CN111808182A - 用于治疗关节损坏的肽和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供新的蛋白酶抗性多肽、以及用于治疗、改善或预防关节损坏相关病症，包括急性关节损伤和关节炎，的组合物和方法。

Description

用于治疗关节损坏的肽和组合物

本申请是申请日为2014年3月7日的、发明名称为“用于治疗关节损坏的肽和组合物”的中国专利申请201480012768.9(PCT/US2014/022102)的分案申请。

相关申请

本申请要求2013年3月8日递交的美国临时专利申请号61/775,400和2014年2月10日递交的美国临时专利申请号61/938,123的优先权和权益，所有这些文献均完整地特此并入作为参考。

发明背景

骨关节炎(OA)是最常见的肌肉骨骼紊乱。大约4千万美国人目前患有OA；预计该数目在接下来的20年里会由于群体老龄化和寿命的增加而增加到6千万，从而导致OA成为第四大致残原因。OA的特征在于，缓慢的关节退行性破坏，包括关节软骨(含有为关节提供润滑和缓冲的细胞和基质)和位于关节软骨下方的软骨下骨。OA可以被认为是各种病因学因素的后果。例如，它可以由关节软骨或骨的异常生物机械压力或遗传性或获得性异常而引起。目前OA治疗包括使用口服NSAID或选择性环加氧酶2(COX-2)抑制剂缓解疼痛、关节内(IA)注射活性剂例如皮质类固醇和透明质酸、以及手术方法。

关节损坏例如急性关节损伤，例如半月板或韧带撕裂、或关节内骨折，也可以导致关节炎，例如创伤后关节炎。由于关节软骨具有有限的修复能力，甚至小的不可检测的损伤也常常可能随时间而恶化并导致OA。目前关节损伤的治疗可以包括手术和聚焦于使受伤关节再生的其它侵入性方法，以及用活性剂治疗以减少疼痛和炎症。

间充质干细胞(MSCs)存在于成年关节软骨中，分离后可以在体外程序化以分化为软骨和其它间充质细胞谱系，并可以用于软骨再生。部分地，该过程受生长因子(TGFβs,BMPs)、血清条件和细胞-细胞接触的调节。WO2011/008773描述肽组合物及其用于治疗或预防关节炎和关节损伤的用途和用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。此外，WO2011/008773描述小分子化合物、组合物及其用于改善关节炎和关节损伤的用途和用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。

尽管手术技术和再生技术已经在软骨恢复、延缓退化和改善关节损坏的修复上取得了一些进展，但是仍持续需要用于有效软骨再生、治疗关节损坏、和改善或防止OA的改良组合物和方法。

发明概述

本发明涉及鉴定新的血管生成素样3(ANGPTL3)多肽和蛋白质变体，所述变体具有改善的药物性质，例如比野生型ANGPTL3更稳定、更不易于发生蛋白水解和酶促降解。本发明还提供在哺乳动物中用于治疗关节损坏或关节损伤的组合物和方法、和改善或预防关节炎、关节损坏或关节损伤的方法。

因此，本发明提供蛋白酶抗性多肽，其包含与选自表1序列之任一或多个的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性、或至少96％,97％,98％,99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，如本文进一步描述。表1的修饰多肽在位置423包括非K或R的极性氨基酸，其中所述位置参照全长ANGPTL3多肽序列SEQ ID NO：1确定。一些实施方案中，参照SEQID NO：1确定的位置423的氨基酸是Q或S。一些实施方案中，参照SEQ ID NO：1确定的位置423的氨基酸是Q。一些实施方案中，参照SEQ ID NO：1确定的位置423的氨基酸是S。一些实施方案中，参照SEQ ID NO：1确定的位置423的氨基酸缺失。此外，提供的多肽具有软骨发生活性。

一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQID NO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQ ID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQID NO：68,SEQ ID NO：69,和SEQ ID NO：70中任一个具有至少95％同一性或至少96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列。一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO：14,SEQID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：18,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：23,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：58,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQID NO：61,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,和SEQ ID NO：64中任一个具有至少95％同一性或至少96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列。一些实施方案中，多肽包含表1中的任一序列。一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ ID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ IDNO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQ ID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQ IDNO：68,SEQ ID NO：69,和SEQ ID NO：70中的任一个。一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：14,SEQ ID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ IDNO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ IDNO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：58,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQ ID NO：61,SEQ IDNO：62,SEQ ID NO：63,和SEQ ID NO：64中的任一个。一些实施方案中，多肽是表1中的任一序列。一些实施方案中，多肽是SEQ ID NO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ ID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ IDNO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQ ID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQ IDNO：68,SEQ ID NO：69,和SEQ ID NO：70中的任一个。一些实施方案中，多肽是SEQ ID NO：14,SEQ ID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ IDNO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ IDNO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：58,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQ ID NO：61,SEQ IDNO：62,SEQ ID NO：63,和SEQ ID NO：64中的任一个。

本发明多肽可以并入一种或多种化学修饰(例如，PEG化)。一些实施方案中，本发明多肽可以以融合蛋白的形式包含异源肽，其中所述异源肽可以任选地融合在该多肽的氨基端或羧基末端。本发明还提供编码本发明多肽的多核苷酸；包含编码该多肽的多核苷酸的载体；和包含该载体的宿主细胞。

本发明还提供包含本发明多肽和可药用载体的药物组合物。该组合物可以用于本文所述的在患者中治疗、改善或防止关节炎或关节损坏的方法中，其中该方法包括向患者的关节施用治疗有效量的本发明药物组合物。可以得益于该方法的病症实例包括，但不限于关节炎(例如，骨关节炎、创伤性关节炎)、和关节损坏(例如，急性关节损伤)。

本发明还提供治疗个体的方法，包括施用治疗有效量的本发明多肽。所提供的方法包括治疗罹患或有危险罹患关节损坏和/或关节炎的个体，包括向个体施用治疗有效量的一种或多种本发明多肽或其药物组合物。本发明还提供诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的方法，包括使间充质干细胞接触有效量的本发明多肽以诱导该间充质干细胞分化为软骨细胞。

本发明的这些和其它方面，包括其它特征、优点和实施方式，将在以下详细描述和后附本发明权利要求书中进一步详细地描述和阐释。

附图简述

图1描述经工程化的hANGPTL3蛋白的示意图，该工程化改善蛋白稳定性和增强蛋白水解抗性。在野生型蛋白和肽序列的蛋白生产过程中，在Lys423和Ser424之间观察到100％的断裂。为了减少蛋白水解，产生了各种突变肽，其中Lys 423被突变为Gln或Ser；或Ser424被突变为Thr；或Lys 423被缺失。

图2A和B描述在ANGPTL3和工程化构建体存在或不存在时软骨特异性蛋白质的表达。对固定的细胞染色进行(2A)2A型前胶原定量(PIIANP)或(2B)II型胶原定量，以确定在实施例中所述处理后分化为软骨细胞的细胞％。图2C描述在ANGPTL3或工程化构建体存在或不存在时血管发生测定试验的定量结果，其中与阳性对照蛋白bFGF比较。总管长度和分支点数量是血管发生的定量量度。尽管其他人已经报道了ANGPTL3的血管发生活性，且本研究证实活性与FGF的活性一样好；但是结果说明在C端ANGPTL3构建体中没有显著活性保留。

图3显示在ANGPTL3或工程化构建体存在时软骨特异性蛋白质表达的增加。3A.在处理后10天使用qRT-PCR评价细胞，以测量在所述处理后软骨特异性蛋白的RNA表达。Lubricin,聚集蛋白聚糖(aggrecan)和Sox9代表软骨相关蛋白；IGF和IFITM1代表分化潜力，骨钙蛋白(osteocalcin)和X型胶原代表骨/纤维化相关蛋白。3B.在所述处理后3天评价细胞。用工程化构建体或野生型ANGPTL1 C端区多肽处理后，观察到增加的聚集蛋白聚糖表达。

图4显示ANGPTL3和工程化构建体的软骨保护活性。4A.糖胺聚糖(GAG)释放(基质损坏的一个指标)随着递增量的ANGPTL3和突变构建体而被抑制。使用在所示构建体存在或不存在下处理的牛软骨，实施离体GAG释放(基质损坏的一个指标)抑制试验。4B和4C：使用递增量的ANGPTL3和所示工程化构建体抑制了NO释放。在所示构建体存在或不存在时处理软骨细胞，之后实施Greiss反应试验，以确定NO释放抑制作用作为软骨保护指标。

图5显示在肥大病况下构建体存在时X型胶原表达(纤维软骨形成活性的指标)的抑制。在肥大病况下在所示构建体存在或不存在的情况下处理原代软骨细胞，之后通过免疫荧光评估，以确定X型胶原表达，作为纤维及肥大软骨形成/软骨细胞分化的量度。5A描述野生型C端ANGPTL3或工程化构建体的结果。5B描述C端ANGPTL3(WT)或工程化构建体242KQ或242Kdel或C端ANGPTL1的结果。

图6示意性显示给药范例(6A)，之后图示(6B)用小鼠ANGPTL3(17-460)处理后关节严重度的改善(通过股骨外侧髁(lateral femoral condyle)的软骨侵蚀评分测定)。

图7显示，在手术诱导软骨损坏和随后用ANGPTL3构建体每周一次持续三周(始于第7日)处理后，小鼠中的失能测量结果(疼痛指标)。7A显示手术后第35天的失能测量结果；7B显示手术后第56天进行测量的结果。

图8显示，在3次ANGPTL3构建体(所示)的每周一次处理(第7、14和21天)后，对于小鼠中胶原酶诱导的软骨损坏，关节严重度的总得分和严重度的改善。

图9显示，在用工程化ANGPTL3构建体处理后，在关节损坏的大鼠半月板撕裂模型中的结果。图9A图示处理后5周关节中的蛋白聚糖含量；图9B图示处理后5周股骨关节严重度得分。结果说明，在3次ANGPTL3构建体(所示)的每周一次处理(第7、14和21天)后，对大鼠中手术切断半月板诱导的软骨损坏的改善。

图10显示，在用工程化ANGPTL3构建体处理后，在关节损坏的大鼠半月板撕裂模型中的结果。图10A图示通过严重度、番红菌素(safranin)O强度、软骨面积和软骨厚度测定的体内修复百分数。图10B显示，在手术诱导软骨损坏和随后处理后，大鼠中的失能测量结果(疼痛指标)。

图11图示总体严重度的总得分，以说明：自第4天开始每两周一次给药(各1.5ug/剂或15ug/剂)后或仅在第7天给药(单个30μg剂量)后，犬中由手术破坏内侧半月板(medialmeniscus)诱导的软骨损坏的改善。

发明详述

本发明至少部分地基于鉴定到可以刺激间充质干细胞分化为软骨细胞并对蛋白酶(例如胰蛋白酶样蛋白酶)切割具有抵抗性的血管生成素样3(ANGPTL3)多肽。WO2011/008773描述ANGPTL3肽组合物及肽组合物用于治疗或预防关节炎和关节损伤的用途和用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。我们发现野生型ANGPTL3蛋白易于发生蛋白酶剪切和不稳定，由此鉴定了减轻该效应的序列变体。本发明由此提供用于修复软骨的改良肽组合物。尤其是，提供了根据本发明修饰的ANGPTL3肽，该修饰肽与野生型ANGPTL3多肽相比具有增加的蛋白酶抗性。本发明还提供用于施用ANGPTL3多肽以预防或改善关节炎或关节损伤的组合物和方法，其中向关节、软骨组织、或软骨邻近组织中、或全身性地施用本发明多肽。此外，本发明提供用于诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的组合物和方法。

