KR20150125712A - 관절 손상의 치료를 위한 펩티드 및 조성물 - Google Patents

관절 손상의 치료를 위한 펩티드 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20150125712A
KR20150125712A KR1020157027474A KR20157027474A KR20150125712A KR 20150125712 A KR20150125712 A KR 20150125712A KR 1020157027474 A KR1020157027474 A KR 1020157027474A KR 20157027474 A KR20157027474 A KR 20157027474A KR 20150125712 A KR20150125712 A KR 20150125712A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
asn
ser
leu
gly
Prior art date
Application number
KR1020157027474A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102267341B1 (ko
Inventor
크리스텐 존슨
지안 시
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20150125712A publication Critical patent/KR20150125712A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102267341B1 publication Critical patent/KR102267341B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1891—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/59—Compounds containing 9, 10- seco- cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems
    • A61K31/593—9,10-Secocholestane derivatives, e.g. cholecalciferol, i.e. vitamin D3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/014—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from connective tissue peptides, e.g. gelatin, collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/225—Calcitonin gene related peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/17—Angiopoietin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

본 발명은 새로운 프로테아제-내성 폴리펩티드, 및 급성 관절 상해 및 관절염을 비롯한 관절 손상에 관련된 병태를 치료, 개선 또는 예방하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

