FI116827B - Luun morfogeneettisen proteiinin deleetiomutantti, sitä sisältävä farmaseuttinen koostumus ja sen käyttö - Google Patents

Description

Luun morfogeneettisen proteiinin deleetiomuU sisältävä farmaseuttinen koostumus ja sen käyttö

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee luun morfogeneettisten 5 (BMP:t) uusia mutantteja, jotka ovat käyttökelpoisia heterotooppis sen inhibiittoreina. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee uusia < tantteja, jotka sisältävät vain BMP:n koko sen alueen, joka osallistu muodostamiseen mukaan lukien ranne-epitooppi, jolloin spesifi iinitähde tai spesifiset kysteiinitähteet on korvattu toisella aminohai 10 oleva keksintö koskee myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sis tä deleetiomutantteja ja mutanttien käyttöä terapiassa.

Keksinnön tausta

Heterotooppinen luutuminen (HO) on yleinen komplika la, jotka ovat kärsineet pään ja niskan vammoista, vammaisesta lo 15 murtumasta tai joille on tehty täysi lantion korvaus. Se on luunmi prosessi ektooppisissa kohdissa, kuten lihaksessa ja sidekudokse johtaa vähentyneeseen liikkuvuuteen, kipuun tai jopa täyteen niveljä pääasiassa lantion ja kyynärpäiden nivelissä [yhteenveto, katso: Eule Der Unfallchirung 100 (1991) 667 - 674; Nilsson, O. S., Acta Orthop 20 (1998) 667 - 674]. Kun vanhemman väestön määrä lisääntyy ja täy nivelten koijausleikkausten lukumäärä kasvaa, HO:sta kärsivien potil rän voidaan odottaa kasvavan. Lisäksi HO manifestoituu joissakin pe taudeissa, kuten sidekudoksen kasvuhäiriössä, tai hankituissa luuta M· vissa leesioissa, kuten selkärangan hyperostoosissa, myelopatiass • 25 rangan jäykistymässä, joihin ei ole olemassa parantavaa hoitoE ....: kirurginen operaatio on ainoa hoitokeino.

..... Täyden lantion korvauksen jälkeistä ylimääräisen luunrr *** sen tehokasta estoa tarvitaan noin 10-50 %:lla potilaista [Seegensi , H., et af., Int J Radiation Oncology Biol Phys 39 (1997) 161 -171] ja * « * 30 lä estoon käytetään radioterapiaa, ei-stenoidisia anti-inflammatorisia • · to toi mnlamnio fPrtv/ontn/ M Q io Goaninn D \AI I Dnno Inint Qi ir 2

Ryhmällä proteiineja, joita nimitetään luun morfogeneetti iineiksi (BMP:t) ja jotka luonnossa esiintyvät dimeereinä, on avain tahansa luutumisprosessissa. BMP-perhe jaetaan alaperheisiin, BMP:t, kuten BMP-2 ja BMP-4, osteogeeniset proteiinit (OP:t), kuti 5 BMP-7, OP-2 eli BMP-8, BMP-5, BMP-6 eli Vgr-1, rustoperäiset moi set proteiinit (CDMP:t), kuten CDMP-1 eli BMP-14 eli GDF-5, ki tumistekijät (GDF:t), kuten GDF-1, GDF-3, GDF-8, GDF-9, GDF-11 < GDF-12 ja GDF-14, ja muut alaperheet, kuten BMP-3 eli osteogeniini GDF-2 ja BMP10. BMP-perhe, jossa on yli kolmekymmentä jäsei 10 TGF-p-suurperheeseen [Reddi, H., Cytokine & Growth Factor Reviev 11 - 20]. Wozney [Progress in Growth Factor Research 1 (1989) 26 karakterisoinut joitakin BMP-perheen jäseniä, mm. BMP-2:ta ja BMF kiksi homologiavertailujen avulla aminohapposekvenssitasolla.

BMP-perheen jäsenten ja muiden TGF-p-suurperheen jä 15 den 3-ulotteinen rakenne on määritetty, kokonaislaskostumistopoloc taa kättä, joka esittää voittomerkin, jolloin ranne esittää keskeistä i kaksi sormea kahta antiparalleelia β-levyä ja kämmen kysteiinisi [Scheufeler, C. et ai., J. Mol. Biol. 287 (1999) 103 - 115]. Kysteiinisoli kolmesta ketjujenvälisestä disulfidisillasta ja on kolmiulotteisen ra ke 20 stabiloija, ja se on niin tehokas, että biologinen aktiivisuus säilyy jopa sä altistuksessa alhaiselle pH:lle tai urea- tai guanidiinihydroklorid : [Sampath, T. K., ja Reddi, A. H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1£ + ** 7603]. Topologian lisästabilointi saavutetaan kahden monomeerin < misella, joka muodostaa sisäisen hydrofobisen ytimen (Scheufeler *:**: 25 supra). Kokonaisdimeerirakenne on välttämätön myös biologiselle va ·;··* kuten osteoinduktiolle, sillä se mahdollistaa dimeerisen molekyylin s .···. sen sitoutumisen vastaavaan reseptoriin, esimerkiksi BMP-dimeerir kaisen sitoutumisen tyypin I ja tyypin 11 seriini/treoniinireseptoriin, jolloi tuu heterotetrameeri, joka käynnistää signaalikaskadin Smadsin foi 30 kautta [Kawabata, M. et a/., Cyto & Growth Factor Rev 9 (1998) 49 -1 ***** aue. Annu Rgv Rinnhem 67 f19981 753 - 7911 Hiljattain nn nfinitpttn 3 BMP:iden proteiini- ja nukleotidisekvensseihin perustuv ovat paljastaneet, että BMP:iden toiminta hallitsee luun morfogen käsittää kemotaksian, mitoosin ja erilaistumisen. On myös osc BMP:iden vaikutukset eivät rajoitu luuhun ja rustoon. Embryogenet 5 sessa vaiheessa BMP:t ohjaavat koko kehon suunnitelman muodc spesifioivat kudostyypit ja kiedonikamat. Aikuisessa BMP:t vaikutt kykyyn parantua onnistuneesti [yhteenveto, katso Wozney, J. ja Clin. Orthop. Rel. Res. 346 (1998) 26 - 37]. Tämä BMP-toiminnan dessä sen osteoinduktiivisen voiman kanssa ehdottaa BMPriden k 10 laiden hoidossa murtuman paranemisen lisäämiseksi ja luun lis Toinen BMP:iden aspekti on niiden vuorovaikutus heterotooppisen (HO) manifestoitumisessa, mikä on luonut suuria odotuksia kehittää inhibiittoreita ja käyttää niitä terapeuttisina aineina HO:ssa.

BMP-mutantit, joilta puuttuu kyky muodostaa oikea disulf 15 kuvattu suomalaisessa patenttihakemuksessa 20011478, Osteoinl kombinantti-BMP-4-mutantit, jotka käsittävät aminohapot 48 - 1 BMP-4:n 116 aminohaposta, ts. jotka kattavat kattaa koko sen ai osallistuu sormen 2 sekä ranne-epitoopin muodostamiseen mutta e vastaavaa aluetta, (mutantti 1), ja BMP-4-mutantit, jotka käsittävät 2 20 1 -55 (mutantti 2) tai 1 - 88 (mutantti 3), ts. jotka sisältävät vain soi een mutta ei sormen 2 aluetta, on kuvattu mainitussa hakemukses • * : ni, joka osallistuu dimeerin muodostamiseen, on asemassa 80 ja s..,: mutanteissa 1 ja 3. Kysteiinitähteet, jotka osallistuvat kysteiinisolmu tamiseen ovat asemissa 16, 45, 49, 81, 113 ja 115 ja siten yksiki ·:·*: 25 teista ei pysty muodostamaan kokonaista kysteiinisolmurakennetta että mutantti 1, mutteivät mutantit 2 tai 3, pystyi vähentämään aikai .···. taasi -aktiivisuutta MC3T3-E1-soluissa, kun taas kysteiinin 80, joki dimeerin muodostamiseen, läsnä olo tai poissa olo ei korreloinut s β e.e kanssa. Siten tehtiin se johtopäätös, että aminohapposekvenssi, jo 30 tuussa luutumisen inhibitiosta, sijaitsee kypsän BMP:n C-terminaali: ***** liciknQca ahtaalla inaca antina ra Haali RJa\n/ inka nttoo wäärio+\/r»a£ 4

Esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön r keinoja BMP:iden ja, luun muodostumista inhiboivan aktiivisuudc käyttöön hoidettaessa potilaita ortopediassa ja muilla lääketieteen a

Erityisesti esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käy 5 BMP-mutantteja, jotka olisivat käyttökelpoisia heterotooppisen lui muiden tautien, joihin liittyy ei-toivottua luun muodostumista hoidos; ta ehkäisyssä. Tällaiset mutantit lisäisivät merkittävästi vaihtoehto on käytettävissä H O: n hoitoon, ja niiltä puuttuisivat sivuvaikutukset vät ei-steroidisten anti-inflammatorisiin lääkeaineisiin (NSAID.t) ja 10 aan, jotka tällä hetkellä ovat vaihtoehtoisia hoitomenetelmiä.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön uusia BMP-mutan BMP-4-mutantteja, jotka pystyvät tehokkaasti inhiboimaan hete luutumista. Erityisesti esillä oleva keksintö antaa käytte 15 deleetiomutantteja, jotka koostuvat oleellisesti vain alueesta, joki kypsän BMP-sekvenssin sormen 2 mukaan lukien rann muodostumiseen, jolloin spesifiset kysteiinitähteet on korvat aminohapolla.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön myös fan 20 koostumuksia, jotka sisältävät tällaisia mutantteja sopivassa farma kantajassa.

• * : Esillä oleva keksintö koskee luun morfogeneettiser (BMP) deleetiomutantteja, jotka oleellisesti koostuvat alueesta mukana BMP:n 3-ulotteisen rakenteen sormen 2 sekä rann *;··· 25 muodostumisessa ja jossa spesifinen kysteiinitähde tai kysteiinitähteet on korvattu toisella aminohapolla, ja jolla on hete .·*·. luutumista inhiboiva vaikutus.

« ·

Erityisesti esillä oleva keksintö koskee BMP:iden, kute . ja BMP-4:n, deleetiomutantteja, jotka oleellisesti koostuvat vain alu φ · · 30 osallistuu sormen 2 muodostamiseen mukaan lukien ranne-epitoc • * '···* snpsifinpn kvstpiinitährfc tai snpsifispf kvstpiinitähtppt on korva 5 asemassa 115 oleva kysteiinitähde, on korvattu toisella arr edullisesti neutraalilla aminohapolla, edullisimmin alaniinitähteellä.

Esillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttisia koe jotka sisältävät tällaisia mutantteja sopivassa farmaseuttisessa kant 5 Esillä oleva keksintö koskee myös tällaisten mutantt terapiassa, erityisesti terapiassa ortopedian alalla, sekä niidf valmistettaessa heterotooppista luutumista vastaan tarkoitettua lääk Tässä yhteydessä ilmaisu ’’spesifiset kysteiinit, jotka toisella aminohapolla" viittaa kysteiinitähteisiin, jotka osallistuvs 10 sidoksen muodostumiseen ja uusien disulfidisidosten muodostu m is* esiinny luonnollisissa BMP:issä.

Piirustukset

Kuvio 1 esittää saadut tulokset ja ALP-aktiivisuuden vähi MC3T3-E1-soluissa käytettyjen inhBMP-4-mutanttien rakenteen. p£ 15 annetaan merkityillä proteiineilla käsiteltyjen MC3T3-E1-solujen ALP-Paneelissa B esitetään kaaviomainen kuva joidenkin keksinnön konstruktien rakenteesta (N-pää vasemmalla).

Kuvio 2 esittää esillä olevan keksinnön mukaisen mutant histologisen vaikutuksen.

20 Kuvio 3 esittää osteoinhibition annoksesta riippuvan lisään

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • » : Esillä oleva keksintö perustuu luun muodostumisen inhi uuden sukupolven kehittämiseen BMP:n, jota BMP-4 kui esimerkinomaisesti, primaarisesta sekvenssistä, jolloin mutantti koe ·:··· 25 4:n alueesta, joka osallistuu sormen 2 muodostamiseen mukaan tul epitooppi (suomalaisen patenttihakemuksen 20011478 MBP-4-n .···, Esillä olevan keksinnön mukaisten uusien mutanttien parannus c käyttämällä vain osaa BMP-sekvenssistä jäljellä oleva primaarinen . ei voi laskostua osteoinduktiiviseksi laskosvariantiksi, kuten teoreet • · * 30 tapahtua kypsille BMP-monomeereille. Siten esillä olevan keksinnö · *···* miitantit Λί/αί nloallicocfi +iiriiollicomnio l/öi/föHönnt.ö tAraniqopq tZ* 6 keksinnön mukaiset mutantit pystyvät muodostamaan uusia disul joita ei esiinny luonnollisissa BMP:issä.

Sellulaarisen vasteen BMP-4-mutantille 1 ja inter; tutkimiseksi edelleen viisi kysteiiniä BMP-4-mutantissa 1, nimitti 5 päässä, C80 ja C81 keskellä ja C113/115 C-päässä, vaihdettiin alan kohdennetulla mutageneesillä ja syntyneiden mutanttien inhiboh tutkittiin käyttäen hiiren osteoblastisolulinjaa MC3T-E1. Tätä solulinja yleisesti BMP-inhibiittoreiden tutkimiseen solutasolla, koska nämä so endogeenistä BMP-2:ta ja BMP-4:a ja erilaistuvat autokriinise; 10 osteoblasteiksi niiden vaikutuksesta [Natsume, T., et a/., J. Biol. (1997) 11535 - 11540]. Tätä prosessia voidaan helposti monitoroi' neen alkalisen fosfataasi (ALP) -aktiivisuuden avulla.

Havaittiin, että vaihdoilla C80/81A, C113A ja käytännöllisesti katsoen ollut vaikutusta tai niillä oli parantunut vaiki 15 mutantin 1 inhiboivaan vaikutukseen mutta vaihdokset C49A ja heikensivät mutantin 1 inhiboivaa vaikutusta (kuvio 1). Tämä osoitta ja C113 tai C115 ovat korvaamattomia inhibitiolle ja, samalla 1 osBMP.ssä, että kysteiinien asema ja disulfidisidosten muo määräävät sen ja mutantin 1 kokonaislaskostumistopologian. Yllättä 20 että mutantti 1 C115A on parempi inhibiittori kuin mutantti 1 C113^ 16), vaikka luonnossa esiintyvä disulfidisilta, joka on peräisin m : perheen jäsenistä, on tähteiden C49 ja C115 välillä. Tämä os * #* BMP.iden inhibiittoreiden tehokkuus riippuu, paitsi siitä, että niii :**·· disulfidin muodostuminen, kuten aikaisemmin on osoitettu (Weber ·:··; 25 supra), myös sellaisten disulfidisidosten muodostumisesta, joita *:··· luonnollisissa BMP:issä.

·*·*. Seuraavaksi joitakin konstrukteja testattiin yleisimmin k£ vivo -malllissa HO:lle, joka käsittää demineralisoidun luun , implantaation rottiin heterotooppisen luutumisen matkimiseksi [DiCe Ϊ.ΙΛ 30 et af., J Orthop Res 9 (1991) 855 - 861; O’Connor, J. P., Clin Ortop ·** 71 _ «m lunnein ilrHt inflra n\/of\/i\/ät alantamoan ΔΙ D-oH-mwIoi n iff-a ^ 7 kalsiumpitoisuuteen implantaateissa. Kuten kuviossa 3 esitetäär inhibiittorin määrät vähentävät implantaatin kalsiumpitoisuutta.

(tuloksia ei ole esitetty) ja mutantin 1 C115A annos-vaste-kuvaaja merkittävää eroa. Kuitenkin, kuten kuviosta 3 käy ilmi, mutantti 1 C1 5 tehokkaammin luun muodostumista kuin BMP-4-monomeeri. Annok proteiinia ero mutantin 1 C115A ja BMP-4-monomeerin välillä, kalsiumpitoisuuden vähentämiseen, on merkittävä (P>0,02). Ki huomioon, että mutantin 1 C115A molekyylipaino on 2/3 kypsi monomeerin molekyyli painosta, ensiksi mainittu on jopa tehokkaa

10 kalsiumpitoisuus, joka saatiin käyttämällä 25 pg mutanttia 1 C115A

kuin kalsiumpitoisuus, joka saatiin 50 pgrlla BMP-4-monomeeriä (p<C

Esillä olevan keksinnön mukaiset BMP-mutantit, jotka alueesta, joka osallistuu BMP:n sormen 2 mukaan lukien rann muodostamiseen, ovat yksinkertaisia proteiineja käytettäväksi 15 sovelluksissa BMP:iden vaikutusten vastustamiseksi HO:ssa, sitoutuvat spesifiseen reseptoriin. Keksinnön mukaisia mutanttej; BMP-4-mutantti 1 C115A testattiin in vivo samassa mallissa, jota ki steroidisten anti-inflammatoristen lääkeaineiden arvioimisessa. Indc erään näitä lääkeaineita edustavan yhdisteen, osoitettiin 1 20 kalsiumpitoisuutta demineralisoidun luun implantaateissa 80 %, ji telyä seurasi päivittäinen lääkkeen anto (DiCesare, P. E., et j,:*: Kuitenkin 50 mikrogrammaa mutanttia 1 C115A vähensi kalsiumi Γ": 98 %, vaikka sitä annettiin vain kerran paikallisesti ja sam j’\. osteoinduktion kanssa. Siten mutantti C115A on tehokkaampi kuin in 25 ja sitä voitaisiin käyttää rutiini-HO-profylaksiana, joka annettaisiin vs leikkauksen aiheuttaman tai tapaturmaisesti aiheutuneen .·»», indusoitumisen jälkeen.

•

Keksinnön mukaisia uusia deleetiomutantteja voidai . terapeuttisina aineina estämään uuden luun muodostuminen yl ’ 30 sopivana yhdistelmänä. Keksinnön mukaiset BMP-4-mutantit ovat ed * * *...* kautathiinö Crli illieia Ι/Αΐτβίηηηη mi mi rfenHian 8 sopivassa kantajassa. Sopivia kantajia ovat kantajat, joita < suomalaisessa patenttihakemuksessa 20011478, kuten on sopivaa.

Keksintöä kuvataan seuraavien esimerkkien avulla, jotk vain valaisutarkoituksiin.

5 Tilastollisissa analyyseissa käytettiin Studentin Ί kaupallisesti saatavissa olevaa ohjelmistoa (SSPE, Chicago, II). I esitetään keskiarvoina + keskiarvon standardivirhe.

Esimerkki 1 BMP-4-mutanttien valmistus 10 Keksinnön mukaisten BMP-4-mutanttien valmistamisess seutaavia menetelmiä. Ensimmäisessä vaiheessa kypsän BMP-4:n konstruktit ja deleefiomutantti 1 muodostettiin PCR:llä käyttäer cDNA:ita templaatteina suomalaisen patenttihakemuksen 20011478

Lyhyesti kuvattuna aloituskodoni osana Nde-restriktiokohtaa iis 15 reaktiolla, kuten Weber, F. et ai. ovat kuvanneet [Cell Mol Life Se 751 - 759], kypsän BMP-4-sekvenssin (sekvenssi tunnusnumero 2 hakunumero M22490) eteen, mikä lisäsi yhden metioniinin N-te pidennyksen kypsään sekvenssiin. Mutantti 1 muodostettiin ii aloituskodoni määrättyyn asemaan. Kohdennettu mutagenees 20 templaattina mutantin 1 kaksisäikeistä plasmidi-DNArta suoritetti

QuickChange™- (Stratagene, Jolla, CA, USA) kohdennettu mutag

: Oligonukleotidit suunniteltiin, kuten Braman, J. et ai. [Methods E

(1996) 31 - 44] ovat kuvanneet, siten, että mutatoitava kysteiinikode alaniinin kodonilla, joka sijoitettiin keskelle suunniteltua oligonukleol ·:··: 25 ja sitä reunusti riittävä templaat-tisekvenssi 5'- ja 3-päähän päin. Ala sisältävän oligonukleotidin sense- ja antisense-sekvenssiä käyt .*··. reaktiossa, jossa oli mutantti 1 -plasmkli templaattina.

♦ · PCR-reaktion jälkeen templaatti digeroitiin metylaatk . endonukleaasilla Dpn I, ja jäljelle jäänyt vasta syntetisoitu DNA tra lii 30 Escherichia coli -soluihin. Kaikki syntyneet kloonit sekvenso * M·* ilmAntömictö Ca aHö ΙτΙηΛΠΔίοοο ^li KMA-raotriUlAl * 9 sentrifugoimalla kierrosnopeudella 5 000 x g. Pellettiä säilytettiin °C:ssa. Sulatuksen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen puskuriin, m M Tris-HCI:a, pH 7,9, 0,5 M NaCI:a ja 5 mM imidatsolia, je kierrättämällä kolmesti French-painekammion läpi paineessa 2( 5 Sentrifugoinnin jälkeen BMP:t olivat pelletissä.

lnh-rBMP-4:n tuottamiseksi pelletti liuotettiin samaan pu aikaisemmin lisäämällä 6 M ureaa ja inkuboitiin kääntyvässä seitsemän päivää 4 °C:ssa. Liukenematon materiaali poistettiin sent kierrosnopeudella 15 000 x g 30 min ja supematantti vietiin affmitei 10 (Chelating HP, 5 ml HiTrap®, Pharmacia Biotech) ja eluoitim 1 M samassa puskurissa. BMP-4-mutantit käsitettiin ditiotreitolilla (loppui: mM), niille tehtiin geelisuodatus (HiLoad® Superdex® 200, Pharmai 1,6 cm x 60 cm; 124 ml) TU:ta (50 mM Tris, pH 8, 6 M urea) käyttäen ja lopputuotteet säilytettiin TU:ssa. Proteiinipitoisuus 15 Coomassie-proteiininmääritysreagenssilla (Pierce, II, USA).

Esimerkki 2

Keksinnön mukaisten mutanttien inhiboivat v solutasolla

Hiiren osteoblastisolulinjaa MC3T3-E1 käytettiin 20 mukaisten mutanttien inhiboivien vaikutusten tutkimiseksi solutasot E1-soluja kasvatettiin alfa-modifioidussa Minimum Essential Medi • · : neessa (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY. USA), joka si j"’: vasikansikiö-seerumia (Life Technologies, Inc.), 50 pg/ml gentamy j‘\. pg/ml askorbiiinihappoa. BMP:ien biologisen aktiivisuuden tutkimis 25 solua per kuoppa levitettiin 6-kuoppaisiille levyille, minkä jälkeen 1 μ nia lisättiin. Väliaine vaihdettiin kolmen päivän kuluttua ja alkalinei määritettiin päivänä 6. Solut pestiin kolmesti fosfaatilla puskuroidu! * * sella suolaliuoksella ja yhden kuopan solut yhdistettiin 0,5 ml:s: . puskuria (0,56 M 2-amino-2-metyylipropan-1-oli, pH 10) ja hom *lll 30 omni-mixer-laitteella. 200 jjJ solulysaattia sekoitettiin 200 pl:aan hajot • ·

λ m m. 1^4 4 Λ II 4 QI A A AA^k / O Λ A^ λ Jk IA_IA l4 IA I Λ #1 ifA A 1111A 1A Jk A^ K 4 λ 4a I_* 11A J

10 fosfataasi -aktiivisuus normalisoitiin kokonaisproteiiniin ja ilmoitett muodostunutta nitrofenylaattia per min per mg proteiinia.

Mutantista 1 peräisin olevilla eri BMP-4-mutanteilla MC3T3-E1 -solujen alkalinen fosfataasi -aktiivisuus esitetään * 5 Oikealla oleva kaavamainen piirustus osoittaa kysteiinien sijainnin nr Kaikki arvot edustavat kahdeksaa mittausta ja annetaan kes keskiarvon standardivirhe. Kuten kuviosta 1 käy ilmi, kun kysteiin 80/81, 113 ja 115 korvattiin alaniinilla, mutantin 1 inhiboiva potentii parani (mutantti 1 C115A). Kuitenkin kun suoritettiin vaihdot C49Aj< 10 mutantin 1 inhiboiva potentiaali hävisi. Kysteiinit asemissa 49, 113 siis kriittisiä inhibitiolle.

Esimerkki 3

Demineralisoidun luun indusoiman heterotooppisen inhibitio

15 Keksinnön mukaisten BMP-mutanttien vaikutuksen I

määrittämiseksi demineralisoitua luujauhetta valmistettiin rotan pi oleellisesti julkaisussa Muthukumaran, N. et af., Collagen Rel. Re 433 - 441, kuvatulla tavalla. Inaktivoidun luun kollageenin vain demineralisoitu luumateriaaii uutettiin 4 M guanidiinihydrokloridilla [i 20 K. ja Reddi, A. H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 7599 - 7603 proteiinien lataamiseksi oli seuraavanlainen: 25 mg materiaali • ♦

: mikrosentrifugiputkeen ja proteiini liuotettiin 120 pl:aan 0,05 mM

* * ψ sisälsi 0,5 mg kondroitiinisulfaattia. Kontrolli valmistettiin vastaa proteiinia. Yhden tunnin huoneen lämpötilassa inkuboinnin jälkeen ( ·:·*: 25 hännän kollageeniä (2 mg/ml 0,1-%:isessa etikkahaposs *:··· kantajamateriaaliin, sekoitettiin vortex-sekoittimella, minkä jälkeer .*··. vielä 30 min. Ladattu materiaali sekoitettiin sitten 1,1 ml:aan EtOH:

-80 °C:ssa) ja siirrettiin -80 °C:n pakastimeen yhdeksi tunniksi. S

sentrifugoitiin 30 min 4 °C:ssa, supematantti poistettiin ja pelletti pes :if 30 85-%:isella EtOH:lla (-20 °C). Lopullinen pelletti muodostettiin 1 ml:n ! · • i* 1/1 α^λοιΪΙΪιρι l/ι ai n in aIIh i «eli φ 11

Endocrinology 4 (1990) 149 - 155] on osoittanut. Irrottamisen implantaatti punnittiin ja jaettiin kahteen osaan. Toinen osa ir punnittiin ja homogenoitiin omni-mixer-laitteella (Waterbury, CT, ml:ssa seosta, jossa oli 3 mM NaHCOsra ja 150 mM NaCI:a. Sei 5 (1000xg 15 min) jälkeen supematantti käytettiin alkalisen fosfati aktiivisuuden määritykseen ja pelletti suspendoitiin uudelleen kolme 10 mM Tris-HCI:a, pH 7, ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1 t pesun jälkeen pellettejä uutettiin yön yli 1 mlrlla 0,5 M HCI kalsiumsisältö mitattiin atomiabsorptiospektroskopialla.

10 Tulokset BMP-4-monomeerille, mutantille 1, mutantille mutantille 1 C47+113A, jotka esitetään taulukossa 1, osoittavat selve 1 C115A ylivoimaisuuden.

Konstrukti B4-monomeeri Mutantti 1 Mu tantti 1 Mutantti

___C115A_113A

keskiarvot 49,9±15,1 8,9±2,8 2,0±0,9 77,2±9,1 SD _L__J__

Kuviossa 3 esitetään keksinnön mukaisen mutantin os 15 annoksesta riippuvainen lisääntyminen. Demineralisoitu luu ladattii määrillä (1 - 50 /yg) mutanttia 1 C115A tai inhBMP-4-monomeeriä kuluttua määritettiin kalsiumsisällön prosenttiosuus näytteessä , , lataamattomaan implataattiin. Tulokset annetaan neljän eläimen kei • * * keskiarvon standardivirhe. Keksinnön mukaisen mutantin annos, j( 20 inhibition, oli annoksesta riippuvainen ja, mikä merkittävää, i : '·· monomeerin annos.

Useimmat implantaatit tutkittiin histologisesti, jolloin ne k upotettiin sitten poly(metyylimetakrylaattiin). Valmistettiin 4,5 | histologiset leikkeet ja värjättiin Goldner-Trichrome- ja toluidiinisini

25 [Sheehan, D. ja Hrapchak, B., teoksessa Theory and F

. .·. Histotechnology, toim. The C.V. Mosby Company, 1980]. Värjä .·*·. tutkittiin luun muodostumisen, solutyypin, morfologian ja st • ♦ ·»· i *4 « | > | , . .. . , | | .

12

Sekvenssilistat <110> Inion Ltd.

5 <120> Pharmaceutical composition

<130> BMP

<140> 10 <141> <160> 3 <170> Patentin Ver. 2.1 15 <210> 1 <211> 381

<212> DNA

<213> Homo sapiens 20 <400> 1 atgcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccci tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtal gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccacl 25 catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatg< gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggtl ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgctagta cagcaae aaatacataa atatatatat a 30 <210> 2 <211> 484 <212> DNA <213 > Homo sapiens 35 <400> 2 atgagcccta agcatcactc acagcgggcc aggaagaaga ataagaactg ccggcgc • tcgctctatg tggacttcag cgatgtgggc tggaatgact ggattgtggc cccacc< ΐ,ΐ ; taccaggcct tctactgcca tggggactgc ccctttccac tggctgacca cctcaac ,···, 40 accaaccatg ccattgtgca gaccctggtc aattctgtca attccagtat ccccaae *«,** tgttgtgtgc ccactgaact gagtgccatc tccatgctgt acctggatga gtatgat ··. gtggtactga aaaattatca ggagatggta gtagagggat gtgggtgccg ctgagat ! ** gcagtccttg aggatagaca gatatacaca ccacacacac acaccacata caccacs acacgttccc atccactcac ccacacacta cacagactgc ttccttatag ctggact • * 45 attt • • * .···. <210> 3 ·...* <211> 1751

50 <212> DNA

<213> Homo sapiens # <400> 3 ·*··. ggcagaggag gagggaggga gggaaggagc gcggagcccg gcccggaagc taggtga *···* 55 tggcatccga gctgagggac gcgagcctga gacgccgctg ctgctccggc tgagtat 13 1 gagccatgag ctcctgcggg acttcgaggc gacacttctg cagatgtttg ggctgi ccgcccgcag cctagcaaga gtgccgtcat tccggactac atgcgggatc tttac< tcagtctggg gaggaggagg aagagcagat ccacagcact ggtcttgagt atcct< cccggccagc cgggccaaca ccgtgaggag cttccaccac gaagaacatc tggag; 5 cccagggacc agtgaaaact ctgcttttcg tttcctcttt aacctcagca gcatc< gaacgaggtg atctcctctg cagagcttcg gctcttccgg gagcaggtgg accagt tgattgggaa aggggcttcc accgtataaa catttatgag gttatgaagc ccccat agtggtgcct gggcacctca tcacacgact actggacacg agactggtcc accac? gacacggtgg gaaacttttg atgtgagccc tgcggtcctt cgctggaccc gggag< 10 gccaaactat gggctagcca ttgaggtgac tcacctccat cagactcgga cccac< ccagcatgtc aggattagcc gatcgttacc tcaagggagt gggaattggg cccagc gcccctcctg gtcacctttg gccatgatgg ccggggccat gccttgaccc gacgc( ggccaagcgt agccctaagc atcactcaca gcgggccagg aagaagaata agaact gcgccactcg ctctatgtgg acttcagcga tgtgggctgg aatgactgga ttgtgc 15 accaggctac caggccttct actgccatgg ggactgcccc tttccactgg ctgacc caactcaacc aaccatgcca ttgtgcagac cctggtcaat tctgtcaatt ccagti caaagcctgt tgtgtgccca ctgaactgag tgccatctcc atgctgtacc tggatc tgataaggtg gtactgaaaa attatcagga gatggtagta gagggatgtg ggtgcc agatcaggca gtccttgagg atagacagat atacacacca cacacacaca ccacat 20 cacacacaca cgttcccatc cactcaccca cacactacac agactgcttc cttate gacttttatt t 25 • t • · ♦ • · I ··· · ··· • · «· • 9 • ·· • · ·* ·

IM

♦ 9 ♦ · • · « • » « ··· ··· • · • ·

Claims (9)

1. Luun morfogeneettisen proteiinin (BMP) delee tunnettu siitä, että se oleellisesti koostuu alueesta, joka <

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen deieetiomutantti, t 10 siitä, että spesifinen kysteiinitähde on korvattu neutraalilla aminohap

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen deieetiomutantti, t siitä, että neutraali aminohappo on alaniini.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen delee tunnettu siitä, että BMP on BMP-4.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen deieetiomutantti, t siitä, että se koostuu oleellisesti kypsän BMP-4-sekvenssin ami 48 - 116, jolloin kysteiinitähde asemassa 115 on korvattu toisi hapolla, edullisesti neutraalilla aminohapolla.

5 BMP:n 3-ulotteisen rakenteen somien 2 sekä ranne-epitoopin misessa ja jossa spesifinen kysteiinitähde tai spesifiset kysteiin korvattu toisella aminohapolla, ja että sillä on heterotooppista inhiboiva vaikutus.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen deieetiomutantti, t 20 siitä, että toinen aminohappo on alaniini.

7. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että • · : jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisen deleetiomutantin yl yhdessä toisen mutantin kanssa, kuten jonkin patenttivaatimus mukaisen deleetiomutantin kanssa, sopivassa kantajassa. ·:··· 25

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen farmaseuttinen tunnettu siitä, että deieetiomutantti on luun morfogeneettisen .···. deieetiomutantti, joka oleellisesti koostuu kypsän BMP-4- aminohapoista 48-116, jolloin kysteiini asemassa 115 on korvattu i

, 9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen delei 30 käytettäväksi terapeuttisena aineena. • · ··· 1Π Innoin nalanHiiiaatim· ilrcielo 1 _ fi mi lUaiean rloloi