定义

术语“蛋白酶抗性”在本文中指包含修饰的多肽，所述修饰可以使该多肽与相应的未修饰野生型多肽相比更不容易被胰蛋白酶样蛋白酶切割。在特定实施方案中，蛋白酶抗性多肽是，相对于天然野生型肽序列，在R或K残基上具有氨基酸替代的ANGPTL3多肽。

“ANGPTL3”指血管生成素蛋白家族的成员。ANGPTL3(GenBank登录号NP_055310.1)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中；相应的多核苷酸序列示于SEQ ID NO：2(NCBI参考序列号NM014495.2,其中ANGPTL3编码序列包含SEQ ID NO：2的nt 52-1434)。“ANGPTL3多肽”指天然表达的多肽。为了本公开的目的，氨基酸编号典型地参考全长野生型人ANGPTL3多肽序列(SEQ ID NO：1)确定。因此，在本发明多肽仅含有全长ANGPTL3的C端部分而不含N端部分的实施方案中，尽管该肽的长度小于460个氨基酸，但位置仍基于SEQ ID NO：1编号。例如，提及本发明ANGPTIL3多肽的位置423，即使该本发明ANGPTIL3多肽本身可能仅200个氨基酸长度，也指SEQ ID NO：1的位置423。可以通过最佳比对序列，例如，使用默认CLUSTAL比对参数或默认BLAST 2比对参数，并比较序列，以确定与参考序列例如SEQ ID NO：1中的位置“相应”的目的序列中的氨基酸。例如，“参考SEQ ID NO：1确定”的目的序列的位置423、或“相应于”SEQ ID NO：1位置423的氨基酸，指当目的序列与SEQ ID NO：1最佳比对后，与SEQ IDNO：1的位置423对齐的氨基酸。

术语“肽模拟物”(peptidomimetic)和“模拟物”指合成的化学化合物，该化合物与天然或非天然的多肽(例如ANGPTL3)具有实质上相同的功能特征，但不同的(尽管典型地是相似的)结构特征。肽类似物在本领域中通常用作和模板肽具有类似性质的非肽活性化合物(例如药物)。此类非肽化合物被称为“肽模拟物”("peptide mimetics"或"peptidomimetics")(Fauchere,J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and FreidingerTINS p.392(1985)；and Evans et al.J.Med.Chem.30：1229(1987))。与治疗有用肽结构相似的肽模拟物可以用于产生等同或增强的治疗或预防效果。一般，肽模拟物与范例多肽(即具有生物学或药理学活性的多肽)结构相似(例如在目的多肽中发现的)，但一个或多个肽键任选地替代为选自例如-CH2NH-,-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH＝CH-(顺式和反式),-COCH2-,-CH(OH)CH2-,和-CH2SO-的连接。模拟物可以完全由合成的非天然氨基酸类似物构成，或可以是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物也可以并入任何数量的天然氨基酸保守替代，只要该保守替代也不实质性改变模拟物的结构和/或活性即可。例如，如果模拟物组合物能够具有ANGPTL3多肽的软骨发生活性，则该模拟物组合物落入本发明范围内。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物、以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本发明多肽、肽和蛋白质包括具有软骨发生活性的蛋白酶抗性ANGPTL3肽模拟物。

术语“氨基酸”指天然的和合成的氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸、以及之后修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指，与天然氨基酸具有相同的基本化学结构——即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的碳——的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍(methionine methylsulfonium)。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保持与天然氨基酸一样的基本化学结构。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸(pyrrolysine)、吡咯啉-羧基-赖氨酸(pyrroline-carboxy-lysine)、和硒代半胱氨酸(selenocysteine)。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA,GCC,GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个由密码子规定丙氨酸的位置上，该密码子均可以被改变为任一所述的相应密码子而不改变编码的多肽。该核酸变异是“沉默变异”,其是保守修饰变异中的一种。本文中每一个由多核苷酸编码的多肽序列都涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员明了，核酸中的每一个密码子(除了AUG——通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG——通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，本文描述的每一个序列都隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。

本领域技术人员明了，对于核酸、肽、多肽或蛋白质序列上的各替代、缺失或添加，当其导致相对于原始编码的氨基酸序列而言改变、添加或缺失了单个氨基酸或小百分数的氨基酸，如果该改变造成氨基酸被化学相似的氨基酸替代、和/或造成可以产生与原始蛋白质具有相似功能活性的结构相似蛋白质的多肽序列时，则该改变导致“保守修饰的变体”。本领域熟知提供功能相似氨基酸的保守替代表。此类保守修饰变体与本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因一起涵盖在本发明中，且不排斥本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因。

术语“保守氨基酸替代”指，来自一个保守氨基酸替代组的氨基酸(概念地或以其它方式)替代为来自相同组的不同氨基酸。替代的一个例子基于分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的标化频率(参见例如Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,Principles ofProtein Structure,Springer-Verlag)。根据该分析，可以定义氨基酸组，其中组中的氨基酸优先地彼此替代，并因此就其对总体蛋白质结构的影响而言彼此最为相似(见例如，Schulz,G.E.and R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。以此方式定义的一个示例性氨基酸组集合包括：(i)带电荷组,由Glu和Asp,Lys,Arg及His组成；(ii)带正电荷组,由Lys,Arg和His组成；(iii)带负电荷组,由Glu和Asp组成；(iv)芳族组,由Phe,Tyr和Trp组成；(v)氮环组,由His和Trp组成；(vi)大脂族非极性组,由Val,Leu和Ile组成；(vii)轻微极性组,由Met和Cys组成；(viii)小残基组,由Ser,Thr,Asp,Asn,Gly,Ala,Glu,Gln和Pro组成；(ix)脂族组，由Val,Leu,Ile,Met和Cys组成；和(x)小羟基组，由Ser和Thr组成。基于共有的物理性质的其它保守替代例子为以下组中的替代：1)丙氨酸(A),甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R),赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)；7)丝氨酸(S),苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。

“序列同一性百分数”通过在比较窗中比较两个最佳对齐的序列而确定，其中比较窗中的氨基酸序列或多核苷酸序列部分，与不包含添加或缺失的参考序列(例如本发明多肽)相比，可以包含添加或缺失(即空位)，以实现这两个序列的最佳对齐。该百分数可以通过如下计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数，用该匹配位置数除于比较窗中的位置总数，结果乘以100，从而得到序列同一性百分数。

术语“同一”或“同一性”百分数，在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，可以指两个或更多个序列或子序列是相同序列。当使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视检查将两个序列在比较窗中或指定区域中进行比较和比对以实现最大对应后，如果两个序列具有规定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域中，或当未规定区域时在整个序列上，95％同一,任选地96％,97％,98％,或99％同一)，则这两个序列“基本相同”。本发明提供与本文示例的多肽(例如，SEQ ID NOs：11-42之任一)基本相同的多肽及其用途，包括但不限于，用于治疗或预防关节炎或关节损伤的用途。任选地，对于核酸，同一性存在于长度至少大约150个核苷酸的区域上，或更优选地长度300个至450个或600个或更多个核苷酸的区域上，或参考序列的全长上。任选地，对于氨基酸序列，同一性存在于长度至少大约50个氨基酸的区域上，或更优选地长度100个至150个或200个或更多个氨基酸的区域上，或参考序列的全长上。

为了序列比较，典型地，一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如果必要的话)，和指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。

“比较窗”在本文中包括具有选自50-600、通常大约75-大约200、更通常大约100-大约150的任一连续位置数的区段，在该区段中序列可以与具有相同连续位置数的参考序列在两序列最佳对齐后进行比较。本领域熟知用于比较的序列比对方法。可以例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)ProcNat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实施方式(GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA)，或通过手工比对和目视检查(参见例如，Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology(1995supplement))，实现用于序列比较的最佳比对。

适于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述在Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402,和Altschulet al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。公众可以从美国国立生物技术信息中心获得实施BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字，鉴定高得分序列对(HSP)，其中当与数据库序列中相同长度的字对齐后，所述短字符合或满足一定的正值阈值分数T。T被称作相邻字得分阈值(Altschul et al.,同上引文)。这些最初的相邻字命中物作为种子启动检索以发现含有其的更长HSP。只要累积比对得分可以增加，这些字命中物将沿着每个序列朝两个方向延伸。对于核苷酸序列，累积得分可以使用参数M(给予匹配残基对的奖分；总是>0)和N(给予错配残基的罚分；总是<0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积得分。当出现以下情形时，字命中物向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用11的字长(W)、10的预期(E)、M＝5、N＝4以及双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长(W)和10的预期(E)、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)、50的对齐(B)、10的预期(E)、M＝5、N＝4以及双链比较。

BLAST算法也进行两个序列之间的相似性统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一个相似性量度是最小和概率(P(N)),其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间因偶然而发生匹配的概率。例如，在测试核酸和参考核酸的比较中，如果最小和概率小于大约0.2,更优选小于大约0.01,最优选小于大约0.001，则该测试核酸被认为与参考序列相似。

术语“分离的”，当应用于核酸或蛋白时，指该核酸或蛋白被纯化至基本上不含有在天然状态下与其相关的其它细胞成分。其常常为均质或近均质状态。其可以是干燥的或在水性溶液中。可以使用本领域已知和通常使用的分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱等，确定纯度和均质性。当一种蛋白质在制品中作为主要物质存在时，该蛋白质是基本上纯化的。术语“纯化的”在一些实施方案中指，蛋白质在电泳凝胶中给出基本上一条带。典型地，这意味着，蛋白质至少85％纯，更优选地至少95％纯，最优选地至少99％纯。

术语“透明质酸”在本文中用于包括透明质酸的衍生物，包括透明质酸的酯、透明质酸的盐，以及还包括术语乙酰透明质酸(hyaluronan)。该名称也包括乙酰透明质酸的低和高分子量形式以及交联的乙酰透明质酸或hylan。此类乙酰透明质酸的例子为Synvisc^TM(Genzyme Corp.Cambridge,Mass.),ORTHOVISC^TM(Anika Therapeutics,Woburn,Mass.),HYALGAN^TM(Sanofi-Synthelabo Inc.,Malvern,Pa.),和ProVisc(Alcon/Novartis)。

在本说明书和权利要求书中，除非文中明确作出其它说明，否则单数形式"a,""an,"和"the"包括复数形式。

血管生成素样3蛋白酶抗性多肽

血管生成素样3是血管生成素样分泌因子家族的成员。其主要在肝脏中表达，具有血管生成素的特征性结构，由信号肽、N端卷曲螺旋结构域(CCD)和C端纤维蛋白原(FBN)样结构域组成。血管生成素样3被证实可以结合αV/β3整联蛋白，FBN样结构域单独足以诱导内皮细胞粘着和体内血管生成(Camenisch et al.,J.Biol.Chem.277：17281-17290,2002)。内源性ANGPTL3一般在体内被切割成氨基端和羧基端片段。如上总结和本文进一步描述的，本发明考虑使用各种具有软骨发生活性的蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白。

在一些实施方案中，分离的多肽包含与选自表1序列之任一的氨基酸序列具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％序列同一性的氨基酸序列，其中多肽在位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，其中所述位置参考SEQ ID NO：1确定。本发明多肽具有软骨发生活性。一些实施方案中，多肽包含与选自SEQ ID NO：30,SEQID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ ID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQ ID NO：68,SEQ ID NO：69,或SEQ ID NO：70中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。在再一实施方案中，多肽包含与选自SEQ ID NO：14,SEQID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：18,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：23,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：58,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQID NO：61,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,或SEQ ID NO：64中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ IDNO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，且多肽具有软骨发生活性。

在一些实施方案中，分离的多肽包含选自表1序列之任一的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ ID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQ IDNO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQ IDNO：66,SEQ ID NO：67,SEQ ID NO：68,SEQ ID NO：69,或SEQ ID NO：70中的任一个的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。在再一实施方案中，多肽包含选自SEQ IDNO：14,SEQ ID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：18,SEQ ID NO：19,SEQ IDNO：20,SEQ ID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：23,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ IDNO：26,SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：58,SEQ ID NO：59,SEQ IDNO：60,SEQ ID NO：61,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,或SEQ ID NO：64中的任一个的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，且多肽具有软骨发生活性。

在一些实施方案中，分离的多肽与选自表1序列之任一的氨基酸序列具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％序列同一性，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。一些实施方案中，多肽与选自SEQ ID NO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ IDNO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ IDNO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQ ID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQ IDNO：68,SEQ ID NO：69,或SEQ ID NO：70中的任一个的氨基酸序列具有至少95同一性％或至少96％,97％,98％,或99％同一性，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。在再一实施方案中，多肽与选自SEQ ID NO：14,SEQ ID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：18,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ ID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：23,SEQ IDNO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ IDNO：58,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQ ID NO：61,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,或SEQID NO：64中的任一个的氨基酸序列具有至少95同一性％或至少96％,97％,98％,或99％同一性，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，且多肽具有软骨发生活性。

在一些实施方案中，分离的多肽是选自表1序列之任一的氨基酸序列。一些实施方案中，多肽是选自SEQ ID NO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ ID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ ID NO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO：39,SEQ IDNO：40,SEQ ID NO：41,SEQ ID NO：65,SEQ ID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQ ID NO：68,SEQ IDNO：69,或SEQ ID NO：70中的任一个的氨基酸序列。在再一实施方案中，多肽是选自SEQ IDNO：14,SEQ ID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ IDNO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ IDNO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：58,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQ ID NO：61,SEQ IDNO：62,SEQ ID NO：63,或SEQ ID NO：64中的任一个的氨基酸序列。

表1：ANGPTL3变体构建体

本发明的修饰ANGPTL3多肽在多肽的C端部分中具有至少一个替代以赋予该多肽蛋白酶抗性。该替代发生在R或K残基上，由此多肽对例如胰蛋白酶样蛋白酶具有增加的抗性。在本发明的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽中R或K可以替代为任何氨基酸。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。在一些实施方案中，替代为S。一些实施方案中，蛋白酶抗性肽在参照SEQ ID NO：1的位置423具有非K或R的氨基酸。在一些实施方案中，本发明多肽在位置423包含极性氨基酸。例如，位置423的氨基酸可以是Q或S或其它极性氨基酸。在一些实施方案中，本发明多肽在位置423具有Q。在其它实施方案中，本发明多肽在位置423具有S。一些实施方案中，除了在位置423的替代外，蛋白酶抗性肽在SEQ ID NO：1或其变体的C端中还具有另外的R或K的替代，其中该替代是非R或K的极性氨基酸。一些实施方案中，在参照SEQ ID NO：1确定的位置423的替代是Q或S。在再其它实施方案中，本发明多肽在参照SEQ ID NO：1确定的位置423具有缺失。

一些实施方案中，本发明多肽长250个氨基酸或更短，并包含SEQ ID NO：16,SEQID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ ID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQID NO：61,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,SEQ ID NO：64,SEQ ID NO：65,SEQ ID NO：66,SEQID NO：67,SEQ ID NO：68,SEQ ID NO：69,或SEQ ID NO：70的氨基酸序列。

一些实施方案中，本发明提供全长蛋白酶抗性软骨生成性ANGPTL3蛋白的用途。一些实施方案中，本发明提供包含ANGPTL3序列的C端部分的蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白，或其软骨生成性变体。一些实施方案中，ANGPTL3蛋白缺失天然蛋白的氨基末端。一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白缺少CCD结构域和/或缺少显著的CCD活性。因此，在一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白至少包含人ANGPTL3蛋白羧基端结构域的一个片段(例如至少100,150,200,220或215个连续氨基酸)、或与该人ANGPTL3蛋白羧基端序列基本上相同的序列，其中该多肽和其变体保留软骨发生活性。一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性多肽至少缺少C端序列的一个部分，例如缺少自SEQ ID NO：1的C末端起的5,10,15,或20个氨基酸(即，缺少SEQ ID NO：1的456-460,451-460,446-460或441-460)。

一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相应于如下氨基酸区域的连续氨基酸：SEQ ID NO：1的氨基酸241-455,或241-460；SEQ ID NO：1的氨基酸242-455,或242-460；SEQ ID NO：1的氨基酸233-455或233-460；SEQ ID NO：1的氨基酸228-455或228-460；SEQ ID NO：1的氨基酸226-455-或226-260或氨基酸225-455-或225-260，其中发生R或K的氨基酸替代或单残基缺失。一些实施方案中，在参照SEQ ID NO：1确定的位置423发生替代。一些实施方案中，在参照SEQ ID NO：1确定的位置423发生缺失。一些实施方案中，蛋白酶抗性多肽包含相应于SEQ ID NO：1的氨基酸区域207-455或207-460的连续氨基酸，其中发生R或K的氨基酸替代或单残基缺失。在一些实施方案中，在位置423发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，包括在相对于SEQ ID NO：1的位置423的缺失。

本发明还提供蛋白酶抗性多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸240-454、SEQ ID NO：1的氨基酸241-455、或SEQ ID NO：1的氨基酸242-455具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，且在相应于SEQ ID NO：1的位置423的氨基酸处具有替代或缺失，其中替代氨基酸不是R，且其中该多肽具有软骨发生活性。在其它实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸240-454、SEQ ID NO：1的氨基酸241-455、或SEQ ID NO：1的氨基酸242-455，且每个多肽在相应于SEQ ID NO：1的位置423的氨基酸处具有替代或缺失，其中替代氨基酸是Q或S。

在一些实施方案中，本发明的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸242-455或242-460；SEQ ID NO：1的氨基酸241-455或241-460；SEQ ID NO：1的氨基酸233-455或233-460；SEQ ID NO：1的氨基酸228-455或228-460,SEQ ID NO：1的氨基酸226-455-或226-260,或SEQ ID NO：1的氨基酸225-455-或225-260具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，其中发生R或K的氨基酸替代，或R或K缺失。在一些实施方案中，在位置423发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在相对于SEQ ID NO：1的位置423存在残基缺失。

一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽长250或240个氨基酸或更短，并包含SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ ID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ IDNO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ IDNO：30,SEQ ID NO：31,SEQ ID NO：32,SEQ ID NO：33,SEQ ID NO：34,SEQ ID NO：35,SEQ IDNO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO：41,SEQ IDNO：59,SEQ ID NO：60,SEQ ID NO：61,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,SEQ ID NO：64,SEQ IDNO：65,SEQ ID NO：66,SEQ ID NO：67,SEQ ID NO：68,SEQ ID NO：69,或SEQ ID NO：70的氨基酸序列。一些实施方案中，本发明的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽长230或225个氨基酸或更短，并包含SEQ ID NO：24,SEQ ID NO：25,SEQ ID NO：26,SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQID NO：29,SEQ ID NO：36,SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO：39,SEQ ID NO：40,SEQID NO：41,SEQ ID NO：62,SEQ ID NO：63,SEQ ID NO：64,SEQ ID NO：68,SEQ ID NO：69,或SEQ ID NO：70的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白包含与犬、牛或马ANGPTL3蛋白C端序列具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白至少包含天然犬(SEQ ID NO：4),马(SEQID NO：5),或牛(SEQ ID NO：6)ANGPTL3蛋白序列的一个片段(例如，至少100,150,200,215个连续氨基酸)，或与该天然犬、牛或马ANGPTL3蛋白序列基本相同的序列，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。在一些实施方案中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％序列同一性的氨基酸序列，其中多肽在参考SEQ ID NO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。在一些实施方案中，多肽与SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％序列同一性，其中多肽在参考SEQ IDNO：1所确定的位置423包含非K或R的极性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有软骨发生活性。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43。在再一实施方案中，多肽是SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43。

在一些实施方案中，本发明的蛋白酶抗性ANGPTL3包含与SEQ ID NO：4的氨基酸232-454、SEQ ID NO：4的氨基酸240-454、SEQ ID NO：4的氨基酸227-454、或SEQ ID NO：4的氨基酸224-454具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，其中发生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：4的位置422(相应于SEQ ID NO：1的位置423)发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在SEQ ID NO：4的位置422发生氨基酸缺失。

在一些实施方案中，本发明的蛋白酶抗性ANGPTL3包含与SEQ ID NO：5的氨基酸233-455、SEQ ID NO：5的氨基酸241-455、SEQ ID NO：5的氨基酸228-455、或SEQ ID NO：5的氨基酸225-455具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，其中发生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：5的位置423(相应于SEQ ID NO：1的位置423)发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在SEQ ID NO：5的位置423发生氨基酸缺失。

在一些实施方案中，本发明的蛋白酶抗性ANGPTL3包含与SEQ ID NO：6的氨基酸233-455、SEQ ID NO：6的氨基酸241-455、SEQ ID NO：6的氨基酸228-455、或SEQ ID NO：6的氨基酸225-455具有至少95％同一性、或至少96％,97％,98％,或99％同一性的氨基酸序列，其中发生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：6的位置422(相应于SEQ ID NO：1的位置423)发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在SEQ ID NO：6的位置422发生氨基酸缺失。

一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相应于如下氨基酸区域的连续氨基酸：SEQ ID NO：4的氨基酸240-454、SEQ ID NO：4的氨基酸232-454、SEQ ID NO：4的氨基酸227-454、或SEQ ID NO：4的氨基酸224-454，其中发生R或K的氨基酸替代或存在R或K的缺失。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：4的位置422(其是参照SEQ ID NO：1确定的位置423)发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在SEQ ID NO：4的位置422发生氨基酸缺失。

一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相应于如下氨基酸区域的连续氨基酸：SEQ ID NO：5的氨基酸241-455、SEQ ID NO：5的氨基酸233-455、SEQ ID NO：5的氨基酸228-455、或SEQ ID NO：5的氨基酸225-455，其中发生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些实施方案中，在位置423(相应于参照SEQ ID NO：1确定的位置423)发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在SEQ ID NO：5的位置423发生氨基酸缺失。

一些实施方案中，本发明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相应于如下氨基酸区域的连续氨基酸：SEQ ID NO：6的氨基酸241-455、SEQ ID NO：6的氨基酸233-455、SEQ ID NO：6的氨基酸228-455、或SEQ ID NO：6的氨基酸225-455，其中发生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：6的位置422(其是参照SEQ ID NO：1确定的位置423)发生替代或缺失。在一些实施方案中，替代为极性氨基酸，例如H,N,Q,S,T,A,或Y。在一些实施方案中，替代为H,N,Q,S,T,或Y。在一些实施方案中，替代为S或Q。在一些实施方案中，替代为Q。一些实施方案中，在SEQ ID NO：6的位置422存在缺失。

如上所述本发明ANGPTL3蛋白可以包括位于上述区域侧翼的天然ANGPTL3蛋白序列。或者，一些实施方案中，本发明ANGPTL3蛋白可以包括非天然ANGPTL3蛋白侧翼序列。例如，ANGPTL3蛋白的软骨发生活性部分可以与一个或多个融合配偶体和/或异源氨基酸融合以形成融合蛋白。融合配偶体序列可以包括但不限于，氨基酸标签、非L(例如D-)氨基酸或其它氨基酸模拟物(以延长体内半衰期和/或蛋白酶抗性)、靶向序列或其它序列。