관절 손상의 치료를 위한 펩티드 및 조성물 {PEPTIDES AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF JOINT DAMAGE}
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 8일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/775,400 및 2014년 2월 10일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/938,123을 우선권 주장하며, 이들 가출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
골관절염 (OA)은 가장 일반적인 근골격 장애를 대표한다. 대략 4천만명의 미국인이 현재 걸려 있고; 그 수치는 고령화하는 인구 및 기대수명 증가의 결과로서 향후 20년 안에 6천만명으로 증가할 것으로 예측되었으며, 그리하여 골관절염을 신체 장애의 4번째 주요 원인이 되게 한다. OA는 관절 연골 (관절에 대한 윤활 및 쿠션 작용을 생성하는 세포와 매트릭스를 함유) 및 관절 연골 밑에 있는 연골하골 양쪽 모두를 포함하여 관절의 완만한 퇴행성 파손을 특징으로 한다. OA는 다양한 병인 인자의 결과라고 생각될 수 있다. 예를 들어, OA는 관절 연골 또는 골의 비정상적인 생물역학적 스트레스나 유전적 또는 후천적 이상에 의하여 초래될 수 있다. 현행 OA 요법은 경구용 NSAID 또는 선택적 시클로옥시게나제 2 (COX-2) 억제제로의 통증 완화, 코르티코스테로이드 및 히알루로난과 같은 작용제로의 관절내 (IA) 주사, 및 수술적 접근법을 포함한다.
관절 손상, 예를 들어 급성 관절 상해, 예컨대 반월판 또는 인대 파열, 또는 관절내 골절은 또한 관절염, 예를 들어 외상후 관절염의 원인이 될 수 있다. 관절 연골은 제한된 복구능을 지니기 때문에, 한층 더 작은 비-검출성 손상이 종종 시간이 지남에 따라 악화되어 OA의 원인이 될 수 있다. 관절 상해에 대한 현행 치료법은 통증 및 염증 경감제로의 치료뿐만 아니라 손상 관절의 재생에 초점을 둔 수술 및 다른 침습적 처치도 포함할 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (MSC)는 성인 관절 연골에 존재하며, 단리시에는 연골세포 및 다른 중간엽 세포 계통으로의 분화를 겪도록 시험관내에서 프로그램화시킬 수 있으며, 연골 재생에 사용될 수 있다. 부분적으로, 그 과정은 성장인자 (TGFβ, BMP), 혈청 상태 및 세포-세포 접촉에 의하여 조절된다. WO2011/008773에서는 관절염 및 관절 상해의 치료 또는 예방을 위한 및 중간엽 세포에서 연골세포로의 분화 유도를 위한 펩티드 조성물 및 그들 조성물의 용도를 기재하고 있다. 부가적으로, WO2012/129562에서는 관절염 및 관절 상해의 개선을 위한 및 중간엽 세포에서 연골세포로의 분화 유도를 위한 소분자 화합물, 조성물 및 그들 조성물의 용도를 기재하고 있다.
비록 수술 기법, 및 재생 기술이 연골의 복구, 퇴행의 둔화, 및 관절 손상의 향상된 복구에 있어서 다소의 진보를 이루게 해주었지만, 효과적인 연골 재생, 관절 손상의 치료 및 OA의 개선 또는 예방을 위한 조성물 및 방법의 개선에 대한 지속적인 필요성이 상존한다.
본 발명은 개선된 제약상 특성을 보유하는, 예를 들어 야생형 안지오포이에틴-유사 3 (ANGPTL3)에 비해 단백질분해 및 효소분해에 보다 안정하고 덜 감수성인 ANGPTL3의 새로운 폴리펩티드 및 단백질 변이체의 확인에 관한 것이다. 관절 손상 또는 관절 상해의 치료를 위한 제약 조성물 및 방법, 및 포유동물에서 관절염, 관절 손상 또는 관절 상해를 개선 또는 예방하는 방법이 또한 제공된다.
따라서, 표 1의 서열 중 어느 하나 이상으로부터 선택되고 본원에 좀더 상세히 기재되는 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제-내성 폴리펩티드가 제공된다. 전장 ANGPTL3 폴리펩티드 서열인 서열 1에 관하여 결정시에 표 1의 변형된 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서의 아미노산은 Q 또는 S이다. 특정 실시양태에서, 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서의 아미노산은 Q이다. 특정 실시양태에서, 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서의 아미노산은 S이다. 특정 실시양태에서, 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서의 아미노산은 결실된다. 또한, 제공된 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 및 서열 70 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1의 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 및 서열 70 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1의 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 및 서열 70 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64 중 어느 하나이다.
본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 화학적 변형 (예를 들어, PEG화)을 혼입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의로는 그 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서 융합될 수 있는 이종 펩티드를 융합 단백질로서 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터; 및 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 그러한 조성물은 환자에서 관절염 또는 관절 손상의 치료, 개선 또는 예방을 위해 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있으며, 여기서 그 방법은 환자의 관절에 치료 유효량의 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 그러한 방법으로부터 이익을 받을 수 있는 병태의 예는 관절염 (예를 들어, 골관절염, 외상성 관절염) 및 관절 손상 (예를 들어, 급성 관절 상해)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 치료 유효량의 본 발명의 1종 이상의 폴리펩티드 또는 그의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 제공된 방법은 관절 손상 및/또는 관절염을 갖거나 그의 위험에 처해 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 중간엽 줄기 세포를 유효량의 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시켜 중간엽 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 방법이 또한 추가로 제공된다.
본 발명의 추가의 특색, 이점 및 실시양태를 비롯한 본 발명의 이들 및 다른 측면은 본 발명의 하기 상세한 설명과 첨부 청구범위에서 기재되고 설명될 것이다.
도 1은 단백질 안정성을 향상시키고 단백질분해 내성을 증진시키도록 조작된 hANGPTL3 단백질의 개략도를 도시한다. 야생형 단백질 및 펩티드 서열의 단백질 생산 동안, Lys423과 Ser424 사이에서 100% 절단이 관찰되었다. 단백질분해를 완화하기 위하여, Lys423을 Gln 또는 Ser으로 돌연변이시키거나; 또는 Ser424를 Thr으로 돌연변이시키거나; 또는 Lys423을 결실시킨 다양한 돌연변이체 펩티드가 생성되었다.
도 2A 및 2B는 ANGPTL3 및 조작 구축물의 존재하에 또는 부재하에 연골-특이적 단백질의 발현의 그래프 표시를 도시한다. 고정 세포를 2A 프로-콜라겐 유형 2A 정량 (PIIANP) 또는 2B 제II형 콜라겐 정량을 위해 염색하여, 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 처리한 뒤에 연골세포로 분화하는 세포의 %를 측정하였다. 도 2C는 양성 대조군 단백질 bFGF와 비교하여, ANGPTL3 또는 조작 구축물의 존재하에 또는 부재하에 혈관신생 검정의 정량의 그래프 표시를 도시한다. 총 튜브 길이 및 분지점 개수는 혈관신생의 정량적 측정결과이었다. 비록 딴 사람들이 ANGPTL3에서의 혈관신생 활성을 보고하였고, 당해 연구는 그 활성과 FGF의 것을 확인시켜 주지만; 결과는 C-말단 ANGPTL3 구축물에는 어떠한 유의한 활성도 보유되어 있지 않다는 것을 보여주었다.
도 3은 ANGPTL3 또는 조작 구축물의 존재하에서 연골-특이적 단백질의 발현 증가를 보여주는 그래프 표시이다. 3A . 세포를 처리 10일 뒤에 qRT-PCR을 이용하여 평가하여 기재된 바와 같이 처리한 뒤에 연골-특이적 단백질에 대한 RNA 발현을 측정하였다. 루브리신(lubricin), 아그레칸(aggrecan) 및 Sox9는 연골-관련 단백질을 나타내고; IGF 및 IFITM1은 분화 가능성을 나타내며, 오스테오칼신(osteocalcin) 및 제X형 콜라겐은 골/섬유증-관련 단백질을 나타낸다. 3B . 세포를 기재된 바와 같이 처리 3일 뒤에 평가하였다. 조작 구축물 또는 야생형 ANGPTL1 C-말단 영역 폴리펩티드로의 처리 뒤에 증가된 아그레칸 발현이 관찰되었다.
도 4는 ANGPTL3 및 조작 구축물의 연골보호 활성의 그래프 표시를 도시한다. 4A : 매트릭스 손상의 지표인 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출은 점점 증가하는 양의 ANGPTL3 및 돌연변이체 구축물로 억제되었다. 생체외 GAG 방출 (매트릭스 손상의 지표) 억제 검정을 기재된 바와 같이 구축물의 존재하에 또는 부재하에 처리한 소 연골을 사용하여 수행하였다. 4B 및 4C: NO 방출은 표시된 바와 같이 점점 증가하는 양의 ANGPTL3 및 조작 구축물로 억제되었다. 연골세포를 기재된 바와 같이 구축물의 존재하에 또는 부재하에 처리하고, 뒤이어 그레이스(Greiss) 반응 검정을 수행하여 연골보호의 지표로서 NO 방출의 억제를 측정하였다.
도 5는 비대성 상태하에 구축물의 존재하에서 제X형 콜라겐 발현 (섬유성 연골 형성 활성의 지표)의 억제를 보여주는 그래프 표시를 도시한다. 1차 연골세포를 기재된 바와 같이 비대성 상태하에 구축물의 존재하에 또는 부재하에서 처리하고, 뒤이어 섬유성 및 비대성 연골의 형성/연골세포 분화의 측정으로서 면역형광에 의하여 평가한 제X형 콜라겐 발현의 측정을 행하였다. 5A는 야생형 C-말단 ANGPTL3 또는 조작 구축물의 결과를 도시한다. 5B는 C-말단 ANGPTL3 (WT) 또는 조작 구축물 242KQ 또는 242Kdel 또는 C-말단 ANGPTL1의 결과를 도시한다.
도 6은 투여 패러다임의 개략적인 표시 (6A), 뒤이어 대퇴골 외측과의 연골 미란 점수로 측정하여 마우스 ANGPTL3 (17-460)으로의 처리 후 관절 중증도 개선의 그래프 표시 (6B)를 도시한다.
도 7은 연골 손상의 외과적 유발 및 주1회 3주 동안 (제7일에 시작) ANGPTL3 구축물로의 후속 처리 뒤에 마우스에서의 인커패시턴스(incapacitance) 측정 (통증의 지표)의 그래프 표시이다. 7A는 수술한 뒤 제35일에서의 인커패시턴스 측정을 나타내고; 7B는 수술한 뒤 제56일에서 취한 측정을 나타낸다.
도 8은 ANGPTL3 구축물 (표시)의 주1회 3회 처리 (제7일, 제14일 및 제21일) 뒤에 마우스에서 콜라게나제에 의하여 유발된 연골 손상에 대한 관절 중증도 총 점수 및 중증도 개선의 그래프 표시이다.
도 9는 조작 ANGPTL3 구축물로의 처리 뒤에 관절 손상의 래트 반월판 파열 모델에서의 결과를 도시한다. 도 9A는 처리하고 5주 뒤 관절에서의 프로테오글리칸 함량의 그래프 표시이고; 도 9B는 처리하고 5주 뒤 대퇴골 관절 중증도 점수의 그래프 표시이다. 결과는 ANGPTL3 구축물 (표시)의 주1회 3회 처리 (제7일, 제14일 및 제21일) 뒤에 래트에서 반월판의 외과적 절단에 의하여 유발된 연골 손상에 대한 개선을 도해한다.
도 10은 조작 ANGPTL3 구축물로의 처리 뒤에 관절 손상의 래트 반월판 파열 모델에서의 결과를 도시한다. 도 10A는 중증도, 사프라닌 O 강도, 연골 면적 및 연골 두께로 측정하여 생체내 복구의 %의 그래프 표시이다. 도 10B는 연골 손상의 외과적 유발 및 후속 치료 뒤에 래트에서 인커패시턴스 측정 (통증의 지표)의 그래프 표시이다.
도 11은 제4일에 시작하여 주2회 투여 (각각 1.5 ㎍/용량 또는 15 ㎍/용량) 또는 오직 제7일에만 주어지는 단일 30 ㎍ 용량 투여 뒤에 개에서 내측 반월판의 외과적 붕괴에 의하여 유발된 연골 손상의 개선을 예시하기 위한 총합계 중증도 점수의 그래프 표시이다.
본 발명은, 적어도 부분적으로는, 중간엽 줄기 세포의 연골세포 분화를 자극하며, 프로테아제 (예를 들어, 트립신-유사 프로테아제)에 의한 절단에 내성인 안지오포이에틴-유사 3 (ANGPTL3) 폴리펩티드의 확인에 기반한다. WO2011/008773에서는 관절염과 관절 상해를 치료 또는 예방하기 위한 및 중간엽 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하기 위한 ANGPTL3 펩티드 조성물 및 펩티드 조성물의 용도를 기재하고 있다. 본 발명자들은 야생형 ANGPTL3 단백질이 프로테아제 클립핑(clipping) 및 불안정성에 노출되기 쉽다는 것을 발견하였으며 이러한 영향을 완화시킬 서열 변이체를 확인해 내었다. 본 발명은 따라서 연골 복구를 위한 개선된 펩티드 조성물을 제공한다. 특히, 야생형 ANGPTL3 폴리펩티드와 비교하여 증가된 프로테아제 내성을 갖도록 본 발명에 따라 변형된 ANGPTL3 펩티드가 제공된다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 관절, 연골 조직 또는 연골 근위 조직중으로 또는 전신적으로 투여함으로써 관절염 또는 관절 상해를 예방 또는 개선하기 위한 ANGPTL3 폴리펩티드의 투여를 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 추가로, 본 발명은 연골세포로의 중간엽 줄기 세포 분화 유도를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "프로테아제-내성"은 폴리펩티드를 상응하는 비-변형 야생형 폴리펩티드에 비하여 트립신-유사 프로테아제에 의한 절단에 덜 감수성이 되게 해주는 변형을 포함하는 폴리펩티드를 언급한다. 구체적 실시양태에서, 프로테아제-내성 폴리펩티드는 천연 야생형 펩티드 서열과 비교하여 R 또는 K 잔기에서 아미노산 치환을 가지는 ANGPTL3 폴리펩티드이다.
"ANGPTL3"은 안지오포이에틴 단백질 패밀리의 구성원을 언급한다. ANGPTL3의 아미노산 서열 (진뱅크 수탁번호 NP_055310.1)은 서열 1에 기재되어 있으며; 그의 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 2로서 기재되어 있다 (NCBI 참조 서열 번호 NM014495.2, 여기서 ANGPTL3 코딩 서열은 서열 2의 nt 52-1434를 포함한다). "ANGPTL3 폴리펩티드"는 자연 발생 발현된 폴리펩티드를 언급한다. 본원 개시의 목적상, 아미노산의 넘버링은 전형적으로는 전장 야생형 인간 ANGPTL3 폴리펩티드 서열 (서열 1)에 기준하여 결정된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드가 전장 ANGPTL3의 오직 C-말단 부분만을 함유하고 N-말단 부분은 함유하지 않는 실시양태에서, 비록 그 펩티드는 460개 미만의 아미노산 길이이지만, 위치의 넘버링은 서열 1에 기초한다. 예를 들어, 비록 본 발명의 ANGPTL3 폴리펩티드 자체는 200개 아미노산 길이에 불과할 수 있지만, 본 발명의 ANGPTL3 폴리펩티드의 위치 423에 대한 언급은 서열 1의 위치 423을 언급한다. 참조 서열, 예컨대 서열 1에서의 위치"에 상응하는" 관심 서열중 아미노산 측정시, 이는 서열을 예를 들어 디폴트 클러스탈(CLUSTAL) 정렬 파라미터 또는 디폴트 블라스트(BLAST) 2 정렬 파라미터를 사용하여 최적으로 정렬한 다음, 서열을 비교함으로써 수행된다. 예를 들어, "서열 1에 기준하여 측정되는" 관심 서열중 위치 423 또는 서열 1의 위치 423"에 상응하는" 아미노산은 관심 서열이 서열 1과 최적으로 정렬될 때 서열 1의 위치 423과 정렬하는 아미노산을 의미한다.
용어 "펩티드모방체" 및 "모방체"는 자연 발생 또는 비-자연 발생 폴리펩티드 (예를 들어, ANGPTL3)의 실질적으로 동일한 기능적 특징을 보유하지만 상이한 (비록 전형적으로는 유사하지만) 구조적 특징을 보유하는 합성 화합물을 언급한다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드의 것들과 유사한 특성을 지닌 비-펩티드 활성 화합물 (예를 들어, 약물)로서 그 분야에서 통용되고 있다. 그러한 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방체"로 지칭된다 (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); 및 Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). 치료상 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동등한 또는 증진된 치료 또는 예방 효과를 산출하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 관심 폴리펩티드에서 발견되는 바와 같이 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약리학적 활성을 보유하는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하며, 그러나 예를 들어 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의하여 임의로 치환된 1개 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 모방체는 전적으로 아미노산의 합성 비-천연 유사체로 구성될 수 있거나, 또는 부분적으로 천연 펩티드 아미노산과 아미노산의 부분적으로 비-천연 유사체의 키메라 분자이다. 모방체는 천연 아미노산 보존적 치환이 또한 그 모방체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한 그러한 천연 아미노산 보존적 치환의 어떠한 양도 또한 혼입할 수 있다. 예를 들어, 모방체 조성물은 ANGPTL3 폴리펩티드의 연골형성 활성을 발휘할 수 있으면 본 발명의 범위 안에 들어온다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 언급하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 그 용어는 자연 발생 아미노산 폴리머와 비-자연 발생 아미노산 폴리머에 뿐만 아니라 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 폴리머에도 적용된다. 본 발명의 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질은 연골형성 활성을 가진 프로테아제 내성 ANGPTL3 펩티드모방체를 포함한다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산과 합성 아미노산, 및 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체와 아미노산 모방체를 언급한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의하여 코딩된 것들, 및 추후에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학구조, 즉 수소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되는 탄소를 가지는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 언급한다. 그러한 유사체는 변형 R 기 (예를 들어, 노르루이신) 또는 변형 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학구조를 갖는다. 자연적으로 코딩된 아미노산은 20가지 일반 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 및 피로리신, 피롤린-카르복시-리신과 셀레노시스테인이다.
"보존적 변형 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 양쪽 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 관하여, 보존적 변형 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 그 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 언급한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의하여 특정되는 모든 위치에서, 그 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않고도 기재된 상응하는 코돈 중 어느 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적 변형 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 본원에서의 모든 폴리펩티드 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 포함한다. 통상의 기술자라면 핵산중의 각 코돈 (보통은 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 보통은 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 산출하도록 변형시킬 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에서 암묵적이다.
통상의 기술자라면 최초 코딩된 아미노산 서열에 관하여 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경하거나, 부가하거나 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가는 변경이 최초 단백질과 유사한 기능적 활성을 갖는 구조적으로 유사한 단백질을 산출하는 화학적으로 유사한 아미노산 및/또는 폴리펩티드 서열로의 아미노산 치환을 일으키는 "보존적 변형 변이체"를 가져온다는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 관련 기술분야에 주지이다. 그러한 보존적 변형 변이체는 그 외에 본 발명의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립 유전자이고 그들을 배제하지 않는다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 하나의 그러한 군으로부터의 아미노산을 동일 군으로부터의 상이한 아미노산으로 치환하는 것 (개념상으로 또는 딴 방법으로)을 언급한다. 치환의 일례는 동종 생물체의 상응하는 단백질간 아미노산 변화의 정규화 빈도 분석에 기초한다 (예를 들어 다음의 문헌 참조: Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). 그러한 분석에 따르면, 군 안의 아미노산이 우선적으로 서로와 교환되고, 따라서 전체적인 단백질 구조에 미치는 그들의 영향에 있어서 대부분 서로와 닮는 아미노산의 군이 정의될 수 있다 (예를 들어 다음의 문헌 참조: Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). 이러한 식으로 정의된 아미노산 군의 세트의 일례는 다음의 것들을 포함한다: (i) Glu와 Asp, Lys, Arg 및 His으로 이루어지는 전하를 띤 군; (ii) Lys, Arg 및 His으로 이루어지는 양전하를 띤 군; (iii) Glu 및 Asp으로 이루어지는 음전하를 띤 군; (iv) Phe, Tyr 및 Trp으로 이루어지는 방향족 군; (v) His 및 Trp으로 이루어지는 질소 고리 군; (vi) Val, Leu 및 Ile으로 이루어지는 대형 지방족 비극성 군; (vii) Met 및 Cys으로 이루어지는 약간 극성을 띠는 군; (viii) Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln 및 Pro으로 이루어지는 소형 잔기 군; (ix) Val, Leu, Ile, Met 및 Cys으로 이루어지는 지방족 군; 및 (x) Ser 및 Thr으로 이루어지는 소형 히드록실 군. 공유되는 물리적 특성에 기초한 보존적 치환의 다른 예는 하기 군 내에서의 치환이다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소루이신 (I), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 하기 문헌 참조: Creighton, Proteins (1984)).
"서열 동일성의 백분율"은 두 최적으로 정렬된 서열을 비교창 위에서 비교함으로써 측정되며, 여기서 두 서열의 최적 정렬에 대하여, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)과 비교하여 비교창에서의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하는 위치의 개수를 측정함으로써 매칭 위치의 개수를 구하고, 매칭 위치의 개수를 비교의 창에서의 위치의 총수로 나눈 다음, 결과에 100을 곱셈하여 서열 동일성의 백분율을 구함으로써 계산된다.
2종 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 관련해서 용어 "동일한" 또는 % "동일성"은 동일 서열인 2종 이상의 서열 또는 부분서열(subsequence)을 언급한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수작업 정렬과 육안검사로 측정하여 비교창, 또는 지정 영역에 걸쳐서 최대 대응성에 대하여 비교 및 정렬시, 두 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율 (즉, 특정된 영역에 걸쳐서, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐서 95% 동일성, 임의로는 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 가지는 경우에 두 서열은 "실질적으로 동일하다". 본 발명은 각각 본원에 예시된 폴리펩티드 (예를 들어, 서열 11 내지 42 중 어느 것)와 실질적으로 동일한 폴리펩티드, 및 관절염 또는 관절 상해의 치료 또는 예방을 위한 용도를 포함한 (그에 한정되지 않음) 그들의 용도를 제공한다. 임의로는, 핵산에 대하여, 동일성은 적어도 약 150 뉴클레오티드 길이인 영역에 걸쳐서 또는 보다 바람직하게는 300 내지 450개 또는 600개 또는 그 보다 많은 뉴클레오티드 길이인 영역, 또는 참조 서열의 전장에 걸쳐서 존재한다. 아미노산 서열에 대하여, 임의로는, 동일성은 적어도 약 50개 아미노산 길이인 영역에 걸쳐서 또는 보다 바람직하게는 100 내지 150개 또는 200개 또는 그 보다 많은 아미노산 길이인 영역, 또는 참조 서열의 전장에 걸쳐서 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로는 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 부분서열 좌표를 지정한 다음, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 이어서 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열 대비 시험 서열에 대한 % 서열 동일성을 계산해낸다.
본원에서 사용되는 "비교창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 한 서열이 연속한 위치의 동일한 개수의 참조 서열과 비교될 수 있는 50 내지 600개, 일반적으로 약 75 내지 약 200개, 보다 일반적으로는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 연속한 위치의 개수의 어느 하나의 세그멘트에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 주지이다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 (Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c)의 국소적 상동성 알고리즘에 의하여, 문헌 (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443)의 상동성 정렬 알고리즘에 의하여, 문헌 (Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)의 유사 방법에 대한 검색에 의하여, 이들 알고리즘 (GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터처리 실행에 의하여, 또는 수작업 정렬과 육안검사 (예를 들어 하기 문헌 참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995년 증보판))에 의하여 수행될 수 있다.
% 서열 동일성 및 서열 유사성의 측정에 적합한 알고리즘의 2가지 예는 블라스트(BLAST) 및 블라스트 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌 (Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) 및 문헌 (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)에 기재되어 있다. 블라스트 분석 수행을 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공적으로 입수가능하다. 당해 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값 역치 점수 T와 매칭되거나 또는 그를 충족하는, 조회(query) 서열에서의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열쌍 (HSP)을 먼저 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 언급된다 (Altschul et al., 상기 참조). 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 그들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾아내기 위한 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 단어 히트는 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해서는 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 포상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 벌점 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해서는, 득점행렬을 이용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로 단어 히트의 연장은 다음과 같을 때 정지된다: 누적 정렬 점수가 그것의 최대 달성치로부터 X의 양만큼 떨어질 때; 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 누적에 기인하여 누적 점수가 0 이하로 될 때; 또는 어느 한 쪽 서열의 말단에 도달될 때. 블라스트 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. 블라스트엔(BLASTN) 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열에 대해서는, 블라스트피(BLASTP) 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 및 10의 기대값 (E), 및 50의 BLOSUM62 득점행렬 (참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 정렬 (B), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 이용한다.
블라스트 알고리즘은 두 서열간 유사성의 통계적 분석을 또한 수행한다 (예를 들어 하기 문헌 참조: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). 블라스트 알고리즘에 의하여 제공된 유사성의 한 가지 척도는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간 매칭이 우연히 일어나게 될 확률의 표시를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 시험 핵산의 비교시에 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
핵산 또는 단백질에 적용될 때 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질이 그것이 자연 상태에서 회합되어 있는 다른 세포 성분이 본질적으로 들어있지 않도록 정제되는 것을 의미한다. 그것은 종종 균질 또는 거의 균질 상태로 있을 수 있다. 그것은 건조용액 또는 수용액 어느 한 쪽 상태로 있을 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 관련 기술분야에서 알려져 있고 사용되는 분석화학 기술, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 고-성능 액체 크로마토그래피 등을 이용하여 측정될 수 있다. 제제에 존재하는 우세 종인 단백질이 실질적으로 정제된다. 일부 실시양태에서 용어 "정제된"은 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 1개의 밴드를 생성하는 것을 의미한다. 전형적으로, 용어 "정제된"은 단백질이 적어도 85% 순도, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순도, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순도임을 의미한다.
용어 "히알루론산"은 히알루론산의 에스테르, 히알루론산의 염을 포함하고 또한 용어 "히알루로난"을 포함하는 히알루론산의 유도체를 포함하도록 본원에서 사용된다. 그 칭호는 히알루로난 및 가교결합 히알루로난 또는 하일란(hylan)의 저- 및 고-분자량 형태 양쪽 모두를 또한 포함한다. 그러한 히알루로난의 예는 신비스크(Synvisc)TM (겐자임 코포레이션(Genzyme Corp.), 미국 매사추세츠주 케임브리지), 오르토비스크(ORTHOVISC)TM (애니카 테라퓨틱스(Anika Therapeutics), 미국 매사추세츠주 워번), 하이얼갠(HYALGAN)TM (사노피-신텔라보 인코포레이티드(Sanofi-Synthelabo Inc.), 미국 펜실베이니아주 맬번), 및 프로비스크(ProVisc) (알콘/노바티스, Alcon/Novartis)이다.
당해 명세서와 첨부 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥상 별도로 명백히 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
안지오포이에틴 -유사 3 프로테아제-내성 폴리펩티드
안지오포이에틴-유사 3은 분비된 인자의 안지오포이에틴-유사 패밀리의 구성원이다. 안지오포이에틴-유사 3은 간에서 우세하게 발현되며, 신호 펩티드, N-말단 코일드-코일 도메인 (CCD) 및 C-말단 피브리노겐 (FBN)-유사 도메인으로 이루어지는, 안지오포이에틴의 특징적인 구조를 갖는다. 안지오포이에틴-유사 3은 αV/β3 인테그린에 결합하는 것으로 나타났으며, FBN-유사 도메인 단독으로도 내피세포 부착 및 생체내 혈관신생을 유도하기에 충분하였다 (Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277: 17281-17290, 2002). 내인성 ANGPTL3은 일반적으로는 생체내에서 아미노-말단 단편과 카르복시-말단 단편으로 절단된다. 상기 요약되고 본원에서 좀더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명은 연골형성 활성을 갖는 다양한 프로테아제 내성 ANGPTL3 단백질의 용도를 고려한다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표 1의 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 또는 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표 1의 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표 1의 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하며, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하고 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표 1의 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열이다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열이다.
<표 1>
ANGPTL3 변이체 구축물
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 변형 ANGPTL3 폴리펩티드는 폴리펩티드의 C-말단 부분에 폴리펩티드를 프로테아제-내성이 되게 해줄 적어도 1개의 치환을 갖는다. 치환은 폴리펩티드가 예를 들어 트립신-유사 프로테아제에 대하여 증가된 내성을 가지도록 R 또는 K 잔기에서 일어난다. 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드에서 R 또는 K는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제-내성 펩티드는 서열 1에 관하여 위치 423에서 K 또는 R과는 다른 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 위치 423에서 극성 아미노산인 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 위치 423에서의 아미노산은 Q 또는 S 또는 또 다른 극성 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 위치 423에서 Q를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 위치 423에서 S를 갖는다. 일부 실시양태에서, 423에서의 치환 이외에, 프로테아제 내성 펩티드는 서열 1 또는 그의 변이체의 C-말단에 또 다른 R 또는 K의 치환을 가지며, 여기서 치환은 R 또는 K 이외의 극성 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서의 치환은 Q 또는 S이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 250개 이하의 아미노산 길이이고, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 전장 프로테아제-내성 연골형성 ANGPTL3 단백질의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 ANGPTL3 서열 또는 그의 연골형성 변이체의 C-말단 부분을 포함하는 프로테아제-내성 ANGPTL3 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, ANGPTL3 단백질은 천연 단백질의 아미노-말단이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 단백질은 CCD 도메인이 결여되어 있고/있거나 유의한 CCD 활성이 결여되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 단백질은 적어도 인간 ANGPTL3 단백질 카르복시-말단 도메인의 단편 (예를 들어, 적어도 100, 150, 200, 220 또는 215개 연속한 아미노산), 또는 인간 카르복시-말단 ANGPTL3 단백질 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 및 그의 변이체는 연골형성 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 폴리펩티드는 적어도 C-말단 서열의 일부가 결여되어 있으며, 예를 들어 서열 1의 C-말단으로부터 5, 10, 15 또는 20개 아미노산이 결여되어 있다 (즉, 서열 1의 456-460, 451-460, 446-460 또는 441-460이 결여되어 있다).
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 다음의 아미노산 영역에 상응하는 연속한 아미노산을 포함한다: R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 단일 잔기가 결실되는, 서열 1의 아미노산 241-455 또는 241-460; 서열 1의 아미노산 242-455 또는 242-460; 서열 1의 아미노산 233-455 또는 233-460; 서열 1의 아미노산 228-455 또는 228-460, 서열 1의 아미노산 226-455 또는 226-260 또는 아미노산 225-455 또는 225-260. 일부 실시양태에서, 치환은 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 결실은 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 내성 폴리펩티드는 R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 단일 잔기가 결실되는 서열 1의 아미노산 영역 207-455 또는 207-460에 상응하는 연속한 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 위치 423에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 특정 실시양태에서, 서열 1에 관하여 위치 423에서의 결실이 포함된다.
본 발명은 프로테아제-내성 폴리펩티드를 추가로 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 1의 위치 423에 상응하는 아미노산에서 치환 또는 결실을 갖는 서열 1의 아미노산 240-454, 서열 1의 아미노산 241-455 또는 서열 1의 아미노산 242-455에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 치환된 아미노산은 R이 아니며, 여기서 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 240-454, 서열 1의 아미노산 241-455 또는 서열 1의 아미노산 242-455를 포함하며, 각각의 폴리펩티드는 서열 1의 위치 423에 상응하는 아미노산에서 치환 또는 결실을 가지며, 여기서 치환된 아미노산은 Q 또는 S이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K가 결실되는, 서열 1의 아미노산 242-455 또는 242-460; 서열 1의 241-455 또는 241-460; 서열 1의 아미노산 233-455 또는 233-460; 서열 1의 아미노산 228-455 또는 228-460, 서열 1의 아미노산 226-455 또는 226-260, 또는 서열 1의 아미노산 225-455 또는 225-260과 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 위치 423에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 특정 실시양태에서, 서열 1에 관하여 위치 423에 결실된 잔기가 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 250개 또는 240개 또는 그보다 적은 아미노산 길이이고, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 및 서열 70의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 230 또는 225개 또는 그보다 적은 아미노산 길이이고, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 단백질은 C-말단 개, 소 또는 말 ANGPTL3 단백질 서열에 대해 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 단백질은 적어도 천연 개 (서열 4), 말 (서열 5) 또는 소 (서열 6) ANGPTL3 단백질 서열의 단편 (예를 들어, 적어도 100, 150, 200, 215개 연속한 아미노산), 또는 천연 개, 소 또는 말 ANGPTL3 단백질 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하고, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 42 또는 서열 43과 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하며, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 42 또는 서열 43과 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 여기서 서열 1에 관하여 결정시에 폴리펩티드는 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하거나 또는 폴리펩티드는 위치 423에서 결실을 포함하며, 폴리펩티드는 연골형성 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 42 또는 서열 43을 포함한다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 42 또는 서열 43이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3은 R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K의 결실이 존재하는, 서열 4의 아미노산 232-454, 서열 4의 아미노산 240-454, 서열 4의 아미노산 227-454 또는 서열 4의 아미노산 224-454에 대해 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 서열 1의 위치 423에 상응하는 서열 4의 위치 422에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열 4의 위치 422에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3은 R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K의 결실이 존재하는, 서열 5의 아미노산 233-455, 서열 5의 아미노산 241-455, 서열 5의 아미노산 228-455 또는 서열 5의 아미노산 225-455에 대해 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 서열 1의 위치 423에 상응하는 서열 5의 위치 423에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열 5의 위치 423에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3은 R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K의 결실이 존재하는, 서열 6의 아미노산 233-455, 서열 6의 아미노산 241-455, 서열 6의 아미노산 228-455 또는 서열 6의 아미노산 225-455에 대해 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 서열 1의 위치 423에 상응하는 서열 6의 위치 422에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열 6의 위치 422에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 다음의 아미노산 영역에 상응하는 연속한 아미노산을 포함한다: R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K의 결실이 존재하는, 서열 4의 아미노산 240-454; 서열 4의 아미노산 232-454; 서열 4의 아미노산 227-454 또는 서열 4의 아미노산 224-454. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 (서열 1에 관하여 결정시에 위치 423인) 서열 4의 위치 422에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열 4의 위치 422에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 다음의 아미노산 영역에 상응하는 연속한 아미노산을 포함한다: R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K의 결실이 존재하는, 서열 5의 아미노산 241-455; 서열 5의 아미노산 233-455; 서열 5의 아미노산 228-455 또는 서열 5의 아미노산 225-455. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 (서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에 상응하는) 위치 423에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열 5의 위치 423에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드는 다음의 아미노산 영역에 상응하는 연속한 아미노산을 포함한다: R 또는 K가 어떤 아미노산으로 치환되거나 또는 R 또는 K의 결실이 존재하는, 서열 6의 아미노산 241-455; 서열 6의 아미노산 233-455; 서열 6의 아미노산 228-455 또는 서열 6의 아미노산 225-455. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실은 (서열 1에 관하여 결정시에 위치 423인) 서열 6의 위치 422에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 치환은 극성 아미노산, 예를 들어 H, N, Q, S, T, A 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 H, N, Q, S, T 또는 Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S 또는 Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q이다. 일부 실시양태에서, 서열 6의 위치 422에 결실이 존재한다.
전술한 바와 같은 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 전술한 영역을 플랭킹하는 천연 ANGPTL3 단백질 서열을 포함할 수 있다. 이와 달리, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 비-천연 ANGPTL3 단백질 플랭킹 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, ANGPTL3 단백질의 연골형성 활성 부분은 1종 이상의 융합 파트너 및/또는 이종 아미노산과 융합되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 융합 파트너 서열은 아미노산 태그, 생체내 반감기 및/또는 프로테아제 내성을 연장시키기 위한 비-L (예를 들어, D-) 아미노산 또는 다른 아미노산 모방체, 표적화 서열 또는 다른 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 PEG화된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 이종 펩티드에 융합된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민 (HSA), 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 폴리히스티딘, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 말토스 결합 단백질 (MBP), 또는 전술한 이종 폴리펩티드(들) 중 어느 것의 단편 중 어느 하나에 융합된다. 특정 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노-말단에서 융합된다. 추가의 또는 대안적인 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 카르복시-말단에서 융합된다.
본 발명의 ANGPTL3 단백질은 연골형성 활성을 가지며 프로테아제-내성이다. 본원에서 정의되는 바와 같이, 연골형성 또는 연골형성 활성은 MSC로부터 연골세포의 발생을 언급한다. 연골형성 활성의 지표는 연골 매트릭스 생산을 포함하며 그에 한정되지 않는다. 연골 매트릭스 생산은 다양한 마커, 예를 들어 예컨대 Sox9, 제II형 콜라겐 또는 글리코사미노글리칸 (GAG) 생산에 의하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, GAG 생산은 연골 매트릭스 생산에 대한 마커로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 연골-특이적 단백질 발현을 갖는 GAG 생산의 3배 증가는 양성 연골 매트릭스 생산을 표시한다.
폴리펩티드는 트립신과 같은 세린 프로테아제에 의한 절단을 측정하는 임의의 알려져 있는 검정을 이용하여 프로테아제 내성에 대하여 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질분해 감수성 평가에 이용되는 프로테아제는 세린 프로테아제 트립신이다. 폴리펩티드는 그것이 그것의 야생형 카운터파트와 비교될 때 트립신에 대한 감소된 민감도를 가질 경우 프로테아제-내성인 것으로 간주된다. 검정의 일례는 상응하는 천연 인간 펩티드와 비교하여, 폴리펩티드가 일정기간에 걸쳐서 트립신에 노출될 때 생성되는 절단 생성물의 양을 측정하는 것이다. 절단은 임의의 알려져 있는 검정, 예를 들어 SDS PAGE 또는 LCMS를 이용하여 측정될 수 있다. 예시적인 검정이 실시예 섹션에 제공되어 있다.
예시적인 검정에서, 트립신처리분해에 의한 제한된 단백질분해는 평가할 10 ng의 단백질을 트립신과 8000:1 (단백질:트립신)의 질량비로 1 h 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 수행된다. 이어서 트립신처리분해 반응은 반응을 pH 3.0으로 가져오도록 아세트산의 첨가에 의하여 켄칭될 수 있다. 이어서 켄칭된 샘플은 SDS-PAGE에 의하여, 예를 들어 4-12% 트리스-비스(Tris-Bis) 겔 상에서 분리 분석하여, 트립신 절단에 의하여 생성되는 단편의 출현에 의하여 절단되는 것들로부터 절단에 내성인 단백질을 확인한다. 절단 생성물에는 그들의 야생형 카운터파트와 비교하여 프로테아제-내성 폴리펩티드가 부재하거나 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 폴리펩티드는 적어도 1개의 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4개 또는 그 보다 많은 비-천연 아미노산을 포함한다. 비-자연 발생 아미노산을 제조하여 단백질중으로 도입하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어 미국 특허 7,083,970; 및 7,524,647을 참조한다. 1개 이상의 목적하는 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질의 제조에 적합한 직교 번역 시스템의 생성을 위한 일반 원리는 직교 번역 시스템을 생성하는 일반 방법이 그러한 것처럼 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 다음의 국제 공개 참조: WO 2002/086075, 발명의 명칭 "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"; WO 2002/085923, 발명의 명칭 "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"; WO 2004/094593, 발명의 명칭 "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"; WO 2005/019415, 출원일: 2004년 7월 7일; WO 2005/007870, 출원일: 2004년 7월 7일; WO 2005/007624, 출원일: 2004년 7월 7일; WO 2006/110182, 출원일: 2005년 10월 27일, 발명의 명칭 "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS" 및 WO 2007/103490, 출원일: 2007년 3월 7일, 발명의 명칭 "SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS". 비-천연 아미노산을 혼입하는 직교 번역 시스템, 및 그들의 생성 및 사용 방법의 논의에 대해서는, 또한 다음의 문헌들 참조: Wang and Schultz, (2005) "Expanding the Genetic Code." Angewandte Chemie Int Ed 44: 34-66; Xie and Schultz, (2005) "An Expanding Genetic Code." Methods 36: 227-238; Xie and Schultz, (2005) "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire." Curr Opinion in Chemical Biology 9: 548-554; and Wang, et al., (2006) "Expanding the Genetic Code." Annu Rev Biophys Biomol Struct 35: 225-249; Deiters, et al., (2005) "In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524; Chin, et al., (2002) "Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli." J Am Chem Soc 124: 9026-9027; 및 국제 공개 WO2006/034332, 출원일: 2005년 9월 20일. 추가의 세부사항은 미국 특허 7,045,337; 7,083,970; 7,238,510; 7,129,333; 7,262,040; 7,183,082; 7,199,222; 및 7,217,809에서 찾아볼 수 있다.
"비-자연적으로 코딩된 아미노산"은 일반 아미노산 중의 하나가 아닌 아미노산 또는 피로리신, 피롤린-카르복시-리신 또는 셀레노시스테인을 언급한다. 용어 "비-자연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-천연 아미노산", "비-천연 아미노산", "비-자연 발생 아미노산" 및 그들의 다양하게 하이픈 연결한 및 비-하이픈 연결한 버전이다. 용어 "비-자연적으로 코딩된 아미노산"은 자연적으로 코딩된 아미노산 (20가지 일반 아미노산 또는 피로리신, 피롤린-카르복시-리신 및 셀레노시스테인을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 변형 (예를 들어, 번역후 변형)에 의하여 발생하지만 그들 자신은 번역 복합체에 의하여 성장 폴리펩티드 쇄중으로 자연적으로는 혼입되지 않는 아미노산을 또한 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러한 비-자연 발생 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
비-자연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로는 20가지 천연 아미노산에 사용되는 것과는 다른 임의의 치환기 측쇄를 가지는 임의 구조이다. 본 발명의 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로는 측쇄의 구조에서만 천연 아미노산과 상이하기 때문에, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은, 아미드 결합이 자연 발생 폴리펩티드에서 형성되는 동일한 방식으로, 자연적으로 또는 비-자연적으로 코딩된 아미노산을 포함한 (이에 제한되지 않음) 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 그들을 천연 아미노산과 구별시켜 주는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들어, R은 임의로는 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 술포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노 기 등 또는 그들의 임의 조합을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 다른 관심 비-자연 발생 아미노산은 광활성화가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규 작용기가 달린 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비-공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징 및/또는 광이성체화가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 예컨대 당-치환 세린, 다른 탄수화물-변형 아미노산, 케토-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자-치환 아미노산, 화학적으로 절단가능하고/하거나 광절단가능한 아미노산, 약 5개보다 많거나 또는 약 10개보다 많은 탄소를 포함하는 (이에 제한되지 않음) 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소를 포함하여 (이에 제한되지 않음) 천연 아미노산과 비교하여 연장된 측쇄를 가지는 아미노산, 탄소-결합 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산-함유 아미노산, 및 1종 이상의 독성 모이어티를 포함하는 아미노산을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기에 적합할 수 있고 수용성 폴리머와의 반응에 유용한 예시적인 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 갖는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-자연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 모이어티를 포함한다. 그러한 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 그러한 아미노산의 예는 아미노산과 사카라이드간 자연 발생 N- 또는 O-결합이 -- 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함한 (이에 제한되지 않음) 자연에서는 일반적으로 발견되지 않는 공유결합에 의하여 치환되는 예들을 또한 포함한다. 그러한 아미노산의 예는 자연 발생 단백질에서는 일반적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예컨대 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 또한 포함한다.
본 발명의 ANGPTL3 단백질중으로 (예를 들어, 폴리펩티드 쇄 안에 또는 N- 또는 C-말단에) 임의로 도입될 수 있는 변형의 또 다른 유형은, 예를 들어 생체내 반감기를 연장하기 위해서는, 장쇄 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG)의 PEG화 또는 혼입이다. PEG 또는 PEG의 장쇄 폴리머 도입은 당해 폴리펩티드의 유효 분자량을 증가시켜 예를 들어 소변중으로의 급속 여과를 방지한다. 일부 실시양태에서, ANGPTL3 서열중 리신 잔기는 PEG에 직접 또는 링커를 통해 접합된다. 그러한 링커는 예를 들어 적당하게 변형된 PEG 쇄에의 결합을 위한 티올 작용기를 함유하는 아실 잔기 또는 Glu 잔기 일 수 있다. PEG 쇄를 도입하기 위한 대안적인 방법은 먼저 C-말단에 또는 Arg 또는 Lys 잔기에 대한 대체물과 같은 용매-노출 잔기에 Cys 잔기를 도입하는 것이다. 당해 Cys 잔기는 이어서 예를 들어 말레이미드 작용기를 함유하는 PEG 쇄에 부위-특이적으로 부착된다. PEG 또는 PEG의 장쇄 폴리머를 혼입하는 방법은 관련 기술분야에 주지이다 (예를 들어, 수록 내용이 본원에 참조로 포함되는 다음의 문헌에 기재: Veronese, F. M., et al., Drug Disc. Today 10: 1451-8 (2005); Greenwald, R. B., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 217-50 (2003); Roberts, M. J., et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 459-76 (2002)). 관련 기술분야에 알려진 폴리머 접합의 다른 방법 역시도 본 발명에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) (PMPC)은 본 발명의 ANGPTL3 단백질과의 폴리머 접합체로서 도입된다 (예를 들어, WO2008/098930; Lewis, et al., Bioconjug Chem., 19: 2144-55 (2008) 참조). 일부 실시양태에서, ANGPTL3 단백질과의 포스포릴콜린-함유 폴리머 접합체가 본 발명에 사용될 수 있다. 통상의 기술자라면 다른 생체적합성 폴리머 접합체가 이용될 수 있음을 손쉽게 인식할 것이다.
비-천연 아미노산 (전술한 바와 같은)의 혼입을 통해 PEG 또는 PEG 폴리머를 혼입하기 위한 보다 최근에 보고된 대안적인 접근법은 당해 폴리펩티드를 가지고서 수행될 수 있다. 당해 접근법은 진화된 tRNA/tRNA 신세타제 쌍을 이용하며 발현 플라스미드에서 앰버 서프레서 코돈에 의하여 코딩된다 (Deiters, A, et al., (2004). Bio-org. Med. Chem. Lett. 14, 5743-5). 예를 들어, p-아지도페닐알라닌을 당해 폴리펩티드중으로 혼입시키고 이어서 환원제와 구리 이온의 존재하에서 아세틸렌 모이어티를 갖는 PEG 폴리머와 반응시켜 "후이스겐(Huisgen) [3+2] 시클로첨가"로 알려져 있는 유기 반응을 촉진시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경하기 위한 ANGPTL3 단백질의 특정 돌연변이를 또한 고려한다. 그러한 돌연변이는 O-결합형 또는 N-결합형 글리코실화 부위를 포함한 (이에 제한되지 않음) 1개 이상의 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하도록 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 ANGPTL3 단백질은 자연 발생 ANGPTL3 단백질과 비교하여 변경되지 않은 글리코실화 부위 및 패턴을 갖는다. 특정 실시양태에서, ANGPTL3 단백질의 변이체는 자연 발생 ANGPTL3 단백질과 비교하여 글리코실화 부위의 개수 및/또는 유형이 변경된 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 변이체는 천연 폴리펩티드와 비교하여 보다 많거나 보다 적은 개수의 N-결합형 글리코실화 부위를 포함한다. N-결합형 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 특징으로 하며, 여기서 X로서 표시된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 당해 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-결합형 탄수화물 쇄의 첨가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 이와 달리, 당해 서열을 제거하는 치환은 기존 N-결합형 탄수화물 쇄를 제거할 것이다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 N-결합형 글리코실화 부위 (전형적으로는 자연 발생하는 것들)가 제거되고 1개 이상의 새로운 N-결합형 부위가 생성되는 N-결합형 탄수화물 쇄의 재배열이 제공된다.
예시적인 ANGPTL3 단백질 변이체는 자연 발생 ANGPTL3 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 1개 이상의 시스테인 잔기가 또 다른 아미노산 (예를 들어, 세린)으로부터 결실되거나 또는 그를 치환하는 시스테인 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, ANGPTL3 단백질이 예컨대 불용성 봉입체의 단리 후에 생물학적 활성 입체구조로 다시 접혀져야 될 때 시스테인 변이체는 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스테인 변이체는 천연 폴리펩티드에 비해 보다 적은 수의 시스테인 잔기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 시스테인 변이체는 짝을 이루지 않은 시스테인으로부터 생기는 상호작용을 최소화하기 위하여 짝수개의 시스테인 잔기를 갖는다.
일부 실시양태에서, ANGPTL3 단백질의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 본 발명의 ANGPTL3 단백질과 1종 이상의 융합 도메인의 융합 단백질을 포함한다. 융합 도메인의 잘 알려진 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP), 및/또는 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 융합 도메인 또는 그의 단편은 목적하는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화도 정제의 목적상, 친화성 크로마토그래피를 위한 적절한 매트릭스, 예컨대 글루타티온-, 아밀라제- 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지가 사용된다. 다수의 그러한 매트릭스는 파마시아 지에스티 (Pharmacia GST) 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너와 유용한 큐엘에이익스프레스(QLAexpress)TM 시스템 (카이아진, Qiagen)과 같이 "키트" 형태로 이용가능하다. 또 다른 예로서, 융합 도메인은 ANGPTL3 단백질의 검출을 촉진하도록 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예는 특정 항체가 이용가능한 일반적으로 길이가 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"뿐만 아니라 다양한 형광 단백질 (예를 들어, GFP)도 포함한다. 특정 모노클로날 항체가 쉽사리 이용가능한 주지의 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 융합 도메인은 적절한 프로테아제로 하여금 융합 단백질을 부분적으로 소화하도록 해주고 그리하여 그로부터 재조합 단백질을 유리시키게 해주는 프로테아제 절단 부위, 예컨대 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 이어서 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의하여 융합 도메인으로부터 단리시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, ANGPTL3 단백질은 생체내에서 ANGPTL3 단백질을 안정화시키는 도메인 ("스태빌라이저" 도메인)과 융합된다. "안정화시키는"이란 혈청 반감기 증가가 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 클리어런스 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 여부에 관계 없이 혈청 반감기를 증가시키는 무언가를 의미한다. 이뮤노글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위의 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 융합 도메인의 다른 유형은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (소망에 따라, 추가의 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인을 포함한다. 융합체는 이종 펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 말단에서 및/또는 본 발명의 폴리펩티드의 카르복시 말단에서 융합되도록 구축될 수 있다.
안지오포이에틴 -유사 3 프로테아제-내성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
본 발명은 본 발명의 프로테아제-내성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 프로테아제 내성 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 벡터와 숙주 세포를 또한 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서의 발현에 최적화된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 환자의 관절에 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 그 결과 폴리펩티드의 발현이 환자에서 관절염 또는 관절 손상을 개선 또는 예방하는, 인간 환자에서 관절염 또는 관절 상해를 개선 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 관절염 또는 관절 상해를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염 또는 관절 상해를 갖지는 않지만 그에 대한 위험에 처해 있다. 일부 실시양태에서, 관절염은 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염이다.
본 발명 폴리펩티드의 발현은 재조합 유전학 분야에서의 일상적인 기술을 이용한다. 본 발명에서의 일반적인 사용 방법을 개시하는 기본 텍스트는 관련 기술분야에 알려진 많은 가운데 다음의 것들을 포함한다: Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007, 2010년까지 업데이트되었음) Current Protocols in Molecular Biology.
발현은 관련 기술분야에 알려진 임의의 적당한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등을 이용할 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템 양쪽 모두 널리 이용가능하다. 일부 실시양태에서, 발현 시스템은 포유동물 세포 발현, 예컨대 CHO 세포 발현 시스템이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 목적하는 숙주 세포에서의 발현을 촉진하도록 코돈-최적화될 수 있다.
비-바이러스성 벡터 및 시스템은 플라스미드 및 에피솜 벡터, 전형적으로는 단백질을 발현시키기 위한 발현 카세트 또는 RNA, 및 인간 인공 염색체를 포함하는 그들 플라스미드 및 에피솜 벡터를 포함한다 (예를 들어, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997 참조). 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 유용한 비-바이러스성 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3. I/His, pEBVHis A, B & C (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현시키기 위한 관련 기술분야에 알려진 다수의 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 아데노바이러스에 기반한 벡터, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, SV40에 기반한 벡터, 파필로마 바이러스, HBP 엡스타인 바르 바이러스, 계두 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현될 예정인 의도되는 숙주 세포에 좌우된다. 전형적으로는, 발현 벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 프로모터 및 그 밖의 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 유도 상태하에서를 제외하고는 삽입 서열의 발현을 방지하기 위하여 유도성 프로모터가 이용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 향상시키기 위하여 다른 조절 요소, 예를 들어 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 서열 등이 또한 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 그 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되도록 분비 신호 서열을 코딩하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 그러한 서열은 벡터에 의하여, 또는 벡터에 존재하는 ANGPTL3 핵산의 일부로서 제공될 수 있다.
목적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다양하다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 원핵생물 세포에 통용되고, 반면에 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다 (일반적으로 Sambrook et al., 상기 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개성 형질전환, 주입 및 미세주입, 충격 방법, 바이로솜, 이뮤노리포솜, 폴리양이온: 핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에의 융합, DNA의 작용제-증진 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기 고-수율 생산을 위해서는 안정적인 발현이 종종 소망될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 세포주는 복제의 바이러스 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로테아제-내성 ANGPTL3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 관절-관련 상해 또는 질환의 치료를 위한 환자에 전달될 수 있다. 그러한 핵산의 전달은 관련 기술분야에 알려진 임의의 수단을 이용하여 달성될 수 있지만, 전형적으로는 환부 관절중으로의 직접 주사를 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, DNA는 관절중으로의 직접 주사를 이용하여 네이키드 DNA로서 전달된다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스-연관 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 계두 바이러스 또는 백시니아 바이러스 벡터를 포함한 (이에 제한되지 않음) 바이러스 벡터가 이용된다.
폴리펩티드의 치료적 사용 방법, 및 적응증
본 발명의 제공된 방법은 치료 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 관절 손상 또는 관절염을 갖거나 그의 위험에 처해 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 환자의 관절에 투여하고, 그에 따라 환자에서 관절염 또는 관절 상해를 개선하거나 또는 예방하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 관절염 또는 관절 상해를 개선 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 관절염 또는 관절 상해를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염 또는 관절 상해를 갖지는 않지만 그에 대한 위험에 처해 있다. 일부 실시양태에서, 관절염은 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 조성물은 히알루론산을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포를 본 발명의 폴리펩티드의 충분량과 접촉시켜 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체내에서 수행되며, 줄기 세포는 인간 환자에 존재한다.
본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 예를 들어 외상성 사고나 건 또는 인대 파열로부터 발생하는 손상을 포함한 관절 연골 손상 (예를 들어, 관절 손상 또는 상해)의 임의의 유형을 치료, 개선 또는 예방하는 데에 사용될 수 있음이 고려된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 예를 들어 관절염 또는 관절 손상 또는 관절 상해의 유전력 또는 가족력이 존재하는 경우 또는 관절 수술 전이나 도중에 관절염 또는 관절 손상을 예방하거나 또는 개선하기 위하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 관절 손상의 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, 관절 손상은 외상성 관절 상해이다. 다른 실시양태에서, 관절 손상은 고령 또는 비활동으로부터 발생하는 손상이다. 또 다른 실시양태에서, 관절 손상은 자가면역 장애로부터 발생하는 손상이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 골관절염의 치료, 개선 또는 예방에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 관절염을 보유하거나 또는 획득할 위험에 처한 대상체에서 관절염의 개선 또는 예방에 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 관절 손상을 보유하거나 또는 획득할 위험에 처한 대상체에서 관절 손상의 개선 또는 예방에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 예를 들어 외상성 상해 또는 연골병증에 기인하여 손상을 입은 연골조직에서 연골세포 증식 및 연골 생산을 자극하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 관절에서, 예를 들어 관절표면, 예를 들어 척주, 어깨, 팔꿈치, 손목, 손가락, 궁둥이, 무릎, 발목의 관절, 및 발의 관절에서 연골 손상의 치료에 유용하다. 치료로부터 이익을 받을 수 있는 질환 또는 장애의 예는 골관절염, 류머티스성 관절염, 다른 자가면역 질환, 또는 박리성 골연골염을 포함한다. 또한, 연골 손상 또는 붕괴는 특정 유전 장애 또는 대상 장애의 결과로서 발생하고, 연골 기형은 종종 인간에서 왜소발육증의 형태로 발견되고/되거나 연골 손상 또는 붕괴는 종종 재건수술의 결과이며; 따라서 단독으로든 또는 다른 접근법과 관련하여서든 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 이들 환자에서 유용한 요법일 것이다.
본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 다양한 연골 장애 및/또는 그러한 병태의 관련 증상 또는 영향을 치료, 개선 또는 예방하는 데 사용될 수 있음이 추가로 고려된다. 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법으로의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 예시적인 병태 또는 장애는 전신 홍반성 루푸스, 류머티스성 관절염, 연소기 만성 관절염, 골관절염, 퇴행성 디스크 질환, 척추관절병증, 엘러스-단로스(Ehlers Danlos) 증후군, 전신 경화증 (경피증) 또는 건 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 관련 영향의 개선을 위한 폴리펩티드로의 치료로부터 이익을 받을 수 있는 다른 병태 또는 장애는 특발성 염증성 근질환 (피부근염, 다발근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이도시스, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작 야간 혈색뇨증), 자가면역 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소 자색반병, 면역-매개성 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 연소기 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역-매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성 신염), 중추신경계와 말초신경계의 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랭-바레 증후군과 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 간담도계 질환, 예컨대 전염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 다른 비-간 친화성 바이러스), 자가면역 만성 활동성 간염, 원발성 답즙성 간경변증, 육아종성 간염과 경화성 담관염, 염증성 장 질환 (궤양성 결장염: 크론병), 글루텐-과민성 장질환, 및 위플병, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반과 접촉 피부염을 포함한 자가면역 또는 면역-매개성 피부 질환, 건선, 알레르기성 질환, 예컨대 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 식품과민증과 두드러기, 폐의 면역학적 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증과 과민성 폐렴, 이식편거부와 이식편대숙주질환을 포함한 이식-관련 질환을 포함한다.
본원에서 사용되는 "환자"는 본 발명의 치료 폴리펩티드가 투여되는 임의의 대상체를 언급한다. 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법이 포유동물의 치료에 사용될 수 있음이 고려된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 인간, 가축, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 소 (예를 들어, 암소), 말, 개, 양, 돼지, 토끼, 염소, 고양이 등을 포함한 임의의 포유동물을 언급한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 말이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 개이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 치료받을 포유동물에 대하여 이종일 수 있다. 예를 들어, 인간 ANGPTL3 단백질 또는 그의 단편, 인간 ANGPTL3 단백질로부터 유래한 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 변형 인간 ANGPTL3 단백질, 인간 ANGPTL3 단백질의 보존적 변이체, 인간 ANGPTL3 단백질로부터 유래한 펩티드모방체)는 동물, 예컨대 말, 소 또는 개의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 이종 ANGPTL3 단백질은 이식을 위해 배양으로 연골세포 집단을 팽창시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이어서 팽창 배양물은 임의로는 치료받을 포유동물에 대하여 동종인 폴리펩티드 및 조성물과 혼합될 것이고, 관절강에 또는 직접 연골 결손중으로 넣어지게 될 것이다. 이와 달리, 본 발명의 폴리펩티드는 동일 종, 즉 인간 ANGPTL3 단백질 또는 그의 단편으로부터 유래되며, 인간 ANGPTL3 단백질로부터 유래한 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 변형 인간 ANGPTL3 단백질, 인간 ANGPTL3 단백질의 보존적 변이체, 인간 ANGPTL3 단백질로부터 유래한 펩티드모방체)는 인간 환자의 치료에 사용된다. 치료되는 바와 동일한 종의 포유동물로부터 유래된 단백질을 사용함으로써, 부주의에 의한 면역반응이 회피될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 단독으로 또는 단백질의 지속방출을 위한 적합한 담체와 복합체를 이루어 관절의 윤활액 중으로, 전신 투여 (경구 또는 정맥내) 또는 직접 연골 결손중으로의 직접 주사에 의하여 적용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 조성물은 생체적합성 매트릭스 또는 스캐폴드 중에서 투여된다. 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 환부 관절에서의 외과적 처치와 병용하여 또한 사용될 수 있다. 본 발명 폴리펩티드의 투여는 외과적 처치 전에, 그 도중에 또는 그와 병용하여, 및/또는 외과적 처치 후에 일어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 자가 또는 동종이계 연골세포 이식 (ACI)을 위해 배양으로 연골세포 집단을 팽창시키는 데 사용될 수 있다. 연골세포는 임의로는 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물의 투여로 이루어지는 병용요법으로 이식될 수 있다. 이들 절차에서, 예를 들어 연골세포는 손상 관절의 상해를 입지 않은 작은 하중부담 영역으로부터 관절경검사로 수확될 수 있으며, 시험관내에서 임의로는 본 발명의 폴리펩티드와 조성물 및/또는 다른 성장인자의 존재하에서 배양시켜 이식에 앞서 세포수를 증가시킬 수 있다. 이어서 팽창 배양물을 임의로는 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물과 혼합시키고/시키거나 관절강에 또는 직접 결손중으로 넣는다. 특정 실시양태에서, 팽창 배양물 (임의로는 본 발명의 폴리펩티드와 더불어)을 매트릭스 또는 멤브레인에 현탁시킨 관절강에 넣는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 연골-형성 세포를 함유하고/하거나 이식한 연골세포 또는 연골세포 전구체 세포를 적소에 붙잡아 두도록 돕는 1개 이상의 골막 또는 연골막 이식편과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 관절 세척, 골수 자극, 연마관절성형술, 연골하 천공술, 또는 근위 연골하골의 미세골절을 포함한 (이에 제한되지 않음) 다른 처치와 병용하여 연골 손상의 복구에 사용된다. 임의로는, 본 발명 폴리펩티드와 조성물의 투여 및 연골의 성장 뒤에는 추가의 외과적 치료가 새로 형성된 연골 표면(들)을 적절하게 윤곽을 그리는 데 유익할 수 있다.
제약 조성물
제공된 폴리펩티드를 포함하는 치료 조성물은 본 발명의 범위 안에 있으며, 증진된 안정성 및 프로테아제 내성을 보이는 몇몇 폴리펩티드 서열의 확인에 비추어 구체적으로 고려된다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 히알루론산 또는 그의 유도체를 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 환자의 관절에 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하고, 그에 따라 환자에서 관절염 또는 관절 상해를 개선하거나 또는 예방하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 관절염 또는 관절 상해를 개선 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 관절염 또는 관절 상해를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 관절염 또는 관절 상해를 갖지는 않지만 그에 대한 위험에 처해 있다. 일부 실시양태에서, 관절염은 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염이다. 일부 실시양태에서, 투여된 조성물은 히알루론산을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포를 본 발명의 폴리펩티드의 충분량과 접촉시켜 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체내에서 수행되며, 줄기 세포는 인간 환자에 존재하며, 접촉은 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 환자의 관절에 투여하고, 그에 따라 줄기 세포에서 연골세포로의 분화 및 연골의 생성을 유도하는 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 치료 조성물은 관절-관련 상해 또는 질환의 치료를 위한 환자에 전달될 수 있으며, 또한 본 발명의 범위 안에 들어온다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 네이키드 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터가 전달의 실행에 사용되며, 제약 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스-연관 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 계두 바이러스 또는 백시니아 바이러스 벡터를 포함하여 (이에 제한되지 않음), 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함한다. 제약 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 치료 유효량을 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체와 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 관절 손상의 치료용 의약으로서 사용하기 위한 제공된 폴리펩티드가 고려된다. 특정 실시양태에서, 관절염 또는 관절 손상의 개선용 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관절염은 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염이다. 일부 실시양태에서, 관절 손상은 외상성 관절 상해, 자가면역 손상, 고령-관련 손상 또는 비활동에 관련된 손상이다. 다른 실시양태에서, 의약에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제공된다.
