FI117667B - Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä - Google Patents

Description

117667 1.-. ..·.·

Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee farmaseuttista koostumusta, joka si-5 sältää rekombinanttien luun morfogeneettisten proteiinien (rBMP:t) pysyvien laskosvarianttien seoksen, ja sen käyttöä valmistettaessa lääkeainetta, joka on tarkoitettu käytettäväksi erityisesti ortopedisten ja hammaspotilaiden hoidossa.

Erityisesti esillä oleva keksintö koskee farmaseuttista koostumusta, joka sisältää vähintään kahden rBMP:n tai niiden monomeerien tai mutanttien pysyvien 10 laskosvarianttien seoksen sopivassa kantajasysteemissä.

Keksinnön tausta

Urist julkaisi ensimmäiset tutkimukset luun muodostumisesta au-toinduktiolla ja esitti uudet siihen osallistuvat proteiinitekijät vuonna 1965 [Urist, M.R., Science 150 (1965) 447 - 454]. Luuta indusoivaa toimintaa ei voitu katsoa 15 johtuvaksi yhdestä proteiinista vaan joukosta proteiineja, jolloin kukin ryhmän jäsen yksinään on riittävä indusoimaan heterotooppisen luutumisen (HO). Tämä aloitti luuta indusoivan toiminnan pitkän etsinnän ja kesti yli kaksikymmentä vuotta, ennen kuin ensimmäiset cDNA:t, jotka koodaavat luun morfogeneettisiä proteiineja eli BMP:itä kloonattiin [Wozney, J. M., et ai., Science 242 (1988) 20 1528 - 1534]. Sekvenssi-ja rakenneanalyysin perusteella muita proteiineja, ku- :V: ten kasvu- ja erilaistumistekijöitä (GDF:t) voitiin yhdistää alkuperäisiin BMP:ihin.

Yhdessä ne muodostavat BMP-perheen, jossa on yli kolmekymmentä jäsentä ··· [Reddi, h., Cytokine & Growth Factor Reviews 8 (1997) 11 - 20] ja joka kuuluu • * · · TGF-p-suurperheeseen.

25 BMP-perhe jaetaan alaperheisiin, joihin kuuluvat BMP:t, kuten * BMP-2 ja BMP-4, osteogeeniset proteiinit (OP:t), kuten OP-1 eli BMP-7, OP-2 eli ** BMP-8, BMP-5, BMP-6 eli Vgr-1, rustoperäiset morfogeneettiset proteiinit , (CDMP:t), kuten CDMP-1 eli BMP-14 eli GDF-5, kasvu/erilaistumistekijät ’‘-f (GDF:t), kuten GDF-1, GDF-3, GDF-8, GDF-9, GDF-11 tai BMP-11, GDF-12 ja 30 GDF-14, ja muut alaperheet, kuten BMP-3 eli osteogeniini, BMP-9 eli GDF-2 ja ·"*· BMP10 (Reddi et ai, supra).

·*· BMP-perheen jäsenten ja muiden TGF-p-suurperheen jäsenten ·. eräs yhteinen piirre on kokonaislaskostumistopologia, joka muistuttaa kättä, joka • · · *··;’ esittää voittomerkin, jolloin ranne esittää keskeistä alfaheliksiä, kaksi sormea 35 kahta antiparalleelia β-levyä ja kämmen kysteiinisolmualuetta [Scheufeler, C. et 2 117667 ai., J. Mol. Biol. 287 (1999) 103 -115]. Kysteiinisolmu koostuu kolmesta ketjujen-välisestä disulfidsillasta ja on kolmiulotteisen rakenteen päästabiloija, ja se on niin tehokas, että biologinen aktiivisuus säilyy jopa pitkällisen alhaiselle pH.lle tai urea- tai guanidiinihydrokloridikäsittelyille altistuksen jälkeen [Sampath, T. K., ja 5 Reddi, A. H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 7599 - 7603]. Kahden monomeerin dimerisoituminen stabiloi edelleen topologiaa, jolloin muodostuu , sisäinen hydrofobinen ydin (Scheufeler, C. ei ai., supra). Kokonaisdimeeriraken-ne on välttämätön myös biologiselle vaikutukselle, kuten osteoinduktiolle, sillä se mahdollistaa dimeerisen molekyylin samanaikaisen sitoutumisen vastaavaan 10 reseptoriin, esimerkiksi BMP-dimeerin samanaikaisen sitoutumisen tyypin I ja tyypin II seriini/treoniinireseptoriin, jolloin muodostuu heterotetrameeri, mikä käynnistää signaalikaskadin Smadsin fosforylaation kautta [Yamashita, H. ja Miyazono, K., Nippon Rinsho 57 (1999) 220 - 226].

BMP:iden proteiini- ja nukleotidisekvensseihin perustuvat tulokset 15 ovat paljastaneet, että luun morfogeneesiä, joka käsittää kemotaksiksen, mitoosin ja erilaistumisen, hallitsee BMP:iden toiminta. On myös osoitettu, että BMP:iden vaikutukset eivät rajoitu luuhun ja rustoon. Embryogeneesin varhaisessa vaiheessa BMP:t ohjaavat koko kehon suunnitelman muodostumista ja spesifioivat kudostyypot ja kiertonikamat. Aikuisessa BMP:t vaikuttavat luiden 20 kykyyn parantua onnistuneesti [yhteenveto, katso Wozney, J. ja Rosen, V., Clin.

Orthop. Rel. Res. 346 (1998) 26 - 37]. Tämä BMP-toiminnan aspekti yhdessä sen osteoinduktiivisen voiman kanssa on johtanut ajatukseen käyttää BMP:itä • · potilaiden hoidossa murtumien paranemisen lisäämiseksi ja luun täydentämi- • *·· seksi. Ensimmäiset tutkimukset, jotka suoritettiin natiiveilla BMP-valmisteilla ih- 25 misen luista [Johnson, E. E. et ai., Clin. Orthop. 250 (1990) 234 - 240; Clin. Or-·:**: thop. 277 (1992) 229 - 237] ja naudan luista [Sailer, H. F. ja Kolb, E., teoksessa

Bone Morphogenetic Proteiinisi Biology, Biochemistry and Reconstructive Sur-.··*. gery, sivut 207 - 230, Lindholm, T. S., toim., R. G. Ljaes Co, 909 Pine St,

Georgetown, TX 78626, 1996] paljastivat BMP:iden tehokkuuden ortopedisessä 30 ja Cranio-maxillokasvokirurgiassa, erityisesti vaikeissa tilanteissa.

::: Toinen BMP:iden aspekti on niiden osallistuminen heterotooppisen • · '··/’ luutumisen (HO) ilmenemiseen, mikä on luonut suuria odotuksia kehittää BMP:iden inhibiittoreita ja käyttää näitä terapeuttisina aineina HO:ssa. HO on ·:·*: yleinen komplikaatio potilailla, jotka ovat kärsineet pään ja niskan vammoista tai 35 vamman aiheuttamasta lonkkamaljan murtumasta tai joille on tehty täydellinen lonkkaleikkaus. Se on luunmuodostumisprosessi ektooppisissa kohdissa, kuten • · • · • · · 3 117667 lihas- ja sidekudoksessa, ja voi johtaa vähentyneeseen liikkuvuuteen, kipuun tai jopa täyteen niveljäykistymään, pääasiassa lantion ja kyynärpäiden nivelissä [yhteenveto, katso: Nilsson, O. S., Acta Orthop. Scja 69 (1998) 667 - 674]. Kun vanhempi väestö lisääntyy ja täysien lonkan nivelten korjausleikkausten luku-5 määrä kasvaa, HO:sta kärsivien potilaiden lukumäärän voidaan odottaa kasvavan. Lisäksi HO.ta esiintyy joissakin perinnöllisissä taudeissa, kuten sidekudoksen kasvuhäiriössä, tai hankituissa luuta muodostavissa vammoissa, kuten selkärangan hyperostoosissa, myelopatiassa ja selkärangan jäykistymässä, joihin ei ole olemassa parantavaa hoitoa tai kirurginen operaatio on ainoa hoitokeino.

10 Valitettavasti, ennen kuin nyt, BMP:iden löytymisellä ei ole ollut vai kutusta potilaiden lääkehoitoon huolimatta ensimmäisistä lupaavista tuloksista.

Tämä johtuu pääasiassa siitä, ettei saatavissa ole riittäviä määriä BMP:itä eikä niiden inhibiittoreita. BMP:iden puhdistus luonnollisista lähteistä ei tuota hoitotar-koituksiin riittäviä proteiinimääriä, eivätkä nisäkäsekspressiosysteemeissä tuo-15 tettujen rekombinanttien ihmisen BMP:iden (rhBMP:t) saannot ole tyydyttäviä.

Yksittäiset rhBMP:t eivät myöskään ole yhtä tehokkaita kuin natiivit ihmis-BMP-valmisteet: on osoitettu, että jälkimmäiset ovat kymmenen kertaa tehokkaampia indusoimaan ektooppista luun muodostusta kuin puhtaat ihmisen rekombinantti-BMP:t [Bessho, K., et ai., Br. J. Oral. Maxillofac. Surg. 37 (1999) 2 - 5]. Lopuksi 20 suuri ongelma BMP.iden rutiinikäytölle potilailla on sopivan BMP-antosysteemin puute. BMP:t on annettava kantajan kanssa, koska niiden anto esimerkiksi injektiona johtaa välittömään BMP:n hajoamiseen. Tämä on täydellisesti ristirii-:.v dassa BMP:n ilmentymisprofiileihin, jotka osoittavat, että murtuman parane- ;"1·· misen aikana esimerkiksi BMP-2:ta ilmentyy jopa 14 päivää murtuman tapah- 25 duttua [Kitazawa, R. et ai., Acta Histochem. Cytochem. 31 (1998)231 -236].

·:2: Selvästi tarvitaan kiireellisesti uusia lähestymistapoja BMP:iden hyväksikäytössä. Esillä oleva keksintö antaa käyttöön ratkaisun edellä kuvat-.··1. tujen epäkohtien ja haittapuolien voittamiseksi.

Esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön keinot m '.m 30 BMP:iden luun muodostumista indusoivan aktiivisuuden hyväksikäyttöön hoi- dettaessa potilaita ortopediassa, hammaslääketieteessä ja muilla lääketieteen 3 • · ***** aloilla.

Toinen keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön keinot BMP:iden luun *:2: muodostumista inhiboivan aktiivisuuden hyväksikäyttöön hoidettaessa potilaita # 35 ortopediassa ja muilla lääketieteen aloilla.

• 1 • · · n • · • · 2 • · · 4 117667

Erityisesti esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön farmaseuttinen koostumus, joka olisi käyttökelpoinen hoidettaessa tauteja, joissa halutaan edistää murtuman paranemista ja luun täydentämistä. Tällainen koostumus parantaisi esimerkiksi sellaisen potilaan paranemista, jolle on tehty ki-5 rurginen luuleikkaus tai joka kärsii tapaturmaisesta luunmurtumasta. Lisäksi tällaista koostumusta voitaisiin käyttää hammasimplanttien integroinnissa, hampaanpoiston jälkeisessä hammaskuoppien täytössä, hammaskuoppahar-janteen täydentäminen, nenän sivuontelon pohjan kohottamisessa ja luutumat-tomien murtumien paranemisessa.

10 Lisäksi toinen esillä olevan keksinnön erityistarkoitus on antaa käyttöön farmaseuttinen koostumus, joka olisi käyttökelpoinen hoidettaessa ja ennalta ehkäistäessä heterotooppista luutumista ja muita tauteja, joissa esiintyy ei-toivottua luunmuodostusta. Tällainen koostumus lisäisi merkittävästi niitä vaihtoehtoja, joita tällä hetkellä on käytettävissä HO:n hoitoon, ja siltä 15 puuttuisivat sivuvaikutukset, jotka liittyvät ei-steroidisiin anti-inflammatorisiin lääkeaineisiin (NSAID:t) ja radioterapiaan, jotka ovat tällä hetkellä vaihtoehtoisia hoitomenetelmiä.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Nyt on yllättäen havaittu, että kun yhdistetään yksittäisten rBMP:ien 20 tai rBMP-monomeerien tai jompien kumpien mutanttien pysyvät laskosvariantit, kuten WO-patenttihakemuksessa IB99/00466 kuvatut, tällaisella yhdistelmällä :V: on synergistinen vaikutus, jota ei olisi voitu odottaa rBMP:ien tai rBMP-mono- ·*·.. meerien erillisten ominaisuuksien perusteella.

··· Esillä oleva keksintö koskee farmaseuttisia koostumuksia, jotka • · · · 25 soveltuvat käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä. Koostumuk-sille on tunnusomaista, että ne sisältävät vähintään kahden rekombinanttisen * · luun morfogeneettisen proteiinin (rBMP) tai niiden monomeerien pysyvien las- · "* kosvarianttien synergistisen seoksen sopivassa farmaseuttisessa kantajasys- teemissä, jolloin pysyvät laskosvariantit eroavat disulfidisidosten muodostumi- • · · ’···’ 30 sen suhteen ja tämän seurauksena kolmiulotteisen konformaation suhteen ·*· vastaavista kypsistä rBMPiista tai rBMP-monomeereistä, tai ne on saatu uu- :***; delleenlaskostamalla tällainen laskosmuoto, ja jolloin mainittu rBMP valitaan • · · rBMP-2:n, rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien joukosta.

Edullisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö koskee farma- • · ♦ *«·* 35 seuttisia koostumuksia, jotka sisältävät rBMP-2:n ja rBMP-4:n tai niiden mono- 9·· meerien tai jommankumman mutanttien pysyvien laskosvarianttien seoksen, 117667 5 rBMP-2:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien tai jommankumman mutanttien pysyvien laskosvarianttien seoksen; rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien tai jommankumman mutanttien pysyvien laskosvarianttien seoksen sopivassa farmaseuttisessa kantajasysteemissä.

5 Toisessa edullisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö kos kee farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät rBMP-2:n, rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien tai kunkin mutanttien pysyvien laskosvarianttien seoksen sopivassa farmaseuttisessa kantajasysteemissä.

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi edellä olevien koostumusten käyt-10 töä valmistettaessa lääkeainetta, joka on tarkoitettu käytettäväksi luun muodostumista inhiboivana aineena ortopediassa ja hammaslääketieteessä.

Edullisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö koskee edellä olevien koostumusten käyttöä valmistettaessa lääkeainetta, joka on tarkoitettu käytettäväksi ortopedisten potilaiden hoidossa.

15 Toisessa edullisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö koskee edellä olevien koostumusten käyttöä valmistettaessa lääkeainetta, joka on tarkoitettu käytettäväksi hammaspotilaiden hoidossa.

Vielä eräässä edullisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö koskee edellä olevien koostumusten käyttöä valmistettaessa lääkeainetta, joka 20 on tarkoitettu käytettäväksi Cranio-maxillokasvokirurgiassa.

Piirustukset :V: Kuvio 1 esittää luutumisen inhibition demineralisoidussa luussa, joka sisältää inh-rBMP-monomeerejä: a) inh-rBMP-2; b) inh-rBMP-4; ja c) inh- ··· rBMP2 sekä inh-rBMP-4.

• * · · ....: 25 Kuvio 2 esittää inh-rBMP-2-monomeerien histologisen vaikutuksen 21 päivän kuluttua: a) lataamaton implantti; b) inh-rBMP-2:lla ladattu implantti; • · ..... c) inh-rBMP-2:lla ladattu implantti, 5-kertainen suurennos.

*" Kuvio 3 esittää kypsän rBMP-2:n laskosvarianttien erottamisen SDS-PAGE:lla: (1) E. colista eristetty inh-rBMP-2; (4) E. colista pelkistetyssä **ί·* 30 muodossa eristetty inh-rBMP-2; (2) ind-rBMP-2 in vitro -uudelleenlaskostamisen • · · jälkeen; (5) ind-rBMP in vitro -uudelleenlaskostamisen jälkeen; (3) molekyyli- :***; painomerkit.

* · ·

Kuvio 4 esittää alkalisen fosfataasin aktiivisuuden määritettynä ·. MC3T3-E1-soluissa inh-rBMP-2:n ja inh-rBMP-4:n 1:1-seoksen vaikutuksen 35 alaisena.

* * · • · • · * · · 1 1 7667 6

Kuvio 5 valaisee inh-rBMP-2:n ja inh-rBMP-4:n seoksen inhibitio-paikkaa MC3T3-E1 -soluissa ja kolme inh-rBMP-4:n katkaistua mutanttia. Vasemmassa paneelissa esitetään kaaviomainen kuva proteiinien rakenteesta. Oikeassa paneelissa esitetään proteiinilla käsiteltyjen MC3T3-E1-solujen vas-5 taava alkalisen fosfataasin aktiivisuus. Proteiinien N- ja C-päät on osoitettu.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Esillä oleva keksintö perustuu ajatukseen valmistaa ja käyttää rBMP:n tai rBMP-monomeerien pysyvien laskosvarianttien seosta niiden biologisen aktiivisuuden parantamiseksi erityisesti heterotooppisen luutumisen in-10 hibitiossa ja luun muodostumisen indusoinnissa. Yllättäen havaittiin, että tällaisilla koostumuksilla on synergistisiä vaikutuksia, joita voidaan käyttää hyväksi sekä inhiboivalla tavalla, toisin sanoen estämään HO:n kehittymistä, tai indusoivalla tavalla, toisin sanoen indusoimaan uuden luun muodostumista. Tällä saadaan etuja siinä suhteessa, että tarvitaan pienempiä määriä materiaalia 15 halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi, mikä on erittäin tärkeää, kun otetaan huomioon rBMP:ien työläs valmistus. Lisäksi sivuvaikutusten riski vähenee merkittävästi, kun pienempiä määriä voidaan käyttää.

Esillä oleviin tarkoituksiin termi pysyvä laskosvariantti viittaa mihin tahansa rBMP.ien tai rBMP-monomeerien tai jompien kumpien mutanttien py-20 syvään konformaatioon, jolloin molekyylin laskostumistila eroaa kolmiulottei-seita konformaatioltaan vastaavan kypsän rBMP:n tai rBMP-monomeerin koi- « « · * miulotteisesta konformaatiosta tai jolloin rBMP:ien tai rBMP-monomeerien vas- • * * : 7 taava kypsä laskostuminen saadaan tällaisen laskostumistilan uudelleen las- *♦* kostumisen kautta.

* ' 25 Esillä oleviin tarkoituksiin termi rBMP viittaa BMP-perheen jäse- "*** neen dimeerisenä rekombinanttituotteena ja termi rBMP-monomeeri viittaa kyp- • * · ·.„· sään geeniekspressiotuotteeseen, joka joko kykenee dimerisoitumaan, jolloin muodostuu rBMP-dimeeri, tai joka ei kykene dimerisoitumaan laskostumisen : :*; vuoksi. Niinpä termi rBMP kattaa BMP-alaperheen jäsenet, kuten BMP-2:n ja ··· .*“· 30 BMP-4:n, OP-alaperheen jäsenet, kuten OP-1:n (eli BMP-7:n) OP-2:n (eli BMP- 8:n), BMP-5:n, BMP-6:n (eli Vgr-1:n), CDMP-alaperheen jäsenet, kuten CDMP-1:n (eli BMP-14:n eli GDF-5:n), GDF-alaperheen jäsenet, kuten GDF-1:n, GDF-3:n, GDF-8:n, GDF-9:n, GDF-11:n (eli BMP-11:n), GDF-12:n ja GDF-14:n, ja : muiden BMP-alaperheiden jäsenet, kuten BMP-3:n (eli osteogeniinin), BMP-9:n

• I

.·*; 35 (eli GDF-2:n) ja BMP10:n, kun ne tuotetaan yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

* ·· 7 117667 rBMP:itä tai rBMP-monomeerejä, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevan keksinnön mukaisessa koostumuksessa, ovat erityisesti laskosvariantit rBMP-2:sta, rBMP-4:stä ja rBMP-7:stä tai niiden monomeereistä, joiden tällä hetkellä tiedetään olevan tärkeällä tavalla osallisia uuden luun muodostumi-5 sessa. Keksinnön suojapiirin katsotaan kuitenkin kattavan myös koostumukset, jotka sisältävät sellaisten rBMP:ien tai niiden monomeerien laskosvariant-teja, joiden roolia luun muodostuksessa ei ole vielä selvitetty.

Esillä oleviin tarkoituksiin termi induktiivinen viittaa koostumuksen tai yksittäisten rBMP:ien pysyvien laskosvarianttien kykyyn indusoida uuden 10 luun muodostumista.

Esillä oleviin tarkoituksiin termi inhiboiva viittaa koostumuksen tai yksittäisten rBMP:ien pysyvien laskosvarianttien kykyyn estää uuden luun muodostumista.

rBMP:n tai rBMP-monomeerien tai jompien kumpien mutanttien 15 pysyvät laskosvariantit, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnössä, voidaan valmistaan normaalilla yhdistelmä-DNA-teknologialla käyttäen sekä prokaryoottisia että eukaryoottisia ilmentämissysteemejä tavanomaisella tavalla. Tässä suhteessa viitataan esimerkiksi hakemukseen Cerletti et ai. (EP-hakemus 0 433 225 A1) ja artikkeliin Israel D.l. et ai., Growth Factors 7 (1992) 20 139 - 150. Tuotanto prokaryoottisessa ilmentämissysteemissä, kuten Escrier/- cia coli -kannoissa tai muissa sopivissa bakteerikannoissa, tarjoaa etuja saan-, , non kannalta. Prokaryoottiset ilmentämissysteemit ovat erityisen sopivia i * · j**’ rBMP-monomeerien tuottamiseen. Toisaalta eukaryoottiset ilmentämissys- : '·* teemit, kuten nisäkäs- tai hyönteissolut, erityisesti nisäkässolut ja erityisesti 25 sellaiset, joissa käytetään proteiinitonta väliainetta, ovat edullisia tuoteturvalli-"*" suuden kannalta. Esimerkkejä sopivista nisäkässoluista ovat kiinanhamsterin :**: munasarjasolut (CHO). Nisäkäsilmentämissysteemit ovat erityisen sopivia rBMP-dimeerien tuottamiseen. Sopivan tuotantosysteemin valinta sisältyy hy- • · · vin alan ammattimiehen tietoihin.

. 30 rBMP:n tai rBMP-monomeerien pysyviä laskosvariantteja, jotka .···, ovat käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnössä, voidaan tarvittaessa lisäksi • i "* käsitellä edelleen altistamalla vastaavat rBMP:t tai rBMP-monomeerit sellaisille • · · olosuhteille, jotka muuttavat, mahdollisesti palautuvasti, mainittujen rBMP:n tai rBMP-monomeerien dimerisoitumiskykyä. Tällaisia olosuhteita ovat käsittely . .·. 35 kaotrooppisella aineella sopivassa puskurissa ajanjakso, joka riittää muutta- .·*·. maan monomeerien stereokemian siten, ettei dimerisoitumista tapahdu. Sopi- • · ♦ ·· 117667 8 vina kaotrooppisina aineina voidaan mainita urea, guanidiinihydrokloridi, imi-dotsoli ja tiosulfaatti pitoisuutena vähintään 3 M, edullisesti 3-8 M ja edullisimmin 5 - 8 M. Edullisesti käytetään ureaa pitoisuutena 5 - 8 M ja edullisimmin pitoisuutena 6 M. Toinen edullinen kaotrooppi on guanidiinihydrokloridi 5 pitoisuutena 3 - 6 M, edullisesti pitoisuutena 6 M.

Kaotrooppisen aineen sijasta voidaan käyttää pelkistävää ainetta. Sopivia pelkistäviä aineita ovat ditiotreitoli pitoisuutena 0,05 -1 mM, edullisesti 0,1 mM, ja merkaptoetanoli pitoisuutena 0,1 -10 mM, edullisesti 1 mM.

Myös käsittelyä sopivalla hapettimella voidaan käyttää. Tässä suh-10 teessä viitataan esimerkiksi EP-hakemukseen 0 433 225 A1 ja US-patenttiin 5 756 308. Muita olosuhteita, kuten lämpötilaa, pH:ta, ionivahvuutta ja vastaavia voidaan käyttää rBMP:ien pysyvien laskosvarianttien muodostamiseen tai edellä olevien aineiden toiminnan auttamiseen.

Vaihtoehtoisesti keksinnössä käyttökelpoisia pysyviä laskosvari-15 antteja ovat vastaavien rBMP:ien tai rBMP-monomeerien mutanttimuodot, joita voidaan saada esimerkiksi poistamalla aminohappo tai aminohappoja rBMP:n tai rBMP-monomeerin polypeptidisekvenssistä tai lisäämällä ylimääräinen aminohappo tai aminohappoja rBMP:n tai rBMP-monomeerin polypeptidisekvens-siin. Nämä menettelyt ovat alan ammattimiesten hyvin tuntemia ja käsittävät 20 käsittelyn sopivalla proteaasilla tai yhdistelmä-DNA-tekniikan käytön.

Onnistuneeseen käsittelyyn riittävä aika riippuu käytetystä aineesta mutta on tavallisesti vähintään 10-100 tuntia, edullisesti 10-50 tuntia ja v.: edullisimmin 24 tuntia. Samoin käytetty lämpötila vaihtelee kyseisen aineen ·· • *·· mukaan, mutta on tavallisesti alueella 3 - 24 °C olevia lämpötiloja, edullisesti *!* 25 4 °C:tta voidaan käyttää.

·:··*: Valmistuksessa käyttökelpoisia puskureita ovat fosfaattipuskurit, ·:*·· jotka mahdollisesti sisältävät fysiologista suolaliuosta, Tris-puskurit ja vastaa-

.···. vat puskurit, joiden pH on 6 - 8, edullisesti 8, ja pitoisuus 5 -100 mM. 20 mM

Tris-puskuri, pH 8, on erityisen sopiva.

i t»m" 30 rBMP:ien tai BMP-monomeerien pysyvät laskosvariantit, jotka ovat ;;; käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnössä, puhdistetaan tavanomaisella ta- • · *·;** valla, kuten kromatografisilla menetelmillä, edullisesti geelisuodatuksella ja/tai affiniteettikromatografialla, dialyysillä, membraanisuodatuksella ja vastaavilla ta-·:·: voilla. Nämä menetelmät ovat alan ammattimiesten hyvin tuntemia.

^ 35 Näin valmistetut rBMP:ien pysyvät laskosvariantit ovat aluksi mo- *;!;* nomeerien muodossa ja keksinnön inhiboivaan aspektiin keksinnön mukainen • · • ·** 9 . 117667 koostumus sisältää rBMP:ien vastaavat laskosvariantit monomeereinä. Mutta rBMP-dimeeri, jonka toinen monomeeri tai molemmat monomeerit on sopivasti käsitelty normaalin laskostumisen estämiseksi, on yhtä sopiva keksinnön inhiboiviin tarkoituksiin. Indusoiviin tarkoituksiin rBMP-monomeerien annetaan di-5 merisoitua spontaanisti tai tätä dimerisoitumista voidaan helpottaa esimerkiksi puskurin valinnalla.

Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoisilla, kunkin vastaavan rBMP:n ja rBMP-monomeerien inhiboivilla (inh) ja indusoivilla (ind) laskosvarian-teilla on identtiset aminohapposekvenssit, mutta ne eroavat disulfidisidoksen 10 muodostumisen suhteen ja tämän seurauksena kolmiulotteisen rakenteen suhteen. Esimerkiksi laskosvarianteilla inh-rBMP-2 ja ind-rBMP-2 on riittävän erilainen liikkuvuus, että ne voidaan erottaa SDS-PAGE:lla (kuvio 3).

Koska rBMP:t tai rBMP-monomeerit hajoavat välittömästi joutuessaan kosketukseen kehon nesteiden kanssa ja koska niillä on voimakas morfo-15 geneettinen vaikutus, paikalliset antoreitit ovat edullisia. Tämä tekee kantaja-systeemin valinnan kriittiseksi. Siten keksinnön mukaiselle koostumukselle sopivia kantajia ovat kiinteät tai puolikiinteät biologisesti hajoavat kantajat, jotka voidaan implantoida potilaaseen. Tällaisia systeemejä ovat systeemit, jotka perustuvat kollageeniin, fibriiniin, hydrogeeleihin, hydroksiapatiittiin (HA), kuten HA-20 fibriinikomposiitti, HA-kollageenikomposiitti, HA-kalsiumsulfaatti, tai biologisesti hajoaviin polymeereihin, kuten polyanhydrideihin, poly(maitohappoihin) (PLA), poly(laktidi-ko-glykolidi)-poly(etyleeniglykoli) (PLG-PEG) -kopolymeereihin, PLG- :·. PGA-kopolymeereihin ja vastaaviin. Biologisesti hajoavat polymeerit ovat edulli- • ·· siä.

• · · **”. 25 Edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukainen koostumus • M*» [ sisältää kantajan, joka on hitaasti vapauttava systeemi, joka perustuu bioha- joaviin polymeereihin, kuten hydrogeeleihin, tai erityisesti polyestereihin, esi-merkiksi polyglykolidiin (PGA), polylaktidiin (PLA) ja vastaaviin polymeereihin, tai niiden kopolymeereihin, kuten polylaktidin kopolymeereihin glykolidien, s-kapro-30 laktiinin, δ-valerolaktonin tai 1,5-dioksepan-2-onin kanssa. Edullisesti kantajana käytetään polylaktidin kopolymeeriä glykolidien kanssa, kuten poly-DL-laktidi-ko- S"t glykolidia (PLGA).

• * ’**. Keksinnön mukaiset koostumukset voivat sisältää esimerkiksi 0,1- 2 mg rBMP:iden tai rBMP-monomeerien pysyviä laskosvariantteja. 35 Laskosvarianttin määrä kuitenkin vaihtelee eri sovelluksissa. Siten pienemmät ··· • ♦ • · ··· 10 1 1 7667 määrät voivat riittää joissakin sovelluksissa, kun taas jonkin verran suurempia määriä voidaan tarvita halutun vaikutuksen saamiseksi muissa sovelluksissa.

Keksinnön mukaisten koostumusten annos riippuu yksittäisistä potilaista ja hoidettavasta häiriötilasta. Esimerkinomainen yksittäinen annos keksin-5 nön mukaista koostumusta on alueella 0,1-2 mg. Kuitenkin pienempi annos voi riittää joissakin häiriötiloissa, kun taas suurempia määriä voidaan tarvita halutun vaikutuksen saamiseksi muissa hoidoissa.

Keksinnön mukaiset koostumukset sisältävät vähintään kahden rBMP:n tai BMP-monomeerin tai jomman kumman mutanttien pysyviä laskosva-10 hantteja painosuhteessa 1-10:1-10, edullisesti painosuhteessa 1-5:1-5. Eduliisimmassa sovellutusmuodossa pysyvien laskosvarianttien painosuhde on 1:1. Kun käytetään useampia kuin kahta rBMP:tä tai BMP-monomeeriä tai jomman kumman mutanttia, pysyvien laskosvarianttien painosuhde on alueella 1 -10:1 -10:1 -10, edullisesti alueella 1 - 5:1 - 5:1 - 5, jolloin painosuhde 1:1:1 15 on edullisin.

Esillä oleva keksintö antaa ensimmäisen kerran käyttöön keinot käyttää hyväksi luun morfogeneettisiä proteiineja hoidettaessa potilaita, jotka kärsivät taudeista tai häiriötiloista, joihin liittyy ei-toivottu luun muodostuminen, kuten heterotooppisesta luutumisesta. Lisäksi esillä oleva keksintö antaa käyttöön 20 keinot uuden luun muodostumisen lisäämiseen luunmurtumien ja muiden vammojen hoidossa. Esillä olevan keksinnön mukaiset koostumukset mahdollistavat . . sen, että rBMP:itä ja BMP-monomeerejä voidaan käyttää merkittävästi pienem- * 1 1 ];1·’ pinä määrinä kuin vastaavia yksittäisiä polypeptidejä halutun vaikutuksen saa- ϊ '1 vuttamiseksi. Siten kun inh-rBMP-2-ja inh-rBMP-4-monomeerejä annettiin 1:1- 25 seoksena, niinkin matala annos kuin 25 pg riitti vähentämään kalsiumpitoi-suuden 39 %:iin kontrolliarvosta, kun taas yksittäisillä rBMP:illä, annettuna yksin, *"1: 50 %:n tai yli vähenemisprosentti saatiin annoksella 50 pg (kuvio 1).

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä, jotka annetaan vain ··1 valaisutarkoituksiin.

, 30 Tilastollisiin analyyseihin sovellettiin Studentin T-testiä kaupallisesti .1··. saatavissa olevaa ohjelmistoa käyttäen (SSPE, Chicago, II). Kaikki arvot edusta- • · *" vat keskiarvoja ± keskiarvon standardivirhe.

··· J • « • · ··· ····· • · • · · • · · • · · • · · · · 11 1 1 7667

Esimerkki 1

Bakteeriperäisten inhiboivien rekombinanttien luun morfogeneettisen proteiinien (inh-rBMP:t) ilmentäminen, puhdistus ja uudelleenlaskostus

Ensimmäisessä vaiheessa ihmisen istukkakirjastoa (Clontech, Palo 5 Alto, CA) käytettiin templaattina ihmisen BMP-2:n ja ihmisen BMP-4:n täysi-pitkien cDNA:iden eristämiseksi polymeraasiketjureaktiota (PCR) käyttäen. Kunkin PCR:stä saadun kloonin 500 emäsparia pitkää 5-päätä käytettiin tämän jälkeen lambda gt10 -kirjaston seulomiseksi pesäkehybridisaatiolla, jotta voitiin eristää monistumaton cDNA-klooni. Lopullisten täysipitkien kloonien molemmat 10 juosteet sekvensoitiin dideoksinukleotidi-ketjunlopetusmenetelmällä käyttäen Sequenase 2.0 -kittiä (USB, Cleveland, OH). Nukleotidit luettiin digitalisoidulla geelinlukijalla ja analysoitiin ohjelmistopaketilla GCG (University of Wisconsin Genetics Computer Group).

Inhiboivien luun morfogeneettisen proteiinien inh-rBMP-2 ja inh-15 rBMP-4 ilmentämiseksi kypsät rBMP-ekspressiokonstruktit muodostettiin PCR:llä käyttäen vastaavia täysipitkiä klooneja templaatteina. Aloitus-ATG laitettiin kypsän rBMP-2-sekvenssin (sekvenssi tunnusnumero 1) eteen ja BMP-4-sekvenssi (sekvenssi tunnusnumero 2) mutagenisoitiin konstruktiin viemällä Nde-restriktiokohta. Tämä salli kloonauksen pET23b+-ekspressiovektoriin 20 [Studier et ai. Methods Enzymol 185 (1990) 60 - 89 (1990)], jota käytettiin Escherichia coli -kannan BL21 (DE3) transfektointiin. Soluja kasvatettiin optimaaliseen tiheyteen 0,6 (aallonpituudella 600 nm), indusoitiin lisäämällä !·:·: isopropyyli-13-D-tiogalaktopyranosidia loppupitoisuuteen 0,4 mM ja ne otettiin «· : *·· talteen 3 h induktion jälkeen sentrifugoimalla kierrosnopeudella 5 000 x g.

„!·* 25 Pellettiä säilytettiin yön yli -80 °C. Sulattamisen jälkeen solut suspendoitiin

:**: uudelleen puskuriin, jossa oli 20 mM Tris-HCI:a, pH 7,9, 0,5 M NaCI:a ja 5 mM

·:*·: imidatsolia, ja hajotettiin viemällä ne kolmesti French-painekammion läpi pai- .***. neessa 20 000 psi. Sentrifugoinnin jälkeen rBMP-monomeerit olivat pelletissä.

• · · lnh-rBMP:n tuottamiseksi pelletti liuotettiin samaan puskuriin kuin aikaisemmin . .·. 30 ja lisättiin 6 M ureaa ja inkuboitiin kääntyvässä pyörässä seitsemän päivää 4 °C:ssa. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella • · "* 15 000 x g 30 min ja supernatantti dialysoitiin perusteellisesti puskuria vastaan, • Il joka sisälsi 10 mM Tris-HCI:a, pH 8, 6 M ureaa, (TU), vietiin affiniteettikolonniin (hepariini, 5 ml, HiTrap®, Pharmacia Biotech) ja eluoitiin 2 M NaCUla TU:ssa.

. /, 35 Inh-rBMP-monomeerit ja -dimeerit erotettiin geelisuodatuksella (HiLoad® ,···, Superdex® 200, Pharmacia Biotech, 1,6 cm x 60 cm; 124 ml). Inh-rBMP-mono- • · *

IM

12 1 1 7667 meerien ja -dimeerien puhtaus analysoitiin Coomassie-värillä värjätystä SDS-PAGE.sta ja oli yli 99 % (kuvio 3).

Kuten kuviosta 3 voidaan nähdä, materiaali koostuu dimeeristä fraktiosta sekä monomeereistä, jotka identifioitiin inh-rBMP-2:ksi ja inh-rBMP-5 4:ksi. SDS-PAGE-geelien tarkka tutkiminen paljastaa, että leveä nauha, joka vastaa dimeeristä fraktiota, koostuu vähintään kolmesta erotettavissa olevasta proteiinista, mikä osoittaa saman proteiinin kolmen konformeerin läsnä oloa.

Esimerkki 2 rhBMP-4:n tuottaminen kiinanhamsterin munasarjasoluissa käyttäen pro-10 teiinia sisältämätöntä väliainetta rhBMP-4:n täysipitkä cDNA (sekvenssi tunnusnumero 3) kloonattin pMPSV-HE-vektoriin (lahja prof. Hauserilta, Braunschweig, Saksa), joka kantaa myeloproliferatiivisen sarkoomaviruksen 1 promoottoria, ja kotransfektoitiin suhteessa 50:1 pMSVtrp 33:n kanssa kiinanhamsterin munasarjasoluihin (Cytos 15 Biotechnology GmbH ja Dr Messi, Cell Culture Technologies, Zurich, Sveitsi). Plasmidi pMSVtrp sisältää E. colir tryptofaanisyntaasin (trpB) geenin ja sallii solujen pysyä hengissä väliaineessa, jossa tryptofaani on koivattu indolilla. Transfektiot suoritettiin 6-kuoppaisissa levyissä FUGENE®:n (Roche Basel) avulla valmistajan suosituksia noudattaen. Päivä transfektion jälkeen lisättiin 20 yhtä suuri määrä väliainetta, joka sisälsi indolia tryptofaanin sijasta. Kolme päivää transfektion jälkeen yhden kuopan solut laimennettiin suhteessa 1:30 väli- i.v aineeseen, jossa oli indolia, ja ympättiin 48 kuoppaan 12-kuoppaisilla levyillä.

Yksittäiset kloonit, jotka voitiin tunnistaa kahden viikon kuluttua, testattiin rhBMP-··· 4-tuotannon suhteen immunoblot-analyysillä käyttäen polyklonaalista anti-BMP- t··· 25 4 vasta-ainetta, joka oli nostatettu kaneissa.

Suuren mittakaavan tuotantoon soluja kasvatettiin yhden litran .···, sekoituspulloissa FMX-8-väliaineessa (tri Messi, Cell Culture Technologies, Zärich, Sveitsi) 37 °C:ssa, 5-prosenttisessa C02:ssa, kierrosnopeudella 40 rpm . ja 720 asteen rotaatiolla. Viiden päivän kuluttua solut poistettiin sentrifugoimalla, • · · 30 supematantti vietiin HiTrap®-hepariinikolonniin ja rhBMP-4 eluoitiin 2 M NaCUla *···* TU:ssa. Muita puhdistusvaiheita olivat geelisuodatus (HiLoad® Superdex® 75 -kolonni, Pharmacia Biotech, 1,6 cm x 60 cm; 124 ml), ioninvaihtokromatografia ·:··· (Mono Q, 1 ml, FPLC, Pharmacia) ja sama käänteisfaasikolonni, jota käytettiin ·, bakteeriperäisten rBMP-monomeerien puhdistukseen.

• · t • » · ··« « · · • · • · •t« ...

13 1 1 7667

Edellä olevaa menetelmää voidaan soveltaa muiden rBMP:ien monomeerien tuottamiseen eukaryoottisessa systeemissä. Tarvittavat muutokset kuuluvat hyvin alan ammattimiesten tietoihin.

Esimerkki 3 5 Demineralisoidun luun indusoiman heterotooppisen luutumisen esto

Inh-rBMP-monomeerien 2 ja 4 (katso esimerkki 1) synergistisen vaikutuksen luutumiseen määrittämiseksi demineralisoitua luujauhetta valmistettiin rotan pitkistä luista oleellisesti julkaisussa Muthukumaran, N. et ai., Collagen Rel. Res. 8 (1988) 433 - 441, kuvatulla tavalla. Inaktivoidun luun kollageenin 10 valmistamiseksi demineralisoitu luumateriaali uutettiin 4 M guanidiinihydro-kloridilla [Sampath, T. K. ja Reddi, A. H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 7599 - 7603]. Lataamista varten 25 mg demineralisoitua materiaalia punnittiin mikrosentrifugiputkeen ja 120 μΙ esimerkin 1 inh-rBMP:itä 0,05 mM HCI:ssa, joka sisälsi 0,5 mg kondroitiinisulfaattia, lisättiin. Kontrolli valmistettiin vastaa-15 vasti ilman proteiinia. Yhden tunnin huoneen lämpötilassa inkuboinnin jälkeen 0,3 ml rotan hännän kollageeniä (2 mg/ml 0,1-prosenttisessa etikkahapossa) lisättiin kantajamateriaaliin, sekoitettiin vortex-sekoittimella, minkä jälkeen inkuboitiin vielä 30 min. Ladattu materiaali sekoitettiin sitten 1,1 ml:aan EtOH:a (säilytetty -80 °C:ssa) ja siirrettiin -80 °C:n pakastimeen yhdeksi tunniksi. 20 Suspensiota sentrifugoitiin 30 min 4 °C:ssa, supernatantti poistettiin ja pelletti pestiin kolmesti 85-prosenttisella EtOH:lla (-20 °C). Lopullinen pelletti muodos- • i tettiin 1 ml:n ruiskussa ja kuivattiin steriilin kuvun alla yön yli.

Kuivatut pelletit implantoitiin ihon alle 200 - 300 g painavien, nuku- ··· tettujen Sprague-Dawley-rottien rintakehän alueelle ja yksi pelletti implantoitiin ·*·· 25 rintakehän kummallekin puolelle.

Demineralisoidut luupreparaatit, jotka sisälsivät inh-rBMP:itä, sijoi- .··*, tettiin rottien ihon alle rintakehän molempien puolien päälle. Jokaisessa eläi- • · messä yksi implantti oli käsitelty 5 pg:lla, 25 pg:lla tai 50 μ9:Ιΐ3 rBMP-mono-. meerejä ja vastakkainen implantti oli käsittelemätön. 21 päivän kuluttua t · · 30 implantaatit poistettiin ja luutumisen aste määritettiin mittaamalla niiden kalsium-*·;·* sisältö. Implantaatin osa punnittiin ja homogenoitiin omni-mixer-laitteella (Water- :*"i bury, CT, USA) 1,5 ml:ssa seosta, jossa oli 3 mM NaHC03:a ja 150 mM NaCI:a.

····· Sentrifugoinnin (1 000 x g, 15 min) jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen kol- *, mesti 1 ml:aan 10 mM Tris-HCI:a, pH 7, ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa *“;* 35 1 h. Viimeisen pesun jälkeen pellettejä uutettiin yön yli 1 ml:lla 0,5 M HCI:a.

• i *···* Uutteen kalsiumsisältö mitattiin atomiabsorptiospektroskopialla.

14 1 1 7667

Tulokset esitetään kuvioissa 1a ja 1b. Kuten niistä voidaan nähdä, sekä inh-rBMP-2- että inh-rBMP-4-monomeerit, jotka ovat 87-prosenttisesti identtisiä aminohappotasolla, kykenevät vähentämään implanttien kalsium-sisältöä annoksesta riippuvalla tavalla. Kuitenkin kun inhBMP-2 ja inhBMP-4-5 monomeerit lisätään 1:1-seoksena, jopa niinkin matala annos kuin 25 pg riittää vähentämään kalsiumsisällön 39 prosenttiin kontrolliarvosta (kuvio 1c).

Lisäksi useimmat implantaatit tutkittiin histologisesti inh-rBMP-mo-nomeerien vaikutuksen solutasolla tutkimiseksi. Implantaatit kiinnitettiin ja upotettiin sitten poly(metyylimetakrylaattiin). Valmistettiin 4,5 pm paksut histologiset 10 leikkeet ja värjättiin Goldner-Trichrome- ja toluidiinisininen-väreillä. Värjätyt leikkeet tutkittiin luun muodostumisen, solutyypin, morfologian ja stromaalisten yksityiskohtien suhteen käyttäen kirkaskenttävalomikroskopiaa.

Mitään merkkejä tulehduksellisesta immuunireaktiosta tai muusta poikkeavuudesta ei voida havaita. Ainoa selvä vaste yksittäiselle inh-rBMP-mo-15 nomeeriannokselle on implantaatin luutumisen viivästyminen (kuvio 2).

Esimerkki 4 inh-rBMP:ien inhiboiva vaikutus solutasolla

Hiiren osteoblastisolulinjaa MC3T3-E1 käytettiin inh-rBMP-2:n ja inh-rBMP-4:n inhiboivien vaikutusten tutkimiseksi solutasolla. Nämä solut tuotta- 20 vat endogeenistä BMP-2:ta ja BMP-4:ä ja erilaistuvat autokriinisesti kypsiksi osteoblasteiksi näiden vaikutuksen alaisuudessa [Natsume, T., et ai., J. Biol.

v.: Chem. 272 (1997) 11535 - 11540]. Tätä prosessia voidaan monitoroida alkali- • · • *·* sen fosfataasin (AP) aktiivisuuden lisääntymisen avulla.

MC3T3-E1-soluja kasvatettiin alpha-modifioidussa Minimum Essen-·:**: 25 tial Medium-väliaineessa (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY. USA), joka ·:··; sisälsi 10% vasikansikiöseerumia (Life Technologies, Inc.), 50 pg/ml genta- .***. mysiiniä ja 50 pg/ml askorbiiinihappoa. rBMP:n laskosvarianttien biologisen ··· e aktiivisuuden tutkimiseksi 1x10 solua per kuoppa levitettiin 6-kuoppaisiille , levyille, minkä jälkeen proteiini lisättiin. Väliaine vaihdettiin kolmen päivän kulut- · · 30 tua ja alkalinen fosfataasi määritettiin päivänä 6. Solut pestiin kolmesti fosfaatilla *"*' puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella ja yhden kuopan solut yhdistettiin * · · :...J 0,5 ml.ssa hajotuspuskuria (0,56 M 2-amino-2-methylpropan-1-oli, pH 10) ja *:*·: homogenoitiin omni-mixer-laitteella. 200 pl solulysaattia sekoitettiin 200 pl:aan

,hajotuspuskuria, jota oli täydennetty 20 mM p-nitrofenyylifosfaatilla ja 4mM

35 MgCI2:lla 4 °C:ssa.

• · · ...

is 1 1 7667

Alkalisen fosfataasin aktiivisuus määritettiin Lowry, Ö. et ai:n. [J. Biol. Chem. 207 (1954) 19 - 37] mukaan. Lisäämällä 400 μ11 M NaOH:ä vapautunut p-nitrofenoli muutettiin p-nitrofenylaatiksi, joka kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 410 nm (epsilon = 17 500/mol x cm). Alkalisen 5 fosfataasin aktiivisuus normalisoitiin kokonaisproteiiniin ja ilmoitettiin nmokina muodostunutta nitrofenylaattia kohti per min per mg proteiini.

MC3T3-E1 -solujen käsittely monomeerisellä inh-rBMP-2:lla tai inh-rBMP-4:lla yksin ei saa aikaan merkittävää AP-aktiivisuuden vähenemistä. Kuitenkin käytettynä 1:1-seoksena inh-rBMP-2- ja inh-rBMP-4-monomeerit vähen-10 tävät AP-aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4).

Esimerkki 5

Rakenteelliset elementit ja inhibitiokohta inh-rBMP:issä

Sen tutkimiseksi, mitkä rakenteelliset elementit inh-rBMP-4:ssa osallistuvat inhibitioon, käytettiin MC3T3-E1 -soluja. Käytettiin kypsien 15 inh-rBMP-4:n ja inh-rBMP-2:n 1:1-seosta ja kolmea inh-rBMP-4:n deleetiomu-tanttia. Kypsät BMP-ekspressiokonstruktit muodostettiin PCR:llä käyttäen vastaavia cDNA:ita templaattina. Aloituskodoni osana Nde-restriktiokohtaa vietiin PCR-reaktiolla [Weber, F. et ai., Cell Mol Life Sei 54 (1998) 751 - 759] kypsän BMP-sekvenssin eteen [Wozney, J. M. et ai., Prog Growth Factor Res 1 20 (1989) 267 - 280], mikä lisäsi N-terminaalisen yhden metioniinin jatkeen kyp sään sekvenssiin. Deleetiomutantit muodostettiin vastaavasti insertoimalla py- • · v.: säytyskodoni mutantteihin 1 ja 2 tai insertoimalla aloituskodoni määrättyihin j'\. asemiin käyttäen alan ammattimiesten tuntemia menetelmiä.

t *:· MC3T3-E1-soluja käsiteltiin 1 μ9:Ιΐ3 proteiinia/ml kypsien 25 inh-rBMP-4:n ja inh-rBMP-2:n 1:1-seosta tai 1 μρ:Ιΐ8 proteiinia/ml inh-rBMP-4-mutantteja ja niiden alkalisen fosfataasin aktiivisuus analysoitiin.

.···, Kypsän BMP-4:n aminohapposekvenssi, joka on identtinen i « inh-rBMP-4:n kanssa, sisältää 115 aminohappoa. Mutantti 1 kattaa aminohapot . 46-115; mutantti 2 aminohapot 1 - 55 ja mutantti 3 aminohapot 1 -88. Di- » » * *;;;* 30 merisaatiosta vastaava kysteiini sijaitsee asemassa 79 ja on siten läsnä mu- • · *·;·' tanteissa 1 ja 3. Kysteiinisolmun muodostamiseen osallistuvat kysteiinitähteet ovat asemissa 14, 43, 47, 79, 111 ja 113 ja niinpä yksikään mutanteista ei ·;··· pystynyt muodostamaan kokonaista kysteiinisolmurakennetta.

*. lnh-rBMP-4:n mutantti 1 kattaa koko sen alueen, joka osallistuu t · · 35 sormen 2 muodostamiseen mutta ei sormen 1 aluetta. Mutantit 2 ja 3 sisältävät # · -*··* vain sormen 1 alueen mutta eivät sormen 2 aluetta. Kuten kuviossa 5 esitetään, 16 117667 mutantti 1, mutteivät mutantit 2 tai 3, kykeni vähentämään AP-aktiivisuutta MC3T3-E1 -soluissa, kun taas kysteiinin 79, joka osallistuu dimeerin muodostamiseen, läsnä tai poissa olo ei korreloinut soluvasteen kanssa. Siten aminohapposekvenssi, joka on vastuussa luutumisen inhibitiosta, sijaitsee kypsän 5 BMP:n C-terminaalisessa puoliskossa, alueella, jossa antiparalleeli B-levy, joka ottaa vääristyneen ristikkäisen konformaation, muodostaa sormen 2.

• · • · · « 1 2 3 · • · • · • ·· ··· • · #·· • · • · *·· f''· • · · ··· ··· • ♦ • « »·« ··· * · ♦ · ··· • · • ' ··· • · · * » · · · * · 2 » i 3 117667 SEQUENCE LISTING <110> Inion Ltd.

5 <120> Pharmaceutical composition

<130> BMP

<140> : 10 <141> <160> 3 <170> Patentin Ver. 2.1 15 <210> 1 <211> 381

<212/· DNA

<213> Homo sapiens 20 <400> 1 atgcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60 tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120 gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180 25 catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240 gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300 ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgctagta cagcaaaatt 360 aaatacataa atatatatat a 381 30 <210> 2 <211> 484

<212> DNA

<213> Homo sapiens 35 <400> 2 ,·,· atgagcccta agcatcactc acagcgggcc aggaagaaga ataagaactg ccggcgccac 60 *,*,· tcgctctatg tggacttcag cgatgtgggc tggaatgact ggattgtggc cccaccaggc 120 ;·, taccaggcct tctactgcca tggggactgc ccctttccac tggctgacca cctcaactca 180 I ** 40 accaaccatg ccattgtgca gaccctggtc aattctgtca attccagtat ccccaaagcc 240 tgttgtgtgc ccactgaact gagtgccatc tccatgctgt acctggatga gtatgataag 300 ···! gtggtactga aaaattatca ggagatggta gtagagggat gtgggtgccg ctgagatcag 360 ·.··! gcagtccttg aggatagaca gatatacaca ccacacacac acaccacata caccacacac 420 acacgttccc atccactcac ccacacacta cacagactgc ttccttatag ctggactttt 480 ·;··· 45 attt 484 *'*' <210> 3 <211> 1751 ; : . 50 <212> DNA ! : I4»ti <213> Homo sapiens • · · <400> 3 * ggcagaggag gagggaggga gggaaggagc gcggagcccg gcccggaagc taggtgagtg 60 ;1· 55 tggcatccga gctgagggac gcgagcctga gacgccgctg ctgctccggc tgagtatcta 120 *·* gcttgtctcc ccgatgggat tcccgtccaa gctatctcga gcctgcagcg ccacagtccc 180 •I*·; cggccctcgc ccaggttcac tgcaaccgtt cagaggtccc caggagctgc tgctggcgag 240 . cccgctactg cagggaccta tggagccatt ccgtagtgcc atcccgagca acgcactgct 300 , ,·, gcagcttccc tgagcctttc cagcaagttt gttcaagatt ggctgtcaag aatcatggac 360 *·!·* 60 tgttattata tgccttgttt tctgtcaaga caccatgatt cctggtaacc gaatgctgat 420 .1, ggtcgtttta ttatgccaag tcctgctagg aggcgcgagc catgctagtt tgatacctga 480 *···* gacggggaag aaaaaagtcg ccgagattca gggccacgcg ggaggacgcc gctcagggca 540 1 1 7667 'f gagccatgag ctcctgcggg acttcgaggc gacacttctg cagatgtttg ggctgcgccg 600 ccgcccgcag cctagcaaga gtgccgtcat tccggactac atgcgggatc tttaccggct 660 tcagtctggg gaggaggagg aagagcagat ccacagcact ggtcttgagt atcctgagcg 720 cccggccagc cgggccaaca ccgtgaggag cttccaccac gaagaacatc tggagaacat 780 5 cccagggacc agtgaaaact ctgcttttcg tttcctcttt aacctcagca gcatccctga 840 gaacgaggtg atctcctctg cagagcttcg gctcttccgg gagcaggtgg accagggccc 900 tgattgggaa aggggcttcc accgtataaa catttatgag gttatgaagc ccccagcaga 960 agtggtgcct gggcacctca tcacacgact actggacacg agactggtcc accacaatgt 1020 gacacggtgg gaaacttttg atgtgagccc tgcggtcctt cgctggaccc gggagaagca 1080 10 gccaaactat gggctagcca ttgaggtgac tcacctccat cagactcgga cccaccaggg 1140 ccagcatgtc aggattagcc gatcgttacc tcaagggagt gggaattggg cccagctccg 1200 gcccctcctg gtcacctttg gccatgatgg ccggggccat gccttgaccc gacgccggag 1260 ggccaagcgt agccctaagc atcactcaca gcgggccagg aagaagaata agaactgccg 1320 gcgccactcg ctctatgtgg acttcagcga tgtgggctgg aatgactgga ttgtggcccc 1380 15 accaggctac caggccttct actgccatgg ggactgcccc tttccactgg ctgaccacct 1440 caactcaacc aaccatgcca ttgtgcagac cctggtcaat tctgtcaatt ccagtatccc 1500 caaagcctgt tgtgtgccca ctgaactgag tgccatctcc atgctgtacc tggatgagta 1560 tgataaggtg gtactgaaaa attatcagga gatggtagta gagggatgtg ggtgccgctg 1620 agatcaggca gtccttgagg atagacagat atacacacca cacacacaca ccacatacac 1680 20 cacacacaca cgttcccatc cactcaccca cacactacac agactgcttc cttatagctg 1740 gacttttatt t 1751 • · • · » • · · • · ·· • · • ·· ··· • · • · ♦ ·* ♦ · • · *·· • · » • * ··· ··· • · ♦ · • · · ♦ · · • · **· ♦ · ♦ · · • · · · : ·· 1 • m • · »··

Claims (17)

17 117667

1. Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään 5 kahden rekombinanttisen luun morfogeneettisen proteiinin (rBMP) tai niiden monomeerien pysyvien laskosvarianttien synergistisen seoksen sopivassa farmaseuttisessa kantajasysteemissä, jolloin pysyvät laskosvariantit eroavat disulfidisidosten muodostumisen suhteen ja tämän seurauksena kolmiulotteisen konformaation suhteen vastaavista kypsistä rBMP:ista tai rBMP-mono- 10 meereistä, tai ne on saatu uudelleenlaskostamalla tällainen laskosmuoto, ja jolloin mainittu rBMP valitaan rBMP-2:n, rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien joukosta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että mainitut pysyvät laskosvariantit voidaan saada käsitte- 15 lemällä vastaavia kypsiä rBMP:ja tai rBMP-monomeerejä kaotrooppisella aineella, pelkistävällä aineella tai hapettavalla aineella sopivassa puskurissa aika, joka on riittävän pitkä muuttamaan stereokemiaa siten, ettei dimerisoitumis-ta tapahdu.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, 20 tunnettu siitä, että mainitut pysyvät laskosvariantit ovat rBMP-dimeerien pysyviä laskosvariantteja. ;*.* 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, • · · ‘ tunnettu siitä, että mainitut pysyvät laskosvariantit ovat rBMP-mono- ***:. meerien pysyviä laskosvariantteja.

5. Patenttivaatjmuksen 1 tai 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, * * tunnettu siitä, että mainitut pysyvät laskosvariantit ovat rBMP-2:n ja rBMP-4:n, rBMP-2:n ja rBMP-7:n tai rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai mainittujen rBMP:iden monomeerien py- i.:j: syviä laskosvariantteja.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen farmaseuttinen koostumus, • · · y..m tunnettu siitä, että mainitut pysyvät laskosvariantit ovat rBMP-2:n ja ·"! rBMP4:n tai niiden monomeerien pysyviä laskosvariantteja. • · ♦ • · · • · ♦ ' * * * • ♦ · ♦ · • ♦ ♦ 18 117667

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että mainittujen pysyvien laskosvarianttien painosuhde on alueella 1 -10:1 -10, edullisesti alueella 1 - 5:1 - 5.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen farmaseuttinen koostumus, 5 tunnettu siitä, että mainittujen pysyvien laskosvarianttien painosuhde on 1:1.

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää rBMP-2:n, rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien pysyvät laskosvariantit.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että mainittujen pysyvien laskosvarianttien painosuhde on alueella 1 -10:1 -10:1 -10, edullisesti alueella 1 - 5:1 - 5:1 - 5.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että mainittujen pysyvien laskosvarianttien painosuhde on 15 1:1:1.

12. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että mainittu farmaseuttinen kantajasysteemi on sää-dellysti lääkeainetta vapauttava systeemi.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen farmaseuttinen koostumus, 20 tunnettu siitä, että mainittu säädellysti lääkeainetta vapauttava systeemi perustuu biohajoavaan polymeerin.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen farmaseuttinen koostumus, :\tm tunnettu siitä, että mainittu biohajoava polymeeri on polylaktidin ja polygly- kosidin kopolymeeri.

15. Koostumuksen käyttö, joka koostumus sisältää vähintään kah- • · m den rekombinanttisen luun morfogeneettisen proteiinin (rBMP) tai niiden mono- meerien pysyvien laskosvarianttien synergistisen seoksen sopivassa farma- • · ***** seuttisessa kantajasysteemissä, jolloin pysyvät laskosvariantit eroavat disulfi- disidosten muodostumisen suhteen ja tämän seurauksena 3-ulotteisen kon-30 formaation suhteen vastaavista kypsistä rBMP:ista tai rBMP-monomeereista, ·*· tai ne on saatu uudelleenlaskostamalla tällainen laskosmuoto, ja jolloin mainit-.··*. tu rBMP valitaan rBMF-2:n, rBMP-4:n ja rBMP-7:n tai niiden monomeerien jou- kosta, valmistettaessa lääkettä, joka on tarkoitettu käytettäväksi luun muodos- • * . tusta inhiboivana aineena ortopediassa ja hammaslääketieteessä. * • * · _ 35 • · * • * • · • · · 19 1 1 7667

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen käyttö, t u n n ett u siitä, että mainittua koostumusta käytetään valmistettaessa lääkettä, joka on tarkoitettu käytettäväksi heterotrofisen ossifikaation ja muiden sairauksien hoidossa, joihin liittyy ei-toivottu luun muodostuminen.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittua koostumusta käytetään valmistettaessa lääkettä, joka on tarkoitettu käytettäväksi Cranio-maxillokasvokirurgiassa. ♦ · • · · ·· • · • ·· * • · # ♦ ··· • ♦ • : ·'·.' • · ··1 • · • · * · · * · · ♦ · · . ··♦ • · • · ··· ··· : * · • · ·1♦ • · ···'···''"· • ♦ ♦ • · · · · ... • · * · 20 1 1 7667