在一些实施方案中，本发明多肽PEG化。在一些实施方案中，本发明多肽与异源肽融合。一些实施方案中，多肽与以下任一融合：人血清白蛋白(HAS)、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、聚组氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、麦芽糖结合蛋白(MBP)、或上述任何异源多肽的片段。一些实施方案中，异源多肽融合在本发明多肽的氨基末端。在其它或备选实施方案中，异源多肽融合在本发明多肽的羧基末端。

本发明ANGPTL3蛋白具有软骨发生活性和蛋白酶抗性。如本文定义的，软骨生成或软骨发生活性指从MSC生成软骨细胞。软骨发生活性的标志包括但不限于软骨基质产生。软骨基质产生可以通过各种标志物，例如Sox9,II型胶原或糖胺聚糖(GAG)的产生进行度量。一些实施方案中，测量GAG产生作为软骨基质产生的标志。一些实施方案中，GAG产生的3倍增加联合软骨特异性蛋白表达指示阳性软骨基质产生。

可以使用测量由丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶引起的切割的任何已知试验，评价多肽的蛋白酶抗性。在一些实施方案中，用于评价蛋白酶解易感性的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶。如果多肽与其野生型对应物相比对胰蛋白酶具有降低的敏感性，则该多肽被认为具有蛋白酶抗性。一个试验例子是测量，与相应的天然人肽相比，在多肽暴露于胰蛋白酶一段时间后产生的切割产物的量。可以使用任何已知试验，例如SDS PAGE或LCMS测量切割。示例性试验在实施例部分提供。

在一个示例性试验中，通过将10ng待评价的蛋白质与胰蛋白酶以8000：1的质量比(蛋白质：胰蛋白酶)在室温孵育1小时，实施由胰蛋白酶解导致的限制性蛋白酶解。然后，通过加入乙酸将反应调节至pH3.0，淬灭胰蛋白酶解反应。然后，通过SDS-PAGE，例如在4-12％Tris-Bis凝胶上，分离淬灭后的样品，通过胰蛋白酶切割产生的片段的外观，从切割的蛋白质中鉴定出抵抗切割的蛋白质。与其野生型对应物相比，在蛋白酶抗性多肽中不存在或具有减少的切割产物。

一些实施方案中，本发明ANGPTL3多肽包含至少一个非天然编码的氨基酸。一些实施方案中，多肽包含1,2,3,4,或更多个非天然氨基酸。制备非天然氨基酸和将非天然氨基酸引入蛋白的方法是已知的。参见例如US专利号7,083,970；和7,524,647。本领域已知适用于产生包含一个或多个期望的非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统的一般制备原则，本领域也已知用于产生正交翻译系统的一般方法。例如,参见国际公布号WO2002/086075,发明名称"METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS；"WO 2002/085923,发明名称"IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS；"WO2004/094593,发明名称"EXPANDING THEEUKARYOTIC GENETIC CODE；"WO 2005/019415,2004年7月7日递交；WO 2005/007870,2004年7月7日递交；WO 2005/007624,2004年7月7日递交；WO 2006/110182,2005年10月27日递交,发明名称"ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OFUNNATURAL AMINO ACIDS"；和WO 2007/103490,2007年3月7日递交,发明名称"SYSTEMS FORTHE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOSTCELLS."。对于并入非天然氨基酸的正交翻译系统和其制备和使用方法的讨论，也参见Wang和Schultz,(2005)"Expanding the Genetic Code."Angewandte Chemie Int Ed 44：34-66；Xie和Schultz,(2005)"An Expanding Genetic Code."Methods 36：227-238；Xie和Schultz,(2005)"Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire."Curr Opinion inChemical Biology 9：548-554；和Wang,et al.,(2006)"Expanding the Genetic Code."Annu Rev Biophys Biomol Struct 35：225-249；Deiters,et al,(2005)"In vivoincorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli."Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 15：1521-1524；Chin,et al.,(2002)"Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli."J Am Chem Soc124：9026-9027；和2005年9月20日递交的国际公布号WO2006/034332。其它细节可以见于美国专利号7,045,337；No.7,083,970；No.7,238,510；No.7,129,333；No.7,262,040；No.7,183,082；No.7,199,222；和No.7,217,809。

“非天然编码的氨基酸”指，非常规氨基酸或吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸、或硒代半胱氨酸的氨基酸。可以与术语“非天然编码氨基酸”作为同义词使用的其它术语是“非天然氨基酸”、“非天然的氨基酸”、“非天然发生的氨基酸”、和各种带连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括，但不限于，通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常规氨基酸或吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸、和硒代半胱氨酸)而形成的、但本身不能通过翻译复合物天然地掺入生长的肽链中的氨基酸。此类非天然氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖氨基-L-苏氨酸、和O-磷酸酪氨酸。

非天然编码氨基酸典型地可以是具有与20种天然氨基酸中使用的取代基侧链不同的任何取代基侧链的任何结构。由于本发明的非天然编码氨基酸与天然氨基酸的不同典型地仅在于侧链结构，故该非天然编码氨基酸可以与其它氨基酸，包括但不限于，天然的或非天然编码的氨基酸，以和天然多肽中酰胺键形成的方式相同的方式，形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有区别于天然氨基酸的侧链基团。例如，R任选地可以包含烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼(hydrazine)、氰基、卤代、酰肼(hydrazide)、链烯基、炔基、醚、硫羟基(thiol)、硒代、磺酰基、硼酸(borate)、硼化(boronate)、二氧磷基(phospho)、膦酰基(phosphono)、膦(phosphine)、杂环、烯酮(enone)、亚胺(imine)、醛、酯、硫羰酸(thioacid)、羟胺、氨基基团等、或其任何组合。可以适用于本发明的其它有意义的非天然氨基酸包括，但不限于，包含可光激活的交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合性氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能基团的氨基酸、共价地或非共价地与其它分子相互作用的氨基酸、光笼蔽的(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸例如糖取代的丝氨酸、其它糖修饰的氨基酸、含酮氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学断裂的和/或可光断裂的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的侧链(包括但不限于，聚醚或长链烃，包括但不限于，大于约5个或大于约10个碳)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧还活性氨基酸、含有氨基硫羰酸的氨基酸、和含有一个或多个毒性部分的氨基酸。

可以适用于本发明并可以用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码氨基酸包括但不限于，具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲(semicarbazide)、叠氮、和炔反应性基团的氨基酸。一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含糖部分。此类氨基酸的例子包括N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-天冬酰胺、和O-甘露糖氨基-L-丝氨酸。此类氨基酸的例子还包括其中氨基酸和糖之间的天然N或O连接被替换为天然不常见的共价键——包括但不限于，烯烃、肟(oxime)、硫醚、酰胺等——的氨基酸。此类氨基酸的实例也包括在天然蛋白质中通常不存在的糖，例如2-脱氧葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。

可以任选地引入本发明ANGPTL3蛋白中(例如多肽链中或N或C端)以例如延长体内半衰期的另一类修饰是PEG化或掺入长链聚乙二醇聚合物(PEG)。PEG或长链PEG聚合物的引入可以增加本发明多肽的有效分子量，例如以防止快速过滤到尿中。一些实施方案中，ANGPTL3序列中的赖氨酸残基直接地或通过接头与PEG缀合。此类接头可以是例如含有用于与合适修饰的PEG链连接的硫羟基官能团的Glu残基或酰基残基。用于引入PEG链的一个备选方法是，首先将Cys残基引入到C端或溶剂暴露残基处(例如置换Arg或Lys残基)。然后，可以使该Cys残基以位点特异的方式连接含有例如马来酰亚胺官能团的PEG链。本领域熟知用于掺入PEG或长链PEG聚合物的方法(描述于例如，Veronese,F.M.,et al.,DrugDisc.Today 10：1451-8(2005)；Greenwald,R.B.,et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.55：217-50(2003)；Roberts,M.J.,et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.,54：459-76(2002))，这些文献的内容并入此处作为参考。本领域已知的其它聚合物缀合方法也可以用于本发明中。在一些实施方案中，引入聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)(PMPC)作为与本发明ANGPTL3蛋白的聚合物缀合物(参见例如WO2008/098930；Lewis,et al.,Bioconjug Chem.,19：2144-55(2008))。一些实施方案中，本发明可以使用ANGPTL3蛋白的含磷酰胆碱的聚合物缀合物。本领域技术人员明了，可以使用其它生物相容性聚合物缀合物。

更为最近报道的通过并入非天然氨基酸(如上述)以掺入PEG或PEG聚合物的备选方法可以用于本发明多肽。该方法利用进化的tRNA/tRNA合成酶对(在表达质粒中由琥珀阻抑密码子编码)(Deiters,A,et al.(2004).Bio-org.Med.Chem.Lett.14,5743-5)。例如，可以将对叠氮基苯丙氨酸掺入本发明多肽中，然后在还原剂和铜离子存在下(以促进称作"Huisgen[3+2]环加成"的有机反应)与具有乙炔部分的PEG聚合物反应。

在一些实施方案中，本发明还考虑ANGPTL3蛋白的特定突变以改变该多肽的糖基化。可以选择此突变以引入或消除一个或多个糖基化位点，包括但不限于，O-连接的或N-连接的糖基化位点。一些实施方案中，本发明ANGPTL3蛋白相对于天然ANGPTL3蛋白具有不变的糖基化位点和模式。一些实施方案中，ANGPTL3蛋白变体包括糖基化变体，其中相对于天然ANGPTL3蛋白，糖基化位点的数量和/或类型已经改变。一些实施方案中，相对于天然多肽，多肽变体包含更多或更少数目的N连接的糖基化位点。N连接的糖基化位点可以通过如下序列表征：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr,其中以X表示的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。通过氨基酸替代以产生该序列，可以提供用于添加N连接的糖链的潜在新位点。备选地，消除该序列的替代将移除已有的N连接糖链。一些实施方案中，提供N连接糖链的重排，其中消除一个或多个N连接糖基化位点(典型地天然的那些位点)和产生一个或多个新的N连接位点。

示例性ANGPTL3蛋白变体包括半胱氨酸变体，其中相对于天然ANGPTL3蛋白的氨基酸序列，一个或多个半胱氨酸残基缺失、或替代为其它氨基酸(例如丝氨酸)。一些实施方案中，当ANGPTL3蛋白必须重折叠成生物活性构象时，例如在分离不溶性包涵体后，半胱氨酸变体可能是有用的。一些实施方案中，半胱氨酸变体比天然多肽具有较少的半胱氨酸残基。一些实施方案中，半胱氨酸变体具有偶数个半胱氨酸残基以最小化由未配对的半胱氨酸导致的相互作用。

一些实施方案中，ANGPTL3蛋白的功能性变体或修饰形式包括本发明ANGPTL3蛋白与一个或多个融合结构域的融合蛋白。熟知的融合结构域例子包括，但不限于，聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和/或人血清白蛋白(HAS)。可以选择融合结构域或其片段以赋予期望性质。例如，一些融合结构域对于通过亲和色谱分离融合蛋白尤其有用。对于亲和纯化，可以使用亲和色谱的相关基质，例如谷胱甘肽、α淀粉酶、和镍或钴缀合的树脂。许多此类基质可以以“试剂盒”形式获得，例如Pharmacia GST纯化系统和可以与(HIS₆)融合配偶体一起使用的QLAexpress^TM系统(Qiagen)。另一例子，可以选择融合结构域以利于ANGPTL3蛋白的检测。检测结构域的例子包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及"表位标签"——通常是可以获得针对其的特异性抗体的短肽序列。易于获得针对其的特异性单克隆抗体的熟知表位标签包括FLAG,流感病毒血细胞凝集素(haemagglutinin)(HA),和c-myc标签。一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如因子Xa或凝血酶(Thrombin)的切割位点，所述切割位点将允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白并由此释放出重组蛋白质。然后，释放的蛋白质可以通过随后的色谱分离而与融合结构域分开。一些实施方案中，ANGPTL3蛋白与可以在体内稳定该ANGPTL3蛋白的结构域(例如“稳定剂”结构域)融合。“稳定”指增加血清半衰期，而不论该增加是否是由破坏减少、肾清除减少、或其它药代动力学效果引起。已知与免疫球蛋白的Fc部分融合可以在广泛的蛋白质上赋予期望的药代动力学性质。同样地，与人血清白蛋白融合可以赋予期望的性质。可以选择的其它类型的融合结构域包括多聚化(例如二聚化、四聚化)结构域和功能结构域(按期望，赋予额外的生物学功能)。可以构建融合物，将异源肽融合在本发明多肽的氨基端和/或本发明多肽的羧基端。

编码血管生成素样3蛋白酶抗性多肽的核酸

本发明还提供编码本发明蛋白酶抗性多肽的核酸、以及用于表达蛋白酶抗性多肽的表达载体和宿主细胞。其它方面，本发明提供编码本发明多肽的多核苷酸、以及包含该多核苷酸的表达载体和宿主细胞。在一些实施方案中，优化多核苷酸以用于在宿主细胞中表达。一些实施方案中，本发明提供在人类患者中改善或防止关节炎或关节损伤的方法，该方法包括：向患者的关节施用编码本发明多肽的表达载体，其中该多肽表达后在患者中改善或防止关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，患者患有关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，个体没有，但有危险罹患，关节炎或关节损伤。一些实施方案中，关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关节炎。

可以使用重组遗传学领域的常规技术，表达本发明多肽。公开了可以在本发明中使用的一般方法的基础教科书包括本领域已知的Sambrook和Russell eds.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd edition；系列丛书Ausubel et al.eds.(2007，更新至2010)Current Protocols in Molecular Biology,等等。

表达可以使用本领域已知的任何合适宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等进行。原核和真核表达系统均是广泛可获得的。一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达系统，例如CHO细胞表达系统。一些实施方案中，可以对核酸进行密码子优化以利于在期望宿主细胞中的表达。

非病毒载体和系统包括质粒和附加型载体(典型地包含用于表达蛋白或RNA的表达盒)、和人工的人染色体(参见例如Harrington et al.,Nat Genet 15：345,1997)。例如，可以用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达本发明多肽的非病毒载体包括pThioHis A,B&C,pcDNA3.I/His,pEBVHis A,B&C(Invitrogen,San Diego,CA),MPSV载体、和本领域已知用于表达其它蛋白的许多其它载体。有用的病毒载体包括，但不限于，基于腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头状瘤病毒、HBP EB病毒的载体、禽痘病毒载体、痘苗病毒载体、和Semliki森林病毒(SFV)载体。

表达载体的选择取决于待表达所述载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与编码本发明多肽的多核苷酸有效连接的启动子和其它调节序列(例如增强子)。一些实施方案中，使用诱导性启动子以防止插入序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导性启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子或热休克启动子。此外，其它调节元件也可以并入以改善编码本发明多肽的核酸的表达，例如增强子、核糖体结合位点、转录终止序列等等。

一些实施方案中，编码本发明多肽的核酸也可以包括编码分泌信号序列的序列，以便多肽可以自宿主细胞分泌。该序列可以由载体提供、或作为存在于载体中的ANGPTL3核酸的一部分。

用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法可以根据宿主细胞类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主(一般地参见Sambrook等，同上引文)。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物轰击方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合、试剂增强的DNA摄取、和离体转导。对于重组蛋白的长期高产率生产，常常期望稳定表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因的本发明表达载体，制备稳定表达本发明多肽的细胞系。

一些实施方案中，可以将编码本发明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽的核酸递送给患者以治疗关节相关损失或疾病。可以使用本领域已知的任何方式递送该核酸，但典型地使用直接注射到受累关节中来实现递送。一些实施方案中，通过向关节中直接注射，以裸DNA的形式递送DNA。一些实施方案中，使用病毒载体，包括但不限于，腺病毒或腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒或痘苗病毒载体。

治疗性应用多肽的方法和适应症

提供的本发明方法包括治疗罹患或有危险罹患关节损坏或关节炎的个体的方法，包括向个体施用治疗有效量的本发明多肽。本发明还提供在人类患者中改善或防止关节炎或关节损伤的方法，该方法包括：向患者的关节施用包含有效量的本发明多肽的组合物，由此在患者中改善或防止关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，患者患有关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，个体没有，但有危险罹患，关节炎或关节损伤。一些实施方案中，关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关节炎。在一些实施方案中，施用给个体的组合物还包括透明质酸。

另一方面，本发明提供诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的方法，包括使间充质干细胞接触足够量的本发明多肽以诱导该干细胞分化为软骨细胞。在一些实施方案中，该方法在体内实施，干细胞存在于人类患者中。

本发明考虑，可以将本发明多肽、组合物和方法用于治疗、改善或防止任何类型的关节软骨损坏(例如，关节损坏或损伤)，包括，例如，因创伤事件、或腱或韧带撕裂引起的损坏。一些实施方案中，例如在存在关节炎或关节损坏或关节损伤的遗传史或家族史时，或在关节手术之前或期间，施用本发明蛋白以防止或改善关节炎或关节损坏。一些实施方案中，使用多肽、组合物和方法治疗关节损坏。在特定实施方案中，关节损坏是创伤性关节损伤。在其它实施方案中，关节损坏是因衰老或不活动引起的损坏。在再其它实施方案中，关节损坏是因自身免疫病症引起的损坏。在本发明的一些实施方案中，可以使用本发明的多肽、组合物和方法治疗、改善或防止骨关节炎。一些实施方案中，使用多肽、组合物和方法在有危险罹患或获得关节炎的个体中改善或防止关节炎。一些实施方案中，使用多肽、组合物和方法在有危险罹患或获得关节损坏的个体中改善或防止关节损坏。

一些实施方案中，本发明多肽、组合物和方法提供在软骨性组织中刺激软骨细胞增殖和软骨产生的方法，其中所述软骨性组织已经例如由于创伤性损伤或软骨病而损坏。在特定实施方案中，本发明多肽、组合物和方法可用于治疗关节中，例如在关节联接的表面，例如脊柱、肩、肘、腕、指关节、髋、膝、踝、和脚关节，的软骨损坏。可以得益于治疗的疾病或病症的例子包括骨关节炎、类风湿性关节炎、其它自身免疫性疾病、或分离性骨软骨炎(osteochondritis dessicans)。此外，软骨损坏或破坏可以因一些遗传或代谢性病症引起，软骨畸形常常以侏儒症的形式见于人类中，和/或软骨损坏或破坏常常可以因重建手术引起；因此多肽、组合物和方法在这些患者中可以是有用的疗法，其可以单独或组合其它方法使用。

本发明还考虑，可以使用本发明的多肽、组合物和方法治疗、改善或防止各种软骨性病症和/或此病症的相关症状或影响。使用本发明多肽、组合物和方法治疗、改善和/或防止的示例性病症或疾病包括，但不限于，全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、骨关节炎、退行性椎间盘疾病(degenerative disc disease)、脊椎关节病(spondyloarthropathies)、Ehlers Danlos综合征、全身硬化(硬皮病)、或腱疾病。可以得益于本发明多肽治疗以改善相关效应的其它病症或病况包括：特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies)(皮肌炎(dermatomyositis)，多发性肌炎(polymyositis))，Sjogren's干燥综合征(Sjogren's syndrome)，系统性血管炎(systemicvasculitis)，结节病(sarcoidosis)，自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolyticanemia)(免疫性全血细胞减少症，阵发性睡眠性血红蛋白尿症)，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少症)，甲状腺炎(Graves病，桥本甲状腺炎，青少年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾脏疾病(肾小球肾炎，肾小管间质性肾炎)、中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病，如多发性硬化，特发性脱髓鞘性多发性神经病或吉兰-巴雷综合征，和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、肝胆疾病，如传染性肝炎(甲型，乙型，丙型，丁型，戊型肝炎和其他非嗜肝病毒)，自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎，和硬化性胆管炎，炎症性肠病(溃疡性结肠炎：克罗恩氏病)，麸质过敏性肠病，和Whipple's病，自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病，多形性红斑、接触性皮炎，银屑病，变应性疾病如哮喘，变应性鼻炎，变应性皮炎，食物过敏和荨麻疹，肺的免疫学疾病如嗜酸性粒细胞性肺炎，特发性肺纤维化、过敏性肺炎，移植相关的疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病。

“患者”在本文中指，被给予本发明的治疗性多肽的任何个体。本发明考虑，本发明的多肽、组合物和方法可用于治疗哺乳动物。在本文中，“个体”指任何哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，和动物园动物、运动动物或宠物动物，如牛(如母牛)、马、狗、绵羊、猪、兔、山羊、猫等。在本发明的一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体是马。在其它实施方案中，个体是狗。

在一些实施方案中，本发明多肽对于被治疗的哺乳动物可以是异源的。例如，人ANGPTL3蛋白或其片段，即源自人ANGPTL3蛋白的蛋白质或肽(例如，修饰的人ANGPTL3蛋白，人ANGPTL3蛋白质的保守变体，源自人ANGPTL3蛋白的肽模拟物)，可以用于治疗动物，如马，牛、或犬。一些实施方案中，可以使用异源ANGPTL3蛋白扩增培养的软骨细胞群以用于移植。在一些实施方案中，然后可以将该扩增的培养物任选地与同源于待治疗哺乳动物的多肽和组合物混合，并放置在关节腔中或直接放入软骨缺损中。备选地，在人患者的治疗中使用源自相同物种的本发明多肽，即人ANGPTL3蛋白或其片段——源自人ANGPTL3蛋白的蛋白质或肽(例如，修饰的人ANGPTL3蛋白，人ANGPTL3蛋白质的保守变体，源自人ANGPTL3蛋白的肽模拟物)。通过使用来自所治疗哺乳动物相同物种的蛋白，可以避免无意中的免疫反应。

在一些实施方案中，通过直接注射到关节滑液中、系统性给药(口服或静脉内)或直接施用在软骨缺损中，单独地或与合适的载体复合地(以延长蛋白释放)，应用本发明的多肽及组合物。一些实施方案中，多肽或组合物于生物基质或支架中施用。本发明的多肽、组合物和方法也可以与受累关节处的外科手术联用。本发明多肽的施用可以在外科手术之前、期间或并行地、和/或之后发生。例如，本发明的多肽，组合物和方法可以用于扩增培养的软骨细胞群以用于自体或同种异体软骨细胞植入(ACI)。任选地，可以植入软骨细胞，并给予施用本发明的多肽和组合物的并行治疗。在这些程序中，例如，可以通过关节镜从损坏关节的未受损的微小受荷区域收获软骨细胞，并可进行体外培养(任选地在本发明多肽和组合物和/或其他生长因子存在下)，以增殖移植之前的细胞数。然后可以将该扩增的培养物任选地与本发明多肽和组合物混合，和/或放置在关节腔中或直接放入缺损中。在一些实施方案中，将扩增的培养物(任选地与本发明多肽一起)放入关节腔中悬浮在基质或膜中。在其它实施方案中，本发明的多肽和组合物可与一个或多个骨膜或软骨膜移植物联合使用，其中所述移植物含有软骨形成细胞和/或有助于固定住移植的软骨细胞或软骨细胞的前体细胞。在一些实施方案中，本发明的多肽和组合物与其它程序联用以修复软骨损坏，包括但不限于关节冲洗，骨髓刺激，磨削关节成形术，软骨下钻孔，或近端软骨下骨的微骨折。任选地，在施用本发明的多肽和组合物和软骨生长后，额外的手术治疗可能有利于适宜地塑造新形成的软骨表面的轮廓。

药物组合物

鉴于表现出增强稳定性和蛋白酶抗性的几个多肽序列的鉴定，包括所提供的多肽的治疗组合物落入本发明的范围内，并特别地被考虑。因此，在再一方面，本发明提供含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含制药上或生理学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物还包含透明质酸或其衍生物。

此外，本发明提供在人类患者中改善或防止关节炎或关节损伤的方法，该方法包括：向患者的关节施用包含有效量的本发明多肽的组合物，由此在患者中改善或防止关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，患者患有关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，个体没有，但有危险罹患，关节炎或关节损伤。一些实施方案中，关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关节炎。在一些实施方案中，施用给个体的组合物还包括透明质酸。

另一方面，本发明提供诱导间充质干细胞分化为软骨细胞的方法，包括使间充质干细胞接触足够量的本发明多肽以诱导该干细胞分化为软骨细胞。在一些实施方案中，该方法在体内实施，所述干细胞存在于人患者中，并且所述接触包括向患者的关节施用含有有效量的本发明多肽的组合物，由此诱导干细胞分化成软骨细胞和产生软骨。

可以将包含编码本发明多肽的核酸的治疗组合物递送给患者以治疗关节相关损伤或疾病，并且该治疗组合物也落入本发明的范围中。一些实施方案中，药物组合物包含编码本发明多肽的裸DNA。一些实施方案中，使用病毒载体以实现递送，药物组合物包含编码本发明多肽的载体,包括但不限于，腺病毒或腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒或痘苗病毒载体。药物组合物可以包含治疗有效量的编码本发明多肽的核酸以及可药用或生理课接受的载体。

本发明另一方面，考虑将所提供的多肽用作治疗关节损坏的药物。在一些实施方案中，提供本发明多肽用作改善关节炎或关节损坏的药物。一些实施方案中，关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关节炎。在其它实施方案中，关节损坏是创伤性关节损伤、自身免疫性损坏、年龄相关性损坏、或与不活动相关的损坏。其它实施方案中，提供编码本发明多肽的核酸用于药物。

适于施用的制剂包括赋形剂，包括但不限于，水性或非水性溶液、等渗无菌溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使制剂等渗的溶质)、以及水性和非水性无菌悬浮液(其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂)。在某些实施方案中，药物组合物包含与可药用配制试剂混合的治疗有效量的肽，其中所述配制试剂经选择与施用模式、递送模式和期望剂量相适宜。见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(18thEd.,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company 1990),及其随后版本。药物组合物中主要的媒介物或载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的注射用媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，任选地补充在胃肠外施用的组合物中常见的其他材料。例如，可以使用缓冲剂，例如，以维持组合物在生理pH值或稍低的pH值，通常在pH值约5至约8的范围内，并可任选包括山梨糖醇，血清白蛋白，去垢剂，或其他附加成分。在某些实施方案中，可以使用适当的赋形剂(例如，蔗糖)配制含有本发明多肽或编码本发明多肽的核酸的药物组合物，以便以冻干形式贮存。

在其他实施方案中，用可以造成本发明多肽或编码本发明多肽的核酸控释或缓释的试剂，如可注射微球，生物可蚀性颗粒，聚合物化合物，珠，或脂质体或其它生物相容性基质，进行配制，然后制剂可以通过储库(depot)注射递送。例如，可以将本发明多肽或编码本发明多肽的核酸包囊在脂质体中、或配制成微粒或微囊，或可并入其他媒介物，如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精(例如见Gonzalez et al.,1999,Bioconjugate Chem.,10,1068-1074；Wang等,国际PCT公布号WO 03/47518和WO 03/46185)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和PLCA微球(见例如U.S.Pat.No.6,447,796和US专利申请公布号US 2002130430)、可生物降解的纳米胶囊、和生物粘附性微球中，或经由蛋白质性载体(O'Hare andNormand,International PCT Publication No.WO 00/53722)或利用缀合物递送。再其他合适的递送机制包括植入式递送装置。

用于治疗上述疾病或病症的本发明化合物的剂量，取决于给药的方式、个体的年龄和/或体重，以及受治个体的情况，是可变的，并最终由主治医师或兽医决定。施用于个体的剂量，在本发明的情况下，应当在一段时间足以在个体中引起有益的反应。该剂量是“治疗有效量”。因此，可以根据所用的本发明特定蛋白质或编码本发明多肽的核酸的有效性、以及个体的情况和体重或待治疗区域的表面积，来确定合适剂量。剂量的大小也可以由特定个体中伴随特定蛋白质或载体的施用而出现的任何不良副反应的存在、性质和程度来确定。施用可以通过单剂量或分剂量来完成，或通过植入装置或导管以连续输注形式实施。给药频率将取决于所用制剂中本发明多肽或编码本发明多肽的核酸的药代动力学参数。临床医生可以滴定剂量和/或改变施用以达到期望的治疗效果。根据这些因素，一个典型的剂量范围从约0.01μ克/kg到约100mg/kg。在某些实施方案中，剂量范围从约0.1μg/kg达约10mg/kg；或约0.1μg/kg；约0.5μg/kg；约1μg/kg；约2μg/kg；约.5μg/kg；约10μg/kg；约15μg/kg；约20μg/kg；约25μg/kg；约30μg/kg；约35μg/kg；约40μg/kg；约45μg/kg；约50μg/kg；约55μg/kg；约60μg/kg；约65μg/kg；约75μg/kg；约85μg/kg；约100μg/kg。在一些实施方案中，剂量为约50μg/kg；约100μg/kg；约150μg/kg；约200μg/kg；约250μg/kg；约300μg/kg；约350μg/kg；约400μg/kg；约450μg/kg；约500μg/kg；约550μg/kg；约600μg/kg；约650μg/kg；约700μg/kg；约750μg/kg；约800μg/kg；约850μg/kg；约900μg/kg；约950μg/kg；约1mg/kg；约2mg/kg；约3mg/kg；约4mg/kg；约5mg/kg；约6mg/kg；约7mg/kg；约8mg/kg；约9mg/kg；约10mg/kg。

施用方法

可以递送本发明蛋白质或编码本发明多肽的核酸到受累关节的任何方法均可用。在本发明中，组合物可胃肠外给药，例如注射，例如，关节内(例，至关节中)，静脉内，肌内，皮下注射；输注或植入，例如，在膜、基质、装置等中。注射、输注或植入时，可直接递送进入合适的组织或关节，并且递送可以是直接浓注(bolus)递送或连续递送。在一些实施方案中，递送可以在紧靠受累关节的合适组织中。在一些实施方案中，递送可通过扩散，或通过定时释放浓注剂进行。在某些实施方案中，控释系统(例如，泵)可以放置在治疗靶(例如，待施用多肽的关节)附近。在其他实施方案中，可选择组合物以用于摄入，例如，吸入或口服递送。

本发明治疗性多肽或编码本发明多肽的核酸也可以有效地与一种或多种其它活性剂(例如，透明质酸或其衍生物或盐，生长因子(例如，FGF18，BMP7)，软骨发生剂(例如，口服鲑鱼降钙素，SD-6010(iNOS抑制剂)，维生素D3(胆钙化醇)，胶原水解物，rusalatideacetate,鳄梨大豆非皂化物(ASU)，在WO2012/129562中描述的化合物，kartogenin)，类固醇，非甾体抗炎药(NSAID)等)组合使用，取决于期望的治疗或效果，以提高或增强任一方的疗效。该方法可涉及在同一时间将两种活性剂施用于患者，其中可以以包括两种活性剂的单一组合物或药物制剂的形式施用，或施用两个不同的组合物或制剂，其中一个组合物包括本发明多肽或编码本发明多肽的多核苷酸，而另一组合物包括第二活性剂(多种第二活性剂)。包含本发明多肽或编码本发明多肽的多核苷酸的治疗性组合物的施用可以在第二活性剂施用之前或之后，间隔从几分钟到几周。

化合物制剂可作为溶液，悬浮液，凝胶，乳液，固体，或作为脱水或冻干粉存放在无菌瓶中。可以在单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶中提供制剂。在一些实施方案中，可以在单室或多室的预填充注射器(例如，液体注射器，lysosyringes)中提供制剂。溶液和悬浮液可以从前述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备。

本发明还提供包括本发明多肽或编码本发明多肽的核酸的试剂盒。在一个实施方案中，提供用于生产单剂量给药单元的试剂盒。试剂盒包括：第一容器，其含有干燥的本发明多肽或编码本发明多肽的核酸；和第二容器，其具有水性重构配方。在某些实施方案中，一个容器包括单室预填充注射器。在其它实施方案中，包括多室预填充注射器形式的容器。

实施例

下面的实施例用于举例说明，但不限制本发明。

实施例1：蛋白酶抗性Angptl3肽构建体

构建各种N-端截断突变体以移除O-连接的糖基化并促进生物物理蛋白表征。为鉴定抗蛋白酶的肽，将氨基酸取代引入到人Angptl3肽片段(相应于该肽C-端区)的不同位置。图1显示了人Angptl3中的突变位置。构建体最初制备为带有His标签。这些突变蛋白是：225-460K423Q(225KQ),225-460S424T(225ST),226-460K423Q(226KQ),226-460K423S(226KS),228-460K423Q(228KQ),228-460S424T(228ST),233-460K423Q(233KQ),233-460K423S(233KS),241-460K423Q(241KQ),241-460K423S(241KS),241-460Kdel(241Kdel),242-460K423Q(242KQ),242-460K423S(242KS)和242-460Kdel(242Kdel)。

带His-标签的蛋白在HEK Freestyle^TM细胞中表达，通过Ni-NTA柱层析法纯化。还克隆了不带标签的C-端构建体，并通过先前描述的方法(Gonzalez R等PNAS 2010)纯化。简言之，将具有信号序列(1-16)的靶蛋白克隆在具有巨细胞病毒启动子的哺乳动物表达载体中。在HEK 293Freestyle(Invitrogen)中DNA/PEI转染后96小时，收获含有分泌的靶蛋白的培养基并通过Hi-Trap SP柱(GE Healthcare)纯化。蛋白在50mM MES(pH 6.0),125mM NaCl到50mM MES(pH 6.0),150mM NaCl之间洗脱。SDS-PAGE电泳确认纯化的蛋白至少为95％的纯度。

抗蛋白酶抗性通过如下评估。制备的蛋白各10ng与胰蛋白酶以质量比8000：1(蛋白质：胰蛋白酶)室温孵育1小时，以进行限制性胰蛋白酶解。然后，加入乙酸使反应到达pH3.0，淬灭胰蛋白酶解反应。淬灭后的样品进行LC/MS分析。对应于C端43个氨基酸(S424-E460)的质量的5min RP HPLC峰是相应野生型蛋白构建体的证据。该剪切位点与全长野生型angplt3蛋白产生过程中观察到的剪切位点一样，即K423和S424之间。当剪切位点处的赖氨酸突变为谷氨酰胺时，则缺少该峰。对肽构建体225KQ，228KQ，233KQ，233KS，241KQ，和242KQ；及野生型225肽，均进行了制备和分析。对于每一种构建体，当剪切位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺或丝氨酸时，或当423位的赖氨酸缺失时，对应于C端43个氨基酸的质量的峰缺失。

实施例2：整联蛋白结合试验

αVβ3整联蛋白体外检测制备的肽225KQ,228KQ,233KQ,241KQ和242KQ与αVβ3整联蛋白的结合。简言之，Maxisorp板用2μg/mLαVβ3整联蛋白包被，加入不同浓度的(所示)多肽构建体。通过加入抗-ANGPTL3 mAb，之后加入辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG抗体，检测结合的肽。所有被测试的肽保留或改进了整联蛋白结合能力。从结合数据确定了每个测试肽的EC₅₀值，结果如表2所示。

表2：ANGPTL3和工程化多肽构建体与整联蛋白的体外结合

	α5β1整联蛋白EC<sub>50</sub>	αVβ3整联蛋白EC<sub>50</sub>
			WT	3.054	3.245
242KQ	1.566	3.076
			241KQ	2.693	4.032
233KQ	13.83	6.636
			228KQ	4.26	4.051
225KQ	19.89	11.18

α5β1整联蛋白体外检测制备的肽225KQ,228KQ,233KQ,241KQ和242KQ与α5β1整联蛋白的结合。用2μg/mL α5β1整联蛋白，如上所述包被板；加入不同浓度的(所示)多肽构建体，如上所述进行检测。所有被测试的肽保留或改进了整联蛋白结合能力。从结合数据确定了每个测试肽的EC₅₀值，结果如表2所示。

实施例3：构建体的功能分析

细胞培养与分化。FACS分选原代人骨髓来源的间充质干细胞(hMSCs)，证明对于CD29，CD44，CD166、CD105而言>98％阳性，对于CD45而言＜0.1％阳性；2-8代的细胞用于实验。人软骨定居MSC(hCR-MSCs)源于人原代关节软骨细胞，其被分离成单细胞、在MSCGM中克隆生长并通过软骨形成、骨形成和脂肪形成性分化而验证为MSC。FACS分选细胞，证明对于CD166和CD105而言>98％阳性。将hCR-MSC培养多达20代，未鉴定到细胞性质、生长或分化速率的改变。

软骨形成。在生理和功能试验中评估本发明的肽构建体，以评价软骨形成活性。

在此提供的工程化构建体来自ANGPTL3，其属于七个已识别的ANGPTL蛋白的家族，这些ANGPTL蛋白的结构与血管生成素相似，但缺乏结合Tie2受体的能力，从而具有不同的功能。ANGPTL蛋白质含有N端卷曲螺旋结构域(CCD)和C端纤维蛋白原样结构域(FLD)，被认为受到其微环境的严格调控，与细胞外基质(ECM)如纤连蛋白和整联蛋白相互作用。Conklin等,Genomics 62(3)：477-482(1999)；Goh YY等,Am J Pathol 177(6)：2791-2803(2010)；GohYY等J Biol Chem 285(43)：32999-33009(2010)。与ANGPTL3最密切相关的ANGPTL家族成员，ANGPTL1(全长和C-端结构域)和ANGPTL4(全长和C端结构域)，的序列见表3；表5B展示了在这些家族成员的C端结构域之间的比对。表5A提供了ANGPTL1、ANGPTL4、以及其他血管生成素蛋白ANGPTL7、ANGPT1和ANGPT2在胞外结构域和C-末端结构域上的序列同一性。ANGPTL3的C端结构域(CT)与CT ANGPTL1共享37％的序列同一性，和CT ANGPTL4共享40％的序列同一性。

依据Johnson,K.,等,(2012)Science336,717的先前描述，体外诱导和评估基于细胞的二维软骨形成。简言之，将原代人骨髓来源的间充质干细胞(hMSCs)接种于生长培养基中，随后改为有或无构建体的软骨细胞形成性刺激培养基。

固定孔并用罗丹明B染色(此时结节容易通过肉眼检测并通过光学显微镜捕获图像)，以最初获取结节形成的图像。为促进高通量的基于成像的检测和定量，采用与胶原非特异结合的尼罗红染色软骨生成性结节。在Acumen eX3(高内涵成像装置)上，采用488激光器激发，快速检测结节，从而量化尼罗红染色的结节。

表3：ANGPTL家族序列

表4：ANGPTL家族成员蛋白的软骨形成

蛋白	结节形成活性	II型胶原诱导	Genbank登录号
				Angptl1	是	是	NP_004664
Angptl2	否	n/a	NP_036230
				Angptl3	是	是	NP_055310
Angptl4	是	否	NP_647475
				Angptl6	否	否	NP_114123
Angptl7	否	否	NP_066969
				Angpt2	否	n/a	NP_001138
Angpt1	否	n/a	NP_004664

依据Johnson,K.,等,(2012)Science336,717的先前描述，体外诱导和评估基于细胞的二维软骨形成。简言之，将原代人骨髓来源的间充质干细胞(hMSCs)接种于生长培养基中，随后改为有或无构建体的软骨细胞形成性刺激培养基，并培养7天或14天。然后用甲醛固定细胞，洗涤后使用标准的免疫细胞化学技术染色，以检测主要软骨蛋白2A型前胶原(PIIANP)(图2A)和II型胶原(图2B)。为检测II型胶原，用添加在透化溶液中的0.2％胶原酶II(Worthington Biochemical,Lakewood,NJ)消化细胞。如前所述，通过高内涵成像(ImageExpress Ultra(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)),利用多波长细胞评分脚本(multi-wavelength cell scoring script)，对所检测的每种蛋白质，定量免疫荧光。参见图2。通过如下方法制备细胞，监测聚集蛋白聚糖的表达：简言之，原代hMSC(5000个细胞)接种于Griener 384孔板中。24小时后，移出生长培养基，替换为25μl含1％FBS的DMEM。然后将蛋白质构建体以所示剂量添加到各孔中，37℃培养3天。经10％福尔马林固定细胞后，使用免疫细胞化学法检测聚集蛋白聚糖的表达。在ImageXpress Ultra上进行孔成像，利用多波长细胞评分脚本，n＝6/蛋白浓度，进行定量。图3b示例性显示了，相对于对照(在无构建体的情况下，仅稀释剂刺激的细胞)，WT野生型C端ANGPTL3(225-460)、工程化构建体242KQ或242Kdel、或全长ANGPTL1(相关的ANGPTL蛋白家族成员)的结果。在分别使用225WT,225KQ,226KQ,228KQ,233KQ,241KQ和242KQ构建体的实验中观察到类似的结果。

采用先前描述的分析试验和方法，在此针对其它ANGPTL相关家族成员，进行了软骨形成分析试验。进行实验以检查是否密切相关的蛋白质可以赋予软骨形成活性、以及是否该活性保留在该蛋白质的C末端中。ANGPTL1和ANGPTL4在结节形成试验中显示出活性；然而，只有ANGPTL1在软骨形成试验中显示出对II型胶原的诱导。见表4。结节形成活性和Ⅱ型胶原诱导试验的结果总结在表4中。本文描述对ANGPTL1的其它表征。参见本实施例的其它部分和图3-5。

表5：人血管生成素样家族成员间的序列同源性

5A：人血管生成素样家族成员间的序列同一性(ECD或CTD)

<u>家族成员</u>	<u>家族成员</u>	％<u>序列同一性</u>
			hANGPTL3_17-460	hANGPTL4_26-406	32.6
hANGPTL3_17-460	hANGPTL1_24-491	25.7
			hANGPTL3_17-460	hANGPTL7_27-346	28.1
hANGPTL3_17-460	hANGPT1_23-498	24.1
			hANGPTL3_17-460	hANGPT2_19-496	23.4
hANGPTL3_241-460	hANGPTL4_179-406	40.0
			hANGPTL3_241-460	hANGPTL1_271-491	36.8
hANGPTL3_241-460	hANGPTL7_122-343	36.4
			hANGPTL3_241-460	hANGPT1_277-497	37.3
hANGＰTL3_241-460	hANGPT2_275-495	36.4

5B：人血管生成素样家族成员的C-端结构域hANGPTL1(271-491)/hANGPTL3(241-460)/hANGPTL4(179-406)的序列比对

RNA表达分析也用于评估软骨特异性蛋白的表达。简言之，在无血清DMEM，1X ITS加构建体(所示)中，qRT-PCR hMSC在团块培养(pellet culture)(1x10⁶细胞/团块)中培养3，7，10，21天。每3天更换一次培养基。使用Roche LightCycler，定量Lubricin、聚集蛋白聚糖、Sox9、IGF1、IFITM1、骨钙蛋白和X型胶原蛋白的mRNA表达(数据汇总自一式两份重复进行的3次实验(n＝6))。图3A代表242KQ和225WT在第10天的表达数据。对所有基因，基因表达数据在第3，7和21天是相似的。

全长ANGPTL3先前已经被证明在人和小鼠间充质干细胞中具有软骨形成活性。检测了构建体在人、小鼠、大鼠和犬间充质干细胞中的活性，以证实其它物种交叉反应能力。将来自小鼠、大鼠、人和狗的CR-MSC与如上所述构建体一起培养18天。固定培养物，使用标准的免疫细胞化学技术染色，以检测软骨细胞特异性蛋白II型胶原；并使用高内涵成像，定量II型胶原阳性细胞。对于评价的每个物种的细胞，证实了量化的II型胶原量的相似倍数增加。

软骨保护。在功能试验中评价肽构建体，以评估软骨保护活性。

依据Johnson,K.,等,(2012)Science336,717-721描述，实施离体糖胺聚糖(GAG)释放抑制试验(指示基质损坏)。简言之，分离牛软骨，打孔成对称圆，并放入器官培养。在存在或不存在蛋白构建体时，用20ng/ml TNFα和10ng/ml抑瘤素M(OSM)(炎性介质)处理切片48小时以诱导软骨基质降解，由此鉴定糖胺聚糖(GAG)释放的抑制百分数。图4A所示结果呈现了汇总自4个供体(n＝12)、使用所示工程化构建体和WT 225-460获得的结果。

依据Johnson,K.,等,(2012)Science336,717-721描述，实施体外一氧化氮(NO)抑制试验(软骨保护的指标)。简言之，原代软骨细胞用所示蛋白质构建体处理48小时。进行Greiss反应，以确定构建体对NO释放抑制的影响，显示在图4B中的结果呈现了以所示工程化构建体和WT C端片段225-460获得的结果。图4C中的结果呈现了使用野生型C端ANGPTL1、工程化ANGPTL3 242KQ或对照获得的结果。

纤维软骨形成的抑制。在添加抗坏血酸和存在或不存在(所示)构建体的情况下，如上所述培养原代人关节软骨细胞14天以诱导肥大，并通过免疫荧光评价X型胶原的表达。图5A中所示结果呈现了使用所示构建体225WT或242KQ得到的数据。图5B中所示结果呈现了使用野生型C端ANGPTL1、工程化ANGPTL3 242KQ或242Kdel、或野生型C端ANGPTL3片段225-460获得的数据。如通过X型胶原表达所检测到的，野生型或活性构建体的存在导致对肥大情况下纤维软骨形成的抑制作用。

血管发生。已经报道，ANGPTL3蛋白的WT C端结构域在体外和在体内在大鼠角膜模型中具有血管发生活性和性质。参见Camenisch等,J.Biol.Chem.277(19)：17281-17290(2002)。为了解决体内施用C端ANGPTL3后诱导新血管的可能危险，检查了体外血管发生试验。简言之，使用基础内皮细胞培养基，对原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)实施血清饥饿过夜。然后，使用cell tracker green标记细胞，加入包埋了蛋白构建体(所示)的预包被的matrigel板。在全长ANGPTL3(50ng/ml)或242KQ(50ng/ml)或bFGF(50ng/ml)(作为阳性对照)存在下培养18小时后，使用高内涵成像，定量分支点数目和形成的总血管长度，作为血管发生活性的量度。与存在全长ANGPTL3或阳性对照下看到的效果相反，当细胞与242KQ一起孵育时，未检测到任一参数的显著增加。见图2C。

CR-MSCs存在于透明关节软骨中，响应于损伤而出现数量增加。软骨组织损伤后，这些细胞有参与修复过程的能力，但其本身不足以导致恰当的软骨修复。由此，患者的关节软骨缺乏支持无痛关节运动的恰当能力，患者常常需要手术干预和/或关节置换以维持他们的生活质量。我们发现，ANGPTL3和尤其是工程化蛋白酶抗性ANGPTL3肽具有指导人CR-MSCs分化为软骨细胞的能力，特别是分泌透明关节软骨蛋白II型胶原和sox9，而抑制纤维软骨形成(通过X型胶原的表达而显示)。

据我们所知，没有ANGPTL3表达的报道，在我们的研究中使用Western印迹在人软骨细胞、人MSC或人滑膜成纤维细胞中也未观测到ANGPTL3表达。在啮齿类动物的关节中，采用免疫组织化学(IHC)发现很少表达至没有表达。然而，在人骨关节炎滑液中(n＝2)，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测到低水平ANGPTL3(1.3-6.0纳克/毫升)，表明在受损的关节中全身循环性蛋白可进入滑膜腔。

实施例4：构建体的体内分析

小鼠急性损伤手术模型。对先前所描述的模型Glasson,S.S.,等,OsteoarthritisCartilage15,1061(2007)进行适应性修改，手术切断C57BL/6小鼠(N＝12/组)右膝的前交叉韧带(ACL)、内侧半月板胫侧韧带(MMTL)、和内侧副韧带(MCL)，诱导膝关节的不稳定性，从而导致OA表型。为评价ANGPTL3治疗的潜在治疗益处，术后15周，如图6A所示在第17-19周小鼠关节内给药，一次/每周：mANGPTL3剂量＝200ng/膝。按0-4级定性评估胫骨平台：0为正常，5为重度骨关节炎(软骨的全层破坏)。来自每只小鼠的两个切片由2个独立的观察者进行盲分级(图6B)。

通过失能测试，或通过使用失能监测装置测定小鼠以手术处理的腿站立的时间相对于以未处理腿站立的时间的百分比，确定动物中骨关节炎诱导的疼痛的缓解。图7描述了读数结果，代表术后第35和56天的疼痛反应，报告为手术肢体相对于非手术肢体的负重％。处理为使用全长小鼠ANGPTL3(WT17-460)或C端人ANGPTL3(WT225-460)按上述给药的小鼠的结果。

小鼠慢性OA模型(胶原酶VII诱导的)另一广泛使用的骨关节炎动物模型——胶原酶VII诱导的慢性关节损伤模型——被用于评价构建体的体内功效。模型和评价如以前所述进行。见van der Kraan,P.M.,等,Am.J.Pathol.135,1001(1989)；和Johnson,K.,等,Science336,717(2012)。简而言之，三(3)天炎症期后是由胶原酶诱导的关节去稳定，导致轻度至中度软骨破坏。在诱导后，在膝中关节内施用构建体，自加入胶原酶VII后3周开始，每周一次，持续3周。治疗后40(42)天，收集关节和切片。通过股骨和胫骨平台的组织学关节严重度评分，定量组织修复。关节严重度得分通过上述组织学评分确定。图8描述了使用225WT，225KQ，228KQ，233KQ，和241KQ构建体的修复。为确认蛋白在关节中的存在(长期关节内保留)，固定组织和染色，通过免疫组织化学分析WT蛋白构建体的存在。分析证实了蛋白质的存在，表明ANGPTL3的关节内保留(对脂质/甘油三酯未观察到影响，使用标准代谢组评估，数据未显示。)

组织学分析和分级番红菌素O染色的内侧胫骨平台切片(用于检测损伤部位的蛋白聚糖，如上所述)，显示软骨基质的再生(数据未显示)。定性分析证实蛋白聚糖的替换类似于在幼稚小鼠中观察到的水平，而媒介物对照没有表现出类似的替换。此外，注射损伤处后8周，如上所述对组织切片进行Ⅱ型胶原染色。定性分析证实以构建体处理的关节中Ⅱ型胶原增加，类似于在幼稚小鼠中观察到的水平；而媒介物处理的对照未表现出类似的增长(数据未显示)。

半月板撕裂大鼠模型

还使用大鼠手术损伤模型评估构建体的体内功效。该模型和评价最初如GerwinN.等Osteoarthritis Cartilage.Suppl 3：S24(2010)先前描述的实施。简言之，剃除膝关节皮肤上的毛发，通过切口分离内侧副韧带(MCL)，稳定MCL，用手术刀造成半月板的远端切口。在手术后第1，2和3周，关节内注射构建体蛋白质或媒介物对照，并在手术后第4周和6周收集关节和切片。对股骨和胫骨平台进行组织学关节严重度评分，以如上所述量化组织修复。针对该6周分析，显示了数据。

治疗后健康的透明软骨替换了损伤。如上所述组织学分析及分级番红菌素O染色的软骨的外侧胫骨平台，并量化。结果显示，采用242KQ构建体治疗的动物表现出了软骨基质再生和蛋白聚糖替换，类似于在幼稚小鼠中见到的水平；而媒介物对照未出现类似的替换。参见图9。用225WT看到了类似的结果。

使用自上述模型稍加改动的手术诱导的半月板撕裂模型，在Lewis雄性大鼠中引发软骨损坏，以检测242KQ体内促进软骨修复的功效。对大鼠进行手术，完全切断内侧副韧带和内侧半月板，从而使关节去稳定，由此将来的负重将导致软骨的快速退化。在针两侧上均进行切割以切断韧带，从而确保完全切开。然后将刀片在髌韧带下方滑入滑膜腔，以尖端切割半月板。当关节外侧脱位时完成成功的切割。手术后一周，通过关节内注射体积25uL的242KQ或盐水到关节内滑膜腔中，向大鼠给药。

半月板撕裂手术后28天和关节内注射盐水或构建体后21天，处死研究动物，并收集受累关节用于分析，以PBS中10％福尔马林固定，甲酸脱钙，石蜡包埋后切片。切出冠状切片，进行番红菌素O染色、或不染色以备将来的免疫组化染色。分析表明，内侧胫骨平台有最大数量的软骨损坏，并且决定仅在关节的该区域进行242KQ功效的评估。使用OARSI评分系统，对每个动物(n＝10)跨胫软骨宽度的六个切片以盲法给出软骨严重性得分。在不同时间点进行两次评分，然后平均得分以产生软骨损伤分数。此外，使用MATLAB中生成的自定义脚本(script)，进行客观评分分析。该算法确定关节软骨表面并客观量化其它软骨参数(分区分析，番红菌素O强度，软骨面积，软骨厚度)。结果见图10A。

至少在人类中，软骨的结构修复不总是伴随着疼痛的缓解。虽然啮齿动物的生理和步态明显与人类不同，但评估242KQ以确定治疗后在步态或手术肢体上所用时间的长度上是否有任何改善。对242KQ治疗的大鼠进行失能监测。大鼠接受如上所述的改动的半月板手术。术后一周，注射242KQ到滑膜腔中。第28天，将大鼠放置在失能监测器上以后肢站立，经过10分钟获取每只大鼠的随后30个读数，以确定在每个后肢上使用(重量分布)的时间的百分比。这些数据指示疼痛诱导的重量重分布，已经确定，在大鼠半月板撕裂模型中，手术后一周用242KQ治疗导致了大鼠的等同负重能力的部分恢复。见图10B。

在自发或手术软骨修复过程中主要的挑战之一是透明关节软骨被纤维软骨置换。为探讨ANGPTL3介导的软骨修复类型，从收集自上述大鼠半月板撕裂研究的大鼠膝获取切片，染色以观察II型胶原(指示透明关节软骨)和X型胶原(指示纤维软骨)的存在。单次注射20μg 242KQ之后，X型胶原表达量定性减少。

通过如下方式确定在静脉内和关节内注射到大鼠膝中后242KQ的长期保留：¹²⁴I标记蛋白，施用后PET/uCT成像以监测保留。见，Gerwin,N.,等(2006)Advanced drugdelivery reviews 58,226-242。IA注射242KQ到关节中后平均停留时间(MRT)被确定为～17.3h，这比报道的标准2-3小时明显增加(见表6)

表6：¹²⁴I 242KQ的持久性

犬部分半月板切除术关节损伤模型

我们也在犬关节损伤模型中评价了ANGPTL3的活性。依据Connor,J.R.,等,Osteoarthritis and cartilage/OARS,Osteoarthritis Research Society17,1236-1243(2009)的描述，实施该模型和评估。简而言之，剃光膝关节皮肤上的毛发，通过切口分离内侧副韧带(MCL)，稳定MCL，用手术刀造成半月板的远端切开。在手术后四(4)天，动物接受蛋白构建体(犬全长ANGPTL3)的每周两次给药(1.5ug或15μg)、或单次给药(30ug)(在第7天)或媒介物对照(关节内注射)。第28天对犬实施安乐死，按上述用于大鼠和小鼠实验的方法，对膝实施组织学、切片和分级。图10显示与犬ANGPTL3治疗相关的修复的合计总体得分。在组织学分级和评价番红菌素O染色的犬关节切片后，在盐水组中出现最严重软骨丢失的区域是30μg单剂cANGPTL3施用后病变面积最大减少的关节部分。

应理解，本文描述的实施例和实施方案用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和后附权利要求书的范围内。

序列

Claims (10)

1.分离的多肽，其由选自SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39，或SEQ ID NO:41之任一的氨基酸序列组成，其中所述多肽具有软骨发生活性。

2.权利要求1的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。

3.药物组合物，其包含权利要求1或2的多肽。

4.权利要求1或2的多肽或权利要求3的药物组合物在制备用于在患者中治疗、改善或防止关节炎或关节损坏的药物中的用途，其中向患者的关节施用治疗有效量的权利要求1或2的多肽、或权利要求3的药物组合物。

5.权利要求4的用途，其中患者患有关节炎或关节损坏，或有罹患关节炎或关节损坏的危险。

6.权利要求1或2的多肽或权利要求3的药物组合物在制备用于治疗患有关节炎或关节损坏、或有罹患关节炎或关节损坏的危险的患者的药物中的用途，其中向患者施用治疗有效量的权利要求1或2的多肽、或权利要求3的药物组合物。

7.权利要求6的用途，其中关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关节炎。

8.权利要求6的用途，还包括对患者的受累关节实施手术。

9.权利要求8的用途，其中所述多肽或所述药物组合物在手术期间或之后施用。

10.权利要求9的用途，其中所述多肽或所述药物组合物与下述任一联合施用：骨髓刺激、软骨置换、自体软骨细胞植入(ACI)、基质诱导的自体软骨细胞植入(MACI)。

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