투여에 적합한 제제는 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 그 제제를 등장성이 되게 해주는 용질을 함유할 수 있는, 수용액과 비-수용액, 등장성 멸균 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제와 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한 (이에 제한되지 않음) 부형제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 투여 방식, 전달 포맷 및 목적하는 투여량과의 적합성에 대하여 선택된 제약상 허용되는 제제화제와 혼합 상태로 펩티드의 치료 유효량을 포함한다. 예를 들어 하기 문헌 참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) 및 동서의 후속판. 제약 조성물중 1차 비히클 또는 담체는 사실상 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 주사용의 적합한 비히클 또는 담체는 임의로는 비경구 투여용 조성물에 공통인 기타 물질로 보충한 물, 생리학적 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 예를 들어, 완충제는 예를 들어 조성물을 생리학적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로는 약 pH 5 내지 약 pH 8의 범위 안에서 유지시키는 데 사용될 수 있으며, 소르비톨, 혈청 알부민, 세제 또는 다른 추가의 성분을 임의로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물은 적당한 부형제 (예를 들어, 수크로스)를 사용하여 동결건조 형태로의 저장용으로 제조될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 제어 방출 또는 지속 방출을 제공하는 작용제, 예컨대 주사가능한 미세소구, 생체침식성 입자, 폴리머 화합물, 비드, 또는 리포솜 또는 다른 생체적합성 매트릭스와의 제제는 이어서 데포 주사를 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 리포솜에 캡슐화될 수 있거나, 또는 미립자 또는 마이크로캡슐로서 제제화될 수 있거나 또는 다른 비히클, 예컨대 생분해성 폴리머, 히드로겔, 시클로덱스트린 (예를 들어 다음의 문헌들 참조: Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., 국제 PCT 공개 WO 03/47518 및 WO 03/46185), 폴리(락틱-코-글리콜릭)산 (PLGA) 및 PLCA 미세소구 (예를 들어 다음의 문헌들 참조: 미국 특허 6,447,796 및 미국 특허 출원 공개 US 2002130430), 생분해성 나노캡슐 및 생체접착성 미세소구중으로, 또는 단백질성 벡터에 의하여 (O'Hare and Normand, 국제 PCT 공개 WO 00/53722) 또는 접합체의 사용에 의하여 혼입될 수 있다. 또 다른 적합한 전달 메카니즘은 이식가능한 전달 장치를 포함한다.
전술한 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 발명 화합물의 용량은 투여 방식, 대상체의 연령 및/또는 체중과 치료할 대상체의 상태에 따라 다양하고, 궁극적으로는 담당 의사 또는 수의사에 의하여 결정될 것이다. 본 발명의 맥락에서 대상체에게 투여된 용량은 시간 경과에 따라 대상체에서 유익한 반응을 성취하기에 충분하여야 한다. 그러한 용량은 "치료 유효량"이다. 따라서, 적당한 용량은 사용되는 특정 단백질 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 효능과 대상체의 상태, 및 체중 또는 치료하고자 하는 영역의 표면적에 의하여 결정될 수 있다. 용량의 크기는 특정 대상체에서 특정 단백질 또는 벡터의 투여에 수반하여 일어나는 어떤 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의하여 또한 결정될 것이다. 투여는 단회 또는 분복 용량을 통해서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 달성될 수 있다. 투여 빈도는 사용된 제제중 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 약동학적 파라미터에 좌우될 것이다. 임상의는 투여량을 적정하고/하거나 투여를 변형하여 목적하는 치료 효과를 달성할 수 있다. 전형적인 투여량은 여러 요인에 따라 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 범위이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg까지; 또는 약 0.1 ㎍/kg; 약 0.5 ㎍/kg; 약 1 ㎍/kg; 약 2 ㎍/kg; 약 5 ㎍/kg; 약 10 ㎍/kg; 약 15 ㎍/kg; 약 20 ㎍/kg; 약 25 ㎍/kg; 약 30 ㎍/kg; 약 35 ㎍/kg; 약 40 ㎍/kg; 약 45 ㎍/kg; 약 50 ㎍/kg; 약 55 ㎍/kg; 약 60 ㎍/kg; 약 65 ㎍/kg; 약 75 ㎍/kg; 약 85 ㎍/kg; 약 100 ㎍/kg 범위이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 50 ㎍/kg; 약 100 ㎍/kg; 약 150 ㎍/kg; 약 200 ㎍/kg; 약 250 ㎍/kg; 약 300 ㎍/kg; 약 350 ㎍/kg; 약 400 ㎍/kg; 약 450 ㎍/kg; 약 500 ㎍/kg; 약 550 ㎍/kg; 약 600 ㎍/kg; 약 650 ㎍/kg; 약 700 ㎍/kg; 약 750 ㎍/kg; 약 800 ㎍/kg; 약 850 ㎍/kg; 약 900 ㎍/kg; 약 950 ㎍/kg; 약 1 mg/kg; 약 2 mg/kg; 약 3 mg/kg; 약 4 mg/kg; 약 5 mg/kg; 약 6 mg/kg; 약 7 mg/kg; 약 8 mg/kg; 약 9 mg/kg; 약 10 mg/kg이다.
투여 방법
단백질 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 환부 관절에 전달하는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에서, 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 주사, 예를 들어 관절내 (즉, 관절중으로), 정맥내, 근육내, 피하 주사; 주입 또는 이식, 예를 들어 멤브레인, 매트릭스, 장치 등에 넣어 주입 또는 이식될 수 있다. 주사, 주입 또는 이식하는 경우, 전달은 적합한 조직 또는 관절중으로 지향될 수 있고, 전달은 직접 볼루스 전달 또는 연속 전달일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달은 환부 관절에 매우 근접하여 위치한 적합한 조직에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달은 확산을 통해서 또는 서방 볼루스를 통해서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 제어 방출 시스템 (예를 들어, 펌프)은 치료 표적, 예를 들어 폴리펩티드가 투여되는 관절의 부근에 배치될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 섭취, 예를 들어 흡입 또는 경구 전달용으로 선택될 수 있다.
치료 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은, 목적하는 요법 또는 효과에 따라, 또한 효과적으로는 1종 이상의 추가의 활성제 (예를 들어, 히알루론산 또는 그의 유도체 또는 염, 성장인자 (예를 들어, FGF18, BMP7), 연골형성제 (예를 들어, 경구 연어 칼시토닌, SD-6010 (iNOS 억제제), 비타민 D3 (콜레칼시페롤), 콜라겐 가수분해물, 루살라타이드 아세테이트, 아보카도 소이 불검화물 (ASU), WO2012/129562에 기재된 화합물, 카르토게닌, 스테로이드, 비-스테로이드성 항염증제 (NSAID) 등)와 조합하여 사용되어 어느 한 쪽의 치료 효과를 개선 또는 증진시킬 수 있다. 당해 과정은 두 작용제 모두를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제제 어느 한 쪽으로서, 또는 두 별개 조성물 또는 제제를 투여함으로써 두 작용제 모두를 환자에 동시에 투여하는 것을 수반할 수 있으며, 여기서 하나의 조성물은 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 다른 하나는 제2 작용제(들)를 포함한다. 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료 조성물의 투여는 분 단위 내지는 주 단위 범위의 간격을 두고 제2 작용제의 투여에 선행하거나 후행할 수 있다.
화합물의 제제는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 멸균 바이얼에 넣어 저장될 수 있다. 제제는 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉 용기, 예컨대 앰풀 및 바이얼에 넣어 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 단일 또는 다중-챔버식 사전충진 시린지 (예를 들어, 액체 시린지, 리소시린지)에 넣어 제공될 수 있다. 용액 및 현탁액은 이전에 기술한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 하나의 실시양태에서, 단일 용량 투여 단위를 생성하는 키트가 제공된다. 키트는 건조된 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 용기 및 수성 재구성 포뮬러를 갖는 제2 용기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나의 용기는 단일 챔버 사전충진 시린지를 포함한다. 다른 실시양태에서, 용기는 다중-챔버식 사전충진 시린지로서 포함된다.
실시예
하기 실시예는 예시를 위해 제공되는 것이지 청구 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 프로테아제-내성 Angptl3 펩티드 구축물
O-결합형 글리코실화를 제거하고 생물물리학적 단백질 특성해석을 촉진하기 위하여 다양한 N-말단부 절단 돌연변이체를 구축하였다. 프로테아제-내성 펩티드를 확인하기 위하여, 펩티드의 C-말단 영역에 상응하는 인간 Angptl3 펩티드 단편의 다양한 위치중으로 아미노산 치환을 도입시켰다. 도 1은 인간 Angptl3중 돌연변이의 위치를 도시한다. 구축물은 초기에는 His 태그가 달리게 제조하였다. 돌연변이체 단백질은 다음과 같다: 225-460 K423Q (225KQ), 225-460 S424T (225ST), 226-460 K423Q (226KQ), 226-460 K423S (226KS), 228-460 K423Q (228KQ), 228-460 S424T (228ST), 233-460 K423Q (233KQ), 233-460 K423S (233KS), 241-460 K423Q (241KQ), 241-460 K423S (241KS), 241-460 Kdel (241Kdel), 242-460 K423Q (242KQ), 242-460 K423S (242KS) 및 242-460 Kdel (242Kdel).
His-태그 단백질을 HEK 프리스타일(Freestyle)TM 세포에서 발현시킨 다음 Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 무-태그성 C-말단 구축물을 또한 클로닝하여, 이전에 기재된 방법 (Gonzalez R et al., PNAS 2010)에 의하여 정제하였다. 간단히 말하자면, 신호 서열 (1-16)을 가진 표적 단백질을 시토메갈로바이러스 프로모터를 가진 포유동물 발현 벡터에서 클로닝하였다. HEK 293 프리스타일 (인비트로젠)에서 DNA/PEI 형질감염 후 96 h에서, 분비된 표적 단백질을 함유하는 배지를 수확하여 하이-트랩 에스피(Hi-Trap SP) 칼럼 (지이 헬스케어, GE Healthcare)에 의하여 정제하였다. 단백질을 50 mM MES (pH 6.0), 125 mM NaCl 내지 50 mM MES (pH 6.0), 150 mM NaCl 사이에서 용리시켰다. SDS-PAGE는 정제된 단백질이 적어도 95% 순도임을 확인시켜 주었다.
프로테아제 내성을 다음과 같이 평가하였다. 각각의 제조된 단백질 10 ng을 트립신과 8000:1 (단백질:트립신)의 질량비로 1 hr 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 제한된 트립신처리분해를 수행하였다. 트립신처리분해 반응을 이어서 아세트산 첨가로 반응을 pH 3.0으로 가져옴으로써 켄칭시킨 다음, 켄칭 샘플을 LC/MS에 의하여 분석하였다. C-말단 43개 아미노산 (S424-E460)의 질량에 상응하는 5 min RP HPLC 피크가 각각의 야생형 단백질 구축물에 대하여 명백하였다. 클립 부위는 전장 야생형 ANGPLT3 단백질 생산 중에 관찰된 바와 같이, 동일 부위에, 즉 K423과 S424 사이에 있었다. 당해 피크는 클립 부위에서의 Lys가 Gln으로 돌연변이되었을 때는 부재하였다. 펩티드 구축물 225KQ, 228KQ, 233KQ, 233KS, 241KQ 및 242KQ의 각각; 및 야생형 225 펩티드를 제조하여 분석하였다. C-말단 43개 아미노산의 질량에 상응하는 피크는 클립 부위에서의 Lys가 구축물 각각에 대하여 Gln 또는 Ser으로 돌연변이되었을 때, 또는 위치 423에서의 Lys가 결실되었을 때는 부재하였다.
실시예 2: 인테그린 결합 검정
αVβ3 인테그린 제조된 펩티드 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ 및 242KQ를 αVβ3 인테그린에의 결합에 대하여 시험관내에서 시험하였다. 간단히 말하자면, 맥시소프(Maxisorp) 플레이트를 2 ㎍/ml 인테그린 αVβ3로 코팅한 다음, 다양한 농도의 폴리펩티드 구축물 (표시)을 첨가하였다. 항-ANGPTL3 mAb를 첨가하고 뒤이어 호스래디시 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 IgG 항체를 첨가함으로써 결합된 펩티드를 검출하였다. 모든 시험된 펩티드는 인테그린 결합능을 유지하거나 또는 개선하였다. 각각에 대한 EC50을 결합 데이터로부터 측정하고, 결과를 표 2에 나타내었다.
<표 2>
인테그린에 대한 ANGPTL3 및 조작 폴리펩티드 구축물의 시험관내 결합
Figure pct00006
α5β1 인테그린 제조된 펩티드 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ 및 242KQ를 α5β1 인테그린에의 결합에 대하여 시험관내에서 시험하였다. 플레이트를 전술한 바와 같이 2 ㎍/ml로 그러나 인테그린 α5β1로 코팅하고, 다양한 농도의 폴리펩티드 구축물 (표시)을 첨가한 다음, 검출을 전술한 바와 같이 수행하였다. 모든 시험된 펩티드는 인테그린 결합능을 유지하거나 또는 개선하였다. 각각에 대한 EC50을 결합 데이터로부터 측정하고, 결과를 표 2에 나타내었다.
실시예 3: 구축물의 기능 분석
세포 배양 및 분화. 1차 인간 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (hMSC)를 FACS 분류하였으며, CD29, CD44, CD166 및 CD105에 대하여 >98% 양성 및 CD45에 대하여 <0.1% 양성인 것으로 입증되었고; 세포를 실험을 위해 2 내지 8차 계대로부터 사용하였다. 인간 연골 정주성 MSC (hCR-MSC)는 인간 1차 관절 연골세포로부터 유래되었으며, 이들은 단일 세포로 분리하고, MSCGM에서 클론 성장시킨 다음, 연골형성, 골형성 및 지방생성 분화를 통해서 MSC로서 확인되었다. 세포를 FACS 분류하였으며, CD166 및 CD105에 대하여 >98% 양성인 것으로 입증되었다. hCR-MSC를 식별된 세포 프로파일, 성장 또는 분화 속도의 변경없이 20차 계대까지 배양시켰다.
연골형성. 본 발명의 펩티드 구축물을 물리적 및 기능적 검정으로 평가하여 연골형성 활성을 평가하였다.
본원에 제공된 조작 구축물은 안지오포이에틴과 구조적 유사성을 갖지만, Tie2 수용체에의 결합능이 결여되어 있고, 따라서 별개의 기능을 가지는 7종의 확인된 ANGPTL 단백질의 패밀리에 속하는 ANGPTL3으로부터 유래된다. ANGPTL 단백질은 N-말단 코일드-코일 도메인 (CCD)과 C-말단 피브리노겐-유사 도메인 (FLD)을 함유하고 있으며, 그들의 마이크로환경 및 세포외 매트릭스 (ECM), 예컨대 피브로넥틴 및 인테그린과의 상호작용에 의하여 긴밀하게 조절되는 것으로 생각된다. Conklin et al., Genomics 62(3): 477-482 (1999); Goh YY, et al., Am J Pathol 177(6): 2791-2803 (2010); Goh YY et al., J Biol Chem 285(43): 32999-33009 (2010). ANGPTL3에 가장 밀접하게 관련된 ANGPTL 패밀리 구성원, ANGPTL1 (전장 및 C-말단 도메인) 및 ANGPTL4 (전장 및 C-말단 도메인)에 대한 서열을 표 3에 제공하였으며; 표 5B는 이들 패밀리 구성원의 C-말단 도메인 전역에 걸친 정렬을 나타낸다. 다른 안지오포이에틴 단백질 ANGPTL7, ANGPT1 및 ANGPT2뿐만 아니라 세포외 도메인 및 C-말단 도메인 ANGPTL1, ANGPTL4 전역에 걸친 서열 동일성을 표 5A에 제공하였다. ANGPTL3의 C-말단 도메인 (CT)은 CT ANGPTL1과는 37% 서열 동일성 및 CT ANGPTL4와는 40% 서열 동일성을 공유한다.
문헌 (Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717)에 이전에 기재된 바와 같이 세포-기반 2D 연골형성을 시험관내에서 유도하고 평가하였다. 간단히 말하자면, 1차 인간 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (hMSC)를 성장 배지에 플레이팅하고 이어서 후속하여 구축물이 존재 및 부재하는 연골형성 자극 배지로 교체하였다.
결절 형성을 초기에 영상화하기 위하여, 웰을 고정시키고 로다민 B로 염색하였으며, 여기서 결절은 눈 및 광학현미경검사로 포착한 영상에 의하여 용이하게 검출되었다. 고-처리량 영상화-기반 검출 및 정량을 촉진하기 위하여, 연골형성 결절을 콜라겐에 비-특이적으로 결합하는 나일 레드로 염색하였다. 나일 레드-염색 결절을 어큐멘(Acumen) eX3 (하이 콘텐트 영상화 장치)상에서 결절의 고속 검출을 위해 488 레이저로의 여기에 의하여 정량하였다.
<표 3>
ANGPTL 패밀리 서열
Figure pct00007
<표 4>
ANGPTL 패밀리 구성원 단백질의 연골형성
Figure pct00008
문헌 (Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717)에 이전에 기재된 바와 같이 세포-기반 2D 연골형성을 시험관내에서 유도하고 평가하였다. 간단히 말하자면, 1차 인간 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (hMSC)를 성장 배지에 플레이팅하고 이어서 후속하여 구축물이 존재 및 부재하는 연골형성 자극 배지로 교체한 다음, 7일 또는 14일 동안 배양하였다. 이어서 세포를 포름알데히드로 고정, 세척 및 이어서 표준 면역세포화학적 기술을 이용하여 염색하여 1차 연골 단백질 프로-콜라겐 타입 2A (PIIANP) (도 2A) 및 제II형 콜라겐 (도 2B)을 검출하였다. 제II형 콜라겐의 검출을 위해, 세포를 투과화 용액에 첨가해 둔 0.2% 콜라게나제 II (워씽톤 바이오케미컬(Worthington Biochemical), 미국 뉴저지주 레이크우드)로 소화시켰다. 검출된 각각의 단백질에 대한 면역형광을 다중파장 세포 채점표를 사용하여 및 이전에 기재된 바와 같이 하이 콘텐트 영상화 (Image Express Ultra (몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일)를 통해 정량하였다. 도 2 참조. 아그레칸 발현은 다음과 같이 세포를 준비함으로써 모니터링하였다: 간단히 말하자면, 1차 hMSC (5000개 세포)를 그리너(Griener) 384-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후, 성장 배지를 제거하고 1% FBS를 함유하는 25 ㎕의 DMEM으로 교체하였다. 단백질 구축물을 이어서 각각의 웰에 표시 용량으로 첨가하고, 배양물을 37℃에서 3일 동안 성장시켰다. 세포를 10% 포르말린으로 고정시킨 다음 면역세포화학적 방법에 투입하여 아그레칸 단백질 발현을 검출하였다. 웰을 이미지엑스프레스 울트라(ImageXpress Ultra)상에서 영상화하고, 다중파장 세포 채점표, n=6/단백질 농도로 정량하였다. 결과를 WT 야생형 C-말단 (225-460) ANGPTL3, 조작 구축물 242KQ 또는 242Kdel 또는 ANGPTL 단백질의 관련 패밀리 구성원인 전장 ANGPTL1에 대하여 대조군 (구축물 없이 자극한 세포, 희석제 단독)과 비교하여 도 3B에 예시하였다. 225WT, 225KQ, 226KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ 및 242KQ 구축물 각각을 사용하는 실험으로 유사한 결과가 관찰되었다.
추가의 ANGPTL-관련 패밀리 구성원에 대하여 이전에 그리고 본원에 기재된 검정 및 방법을 이용하여 연골형성 검정을 수행하였다. 밀접하게 관련된 단백질이 연골형성 활성을 부여하는지 여부, 및 그 활성이 단백질의 C-말단에 보유되었는지를 검사하기 위하여 실험을 수행하였다. ANGPTL1 및 ANGPTL4는 결절 형성 검정에서 활성을 드러내 보여주었으며; 그러나, 오직 ANGPTL1만이 연골형성 검정에서 제II형 콜라겐의 유도를 나타내었다. 표 4 참조. 제II형 콜라겐 검정의 결절 형성 활성 및 유도의 결과를 표 4에 요약하였다. ANGPTL1의 추가의 특성해석을 본원에 기재한다. 본 실시예의 다른 부분과 도 3 내지 5를 참조한다.
<표 5>
인간 안지오포이에틴-유사 패밀리 구성원간의 서열 상동성
5A: 인간 안지오포이에틴-유사 패밀리 구성원 (ECD 또는 CTD)간의 서열 상동성
Figure pct00009
5B: 인간 안지오포이에틴-유사 패밀리 구성원 hANGPTL1(271-491) /hANGPTL3(241-460)/hANGPTL4(179-406)의 C-말단 도메인의 서열 정렬
Figure pct00010
RNA 발현 분석은 연골-특이적 단백질의 발현 평가에 또한 사용되었다. 간단히 말하자면, qRT-PCR hMSC를 펠릿 배양 (1x106개 세포/펠릿)으로 3, 7, 10, 21일 동안 무-혈청 DMEM, 1X ITS + 구축물 (표시한 바와 같다)에서 성장시켰다. 배지를 3일마다 교체하였다. 루브리신, 아그레칸, Sox9, IGF1, IFITM1, 오스테오칼신 및 제X형 콜라겐 mRNA 발현을 로슈 라이트사이클러(Roche LightCycler)를 이용하여 정량하였다 (2회1조로 수행한 3개 실험 (n=6)으로부터 모은 데이터). 도 3A는 제10일에서 242KQ 및 225WT에 대한 발현 데이터를 나타낸다. 유전자 발현 데이터는 제3일, 제7일 및 제21일에서 모든 유전자에 대하여 유사하였다.
전장 ANGPTL3은 인간 및 마우스 중간엽 줄기 세포 양쪽 모두에서 연골형성 활성을 갖는 것으로 이전에 밝혀졌었다. 구축물을 추가의 종 교차반응성의 능력을 증명해 보이기 위하여 인간, 마우스, 래트 및 개 중간엽 줄기 세포에서의 활성에 대하여 시험하였다. 마우스, 래트, 인간 및 개로부터의 CR-MSC를 전술한 바와 같은 구축물과 18일 동안 배양하였다. 배양물을 고정시킨 다음 표준 면역세포화학적 기술을 이용하여 염색하여 연골세포-특이적 단백질 제II형 콜라겐을 검출하였으며, 하이 콘텐트 영상화를 이용하여 제II형 콜라겐 양성 세포를 정량하였다. 정량된 제II형 콜라겐의 양에 있어서 유사한 배수 증가가 평가된 세포의 각각의 종에 대하여 확인되었다.
연골보호. 펩티드 구축물을 기능 검정으로 평가하여 연골보호 활성을 평가하였다.
생체외 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출 억제 검정 (매트릭스 손상의 지표)을 문헌 (Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말하자면, 소 연골을 단리하고, 대칭원으로 천공한 다음, 기관 배양에 투입하였다. 박편을 48시간 동안 20 ng/ml TNFα 및 10 ng/ml 온코스타틴 M (OSM) (염증 매개체)으로 처리하여 단백질 구축물의 존재하에 또는 부재하에 연골 매트릭스의 분해를 유도하여 글리코사미노글리칸 (GAG) 방출의 %억제를 확인하였다. 도 4A에 도시된 결과는 표시한 바와 같은 조작 구축물 및 WT 225-460을 가지고서 4명의 도너, n=12로부터 모은 데이터를 도시한다.
시험관내 산화질소 (NO) 억제 검정 (연골보호의 지표)을 문헌 (Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말하자면, 1차 연골세포를 48 hr 동안 표시한 바와 같은 단백질 구축물로 처리하였다. 도 4B에 도시된 결과가 표시한 바와 같은 조작 구축물 및 WT C-말단 단편 225-460을 가지고 얻은 결과를 도시하고 있으므로 NO 방출의 억제에 미치는 구축물의 영향을 측정하기 위하여 그레이스 반응을 수행하였다. 도 4C에 나타낸 결과는 야생형 C-말단 ANGPTL1, 조작 ANGPTL3 242KQ 또는 대조군을 가지고 얻은 결과를 도시한다.
섬유성 연골 형성의 억제. 1차 인간 관절 연골세포를 아스코르브산의 첨가와 구축물 (표시)의 존재 또는 부재하에서 14일 동안 전술한 바와 같이 배양하여 비대를 유도하였고, 제X형 콜라겐 발현을 면역형광에 의하여 평가하였다. 도 5A에 나타낸 결과는 표시된 바와 같은 구축물 225WT 또는 242KQ를 가지고 얻은 데이터를 도시한다. 도 5B에 나타낸 결과는 표시된 바와 같은 야생형 C-말단 ANGPTL1, 조작 ANGPTL3 242KQ 또는 242Kdel 또는 야생형 C-말단 ANGPTL3 단편 225-460을 가지고 얻은 데이터를 도시한다. 야생형 또는 활성 구축물의 존재는, 제X형 콜라겐의 발현에 의하여 검출되는 바와 같이, 비대성 상태하에서 섬유성 연골의 형성에 대한 억제 효과를 부여한다.
혈관신생. ANGPTL3 단백질의 WT C-말단 도메인은 래트 각막 모델에서 시험관내 및 생체내에서 혈관신생 활성 및 특성을 보유하는 것으로 보고되었다. 문헌 (Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277(19): 17281-17290 (2002)) 참조. C-말단 ANGPTL3의 생체내 투여 뒤에 새로운 혈관을 유도하는 일어날 수 있는 위험에 대처하기 위하여, 시험관내 혈관신생 검정을 검사하였다. 간단히 말하자면, 1차 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC)를 기저 내피세포 배지로 밤새 혈청 고갈시켰다. 세포를 이어서 세포 트래커 그린으로 표지한 다음, 단백질 구축물 (표시)로 포매한 사전코팅 매트리겔 플레이트에 첨가하였다. 전장 ANGPTL3 (50 ng/mL) 또는 242KQ (50 ng/mL) 또는 양성 대조군으로 사용된 bFGF (50 ng/mL)의 존재하에서 18시간 동안 배양한 뒤에, 분지점의 개수 및 형성된 총 튜브 길이를 혈관신생 활성의 척도로서 하이 콘텐트 영상화를 이용하여 정량하였다. 전장 ANGPTL3 또는 양성 대조군의 존재하에서 관찰된 효과와는 대조적으로, 세포를 242KQ와 인큐베이션하였을 때 어느 한 쪽 파라미터의 어떠한 유의한 증가도 검출되지 않았다. 도 2C 참조.
CR-MSC는 초자 관절 연골 안에 존재하고 있으며 상해에 반응하여 개수가 증가한다. 연골 조직에 대한 상해 뒤에, 이들 세포는 복구 과정에 참여할 능력을 보유하지만, 그들 자력으로는 적당한 연골 복구로 충분히 인도하지 못한다. 그러므로 환자는 무통 관절 운동을 지지할 적정한 능력이 결여되어 있고 종종 그들의 삶의 질을 유지하기 위하여 외과적 개입 및/또는 관절 치환술을 필요로 하는 관절 연골을 떠안게 된다. 본 발명자들은 ANGPTL3 및 특히 조작 프로테아제-내성 ANGPTL3 펩티드가 제X형 콜라겐의 발현에 의하여 알아차리게 되는 섬유성 연골 형성을 억제하면서 인간 CR-MSC에서 연골세포, 구체적으로는 초자 관절 연골 단백질 제II형 콜라겐 및 Sox9를 분비하는 연골세포로의 분화 지시능을 보유하고 있음을 밝혀내었다.
본 발명자들이 아는 바로는 ANGPTL3의 발현은 보고된 바가 없으며 인간 연골세포, 인간 MSC 또는 인간 활막 섬유모세포에서의 웨스턴 블로팅을 이용한 본 발명자들의 연구에서도 관찰되지 않았다. 설치류 관절에서, 면역조직화학 (IHC)을 통해서 거의 내지는 전혀 발현이 발견되지 않았다. 그러나, 인간 골관절염 윤활액 (n=2)에서, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의하여 저-수준 ANGPTL3 (1.3 내지 6.0 ng/mL)이 검출되었으며, 이는 훼손된 관절에서, 전신 순환 단백질이 활액강에 진입할 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 구축물의 생체내 분석
마우스 급성 상해 외과적 모델. C57BL/6 마우스 (n=12/군)로부터의 우측 무릎의 전방십자인대 (ACL), 내측반월판경골인대 (MMTL) 및 내측측부인대 (MCL)의 외과적 가로절단을 수행하여 슬관절에 불안정성을 유도하고 따라서 이전에 기재된 모델 (Glasson, S.S., et al., Osteoarthritis Cartilage 15, 1061 (2007))로부터 적응된 OA 표현형으로 인도하였다. ANGPTL3 처리의 잠재적인 치료적 이익을 평가하기 위하여, 수술하고 15주 뒤에, 마우스에 도 6A에 표시한 바와 같이 주1회 제17주 내지 제19주에서 mANGPTL3 용량 = 200 ng/무릎으로 관절내 투여하였다. 경골 고평부의 정량적 평가를 0-4 스케일로 행하였으며, 0은 정상이고 5는 중증 골관절염 (연골의 전층 붕괴)이다. 각 마우스로부터의 두 절편을 2명의 독립적인 관찰자에 의하여 맹검방식으로 등급을 매겼다 (도 6B).
동물에 대한 골관절염-유발 통증의 완화는 인커패시턴스 시험에 의하여, 또는 인커패시턴스 모니터링 장치를 사용하여 마우스가 외과적 처리 다리 vs 비-처리 다리로 기립한 시간의 백분율을 측정함으로써 계측되었다. 도 7은 수술 후 제35일 및 제56일에서의 통증 반응이 외과적 다리 vs 비-외과적 다리에 걸리는 %체중부하로서 보고되었음을 나타내는 판독의 결과를 도시한다. 처리는 전장 뮤린 ANGPTL3 (WT 17-460) 또는 C-말단 인간 ANGPTL3 (WT 225-460)으로 전술한 바와 같이 투여한 동물의 결과를 도시한다.
마우스 만성 OA 모델 ( 콜라게나제 VII- 유발) 골관절염의 또 다른 널리 이용되는 동물 모델인 콜라게나제 VII-유발 만성 관절 상해 모델을 이용하여 구축물의 생체내 효능을 평가하였다. 모델 및 평가는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 다음의 문헌들 참조: van der Kraan, P.M., et al., Am. J. Pathol. 135, 1001 (1989); 및 Johnson, K., et al., Science 336, 717 (2012)). 간단히 말하자면, 3일간의 염증기 뒤에는 관절의 콜라게나제-유발 불안정화가 후속하며, 그에 따라 경증 내지는 보통 정도의 연골 파괴를 가져온다. 구축물의 관절내 투여는 콜라게나제 VII의 첨가 3주 후 시작으로 3주 동안 주1회 무릎에서의 유발 뒤에 수행하였다. 처리하고 42일 뒤에, 관절을 수집하여 절편을 만들었다. 대퇴골 및 경골 고평부의 조직학적 관절 중증도 채점은 조직 복구의 정량을 가능케 해주었다. 관절 점수의 중증도는 전술한 바와 같은 조직학적 채점을 통해 측정하였다. 도 8은 225WT, 225KQ, 228KQ, 233KQ 및 241KQ 구축물을 가지고 행한 복구를 도시한다. 관절중 단백질의 존재 (장기 관절내 보유)를 확인하기 위하여, 조직을 고정한 다음 면역조직화학을 통해 WT 단백질 구축물의 존재에 대하여 염색하였다. 분석은 ANGPTL3의 관절내 보유를 표시하는 단백질의 존재를 확인시켜 주었다 (지질/트리글리세리드에 대해서는 어떠한 영향도 보이지 않았음, 표준 대사 패널을 이용하여 평가, 데이터 나타내지 않았음).
내측 경골 고평부의 사프라닌 O-염색 절편 (전술한 바와 같이 상해 부위에서 프로테오글리칸의 검출을 위한)에 대한 조직학적 분석 및 등급 매기기는 연골 매트릭스에서의 재생을 밝혀주었다 (데이터 나타내지 않았음). 정성적 분석은 나이브 마우스에서 보인 수준과 유사한 프로테오글리칸의 교체를 확인시켜 주었으며, 반면에 비히클 대조군은 유사한 교체를 보이지 않았다. 조직 절편을 상해의 주사 8주 뒤에 제II형 콜라겐에 대하여 전술한 바와 같이 또한 염색하였다. 정성적 분석은 나이브 마우스에서 보인 수준과 유사한 구축물로 처리한 관절에서 제II형 콜라겐의 증가를 확인시켜 주었으며; 반면에 비히클-처리 대조군은 유사한 증가를 보이지 않았다 (데이터 나타내지 않았음).
래트 반월판 파열 모델
래트 외과적 상해 모델을 또한 이용하여 구축물의 생체내 효능을 평가하였다. 모델 및 평가는 이전에 기재된 바와 같이 초기에 수행하였다 (Gerwin N. et al. Osteoarthritis Cartilage. Suppl 3: S24 (2010)). 간단히 말하자면, 슬관절 전체에 걸쳐서 피부를 제모하고, 내측측부인대 (MCL)를 절개를 통해 단리한 다음, MCL을 안정화시키고 외과용 메스를 사용하여 반월판의 말단부 절단을 행하였다. 수술하고 나서 제1주, 제2주 및 제3주에서 단백질 구축물 또는 비히클 대조군을 관절내 주사하고, 이어서 관절을 수집한 다음, 수술 후 제4주 및 제6주에서 절편을 만들었다. 대퇴골 및 경골 고평부의 조직학적 관절 중증도 채점을 전술한 바와 같이 조직 복구의 정량을 위해 수행하였다. 데이터는 6주 분석에 대하여 나타내었다.
건강한 초자 연골이 처리 뒤에 손상을 대체하였다. 사프라닌 O-염색 연골의 외측 경골 고평부의 조직학적 분석 및 등급 매기기를 전술한 바와 같이 수행하였으며, 정량 결과는 242KQ 구축물로 처리한 동물은 연골 매트릭스에 있어서의 재생 및 나이브 래트에서 보인 수준과 유사한 프로테오글리칸의 교체를 보였으며, 반면에 비히클 대조군은 유사한 교체를 보이지 않았음을 증명해 보여주었다. 도 9 참조. 225WT로도 유사한 결과가 관찰되었다.
생체내에서의 연골 복구 촉진에 있어서 242KQ의 효능을 시험하기 위하여 전술한 것으로부터의 약간 변경된 외과적으로 유발된 반월판 파열 모델을 이용하여 수컷 루이스 래트에서 연골 손상을 개시하였다. 장래 체중부하가 연골의 급속한 퇴화를 가져오게 되도록 관절을 불안정화시키기 위하여 내측측부인대 및 내측반월판을 완전히 절단하도록 래트에 대한 수술을 수행하였다. 니들의 양측에서 인대를 절단하도록 절개를 행였으며, 따라서 완전한 절단이 확보된다. 이어서 외과용 메스 날을 사용하여 슬개골 인대 아래에서 활막강 안으로 미끄러져 들어가게 하였으며, 선단부를 이용하여 반월판을 절단하였다. 관절이 측면으로 탈구되었을 때 성공적인 절단이 달성되었다. 수술 1주일 후, 래트에 242KQ 또는 염수를 25 ㎕의 부피로 관절내 활막강에 관절내 주사로 투여하였다.
반월판 파열 수술하고 28일 후 및 염수 또는 구축물의 관절내 주사하고 21일 후, 연구 동물을 안락사시키고, 환부 관절을 분석을 위해 수확하여, PBS중 10% 포르말린에 고정시키고, 포름산으로 탈석회화한 다음, 절편화에 앞서 파라핀에 포매시켰다. 관상 단면을 절단하여 사프라닌 O에 대하여 염색하거나 또는 장래 면역조직화학적 염색을 위해 비-염색상태로 놔두었다. 분석은 내측 경골 고평부에 최대량의 연골 손상이 있었음을 보여주었고, 242KQ의 효능에 대하여 관절의 오직 이 영역만을 평가하기로 결정하였다. OARSI 채점 시스템을 이용하여, 맹검방식으로 각각의 동물 (N=10)에 대하여 경골 연골의 폭을 가로질러 6개 절편에 대하여 연골 중증도 점수를 배정하였다. 채점은 상이한 시점에서 2회 행하였으며, 이어서 그 점수를 평균을 내어 연골 손상의 점수를 작성하였다. 부가적으로, 매트랩(Matlab)에서 생성한 커스텀 스크립트로 객관적 채점 분석을 수행하였다. 알고리즘은 관절 연골 표면을 식별하고 추가의 연골 파라미터 (구역 분석, 사프라닌 O 강도, 연골 면적, 연골 두께)를 객관적으로 정량하였다. 결과를 도 10A에 도시하였다.
적어도 인간에서는 연골의 구조적 복구가 반드시 통증의 완화와 연관되는 것은 아니다. 비록 설치류 생리기능 및 걸음걸이가 인간과는 현저히 상이하지만, 242KQ를 평가하여 처리 후 걸음걸이 또는 외과적 다리로 소비한 시간의 길이에 있어서 어떤 개선이 있었는지를 측정하였다. 인커패시턴스 모니터링을 242KQ로 처리한 래트에서 수행하였다. 래트를 전술한 바와 같은 변형된 반월판 수술에 투입하였다. 수술 1주일 뒤에, 242KQ를 활막강에 주사하였다. 제28일에, 래트를 인커패시턴스 모니터에 그들의 뒷다리로 일어서게 올려놓고, 각각의 래트에 대하여 10분에 걸쳐서 30회 후속 판독을 취하여 각각의 뒷다리로 소비한 시간의 % (체중 분포)를 측정하였다. 이들 데이터는 통증-유발 체중 재분배의 표시를 부여한다. 래트 반월판 파열 모델에서, 수술하고 1주일 뒤에 242KQ로의 처리는 래트의 균일 체중부하능의 부분적인 회복을 가져왔음이 측정되었다. 도 10B 참조.
자발적인 또는 외과적 연골 복구 도중의 1차적 난제 중 하나는 섬유성 연골로의 초자 관절 연골의 교체이다. ANGPTL3에 의하여 매개된 연골 복구의 유형을 탐구하기 위하여, 상기 수행된 래트 반월판 파열 연구로부터 수집한 래트 무릎으로부터의 절편을 제II형 콜라겐 (초자 관절 연골을 표시하기 위하여) 및 제X형 콜라겐 (섬유성 연골을 표시하기 위하여)의 존재에 대하여 염색하였다. 20 ㎍의 242KQ 단일 주사 후, 제X형 콜라겐 발현의 양에 있어서 정성적 감소가 있었다.
래트 무릎중으로의 정맥내 및 관절내 주사 뒤에 242KQ의 장기 보유는 단백질의 124I 표지화 및 투여를 통해 측정하고, 뒤이어 PET/uCT 영상화를 행하여 보유를 모니터링하였다. 문헌 (Gerwin, N., et al. (2006) Advanced drug delivery reviews 58, 226-242) 참조. 관절중으로 242KQ의 IA 주사 후 평균체류시간 (MRT)은 약 17.3h인 것으로 측정되었으며, 이는 보고된 표준 2-3h을 능가하여 현저히 증가된 것이다 (표 6 참조).
<표 6>
124I 242KQ의 지속성
Figure pct00011
개 부분 반월판절제술 관절 상해 모델 본 발명자들은 개 관절 상해 모델에서 ANGPTL3 활성을 또한 평가하였다. 문헌 (Connor, J.R., et al., Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society 17, 1236-1243 (2009))에 기재된 바와 같이 모델을 수행하고 평가를 수행하였다. 간단히 말하자면, 슬관절 전체에 걸쳐서 피부를 제모하고, 내측측부인대 (MCL)를 절개를 통해 단리한 다음, MCL을 안정화시키고 외과용 메스를 이용하여 반월판의 말단부 절단을 행하였다. 수술하고 4일 뒤, 동물은 제7일에 단백질 구축물 (전장 개 ANGPTL3)을 주2회 투여 (1.5 ㎍ 또는 15 ㎍) 또는 단일 용량 (30 ㎍) 또는 비히클 대조군을 투여받았다 (관절내 주사). 개를 제28일에 안락사시키고 무릎을 래트 및 마우스 실험에 대하여 전술한 바와 같이 조직학적 절편화 및 등급 매기기에 투입하였다. 도 10은 개 ANGPTL3의 처리와 관련된 복구의 총 합계 점수를 도시한다. 사프라닌 O로 염색한 개 관절 절편의 조직학적 등급 매기기 및 평가시, 염수 군에서 가장 중한 연골 손실이 일어난 영역은 cANGPTL3의 단일 30 ㎍ 용량 투여 뒤 병변 면적에 있어서 최대 감소가 있었던 관절의 부분이었다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 예시적인 목적을 위한 것이라는 점 및 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제시될 것이고 본 출원의 취지와 범위 및 첨부 청구범위의 범위 안에 포함시키고자 함이 이해된다.
서열
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
SEQUENCE LISTING <110> JOHNSON, Kristen SHI, Jian <120> PEPTIDES AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF JOINT DAMAGE <130> PAT055625 <150> 61/775400 <151> 2013-03-08 <150> 61/938123 <151> 2014-02-10 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460 <210> 2 <211> 2126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttccagaaga aaacagttcc acgttgcttg aaattgaaaa tcaagataaa aatgttcaca 60 attaagctcc ttctttttat tgttcctcta gttatttcct ccagaattga tcaagacaat 120 tcatcatttg attctctatc tccagagcca aaatcaagat ttgctatgtt agacgatgta 180 aaaattttag ccaatggcct ccttcagttg ggacatggtc ttaaagactt tgtccataag 240 acgaagggcc aaattaatga catatttcaa aaactcaaca tatttgatca gtctttttat 300 gatctatcgc tgcaaaccag tgaaatcaaa gaagaagaaa aggaactgag aagaactaca 360 tataaactac aagtcaaaaa tgaagaggta aagaatatgt cacttgaact caactcaaaa 420 cttgaaagcc tcctagaaga aaaaattcta cttcaacaaa aagtgaaata tttagaagag 480 caactaacta acttaattca aaatcaacct gaaactccag aacacccaga agtaacttca 540 cttaaaactt ttgtagaaaa acaagataat agcatcaaag accttctcca gaccgtggaa 600 gaccaatata aacaattaaa ccaacagcat agtcaaataa aagaaataga aaatcagctc 660 agaaggacta gtattcaaga acccacagaa atttctctat cttccaagcc aagagcacca 720 agaactactc cctttcttca gttgaatgaa ataagaaatg taaaacatga tggcattcct 780 gctgaatgta ccaccattta taacagaggt gaacatacaa gtggcatgta tgccatcaga 840 cccagcaact ctcaagtttt tcatgtctac tgtgatgtta tatcaggtag tccatggaca 900 ttaattcaac atcgaataga tggatcacaa aacttcaatg aaacgtggga gaactacaaa 960 tatggttttg ggaggcttga tggagaattt tggttgggcc tagagaagat atactccata 1020 gtgaagcaat ctaattatgt tttacgaatt gagttggaag actggaaaga caacaaacat 1080 tatattgaat attcttttta cttgggaaat cacgaaacca actatacgct acatctagtt 1140 gcgattactg gcaatgtccc caatgcaatc ccggaaaaca aagatttggt gttttctact 1200 tgggatcaca aagcaaaagg acacttcaac tgtccagagg gttattcagg aggctggtgg 1260 tggcatgatg agtgtggaga aaacaaccta aatggtaaat ataacaaacc aagagcaaaa 1320 tctaagccag agaggagaag aggattatct tggaagtctc aaaatggaag gttatactct 1380 ataaaatcaa ccaaaatgtt gatccatcca acagattcag aaagctttga atgaactgag 1440 gcaaatttaa aaggcaataa tttaaacatt aacctcattc caagttaatg tggtctaata 1500 atctggtatt aaatccttaa gagaaagctt gagaaataga ttttttttat cttaaagtca 1560 ctgtctattt aagattaaac atacaatcac ataaccttaa agaataccgt ttacatttct 1620 caatcaaaat tcttataata ctatttgttt taaattttgt gatgtgggaa tcaattttag 1680 atggtcacaa tctagattat aatcaatagg tgaacttatt aaataacttt tctaaataaa 1740 aaatttagag acttttattt taaaaggcat catatgagct aatatcacaa ctttcccagt 1800 ttaaaaaact agtactcttg ttaaaactct aaacttgact aaatacagag gactggtaat 1860 tgtacagttc ttaaatgttg tagtattaat ttcaaaacta aaaatcgtca gcacagagta 1920 tgtgtaaaaa tctgtaatac aaatttttaa actgatgctt cattttgcta caaaataatt 1980 tggagtaaat gtttgatatg atttatttat gaaacctaat gaagcagaat taaatactgt 2040 attaaaataa gttcgctgtc tttaaacaaa tggagatgac tactaagtca cattgacttt 2100 aacatgaggt atcactatac cttatt 2126 <210> 3 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met His Thr Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala 1 5 10 15 Ser Arg Val Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Thr Ala Leu Gln His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Ser Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Arg 165 170 175 Glu Leu Leu Gln Ser Val Glu Glu Gln Tyr Lys Gln Leu Ser Gln Gln 180 185 190 His Met Gln Ile Lys Glu Ile Glu Lys Gln Leu Arg Lys Thr Gly Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Ser Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ser Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Leu Gln Leu Asn Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gln Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Ala Asp Cys Ser Ala Val Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Val Tyr Thr Ile Lys Pro Arg Asn Ser Gln Gly Phe Asn Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Thr Gln Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Lys Asp Gly Ser Gln Asp Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Glu Lys 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ala Ile Val Gln Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Leu Glu Leu Gln 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Ser Lys His Tyr Val Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly 340 345 350 Ser His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Val Ala Glu Ile Ala Gly Asn 355 360 365 Ile Pro Gly Ala Leu Pro Glu His Thr Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asn His Arg Ala Lys Gly Gln Leu Tyr Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp Asn Asp Ile Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Thr Lys Ser Arg Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile 420 425 430 Tyr Trp Arg Pro Gln Ser Arg Lys Leu Tyr Ala Ile Lys Ser Ser Lys 435 440 445 Met Met Leu Gln Pro Thr Thr 450 455 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 4 Met Tyr Thr Ile Lys Leu Phe Leu Phe Ile Ile Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Lys Ile Asp Arg Asp Tyr Ser Ser Tyr Asp Ser Val Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Val Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Arg Tyr Leu Glu Lys Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Leu Ile Lys Asn Gln Pro Glu Ile Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Glu Gln Tyr Arg Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Asn Val Ile Gln 195 200 205 Glu Ser Thr Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg Thr 210 215 220 Thr Pro Phe Leu His Leu Asn Glu Thr Lys Asn Val Glu His Asn Asp 225 230 235 240 Ile Pro Ala Asn Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 245 250 255 Gly Ile Tyr Ser Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe Asn Val Tyr 260 265 270 Cys Asp Val Lys Ser Gly Ser Ser Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 275 280 285 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Arg Tyr Gly 290 295 300 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 305 310 315 320 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 325 330 335 Trp Asn Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Phe Phe His Leu Gly Asn 340 345 350 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Glu Ile Thr Gly Asn Ile 355 360 365 Leu Asn Ala Leu Pro Glu His Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 370 375 380 His Lys Ala Lys Gly His Val Asn Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly Gly 385 390 395 400 Trp Trp Trp His Asn Val Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 405 410 415 Asn Lys Gln Arg Ala Lys Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Tyr 420 425 430 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 435 440 445 Leu Ile His Pro Ile Asp Ser Glu Ser Ser Glu 450 455 <210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 5 Met Tyr Thr Ile Lys Leu Phe Leu Val Ile Ala Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Asp Ser Ile Pro Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ser Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Lys Leu Ile Lys Asn Gln Pro Glu Ile Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Met Glu Glu Gln Tyr Arg Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Gly Ile 195 200 205 Gln Glu Ser Thr Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Ser Phe His Leu Asn Glu Thr Lys Asp Val Glu His Asp 225 230 235 240 Asp Phe Pro Ala Asp Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Ile Tyr Ser Ile Lys Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe Asn Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Ser Trp Ile Leu Ile Gln Arg Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Gln Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Phe Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Arg Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Thr Ile Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Glu Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Leu Pro Glu His Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly Gln Leu Asn Cys Leu Glu Ser Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Val Cys Gly Gly Asp Asn Pro Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ser Lys Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile 420 425 430 Cys Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Thr Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Ile Asp Ser Glu Ser Phe Glu Leu Arg Gln Ile 450 455 460 Lys Lys Pro Met Asn 465 <210> 6 <211> 459 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 6 Met Tyr Thr Ile Lys Leu Phe Leu Ile Ile Ala Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Thr Asp Gln Asp Tyr Thr Ser Leu Asp Ser Ile Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Ala Thr Ser Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asp Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Arg Tyr Leu Glu Asp Gln 130 135 140 Leu Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Pro Gln Ile Gln Glu Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Leu Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Ile Val Glu Glu Gln Tyr Arg Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 Gln Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Gly Ile 195 200 205 Lys Glu Ser Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Ser Phe His Ser Asn Glu Thr Lys Asn Val Glu His Asp 225 230 235 240 Asp Ile Pro Ala Asp Cys Thr Ile Ile Tyr Asn Gln Gly Lys His Thr 245 250 255 Ser Gly Ile Tyr Ser Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe Asn Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Lys Ser Gly Ser Ser Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Met Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Lys Tyr Tyr Thr Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly Asp 340 345 350 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Ala Glu Ile Ser Gly Asn Gly 355 360 365 Pro Lys Ala Phe Pro Glu His Lys Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp Asp 370 375 380 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Ser Asn Ser Gly Gly 385 390 395 400 Trp Trp Tyr His Asp Val Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 405 410 415 Asn Lys Pro Lys Ala Lys Ala Lys Pro Glu Arg Lys Glu Gly Ile Cys 420 425 430 Trp Lys Ser Gln Asp Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ala Thr Lys Met 435 440 445 Leu Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Asn Ser Glu 450 455 <210> 7 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro 1 5 10 15 Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His 20 25 30 Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His 35 40 45 Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His 50 55 60 Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His 65 70 75 80 Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys 85 90 95 Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys 100 105 110 Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu 115 120 125 Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu 130 135 140 Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160 Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr 165 170 175 Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser 180 185 190 Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly 195 200 205 Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly 210 215 220 Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr 225 230 235 240 Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp 245 <210> 8 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 195 200 205 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 210 215 220 Met Leu Ile His Pro Thr Asp 225 230 <210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Thr Asp 225 <210> 10 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser 180 185 190 Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 220 <210> 11 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 195 200 205 Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 <210> 12 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K423Q <400> 12 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460 <210> 13 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K423S <400> 13 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460 <210> 14 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 207-460 K423Q <400> 14 Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro 1 5 10 15 Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His 20 25 30 Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His 35 40 45 Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His 50 55 60 Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His 65 70 75 80 Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys 85 90 95 Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys 100 105 110 Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu 115 120 125 Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu 130 135 140 Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160 Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr 165 170 175 Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser 180 185 190 Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly 195 200 205 Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly 210 215 220 Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr 225 230 235 240 Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 245 250 <210> 15 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 207-460 K423S <400> 15 Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro 1 5 10 15 Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His 20 25 30 Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His 35 40 45 Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His 50 55 60 Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His 65 70 75 80 Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys 85 90 95 Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys 100 105 110 Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu 115 120 125 Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu 130 135 140 Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160 Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr 165 170 175 Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser 180 185 190 Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly 195 200 205 Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly 210 215 220 Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr 225 230 235 240 Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 245 250 <210> 16 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-460 K423Q <400> 16 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 195 200 205 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 210 215 220 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 235 <210> 17 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-460 K423S <400> 17 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 195 200 205 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 210 215 220 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 235 <210> 18 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-460 S424T <400> 18 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 195 200 205 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 210 215 220 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 235 <210> 19 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 226-460 K423Q <400> 19 Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 20 25 30 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 35 40 45 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 50 55 60 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 85 90 95 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 115 120 125 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 130 135 140 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 145 150 155 160 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 165 170 175 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 180 185 190 Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 195 200 205 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 210 215 220 Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 235 <210> 20 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 226-460 K423S <400> 20 Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 20 25 30 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 35 40 45 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 50 55 60 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 85 90 95 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 115 120 125 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 130 135 140 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 145 150 155 160 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 165 170 175 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 180 185 190 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 195 200 205 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 210 215 220 Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 235 <210> 21 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-460 K423Q <400> 21 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 <210> 22 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-460 K423S <400> 22 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 <210> 23 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-460 S424T <400> 23 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Lys Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 <210> 24 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233-460 K423Q <400> 24 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser 180 185 190 Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser 210 215 220 Glu Ser Phe Glu 225 <210> 25 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233-460 K423S <400> 25 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser 180 185 190 Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser 210 215 220 Glu Ser Phe Glu 225 <210> 26 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 241-460 K423Q <400> 26 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 195 200 205 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 210 215 220 <210> 27 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 241-460 K423S <400> 27 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 195 200 205 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 210 215 220 <210> 28 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 242-460 K423Q <400> 28 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 20 25 30 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 50 55 60 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 85 90 95 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 100 105 110 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 115 120 125 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 130 135 140 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 165 170 175 Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 180 185 190 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 195 200 205 Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 210 215 <210> 29 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 242-460 K423S <400> 29 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 20 25 30 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 50 55 60 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 85 90 95 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 100 105 110 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 115 120 125 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 130 135 140 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 165 170 175 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 180 185 190 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 195 200 205 Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 210 215 <210> 30 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-455 K423Q <400> 30 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 195 200 205 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 210 215 220 Met Leu Ile His Pro Thr Asp 225 230 <210> 31 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-455 K423S <400> 31 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 195 200 205 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 210 215 220 Met Leu Ile His Pro Thr Asp 225 230 <210> 32 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 226-455 K423Q <400> 32 Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 20 25 30 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 35 40 45 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 50 55 60 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 85 90 95 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 115 120 125 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 130 135 140 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 145 150 155 160 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 165 170 175 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 180 185 190 Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 195 200 205 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 210 215 220 Leu Ile His Pro Thr Asp 225 230 <210> 33 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 226-455 K423S <400> 33 Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 20 25 30 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 35 40 45 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 50 55 60 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 85 90 95 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 115 120 125 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 130 135 140 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 145 150 155 160 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 165 170 175 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 180 185 190 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 195 200 205 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 210 215 220 Leu Ile His Pro Thr Asp 225 230 <210> 34 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-455 K423Q <400> 34 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Thr Asp 225 <210> 35 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-455 K423S <400> 35 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Thr Asp 225 <210> 36 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233-455 K423Q <400> 36 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser 180 185 190 Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 220 <210> 37 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233-455 K423S <400> 37 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser 180 185 190 Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 220 <210> 38 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 241-455 K423Q <400> 38 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 195 200 205 Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 <210> 39 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 241-455 K423S <400> 39 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 195 200 205 Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 242-455 K423Q <400> 40 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 20 25 30 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 50 55 60 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 85 90 95 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 100 105 110 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 115 120 125 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 130 135 140 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 165 170 175 Asn Lys Pro Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 180 185 190 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 195 200 205 Leu Ile His Pro Thr Asp 210 <210> 41 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 242-455 K423S <400> 41 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 20 25 30 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 50 55 60 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 85 90 95 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 100 105 110 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 115 120 125 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 130 135 140 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 165 170 175 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 180 185 190 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 195 200 205 Leu Ile His Pro Thr Asp 210 <210> 42 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> canine 227 K423Q <400> 42 Phe Leu His Leu Asn Glu Thr Lys Asn Val Glu His Asn Asp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Asn Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Ile 20 25 30 Tyr Ser Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe Asn Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Lys Ser Gly Ser Ser Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Arg Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Asn 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Phe Phe His Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Glu Ile Thr Gly Asn Ile Leu Asn 130 135 140 Ala Leu Pro Glu His Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Val Asn Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asn Val Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Gln Arg Ala Gln Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Tyr Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Ile Asp Ser Glu Ser Ser Glu 225 230 <210> 43 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> canine 227 K423S <400> 43 Phe Leu His Leu Asn Glu Thr Lys Asn Val Glu His Asn Asp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Asn Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Ile 20 25 30 Tyr Ser Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe Asn Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Lys Ser Gly Ser Ser Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Arg Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Asn 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Phe Phe His Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Glu Ile Thr Gly Asn Ile Leu Asn 130 135 140 Ala Leu Pro Glu His Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Val Asn Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asn Val Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Gln Arg Ala Ser Thr Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Tyr Trp Lys 195 200 205 Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile 210 215 220 His Pro Ile Asp Ser Glu Ser Ser Glu 225 230 <210> 44 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 225WT <400> 44 actactccct ttcttcagtt gaatgaaata agaaatgtaa aacatgatgg cattcctgct 60 gaatgtacca ccatttataa cagaggtgaa catacaagtg gcatgtatgc catcagaccc 120 agcaactctc aagtttttca tgtctactgt gatgttatat caggtagtcc atggacatta 180 attcaacatc gaatagatgg atcacaaaac ttcaatgaaa cgtgggagaa ctacaaatat 240 ggttttggga ggcttgatgg agaattttgg ttgggcctag agaagatata ctccatagtg 300 aagcaatcta attatgtttt acgaattgag ttggaagact ggaaagacaa caaacattat 360 attgaatatt ctttttactt gggaaatcac gaaaccaact atacgctaca tctagttgcg 420 attactggca atgtccccaa tgcaatcccg gaaaacaaag atttggtgtt ttctacttgg 480 gatcacaaag caaaaggaca cttcaactgt ccagagggtt attcaggagg ctggtggtgg 540 catgatgagt gtggagaaaa caacctaaat ggtaaatata acaaaccaag agcaaaatct 600 aagccagaga ggagaagagg attatcttgg aagtctcaaa atggaaggtt atactctata 660 aaatcaacca aaatgttgat ccatccaaca gattcagaaa gctttgaa 708 <210> 45 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 225 K423Q <400> 45 actactccct ttcttcagtt gaatgaaata agaaatgtaa aacatgatgg cattcctgct 60 gaatgtacca ccatttataa cagaggtgaa catacaagtg gcatgtatgc catcagaccc 120 agcaactctc aagtttttca tgtctactgt gatgttatat caggtagtcc atggacatta 180 attcaacatc gaatagatgg atcacaaaac ttcaatgaaa cgtgggagaa ctacaaatat 240 ggttttggga ggcttgatgg agaattttgg ttgggcctag agaagatata ctccatagtg 300 aagcaatcta attatgtttt acgaattgag ttggaagact ggaaagacaa caaacattat 360 attgaatatt ctttttactt gggaaatcac gaaaccaact atacgctaca tctagttgcg 420 attactggca atgtccccaa tgcaatcccg gaaaacaaag atttggtgtt ttctacttgg 480 gatcacaaag caaaaggaca cttcaactgt ccagagggtt attcaggagg ctggtggtgg 540 catgatgagt gtggagaaaa caacctaaat ggtaaatata acaaaccaag agcacaatct 600 aagccagaga ggagaagagg attatcttgg aagtctcaaa atggaaggtt atactctata 660 aaatcaacca aaatgttgat ccatccaaca gattcagaaa gctttgaa 708 <210> 46 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 225 K423S <400> 46 actactccct ttcttcagtt gaatgaaata agaaatgtaa aacatgatgg cattcctgct 60 gaatgtacca ccatttataa cagaggtgaa catacaagtg gcatgtatgc catcagaccc 120 agcaactctc aagtttttca tgtctactgt gatgttatat caggtagtcc atggacatta 180 attcaacatc gaatagatgg atcacaaaac ttcaatgaaa cgtgggagaa ctacaaatat 240 ggttttggga ggcttgatgg agaattttgg ttgggcctag agaagatata ctccatagtg 300 aagcaatcta attatgtttt acgaattgag ttggaagact ggaaagacaa caaacattat 360 attgaatatt ctttttactt gggaaatcac gaaaccaact atacgctaca tctagttgcg 420 attactggca atgtccccaa tgcaatcccg gaaaacaaag atttggtgtt ttctacttgg 480 gatcacaaag caaaaggaca cttcaactgt ccagagggtt attcaggagg ctggtggtgg 540 catgatgagt gtggagaaaa caacctaaat ggtaaatata acaaaccaag agcaagctct 600 aagccagaga ggagaagagg attatcttgg aagtctcaaa atggaaggtt atactctata 660 aaatcaacca aaatgttgat ccatccaaca gattcagaaa gctttgaa 708 <210> 47 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 226 K423Q <400> 47 actccctttc ttcagttgaa tgaaataaga aatgtaaaac atgatggcat tcctgctgaa 60 tgtaccacca tttataacag aggtgaacat acaagtggca tgtatgccat cagacccagc 120 aactctcaag tttttcatgt ctactgtgat gttatatcag gtagtccatg gacattaatt 180 caacatcgaa tagatggatc acaaaacttc aatgaaacgt gggagaacta caaatatggt 240 tttgggaggc ttgatggaga attttggttg ggcctagaga agatatactc catagtgaag 300 caatctaatt atgttttacg aattgagttg gaagactgga aagacaacaa acattatatt 360 gaatattctt tttacttggg aaatcacgaa accaactata cgctacatct agttgcgatt 420 actggcaatg tccccaatgc aatcccggaa aacaaagatt tggtgttttc tacttgggat 480 cacaaagcaa aaggacactt caactgtcca gagggttatt caggaggctg gtggtggcat 540 gatgagtgtg gagaaaacaa cctaaatggt aaatataaca aaccaagagc acaatctaag 600 ccagagagga gaagaggatt atcttggaag tctcaaaatg gaaggttata ctctataaaa 660 tcaaccaaaa tgttgatcca tccaacagat tcagaaagct ttgaa 705 <210> 48 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 226 K423S <400> 48 actccctttc ttcagttgaa tgaaataaga aatgtaaaac atgatggcat tcctgctgaa 60 tgtaccacca tttataacag aggtgaacat acaagtggca tgtatgccat cagacccagc 120 aactctcaag tttttcatgt ctactgtgat gttatatcag gtagtccatg gacattaatt 180 caacatcgaa tagatggatc acaaaacttc aatgaaacgt gggagaacta caaatatggt 240 tttgggaggc ttgatggaga attttggttg ggcctagaga agatatactc catagtgaag 300 caatctaatt atgttttacg aattgagttg gaagactgga aagacaacaa acattatatt 360 gaatattctt tttacttggg aaatcacgaa accaactata cgctacatct agttgcgatt 420 actggcaatg tccccaatgc aatcccggaa aacaaagatt tggtgttttc tacttgggat 480 cacaaagcaa aaggacactt caactgtcca gagggttatt caggaggctg gtggtggcat 540 gatgagtgtg gagaaaacaa cctaaatggt aaatataaca aaccaagagc aagctctaag 600 ccagagagga gaagaggatt atcttggaag tctcaaaatg gaaggttata ctctataaaa 660 tcaaccaaaa tgttgatcca tccaacagat tcagaaagct ttgaa 705 <210> 49 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 228 K423Q <400> 49 tttcttcagt tgaatgaaat aagaaatgta aaacatgatg gcattcctgc tgaatgtacc 60 accatttata acagaggtga acatacaagt ggcatgtatg ccatcagacc cagcaactct 120 caagtttttc atgtctactg tgatgttata tcaggtagtc catggacatt aattcaacat 180 cgaatagatg gatcacaaaa cttcaatgaa acgtgggaga actacaaata tggttttggg 240 aggcttgatg gagaattttg gttgggccta gagaagatat actccatagt gaagcaatct 300 aattatgttt tacgaattga gttggaagac tggaaagaca acaaacatta tattgaatat 360 tctttttact tgggaaatca cgaaaccaac tatacgctac atctagttgc gattactggc 420 aatgtcccca atgcaatccc ggaaaacaaa gatttggtgt tttctacttg ggatcacaaa 480 gcaaaaggac acttcaactg tccagagggt tattcaggag gctggtggtg gcatgatgag 540 tgtggagaaa acaacctaaa tggtaaatat aacaaaccaa gagcacaatc taagccagag 600 aggagaagag gattatcttg gaagtctcaa aatggaaggt tatactctat aaaatcaacc 660 aaaatgttga tccatccaac agattcagaa agctttgaa 699 <210> 50 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 228 K423S <400> 50 tttcttcagt tgaatgaaat aagaaatgta aaacatgatg gcattcctgc tgaatgtacc 60 accatttata acagaggtga acatacaagt ggcatgtatg ccatcagacc cagcaactct 120 caagtttttc atgtctactg tgatgttata tcaggtagtc catggacatt aattcaacat 180 cgaatagatg gatcacaaaa cttcaatgaa acgtgggaga actacaaata tggttttggg 240 aggcttgatg gagaattttg gttgggccta gagaagatat actccatagt gaagcaatct 300 aattatgttt tacgaattga gttggaagac tggaaagaca acaaacatta tattgaatat 360 tctttttact tgggaaatca cgaaaccaac tatacgctac atctagttgc gattactggc 420 aatgtcccca atgcaatccc ggaaaacaaa gatttggtgt tttctacttg ggatcacaaa 480 gcaaaaggac acttcaactg tccagagggt tattcaggag gctggtggtg gcatgatgag 540 tgtggagaaa acaacctaaa tggtaaatat aacaaaccaa gagcaagctc taagccagag 600 aggagaagag gattatcttg gaagtctcaa aatggaaggt tatactctat aaaatcaacc 660 aaaatgttga tccatccaac agattcagaa agctttgaa 699 <210> 51 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 233 K423Q <400> 51 gaaataagaa atgtaaaaca tgatggcatt cctgctgaat gtaccaccat ttataacaga 60 ggtgaacata caagtggcat gtatgccatc agacccagca actctcaagt ttttcatgtc 120 tactgtgatg ttatatcagg tagtccatgg acattaattc aacatcgaat agatggatca 180 caaaacttca atgaaacgtg ggagaactac aaatatggtt ttgggaggct tgatggagaa 240 ttttggttgg gcctagagaa gatatactcc atagtgaagc aatctaatta tgttttacga 300 attgagttgg aagactggaa agacaacaaa cattatattg aatattcttt ttacttggga 360 aatcacgaaa ccaactatac gctacatcta gttgcgatta ctggcaatgt ccccaatgca 420 atcccggaaa acaaagattt ggtgttttct acttgggatc acaaagcaaa aggacacttc 480 aactgtccag agggttattc aggaggctgg tggtggcatg atgagtgtgg agaaaacaac 540 ctaaatggta aatataacaa accaagagca caatctaagc cagagaggag aagaggatta 600 tcttggaagt ctcaaaatgg aaggttatac tctataaaat caaccaaaat gttgatccat 660 ccaacagatt cagaaagctt tgaa 684 <210> 52 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 233 K423S <400> 52 gaaataagaa atgtaaaaca tgatggcatt cctgctgaat gtaccaccat ttataacaga 60 ggtgaacata caagtggcat gtatgccatc agacccagca actctcaagt ttttcatgtc 120 tactgtgatg ttatatcagg tagtccatgg acattaattc aacatcgaat agatggatca 180 caaaacttca atgaaacgtg ggagaactac aaatatggtt ttgggaggct tgatggagaa 240 ttttggttgg gcctagagaa gatatactcc atagtgaagc aatctaatta tgttttacga 300 attgagttgg aagactggaa agacaacaaa cattatattg aatattcttt ttacttggga 360 aatcacgaaa ccaactatac gctacatcta gttgcgatta ctggcaatgt ccccaatgca 420 atcccggaaa acaaagattt ggtgttttct acttgggatc acaaagcaaa aggacacttc 480 aactgtccag agggttattc aggaggctgg tggtggcatg atgagtgtgg agaaaacaac 540 ctaaatggta aatataacaa accaagagca agctctaagc cagagaggag aagaggatta 600 tcttggaagt ctcaaaatgg aaggttatac tctataaaat caaccaaaat gttgatccat 660 ccaacagatt cagaaagctt tgaa 684 <210> 53 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 241 K423Q <400> 53 ggcattcctg ctgaatgtac caccatttat aacagaggtg aacatacaag tggcatgtat 60 gccatcagac ccagcaactc tcaagttttt catgtctact gtgatgttat atcaggtagt 120 ccatggacat taattcaaca tcgaatagat ggatcacaaa acttcaatga aacgtgggag 180 aactacaaat atggttttgg gaggcttgat ggagaatttt ggttgggcct agagaagata 240 tactccatag tgaagcaatc taattatgtt ttacgaattg agttggaaga ctggaaagac 300 aacaaacatt atattgaata ttctttttac ttgggaaatc acgaaaccaa ctatacgcta 360 catctagttg cgattactgg caatgtcccc aatgcaatcc cggaaaacaa agatttggtg 420 ttttctactt gggatcacaa agcaaaagga cacttcaact gtccagaggg ttattcagga 480 ggctggtggt ggcatgatga gtgtggagaa aacaacctaa atggtaaata taacaaacca 540 agagcacaat ctaagccaga gaggagaaga ggattatctt ggaagtctca aaatggaagg 600 ttatactcta taaaatcaac caaaatgttg atccatccaa cagattcaga aagctttgaa 660 <210> 54 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 241 K423S <400> 54 ggcattcctg ctgaatgtac caccatttat aacagaggtg aacatacaag tggcatgtat 60 gccatcagac ccagcaactc tcaagttttt catgtctact gtgatgttat atcaggtagt 120 ccatggacat taattcaaca tcgaatagat ggatcacaaa acttcaatga aacgtgggag 180 aactacaaat atggttttgg gaggcttgat ggagaatttt ggttgggcct agagaagata 240 tactccatag tgaagcaatc taattatgtt ttacgaattg agttggaaga ctggaaagac 300 aacaaacatt atattgaata ttctttttac ttgggaaatc acgaaaccaa ctatacgcta 360 catctagttg cgattactgg caatgtcccc aatgcaatcc cggaaaacaa agatttggtg 420 ttttctactt gggatcacaa agcaaaagga cacttcaact gtccagaggg ttattcagga 480 ggctggtggt ggcatgatga gtgtggagaa aacaacctaa atggtaaata taacaaacca 540 agagcaagct ctaagccaga gaggagaaga ggattatctt ggaagtctca aaatggaagg 600 ttatactcta taaaatcaac caaaatgttg atccatccaa cagattcaga aagctttgaa 660 <210> 55 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 242 K423Q <400> 55 attcctgctg aatgtaccac catttataac agaggtgaac atacaagtgg catgtatgcc 60 atcagaccca gcaactctca agtttttcat gtctactgtg atgttatatc aggtagtcca 120 tggacattaa ttcaacatcg aatagatgga tcacaaaact tcaatgaaac gtgggagaac 180 tacaaatatg gttttgggag gcttgatgga gaattttggt tgggcctaga gaagatatac 240 tccatagtga agcaatctaa ttatgtttta cgaattgagt tggaagactg gaaagacaac 300 aaacattata ttgaatattc tttttacttg ggaaatcacg aaaccaacta tacgctacat 360 ctagttgcga ttactggcaa tgtccccaat gcaatcccgg aaaacaaaga tttggtgttt 420 tctacttggg atcacaaagc aaaaggacac ttcaactgtc cagagggtta ttcaggaggc 480 tggtggtggc atgatgagtg tggagaaaac aacctaaatg gtaaatataa caaaccaaga 540 gcacaatcta agccagagag gagaagagga ttatcttgga agtctcaaaa tggaaggtta 600 tactctataa aatcaaccaa aatgttgatc catccaacag attcagaaag ctttgaa 657 <210> 56 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 242 K423S <400> 56 attcctgctg aatgtaccac catttataac agaggtgaac atacaagtgg catgtatgcc 60 atcagaccca gcaactctca agtttttcat gtctactgtg atgttatatc aggtagtcca 120 tggacattaa ttcaacatcg aatagatgga tcacaaaact tcaatgaaac gtgggagaac 180 tacaaatatg gttttgggag gcttgatgga gaattttggt tgggcctaga gaagatatac 240 tccatagtga agcaatctaa ttatgtttta cgaattgagt tggaagactg gaaagacaac 300 aaacattata ttgaatattc tttttacttg ggaaatcacg aaaccaacta tacgctacat 360 ctagttgcga ttactggcaa tgtccccaat gcaatcccgg aaaacaaaga tttggtgttt 420 tctacttggg atcacaaagc aaaaggacac ttcaactgtc cagagggtta ttcaggaggc 480 tggtggtggc atgatgagtg tggagaaaac aacctaaatg gtaaatataa caaaccaaga 540 gcaagctcta agccagagag gagaagagga ttatcttgga agtctcaaaa tggaaggtta 600 tactctataa aatcaaccaa aatgttgatc catccaacag attcagaaag ctttgaa 657 <210> 57 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding canine 227KQ <400> 57 tttttgcatc tcaacgaaac gaagaatgtc gaacacaacg acattccggc aaattgcaca 60 actatctaca atagaggcga acatacgtcc ggtatctact ccattagacc ttcaaacagc 120 caggtattca atgtgtactg cgatgtaaag tcaggatcgt catggacact gatccagcat 180 aggatcgacg ggtcccagaa cttcaacgag acatgggaga actaccgcta tggatttgga 240 aggctggatg gggagttctg gttgggactt gagaaaatct acagcattgt gaagcagtcg 300 aactacattc tccggattga actggaggac tggaatgaca acaaacacta catcgagtat 360 ttctttcatc tcggcaacca tgaaacgaat tacaccttgc accttgtgga aatcacgggc 420 aacattttga acgcgctgcc agaacacaaa gacctggtgt tttcgacatg ggatcacaaa 480 gcaaaggggc acgtgaactg tcccgaatca tatagcgggg gatggtggtg gcacaatgtc 540 tgtggtgaga acaatctcaa cgggaaatac aataagcagc gagctcagac gaaacccgag 600 cggcggagag gtctgtattg gaagtcgcag aatggacgcc tgtattcgat caaatcgacg 660 aaaatgctca tccaccccat cgactccgaa tcgtcggag 699 <210> 58 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 201-460 K423del <400> 58 Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro 1 5 10 15 Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His 20 25 30 Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His 35 40 45 Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His 50 55 60 Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His 65 70 75 80 Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys 85 90 95 Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys 100 105 110 Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu 115 120 125 Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu 130 135 140 Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly 145 150 155 160 Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr 165 170 175 Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser 180 185 190 Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly 195 200 205 Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 210 215 220 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 225 230 235 240 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 245 250 <210> 59 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-460 K423del <400> 59 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 195 200 205 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 210 215 220 Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 235 <210> 60 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 226-460 K423del <400> 60 Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 20 25 30 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 35 40 45 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 50 55 60 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 85 90 95 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 115 120 125 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 130 135 140 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 145 150 155 160 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 165 170 175 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 180 185 190 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp 195 200 205 Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu 210 215 220 Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 <210> 61 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-460 K423del <400> 61 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser 195 200 205 Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His 210 215 220 Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 225 230 <210> 62 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233-460 K423del <400> 62 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys 180 185 190 Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu 195 200 205 Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu 210 215 220 Ser Phe Glu 225 <210> 63 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 241-460 K423del <400> 63 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 180 185 190 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 195 200 205 Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 210 215 <210> 64 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 242-460 K423del <400> 64 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 20 25 30 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 50 55 60 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 85 90 95 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 100 105 110 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 115 120 125 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 130 135 140 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 165 170 175 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp 180 185 190 Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu 195 200 205 Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 210 215 <210> 65 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 225-455 K423del <400> 65 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 20 25 30 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 35 40 45 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 85 90 95 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 115 120 125 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 130 135 140 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 145 150 155 160 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 165 170 175 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 195 200 205 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 210 215 220 Leu Ile His Pro Thr Asp 225 230 <210> 66 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 226-455 K423del <400> 66 Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 20 25 30 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 35 40 45 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 50 55 60 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 85 90 95 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 100 105 110 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 115 120 125 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 130 135 140 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 145 150 155 160 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 165 170 175 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 180 185 190 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp 195 200 205 Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu 210 215 220 Ile His Pro Thr Asp 225 <210> 67 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 228-455 K423del <400> 67 Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met 20 25 30 Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly 50 55 60 Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly 65 70 75 80 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile 85 90 95 Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys 100 105 110 Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu 115 120 125 Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn 130 135 140 Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 165 170 175 Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 180 185 190 Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser 195 200 205 Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His 210 215 220 Pro Thr Asp 225 <210> 68 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 233-455 K423del <400> 68 Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro 20 25 30 Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser 35 40 45 Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn 50 55 60 Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn 85 90 95 Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr 100 105 110 Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 115 120 125 His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn 130 135 140 Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys 165 170 175 Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys 180 185 190 Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu 195 200 205 Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp 210 215 220 <210> 69 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 241-455 K423del <400> 69 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 1 5 10 15 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 20 25 30 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 35 40 45 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 50 55 60 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 100 105 110 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 130 135 140 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser 180 185 190 Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met 195 200 205 Leu Ile His Pro Thr Asp 210 <210> 70 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 242-455 K423del <400> 70 Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser 1 5 10 15 Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr 20 25 30 Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile 35 40 45 Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly 50 55 60 Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp 85 90 95 Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn 100 105 110 His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val 115 120 125 Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp 130 135 140 His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr 165 170 175 Asn Lys Pro Arg Ala Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp 180 185 190 Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu 195 200 205 Ile His Pro Thr Asp 210 <210> 71 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Lys Thr Phe Thr Trp Thr Leu Gly Val Leu Phe Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Asp Thr Gly His Cys Arg Gly Gly Gln Phe Lys Ile Lys Lys Ile Asn 20 25 30 Gln Arg Arg Tyr Pro Arg Ala Thr Asp Gly Lys Glu Glu Ala Lys Lys 35 40 45 Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Val Pro Glu Gln Arg Ile Thr Gly Pro Ile 50 55 60 Cys Val Asn Thr Lys Gly Gln Asp Ala Ser Thr Ile Lys Asp Met Ile 65 70 75 80 Thr Arg Met Asp Leu Glu Asn Leu Lys Asp Val Leu Ser Arg Gln Lys 85 90 95 Arg Glu Ile Asp Val Leu Gln Leu Val Val Asp Val Asp Gly Asn Ile 100 105 110 Val Asn Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Asn Met Asn Ser 115 120 125 Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu Ile Ile Arg Lys 130 135 140 Arg Asp Asn Ser Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn Lys Ile Leu Asn 145 150 155 160 Val Thr Thr Glu Met Leu Lys Met Ala Thr Arg Tyr Arg Glu Leu Glu 165 170 175 Val Lys Tyr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Val Asn Asn Gln Ser Val Met 180 185 190 Ile Thr Leu Leu Glu Glu Gln Cys Leu Arg Ile Phe Ser Arg Gln Asp 195 200 205 Thr His Val Ser Pro Pro Leu Val Gln Val Val Pro Gln His Ile Pro 210 215 220 Asn Ser Gln Gln Tyr Thr Pro Gly Leu Leu Gly Gly Asn Glu Ile Gln 225 230 235 240 Arg Asp Pro Gly Tyr Pro Arg Asp Leu Met Pro Pro Pro Asp Leu Ala 245 250 255 Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro Phe Lys Ile Pro Pro Val Thr Phe Ile 260 265 270 Asn Glu Gly Pro Phe Lys Asp Cys Gln Gln Ala Lys Glu Ala Gly His 275 280 285 Ser Val Ser Gly Ile Tyr Met Ile Lys Pro Glu Asn Ser Asn Gly Pro 290 295 300 Met Gln Leu Trp Cys Glu Asn Ser Leu Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val 305 310 315 320 Ile Gln Lys Arg Thr Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu 325 330 335 Asn Tyr Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly 340 345 350 Leu Glu Asn Ile Tyr Met Leu Ser Asn Gln Asp Asn Tyr Lys Leu Leu 355 360 365 Ile Glu Leu Glu Asp Trp Ser Asp Lys Lys Val Tyr Ala Glu Tyr Ser 370 375 380 Ser Phe Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Phe Tyr Arg Leu Arg Leu Gly 385 390 395 400 Thr Tyr Gln Gly Asn Ala Gly Asp Ser Met Met Trp His Asn Gly Lys 405 410 415 Gln Phe Thr Thr Leu Asp Arg Asp Lys Asp Met Tyr Ala Gly Asn Cys 420 425 430 Ala His Phe His Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser 435 440 445 Asn Leu Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Lys His 450 455 460 Gln Asp Gly Ile Phe Trp Ala Glu Tyr Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu 465 470 475 480 Arg Ala Val Gln Met Met Ile Lys Pro Ile Asp 485 490 <210> 72 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cterminal hANGPTL1 271-491 <400> 72 Phe Ile Asn Glu Gly Pro Phe Lys Asp Cys Gln Gln Ala Lys Glu Ala 1 5 10 15 Gly His Ser Val Ser Gly Ile Tyr Met Ile Lys Pro Glu Asn Ser Asn 20 25 30 Gly Pro Met Gln Leu Trp Cys Glu Asn Ser Leu Asp Pro Gly Gly Trp 35 40 45 Thr Val Ile Gln Lys Arg Thr Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn 50 55 60 Trp Glu Asn Tyr Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp 65 70 75 80 Leu Gly Leu Glu Asn Ile Tyr Met Leu Ser Asn Gln Asp Asn Tyr Lys 85 90 95 Leu Leu Ile Glu Leu Glu Asp Trp Ser Asp Lys Lys Val Tyr Ala Glu 100 105 110 Tyr Ser Ser Phe Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Phe Tyr Arg Leu Arg 115 120 125 Leu Gly Thr Tyr Gln Gly Asn Ala Gly Asp Ser Met Met Trp His Asn 130 135 140 Gly Lys Gln Phe Thr Thr Leu Asp Arg Asp Lys Asp Met Tyr Ala Gly 145 150 155 160 Asn Cys Ala His Phe His Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala 165 170 175 His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser 180 185 190 Lys His Gln Asp Gly Ile Phe Trp Ala Glu Tyr Arg Gly Gly Ser Tyr 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Val Gln Met Met Ile Lys Pro Ile Asp 210 215 220 <210> 73 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe 180 185 190 Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly 195 200 205 Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp 210 215 220 Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro 225 230 235 240 Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp 245 250 255 Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg 260 265 270 Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln 275 280 285 Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu 290 295 300 Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg 325 330 335 Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly 340 345 350 Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro 355 360 365 Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg 370 375 380 Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met 385 390 395 400 Ala Ala Glu Ala Ala Ser 405 <210> 74 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cterminal hANGPTL4 179-406 <400> 74 Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln Val 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser Pro 20 25 30 Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr Val 35 40 45 Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu 50 55 60 Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly 65 70 75 80 Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala 85 90 95 Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser 100 105 110 Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala 115 120 125 Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu 130 135 140 Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp 145 150 155 160 Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys 165 170 175 Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln 180 185 190 Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg 195 200 205 Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala 210 215 220 Glu Ala Ala Ser 225

Claims (50)

  1. 표 1의 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 1에 관하여 결정시에 위치 423에서 K 또는 R 이외의 극성 아미노산인 아미노산을 포함하고, 연골형성 활성을 가지는 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 또는 서열 70 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 표 1의 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열인 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69 및 서열 70 중 어느 하나인 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64 중 어느 하나인 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 423에서의 아미노산이 Q 또는 S이거나 또는 위치 423에서의 아미노산이 결실되는 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 423에서의 아미노산이 Q인 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 423에서의 아미노산이 S인 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화되는 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민 (HSA), 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 폴리히스티딘, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 또는 말토스 결합 단백질 (MBP), 또는 그의 단편 중 어느 것과 융합되는 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 이종 펩티드가 폴리펩티드의 아미노-말단에서 융합되는 것인 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 이종 펩티드가 폴리펩티드의 카르복시-말단에서 융합되는 것인 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 히알루론산 또는 그의 유도체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 경구 연어 칼시토닌, SD-6010 (iNOS 억제제), 비타민 D3 (콜레칼시페롤), 콜라겐 가수분해물, FGF18, BMP7, 루살라타이드 아세테이트, 아보카도 소이 불검화물 (ASU), 카르토게닌, 스테로이드, 및 비-스테로이드성 항염증제 (NSAID)로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  21. 환자의 관절에 치료 유효량의 제18항의 제약 조성물을 투여하고, 그에 따라 환자에서 관절염 또는 관절 손상을 치료, 개선 또는 예방하는 것을 포함하는, 환자에서 관절염 또는 관절 손상을 치료, 개선 또는 예방하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 환자가 관절염 또는 관절 손상을 갖는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 환자가 관절염 또는 관절 손상에 대한 위험에 처해 있는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 관절염이 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 히알루론산을 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 환부 관절에의 외과적 처치를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 외과적 처치 중에 또는 후에 투여되는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 제약 조성물이 골수 자극, 연골 교체, 자가 연골세포 이식 (ACI), 매트릭스-유도 자가 연골세포 이식 (MACI) 중 어느 하나와 함께 투여되는 것인 방법.
  29. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 하나 이상의 추가의 연골형성 인자와 함께 투여되는 것인 방법.
  30. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물이 매트릭스 또는 생체적합성 스캐폴드 중에서 투여되는 것인 방법.
  31. 중간엽 줄기 세포를 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시켜 중간엽 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포에서 연골세포로의 분화를 유도하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 방법이 생체내에서 수행되고, 줄기 세포가 인간 대상체에 존재하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 대상체가 관절염 또는 관절 손상을 갖는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 대상체가 관절염 또는 관절 손상에 대한 위험에 처해 있는 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 관절염이 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염인 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 내 환부 관절에의 외과적 처치를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 외과적 처치 중에 또는 후에 투여되는 것인 방법.
  38. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 하나 이상의 추가의 연골형성 인자와 함께 투여되는 것인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 폴리펩티드가 골수 자극, 연골 교체, 자가 연골세포 이식 (ACI), 매트릭스-유도 자가 연골세포 이식 (MACI) 중 어느 하나와 함께 투여되는 것인 방법.
  40. 제36항에 있어서, 폴리펩티드가 매트릭스 또는 생체적합성 스캐폴드 중에서 투여되는 것인 방법.
  41. 관절 손상 또는 관절염을 갖거나 그의 위험에 처해 있는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 환자가 관절염 또는 관절 손상을 갖는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 환자가 관절염 또는 관절 손상에 대한 위험에 처해 있는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 관절염이 골관절염, 외상성 관절염 또는 자가면역 관절염인 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루론산 투여를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 환부 관절에의 외과적 처치를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 외과적 처치 중에 또는 후에 투여되는 것인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 폴리펩티드가 골수 자극, 연골 교체, 자가 연골세포 이식 (ACI), 매트릭스-유도 자가 연골세포 이식 (MACI) 중 어느 하나와 함께 투여되는 것인 방법.
  49. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 하나 이상의 추가의 연골형성 인자와 함께 또는 그에 더하여 투여되는 것인 방법.
  50. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 매트릭스 또는 생체적합성 스캐폴드와 함께 또는 그에 더하여 투여되는 것인 방법.
KR1020157027474A 2013-03-08 2014-03-07 관절 손상의 치료를 위한 펩티드 및 조성물 KR102267341B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361775400P 2013-03-08 2013-03-08
US61/775,400 2013-03-08
US201461938123P 2014-02-10 2014-02-10
US61/938,123 2014-02-10
PCT/US2014/022102 WO2014138687A1 (en) 2013-03-08 2014-03-07 Peptides and compositions for treatment of joint damage

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150125712A true KR20150125712A (ko) 2015-11-09
KR102267341B1 KR102267341B1 (ko) 2021-06-21

Family

ID=50390286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157027474A KR102267341B1 (ko) 2013-03-08 2014-03-07 관절 손상의 치료를 위한 펩티드 및 조성물

Country Status (39)

Country Link
US (4) US9649359B2 (ko)
EP (2) EP2964250B1 (ko)
JP (3) JP6567429B2 (ko)
KR (1) KR102267341B1 (ko)
CN (2) CN105025917B (ko)
AP (1) AP2015008675A0 (ko)
AU (3) AU2014225348B2 (ko)
BR (2) BR112015021269B1 (ko)
CA (1) CA2903448C (ko)
CL (1) CL2015002443A1 (ko)
CO (1) CO7461145A2 (ko)
CR (2) CR20200290A (ko)
CU (1) CU24301B1 (ko)
CY (1) CY1120729T1 (ko)
DK (1) DK2964250T3 (ko)
EA (1) EA035158B1 (ko)
EC (1) ECSP15042898A (ko)
ES (1) ES2684349T3 (ko)
HK (1) HK1214754A1 (ko)
HR (1) HRP20181269T1 (ko)
HU (1) HUE038499T2 (ko)
IL (1) IL240727B (ko)
JO (1) JO3564B1 (ko)
LT (1) LT2964250T (ko)
MX (1) MX365157B (ko)
MY (1) MY173172A (ko)
NZ (1) NZ711037A (ko)
PE (1) PE20151528A1 (ko)
PH (1) PH12015501983A1 (ko)
PL (1) PL2964250T3 (ko)
PT (1) PT2964250T (ko)
RS (1) RS57446B1 (ko)
SG (1) SG11201506490TA (ko)
SI (1) SI2964250T1 (ko)
TN (1) TN2015000385A1 (ko)
TW (1) TWI634124B (ko)
UY (1) UY35368A (ko)
WO (1) WO2014138687A1 (ko)
ZA (1) ZA201505966B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190062538A (ko) 2016-10-24 2019-06-05 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 세퍼레이터 및 세퍼레이터를 포함하는 이차 전지

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2453921T3 (pl) 2009-07-14 2015-11-30 Scripps Research Inst Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych
US9301971B2 (en) 2013-03-08 2016-04-05 Novartis Ag Peptides and compositions for treatment of joint damage
UY35368A (es) 2013-03-08 2014-10-31 Irm Llc Péptidos y composiciones para el tratamiento de daño articular
MX2019005621A (es) * 2016-11-14 2019-08-12 Novartis Ag Metodos y composiciones para el tratamiento del daño del cartilago y la artritis.
CN108530619B (zh) * 2017-03-01 2020-12-08 北京大学第三医院 功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶
EP3827008B1 (en) 2018-07-25 2024-07-31 Novartis AG Nlrp3 inflammasome inhibitors
TW202027794A (zh) * 2018-10-03 2020-08-01 瑞士商諾華公司 血管生成素樣３多肽之持續遞送
AR119731A1 (es) 2019-05-17 2022-01-05 Novartis Ag Inhibidores del inflamasoma nlrp3
CN111973617A (zh) * 2019-05-23 2020-11-24 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
MX2022000094A (es) * 2019-07-04 2022-04-27 Cadila Healthcare Ltd Vacuna a base de angptl3 para el tratamiento de enfermedad hepática.
KR102577697B1 (ko) * 2019-11-13 2023-09-14 주식회사 나이벡 염증 및 상처 치료용 펩타이드
JP7298496B2 (ja) 2020-01-31 2023-06-27 トヨタ自動車株式会社 車両
TW202306970A (zh) 2021-05-24 2023-02-16 瑞士商諾華公司 用於治療骨關節炎之方法
US20240238376A1 (en) 2021-05-24 2024-07-18 Novartis Ag Methods for the treatment of osteoarthritis
CN113683678B (zh) * 2021-09-15 2023-11-24 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途
CN113683681B (zh) * 2021-09-15 2023-10-03 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途
EP4430395A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Novartis AG Methods for determining the biological activity of angptl polypeptides
CN114377202B (zh) * 2021-12-16 2023-01-24 方向前 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法
TW202406550A (zh) 2022-08-03 2024-02-16 瑞士商諾華公司 Ｎｌｒｐ３炎性小體抑制劑
KR20240087877A (ko) * 2022-12-09 2024-06-20 (주)케어젠 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6348351B1 (en) * 1997-09-19 2002-02-19 Genentech, Inc. Tie receptor tyrosine kinase ligand homologues
US20030215451A1 (en) * 2001-11-16 2003-11-20 Napoleone Ferrara Composition comprising and method of using angiopoietin-like protein 3 Angptl3
WO2011008773A2 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 The Scripps Research Institute Mesenchymal stem cell differentiation

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
US5462990A (en) 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
US5288931A (en) 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
WO1999058660A1 (en) 1998-05-12 1999-11-18 Human Genome Sciences, Inc. 97 human secreted proteins
WO1999055869A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Zymogenetics, Inc. Novel polypeptide growth factors and materials and methods for making them
AU4643699A (en) 1998-06-24 2000-01-10 Compugen Ltd. Angiopoietin-like growth factor sequences
KR20010104373A (ko) 1999-03-08 2001-11-24 제넨테크, 인크. 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법
MXPA01009073A (es) 1999-03-10 2002-05-06 Phogen Ltd Suministro de acidos nucleicos y proteinas a las celulas.
GB9912350D0 (en) 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
DE60035693T2 (de) 1999-07-20 2008-05-15 Genentech, Inc., South San Francisco Zusammensetzung und verfahren zur behandlung von immunverwandten krankheiten
US20030013649A1 (en) 2000-01-31 2003-01-16 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
IL155279A0 (en) 2000-10-16 2003-11-23 Genentech Inc Methods of treatment using wisp polypeptides
US20040249141A1 (en) 2000-10-16 2004-12-09 Audrey Goddard Tie ligand homologues
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US20030027751A1 (en) 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins
EP2128246B1 (en) 2001-04-19 2014-03-12 The Scripps Research Institute Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-Aminoacyl-tRNA synthetase pairs
US20030194798A1 (en) 2001-05-24 2003-10-16 Surber Mark W. Minicell compositions and methods
FI117667B (fi) 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
US7157546B2 (en) 2002-09-09 2007-01-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Water-soluble polymer alkanals
MXPA05003983A (es) 2002-10-16 2005-06-22 Scripps Research Inst Incorporacion en sitio especifico de cetoaminoacidos en proteinas.
EP1558747B1 (en) 2002-10-16 2009-10-14 The Scripps Research Institute Glycoprotein synthesis
JP5642916B2 (ja) 2003-04-17 2014-12-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 真核遺伝コードの拡張
US20060160175A1 (en) 2003-07-07 2006-07-20 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal leucyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof
DE602004011789T2 (de) 2003-07-07 2009-02-12 The Scripps Research Institute, La Jolla Zusammensetzungen der orthogonalen Lysyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA Synthetase Paaren und ihre Verwendungen
WO2005007624A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal glutamyl-trna and aminoacyl trna synthetase pairs and uses thereof
US7718410B2 (en) 2004-09-21 2010-05-18 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of alkynyl amino acids into proteins in eubacteria
EP1807515A4 (en) 2004-10-27 2008-06-18 Scripps Research Inst ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR IN VIVO INCORPORATION OF NON-NATURAL AMINO ACIDS
JP2008532516A (ja) 2005-03-11 2008-08-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド 遺伝子破壊、組成物、およびそれに関連する方法
US7807464B2 (en) 2005-05-24 2010-10-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for expansion and analysis of cultured hematopoietic stem cells
JP5589186B2 (ja) 2006-03-09 2014-09-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現システム
EP2910248A1 (en) 2006-12-06 2015-08-26 Seikagaku Corporation Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders
PT2121751T (pt) 2006-12-08 2017-04-18 Lexicon Pharmaceuticals Inc Anticorpos monoclonais contra angptl3
WO2008098930A1 (en) 2007-02-14 2008-08-21 Biocompatibes Uk Limited Derivatisation of biological molecules
JP2010525836A (ja) 2007-05-04 2010-07-29 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ ヒト造血幹細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖
CA2826142A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
US9464065B2 (en) 2011-03-24 2016-10-11 The Scripps Research Institute Compounds and methods for inducing chondrogenesis
WO2014004465A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeted therapeutics
US9301971B2 (en) 2013-03-08 2016-04-05 Novartis Ag Peptides and compositions for treatment of joint damage
UY35368A (es) 2013-03-08 2014-10-31 Irm Llc Péptidos y composiciones para el tratamiento de daño articular

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6348351B1 (en) * 1997-09-19 2002-02-19 Genentech, Inc. Tie receptor tyrosine kinase ligand homologues
US20030215451A1 (en) * 2001-11-16 2003-11-20 Napoleone Ferrara Composition comprising and method of using angiopoietin-like protein 3 Angptl3
WO2011008773A2 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 The Scripps Research Institute Mesenchymal stem cell differentiation

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190062538A (ko) 2016-10-24 2019-06-05 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 세퍼레이터 및 세퍼레이터를 포함하는 이차 전지

Also Published As

Publication number Publication date
BR112015021269A2 (pt) 2017-10-10
AU2016203028C1 (en) 2017-06-01
PH12015501983B1 (en) 2016-01-11
AU2016277608B2 (en) 2018-04-05
LT2964250T (lt) 2018-07-25
AU2014225348B2 (en) 2016-03-31
CU24301B1 (es) 2017-12-08
TWI634124B (zh) 2018-09-01
CU20150097A7 (es) 2016-05-30
PE20151528A1 (es) 2015-11-14
SI2964250T1 (sl) 2018-11-30
US9649359B2 (en) 2017-05-16
BR122016021558B1 (pt) 2023-03-28
US20220184182A1 (en) 2022-06-16
EP2964250B1 (en) 2018-05-16
PH12015501983A1 (en) 2016-01-11
SG11201506490TA (en) 2015-09-29
US20160008433A1 (en) 2016-01-14
CO7461145A2 (es) 2015-11-30
CN111808182A (zh) 2020-10-23
AP2015008675A0 (en) 2015-08-31
AU2016277608A1 (en) 2017-01-12
MX365157B (es) 2019-05-24
CN105025917B (zh) 2020-08-18
CR20150466A (es) 2015-10-27
CY1120729T1 (el) 2019-12-11
WO2014138687A1 (en) 2014-09-12
JP2016510763A (ja) 2016-04-11
PT2964250T (pt) 2018-10-19
EP3391900A1 (en) 2018-10-24
CA2903448C (en) 2021-03-23
UY35368A (es) 2014-10-31
CA2903448A1 (en) 2014-09-12
ECSP15042898A (es) 2019-03-29
AU2016203028B2 (en) 2017-02-02
US20200268849A1 (en) 2020-08-27
NZ711037A (en) 2018-07-27
KR102267341B1 (ko) 2021-06-21
DK2964250T3 (da) 2018-08-06
EA035158B1 (ru) 2020-05-06
IL240727A0 (en) 2015-10-29
HRP20181269T1 (hr) 2018-10-19
ES2684349T3 (es) 2018-10-02
BR112015021269B1 (pt) 2023-04-11
BR122016021558A2 (pt) 2019-07-30
IL240727B (en) 2019-12-31
MX2015011963A (es) 2015-12-09
CR20200290A (es) 2020-08-27
CL2015002443A1 (es) 2016-05-20
RS57446B1 (sr) 2018-09-28
JP6567429B2 (ja) 2019-08-28
JP2020015725A (ja) 2020-01-30
US11179442B2 (en) 2021-11-23
EP2964250A1 (en) 2016-01-13
AU2016203028A1 (en) 2016-05-26
US10328126B2 (en) 2019-06-25
HUE038499T2 (hu) 2018-10-29
ZA201505966B (en) 2017-03-29
HK1214754A1 (zh) 2016-08-05
PL2964250T3 (pl) 2018-10-31
AU2014225348A1 (en) 2015-09-10
MY173172A (en) 2020-01-02
US20170252407A1 (en) 2017-09-07
JO3564B1 (ar) 2020-07-05
EA201591661A1 (ru) 2015-12-30
TN2015000385A1 (en) 2017-01-03
TW201444865A (zh) 2014-12-01
CN105025917A (zh) 2015-11-04
JP2021178841A (ja) 2021-11-18
JP6918871B2 (ja) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11179442B2 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage
US11370820B2 (en) Peptides and compositions for treatment of joint damage

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant