NH-, -CH2S-, СН2-СН2-, -СН=СН- (цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -CH2SO-. Миметик может либо полностью состоять из синтетических, ненатуральных аналогов аминокислот, или представляет собой химерную молекулу частично природных пептидных аминокислот и частично ненатуральных аналогов аминокислот. Миметик может также включать любое количество консервативных замен натуральных аминокислот при условии, что такие замены также не
- 4 035158 существенно изменяют структуру и/или активность миметика. Например, композиция миметика находится в рамках изобретения, если он обладает хондрогенной активностью полипептида ANGPTL3.
Термины полипептид, пептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислотных остатков. Термины применяются для аминокислотных полимеров, в которых один или более аминокислотных остатков представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также для природных аминокислотных полимеров и неприродных аминокислотных полимеров. Полипептиды, пептиды и белки по изобретению включают протеаза-устойчивые ANGPTL3-пептидомиметики, обладающие хондрогенной активностью.
Термин аминокислота относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природными являются те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые затем были изменены, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и Офосфосерин. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е. углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группу, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированный пептидный остов, но сохраняют ту же базовую химическую структуру, что и у природной аминокислоты. Природно кодируемыми аминокислотами являются 20 общих аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин), а также пирролизин, пирролинкарбоксилизин и селеноцистеин.
Консервативно модифицированные варианты относится к последовательностям как аминокислот, так и нуклеиновых кислот. По отношению к конкретной последовательности нуклеиновых кислот консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность к, по существу, идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой заданный белок. Например, каждый из кодонов GCA, GCC, GCG и GCU кодирует аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин определяется кодоном, кодон может быть изменен на какой-либо из соответствующих кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой молчащие вариации, которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая полипептидная последовательность в настоящем документе, которая кодируется с помощью полинуклеотида, включает все возможные молчащие вариации нуклеиновой кислоты. Любой специалист в рассматриваемой области техники признает, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который является обычно единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности.
Любой специалист признает, что отдельные замены, делеции или добавления к нуклеотидной, пептидной, полипептидной, белковой последовательности, которая изменяет, добавляет или удаляет одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот по сравнению с исходной кодируемой аминокислотной последовательностью, приводит к консервативно модифицированному варианту, где изменение производит замену аминокислоты на химически сходную аминокислоту, и/или полипептидной последовательности, которая производит структурно сходный белок, имеющий сходную функциональную активность исходного белка. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально подобные аминокислоты, хорошо известны в данной области техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по изобретению.
Термин консервативные замены аминокислот относится к замене (по существу или иначе) аминокислоты из одной такой группы другой аминокислотой из той же группы. Один из примеров замен основан на анализе нормированных частот аминокислотных изменений между соответствующими белками гомологичных организмов (см., например Schulz G.E. and КН. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). По данным такого анализа можно определить группы аминокислот, где аминокислот внутри группы обмениваются преимущественно друг с другом и, следовательно, похожи друг на друга больше всего в их влиянии на общую структуру белка (см., например, Schulz GT. and R.H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Один пример из набора аминокислотных групп, определенных таким образом, включает: (i) заряженную группы, состоящую из Glu and Asp, Lys, Arg и His; (ii) положительно заряженную группу, состоящую из Lys, Arg и His; (iii) отрицательно заряженную группу, состоящую из Glu и Asp; (iv) ароматическую группу, состоящую из Phe, Tyr и Trp; (v) группу азотного кольца, состоящую из His и Trp; (vi) большую алифатическую неполярную группу, состоящую из Val, Leu and Ile; (vii) слабо-полярную группу, состоящую из Met и Cys; (viii) группу небольших остатков, со
- 5 035158 стоящую из Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln и Pro; (ix) алифатическую группу, состоящую из Val, Leu, His, Met и Cys; и (х) небольшую гидроксильную группу, состоящую из Ser и Thr. Другие примеры консервативных замен, основанных на общих физических свойствах, являются замены в следующих группах: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (Т); и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984)).
Процент идентичности последовательности определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения, при котором участок аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы) по сравнению с эталонной последовательностью (например, полипептидом по изобретению), которая не содержит добавлений или делеций, для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент высчитывается путем определения числа положений, на которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотных остатков находятся в обеих последовательностях, для получения числа совпавших положений, деленного на число совпавших положений в общем количестве положений в окне сравнения, и умножения результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми последовательностями. Две последовательности являются по существу идентичными, если две последовательности имеют определенный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е. 95% идентичность, необязательно 96, 97, 98 или 99% идентичность на протяжении определенной области или, если он не указан, на протяжении всей последовательности), при сравнении и выравнивании для максимального соответствия на протяжении окна сравнения, или желательного участка, определяемого с помощью одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуального исследования. Изобретение предоставляет полипептиды, которые являются существенно идентичными полипептидам, соответственно, служащим примером в настоящем документе (например, любой из SEQ ID NOs: 11-42), а также использует их, в том числе, но без ограничения, для применения при лечении или профилактике артрита или травмы сустава. Дополнительно, для нуклеиновых кислот, идентичность имеет место на протяжении области по меньшей мере примерно 150 нуклеотидов в длину или, более предпочтительно, на протяжении области, составляющей от 300 до 450 или 600 или более нуклеотидов в длину или всю длину эталонной последовательности. Для аминокислотной последовательности, необязательно, идентичность имеет место на протяжении области, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот в длину или, более предпочтительно, на протяжении области, составляющей от 100 до 150 или 200 и более аминокислот в длину или всю длину эталонной последовательности.
При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравниваются тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей, тестируемые и эталонную последовательности вводят в компьютер, обозначают координаты подпоследовательностей в случае необходимости и задают параметры программы алгоритма последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию, или могут быть определены альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем вычисляет процент идентичности последовательности для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности на основе параметров программы.
Окно сравнения, как используется в настоящем документе, включает ссылку на сегмент любого ряда последовательных положений, выбранного из группы, включающей от 50 до 600, как правило, примерно от 75 до примерно 200, более обычно примерно от 100 до примерно 150, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью из такого же числа смежных положений после того, как две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, путем алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, путем алгоритма гомологического выравнивания Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, путем поиске способом сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, при помощи компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA) или путем ручного выравнивания и визуального рассмотрения (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995, приложение)).
Двумя примерами алгоритмов, пригодных для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977) Nuc. Acids. Res. 25:3389-3402 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 соответственно. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST публично доступно через Национальный центр биотехнологической информации. Этот алгоритм предполагает, в первую очередь, выявление высокорезультативных пар у последовательностей (HSP) путем идентификации коротких
- 6 035158 слов длиной W в последовательности запроса, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительно оцененному проходному баллу Т при выравнивании со словом той же длины в последовательности базы данных. Т называется порогом оценки соседних слов (Altschul et al., выше). Эти первоначальные совпадения соседних слов выступают в качестве затравок для инициирующих поисков, чтобы найти более длинные HSP, их содержащие. Совпадения слов распространяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока совокупный балл выравнивания может увеличиваться. Совокупные баллы рассчитываются с использованием, для нуклеотидных последовательностей, параметров М (наградной балл для пары совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадение остатков; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей оценочные таблицы используются для расчета суммарного балла. Распространение совпадений слов в каждом направлении прекращается в случае, когда совокупный балл выравнивания снижается на количество X от своего максимального достигнутого значения; совокупный балл достигает нуля или ниже, из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательной оценкой; или достигается конец любой последовательности. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используется длина слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP по умолчанию использует длину слова 3 и ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) выравнивания (В) 50, ожидание (Е) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.
Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Одним из критериев сходства, предусмотренных алгоритмом BLAST, является наименьшая сумма вероятностей (P(N)), которая обеспечивает индикацию вероятности, по которой сопоставление двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей могло бы произойти случайно. Например, нуклеиновая кислота рассматривается аналогично эталонной последовательности, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислоты составляет менее чем примерно 0,2, более предпочтительно менее чем примерно 0,01 и, наиболее предпочтительно, менее чем примерно 0,001.
Термин выделенный в случае применения к нуклеиновой кислоте или белку означает, что нуклеиновая кислота или белок очищается, чтобы быть, по существу, свободной от других клеточных компонентов, с которыми она(он) связан в природном состоянии. Часто она(он) находится в однородном или почти однородном состоянии. Она(он) может быть либо сухой, либо находиться в водном растворе. Чистота и однородность может быть определена с использованием способов аналитической химии, известных и, как правило, используемых в рассматриваемой области техники, например гель-электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная жидкостная хроматография и др. Белок, который является преобладающим видом, присутствующим в препарате, является в существенной степени очищенным. Термин очищенный в некоторых вариантах осуществления обозначает, что белок образует, в основном, одну полосу на электрофорезном геле. Как правило, это означает, что белок, является, по меньшей мере, 85% чистоты, более предпочтительно по меньшей мере 95% чистоты и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99% чистоты.
Термин гиалуроновая кислота используются в настоящем документе для включения производных гиалуроновой кислоты, которые включают сложные эфиры гиалуроновой кислоты, соли гиалуроновой кислоты, а также включает в себя термин гиалуронан. Обозначение также включает как низко-, так и высокомолекулярные формы гиалуронанов и сшитых гиалуронанов или ксиланов. Примерами таких гиалуронанов являются Synvisc™ (Genzyme Corp. Cambridge, Массачусетс), ORTHOVISC™ (Anika Therapeutics, Уоберн, Массачусетс), HYALGAN™ (Sanofi-Synthelabo Inc., Малверн, Пенсильвания) и Pro Vise (Alcon/No vartis).
Ангиопоэтин-подобные 3 протеаза-устойчивые полипептиды.
Ангиопоэтин-подобный 3 является членом ангиопоэтин-подобного семейства секретируемых факторов. Он преимущественно экспрессируется в печени и имеет характерную структуру ангиопоэтинов, состоящих из сигнального пептида, N-концевого биспирального домена (CCD) и С-концевого фибриноген(FBN)-подобного домена. Ангиопоэтин-подобный 3, как было показано, связывается с аУф3 интегринами, и самого по себе FBN-подобного домена было достаточно, чтобы индуцировать адгезию эндотелиальных клеток и ангиогенез in vivo (Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277: 17281-17290, 2002). Эндогенные ANGPTL3 обычно расщепляются in vivo на аминоконцевой и карбоксиконцевой фрагменты. Как кратко изложено выше и далее описано в этом документе, изобретение предусматривает применение различных протеаза-устойчивых ANGPTL3-белков, обладающих хондрогенной активностью.
В некоторых вариантах осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95% идентичность или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из последовательностей в табл. 1, отличающаяся тем, что полипептид содержит аминокислоту, которая является полярной
- 7 035158 аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид по изобретению обладает хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70, где полипептид содержит аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423 или полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активности. В дополнительном варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющей по меньшей мере 95% идентичность или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:64, где полипептид содержит аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью.
В некоторых вариантах осуществления выделенный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из последовательностей из табл. 1, отличающуюся тем, что полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептидной содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность выбранную из любой из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении, или 423 полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В дополнительном варианте полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:64, где полипептид содержит аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью.
В некоторых вариантах осуществления, выделенный полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичность или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из последовательностей из табл. 1, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичность или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептидной содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В дополнительном варианте осуществления полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичность, или по меньшей мере или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:64, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью.
В некоторых вариантах осуществления выделенный полипептид представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из любой из последовательностей, представленных в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ
- 8 035158
ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 или SEQ ID N0:70. В дополнительном варианте полипептид представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:64.
Таблица 1 Конструкции вариантов ANGPTL3
SEQ ID Конструкция Последовательность
14 207KQ IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPE RRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
15 207KS IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPE RRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
16 225KQ TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTDSESFE
17 225KS TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTDSESFE
18 225ST TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKTKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTDSESFE
- 9 035158
19 226KQ TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTDSESFE
20 226KS TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTDSESFE
21 228KQ FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTDSESFE
22 228KS FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTDSESFE
23 228ST FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKTKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTDSESFE
24 233KQ EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH PTDSESFE
25 233KS EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH PTDSESFE
26 241KQ GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGW-WH DECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
27 2 4 IKS GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWTWH DECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
28 242KQ IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
29 242KS IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
- 10 035158
30 225-455KQ TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTD
31 225-455KS TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTD
32 22 6-455KQ TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTD
33 226-455KS TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTD
34 228-455KQ FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTD
- 11 035158
FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW
TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED
228-455KS
WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF
NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST
KMLIHPTD
EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH
RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK
233-455KQ
HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG
YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH
PTD
EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH
RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK
233-455KS
HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG
YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH
PTD
GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF
241-455KQ
NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY
LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH
DECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF
241-455KS
NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY
LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH
DECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN
242-455KQ
ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL
GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD
ECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN
242-455KS
ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL
GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD
ECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI
RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL
207Kdel
EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA
IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPER
RRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
- 12 035158
59 225Kdel TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTDSESFE
60 226Kdel TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKS TKMLIHPTDSESFE
61 228Kdel FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTK MLIHPTDSESFE
62 233Kdel EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHP TDSESFE
63 241Kdel GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
64 242Kdel IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
65 225- 455Kdel TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHICAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTD
66 226- 455Kdel TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKS TKMLIHPTD
67 228-455Kdel FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTK MLIHPTD
- 13 035158
68 233-455Kdel EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHP TD
69 241-455Kdel GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
70 242-455Kdel IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
Модифицированные полипептиды ANGPTL3 по изобретению имеют по меньшей мере одну замену в С-концевой части полипептида, чтобы сделать полипептид протеаза-устойчивым. Замена имеет место по остаткам R или K, так что полипептиды обладают повышенной устойчивостью, например, к трипсиноподобным протеиназам. Любая аминокислота может быть заменена на R или K в протеаза-устойчивом полипептиде ANGPTL3 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой полярную аминокислоту, например Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S. В некоторых вариантах осуществления протеазаустойчивый пептид содержит аминокислоту в положении 423, по отношению к SEQ ID NO:1, которая отлична от K или R. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению содержит аминокислоту в положении 423, которая является полярной аминокислотой. Например, аминокислота в положении 423 может представлять собой Q или S или другую полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению имеет Q в положении 423. В других вариантах осуществления полипептид по изобретению имеет S в положении 423. В некоторых вариантах осуществления в дополнение к замене в 423, протеаза-устойчивый пептид имеет замену другого R или K в С-конце SEQ ID NO: 1 или ее варианте, при которой замена представляет собой полярную аминокислоту, отличную от R или K. В некоторых вариантах осуществления замена в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, представляет собой Q или S. Еще в других вариантах осуществления полипептид по изобретению имеет делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению составляет 250 аминокислот или меньше в длину и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70.
В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет применение полноразмерных протеаза-устойчивых, хондрогенных белков ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет протеаза-устойчивые белки ANGPTL3, содержащие С-концевую часть последовательности ANGPTL3, или ее хондрогенный вариант. В определенных вариантах осуществления у белков ANGPTL3 отсутствует амино-терминальный конец нативного белка. В некоторых вариантах осуществления у протеаза-устойчивых белков ANGPTL3 по изобретения отсутствует домен CCD и/или отсутствует существенная CCD-активность. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления протеазаустойчивые белки ANGPTL3 по изобретению включают, по меньшей мере, фрагмент (например по меньшей мере 100, 150, 200, 220 или 215 смежных аминокислот) карбоксиконцевого домена белка ANGPTL3 человека, или в существенной степени идентична последовательности карбоксиконцевой последовательности белка ANGPTL3 человека, где полипептид и его варианты сохраняет хондрогенную активность. В некоторых вариантах осуществления у протеаза-устойчивого полипептида по изобретению отсутствует по меньшей мере часть С-терминальной последовательности, например, отсутствует 5, 10, 15 или 20 аминокислот с С-терминального конца SEQ ID NO:1 (т.е. отсутствуют 456-460, 451-460, 446-460 или 441-460 в SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобретению содержит смежные аминокислоты, соответствующие аминокислотным участкам: аминокислоты 241-455 или 241-460 из SEQ ID NO:1; аминокислоты 242-455 или 242-460 из SEQ ID NO:1; аминокислоты 233-455 или 233-460 из SEQ ID NO:1; аминокислоты 228-455 или 228-460 из SEQ ID NO:1, аминокислоты 226-455 или 226-260 или аминокислоты 225-455 или 225-260 из SEQ ID NO:1, в которой аминокис
- 14 035158 лота заменяется на R или K или один остаток делегирован. В некоторых вариантах осуществления замены содержится в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления содержится делеция в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления протеазы-устойчивый полипептид содержит смежные аминокислоты, соответствующие аминокислотным областям 207-455 или 207-460 из SEQ ID NO:1, в которой аминокислота заменена на R или K, или один остаток делетирован. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция содержится в положении 423. В некоторых вариантах осуществления замена является полярной аминокислотой, например Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления, включена делеция в положении 423 относительно SEQ ID NO:1.
Изобретение дополнительно предоставляет протеаза-устойчивый полипептид, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность, или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с аминокислотами 240-454 из SEQ ID NO:1, аминокислотами 241-455 из SEQ ID NO:1 или аминокислотами 242-455 из SEQ ID NO:1 с заменой или делецией по аминокислоте, соответствующей положению 423 из SEQ ID NO:1, где замещенной аминокислотой является не R, и где полипептид обладает хондрогенной активностью. В других вариантах осуществления полипептид включает аминокислоты 240-454 из SEQ ID NO:1, аминокислоты 241-455 из SEQ ID NO:1 или аминокислоты 242-455 из SEQ ID NO:1, каждый полипептид с заменой или делецией по аминокислоте, соответствующей положению 423 SEQ ID NO:1, где замещенный аминокислотой является Q или S.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобретению содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичность с аминокислотами аминокислотами 242-455 или 242-460 из SEQ ID NO:1; 241-455 или 241-460 из SEQ ID NO:1; аминокислотами 233-455 или 233-460 из SEQ ID NO:1; аминокислотами 228-455 или 228-460 из SEQ ID NO:1, аминокислотами 226-455 или 226-260 из SEQ ID NO:1, или аминокислотами 225-455 или 225-260 из SEQ ID NO:1, в котором аминокислота заменена на R или K, или R или K делетированы. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция содержится в положении 423. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой полярную аминокислоту, например Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления, замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления содержится делетированный остаток в положении 423 относительно SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобретению составляет 250 или 240 или меньше аминокислот в длину и содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70. В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобретению составляет 230 или 225 или меньше аминокислот в длину и содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивые белки ANGPTL3 по изобретению включают аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере 95% идентичность, или, по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с С-концевой последовательностью белка ANGPTL3 собаки, быка или лошади. В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивые белки ANGPTL3 по изобретению включают, по меньшей мере, фрагмент (например, по меньшей мере 100, 150, 200, 215 смежных аминокислот) последовательности нативного белка ANGPTL3 собаки (SEQ ID NO:4), лошади (SEQ ID NO:5) или быка (как SEQ ID NO:6), или последовательности, в существенной степени идентичной последовательности нативного белка ANGPTL3 собаки, быка или лошади, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления выделенный полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичностю, или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:43, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид
- 15 035158 имеет по меньшей мере 95% идентичность или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичность с SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:43, где полипептид включает аминокислоту, которая является полярной аминокислотой, отличной от K или R в положении 423, или полипептид содержит делецию в положении 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1, и полипептид обладает хондрогенной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:43. В дополнительном варианте осуществления полипептид представляет собой SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:43.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый ANGPTL3 по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96, 97, 98, или по меньшей мере 99% идентичность с аминокислотами 232-454 из SEQ ID NO:4, аминокислотами
240- 454 из SEQ ID NO:4, аминокислотами 227-454 из SEQ ID NO:4 или аминокислотами 224-454 из SEQ ID NO:4, в которой аминокислота заменена на R или K, или содержится делеция R или K. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция содержится в положении 422 в SEQ ID NO:4, что соответствует положению 423 в SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой полярную аминокислоту, например Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная делеция находится в положении 422 в SEQ ID NO:4.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый ANGPTL3 по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95% или по меньшей мере 96, 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичность с аминокислотами 233-455 из SEQ ID NO:5, аминокислотами
241- 455 из SEQ ID NO:5, аминокислотами 228-455 из SEQ ID NO:5 или аминокислотами 225-455 из SEQ ID NO:5, в которой аминокислота заменена на R или K, или содержится делеция R или K. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция находится в положении 423 в SEQ ID NO:5, что соответствует положению 423 в SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления замена является полярной аминокислотой, например, Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления, замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная делеция находится в положении 423 в SEQ ID NO:5.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый ANGPTL3 по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95% или по меньшей мере 96, 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичность с аминокислотами 233-455 из SEQ ID NO:6, аминокислотами 241-455 из SEQ ID NO:6, аминокислотами 228-455 из SEQ ID NO:6 или аминокислотами 225-455 из SEQ ID NO:6, в которой аминокислота заменяется на R или K, или содержится делеция R или K. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция содержится в положении 422 в SEQ ID NO:6, что соответствует положению 423 в SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления замена является полярной аминокислотой, например, Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная делеция находится в положении 422 из SEQ ID NO:6.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобретению содержит смежные аминокислоты, соответствующие аминокислотным областям: аминокислоты
240- 454 из SEQ ID NO:4; аминокислоты 232-454 из SEQ ID NO:4; аминокислоты 227-454 из SEQ ID NO:4 или аминокислоты 224-454 из SEQ ID NO:4, в которой аминокислота заменена на R или K, или содержится делеция R или K. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция находится в положении 422 в SEQ ID NO:4 (которое является положением 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой полярную аминокислоту, например, Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления, замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления аминокислота делеция находится в положении 422 в SEQ ID NO:4.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобретению содержит смежные аминокислоты, соответствующие аминокислотным областям: аминокислоты
241- 455 из SEQ ID NO:5; аминокислоты 233-455 из SEQ ID NO:5; аминокислоты 228-455 из SEQ ID NO:5 или аминокислоты 225-455 из SEQ ID NO:5, в которых аминокислота заменяется на R или K, или содержится делеция R или K. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция находится в положении 423 (что соответствует положению 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления замена является полярной аминокислотой, например, Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная делеция находится в положении 423 в SEQ ID NO:5.
В некоторых вариантах осуществления протеаза-устойчивый полипептид ANGPTL3 по изобрете
- 16 035158 нию содержит смежные аминокислоты, соответствующие аминокислотным областям: аминокислоты 241-455 из SEQ ID NO:6; аминокислоты 233-455 из SEQ ID NO:6; аминокислоты 228-455 из SEQ ID NO:6 или аминокислоты 225-455 из SEQ ID NO:6, в котором аминокислота заменена на R или K, или содержится делеция R или K. В некоторых вариантах осуществления замена или делеция находится в положении 422 в SEQ ID NO:6 (которая является положением 423, как определено по отношению к SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления замена является полярной аминокислотой, например Н, N, Q, S, Т, А или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Н, N, Q, S, Т или Y. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой S или Q. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Q. В некоторых вариантах осуществления имеется делеция находится в положении 422 в SEQ ID NO:6.
Белки ANGPTL3 по изобретению, как описано выше, может включать природные последовательности белка ANGPTL3, фланкирующие области, описанные выше. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления белки ANGPTL3 по изобретению могут включать фланкирующие последовательности белка ANGPTL3, отличные от природных. Например, хондрогенно-активная часть белка ANGPTL3 может быть слита с одним или несколькими партнерами по слиянию и/или гетерологичными аминокислотами с образованием слитого белка. Последовательности партнеров по слиянию могут включать, в качестве неограничивающих примеров, аминокислотные теги, аминокислоты, отличные от L-аминокислот (например, Dаминокислоты) или другие аминокислотные миметики для продления in vivo времени полужизни и/или протеазной устойчивости, нацеливания последовательностей или других последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению является ПЭГилированным. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению слит с гетерологичным пептидом. В определенных вариантах осуществления полипептид слит с любым из человеческого сывороточного альбумина (HSA), константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина (Fc), полигистидина, глутатион^-трансферазы (GST), тиоредоксина, белка А, белка G, мальтоза-связывающего белка (МВР) или фрагментом любого из вышеперечисленных гетерологичных полипептидов(а). В конкретных вариантах осуществления гетерологичный полипептид слит с амино-терминальным концом полипептида по изобретению. В дополнительных или альтернативных вариантах осуществления гетерологичный полипептид слит с карбокси-терминальным концом полипептида по изобретению.
Белки ANGPTL3 по изобретению имеют хондрогенную активность и являются протеаза-устойчивыми. Как определено в настоящем документе, хондрогенез или хондрогенная активность относится к развитию хондроцитов из MSC. Индикаторы хондрогенной активности включают, без ограничения, продуцирование хрящевого матрикса. Продуцирование хрящевого матрикса может быть измерено с помощью различных маркеров, например таких как Sox9, коллагена II типа или продуцирование гликозаминогликанов (ГАГ). В некоторых вариантах осуществления продуцирование ГАГ измеряется как маркер продуцирования хрящевого матрикса. В некоторых вариантах осуществления 3-кратное увеличение продуцирования ГАГ при помощи экспрессии хрящ-специфического белка указывает на положительное продуцирование хрящевого матрикса.
Полипептид можно оценить на протеазную устойчивость, используя любой известный тест, который определяет расщепление с помощью сериновой протеазы, такой как трипсин. В некоторых вариантах осуществления протеазы, используемые для оценки протеолиза восприимчивость является сериновая протеаза трипсин. Полипептид считается протеаза-устойчивым, если он имеет пониженную чувствительность к трипсину, по сравнению с аналогом дикого типа. Пример анализа заключается в измерении количества расщепленного продукта, который образуется, когда полипептид подвергается воздействию трипсина в течение определенного периода времени, по сравнению с соответствующим природным пептидом человека. Расщепление можно определить с помощью любого известного анализа, например, электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия и LCMS. Иллюстративный анализ приводится в разделе Примеры.
В иллюстративном анализе ограниченный протеолиз путем проведения трипсинолиза осуществляется путем инкубации 10 нг белка, подлежащего оцениванию, с трипсином при массовом соотношении 8000:1 (белок:трипсин) в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакцию трипсинолиза можно затем гасить добавлением уксусной кислоты, чтобы довести реакцию до рН 3,0. Загашенные образцы затем разделяли и анализировали способом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, например в 4-12% трис-бис геле для идентификации белков, которые устойчивы к расщеплению, от тех, которые расщепляются с появлением фрагмента, который образуется путем расщепления трипсином. Продукт расщепления отсутствует или снижен в протеаза-устойчивых полипептидах по сравнению с их аналогами дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды ANGPTL3 по изобретению включают по меньшей мере одну природно не кодируемую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит 1, 2, 3, 4 или более не встречающихся в природе аминокислот. Способы получения и встраивания не встречающейся в природе аминокислоты в белок известны. См., например, патенты США № 7083970; и 7524647. Общие принципы производства ортогональных систем трансляции, которые подходят для создания белков, которые содержат одну или более желаемых не встречающихся в природе
- 17 035158 аминокислот, известны в данной области техники, так как являются общими способами получения ортогональных систем трансляции. Например, см. номера международных публикаций WO 2002/086075, озаглавленной METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNAAMINO ACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS; WO 2002/085923, озаглавленной IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS; WO 2004/094593, озаглавленной EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE; WO 2005/019415, поданной 7 июля 2004; WO 2005/007870, поданной 7 июля 2004; WO 2005/007624, поданной 7 июля 2004; WO 2006/110182, поданной 27 октября 2005, озаглавленной ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS и WO 2007/103490, поданной 7 марта 2007, озаглавленной SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS. Для обсуждения ортогональных систем трансляции, которые включают не встречающиеся в природе аминокислоты, и способы их производства и применения, см. также Wang and Schultz, (2005) Expanding the Genetic Code Angewandte Chemie Int. Ed. 44: 34-66; Xie and Schultz, (2005) An Expanding Genetic Code Methods 36: 227-238; Xie and Schultz, (2005) Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire Curr. Opinion in Chemical Biology 9: 548-554; и Wang, et al., (2006) Expanding the Genetic Code Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35: 225-249; Deiters et al., (2005) In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15: 1521-1524; Chin et al., (2002) Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027; и международную публикацию № WO 2006/034332, поданную 20 сентября 2005. Дополнительные подробности обнаруживаются в патентах США № 7045337; 7083970; 7238510; 7129333; 7262040; 7183082; 7199222 и 7217809. Природно не кодируемая аминокислота означает аминокислоту, которая не является одной из обычных аминокислот или пирролизином, пирролинкарбоксилизином или селеноцистеином. Другими терминами, которые могут использоваться синонимично с термином природно не кодируемая аминокислота, являются ненатуральная аминокислота, неприродная аминокислота, не встречающаяся в природе аминокислота и различные их версии с дефисом и без него. Термин природно не кодируемая аминокислота также включает, без ограничения, аминокислоты, которые возникают путем модификации (например, посттрансляционные модификации) природно кодируемой аминокислоты (включая, без ограничения, 20 обычных аминокислот или пирролизин, пирролинкарбоксилизин или селеноцистеин), но сами природно не включаются в растущую цепь полипептида при помощи трансляционного комплекса. Неограничивающие примеры таких не встречающающихся в природе аминокислот включают Nацетилглюкозаминил-С-серин, №ацетилглюкозаминил-С-треонин и O-фосфотирозин.
Природно не кодируемая аминокислота обычно обладает любой структурой, имеющей любую замещающую боковую цепь, отличную от тех, которые используются в двадцати природных аминокислотах. Поскольку природно не кодируемые аминокислоты по изобретению, как правило, отличаются от природных аминокислот только структурой боковой цепи, природно не кодируемые аминокислоты образуют амидные связи с другими аминокислотами, включая, в качестве неограничивающих примеров, природно или неприродно кодируемые, в том же порядке, в котором они формируются в природных полипептидах. При этом природно не кодируемые аминокислоты имеют группы боковой цепи, которые отличают их от природных аминокислот. Например, R необязательно включает алкил-, арил-, ацил-, кето-, азидо-, гидроксил-, гидразин-, циано-, гало-, гидразид, алкенил, алкинил, простой эфир, тиол, селено-, сульфонил-, борат, боронат, фосфо, фосфоно, фосфин, гетероциклическая, энон, имин, альдегид, сложный эфир, тиокислоту, гидроксиламин, аминогруппу или тому подобное или любые их сочетания. Другие не встречающиеся в природе аминокислоты, представляющие интерес, которые могут быть пригодны для использования в настоящем изобретении, включают, в качестве неограничивающих примеров, аминокислоты, содержащие фотоактивируемый кросс-линкер, спин-меченые аминокислоты, флуоресцентные аминокислоты, металл-связывающие аминокислоты, металл-содержащие аминокислоты, радиоактивные аминокислоты, аминокислоты с новыми функциональными группами, аминокислоты, которые ковалентно или нековалентно взаимодействуют с другими молекулами, фотозапираемые и/или фотоизомеризуемые аминокислоты, аминокислоты, которые содержат биотин или аналог биотина, гликозилированные аминокислоты, такие как серин с замещенным сахаром, других аминокислоты с модифицированными углеводами, кето-содержащие аминокислоты, аминокислоты, содержащие полиэтиленгликоль или полиэфир, аминокислоты с замещенным тяжелым атомом, химически расщепляемые и/или фоторазрушаемые аминокислоты, аминокислоты с удлиненной боковой цепью по сравнению с природными аминокислотами, включая, в качестве неограничивающих примеров, полиэфиры или длинноцепочечные углеводороды, включающие, в качестве неограничивающих примеров, больше, чем примерно 5 или больше, чем примерно 10 атомов углерода, углерод-связанные сахаросодержащие аминокислоты, редоксактивные аминокислоты, аминотиокислот-содержащие аминокислоты и аминокислоты, содержащие одну или более токсичных функциональных групп.
Типичные природно не кодируемые аминокислоты, которые могут быть пригодны для использования в настоящем изобретении и которые полезны для реакций с водорастворимыми полимерами, включают, в качестве неограничивающих примеров, таковые с карбонильной, аминоокси, гидразиновой, гидразидной, семикарбазидной, азидной и алкинной реакционноспособными группами. В некоторых вари
- 18 035158 антах осуществления природно не кодируемые аминокислоты содержат сахаридную функциональную группу. Примеры таких аминокислот включают N-ацетил-Е-глюкозаминил-Е-серин, N-ацетил-Егалактозаминил-Е-серин, N-ацетил-Е-глюкозаминил-Е-треонин, N-ацетил-Е-глюкозаминил-Е-аспарагин и О-маннозил-Е-серин. Примеры таких аминокислот включают также примеры, где природные N- или Освязь между аминокислотой и сахаридом заменяется ковалентной связью, не часто встречающейся в природе, в том числе в качестве неограничивающих примеров, алкен, оксим, тиоэфир, амид и тому подобное. Примеры таких аминокислот включают также сахариды, которые обычно не встречаются в природных белках, такие как 2-дезоксиглюкоза, 2-дезоксигалактоза и тому подобное.
Другой тип модификации, которую можно дополнительно вводить в белки ANGPIES по изобретению (например, в пределах полипептидной цепи или на N- или С-конец), например, для продления in vivo времени полужизни, является ПЭГ илирование или включение длинноцепочечных полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ). Введение ПЭГ или длинноцепочечных полимеров ПЭГ увеличивает эффективную молекулярную массу полипептидов, присутствующих, например, для предотвращения быстрой фильтрации в мочу. В некоторых вариантах осуществления остаток лизина в последовательности ANGPTE3 конъюгирован с ПЭГ непосредственно или через линкер. Такой линкер может представлять собой, например, остаток Glu или ацильный остаток, содержащие тиоловые функциональные группы для связывания с соответствующим образом модифицированной цепью ПЭГ. Альтернативным способом введения цепи ПЭГ является введение сначала остатка Cys в С-конец полипептидной цепи или в гидрофильные остатки, такие как замены по остаткам Arg или Eys. Этот остаток Cys затем сайт-специфически присоединяют к цепи ПЭГ, заключающей, например, малеимидную функцию. Способы включения ПЭГ или длинноцепочечных полимеров ПЭГ известны в рассматриваемой области техники (описанный, например, в Veronese F.M. et al., Drug Disc. Today 10: 1451-8 (2005); Greenwald R.B. et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 217- 50 (2003); Roberts M.J. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 459-76 (2002)), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Другие способы полимерных коньюгатов, известные в данной области техники, могут также использоваться в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления, поли(2-метакрилоилоксиэтил фосфорилхолин) (РМРС) вводится в качестве полимерного конъюгата с белками ANGPTE3 по изобретению (см., например, WO 2008/098930; Eewis et al., Bioconjug Chem., 19: 2144-55 (2008)). В некоторых вариантах осуществления в фосфорилхолинсодержащие полимерные коньюгаты с белками ANGPTE3 могут быть использованы в настоящем изобретении. Специалист в рассматриваемой области техники признает, что другие биосовместимые полимерные конъюгаты могут быть использованы.
Описанный ранее альтернативный подход для включения ПЭГ или полимеров ПЭГ через включение ненатуральных аминокислот (как описано выше) может быть осуществлен с настоящими полипептидами. Этот подход использует эволюционирующую пару тРНК/тРНК-синтетазы и кодируется экспрессионной плазмидой при помощи амбер-супрессорного кодона (Deiters A. et al. (2004). Bio-org. Med. Chem. Eett. 14, 5743-5). Например, р-азидофенилаланин можно включать в настоящие полипептиды и затем проводить в реакцию с полимером ПЭГ, обладающего ацетиленовым радикалом, в присутствии восстановителя и ионов меди для облегчения органической реакции, известной как Хуисген[3+2]циклоприсоединение.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также предусматривает конкретные мутации белков ANGPTE3, с тем чтобы изменить гликозилирование полипептида. Такие мутации могут быть отобраны так, чтобы ввести или устранить один или более сайтов гликозилирования, включая, в качестве неограничивающих примеров, О-связанные или N-связанные сайты гликозилирования. В определенных вариантах осуществления белки ANGPTE3 по настоящему изобретению имеют сайты гликозилирования и структуры без изменений по отношению к природным белкам ANGPTE3. В определенных вариантах осуществления вариант белков ANGPTE3 включает вариант гликозилирования, в котором число и/или тип сайтов гликозилирования были изменены по отношению к природным белкам ANGPTE3. В определенных вариантах вариант полипептида содержит большее или меньшее число Nсвязанных сайтов гликозилирования по сравнению с природным полипептидом. Сайт N-связанного гликозилирования характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, в котором аминокислотный остаток, обозначенный как X, может представлять собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает потенциальный новый сайт для добавления N-связанной углеводной цепи. Кроме того, замены, которые устраняют эту последовательность, удалят существующую N-связанную углеводную цепь. В определенных вариантах осуществления обеспечивается перестановка N-связанных углеводных цепей, где один или более N-связанных сайтов гликозилирования (обычно те, которые являются природными) устраняются и создаются один или более новых N-связанных сайтов.
Типичные варианты белков ANGPTE3 включают варианты цистеина, в которых один или более остатков цистеина удалены или заменены на другую аминокислоту (например, серин) по отношению к аминокислотной последовательностью природных белков ANGPTE3. В определенных вариантах осуществления цистеиновые варианты могут быть полезны, если белки ANGPTE3 должны быть повторно свернуты в биологически активную конформацию, например после выделения нерастворимых тел вклю
- 19 035158 чения. В определенных вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют меньше остатков цистеина, чем природный полипептид. В определенных вариантах осуществления цистеиновые варианты содержат четное число остатков цистеина для минимизации взаимодействий, вытекающих из непарных цистеинов.
В некоторых вариантах осуществления функциональные варианты или модифицированные формы белков ANGPTL3 включают слитые белки белка ANGPTL3 по изобретению и один или более сливных доменов. Известные неограничивающие примеры сливных доменов включают полигистидин, Glu-Glu, глутатион-8-трансферазу (GST), тиоредоксин, белок А, белок G, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Fc), мальтоза-связывающий белок (МВР) и/или сывороточный альбумин человека (HSA). Сливной домен или его фрагмент может быть выбран так, чтобы придать желаемое свойство. Например, некоторые сливные домены являются особенно полезными для выделения слитых белков с помощью аффинной хроматографии. Для аффинной очистки используются соответствующие матрицы для аффинной хроматографии, такие как глутатион-, амилаза- и никель- или кобальт-конъюгированные смолы. Множество таких матриц доступны в форме наборов, таких как система очистки Pharmacia GST и система QLAexpress™ (Qiagen), применимая для (HIS6) партнеров по слиянию. В качестве другого примера сливной домен может быть выбран таким образом, чтобы облегчить детектирование белков ANGPTL3. Примеры таких детекционных доменов включают различные флуоресцентные белки (например, GFP), а также эпитопные теги, которые, как правило, представляют собой короткие пептидные последовательности, для которых доступны специфические антитела. Известный эпитопные теги, для которых легкодоступны специфические моноклональные антитела, включают теги FLAG, гемагглютинин вируса гриппа (HA) и c-myc. В некоторых случаях сливные доменов имеют сайт расщепления протеазой, такой как сайт для фактора Xa или тромбина, который позволяет соответствующей протеазе частично расщеплять слитые белки и тем самым высвобождать оттуда рекомбинантные белки. Освобожденные белки могут быть отделены от сливного домена путем последующего хроматографического разделения. В определенных вариантах осуществления белок ANGPTL3 слит с доменом, который стабилизирует белок ANGPTL3 in vivo (стабилизирующий домен). По стабилизацией понимается все, что увеличивает время полужизни в сыворотке крови, независимо от того, является ли это следствием уменьшения деструкции, уменьшения выведения почками или другим фармакокинетическим эффектом. Слияния с Fc-частью иммуноглобулина, как известно, придают желательные фармакокинетические свойства широкому спектру белков. Кроме того, слияния человеческого сывороточного альбумина может придавать желательные свойства. Другие типы сливных доменов, которые можно выбрать, включают мультимеризированные (например, димеризированные, тетрамеризированные) домены и функциональные домены (что придает дополнительную биологическую функцию, по желанию). Слияния могут быть сконструированы таким образом, чтобы гетерологичный пептид был слит с аминоконца полипептида по изобретению и/или карбоксиконца полипептида по изобретению.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие ангиопозтин-подобные 3 протеаза-устойчивые полипептиды.
Изобретение также предоставляет нуклеиновые кислоты, кодирующие протеаза-устойчивые полипептиды по изобретению и векторы экспрессии и клетки-хозяева для экспрессии протеаза-устойчивого полипептида. В других аспектах изобретение предоставляет полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению, и экспрессионные векторы и клетки-хозяева, включающие такой полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид оптимизирован для экспрессии в клетках-хозяевах. В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет способ улучшения состояния или профилактики артрита или повреждение сустава у пациента-человека, включающий: введение в сустав пациента экспрессионного вектора, кодирующего полипептид по изобретению, после чего экспрессии полипептида приводит к улучшению состояния или предотвращает артрит или повреждение сустава у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет артрит или повреждение сустава. В некоторых вариантах осуществления пациент не имеет, но находится в группе риска получения артрита или повреждения сустава. В некоторых вариантах осуществления артрит представляет собой остеоартрит, травматический артрит или аутоиммунный артрит.
Для экспрессии полипептидов по изобретению используют рутинные способы из области рекомбинантной генетики. Основные руководства, раскрывающие общие способы, использованные в этом изобретении, включают Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; серийные издания Ausubel et al. eds. (2007, с доработанным в 2010) Current Protocols in Molecular Biology, среди других известных в данной области техники.
Для экспрессии могут использоваться любые подходящие клетки-хозяева, известные в данной области техники, например клетки-хозяева млекопитающих, бактериальные клетки-хозяева, дрожжевых клетки-хозяева, клетки-хозяева насекомых и др. Как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии являются широко доступными. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная система представляет собой систему экспрессии клеток млекопитающих, такую как система экспрессии СНО-клеток. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может быть кодоноптимизированной для облегчения экспрессии в желаемой клетке-хозяине.
Невирусные векторы и системы включают плазмиды и эписомные векторы, обычно включающие
- 20 035158 экспрессионную кассету для экспрессии белка или РНК, и искусственные хромосомы человека (см., например, Harrington et al., Nat. Genet. 15:345, 1997). Например, невирусные векторы, полезные для экспрессии полипептидов по изобретению в клетках млекопитающих (например, человека), включают pThioHis А, В & С, pcDNA3. I/His, pEBVHis А, В & С (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), векторы MPSV и многочисленные другие векторы, известные в рассматриваемой области техники для экспрессия других белков. Полезные вирусные векторы включают, в качестве неограничивающих примеров, векторы на основе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса, векторы на основе SV40, вируса папилломы, вируса НВР Эпштейна-Барра, вектор на основе вируса оспы кур, векторы на основе вируса коровьей оспы и вируса леса Семлики (SFV).
Выбор вектора экспрессии зависит от предполагаемой клетки-хозяина, в которой вектор будет экспрессироваться. Как правило, экспрессирующие векторы содержат промотор и другие регуляторные последовательности (например, энхансеры), которые функционально связаны с полинуклеотидами, кодирующими полипептид по изобретению. В некоторых вариантах осуществления используется индуцируемый промотор, чтобы предотвратить экспрессию встроенных последовательностей, кроме как при индуцирующих условиях. Индуцибельные промоторы включают, например, арабинозный. lacZ, металлотионеиновый промотор, глюкокортикоидные промоторы или промотор теплового шока. Кроме того, другие регуляторные элементы также могут быть включены для улучшения экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, например энхансеры, сайты связывания с рибосомой, последовательности терминации транскрипции и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению, может также включать последовательность, кодирующую последовательность сигнала секреции, так что полипептид секретируется из клетки-хозяина. Такая последовательность может быть предусмотрена в векторе или как часть нуклеиновой кислоты ANGPTL3, присутствующей в векторе.
Способы введения векторов экспрессии, содержащих представляющую интерес полинуклеотидную последовательность, варьируют в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию при помощи хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработка фосфатом кальция или электропорация может быть использована для других клеточных хозяев (см., обычно, Sambrook et al., выше). Другие способы включают, например, электропорацию, обработку фосфатом кальция, липосомо-опосредованную трансформацию, инъекции и микроинъекции, баллистические способы, виросомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион:нуклеиновая кислота, незащищенную ДНК, искусственные вирионы, слияние со структурным белком VP22 вируса герпеса, агент-усиливающее поглощение ДНК и трансдукция ex vivo. Для долгосрочного, высокопродуктивного продуцирования рекомбинантных белков часто желательна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют полипептиды по изобретению, могут быть подготовлены, используя экспрессирующие векторы по изобретению, которые содержат участок начала репликации вируса или эндогенные элементы экспрессии и селектируемый маркерный ген.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие протеаза-устойчивые полипептиды ANGPTL3 по изобретению, могут доставляться пациенту для лечения травмы или болезни, связанной суставами. Доставка таких нуклеиновых кислот может быть достигнуто с помощью любых средств, известных в данной области техники, но обычно выполняется с помощью прямой инъекции в пораженный сустав. В некоторых вариантах осуществления ДНК доставляется в виде незащищенной ДНК с помощью прямой инъекции в сустав. В некоторых вариантах осуществления используется вирусный вектор, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденовирусный или аденовирусассоциированный вектор, вектор на основе вируса герпеса, вектор на основе вируса оспы кур или вектор на основе вируса коровьей оспы.
Способы лечебного применения полипептидов и показания.
Способы, описанные в изобретении, включают способ лечения индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества полипептида по изобретению, отличающийся тем, что индивидуум имеет или существует риск повреждения суставов или артрит. Изобретение также предоставляет способ улучшения состояния или профилактики артрита или повреждения сустава у пациента-человека, включающий введение в сустав пациента композиции, содержащей эффективное количество полипептида по изобретению, таким образом, улучшения состояния или профилактики артрита или травмы сустава у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет артрит или повреждение сустава. В некоторых вариантах осуществления человек не имеет, но находится в группе риска получения артрита или повреждения сустава. В некоторых вариантах осуществления артрит представляет собой остеоартрит, травматический артрит или аутоиммунный артрит. В некоторых вариантах осуществления вводимая композиция дополнительно содержит гиалуроновую кислоту.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты, включающий контактирование мезенхимальных стволовых клеток с достаточным количеством полипептида по изобретению, для индуцирования дифференцировки стволовых клеток в хондроциты. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют in vivo, и стволовые клетки присутствуют у пациента-человека.
- 21 035158
Предполагается, что полипептиды, композиции и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения, улучшения состояния или предотвращения любого вида повреждений суставного хряща (например, повреждений суставов или травмы), в том числе, например, повреждение, возникающее в результате травмирующего события или разрыва сухожилия или связки. В некоторых вариантах осуществления белки по изобретению вводят для предотвращения или уменьшения артрита или повреждения сустава, например в случае, когда существует генетическая или семейная анамнеза артрита или повреждения сустава или травмы сустава или до или во время операции на суставе. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, композиции и способы применяются для лечения повреждения суставов. В конкретных вариантах осуществления повреждение сустава представляет собой травматические поражение сустава. В других вариантах повреждение сустава представляет собой повреждение, возникающее от возраста или обездвиженности. Еще в других вариантах осуществления поражение сустава представляет собой повреждение, возникшее вследствие аутоиммунного расстройства. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, композиции и способы по изобретению могут применяться для лечения, улучшения состояния или профилактики остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, композиции и способы применяют для уменьшения или предотвращения артрита у индивидуума с риском наличия или приобретения артрита. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, композиции и способы применяют для уменьшения или предотвращения повреждения суставов у индивидуума с риском наличия или приобретения повреждения суставов.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды, композиции и способы по настоящему изобретению обеспечивают способ стимуляции пролиферации хондроцитов и производства хряща в хрящевых тканях, которые были повреждены, например, вследствие травматического повреждения или хондропатии. В конкретных вариантах осуществления полипептиды, композиции и способы по настоящему изобретению полезны для лечения повреждений хряща в суставах, например на шарнирно-сочлененной поверхности, например в позвоночнике, плече, локте, запястье, суставах пальцев рук, тазобедренных, коленных, голеностопных суставах и суставах ног. Примеры заболеваний или расстройств, которые могут получить преимущество от лечения, включают остеоартрит, ревматоидный артрит, другие аутоиммунные заболевания или остеохондритные дессиканы. Кроме того, повреждение хряща или разрушение происходит в результате определенных генетических или метаболических расстройств, нарушение развития хрящевой ткани часто наблюдается в формах карликовости у человека, и/или повреждение или разрушение хрящей часто является результатом реконструктивной хирургии; таким образом, полипептиды, композиции и способы были бы полезны в терапии этих пациентов, будь то сами по себе или в сочетании с другими подходами.
Далее предполагается, что полипептиды, композиции и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения, улучшения или профилактики различных расстройств хряща и/или связанные с ними симптомы или последствия таких состояний. Типичные состояния или расстройства для лечения, улучшения и/или профилактики с помощью полипептидов, композиций и способов по изобретению, включая, в качестве неограничивающих примеров, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, артроз, остеохондроз, спондилоартропатии, синдром Элерса Данло, системный склероз (склеродермию) или заболевание сухожилий. Другие состояния или расстройства, которые могут получить преимущества от лечения полипептидами для улучшения связанных эффектов, включают идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунную гемолитическую анемию (иммунную панцитопению, пароксизмальную ночную гемоглобинурию), аутоиммунную тромбоцитопению (идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммуно-опосредованную тромбоцитопению), тиреоидит (базедова болезнь, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, иммуноопосредованное заболевание почек (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит), демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия или синдром Гийена-Барре и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, гепатобилиарные заболевания, такие как инфекционный гепатит (гепатит А, В, С, D, Е и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, гранулематозный гепатит и склерозирующий холангит, воспалительное заболевание кишечника (язвенный колит: болезнь Крона), глютенчувствительная энтеропатия и болезнь Уиппла, аутоиммунные или иммуно-опосредованные заболевания кожи, включая буллезные кожные заболевания, мультиформную эритему и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевая аллергия и крапивница, иммунологические заболевания легких, такие как эозинофильные пневмонии, идиопатический фиброз легких и пневмонит гиперчувствительности, сопутствующие трансплантации заболевания, включая отторжение трансплантата и реакция трансплантат против хозяина.
Пациент, как используется в настоящем документе, относится к любому индивидууму, которому вводят терапевтический полипептид по изобретению. Предполагается, что полипептиды, композиции и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения млекопитающего. Как используется в настоящем документе, индивидуум относится к любому млекопитающему, включая лю
- 22 035158 дей, домашних и сельскохозяйственных животных, и зоопарк, спортивных или домашних животных, например крупный рогатый скот (например, коровы), лошади, собаки, овцы, свиньи, кролики, козы, кошки и др. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуумом является человек. В определенных вариантах осуществления индивидуумом является лошадь. В других вариантах осуществления индивидуум представляет собой собаку.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды по изобретению могут быть гетерологичными по отношению к проходящему лечение млекопитающему. Например, белок ANGPTL3 человека или его фрагмент, белок или пептид, производный от белка ANGPTL3 человека (например, модифицированный белок ANGPTL3 человека, консервативный вариант белка ANGPTL3 человека, пептидомиметики, производные от белка ANGPTL3 человека) используются в лечении животного, такого как лошадь, крупный рогатый скот или собака. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный белок ANGPTL3 может использоваться для наращивания популяций хондроцитов в культуре для трансплантации. В некоторых вариантах осуществления к наращенным культурам дополнительно подмешивают полипептиды и композиции, гомологиченые по отношению к проходящему лечение млекопитающему, и помещают в суставное пространство или непосредственно в дефект хряща. Альтернативно, полипептиды по изобретению, полученные от того же вида, т.е. белок ANGPTL3 человека или его фрагменты, белок или пептид, производный от белка ANGPTL3 человека (например, модифицированный белок ANGPTL3 человека, консервативный вариант белка ANGPTL3 человека, пептидомиметик, производный от белка ANGPTL3 человека) применяют при лечении пациента-человека. С помощью белка, полученного из тех же видов млекопитающих, которые проходят лечение, можно избежать случайных иммунных реакций.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды и композиции по настоящему изобретению применяют способом прямой инъекции в синовиальную жидкость сустава, системного введения (перорально или внутривенно) либо непосредственно в дефект хряща, либо самостоятельно, либо в комплексе с подходящим носителем для длительного высвобождения белка. В некоторых вариантах осуществления полипептиды или композиции вводят в биосовместимой матрице или каркасе. Полипептиды, композиции и способы по настоящему изобретению могут также использоваться в сочетании с хирургической процедурой на пораженном суставе. Введение полипептида по изобретению может происходить до, во время или в сочетании с, и/или после хирургической процедуры. Например, полипептиды, композиции и способы по изобретению могут быть использованы для наращивания популяции хондроцитов в культуре для аутологичной или аллогенной хондроцитной имплантации (ACI). Хондроциты можно необязательно имплантировать с параллельным лечением, состоящим из введения полипептидов и композиций по настоящему изобретению. В этих процедурах, например, хрящевые клетки могут быть собраны артроскопически с неповрежденной минорной несущей нагрузку области поврежденного сустава, и могут культивироваться in vitro, при необходимости в присутствии полипептидов и композиций по настоящему изобретению и/или других факторов роста, чтобы увеличить количество клеток перед трансплантацией. К выращенным культурам затем при необходимости подмешивают полипептиды и композиции по настоящему изобретению и/или помещают в пространство сустава или непосредственно в дефект. В определенных вариантах осуществления выращенные культуры (необязательно с полипептидами по настоящему изобретению) помещаются в пространство сустава, суспендированные в матриксе или мембране. В других вариантах осуществления полипептиды и композиции по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации с одним или более периостальных или перихондральных графтов, которые содержат образующие хрящ клетки и/или помогают удерживать трансплантированные хондроциты или клетки-предшественники хондроцитов на месте. В некоторых вариантах осуществления полипептиды и композиции по изобретению используются для восстановления повреждений хряща в сочетании с другими процедурами, включая, в качестве неограничивающих примеров, лаваж сустава, стимуляцию костного мозга, абразивную артропластику, субхондральное бурение или микротравматизацию проксимальной субхондральной кости. При необходимости, после введения полипептидов и композиций по настоящему изобретению и роста хрящей может быть полезным дополнительные хирургическое лечение, чтобы соответствующим образом оконтурить новообразованную хрящевую поверхность(ти).
Фармацевтические композиции.
Терапевтические композиции, содержащие предоставляемые полипептиды, находятся в рамках настоящего изобретения, и специально предусмотрены в свете выявления нескольких полипептидных последовательностей, проявляющих повышенную стабильность и протеаза-устойчивость. Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество полипептида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции дополнительно включают фармацевтически или физиологически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит гиалуроновую кислоту или ее производное.
В дополнение, изобретение предоставляет способ улучшения или профилактики артрита или травмы сустава пациента-человека, включающий введение в сустав пациента композиции, содержащей эффективное количество полипептида по изобретению, тем самым улучшая состояние или препятствуя артриту или травме сустава у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет артрит
- 23 035158 или повреждение сустава. В некоторых вариантах осуществления индивидуум не имеет, но находится в группе риска артрита или травмы сустава. В некоторых вариантах осуществления артрита представляет собой остеоартрит, травматический артрит или аутоиммунный артрит. В некоторых вариантах осуществления вводимая композиция дополнительно содержит гиалуроновую кислоту.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты, включающий контактирование мезенхимальных стволовых клеток с достаточным количеством полипептида по изобретению для индуцирования дифференцировки стволовых клеток в хондроциты. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют in vivo, стволовые клетки передаются пациенту-человеку, и контактирование включает введение в сустав пациента композиции, содержащей эффективное количество полипептида по изобретению, индуцируя тем самым дифференцировку стволовых клеток в хондроциты и образование хряща.
Терапевтические композиции, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, могут быть доставлены пациенту для лечения связанной с суставом травмы или болезни, и также находятся в пределах объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат зезащищенную ДНК, кодирующую полипептид по изобретению. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор используется для осуществления доставки, и фармацевтическая композиция содержит вектор, кодирующий полипептид по изобретению, включая, в качестве неограничивающих примеров, вектор на основе аденовируса или аденовирус-ассоциированный вектор, вектор на основе вируса герпеса, вектор на основе вирус оспы кур или вектор на основе вируса коровьей оспы. Фармацевтические композиции включают терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем.
В другом аспекте настоящего изобретения предоставленные полипептиды предусматриваются для применения в качестве лекарственного средства для лечения поражения суставов. В некоторых вариантах осуществления предоставляются полипептиды по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для облегчения артрита или повреждения суставов. В некоторых вариантах осуществления артрита является остеоартритом, травматическим артритом или аутоиммунным артритом. В некоторых вариантах осуществления повреждение суставов представляет собой травматическое поражение суставов, аутоиммунное повреждение, возрастное повреждение, или повреждение, связанное с обездвижением. В других вариантах осуществления предоставляется нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению для использования в лекарственном средстве.
Составы, пригодные для введения, содержат наполнители, включая, в качестве неограничивающих примеров, водные и неводные растворы, изотонические стерильные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают составы изотоническими, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции включают терапевтически эффективное количество пептида в смеси с фармацевтически приемлемое рецептурное средство, выбранное для пригодности со способом введения, форматом доставки и нужной дозировкой. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), и последующих изданий того же. Основное средство доставки или носитель в фармацевтической композиции может быть водной или неводной природы. Например, подходящее средство доставки или носитель может представлять собой воду для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, при необходимости дополненная другими материалами, распространенными в композициях для парентерального введения. Например, буферы могут использоваться, например, для поддержания композиции при физиологическом рН или при слегка пониженном рН, обычно в пределах диапазона от примерно рН 5 до примерно рН 8, и могут дополнительно включать сорбит, сывороточный альбумин, детергент или другой дополнительный компонент. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие полипептиды или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по изобретению, могут быть подготовлены для хранения в лиофилизированном виде с использованием соответствующих наполнителей (например, сахарозы).
Еще в других вариантах осуществления состав со средством, таким как инъекционные микросферы, биоэродируемые частицы, полимерные соединения, бусы или липосомы или другая биосовместимая матрица, которая обеспечивает контролируемое или замедленное высвобождение полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, может затем быть доставлен посредством депо инъекции. Например, полипептиды или нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению, могут быть инкапсулированы в липосомы, или сформулированы в виде микрочастиц или микрокапсул, или могут быть включены в другие носители, такие как биодеградируемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины (см., например, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., Международная РСТ публикация № WO 03/47518 и WO 03/46185), микросферы поли(молочной-когликолевой)кислоты (PLGA) и PLCA (см., например, патент США № 6447796 и публикацию патентной заявки США № US 2002130430), биодеградируемые нанокапсулы и биоклеющиеся микросферы, или с
- 24 035158 помощью белковых векторов (O'Hare and Normand, Международная РСТ публикация № WO 00/53722) или путем использования конъюгатов. Еще другие подходящие механизмы включают имплантируемые устройства доставки.
Доза соединения по настоящему изобретению для лечения вышеуказанных заболеваний или расстройств варьирует в зависимости от способа введения, возраста и/или массы тела индивидуума, состояния проходящего лечение индивидуума, и, в конечном счете, будет определяться лечащим врачом или ветеринаром. Доза, вводимая индивидууму, в контексте настоящего изобретения должна быть достаточной, чтобы вызвать благотворный ответ у индивидуума с течением времени. Такая доза является терапевтически эффективным количеством. В этой связи соответствующая доза может определяться эффективностью конкретного белка или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по используемому изобретению, и состоянием индивидуума, а также массой тела или площадью поверхности зоны обработки. Размер дозы также определяется наличием, характером и степенью каких-либо негативных побочных эффектов, которые сопровождают введение конкретного белка или вектора конкретному индивидууму. Введение может выполняться путем однократной или разделенной дозами, или в виде непрерывной инфузии с помощью имплантированного устройства или катетера. Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, в применяемом составе. Врач-клиницист может титровать дозировку и/или модифицировать введение для достижения желаемых терапевтических эффектов. Типичная дозировка составляет от примерно 0,01 мкг/кг до примерно 100 мг/кг в зависимости от факторов. В определенных вариантах осуществления дозировка составляет от примерно 0,1 мкг/кг до примерно 10 мг/кг; или примерно 0,1 мкг/кг; примерно 0,5 мкг/кг; примерно 1 мкг/кг; примерно 2 мкг/кг; примерно 5 мкг/кг; примерно 10 мкг/кг; примерно 15 мкг/кг; примерно 20 мкг/кг; примерно 25 мкг/кг; примерно 30 мкг/кг; примерно 35 мкг/кг; примерно 40 мкг/кг; примерно 45 мкг/кг; примерно 50 мкг/кг; примерно 55 мкг/кг; примерно 60 мкг/кг; примерно 65 мкг/кг; примерно 75 мкг/кг; примерно 85 мкг/кг; примерно 100 мкг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет примерно 50 мкг/кг; 100 мкг/кг; примерно 150 мкг/кг; примерно 200 мкг/кг; примерно 250 мкг/кг; примерно 300 мкг/кг; примерно 350 мкг/кг; примерно 400 мкг/кг; примерно 450 мкг/кг; примерно 500 мкг/кг; примерно 550 мкг/кг; примерно 600 мкг/кг; примерно 650 мкг/кг; примерно 700 мкг/кг; примерно 750 мкг/кг; примерно 800 мкг/кг; примерно 850 мкг/кг; примерно 900 мкг/кг; примерно 950 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг; примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг; примерно 10 мг/кг.
Способы введения.
Любой способ доставки белков или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, в пораженный сустав может применяться. В практике данного изобретения композиции можно вводить парентерально, например инъецировать, например интраартикулярно (т.е. в сустав), внутривенно, внутримышечно, подкожно; впрыскивать, или имплантировать, например, в мембрану, матрицы, устройство и др. При инъецировании, вливании или имплантировании, доставка может направляться в соответствующую ткань или сустав, и доставка может представлять собой прямую доставку болюса или непрерывную подачу. В некоторых вариантах осуществления доставки может происходить в соответствующую ткань, расположенную в непосредственной близости от пораженного сустава. В некоторых вариантах осуществления доставки может проходить посредством диффузии, или посредством болюса с временным высвобождением. В некоторых вариантах осуществления система контролируемого высвобождения (например, насос) могут быть размещены в непосредственной близости от терапевтической мишени, например, объединенной в котором полипептид вводят. В других вариантах осуществления композиции могут быть выбраны для приема внутрь, например ингаляционная или пероральная доставка.
Терапевтические полипептиды или нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению по настоящему изобретению, также можно эффективно использовать в комбинации с одним или более дополнительных активных средств (например, гиалуроновой кислотой или ее производным или солью, фактором роста (например, FGF18, ВМР7), хондрогенным средством (например, перорально кальцитонин лосося, SD-6010 (ингибитор iNOS), витамином D3 (холекальциферол), гидролизатом коллагена, ресулатидацетатом, неомыляемыми веществами авокадо, сои (ASU), соединение, описанное в WO 2012/129562, картогенин), стероидом, нестероидным противовоспалительным средством (НПВП) и др.) в зависимости от желаемой терапии или эффекта для улучшения или усиления терапевтического эффекта любого. Этот процесс может включать в себя введение обоих средств пациенту одновременно, либо в виде единой композиции или фармакологического состава, который включает в себя оба средства, или путем введения двух различных композиций или составов, где одна композиция включает полипептид или полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению, а другая включает в себя второе средство(а). Введение терапевтической композиции, содержащей полипептид или полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению, может предшествовать или следовать за введением второго средства с интервалами в диапазоне от минут до недель.
Составы соединений могут храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, сухого вещества или в виде обезвоженного или лиофилизированного порошка. Составы могут
- 25 035158 быть представлены в герметичных контейнерах с единичной дозой или несколькими дозами, таких как ампулы и флаконы. В некоторых вариантах осуществления составы могут быть представлены в одноили многокамерных предварительно наполненных шприцах (например, жидкостные шприцы, лизошприцы). Растворы и суспензии могут быть подготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного вида.
Также предоставляются наборы, включающие полипептиды или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по изобретению, по изобретению. В одном варианте осуществления предоставляются наборы для изготовления вводимой единицы однократной дозы. Набор содержит первый контейнер, содержащий высушенный полипептид или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по изобретению, и второй контейнер, содержащий формулу водного восстановления. В определенных вариантах осуществления один контейнер содержит однокамерный предварительно заполненный шприц. В других вариантах осуществления контейнеры объединены в качестве многокамерного предварительно заполненного шприца.
Иллюстративные примеры.
Следующие примеры предлагаются для иллюстрации, но не для ограничения изобретения.
Пример 1. Конструкции протеаза-устойчивых пептидов AngptB.
Различные N-концевые укороченные мутанты были сконструированы, чтобы устранить Освязанные сайты гликозилирования и содействовать биофизическим характеристикам белка. Для идентификации протеаза-устойчивых пептидов аминокислотные замены были введены в различные положения фрагментов пептида Angpt13 человека, соответствующие С-концевой области пептида. На фиг. 1 показаны положения мутаций в Angpt13 человека. Конструкции первоначально были подготовлены Hisтегами. Мутантные белки представляли собой: 225-460 K423Q (225KQ), 225-460 S424T (225ST), 226-460 K423Q (226KQ), 226-460 K423S (226KS), 228-460 K423Q (228KQ), 228-460 S424T (228ST), 233-460 K423Q (233KQ), 233-460 K423S (233KS), 241-460 K423Q (241KQ), 241-460 K423S (241KS), 241-460 Kdel (241Kdel), 242-460 K423Q (242KQ), 242-460 K423S (242KS) и 242-460 Kdel (242Kdel).
His-меченые белки экспрессировали в клетках HEK Freestyle™ и очищали при помощи Ni-NTA колоночной хроматографии. С-концевые конструкции без тега также клонировали, очищали описанным ранее способом (Gonzalez R. et al. PNAS 2010). Кратко, целевой белок с сигнальной последовательностью (1-16) был клонирован в вектор экспрессии млекопитающих с промотором цитомегаловируса. Через 96 ч после ДНК/ПЭИ трансфекции в HEK Freestyle 293 (Invitrogen) среду, содержащую секретируемый целевой белок, собирали и очищали при помощи колонки Hi-Trap SP (GE Healthcare). Белок элюировался в интервале от 50 мМ MES (рН 6,0), 125 мМ NaCl до 50 мМ MES (рН 6,0), 150 мМ NaCl. Анализ способом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия подтвердил, что очищенный белок обладал по меньшей мере 95% чистотой.
Протеаза-устойчивость оценивалась следующим образом. Ограниченный трипсинолиз проводили путем инкубации 10 нг каждого подготовленного белка с трипсином при массовом соотношении 8000:1 (белок:трипсин) в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакцию трипсинолиза затем гасили добавлением уксусной кислоты, чтобы довести реакцию до рН 3,0, и загашенные образцы анализировали при помощи LC/MS. 5 мин пик ОФ-ВЭЖХ, соответствующий массе С-концевым 43 аминокислотам (S424E460), было явным для соответствующих конструкций белка дикого типа. Сайт отрезания находился на том же участке, т.е. между K423 и S424, как отмечалось при продукции полноразмерного белка ANGPLT3 дикого типа. Этот пик отсутствовал, когда Lys в сайте отрезания был заменен на Gln. Каждая из пептидных конструкций 225KQ, 228KQ, 233KQ, 233KS, 241KQ, и 242KQ; и пептид дикого типа 225 подготавливали и анализировали. Пик, соответствующий массе С-концевым 43 аминокислотам, отсутствовал, когда Lys в сайте отрезания был заменен на Gln или Ser в каждой из конструкций, или когда Lys в положении 423 был удален.
Пример 2. Реакции связывания интегрина.
Интегрин aVB3. Подготовленные пептиды 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ и 242KQ проверяли in vitro на связывание с интегрином aV63. Кратко, планшеты Maxisorp покрывали интегрином aV63 (2 мкг/мл) и добавляли полипептидную конструкцию (указано) в различных концентрациях. Связанный пептид детектировали путем добавления моноклонального антитела против ANGPTL3, а затем с конъюгированным с пероксидазой корня хрена козьим антимышиным IgG-антителом. Все проверенные пептиды сохранили или улучшили способность к связыванию интегрина. ЕС50 для каждого определяли из данных связывания, и результаты показаны в табл. 2.
- 26 035158
Таблица 2. In vitro связывание ANGPTL3 и генно-инженерных полипептидных конструкций с интегринами
Интегрин α5β! ЕС50 Интегрин aVp3 ЕС5о
WT 3, 054 3,245
242KQ 1,566 3, 076
241KQ 2, 693 4,032
233KQ 13, 83 6, 636
228KQ 4,26 4,051
22 5KQ 19, 89 11,18
Интегрин α5β1. Подготовленные пептиды 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ и 242KQ кг проверяли in vitro на связывание с интегрином α5β1. Планшеты покрывали 2 мкг/мл, как описано выше, но интегрином α5β1, и добавляли различные концентрации полипептидной конструкции (указано), и детектирование проводили, как описано выше. Все испытанные пептиды сохранили или улучшили способность к связыванию интегрина. ЕС50 для каждого определяли из данных связывания, и результаты показаны в табл. 2.
Пример 3. Функциональный анализ конструкций.
Культура клеток и дифференцировка. Первичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (hMSC) были отсортированы в FACS и проверены, чтобы быть >98% положительными по CD29, CD44, CD105 и CD166 и <0,1% положительными по CD45; и для экспериментов были использованы клетки из пассажей 2-8. Хрящевые резидентные MSC человека (hCR-MSC) получали из человеческих первичных суставных хондроцитов, которые разделяли на отдельные клетки, поклоново выращивали в MSCGM и проверяли в качестве MSC через хондрогенную, остеогенную и адипогенную дифференциации. Клетки отсортировывали в FACS и проверяли, чтобы >98% были положительными по CD166 и CD105. hCR-MSC культивировали до 20 пассажей без изменения в клеточном профиле, определяли скорость роста или дифференциации.
Хондрогенез. Пептидные конструкции по изобретению оценивали в физических и функциональных тестах для оценки активности хондрогенеза.
Генно-инженерные конструкции, предоставленные в этом документе, являются производными от ANGPTL3, который принадлежит семейству из семи выявленных белков ANGPTL, которые имеют структурное сходство с ангиопоэтинами, но лишены способности связываться с рецептором Tie2 и, следовательно, имеют различные функции. Белки ANGPTL содержат N-терминальный биспиральный домена (CCD) и С-концевой фибриноген-подобный домен (FLD), и, как полагают, сильно регулируются при помощи их микроокружения и взаимодействиями с внеклеточным матриксом (ЕСМ), таким как фибронектин и интегрины. Conklin et al., Genomics 62(3): 477-482 (1999); Goh Y.Y. et al., Am. J. Pathol. 177(6): 2791-2803 (2010); Goh Y.Y. et al., J. Biol. Chem. 285(43): 32999-33009(2010). Последовательности для членов семейства ANGPTL, наиболее близкородственные ANGPTL3, ANGPTL1 (полноразмерный и Сконцевой домен) и ANGPTL4 (полноразмерный и С-концевой домен), приведены в табл. 3; и табл. 5В иллюстрирует выравнивание по всем С-концевым доменам членов этого семейства. Идентичности последовательностей среди внеклеточных доменов и С-концевых доменов ANGPTL1, ANGPTL4, а также других ангиопоэтиновых белков ANGPTL7, ANGPT1 и ANGPT2 представлены в табл. 5А. С-концевой домен (СТ) ANGPTL3 имеет 37% идентичности последовательности с СТ ANGPTL1 и 40% идентичности последовательности с СТ ANGPTL4.
Хондрогенез на основе клеток 2D индуцировали in vitro и оценивали, как описано ранее в Johnson K. et al., (2012) Science 336, 717. Кратко, первичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (hMSC) высевали на питательные среды, затем заменяли на среды для хондрогенной стимуляции с конструкциями и без них.
Для первоначального изображения формировании конкреций лунки фиксировали и окрашивали родамином В, где конкреции легко выявлялись визуально, а снимки получали с помощью световой микроскопии. Для обеспечения высокопропускной детекции на основе изображений и количественного определения хондрогенные конкреции окрашивали Nile красным, который связывается неспецифично с коллагенами. Окрашенные Nile красным конкреции количественно оценивали на Acumen eX3 (устройство обработки изображений с высоким содержанием) путем возбуждения 488-лазером для быстрого обнаружения конкреций.
- 27 035158
Таблица 3. Последовательности ANGPTL-семейства
SEQ ID Конструкция Последовательность
71 hANGPTLl 1-491 MKTFTWTLGVLFFLLVDTGHCRGGQFKIKKINQRRYPRATDGKEEAKKCA YTFLVPEQRITGPICVNTKGQDASTIKDMITRMDLENLKDVLSRQKREID VLQLWDVDGNIVNEVKLLRKESRNMNSRVTQLYMQLLHEIIRKRDNSLE LSQLENKILNVTTEMLKMATRYRELEVKYASLTDLVNNQSVMITLLEEQC LRIFSRQDTHVSPPLVQWPQHIPNSQQYTPGLLGGNEIQRDPGYPRDLM PPPDLATSPTKSPFKIPPVTFINEGPFKDCQQAKEAGHSVSGIYMIKPEN SNGPMQLWCENSLDPGGWTVIQKRTDGSVNFFRNWENYKKGFGNIDGEYW LGLENIYMLSNQDNYKLLIELEDWSDKKVYAEYSSFRLEPESEFYRLRLG TYQGNAGDSMMWHNGKQFTTLDRDKDMYAGNCAHFHKGGIVWYNACAHSNL NGVWYRGGHYRSKHQDGIFWAEYRGGSYSLRAVQMMIKPID
72 СТ hANGPTLl 271-491 FINEGPFKDCQQAKEAGHSVSGIYMIKPENSNGPMQLWCENSLDPGGWTV IQKRTDGSVNFFRNWENYKKGFGNIDGEYWLGLENIYMLSNQDNYKLLIE LEDWSDKKVYAEYSSFRLEPESEFYRLRLGTYQGNAGDSMMWHNGKQFTT LDRDKDMYAGNCAHFHKGGWWYNACAHSNLNGVWYRGGHYRSKHQDGIFW AEYRGGSYSLRAVQMMIKPID
73 hANGPTL4 1-406 MSGAPTAGAALMLCAATAVLLSAQGGPVQSKSPRFASWDEMNVLAHGLLQ LGQGLREHAERTRSQLSALERRLSACGSACQGTEGSTDLPLAPESRVDPE VLHSLQTQLKAQNSRIQQLFHKVAQQQRHLEKQHLRIQHLQSQFGLLDHK HLDHEVAKPARRKRLPEMAQPVDPAHNVSRLHRLPRDCQELFQVGERQSG LFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQRRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGD PHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDWDGNAELLQFSVHLGGEDTAY SLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLRRDKNCAKSLSGGWW FGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQATTMLIQPM AAEAAS
74 СТ hANGPTL4 179-406 SRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQ RRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLR DWDGNAELLQFSVHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFST WDQDHDLRRDKNCAKSLSGGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGI FWKTWRGRYYPLQAT TMLIQPMAAEAAS
Таблица 4. Хондрогенез белков-членов семейства ANGPTL
Белок Активность образования конкреций Индукция коллагена II типа Входящий номер Genbank
Angptll Да Да NP_004664
Angptl2 Нет н/о NP_036230
Angptl3 Да Да NP_055310
Angptl4 Да Нет NP_647475
Angptl6 Нет Нет NP_114123
Ansptl7 Нет Нет NP_066969
Angpt2 Нет н/о NP_001138
Angptl Нет н/о NP_004664
Хондрогенез на основе клеток 2D индуцировали in vitro и оценивали, как описано ранее в Johnson K. et al., (2012) Science 336, 717. Кратко, первичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (hMSC) высевали на питательные среды, затем заменяли на среды для хондрогенной стимуляции с конструкциями и без них, и культивировали в течение 7 или 14 дней. Клетки затем фиксировали при помощи формальдегида, промывали и затем окрашивали с помощью стандартных иммуноцитохимических способов для детектирования первичных хрящевых белков проколлагена типа 2А (PIIANP) (фиг. 2A) и коллагена типа II (фиг. 2B). Для детектирования коллагена типа II, клетки переваривали с 0,2% коллагеназы II ((Worthington Biochemical, Лейквуд, штат Нью-Джерси), которую добавляли в
- 28 035158 раствор для нарушения проницаемости мембраны. Иммунофлуоресценцию для каждого детекируемого белка количественно определяли через отображение высокого содержания (Image Express Ultra (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), используя ячейку балльного сценария с несколькими длинами волн, и как описано ранее. См. фиг. 2. Экспрессию аггрекана контролировали путем подготовки клеток следующим образом: кратко, первичные hMSC (5000 клеток) засевали в Griener 384 луночный планшет. После 24 ч роста среду удаляли и заменяли 25 мкл DMEM, содержащей 1% FBS. Белковые конструкции, затем добавляли в каждую лунку в указанной дозе, и культуры выращивали при 37°C в течение 3 дней. Клетки фиксировали в 10% формалине и подвергали иммуноцитохимическим способам для детектирования экспрессии белка аггрекана. Лунки отображали при помощи ImageXpress Ultra и количественно определяли при помощи ячейку балльного сценария с несколькими длинами волн, n=6/концентрация белка. Результаты проиллюстрированы на фиг. 3B по отношению к контролю (клетки, стимулированные без конструкции, только разбавителем) для С-концевого (225-460) ANGPTL3 WT дикого типа, генноинженерной конструкции 242KQ или 242Kdel или полноразмерного ANGPTL1, члена родственного семейства ANGPTL-белков. Подобные результаты были получены в экспериментах с использованием каждой из конструкций 225WT, 225KQ, 226KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ и 242KQ.
Анализ хондрогенеза проводили с использованием тестов и способов, описанных ранее и в настоящем документе для дополнительных членов ANGPTL-родственного семейства.
Эксперименты проводили для проверки того, обладают ли близкородственные белки хондрогенной активностью и сохраняет ли активность С-терминальный конец белка. ANGPTL1 и ANGPTL4 демонстрировали активность в тестах на формирование конкреций; однако только ANGPTL1 показал индукцию коллагена типа II в анализах на хондрогенез. См. табл. 4. Результаты анализов активности формирования конкреций и индукции коллагена типа II суммированы в табл. 4. Дополнительные характеристики ANGPTL1 описаны в настоящем документе. См. другие части этого примера и фиг. 3-5.
Таблица 5. Гомология последовательностей среди членов ангиопоэтин-подобного семейства человека 5А. Идентичность последовательностей среди членов ангиопоэтин-подобного семейства человека (ECD или CTD)
Family member Family member % Sequence Identity
hANGPTL3_17-460 hANGPTL4_26-406 32, 6
hANGPTL3_17-460 hANGPTLl_24-491 25, 7
hANGPTL3_17-460 hANGPTL7_27-346 28,1
hANGPTL3_17-460 hANGPTl_23-498 24,1
hANGPTL3_17-460 hANGPT2_19-496 23,4
hANGPTL3_241-460 hANGPTL4_l79-406 40, 0
hANGPTL3_241-460 hANGPTLl_271-491 36, 8
hANGPTL3 241-460 hANGPTL7_122-343 36, 4
hANGPTL3 241-460 hANGPTl_277-497 37,3
hANGPTL3_241-460 hANGPT2_275-495 36, 4
5В. Выравнивание последовательностей С-терминальных доменов членов ангиопоэтин-подобного семейства hANGPTL 1(271-491 )/hANGPTL3(241 -460)/hANGPTL4( 179-406)
HANGPTL3241-460 hANGPTL4_179-406 hANGPTL 1271-4 71
Clustal Consensus hANGPTL3_241-460 hANGPTL4_179-406 hANGPTLl_271-471 Clustal Consensus hANGPTL3_241-460 hANGPTL4_179-406 hANGPTl.l_271.-471
Clustal Consensus hANGPTL3_241-460 hANGPTL4_179-406 hANGPTll_271-471 Clustal Consensus hANGPTL3_241-460 hANGPTL4_179-406 hANGPTLl_271-471 Clustal Consensus
G GWW G GWW G GWW
Анализ экспрессии РНК был также использован для оценки экспрессии специфических белков хряща. Вкратце, qrt-PCR hMSC выращивали в осадочной культуре (1 χ 106 клеток/осадок) в течение 3, 7,
- 29 035158
10, 21 суток в бессывороточной среде DMEM, 1X ITS плюс конструкции (как указано). Среды заменяли каждые 3 дня. Экспрессию мРНК лубрицина, аггрекана, Sox9, IGF1, IFITM1, остеокальцина и коллагена X типа количественно оценивали с использованием Roche LightCycler (данные, полученные из 3 экспериментов, выполненных в двух повторностях (n=6)). Фиг. 3A представляет данные по экспрессии в день 10 для 242KQ и 225WT. Данные по генной экспрессии были сходными для всех генов в дни 3, 7 и 21.
Полноразмерный ANGPTL3, как ранее было показано, обладает хондрогенезной активностью как в человеческих, так и в мышиных мезенхимальных стволовых клетках. Конструкции проверяли на активность в мезенхимальных стволовых клетках человека, мыши, крысы и собаки, чтобы продемонстрировать способность к перекрестной реактивности с дополнительными видами. CR-MSC мыши, крысы, собаки и человека культивировали с конструкциями, как описано выше, в течение 18 дней. Культуры фиксировали и окрашивали с использованием стандартных иммуноцитохимических методик для детектирования хондроцит-специфического белка коллагена II типа, и коллаген II типа позитивные клетки были получены с помощью отображений высокого содержания. Похожее кратное увеличение количества коллагена II типа было подтверждено количественно для каждого вида оцениваемых клеток.
Хондропротекция. Пептидные конструкции оценивали в функциональных тестах для оценки хондропротекторной активности.
Анализ ингибирования высвобождения гликозамингликана (Г АГ) ex vivo (показатель повреждения матрикса) проводили, как описано в Johnson K. et al., (2012) Science 336, 717-721. Кратко, хрящ крупного рогатого скота выделяли, штамповали в симметричные круги и помещали в органную культуру. Срезы обрабатывали в течение 48 ч 20 нг/мл TNFa и 10 нг/мл онкостатина М (OSM) (медиаторы воспаления), чтобы индуцировать деградацию хрящевой ткани в присутствии или при отсутствии белковых конструкций для определения процента ингибирования высвобождения гликозаминогликанов (ГАГ).
Результаты, показанные на фиг. 4А, иллюстрируют данные, полученные от 4 доноров, n=12 с генноинженерными конструкциями как указано, и WT 225-460.
Анализ ингибирования оксида азота (NO) in vitro (показатель хондропротекции) проводили, как описано в Johnson K. et al., (2012) Science 336, 717-721. Кратко, первичные хондроциты обрабатывали в течение 48 ч белковыми конструкциями, как указано. Реакцию Грейсса проводили, чтобы определить влияние конструкций на ингибирование высвобождения NO. Результаты, показанные на фиг. 4В, иллюстрируют результаты для инженерных конструкций, как указывается, и WT C-терминального фрагмента 225-460. Результаты, показанные на фиг. 4С, иллюстрируют результаты с С-терминальным ANGPTL1 дикого типа, генно-инженерным ANGPTL3 242KQ или контролем.
Ингибирование формирования фиброзных хрящей. Первичные суставные хондроциты человека культивировали, как описано выше, с добавлением аскорбиновой кислоты и наличием или отсутствием конструкций (указано) в течение 14 дней для индуцирования гипертрофии и экспрессию коллагена тип X оценивали по иммунофлуоресценции. Результаты, показанные на фиг. 5А, иллюстрируют данные с конструкциями 225WT или 242KQ, как указано. Результаты, показанные на фиг. 5В, иллюстрируют данные с С-терминальным ANGPTL1 дикого типа, генно-инженерными ANGPTL3 242KQ или 242Kdel или фрагментом 225-460 С-терминальным ANGPTL3 дикого типа, как указано. Наличие дикого типа или активных конструкций оказывает ингибирующее действие на формирование фиброзной хрящевой ткани при гипертрофических состояниях, как детектируется по экспрессии коллагена типа X.
Ангиогенез. WT С-концевой домен белка ANGPTL3, как сообщалось, обладает ангиогенными активностями и свойствами in vitro и in vivo в модели роговицы на крысе. См. Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277(19): 17281-17290 (2002). Для устранения возможного риска индуцирования новых кровеносных сосудов после in vivo введения с-концевого ANGPTL3, ангиогенные анализы in vitro были проведены. Кратко, первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) находились без сыворотки в течение ночи со средой базальных эндотелиальных клеток. Клетки затем метили зеленым клеточным трекером и добавляли к предварительно покрытым матригелем планшетам с внедренной белковой конструкцией (указывается). После культивирования в течение 18 ч в присутствии полноразмерного ANGPTL3 (50 нг/мл) или 242KQ (50 нг/мл) или bFGF в (50 нг/мл), который использовали в качестве положительного контроля, число точек ветвления и общую длину образованной пробки количественно определяли с помощью отображения высокого содержания как меру ангиогенной активности. В отличие от эффекта, наблюдаемого в присутствии полноразмерного ANGPTL3 или положительного контроля, было обнаружено незначительное увеличение любого из этих параметров в случае, когда клетки инкубировали с 242KQ. См. фиг. 2С.
CR-MSC существуют в пределах гиалинового суставного хряща и увеличиваются в числе в ответ на травму. После повреждения хрящевой ткани эти клетки обладают способностью участвовать в процессах репарации, но не в достаточной мере приводят к надлежащему восстановлению хряща сами по себе. Пациенты поэтому остаются с суставным хрящ, у которого отсутствует достаточная способность поддерживать безболезненную подвижность суставов и часто требуется хирургическое вмешательство и/или замена сустава для поддержания их качества жизни. Мы обнаружили, что ANGPTL3 и, в частности, сконструированные протеаза-устойчивые ANGPTL3-пептиды обладают способностью направлять дифференцировку человеческих CR-MSC в хондроциты, специфически секретирующие гиалиновые белки
- 30 035158 суставного хряща коллаген II типа и Sox9 при ингибировании формирования фиброзного хряща, отмеченного путем экспрессии коллагена типа X.
Об экспрессии ANGPTL3 не сообщалось, насколько нам известно, и она не наблюдалась в наших исследованиях с использованием вестерн-блоттинга в человеческих хондроцитах, MSC человека или синовиальных фибробластах человека. В суставах грызунов, экспрессия практически не была обнаружена посредством иммуногистохимии (IHC). Однако в остеоартритной синовиальной жидкости человека (n=2) низкий уровень ANGPTL3 (1,3-6,0 нг/мл) был выявлен с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), указывая на то, что в подвергаемом риску суставе системно циркулирующий белок может входить в синовиальную полость.
Пример 4. Анализ конструкций in vivo Хирургическая модель тяжелой травмы на мышах.
Хирургическое рассечение передней крестообразной связки (ACL), медиального мениска большеберцовой связки (MMTL) и медиальной коллатеральной связки (MCL) правого колена у мышей линии C57BL/6 (n=12 /группе) проводили, чтобы вызвать нестабильность в коленном суставе и тем самым привести к ОА-фенотипу, использованному от ранее описанной модели Glasson S.S. et al., Osteoarthritis Cartilage 15, 1061 (2007). Для оценки потенциального терапевтического преимущества ANGPTL3-лечения, 15 недель после операции мышам вводили интрасуставно, как указано на фиг. 6А, раз в неделю в недели 1719: доза mANGPTL3 = 200 нг/колено. Количественные оценки тибиального плато были сделаны на шкале 0-4, где 0 является нормой, а 5 - тяжелым остеоартритом (разрушение хряща на всю его толщину). Два среза от каждой мыши были вслепую классифицировались 2 независимыми наблюдателями (фиг. 6В).
Облегчение индуцированной остеоартрозом боли у животных определяли при помощи инкапаситантного тестирования или определения процента времени, в течение которого мышь стояла на прооперированной ноге vs неоперированной ноге, с помощью прибора инкапаситантного мониторинга. Фиг. 7 иллюстрирует результаты отсчетов, представляющих болевой отклик на 35- и 56-й дни после операции, выраженные как % веса, приходящийся на прооперированную конечность vs неоперированной конечности. Обработка иллюстрирует результаты, полученные на животных, дозированных, как описано выше, полноразмерным мышиным ANGPTL3 (WT17-460) или С-концевым ANGPTL3 человека (WT225-460).
Модель хронического ОА на мышах (индуцированного коллагеназой VII). Другая широко применяемая животная модель остеоартрита, модель коллагеназа VII-индуцированного хронического поражения суставов, была использована для оценки in vivo эффективности конструкций. Модель и оценивание проводили, как описано ранее. См. van der Kraan P.M. et al., Am. J. Pathol. 135, 1001 (1989); и Johnson K. et al., Science 336, 717 (2012). Кратко, 3-дневный период воспаления следует за индуцированной коллагеназой дестабилизацией сустава, приводящей в результате к легкому или умеренному разрушению хрящевой ткани. Внутрисуставное введение конструкций проводили после индукции в колено один раз в неделю в течение трех недель, начиная с 3 недель после добавления коллагеназы VII. Сорок (42) дней после лечения суставы собирали и делали срезы. Гистологическая балльная оценка степени тяжести состояния сустава бедренной и большеберцовой кости давала возможность количественно оценивать репарацию тканей. Степени тяжести состояния сустава определяли путем гистологической балльной оценки, как описано выше. Фиг. 8 иллюстрирует восстановление с использованием конструкций 225WT, 225KQ, 228KQ, 233KQ и 241KQ. Для подтверждения наличия белка в суставе (долгосрочные внутрисуставные удержание), ткань фиксировали и окрашивали на присутствие конструкции белка WT с помощью иммуногистохимии. Анализ подтвердил присутствие белка, что указывало на внутрисуставное удержание ANGPTL3 (без каких-либо последствий на липид/триглицериды, оцениваемых с использованием стандартной метаболической панели, данные не приведены).
Гистологический анализ и оценивание сафранин О окрашенных срезов медиального плато большеберцовой кости (для выявления протеогликанов в участке повреждения, как описано выше) показали регенерацию в хрящевой ткани (данные не показаны). Качественный анализ подтвердил замену протеогликанов, сходную с уровнями, наблюдаемыми у наивной мыши, в то время как контроль с носителем не продемонстрировал похожей замены. Тканевые срезы также окрашивали, как описано выше для коллагена II типа, через 8 недель после инъекции повреждения. Качественный анализ подтвердил увеличение коллагена II типа в суставах, подвергавшихся лечению конструкцией, аналогичных уровням, которые наблюдались у наивной мыши; в то время как контроли, подвергшиеся лечению носителем, не продемонстрировали похожей замены. (данные не показаны).
Модель разрыва мениска на крысах.
Модель хирургической травмы на крысах также была использована для оценки эффективности конструкций in vivo. Модель и оценивание первоначально осуществляли, как описано ранее Gerwin N. et al. Osteoarthritis Cartilage. Suppl. 3: S24 (2010). Коротко, кожу обривали вдоль коленного сустава и медиальную коллатеральную связку (MCL) выделяли через разрез, и MCL стабилизировали и дистальный срез мениска делали с помощью скальпеля. В недели 1, 2 и 3 после операции белковую конструкцию или контроль с носителем вводили интрасуставно, затем суставы собирали и делали срезы на 4- и 6-й неделе после операции. Гистологическую балльную оценку степни тяжести состояния плато бедренной и большеберцовой кости проводили для количественной оценки восстановления тканей, как описано выше. Данные приведены за 6 недель анализов.
- 31 035158
Здоровый гиалиновый хрящ заменял повреждение после лечения. Гистологический анализ и классификацию латерального тибиального плато окрашенного сафранином О хряща проводили, как описано выше, и количественно оценивали. Результаты показали, что у животных, получавших конструкцию 242KQ, выявлялась регенерация в хрящевой ткани и замена протеогликанов, сходно с уровнями, наблюдаемыми у наивной крысы, в то время как контроль с носителем не продемонстрировал похожей замены. См. фиг. 9. Аналогичные результаты были отмечены для 225WT.
Слегка измененная модель хирургически индуцированного разрыва мениска, описанная выше, была использована, чтобы инициировать повреждение хряща у самцов крыс Льюиса с целью проверки эффективности 242KQ в стимулировании восстановления хрящевой ткани in vivo. Операции на крысах проводили, чтобы полностью разорвать медиальную коллатеральную связку и медиальный мениск для дестабилизации сустава, с тем чтобы последующая весовая нагрузка привела бы к быстрой дегенерации хряща. Был сделан надрез, чтобы разорвать связки по обе стороны иглы, обеспечивая тем самым полный разрез. Затем использовали лезвие скальпеля, чтобы проникнуть под связкой надколенника в синовиальное пространство, и заостренную верхушку использовали для того, чтобы разрезать мениск. Удачный разрез достигался, когда сустав вывихивался вбок. Через неделю после операции крыс дозировали путем внутрисуставной инъекции 242KQ или физиологического раствора в объеме 25 мкл во внутрисуставное синовиальное пространство.
Через двадцать восемь дней после операции по разрыву мениска и двадцать один день после внутрисуставной инъекции физиологического раствора или конструкции, исследуемых животных умерщвляли и пораженные суставы собирали для анализа, фиксировали в 10% формалине в PBS, декальцинировали муравьиной кислотой и заливали в парафин перед изготовлением срезов. Готовили корональные срезы и окрашивали сафранином О или оставляли неокрашенными для дальнейшего иммуногистохимического окрашивания. Анализ показал, что медиальное тибиальное плато имело наибольшее количество повреждений хряща, и было решено оценивать только эту область сустава на эффективность 242KQ. С использованием системы оценивания OARSI, балльная оценка степени тяжести состояния хрящей назначали для шести срезов по ширине тибиального хряща для каждого животного (N=10) вслепую. Балльное оценивание проводили дважды в разные временные точки и баллы затем усредняли, чтобы создать балльную оценку повреждения хряща. Кроме того, анализы объективной балльной оценки проводили с пользовательским скриптом, сгенерированным в среде Matlab. Алгоритм выявлял суставные хрящевые поверхности и объективно количественно определял дополнительные параметры хряща (зональные анализы, интенсивность сафранина О, область хряща, толщину хряща). Результаты иллюстрируются на фиг. 10А.
Структурное восстановление хряща не всегда связано с облегчением боли, по меньшей мере, у людей. Хотя физиология грызунов и манера ходьбы значительно отличаются от таковых у людей, 242KQ оценивали, чтобы определить наличие какого-либо улучшения в манере ходьбы или в продолжительности нахождения на конечности после хирургического лечения. Инкапаситантный мониторинг проводился на крысах, получавших 242KQ. Крыс подвергали измененной хирургической операции на мениске, как описано выше. Через одну неделю после операции 242KQ вводили в синовиальное пространство. На 28-й день крыс помещали в инкапаситантный монитор задними конечностями, и 30 последующих считываний были приняты в течение более 10 мин для каждой крысы для определения процента времени, проведенного (распределение веса) на каждой задней конечности. Эти данные дают представление о боль-индуцированном перераспределении веса. Было установлено, что в модели разрыва мениска на крысах лечение при помощи 242KQ через одну неделю после операции привело к частичному восстановлению способности к равной весовой нагрузке у крыс. См. фиг. 10В.
Одной из основных проблем в ходе спонтанного или хирургического восстановления хряща является замещение гиалинового суставного хряща фиброзной хрящевой тканью. Для исследования типа восстановления хряща, опосредованного ANGPTL3, срезы коленей крыс, полученные в исследовании разрыва мениска у крыс, проведенном выше, окрашивали в присутствии коллагена II типа (для индикации гиалинового суставного хряща) и коллагена X типа (для индикации фиброзного хряща). После однократного введения 20 мкг 242KQ наблюдалось качественное уменьшение величины экспрессии коллагена X типа.
Долговременное удержание 242KQ после внутривенной и внутрисуставной инъекции в колени крыс определяли путем 124Гмечения белка и введения с последующим РЕТ/цСТ отображением для контроля удержания. См., Gerwin N. et al. (2006) Advanced drug delivery reviews 58, 226-242. Среднее время удержания (MRT) после инъекции 242KQ в сустав, как был определено, составило ~17,3 ч, что является значительно увеличенным по сравнению со стандартными 2-3 ч, как сообщалось (см. табл. 6)
Таблица 6. Устойчивость 1241242KQ
Способ Доза (мкг) (нг/мл) AUCo-inf (ч*мкг/мл) CL (мл/ч) Vss (мл) MRT (ч) Т1/2 (ч)
IV 164,2 129,3 22,1 7,4 53,4 7,2 12,4
IA 38,3 0,2 1,9 - - 17,3 7,2
Модель травматического повреждения сустава путем частичной менискэктомии на собаках Мы
- 32 035158 также оценивали активность ANGPTL3 в модели травматического повреждения суставов у собак. Модель выполняли и оценивание осуществляли, как описано в Connor J.R. et al., Osteoarthritis and cartilage/OARS, Osteoarthritis Research Society 17, 1236-1243 (2009). Вкратце, кожу обривали над коленным суставом и медиальную коллатеральную связку (MCL) выделяли через разрез, и MCL стабилизировали, и дистальный срез мениска проводили с помощью скальпеля. Четыре (4) дня после операции животные получали либо дозирование два раза в неделю (1,5 или 15 мкг), или однократную дозу (30 мкг) белковой конструкции (полноразмерный ANGPTL3 собаки) на 7-й день или контроль носителя (вводят внутрисуставно). Собак усыпляли на 28-е сутки и колени подвергали гистологическим срезам и классификации, как описано выше для экспериментов с крысами и мышами. Фиг. 10 иллюстрирует общую валовую балльную оценку восстановления, связанного с лечением собачьим ANGPTL3. По гистологической классификации и оценке срезов суставов собак, окрашенных сафранином О, в областях, где имели место наиболее серьезные потери хряща в группах с физраствором была, была часть сустава, которая имела наибольшее снижение в области поражения после однократной дозы 30 мкг cANGPTL3.
Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные в настоящем документе, предназначены лишь для иллюстративных целей,и что различные модификации или изменения в свете этого могут быть предложены специалистами в рассматриваемой области техники и подлежат включению в духе и компетенции данной заявки и в рамках прилагаемых пунктов формулы изобретения.
- 33 035158
Последовательности
SEQ ID Конструкция Последовательность
1 ANGPTL3 MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKN EEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLK TFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKP RAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCD VISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYV LRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWD HKAKGHFNCPEGYSGGWWraDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGR LYSIKSTKMLIHPTDSESFE
человека
2 REFSEQ ttccagaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaagataaaaatgt tcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattga tcaagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgct atgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtc ttaaagactttgtccataagacgaagggccaaattaatgacatatttcaaaaact caacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaaccagtgaaatcaaa gaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaag aggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaaga aaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaactta attcaaaatcaacctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaactt ttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagaccgtggaagacca atataaacaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctc agaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagag caccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaacatga tggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggc atgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgtta tatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaactt caatgaaacgtgggagaactacaaatatggttttgggaggcttgatggagaattt tggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattatgttttac gaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattcttttta cttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaat gtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcaca aagcaaaaggacacttcaactgtccagagggttattcaggaggctggtggtggca tgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagagcaaaa tctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaatggaaggttat actctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttga atgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagt taatgtggtctaataatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaataga ttttttttatcttaaagtcactgtctatttaagattaaacatacaatcacataac cttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataatactatttgttt
ANGPTL3
человека
taaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatca ataggtgaacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattt taaaaggcatcatatgagctaatatcacaactttcccagtttaaaaaactagtac tcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagaggactggtaattgtacagttc ttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagtatgtgt aaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatt tggagtaaatgtttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaat actgtattaaaataagttcgctgtctttaaacaaatggagatgactactaagtca cattgactttaacatgaggtatcactataccttatt
- 34 035158
3 ANGPTL3 мыши MHTIKLFLFWPLVIASRVDPDLSSFDSAPSEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLRTNEIKEEEKELRRTTSTLQVKN EEVKNMSVELNSKLESLLEEKTALQHKVRALEEQLTNLILSPAGAQEHPEVTSLK SFVEQQDNSIRELLQSVEEQYKQLSQQHMQIKEIEKQLRKTGIQEPSENSLSSKS RAPRTTPPLQLNETENTEQDDLPADCSAVYNRGEHTSGVYTIKPRNSQGFNVYCD TQSGSPWTLIQHRKDGSQDFNETWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVQQSNYI LRLELQDWKDSKHYVEYSFHLGSHETNYTLHVAEIAGNIPGALPEHTDLMFSTWN HRAKGQLYCPESYSGGWWWNDICGENNLNGKYNKPRTKSRPERRRGIYWRPQSRK LYAIKSSKMMLQPTT
4 ANGPTL3 собаки MYTIKLFLFIIPLVISSKIDRDYSSYDSVSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTNEIKEEEKELRRTTSKLQVKN EEVKNMSLELNSKVESLLEEKILLQQKVRYLEKQLTSLIKNQPEIQEHPEVTSLK TFVEQQDNSIKDLLQTVEEQYRQLNQQHSQIKEIENQLRNVIQESTENSLSSKPR APRTTPFLHLNETKNVEHNDIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDV KSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYIL RIELEDWNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDH KAKGHVNCPESYSGGWIVWHNVCGENNLNGKYNKQRAKTKPERRRGLYWKSQNGR L YSIKSTKMLIHPIDSESSE
5 ANGPTL3 лошади MYTIKLFLVIAPLVISSRIDQDYSSLDSIPPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYALSLQTNEIKEEEKELRRTTSKLQVKN EEVKNMSLELNSKLESLLEEKSLLQQKVKYLEEQLTKLIKNQPEIQEHPEVTSLK TFVEQQDNSIKDLLQTMEEQYRQLNQQHSQIKEIENQLRRTGIQESTENSLSSKP RAPRTTPSFHLNETKDVEHDDFPADCTTIYNRGEHTSGIYSIKPSNSQVFNVYCD VISGSSWILIQRRIDGSQNFNETWQNYKYGFGRLDFEFWLGLEKIYSIVKRSNYI LRIELEDWKDNKHTIEYSFHLGNHETNYTLHLVEITGNVPNALPEHKDLVFSTWD HKAKGQLNCLESYSGGWWWHDVCGGDNPNGKYNKPRSKTKPERRRGICWKSQNGR LYTIKSTKMLIHPIDSESFELRQIKKPMN
6 Бычий ANGPTL3 MYTIKLFLIIAPLVISSRTDQDYTSLDSISPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTNEIKEEEKELRRATSKLQVKN EEVKNMSLELDSKLESLLEEKILLQQKVRYLEDQLTDLIKNQPQIQEYLEVTSLK
TLVEQQDNSIKDLLQIVEEQYRQLNQQQSQIKEIENQLRRTGIKESTEISLSSKP RAPRTTPSFHSNETKNVEHDDIPADCTIIYNQGKHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCD VKSGSSWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVMQSNYI LRIELEDWKDKYYTEYSFHLGDHETNYTLHLAEISGNGPKAFPEHKDLMFSTWDH KAKGHFNCPESNSGGWVYHDVCGENNLNGKYNKPKAKAKPERKEGICWKSQDGRL YSIKATKMLIHPSDSENSE
7 207-455WT IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPE RRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
8 225-455WT TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTD
9 228-455WT FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTD
- 35 035158
10 233-455WT EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH PTD
11 241-455WT GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
12 ANGPTL3KQ MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKN EEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLK TFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKP RAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCD VISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYV LRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWD HKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGR LYSIKSTKMLIHPTDSESFE
13 ANGPTL3KS MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGH GLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKN EEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLK TFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKP RAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCD VISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYV LRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWD HKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGR LYSIKSTKMLIHPTDSESFE
14 207KQ IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPE RRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
15 207KS IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPE RRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
16 225KQ TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTDSESFE
17 225KS TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTDSESFE
18 225ST TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKTKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTDSESFE
- 36 035158
TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS
PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL
226KQ
EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG
HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK
STKMLIHPTDSESFE
TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS
PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL
226KS
EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG
HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK
STKMLIHPTDSESFE
FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW
TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED
228KQ
WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF
NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST
KMLIHPTDSESFE
FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW
TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED
228KS
WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF
NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST
KMLIHPTDSESFE
FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW
TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED
228ST
WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF
NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKTKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST
KMLIHPTDSESFE
EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH
RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK
233KQ
HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG
YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH
PTDSESFE
EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH
RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK
233KS
HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG
YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH
PTDSESFE
GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF
241KQ
NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY
LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH
DECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF
241KS
NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY
LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGW1WH
DECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN
242KQ
ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL
GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD
ECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN
242KS
ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL
GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD
ECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
- 37 035158
30 225-455KQ TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTD
31 225-455KS TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSI KSTKMLIHPTD
32 22 6-4 55KQ TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTD
33 226-455KS TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTD
34 228-455KQ FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTD
35 228-455KS FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSRPERRRGLSWKSQNGRLYSIKST KMLIHPTD
36 233-455KQ EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH PTD
- 38 035158
37 233-455KS EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIH PTD
38 241-455KQ GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
39 241-455KS GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
40 242-455KQ IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRAQSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
41 242-455KS IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRASSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
42 227KQ собаки FLHLNETKNVEHNDIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSW TLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYILRIELED WNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDHKAKGHV NCPESYSGGWWWHNVCGENNLNGKYNKQRAQTKPERRRGLYWKSQNGRLYSIKST KMLIHPIDSESSE
11 227KS собаки FLHLNETKNVEHNDIPANCTTIYNRGEHTSGIYSIRPSNSQVFNVYCDVKSGSSW TLIQHRIDGSQNFNETWENYRYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYILRIELED WNDNKHYIEYFFHLGNHETNYTLHLVEITGNILNALPEHKDLVFSTWDHKAKGHV NCPESYSGGWWWHNVCGENNLNGKYNKQRASTKPERRRGLYWKSQNGRLYSIKST KMLIHPIDSESSE
44 Последовательность нуклеиновых кислот 225WT ACTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTC СТ GCT GAAT GTACCACCATTTATAACAGAGGT GAACATACAAGT GGCAT GTAT GC CATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGT AGT С CAT G GACАТ ТААТ Т СААСАТ С GAATAGAT G GAT САСААААС Т Т СААТ GAAA CGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGG С С ТAGAGAAGATАТАС Т С СATAGT GAAG СААТ С ТААТ TATGTTTTAC GAAT Т GAG TTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAA ATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAA
- 39 035158
TGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAA GGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGT GTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAAATCTAAGCC AGAGAGGAGAAGAGGATTAT СТТ GGAAGT СТ CAAAAT GGAAGGTTATACT СТАТА АААТ СААС СААААТ GT Т GAT С CAT С СААСAGAT Т СAGAAAG С Т Т Т GAA
45 Последова- ACTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTC СТ GCT GAAT GTACCACCATTTATAACAGAGGT GAACATACAAGT GGCAT GTAT GC CATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGT AGT С CAT G GAGAT TААТ T СAACAT C GAATAGAT G GAT СACААААС T T GAAT GAAA CGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGG С С TAGAGAAGATATAC T C CATAGT GAAG GAAT С TAAT TATGTTTTAC GAAT T GAG TTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAA ATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAA TGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAA GGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGT GTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCACAATCTAAGCC AGAGAGGAGAAGAGGATTAT CTT GGAAGT CT CAAAAT GGAAGGTTATACT СТАТA АААТ CAAC CAAAAT GT T GAT C CAT C GAAGAGAT T CAGAAAG С T T T GAA
дельность
нуклеиновых
кислот 225KQ
46 Последова- A.CTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTC CT GCT GAAT GTACCACCATTTATAACAGAGGT GAACATACAAGT GGCAT GTAT GC CATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGT AGTCCAT GGAGATTААТT GAAGAT CGAATAGAT GGAT СACААААСTT GAAT GAAA CGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGG С С T AGAGAAGAT AT AC T C CAT AGT GAAG GAAT С T AAT TATGTTTTAC GAAT T GAG TTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAA ATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAA TGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAA GGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGT GTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAGCTCTAAGCC AGAGAGGAGAAGAGGATTAT CTT GGAAGT CT CAAAAT GGAAGGTTATACT GTATA АААТ CAAC CAAAAT GT T GAT C CAT С CAACAGAT T CAGAAAGСT T T GAA
тельность
нуклеиновых
кислот 225KS
£7 Последова- ACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTG CTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGTATGCCAT CAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGT С CAT G GAGАТ ТААТ Т СААСАТ С GAATAGAT G GAT САСААААС Т Т СААТ GAAAC GT GGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCT AGAGAAGATАТАС Т С СATAGT GAAG СААТ С ТААТ TATGTTTTAC GAAT Т GAGT Т G GAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATC ACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGC
тельность
нуклеиновых
кислот 226KQ
- 40 035158
AA.TCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGA CACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTG GAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCACAATCTAAGCCAGA GAGGAGAAGAGGATTAT СТТ GGAAGT СТ CAAAAT GGAAGGTTATACT СТАТАААА Т СAAC СААААТ GT Т GAT С CAT С СAACAGAT Т СAGAAAG С Т Т Т GAA
48_ Поспелова- ACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTG CTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGTATGCCAT CAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGT С CAT G GACАТ ТААТ Т СAACАТ С GAATAGAT G GAT САСААААС Т Т СААТ GAAAC GT GGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCT AGAGAAGATАТАС Т С СATAGT GAAG СААТ С ТААТ TATGTTTTAC GAAT Т GAGT Т G GAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATC ACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGC AATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGA CACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTG GAGAAAACAACCTAAAT GGTAAATATAACAAAC CAAGAGCAAGCT CTAAGCCAGA GAGGAGAAGAGGATTAT СТТ GGAAGT СТ CAAAAT GGAAGGTTATACT СТАТАААА Т СAAC CAAAAT GT Т GAT С CAT С СAACAGAT Т СAGAAAG С Т Т Т GAA
тельность
нуклеиновых
кислот 226KS
49 Последова- TTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGAAT GTАС СAC CAT Т ТATAACAGAG GT GAACATACAAGT G G CAT GTAT G C CAT CAGAC C CAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGG ACAT TААТ T CAACAT C GAATAGAT GGAT СACААААСT T СAAT GAAAC GT GGGAGA ACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAA GATATAC T C CATAGT GAAG СААТ С TAAT TATGTTTTAC GAAT T GAGT T G GAAGAC TGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAA CCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCC GGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTC AA.CTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAA ACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCACAATCTAAGCCAGAGAGGAG AA.GAGGATTATCTTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACC Z\Z\Z\AT GT T GAT C CAT C CZ\AC AGAT T CAGAAAG С T T T GAA
тельность
нуклеиновых
кислот 228KQ
50 Последова- TTTCTTCAGTTGZ\ATGZ\Z\ATZ\AGZ\Z\ATGTZ\Z\Z\ACATGATGGCATTCCTGCTGZ\AT GT AC C AC CAT T T ATZVX.C AGAG GT GZ\AC AT ACZiAGT G G CAT GT AT G C CAT C AGAC C CAGCZ\ACTCTCZ\AGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGG AC AT TZ\AT T CZ\AC AT C GZ\AT AGAT G GAT C ACZVViAC T T CZ\AT GAAAC GT G G GAGA ACTACZ\Z\ATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGZ\ATTTTGGTTGGGCCTAGAGZ\A GAT AT AC T C CAT AGT GAAG CZ\AT C TZ\AT TATGTTTTAC GZ\AT T GAGT T G GAAGAC TGGZ\Z\AGACZ\ACZ\Z\ACATTATATTGZ\ATATTCTTTTTACTTGGGZ\Z\ATCACGZ\Z\A CCZ\ACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCZ\ATGTCCCCZ\ATGCZ\ATCCC GGZ\Z\Z\ACZ\Z\AGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAZ\AGCZ\Z\Z\AGGACACTTC Z\ACT GT CCAGAGGGTTATT CAGGAGGCT GGT GGT GGCAT GAT GAGT GT GGAGZViA ACZ\ACCTZ\Z\ATGGTZ\Z\ATATZ\ACZ\Z\ACCZ\AGAGCZ\AGCTCTZ\AGCCAGAGAGGAG
тельность
нуклеиновых
кислот 228KS
AAGAGGATTATCTTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACC
ZiAAAT GT T GAT C CAT С СAACAGAT T CAGAAAG С T T T GAA
- 41 035158
Последовануклеиновых кислот
233KQ
Последовануклеиновых кислот
233KS
Последовануклеиновых кислот
241KQ
Последовануклеиновых кислот
241KS
ACAGAGGT GAACATACAAGT GGCAT GTAT GCCAT CAGACCCAGCAACT CT CAAGT
TTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGGACAXTAATTCAACAT
TTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGT
CATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTAC
ATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTT
GGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGT
TATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTA
ACAGAGGT GAACATACAAGT GGCAT GTAT GCCAT CAGACCCAGCAACT CT CAAGT
T T T T CAT GT CTACT GT GAT GT TATAT CAGGTAGT C CAT GGACAT TAAT T CAACAT
TTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGT
CATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTAC
ATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTT
GGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGT
TATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTA
GGCATTCCTGCTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCA
TGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTAT
ATCAGGTAGTC CAT G GACAT TAAT T CAACAT C GAATAGAT G GAT СACAAAAC T T C
AATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTT
GGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACG
AATT GAGTT GGAAGACT GGAAAGACAACAAACATTATATT GAATATTCTTTTTAC
TTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATG
TCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAA
AGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCAT
GGCATTCCTGCTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCA
TGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTAT
ATCAGGTAGTC CAT G GACAT TAAT T CAACAT C GAATAGAT G GAT CACAAAAC T T C
AATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTT
GGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACG
AATT GAGTT GGAAGACT GGAAAGACAACAAACATTATATT GAATATTCTTTTTAC
TTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATG
TCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAA
AGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCAT
- 42 035158
55 Последовательность нуклеиновых кислот 242KQ ATTCCTGCTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGT ATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATC AGGTAGTC CAT G GAGAT TAAT T СAACAT C GAATAGAT G GAT СACAAAAC T T СAAT GAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGT TGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACGAAT TGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTG GGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCC CCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGC AAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGAT GAGT GT GGAGAAAACAACCTAAAT GGTAAATATAACAAACCAAGAGCACAAT СТА AGCCAGAGAGGAGAAGAGGATTAT CTT GGAAGT CT CAAAAT GGAAGGTTATACT C TATAAAATCAACCAAAATGTT GAT CCAT СCAACAGATT CAGAAAGСTTT GAA
56 57 5_8 59 Последовательность нуклеиновых кислот 242KS Последовательность нуклеиновых кислот C227KQ 2 07Kdel 225Kdel ATTCCTGCTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGT ATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATC AGGTAGTC CAT G GAGAT TAAT T CAACAT C GAATAGAT G GAT GAGAAAAC T T CAAT GAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGT TGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACGAAT TGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTG GGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCC CCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGC AAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGAT GAGT GT GGAGAAAACAACCTAAAT GGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAGCT СТА AGCCAGAGAGGAGAAGAGGATTAT CTT GGAAGT CT CAAAAT GGAAGGTTATACT C TATAAAAT CAAC CAAAAT GT T GAT C CAT С CAACAGAT T CAGAAAGСT T T GAA T T T T T GCAT СT CAAC GAAAC GAAGAAT GT C GAACACAAC GAGAT T С C GGСAAAT T GCACAACTATCTACAATAGAGGCGAACATACGTCCGGTATCTACTCCATTAGACC TTCAAACAGCCAGGTATTCAATGTGTACTGCGATGTAAAGTCAGGATCGTCATGG ACACTGATCCAGCATAGGATCGACGGGTCCCAGAACTTCAACGAGACATGGGAGA ACTACCGCTATGGATTTGGAAGGCTGGATGGGGAGTTCTGGTTGGGACTTGAGAA AATCTACAGCATTGTGAAGCAGTCGAACTACATTCTCCGGATTGAACTGGAGGAC TGGAATGACAACAAACACTACATCGAGTATTTCTTTCATCTCGGCAACCATGAAA CGAATTACACCTTGCACCTTGTGGAAATCACGGGCAACATTTTGAACGCGCTGCC AGAACACAAAGACCTGGTGTTTTCGACATGGGATCACAAAGCAAAGGGGCACGTG AACTGTCCCGAATCATATAGCGGGGGATGGTGGTGGCACAATGTCTGTGGTGAGA ACAATCTCAACGGGAAATACAATAAGCAGCGAGCTCAGACGAAACCCGAGCGGCG GAGAGGTCTGTATTGGAAGTCGCAGAATGGACGCCTGTATTCGATCAAATCGACG AAAATGCTCATCCACCCCATCGACTCCGAATCGTCGGAG IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAI RPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGL EKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNA IPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPER RRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTDSESFE
60 22 6Kdel TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKS TKMLIHPTDSESFE
- 43 035158
61 228Kdel FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTK MLIHPTDSESFE
62 233Kdel EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHP TDSESFE
63 241Kdel GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
64 242Kdel IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHD ECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
65 225-455Kdel TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISG SPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIE LEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAK GHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIK STKMLIHPTD
66 226-455Kdel TPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGS PWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIEL EDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKG HFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKS TKMLIHPTD
67 228-455Kdel FLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPW TLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELED WKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHF NCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTK MLIHPTD
68 233-455Kdel EIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQH RIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNK HYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEG YSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHP TD
69 241-455Kdel GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNF NETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFY LGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWH DECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
70 242-455Kdel IPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFN ETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYL GNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWTfH D ECGENNLNGKYNKPRASKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
- 44 035158
71 hANGPTLl 1- MKTFTWTLGVLFFLLVDTGHCRGGQFKIKKINQRRYPRATDGKEEAKKCAYTFLVP EQRITGPICVNTKGQDASTIKDMITRMDLENLKDVLSRQKREIDVLQLWDVDGNI VNEVKLLRKESRNMNSRVTQLYMQLLHEIIRKRDNSLELSQLENKILNVTTEMLKM ATRYRELEVKYASLTDLVNNQSVMITLLEEQCLRIFSRQDTHVSPPLVQWPQHIP NSQQYTPGLLGGNEIQRDPGYPRDLMPPPDLATSPTKSPFKIPPVTFINEGPFKDC QQAKEAGHSVSGIYMIKPENSNGPMQLWCENSLDPGGWTVIQKRTDGSVNFFRNWE NYKKGFGNIDGEYWLGLENIYMLSNQDNYKLLIELEDWSDKKVYAEYSSFRLEPES EFYRLRLGTYQGNAGDSMMWHNGKQFTTLDRDKDMYAGNCAHFHKGGWWYNACAHS NLNGVWYRGGHYRSKHQDGIFWAEYRGGSYSLRAVQMMIKPID
491
72 СТ hANGPTLl 271- FINEGPFKDCQQAKEAGHSVSGIYMIKPENSNGPMQLWCENSLDPGGWTVIQKRTD GSVNFFRNWENYKKGFGNIDGEYWLGLENIYMLSNQDNYKLLIELEDWSDKKVYAE YSSFRLEPESEFYRLRLGTYQGNAGDSMMWHNGKQFTTLDRDKDMYAGNCAHFHKG GWWYNACAHSNLNGVWYRGGHYRSKHQDGIFWAEYRGGSYSLRAVQMMIKPID
491
73 hANGPTL4 1- MSGAPTAGAALMLCAATAVLLSAQGGPVQSKSPRFASWDEMNVLAHGLLQLGQGLR EHAERTRSQLSALERRLSACGSACQGTEGSTDLPLAPESRVDPEVLHSLQTQLKAQ NSRIQQLFHKVAQQQRHLEKQHLRIQHLQSQFGLLDHKHLDHEVAKPARRKRLPEM AQPVDPAHNVSRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGW TVIQRRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDW DGNAELLQFSVHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLR RDKNCAKSLSGGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQA TTMLIQPMAAEAAS
406
74 СТ LANGPTL4 179- SRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQRRHDGS VDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDWDGNAELLQFS VHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLRRDKNCAKSLS GGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQATTMLIQPMAA EAAS
406
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (27)

1. Выделенный полипептид с хондрогенной активностью, содержащий аминокислотную последовательность, которая по аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентична любой аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70, причем аминокислота в положении 423 представляет собой Q или аминокислота в положении 423 удалена, как определено по отношению к SEQ ID NO:1.
2. Полипептид по п.1, в котором полипептид содержит SEQ ID NO:28.
3. Полипептид по п.1, в котором полипептид состоит из любой аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70.
4. Полипептид по п.1, который состоит из SEQ ID NO:28.
5. Полипептид по любому из пп.1-4, в котором полипептид является ПЭГилированным.
6. Фармацевтическая композиция для лечения, облегчения течения или профилактики артрита или повреждения хряща у пациента, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида по любому из пп.1-5.
7. Способ лечения, облегчения течения или профилактики артрита или повреждения хряща у пациента, включающий введение в сустав пациента терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.6.
8. Способ по п.7, при котором у пациента имеется артрит или повреждение хряща.
9. Способ по п.7, при котором у пациента существует риск возникновения артрита или повреждения хряща.
10. Способ по п.8 или 9, при котором артрит представляет собой остеоартрит, травматический артрит или аутоиммунный артрит.
11. Способ по любому из пп.7-10, при котором композиция дополнительно содержит гиалуроновую
- 45 035158 кислоту.
12. Способ по любому из пп.7-11, дополнительно включающий хирургическое вмешательство на пораженном суставе.
13. Способ по п.12, при котором введение фармацевтической композиции происходит во время или после хирургического вмешательства.
14. Способ по п.7, при котором введение фармацевтической композиции происходит в сочетании с заменой хряща, имплантацией аутологичных хондроцитов (ACI) или матрикс-индуцированной имплантацией аутологичных хондроцитов (MACI).
15. Способ индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты, включающий приведение мезенхимальных стволовых клеток в контакт с эффективным количеством полипептида по любому из пп.1-5 для индукции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондроциты.
16. Способ по п.15, при котором способ осуществляют in vivo и стволовые клетки присутствуют в организме индивида-человека.
17. Способ по п.16, при котором у индивида имеется артрит или повреждение хряща.
18. Способ по п.16, при котором у индивида имеется риск возникновения артрита или повреждения хряща.
19. Способ по п.17 или 18, при котором артрит представляет собой остеоартрит, травматический артрит или аутоиммунный артрит.
20. Способ лечения, облегчения течения или профилактики артрита или повреждения хряща у индивида, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества полипептида по любому из пп.1-5.
21. Способ по п.20, при котором индивид имеет артрит или повреждения хряща.
22. Способ по п.20, при котором индивид находится в группе риска возникновения артрита или повреждения хряща.
23. Способ по п.21 или 22, при котором артрит представляет собой остеоартроз, травматический артрит или аутоиммунный артрит.
24. Способ по любому из пп.20-23, дополнительно включающий введение гиалуроновой кислоты.
25. Способ по любому из пп.20-24, дополнительно включающий хирургическое вмешательство на пораженном суставе.
26. Способ по п.25, при котором введение полипептида происходит во время или после хирургического вмешательства.
27. Способ по п.20, при котором введение полипептида происходит в сочетании с заменой хряща, имплантацией аутологичных хондроцитов (ACI) или матрикс-индуцированной имплантацией аутологичных хондроцитов (MACI).
EA201591661A 2013-03-08 2014-03-07 Пептиды и композиции для лечения повреждений суставов EA035158B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361775400P 2013-03-08 2013-03-08
US201461938123P 2014-02-10 2014-02-10
PCT/US2014/022102 WO2014138687A1 (en) 2013-03-08 2014-03-07 Peptides and compositions for treatment of joint damage

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591661A1 EA201591661A1 (ru) 2015-12-30
EA035158B1 true EA035158B1 (ru) 2020-05-06

Family

ID=50390286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591661A EA035158B1 (ru) 2013-03-08 2014-03-07 Пептиды и композиции для лечения повреждений суставов

Country Status (39)

Country Link
US (4) US9649359B2 (ru)
EP (2) EP2964250B1 (ru)
JP (3) JP6567429B2 (ru)
KR (1) KR102267341B1 (ru)
CN (2) CN111808182A (ru)
AP (1) AP2015008675A0 (ru)
AU (3) AU2014225348B2 (ru)
BR (2) BR112015021269B1 (ru)
CA (1) CA2903448C (ru)
CL (1) CL2015002443A1 (ru)
CO (1) CO7461145A2 (ru)
CR (2) CR20200290A (ru)
CU (1) CU24301B1 (ru)
CY (1) CY1120729T1 (ru)
DK (1) DK2964250T3 (ru)
EA (1) EA035158B1 (ru)
EC (1) ECSP15042898A (ru)
ES (1) ES2684349T3 (ru)
HK (1) HK1214754A1 (ru)
HR (1) HRP20181269T1 (ru)
HU (1) HUE038499T2 (ru)
IL (1) IL240727B (ru)
JO (1) JO3564B1 (ru)
LT (1) LT2964250T (ru)
MX (1) MX365157B (ru)
MY (1) MY173172A (ru)
NZ (1) NZ711037A (ru)
PE (1) PE20151528A1 (ru)
PH (1) PH12015501983A1 (ru)
PL (1) PL2964250T3 (ru)
PT (1) PT2964250T (ru)
RS (1) RS57446B1 (ru)
SG (1) SG11201506490TA (ru)
SI (1) SI2964250T1 (ru)
TN (1) TN2015000385A1 (ru)
TW (1) TWI634124B (ru)
UY (1) UY35368A (ru)
WO (1) WO2014138687A1 (ru)
ZA (1) ZA201505966B (ru)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012000707A (es) 2009-07-14 2012-03-21 Scripps Research Inst Diferenciacion de celula madre mesenquimatica.
JO3564B1 (ar) 2013-03-08 2020-07-05 Novartis Ag ببتيدات وتركيبات لعلاج ضرر المفاصل
US9301971B2 (en) 2013-03-08 2016-04-05 Novartis Ag Peptides and compositions for treatment of joint damage
WO2018078706A1 (ja) 2016-10-24 2018-05-03 住友化学株式会社 セパレータ、およびセパレータを含む二次電池
AU2017357785A1 (en) 2016-11-14 2019-04-11 Novartis Ag Methods and compositions for treatment of cartilage damage and arthritis
CN108530619B (zh) * 2017-03-01 2020-12-08 北京大学第三医院 功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶
WO2020021447A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Novartis Ag Nlrp3 inflammasome inhibitors
TW202027794A (zh) * 2018-10-03 2020-08-01 瑞士商諾華公司 血管生成素樣３多肽之持續遞送
AR119731A1 (es) 2019-05-17 2022-01-05 Novartis Ag Inhibidores del inflamasoma nlrp3
CN111973617A (zh) * 2019-05-23 2020-11-24 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
US20220380425A1 (en) * 2019-07-04 2022-12-01 Cadila Healthcare Limited Angptl3 based vaccine for the treatment of liver disease
KR102577697B1 (ko) * 2019-11-13 2023-09-14 주식회사 나이벡 염증 및 상처 치료용 펩타이드
JP7298496B2 (ja) 2020-01-31 2023-06-27 トヨタ自動車株式会社 車両
WO2022249040A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Novartis Ag Methods for the treatment of osteoarthritis
TW202306970A (zh) 2021-05-24 2023-02-16 瑞士商諾華公司 用於治療骨關節炎之方法
CN113683681B (zh) * 2021-09-15 2023-10-03 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途
CN113683678B (zh) * 2021-09-15 2023-11-24 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途
WO2023084388A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Novartis Ag Methods for determining the biological activity of angptl polypeptides
CN114377202B (zh) * 2021-12-16 2023-01-24 方向前 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法
TW202406550A (zh) 2022-08-03 2024-02-16 瑞士商諾華公司 Ｎｌｒｐ３炎性小體抑制劑

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011008773A2 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 The Scripps Research Institute Mesenchymal stem cell differentiation

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
US5462990A (en) 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
US5288931A (en) 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
WO1999055869A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Zymogenetics, Inc. Novel polypeptide growth factors and materials and methods for making them
CA2332109A1 (en) 1998-05-12 1999-11-18 Human Genome Sciences, Inc. 97 human secreted proteins
AU4643699A (en) 1998-06-24 2000-01-10 Compugen Ltd. Angiopoietin-like growth factor sequences
JP2003531811A (ja) 1999-03-08 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害
JP2002537828A (ja) 1999-03-10 2002-11-12 フォゲン リミティド 細胞への物質のデリバリー
GB9912350D0 (en) 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
ES2291198T3 (es) 1999-07-20 2008-03-01 Genentech, Inc. Composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunologico.
US20030013649A1 (en) 2000-01-31 2003-01-16 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
ATE389719T1 (de) 2000-10-16 2008-04-15 Genentech Inc Behandlungsverfahren mit wisp-polypeptiden
US20030144498A1 (en) 2000-10-16 2003-07-31 Audrey Goddard TIE ligand homologues
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US20030027751A1 (en) 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins
WO2002085923A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of unnatural amino acids
US20030194798A1 (en) 2001-05-24 2003-10-16 Surber Mark W. Minicell compositions and methods
FI117667B (fi) 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
JP5105696B2 (ja) 2001-11-16 2012-12-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド アンジオポエチン様タンパク質３Ａｎｇｐｔｌ３含有組成物とその使用方法
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
BR0314172A (pt) 2002-09-09 2005-07-26 Nektar Therapeutics Al Corp Polìmero solúvel em água, composição, forma de hidrato ou acetal, composto,composição, usos do composto e do conjugado, e, processo para preparar o conjugado
DK1578949T3 (da) 2002-10-16 2009-07-27 Scripps Research Inst Stedspecifik optagelse af keto-aminnosyrer hos proteiner
CA2500653A1 (en) 2002-10-16 2004-04-29 The Scripps Research Institute Glycoprotein synthesis
JP5642916B2 (ja) 2003-04-17 2014-12-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 真核遺伝コードの拡張
BRPI0412272A (pt) 2003-07-07 2006-09-05 Scripps Research Inst composições de pares de lisil-trna e aminoacil-trna sintetase ortogonais e usos destes
US20060160175A1 (en) 2003-07-07 2006-07-20 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal leucyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof
WO2005007624A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal glutamyl-trna and aminoacyl trna synthetase pairs and uses thereof
ES2519444T3 (es) 2004-09-21 2014-11-07 The Scripps Research Institute Incorporación in vivo de alquinil aminoácidos a proteínas en eubacterias
AU2005330514B2 (en) 2004-10-27 2011-05-12 The Scripps Research Institute Orthogonal translation components for the in vivo incorporation of unnatural amino acids
EP1863340A2 (en) 2005-03-11 2007-12-12 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7807464B2 (en) 2005-05-24 2010-10-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for expansion and analysis of cultured hematopoietic stem cells
US8198044B2 (en) 2006-03-09 2012-06-12 The Scripps Research Institute Systems for the expression of orthogonal translation components eubacterial host cells
WO2008069348A1 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Seikagaku Corporation Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders
BRPI0720218A2 (pt) 2006-12-08 2013-12-24 Lexicon Pharmaceuticals Inc Anticorpos monoclonais contra angptl3
EP2118150B1 (en) 2007-02-14 2015-09-23 Biocompatibles UK Limited Derivatisation of biological molecules
WO2008137641A2 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells
CA2826142A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
WO2012129562A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 The Scripps Research Institute Compounds and methods for inducing chondrogenesis
CN104619727B (zh) 2012-06-25 2019-04-05 布里格姆及妇女医院股份有限公司 靶向治疗
JO3564B1 (ar) 2013-03-08 2020-07-05 Novartis Ag ببتيدات وتركيبات لعلاج ضرر المفاصل
US9301971B2 (en) 2013-03-08 2016-04-05 Novartis Ag Peptides and compositions for treatment of joint damage

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011008773A2 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 The Scripps Research Institute Mesenchymal stem cell differentiation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. F. O'SHEA, P. M. O'CONNOR, P. D. COTTER, R. P. ROSS, C. HILL: "Synthesis of Trypsin-Resistant Variants of the Listeria-Active Bacteriocin Salivaricin P", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 76, no. 16, 15 August 2010 (2010-08-15), pages 5356 - 5362, XP055125364, ISSN: 00992240, DOI: 10.1128/AEM.00523-10 *
JENNIFER A. SIEPEN, EMMA-JAYNE KEEVIL, DAVID KNIGHT, SIMON J. HUBBARD: "Prediction of Missed Cleavage Sites in Tryptic Peptides Aids Protein Identification in Proteomics", JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 6, no. 1, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 399 - 408, XP055125357, ISSN: 15353893, DOI: 10.1021/pr060507u *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016510763A (ja) 2016-04-11
NZ711037A (en) 2018-07-27
CY1120729T1 (el) 2019-12-11
KR20150125712A (ko) 2015-11-09
PH12015501983B1 (en) 2016-01-11
AU2014225348A1 (en) 2015-09-10
CO7461145A2 (es) 2015-11-30
TN2015000385A1 (en) 2017-01-03
AU2016203028A1 (en) 2016-05-26
JP6567429B2 (ja) 2019-08-28
JP2021178841A (ja) 2021-11-18
CA2903448C (en) 2021-03-23
LT2964250T (lt) 2018-07-25
AU2016203028B2 (en) 2017-02-02
HRP20181269T1 (hr) 2018-10-19
WO2014138687A1 (en) 2014-09-12
CN111808182A (zh) 2020-10-23
JP6918871B2 (ja) 2021-08-11
US20170252407A1 (en) 2017-09-07
ES2684349T3 (es) 2018-10-02
IL240727B (en) 2019-12-31
BR122016021558B1 (pt) 2023-03-28
US9649359B2 (en) 2017-05-16
TW201444865A (zh) 2014-12-01
BR122016021558A2 (pt) 2019-07-30
EP2964250B1 (en) 2018-05-16
MX2015011963A (es) 2015-12-09
RS57446B1 (sr) 2018-09-28
PE20151528A1 (es) 2015-11-14
SI2964250T1 (sl) 2018-11-30
DK2964250T3 (da) 2018-08-06
AU2016203028C1 (en) 2017-06-01
US11179442B2 (en) 2021-11-23
HK1214754A1 (zh) 2016-08-05
US10328126B2 (en) 2019-06-25
BR112015021269A2 (pt) 2017-10-10
CL2015002443A1 (es) 2016-05-20
MY173172A (en) 2020-01-02
AU2016277608B2 (en) 2018-04-05
EA201591661A1 (ru) 2015-12-30
EP3391900A1 (en) 2018-10-24
PT2964250T (pt) 2018-10-19
PH12015501983A1 (en) 2016-01-11
UY35368A (es) 2014-10-31
ECSP15042898A (es) 2019-03-29
AU2014225348B2 (en) 2016-03-31
US20160008433A1 (en) 2016-01-14
SG11201506490TA (en) 2015-09-29
KR102267341B1 (ko) 2021-06-21
JP2020015725A (ja) 2020-01-30
US20220184182A1 (en) 2022-06-16
AP2015008675A0 (en) 2015-08-31
CN105025917A (zh) 2015-11-04
CR20200290A (es) 2020-08-27
IL240727A0 (en) 2015-10-29
CN105025917B (zh) 2020-08-18
CU20150097A7 (es) 2016-05-30
CR20150466A (es) 2015-10-27
HUE038499T2 (hu) 2018-10-29
PL2964250T3 (pl) 2018-10-31
EP2964250A1 (en) 2016-01-13
CU24301B1 (es) 2017-12-08
AU2016277608A1 (en) 2017-01-12
CA2903448A1 (en) 2014-09-12
US20200268849A1 (en) 2020-08-27
JO3564B1 (ar) 2020-07-05
ZA201505966B (en) 2017-03-29
MX365157B (es) 2019-05-24
BR112015021269B1 (pt) 2023-04-11
TWI634124B (zh) 2018-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11179442B2 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
US11370820B2 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM