JP6918871B2 - 関節損傷の治療のためのペプチドおよび組成物 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１３年３月８日に出願された米国仮特許出願第６１／７７５，４００号
および２０１４年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／９３８，１２３号の優
先権および利益を主張するものであり、そのそれぞれの出願の全体を参照により本明細書
に組み込んだものとする。

発明の背景
変形性関節症（ＯＡ）は、最も一般的な筋骨格障害である。現在、およそ４千万人の米
国人が罹患しており、老齢人口および平均余命の増加の結果として、その数は今後２０年
間で６千万人に増加して、ＯＡが障害の第４の主要な原因なることが予想される。ＯＡは
、関節軟骨（関節に対して潤滑および緩衝もたらす細胞および基質（マトリックス）を含
む）ならびに関節軟骨の下にある軟骨下骨の両方を含む関節のゆっくりとした変性性の破
壊が特徴である。ＯＡは、さまざまな病因的因子の結果と考えることができる。例えば、
ＯＡは異常な生体力学的ストレスまたは関節軟骨もしくは骨の遺伝学的もしくは後天的な
異常によって引き起される場合がある。現行のＯＡ治療法としては、経口ＮＳＡＩＤすな
わち選択的シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤による痛みの緩和、副腎皮質ス
テロイド薬およびヒアルロナンなどの薬剤を用いた関節内（ＩＡ）注射、ならびに外科的
アプローチが挙げられる。

関節損傷、例えば、半月板もしくは靱帯裂傷または関節骨折などの急性の関節傷害は、
関節炎、例えば、外傷後関節炎に至る場合もある。関節軟骨は、修復能力が限られている
ため、気づかれないほど小さな損傷であっても、時間とともに悪化し、ＯＡに至る場合が
多い。関節傷害のための現行の治療としては、損傷した関節の再生に重点を置いた手術お
よびその他の侵襲的手技ならびに痛みおよび炎症を緩和するための薬剤を用いた治療が挙
げられる。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、成人の関節軟骨に存在し、単離されると、インビトロにお
いて軟骨細胞およびその他の間葉系細胞系列に分化するようプログラムされ得、軟骨再生
に使用される場合もある。ある程度、このプロセスは、成長因子（ＴＧＦβ、ＢＭＰ）、
血清条件および細胞−細胞接触によって調整される。ＷＯ２０１１／００８７７３は、関
節炎および関節傷害を治療または予防するため、さらに間葉系細胞の軟骨細胞への分化を
誘導するためのペプチド組成物ならびにそれらの組成物の使用について記載している。さ
らに、ＷＯ２０１２／１２９５６２は、関節炎および関節傷害の改善のため、さらに間葉
系細胞の軟骨細胞への分化を誘導するための小分子化合物、組成物ならびにそれらの組成
物の使用について記載している。

外科的技術および再生技術は、軟骨の修復、変性の遅延および関節損傷の修復の改善に
おいていくらか進歩はしたが、有効な軟骨再生、関節損傷の治療およびＯＡの改善または
予防のための組成物ならびに方法の改善に対して継続した需要がある。

発明の簡単な要旨
本発明は、例えば、野生型ＡＮＧＰＴＬ３よりも安定で、タンパク質分解および酵素分
解を受けにくいなどの改善された薬学的特性をもつ新規のアンジオポエチン様３（ＡＮＧ
ＰＴＬ３）ポリペプチドおよびタンパク質バリアントの特定に関する。関節損傷または関
節傷害の治療のための医薬組成物および方法ならびに哺乳動物の関節炎、関節損傷もしく
は関節傷害を改善または予防する方法も提供される。

したがって、表１の配列のいずれか１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列と少な
くとも９５％のアミノ酸配列同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％も
しくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列およびさらに本明細書に記載
されるとおりのアミノ酸配列を含むプロテアーゼ抵抗性ポリペプチドが提供される。表１
の改変ポリペプチドは、完全長型ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド配列である配列番号１を参
照して決定される４２３位がＫまたはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含む。一部
の実施形態において、配列番号１を参照して決定される４２３位のアミノ酸は、Ｑまたは
Ｓである。特定の実施形態において、配列番号１を参照して決定される４２３位のアミノ
酸はＱである。特定の実施形態において、配列番号１を参照して決定される４２３位のア
ミノ酸はＳである。特定の実施形態において、配列番号１を参照して決定される４２３位
のアミノ酸は欠失している。さらに、提供されるポリペプチドは、軟骨形成活性をもつ。

一部の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号
３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列
番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、
配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７０のいずれか１つと少な
くとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００
％を有する配列を含む。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号１４、配
列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０
、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号
２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列
番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６４のいずれか
１つと少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もし
くは１００％を有する配列を含む。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、表１の
配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号３０
、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号
３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列
番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号
７０のいずれか１つを含む。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号１４
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号
２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列
番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、
配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６４のいずれか１つを含む。一部の実施形
態において、本ポリペプチドは、表１の配列のいずれか１つである。一部の実施形態にお
いて、本ポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３
９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番
号６８、配列番号６９、および配列番号７０のいずれか１つである。一部の実施形態にお
いて、本ポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２
５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番
号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６
４のいずれか１つである。

本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の化学的改変（例えば、ペグ化）を組み込ん
でもよい。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ末
端またはカルボキシル末端において任意に融合されてもよい融合タンパク質として異種ペ
プチドを含んでもよい。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのようなベクターを含む宿
主細胞も提供される。

本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
を提供する。そのような組成物は、患者の関節炎または関節損傷を治療、改善または予防
するための本明細書中で提供される方法に使用することができ、この方法は、患者の関節
に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。そのような方法から利益
を得ることができる状態の例としては、これらに限定されるものではないが、関節炎（例
えば、変形性関節症、外傷性関節炎）および関節損傷（例えば、急性の関節傷害）が挙げ
られる。

本発明は、治療有効量の本発明のポリペプチドを投与するステップを含む対象を治療す
る方法をさらに提供する。提供される方法は、関節損傷および／もしくは関節炎があるか
、またはそのリスクがある対象を治療することを含み、この方法は、対象に治療有効量の
１つまたは複数の本発明のポリペプチドまたはその医薬組成物を投与するステップを含む
。なおかつ、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導する方法がさらに提供され、この方
法は、間葉系幹細胞を有効量の本発明のポリペプチドと接触させて間葉系幹細胞の軟骨細
胞への分化を誘導するステップを含む。

本発明の追加の特徴、利点および実施形態を含む本発明のこうした態様およびその他の
態様は、以下の詳細な説明および添付の本発明の特許請求の範囲にさらに詳細に記載され
、解明される。

図１は、タンパク質の安定性を改善するためおよびタンパク質分解抵抗性を向上させるために操作されたｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の図である。野生型タンパク質およびペプチド配列のタンパク質の産生の過程において、Ｌｙｓ４２３とＳｅｒ４２４の間に１００％切断が観察された。タンパク質分解を減らすために、Ｌｙｓ４２３がＧｌｎもしくはＳｅｒに変異した；またはＳｅｒ４２４がＴｈｒに変異した；またはＬｙｓ４２３が欠失したさまざまな変異ペプチドが作製された。 図２ＡおよびＢは、ＡＮＧＰＴＬ３および人工構築物（engineered construct）の存在下または不在下における軟骨特異的なタンパク質の発現を表わすグラフ表示である。２Ａ型プロコラーゲンの定量化（ＰＩＩＡＮＰ）のために（２Ａ）またはＩＩ型コラーゲンの定量化のために（２Ｂ）、固定された細胞は着色されて、実施例に記載されるとおりの処理の後に軟骨細胞へ分化する細胞の％を求めた。図２Ｃは、陽性対照タンパク質であるｂＦＧＦと比較した場合のＡＮＧＰＴＬ３または人工構築物の存在下または不在下における血管形成アッセイを定量化したグラフ表示である。合計の管の長さおよび分岐点の数を血管形成の量的測定値とした。他の人たちがＡＮＧＰＴＬ３の血管形成活性を報告し、この試験は、活性ならびにＦＧＦの活性を確認したが、その結果は、Ｃ末端ＡＮＧＰＴＬ３構築物には顕著な活性が保持されないことを示した。 図３は、ＡＮＧＰＴＬ３または人工構築物の存在下における軟骨に特異的なタンパク質の発現の増加を示すグラフ表示である。３Ａ．記載されるとおりの処理の後に、軟骨に特異的なタンパク質についてのＲＮＡ発現を測定するために、細胞は処理１０日後にｑＲＴ−ＰＣＲを使用して評価された。ラブリシン、アグリカンおよびＳｏｘ９は、軟骨関連タンパク質を表わし、ＩＧＦおよびＩＦＩＴＭ１は、分化能を表わし、オステオカルシンおよびＸ型コラーゲンは、骨／線維化関連タンパク質を表わす。３Ｂ．記載されるとおりの処理の３日後に細胞を評価した。人工構築物または野生型ＡＮＧＰＴＬ１ Ｃ末端領域ポリペプチドによる処理の後にアグリカン発現に増加が見られた。 図４は、ＡＮＧＰＴＬ３および人工構築物の軟骨保護活性のグラフ表示である。４Ａ：基質損傷の指標であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）放出は、ＡＮＧＰＴＬ３および変異構築物の量の増加に伴って阻害された。エクスビボにおけるＧＡＧ放出（基質損傷の指標）阻害アッセイは、記載されるとおりに構築物の存在下または不在下において処理されたウシの軟骨を使用して行われた。４Ｂおよび４Ｃ：ＮＯ放出は、ＡＮＧＰＴＬ３および示した人工構築物の量の増加に伴って阻害された。軟骨細胞は、記載されるとおりに構築物の存在下または不在下において処理された後、Ｇｒｅｉｓｓ反応アッセイを行って軟骨保護の指標としてＮＯ放出の阻害を確認した。 図５は、構築物の存在下、肥大条件下におけるＸ型コラーゲン発現（線維軟骨（fibrotic cartilage）形成活性の指標）の阻害を示すグラフ表示である。初代軟骨細胞を、記載されるとおりに構築物の存在下または不在下、肥大条件下において処理した後、線維および肥大軟骨の形成／軟骨細胞分化の測定値としてＸ型コラーゲン発現を定量し、免疫蛍光法によって評価した。５Ａは、野生型Ｃ末端ＡＮＧＰＴＬ３または人工構築物の結果を示す。５Ｂは、Ｃ末端ＡＮＧＰＴＬ３（ＷＴ）または人工構築物２４２ＫＱもしくは２４２ＫｄｅｌまたはＣ末端ＡＮＧＰＴＬ１の結果を示す。 図６は、投薬の実例（dosing paradigm）の略図（６Ａ）、マウスＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）による処置後の大腿骨外側顆の軟骨侵食スコアによって判定される関節の重症度の改善に関するグラフ表示（６Ｂ）である。 図７は、軟骨損傷の外科的誘発に続くＡＮＧＰＴＬ３構築物による週１回の３週間の処置（７日目に開始）後のマウスのインキャパシタンス測定（疼痛の指標）のグラフ表示である。７Ａは、手術後３５日目のインキャパシタンス測定を示す。７Ｂは、手術後５６日目に行った測定を示す。 図８は、合計の関節の重症度スコアおよびコラゲナーゼによって誘発されたマウスの軟骨損傷に対する、（示した）ＡＮＧＰＴＬ３構築物による週１回の３回の処置（７、１４および２１日）後の重症度の改善に関するグラフ表示である。 図９は、ラット半月板断裂モデルの関節損傷を人工ＡＮＧＰＴＬ３構築物により処置した後の結果を示すグラフである。図９Ａは、処置５週間後の関節のプロテオグリカン含有量のグラフ表示である。図９Ｂは、処置の５週間後の大腿関節の重症度スコアのグラフ表示である。結果は、ラットの半月板を外科的に切断することによって誘発した軟骨損傷が（示した）ＡＮＧＰＴＬ３構築物の週１回の３回の処置（７、１４および２１日）後に改善したことを示す。 図１０は、ラット半月板断裂モデルの関節損傷を人工ＡＮＧＰＴＬ３構築物により処置した後の結果を示すグラフである。図１０Ａは、重症度、サフラニンＯ強度、軟骨面積および軟骨厚さによって判定されるインビボ修復の割合を示すグラフ表示である。図１０Ｂは、軟骨損傷の外科的誘発およびそれに続く処置後のラットのインキャパシタンス測定（疼痛の指標）を示すグラフ表示である。 図１１は、総重症度スコアの合計（total gross severity score）のグラフ表示である。イヌの内側半月板を外科的に破壊することによって誘発した軟骨損傷の４日目に開始した隔週の投薬（それぞれが１．５ｕｇ／用量もしくは１５ｕｇ／用量）または７日目のみに与えた３０ｕｇの単回投与の後の改善を示す。

詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化を刺激し、プロテアー
ゼ（例えば、トリプシン様プロテアーゼ）による切断に対して抵抗性のあるアンジオポエ
チン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）の特定に基づくものである。ＷＯ２０１１／０
０８７７３は、関節炎および関節傷害を治療または予防するため、さらに間葉系細胞から
軟骨細胞への分化を誘導するためのＡＮＧＰＴＬ３ペプチド組成物ならびにペプチド組成
物の使用について記載している。本発明者らは、野生型ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、プ
ロテアーゼの切断（clipping）を受けやすく、不安定であることがわかり、この影響を軽
減する配列バリアント（sequence variant）を特定した。それにより、本発明は、軟骨を
修復するための改善されたペプチド組成物を提供する。特に、野生型ＡＮＧＰＴＬ３ポリ
ペプチドと比較した場合にプロテアーゼ抵抗性が増加した、本発明に従って改変されたＡ
ＮＧＰＴＬ３ペプチドが提供される。関節、軟骨組織もしくは軟骨に隣接する組織（cart
ilage proximal tissue）または全身的に本発明のポリペプチドを投与することによって
関節炎もしくは関節傷害を予防または改善するＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドの投与のため
の組成物および方法も提供される。さらに、本発明は、軟骨細胞への間葉系幹細胞の分化
の誘導ための組成物および方法を提供する。

定義
「プロテアーゼ抵抗性」という用語は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドを
対応する非改変の野生型ポリペプチドよりもトリプシン様プロテアーゼによる切断を受け
にくくさせる改変を含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、プロテアーゼ抵
抗性ポリペプチドは、未変性の野生型ペプチド配列と比較して、ＲまたはＫ残基にアミノ
酸置換があるＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドである。

「ＡＮＧＰＴＬ３」とは、アンジオポエチンタンパク質ファミリーメンバーを指す。Ａ
ＮＧＰＴＬ３のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５５３１０．１）は配列
番号１に記載されており、さらに、その対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号２と
して示されている（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ０１４４９５．２、ＡＮＧＰＴＬ３コード
配列は、配列番号２のｎｔ５２−１４３４を含む）。「ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド」と
は、自然発生的に発現されるポリペプチドを指す。本開示の目的に対して、アミノ酸の番
号付けは、一般に完全長野生型ヒトＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド配列（配列番号１）を参
照して決定される。よって、本発明のポリペプチドが完全長ＡＮＧＰＴＬ３のＣ末端部分
のみを含むが、Ｎ末端部分は含まない実施形態において、ペプチドが４６０未満のアミノ
酸長であっても、位置の番号付けは配列番号１に基づく。例えば、本発明のＡＮＧＰＴＬ
３ポリペプチドの４２３位の言及は、本発明のＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド自体が２００
アミノ酸長しかない可能性があったとしても、配列番号１の４２３位を指す。配列番号１
などの参照配列における位置「に対応する」対象の配列中のアミノ酸を特定する際、これ
は、例えば、デフォルトのＣＬＵＳＴＡＬアライメントパラメータまたはデフォルトのＢ
ＬＡＳＴ２アライメントパラメータを使用して配列を最適に整列させ、配列を比較するこ
とによって行われる。例えば、「配列番号１を参照して決定される」対象の配列の４２３
位または配列番号１の４２３位「に対応する」アミノ酸は、対象の配列が配列番号１と最
適に整列させられたときに配列番号１の４２３位と並ぶアミノ酸を意味する。

「ペプチド模倣物」および「模倣物」という用語は、天然に生じるまたは天然に生じな
いポリペプチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３）と実質的に同じ機能的特徴をもつが、（一般
に類似しているが）構造的特徴が異なる合成の化学的化合物を指す。ペプチドアナログは
、この分野において、鋳型ペプチドの特性と類似の特性をもつ非ペプチド活性化合物（例
えば、薬物）として一般的に使用されている。そのような非ペプチド化合物は、「ペプチ
ドの模倣物」または「ペプチド模倣物」と呼ばれる（Fauchere, J. Adv.Drug Res.15:29
(1986)；Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)；およびEvans et al. J. Med.Chem.
30:1229 (1987)）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチドの模倣物は、同
等のまたは向上した治療または予防効果を生じさせるために使用される場合もある。一般
に、ペプチド模倣物は、対象のポリペプチドに見出されるものなどの代表例のポリペプチ
ド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似して
いるが、例えば、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−
（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ_２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−および−ＣＨ_２ＳＯ
−からなる群から選択される結合によって任意に置換された１つまたは複数のペプチド結
合を有する。模倣物は、完全に合成、非天然のアミノ酸アナログからなる場合もあり、ま
たは部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に非天然のアミノ酸アナログのキメラ
分子であるかのいずれかである。模倣物はまた、置換が模倣物の構造および／または活性
を実質的に変えない限り、任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を含んでもよい。例えば
、模倣組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドの軟骨形成活性を発揮できれば本発明の範
囲内である。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中で同
義に使用され、アミノ酸残基の重合体を指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残
基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工化学的模倣物であるアミノ酸重合体ならびに天
然に生じるアミノ酸重合体および天然に生じないアミノ酸重合体に該当する。本発明のポ
リペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、軟骨形成活性を有するプロテアーゼ抵抗性Ａ
ＮＧＰＴＬ３ペプチド模倣物を含む。

「アミノ酸」という用語は、天然に生じるおよび合成のアミノ酸ならびに天然に生じる
アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に
生じるアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に改変されるそ
れらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−
ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造
、すなわち、水素と結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基を有する化合
物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルス
ルホニウムを指す。そのようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）ま
たは改変されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造を保
持している。天然にコードされるアミノ酸は、２０種の通常のアミノ酸（アラニン、アル
ギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリ
シン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、
プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）ならびにピロ
リシン、ピロリン−カルボキシ−リシンおよびセレノシステインである。

「保存的に改変されたバリアント」とは、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される
。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一もしくは本質的に
同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしな
い場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一
の核酸があらゆる所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣ
ＧおよびＧＣＵのすべてがアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコ
ドンによって特定される位置の全てにおいて、コードされるポリペプチドを変更すること
なく、コドンを上記の対応するコドンのいずれかに変えることができる。そのような核酸
変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレント変異（silent variation）」
である。ポリヌクレオチドによってコードされる本明細書中のすべてのポリペプチド配列
は、可能性のある核酸のサイレント変異をすべて包含する。当業者は、（通常はメチオニ
ンに対する唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常はトリプトファンに対する唯一のコドン
であるＴＧＧを除いて）核酸の各コドンは、変更されて、機能的に同一の分子をもたらす
ことができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサ
イレント変異のそれぞれが記載される配列のそれぞれに潜在的に含まれる。

当業者は、もとのコードされるアミノ酸配列を基準にして１つのアミノ酸もしくは小さ
な割合のアミノ酸を変更、付加もしくは欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまた
はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変更によりアミノ酸が化
学的に類似したアミノ酸により置換された「保存的に改変されたバリアント」および／ま
たはもとのタンパク質と同様の機能活性を有する構造的に類似したタンパク質をもたらす
ポリペプチド配列をもたらすことを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸をもたら
す保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。そのような保存的に改変された
バリアントは、本発明の多型バリアント、種間のホモログおよび対立遺伝子に追加され、
除外されない。

「保存的なアミノ酸置換」という用語は、かかる１つのグループのアミノ酸を同じグル
ープの異なるアミノ酸で（概念的にまたは別に）置換することを指す。置換の一例は、同
族の生物の対応するタンパク質間における正規化されたアミノ酸の変化の発生頻度の分析
に基づく（例えば、Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Struct
ure, Springer-Verlagを参照）。そのような分析によると、あるグループ内のアミノ酸同
士が互いに選択的に入れ替わり、その結果、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影
響が互いに最も類似している場合にアミノ酸のグループが定義され得る（例えば、Schulz
, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlagを参
照）。この様式で定義された一連のアミノ酸のグループの一例としては、以下のものが挙
げられる：（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる荷電したグ
ループ；（ｉｉ）Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる正に荷電したグループ；（ｉｉｉ
）ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負に荷電したグループ；（ｉｖ）Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴ
ｒｐからなる芳香族のグループ；（Ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環のグループ；
（ｖｉ）Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる大きな脂肪族の非極性のグループ；（ｖｉ
ｉ）ＭｅｔおよびＣｙｓからなるやや極性があるグループ；（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＰｒｏからなる小さな残基の
グループ；（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＣｙｓからなる脂肪族のグル
ープ；ならびに（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小さなヒドロキシ基のグループ。共有
する物理的特性に基づく保存的置換のその他の例は、以下のグループ内における置換であ
る：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（
Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ
）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、
トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighto
n, Proteins(1984)を参照）。

「配列同一性の割合」は、２つの最適に整列させられた配列を比較領域（comparison w
indow）について比較することによって決定され、２つの配列の最適なアライメントに対
する比較領域のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の部分は、付加または欠失を含
まない参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較した場合に付加または欠失（す
なわち、差）を含んでいてもよい。この割合は、両配列において同一の核酸塩基またはア
ミノ酸残基が生じている位置の数を求めて一致した位置の数を得、一致した位置の数を比
較領域の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性の割合を得ることによ
って算出される。

「同一の」またはパーセントの「同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペ
プチド配列の文脈において、同じ配列である２つ以上の配列または部分配列（subsequenc
e）を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してまたは手によるアライ
メントおよび目視による検証によって判定されるとおり、比較領域または指定領域につい
て比較し、最大一致するよう整列された場合、２つの配列が特定の割合の同じアミノ酸残
基またはヌクレオチド（すなわち、特定の領域についてまたは特定されない場合は、全配
列について９５％の同一性、任意に９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性）を
有するなら、２つの配列は「実質的に同一」である。本発明は、それぞれ、本明細書中で
例示されるポリペプチド（例えば、配列番号１１〜４２のいずれか）と実質的に同一のポ
リペプチドならびに以下に限定されるものではないが、関節炎または関節傷害を治療また
は予防するための使用を含むペプチドの使用を提供する。任意に、核酸について、同一性
は、少なくとも約１５０ヌクレオチド長である領域、またはより好ましくは３００から４
５０もしくは６００ヌクレオチド長以上である領域、または完全長の参照配列に存在する
。アミノ酸配列について、任意に、同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長である領域、
またはより好ましくは１００から１５０もしくは２００アミノ酸長以上である領域または
完全長の参照配列にわたって存在する。

配列比較について、一般に１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割
を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュー
タに入力され、必要に応じて部分配列座標（subsequence coordinate）が指定され、配列
アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが
使用されてもよく、または代替的なパラメータが指定されてもよい。配列比較アルゴリズ
ムは、その後、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセン
ト配列同一性を算出する。

「比較領域」とは、本明細書中で使用される場合、２つの配列が最適に整列させられた
後に、同数の連続的な位置の参照配列と配列が比較されてもよい、５０から６００、一般
には約７５から約２００、より一般には約１００から約１５０からなる群から選択される
、連続的な位置の数の任意の１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列の
アライメントの方法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラ
イメントは、例えば、Smith and Waterman(1970)Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性
アルゴリズム（local homology algorithm）、Needleman and Wunsch(1970)J. Mol. Biol
. 48:443の相同性アライメントアルゴリズム（homology alignment algorithm）、Pearso
n and Lipman(1988)Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法（search for
similarity method）、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡお
よびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施または手によるアライメントおよび目視に
よる検証（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 s
upplement)を参照）によって行うことができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの２つの例は
、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これは、それぞれAltschul e
t al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al., (1990)J. Mol. B
iol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎを通じて公的に利用できる。このアルゴリズムは、問い合わせ配列中の長さＷ
の短いワードを特定することによって最初に高スコア配列ペア（high scoring sequence
pair）（ＨＳＰ）を特定することを含み、これは、データベースの配列中の同じ長さのワ
ードと整列させられたときに、一致するかまたはある正値の閾値スコアＴを満たすかのい
ずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と
称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照）。これらの最初の隣接ワードヒットは、そ
れを含むさらに長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシード（seed）として
働く。累積アライメントスコアが増加可能な限り、ワードヒットはそれぞれ配列に沿って
両方向に伸長される。ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致残基のペアに対す
るリワードスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルテ
ィスコア（penalty score）；常に＜０）を使用して累積スコアが算出される。アミノ酸
配列に関して、累積スコアを算出するために、スコア行列が使用される。それぞれの方向
へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少した
；１つ以上の負のスコアの残基アライメントが積み重なることにより累積スコアがゼロ以
下になった；またはいずれかの配列の末端に達した場合に中止される。ＢＬＡＳＴアルゴ
リズムのパラメータＷ、ＴおよびＸがアライメントの感度および速さを決める。ＢＬＡＳ
ＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワードの長さ（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が
１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に
関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワードの長さが３および期待値（Ｅ）が１０、なら
びにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 89:10915を参照）アライメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ
＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Karlin
and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照）。ＢＬＡＳＴ
アルゴリズムによって提供される類似性の基準の１つは最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり
、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって起こる確率の
指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２
未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核
酸が参照配列と類似していると見なされる。

「単離される」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタ
ンパク質が、精製されて、本来の状態では関連しているその他の細胞の構成要素を本質的
に含まないことを指す。それは、均質またはほぼ均質な状態である場合が多い。それは、
乾燥または水溶液のいずれかであってもよい。純度および均質性は、一般に当該技術分野
において知られており、使用されている分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを使用して決定されてもよい。調製物中に最
も多く存在する種類のタンパク質が実質的に精製される。「精製される」という用語は、
一部の実施形態においては、タンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１本のバンドを生じさ
せることを指す。一般に、これは、タンパク質が少なくとも８５％純粋、より好ましくは
少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。

「ヒアルロン酸」という用語は、本明細書中では、ヒアルロン酸のエステル、ヒアルロ
ン酸の塩を含むヒアルロン酸の誘導体を含んで使用され、ヒアルロナンという用語も含む
。この呼称は、低および高分子量の両形態のヒアルロナンおよび架橋ヒアルロナンまたは
ヒラン（hylan）も含む。そのようなヒアルロナンの例は、Ｓｙｎｖｉｓｃ（商標）（Ｇ
ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、ＯＲＴＨＯＶＩＳＣ
（商標）（Ａｎｉｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ウォーバーン、マサチューセッツ州
）、ＨＹＡＬＧＡＮ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｉｎｃ．、モール
バーン、ペンシルベニア州）、およびＰｒｏＶｉｓｃ（Ａｌｃｏｎ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
である。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ、
ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを規定しない限り、複数
の指示対象を含む。

プロテアーゼ抵抗性アンジオポエチン様ポリペプチド３
アンジオポエチン様３は、分泌因子のアンジオポエチン様ファミリーのメンバーである
。アンジオポエチン様３は、大部分が肝臓で発現し、シグナルペプチド、Ｎ末端のコイル
ドコイルドメイン（ＣＣＤ）およびＣ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインから
なるアンジオポエチンの特徴的構造を有する。アンジオポエチン様３は、αＶ／β３イン
テグリンに結合することが示され、ＦＢＮ様ドメイン単独で内皮細胞接着およびインビボ
における血管形成を誘導するのに十分であった（Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277
: 17281-17290, 2002）。内在性ＡＮＧＰＴＬ３は、一般にインビボにおいてアミノ末端
フラグメントとカルボキシ末端フラグメントに切断される。上で概要が示され、本明細書
においてさらに記載されるとおり、本発明は、軟骨形成活性を有するさまざまなプロテア
ーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の使用を意図する。

一部の実施形態において、単離ポリペプチドは、表１の配列のいずれか１つから選択さ
れるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％
もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、本ポリペプチドは、配列番号１を
参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含むか
、または本ポリペプチドは４２３位に欠失を有する。本発明のポリペプチドは、軟骨形成
活性がある。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、
配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３
７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番
号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のいずれか１
つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９
７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、本ポリペプチドは、
配列番号１を参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミ
ノ酸を含むか、または本ポリペプチドは４２３位に欠失を有し、本ポリペプチドは、軟骨
形成活性がある。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４、配列番号１５、配
列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１
、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号
２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列
番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のいずれか１つから選択さ
れるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％
もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、本ポリペプチドは、配列番号１を
参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含み、
本ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。

一部の実施形態において、単離ポリペプチドは、表１の配列のいずれか１つから選択さ
れるアミノ酸配列を含み、本ポリペプチドは、配列番号１を参照して決定される４２３位
がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含むか、または本ポリペプチドは４
２３位に欠失を有し、本ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。一部の実施形態において
、ポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番
号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配
列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８
、配列番号６９、または配列番号７０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み
、本ポリペプチドは、配列番号１を参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極
性アミノ酸であるアミノ酸を含むか、または本ポリペプチドは４２３位に欠失を有し、本
ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１
４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配
列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９
、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のい
ずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含み、本ポリペプチドは、配列番号１を参照し
て決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含み、本ポリ
ペプチドは、軟骨形成活性がある。

一部の実施形態において、単離ポリペプチドは、表１の配列のいずれか１つから選択さ
れるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％
もしくは９９％の同一性を有し、本ポリペプチドは、配列番号１を参照して決定される４
２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含むか、または本ポリペプチ
ドは４２３位に欠失を有し、本ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。一部の実施形態に
おいて、ポリペプチドは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３
９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番
号６８、配列番号６９、または配列番号７０のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列
と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の
同一性を有し、本ポリペプチドは、配列番号１を参照して決定される４２３位がＫもしく
はＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含むか、または本ポリペプチドは４２３位に欠
失を有し、本ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。別の実施形態では、ポリペプチドは
、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号
１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列
番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、
配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列
番号６４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性または
少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、本ポリペプチドは、
配列番号１を参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミ
ノ酸を含み、本ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。

一部の実施形態において、単離ポリペプチドは、表１の配列のいずれか１つから選択さ
れるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３０、配
列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６
、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号
６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０
のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列である。別の実施形態では、ポリペプチドは
、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号
２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列
番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、
配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のいずれか１つから選
択されるアミノ酸配列である。

本発明の改変ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは、ポリペプチドをプロテアーゼ抵抗性にす
るためにポリペプチドのＣ末端部分に少なくとも１つの置換を有する。置換は、Ｒまたは
Ｋ残基にあり、それにより、例えば、トリプシン様プロテアーゼに対するポリペプチドの
抵抗性が高まる。任意のアミノ酸が、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペ
プチドのＲまたはＫを置換してもよい。一部の実施形態において、置換基は、極性アミノ
酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＹである。一部の実施形態において、置換基
は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｓまたは
Ｑである。一部の実施形態において、置換基は、Ｑである。一部の実施形態において、置
換基は、Ｓである。一部の実施形態において、プロテアーゼ抵抗性ペプチドは、配列番号
１を参照して４２３位にＫまたはＲ以外のアミノ酸を有する。一部の実施形態において、
本発明のポリペプチドは、４２３位に極性アミノ酸であるアミノ酸を含む。例えば、４２
３位のアミノ酸は、ＱもしくはＳまたは別の極性アミノ酸であってもよい。特定の実施形
態において、本発明のポリペプチドは、４２３位にＱを有する。他の実施形態において、
本発明のポリペプチドは、４２３位にＳを有する。一部の実施形態において、４２３にお
ける置換に加えて、プロテアーゼ抵抗性ペプチドは、配列番号１のＣ末端またはそのバリ
アントに別のＲまたはＫの置換を有し、置換基は、ＲまたはＫ以外の極性アミノ酸である
。一部の実施形態において、配列番号１を参照して決定される４２３位における置換基は
、ＱまたはＳである。さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号
１を参照して決定される４２３位に欠失を有する。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、２５０以下のアミノ酸長であり、
配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２
４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番
号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配
列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番
号７０のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、本発明は、完全長でプロテアーゼ抵抗性の軟骨形成ＡＮＧＰ
ＴＬ３タンパク質の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ
３配列のＣ末端部分またはその軟骨形成バリアントを含むプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴ
Ｌ３タンパク質を提供する。特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、未
変性タンパク質のアミノ末端が欠如している。一部の実施形態において、本発明のプロテ
アーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、ＣＣＤドメインが欠如しているかつ／または
大幅にＣＣＤ活性が欠如している。このように、一部の実施形態において、本発明のプロ
テアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質カルボキシ
末端ドメインのフラグメント（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、２２０また
は２１５個の連続的なアミノ酸）を少なくとも含むか、またはヒトカルボキシ末端ＡＮＧ
ＰＴＬ３タンパク質配列と実質的に同一の配列を含む。ただし、本ポリペプチドおよびそ
のバリアントは、軟骨形成活性を保持する。一部の実施形態において、本発明のプロテア
ーゼ抵抗性ポリペプチドは、Ｃ末端配列の少なくとも一部が欠如しており、例えば、配列
番号１のＣ末端から５、１０、１５または２０個のアミノ酸が欠如している（すなわち、
配列番号１の４５６−４６０、４５１−４６０、４４６−４６０もしくは４４１−４６０
が欠如している）。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは
、以下のアミノ酸領域に対応する連続的なアミノ酸を含む：配列番号１のアミノ酸２４１
−４５５または２４１−４６０；配列番号１のアミノ酸２４２−４５５または２４２−４
６０；配列番号１のアミノ酸２３３−４５５または２３３−４６０；配列番号１のアミノ
酸２２８−４５５または２２８−４６０、配列番号１のアミノ酸２２６−４５５もしくは
２２６−２６０またはアミノ酸２２５−４５５もしくは２２５−２６０。その中において
、アミノ酸がＲまたはＫを置換しているか、または１つの残基が欠失している。一部の実
施形態において、置換は、配列番号１を参照して決定される４２３位にある。一部の実施
形態において、欠失は、配列番号１を参照して決定される４２３位にある。一部の実施形
態において、プロテアーゼ抵抗性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸領域２０７−４
５５または２０７−４６０に対応する連続的なアミノ酸を含み、その中において、アミノ
酸がＲもしくはＫを置換しているか、または１つの残基が欠失している。一部の実施形態
において、置換または欠失は４２３位にある。一部の実施形態において、置換基は、極性
アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＹである。一部の実施形態において、
置換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｓ
またはＱである。一部の実施形態において、置換基は、Ｑである。特定の実施形態におい
て、配列番号１に対して４２３位に欠失が含まれる。

本発明は、プロテアーゼ抵抗性ポリペプチドをさらに提供する。ただし、本ポリペプチ
ドは、配列番号１のアミノ酸２４０−４５４、配列番号１のアミノ酸２４１−４５５また
は配列番号１のアミノ酸２４２−４５５と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９
６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、配列番号１の４２３位に対応する
アミノ酸に置換または欠失があるアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸はＲではなく、本ポ
リペプチドは、軟骨形成活性がある。他の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番
号１のアミノ酸２４０−４５４、配列番号１のアミノ酸２４１−４５５または配列番号１
のアミノ酸２４２−４５５を含み、それぞれのポリペプチドは配列番号１の４２３位に対
応するアミノ酸に置換または欠失があり、置換アミノ酸はＱまたはＳである。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは
、配列番号１のアミノ酸２４２−４５５または２４２−４６０；配列番号１のアミノ酸２
４１−４５５または２４１−４６０；配列番号１のアミノ酸２３３−４５５もしくは２３
３−４６０；配列番号１のアミノ酸２２８−４５５もしくは２２８−４６０、配列番号１
のアミノ酸２２６−４５５もしくは２２６−２６０または配列番号１のアミノ酸２２５−
４５５もしくは２２５−２６０と少なくとも９５％、または少なくとも９６％、少なくと
も９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を
含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換しているか、またはＲもしくはＫ
が欠失している。一部の実施形態において、置換または欠失は４２３位にある。一部の実
施形態において、置換基は、極性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＹで
ある。一部の実施形態において、置換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一部の
実施形態において、置換基は、ＳまたはＱである。一部の実施形態において、置換基はＱ
である。特定の実施形態において、配列番号１に対して４２３位の残基が欠失している。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは
２５０または２４０以下のアミノ酸長であり、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２
０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番
号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配
列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８
、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号
６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列
番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一
部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは、２
３０または２２５以下のアミノ酸長であり、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６
、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３７、配列番号
３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６２、配列番号６３、配列
番号６４、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、
Ｃ末端イヌ、ウシまたはウマＡＮＧＰＴＬ３タンパク質配列と少なくとも９５％の同一性
または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク
質は、未変性のイヌ（配列番号４）、ウマ（配列番号５）もしくはウシ（配列番号６）Ａ
ＮＧＰＴＬ３タンパク質配列または未変性のイヌ、ウシもしくはウマＡＮＧＰＴＬ３タン
パク質配列と実質的に同一の配列の少なくともフラグメント（例えば、少なくとも１００
、１５０、２００、２１５個の連続的なアミノ酸）を含み、本ポリペプチドは、配列番号
１を参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含
むか、または本ポリペプチドは４２３位に欠失を有し、本ポリペプチドは、軟骨形成活性
がある。一部の実施形態において、単離ポリペプチドは、配列番号４２または配列番号４
３と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％
の同一性を有するアミノ酸配列を含み、本ポリペプチドは、配列番号１を参照して決定さ
れる４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含むか、または本ポリ
ペプチドは４２３位に欠失を有し、本ポリペプチドは、軟骨形成活性がある。一部の実施
形態において、ポリペプチドは、配列番号４２または配列番号４３と少なくとも９５％の
同一性または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、本ポリ
ペプチドは、配列番号１を参照して決定される４２３位がＫもしくはＲ以外の極性アミノ
酸であるアミノ酸を含むか、または本ポリペプチドは４２３位に欠失を有し、本ポリペプ
チドは、軟骨形成活性がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４２
または配列番号４３を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４２または配
列番号４３である。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３は、配列番号４
のアミノ酸２３２−４５４、配列番号４のアミノ酸２４０−４５４、配列番号４のアミノ
酸２２７−４５４または配列番号４のアミノ酸２２４−４５４と少なくとも９５％または
少なくとも９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換しているか、またはＲもしく
はＫが欠失している。一部の実施形態において、置換または欠失は、配列番号１の４２３
位に対応する配列番号４の４２２位にある。一部の実施形態において、置換基は、極性ア
ミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＹである。一部の実施形態において、置
換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｓま
たはＱである。一部の実施形態において、置換基はＱである。一部の実施形態において、
アミノ酸欠失は、配列番号４の４２２位にある。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３は、配列番号５
のアミノ酸２３３−４５５、配列番号５のアミノ酸２４１−４５５、配列番号５のアミノ
酸２２８−４５５または配列番号５のアミノ酸２２５−４５５と少なくとも９５％または
少なくとも９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換しているか、またはＲもしく
はＫが欠失している。一部の実施形態において、置換または欠失は、配列番号１の４２３
位に対応する配列番号５の４２３位にある。一部の実施形態において、置換基は、極性ア
ミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＹである。一部の実施形態において、置
換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｓま
たはＱである。一部の実施形態において、置換基はＱである。一部の実施形態において、
アミノ酸欠失は、配列番号５の４２３位にある。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３は、配列番号６
のアミノ酸２３３−４５５、配列番号６のアミノ酸２４１−４５５、配列番号６のアミノ
酸２２８−４５５または配列番号６のアミノ酸２２５−４５５と少なくとも９５％または
少なくとも９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換しているか、またはＲもしく
はＫが欠失している。一部の実施形態において、置換または欠失は、配列番号１の４２３
位に対応する配列番号６の４２２位にある。一部の実施形態において、置換基は、極性ア
ミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＹである。一部の実施形態において、置
換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｓま
たはＱである。一部の実施形態において、置換基はＱである。一部の実施形態において、
アミノ酸欠失は、配列番号６の４２２位にある。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは
、配列番号４のアミノ酸２４０−４５４；配列番号４のアミノ酸２３２−４５４；配列番
号４のアミノ酸２２７−４５４または配列番号４のアミノ酸２２４−４５４のアミノ酸領
域に対応する連続的なアミノ酸を含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換
しているか、またはＲもしくはＫが欠失している。一部の実施形態において、置換または
欠失は、（配列番号１を参照して決定される４２３位である）配列番号４の４２２位にあ
る。一部の実施形態において、置換基は、極性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、
ＡまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹで
ある。一部の実施形態において、置換基は、ＳまたはＱである。一部の実施形態において
、置換基は、Ｑである。一部の実施形態において、アミノ酸欠失は、配列番号４の４２２
位にある。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは
、配列番号５のアミノ酸２４１−４５５；配列番号５のアミノ酸２３３−４５５；配列番
号５のアミノ酸２２８−４５５または配列番号５のアミノ酸２２５−４５５のアミノ酸領
域に対応する連続的なアミノ酸を含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換
しているか、またはＲもしくはＫが欠失している。一部の実施形態において、置換または
欠失は、（配列番号１を参照して決定される４２３位に対応する）４２３位にある。一部
の実施形態において、置換基は、極性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ａまたは
Ｙである。一部の実施形態において、置換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹである。一
部の実施形態において、置換基は、ＳまたはＱである。一部の実施形態において、置換基
は、Ｑである。一部の実施形態において、アミノ酸欠失は、配列番号５の４２３位にある
。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは
、配列番号６のアミノ酸２４１−４５５；配列番号６のアミノ酸２３３−４５５；配列番
号６のアミノ酸２２８−４５５または配列番号６のアミノ酸２２５−４５５のアミノ酸領
域に対応する連続的なアミノ酸を含み、その中において、アミノ酸がＲもしくはＫを置換
しているか、またはＲもしくはＫが欠失している。一部の実施形態において、置換または
欠失は、（配列番号１を参照して決定される４２３位である）配列番号６の４２２位にあ
る。一部の実施形態において、置換基は、極性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、
ＡまたはＹである。一部の実施形態において、置換基は、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＹで
ある。一部の実施形態において、置換基は、ＳまたはＱである。一部の実施形態において
、置換基は、Ｑである。一部の実施形態において、配列番号６の４２２位に欠失がある。

上記のとおり本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、上記の領域に隣接する未変性のＡ
ＮＧＰＴＬ３タンパク質配列を含んでもよい。あるいは、一部の実施形態において、本発
明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、未変性でないＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の隣接配列を
含んでもよい。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の軟骨形成活性部分は、１つまたは複
数の融合パートナーおよび／または異種アミノ酸と融合して融合タンパク質を形成しても
よい。融合パートナー配列としては、これらに限定されるものではないが、アミノ酸タグ
、Ｌ型でない（例えば、Ｄ−）アミノ酸もしくは生体内半減期を延長するためのその他の
アミノ酸模倣物および／またはプロテアーゼ抵抗性、ターゲティング配列もしくはその他
の配列が挙げられる。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ペグ化されている。一部の実施形
態において、本発明のポリペプチドは、異種ペプチドと融合している。特定の実施形態に
おいて、ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン重鎖定常領域
（Ｆｃ）、ポリヒスチジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキ
シン、プロテインＡ、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）または前述の
異種ポリペプチドのいずれかのフラグメントのいずれか１つと融合している。特定の実施
形態において、異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端において融合し
ている。さらにまたは代替の実施形態において、異種ポリペプチドは、本発明のポリペプ
チドのカルボキシ末端において融合している。

本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、軟骨形成活性を有し、プロテアーゼ抵抗性であ
る。本明細書中で定義されるとおり、軟骨形成または軟骨形成活性は、ＭＳＣからの軟骨
細胞の発生を指す。軟骨形成活性の指標としては、これらに限定されるものではないが、
軟骨基質の産生が挙げられる。軟骨基質の産生は、例えば、Ｓｏｘ９などのさまざまなマ
ーカー、ＩＩ型コラーゲンまたはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生によって評価され
てもよい。一部の実施形態において、ＧＡＧ産生が、軟骨基質の産生についてのマーカー
として測定される。一部の実施形態において、軟骨に特異的なタンパク質の発現をともな
うＧＡＧ産生の３倍の増加は、明確な軟骨基質の産生を示す。

ポリペプチドは、トリプシンなどのセリンプロテアーゼによる切断を測定する任意の既
知のアッセイを使用してプロテアーゼ抵抗性について評価されてもよい。一部の実施形態
において、タンパク質分解のされやすさを評価するために利用されるプロテアーゼはセリ
ンプロテアーゼトリプシンである。ポリペプチドは、その野生型対応物と比較して、トリ
プシンに対する感受性が低下していれば、プロテアーゼ抵抗性であると考えられる。アッ
セイの例は、ある時間にわたってポリペプチドがトリプシンに曝露されたときに生成され
る切断産物の量を対応する未変性のヒトペプチドと比較して測定することである。切断は
、任意の既知のアッセイ、例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥまたはＬＣＭＳを使用して測定され
てもよい。実例となるアッセイは、実施例のセクションに示す。

実例となるアッセイにおいて、トリプシン分解（trypsinolysis）による限定加水分解
（limited proteolysis）は、１０ｎｇの評価対象のタンパク質を質量比８０００：１（
タンパク質：トリプシン）でトリプシンと室温で１時間インキュベートすることによって
行われる。トリプシン分解反応は、その後、酢酸を添加して反応をｐＨ３．０にすること
によってクエンチすることができる。クエンチされたサンプルは、その後、例えば、４〜
１２％のＴｒｉｓ−Ｂｉｓゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、分析されてト
リプシンの切断によって生成されるフラグメントの出現よって切断されるものから切断に
抵抗性のタンパク質を特定する。プロテアーゼ抵抗性ポリペプチドでは、それらの野生型
対応物と比較して切断産物がないか、または減少している。

一部の実施形態において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは、少なくとも１つの
天然にコードされないアミノ酸（non-naturally encoded amino acid）を含むことになる
。一部の実施形態において、ポリペプチドは、１、２、３、４個以上の非天然アミノ酸を
含む。天然に生じないアミノ酸を作製する方法およびそれをタンパク質に導入する方法は
知られている。例えば、米国特許第７，０８３，９７０号および同第７，５２４，６４７
号を参照。１つまたは複数の所望の非天然アミノ酸を含むタンパク質を作製するのに適し
た直交翻訳系（orthogonal translation system）の生成についての一般原理は当該技術
分野において既知であり、それは、直交翻訳系を生成するための一般的な方法である。例
えば、国際公開第ＷＯ２００２／０８６０７５号、名称「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯ
ＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮ
ＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ」
；ＷＯ２００２／０８５９２３、名称「ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ」；ＷＯ２００４／０９４５９３、
名称「ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ
」；２００４年７月７日に出願されたＷＯ２００５／０１９４１５；２００４年７月７日
に出願されたＷＯ２００５／００７８７０；２００４年７月７日に出願されたＷＯ２００
５／００７６２４；２００５年１０月２７日に出願されたＷＯ２００６／１１０１８２、
名称「ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ
ＴＨＥ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩ
ＮＯ ＡＣＩＤＳ」および２００７年３月７日に出願されたＷＯ２００７／１０３４９０
、名称「ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧ
ＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＩＮ ＥＵＢＡＣＴＥＲＩ
ＡＬ ＨＯＳＴ ＣＥＬＬＳ」を参照。非天然アミノ酸を組み込む直交翻訳系の解説なら
びにそれらの生成および使用方法については、Wang and Schultz, (2005) "Expanding th
e Genetic Code." Angewandte Chemie Int Ed 44: 34-66；Xie and Schultz, (2005) "An
Expanding Genetic Code." Methods 36: 227-238；Xie and Schultz, (2005) "Adding A
mino Acids to the Genetic Repertoire." Curr Opinion in Chemical Biology 9: 548-5
54；およびWang, et al., (2006) "Expanding the Genetic Code." Annu Rev Biophys Bi
omol Struct 35: 225-249；Deiters, et al, (2005) "In vivo incorporation of an alk
yne into proteins in Escherichia coli." Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
15:1521-1524；Chin, et al, (2002) "Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the G
enetic Code of Escherichia coli." J Am Chem Soc 124: 9026-9027；ならびに２００５
年９月２０日に出願された国際公開第ＷＯ２００６／０３４３３２号も参照。追加の詳細
については、米国特許第７，０４５，３３７号；同第７，０８３，９７０号；同第７，２
３８，５１０号；同第７，１２９，３３３号；同第７，２６２，０４０号；同第７，１８
３，０８２号；同第７，１９９，２２２号；および同第７，２１７，８０９号で見つけら
れる。

「天然にコードされないアミノ酸」とは、通常のアミノ酸またはピロリシン、ピロリン
−カルボキシ−リシンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。
「天然にコードされないアミノ酸」という用語と同義に使用されることもあるその他の用
語は、「非天然型アミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「天然に生じないアミノ酸」ならび
にそれらのさまざまにハイフンでつながれたおよびハイフンでつながれていない形である
。「天然にコードされないアミノ酸」という用語は、（以下に限定されるものではないが
、２０種の通常のアミノ酸またはピロリシン、ピロリン−カルボキシ−リシンおよびセレ
ノシステインを含む）以下に限定されるものではないが、天然にコードされるアミノ酸の
改変によって生じる（例えば、翻訳後改変）アミノ酸も含むが、それ自体は、翻訳複合体
によって成長するポリペプチド鎖に天然に組み込まれない。そのような天然に生じないア
ミノ酸の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル
−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニンおよびＯ−ホスホチロシン
が挙げられる。

天然にコードされないアミノ酸は、一般に２０種の天然アミノ酸に使用されるもの以外
の任意の置換側鎖を有する任意の構造である。本発明の天然にコードされないアミノ酸は
、一般に側鎖の構造のみが天然アミノ酸とは異なるため、天然にコードされないアミノ酸
は、以下に限定されるものではないが、天然にコードされるか、または天然にコードされ
ないものを含む他のアミノ酸と、それらが天然に生じるポリペプチドにおいて形成される
同じ様式でアミド結合を形成する。ただし、天然にコードされないアミノ酸は、それらを
天然アミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシ
ル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド
、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボラート（
borate）、ボロナート（boronate）、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン
、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基もしくは同種
のものまたはそれらの任意の組み合わせを任意に含む。本発明に使用するのに適している
場合もある対象のその他の天然に生じないアミノ酸としては、これらに限定されるもので
はないが、光で活性化され得るクロスリンカーを含むアミノ酸、スピン標識化アミノ酸、
蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規の官能基を
含むアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光活
性型（photocaged）および／または光異性化可能な（photoisomerizable）アミノ酸、ビ
オチンまたはビオチンアナログを含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ
酸、その他の炭水化物改変アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたは
ポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能および／または光
により切断可能なアミノ酸、以下に限定されるものではないが、約５個もしくは約１０個
を超える炭素を含む以下に限定されるものではないがポリエーテルまたは長鎖炭化水素を
などの天然アミノ酸と比較した場合に延長された側鎖をもつアミノ酸、炭素連結型糖含有
アミノ酸（carbon-linked sugar-containing amino acid）、酸化還元活性のあるアミノ
酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つまたは複数の毒性部分を含むアミノ酸が挙
げられる。

本発明に使用するのに適している場合もあり、水溶性重合体との反応に有用な例となる
天然にコードされないアミノ酸としては、これらに限定されるものではないが、カルボニ
ル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジドおよびアルキン反
応基をもつものが挙げられる。一部の実施形態において、天然にコードされないアミノ酸
は、糖部分を含む。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニ
ル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ
−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラ
ギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例とし
ては、アミノ酸と糖の間の天然に生じるＮ−またはＯ−結合が、一般的に自然界では見ら
れない共有結合によって置換されている例も含まれ、以下に限定されるものではないが、
アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含む。そのようなアミノ酸の例は、２
−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースおよび同種のものなどの一般的に天
然に生じるタンパク質には見られない糖も含む。

例えば、生体内半減期を延長するために、任意に本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質（
例えば、ポリペプチド鎖またはＮもしくはＣ末端のいずれかの中）に組み込まれ得る別の
種類の改変は、ペグ化または長鎖ポリエチレングリコール重合体（ＰＥＧ）の組み込みで
ある。例えば、尿中への急速な濾過を防ぐために、ＰＥＧまたはＰＥＧの長鎖重合体を導
入することにより、本ポリペプチドの有効分子量を増加させる。一部の実施形態において
、ＡＮＧＰＴＬ３配列のリシン残基を、直接的にまたはリンカーを介してＰＥＧと結合さ
せる。そのようなリンカーは、例えば、適切に改変されたＰＥＧ鎖と結合させるためのチ
オール官能基を含むＧｌｕ残基またはアシル残基であってもよい。ＰＥＧ鎖を導入するた
めの代替的な方法は、まずＣｙｓ残基をＣ末端またはＡｒｇもしくはＬｙｓ残基と置換す
るなど溶媒曝露残基（solvent exposed residue）に導入することである。このＣｙｓ残
基は、その後、部位特異的に例えば、マレイミド官能基を含むＰＥＧ鎖と付着させられる
。ＰＥＧまたはＰＥＧの長鎖重合体を組み込むための方法は、当該技術分野において周知
であり（例えば、Veronese, F. M., et al., Drug Disc. Today 10: 1451-8 (2005)；Gre
enwald, R. B., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 217-50(2003)；Roberts, M. J., e
t al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 459-76 (2002)に記載されている）、これの内容を
参照によって本明細書中に組み込んだものとする。当該技術分野において知られている重
合体の結合のその他の方法が本発明に使用されてもよい。一部の実施形態において、ポリ
（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）が、重合体の本発明
のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質との複合物として導入される（例えば、ＷＯ２００８／０９
８９３０；Lewis, et al., Bioconjug Chem., 19: 2144-55 (2008)を参照）。一部の実施
形態において、ホスホリルコリン含有重合体のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質との複合物が本
発明に使用されてもよい。当業者は、その他の生体適合性重合体の複合物を利用できるこ
とを容易に認識するであろう。

（上記のとおりの）非天然型アミノ酸を組み込むことによりＰＥＧまたはＰＥＧ重合体
を組み込むための、さらに最近報告された代替的なアプローチが本ポリペプチドを用いて
行われてもよい。このアプローチは、進化型ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼペア（evol
ved tRNA/tRNA synthetase pair）を利用し、アンバーサプレッサーコドンによって発現
プラスミドにコードされる（Deiters, A, et al. (2004). Bio-org. Med. Chem. Lett. 1
4, 5743-5）。例えば、ｐ−アジドフェニルアラニンが本ポリペプチドに組み込まれ、そ
の後、「ヒュスゲン［３＋２］環化付加」として知られる有機反応を容易にするために還
元剤および銅イオンの存在下でアセチレン部分を有するＰＥＧ重合体と反応させられても
よい。

特定の実施形態において、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変えるためのＡＮ
ＧＰＴＬ３タンパク質の特異的な変異も意図する。そのような変異は、以下に限定される
ものではないが、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシル化部位などの１つまたは複数の
グリコシル化部位を導入または除去するために選択されてもよい。特定の実施形態におい
て、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と比
較して未変化のグリコシル化部位およびパターンを有する。特定の実施形態において、Ａ
ＮＧＰＴＬ３タンパク質のバリアントとしては、グリコシル化部位の数および／または種
類が、天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と比較して変更されているグリコシル化バ
リアントが挙げられる。特定の実施形態において、ポリペプチドのバリアントは、未変性
のポリペプチドと比較して多いかまたは少ない数のＮ−結合型グリコシル化部位を含む。
Ｎ−結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒに
よって特徴づけられ、Ｘと表わされるアミノ酸残基は、プロリンを除く任意のアミノ酸残
基であってもよい。この配列を作り出すためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合型炭水化
物鎖の新しい付加部位をもたらす可能性がある。あるいは、この配列を除去する置換は、
既存のＮ−結合型炭水化物鎖を取り除くことになる。特定の実施形態において、１つまた
は複数のＮ−結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に生じるもの）が除去され、１
つまたは複数の新しいＮ−結合型部位が作り出される、Ｎ−結合型炭水化物鎖の再構成が
もたらされる。

例となるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質バリアントとしては、１つまたは複数のシステイン
残基が、天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のアミノ酸配列から欠失しているか、ま
たは天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のアミノ酸配列に対して別のアミノ酸（例え
ば、セリン）で置換されているシステインバリアントが挙げられる。特定の実施形態にお
いて、システインバリアントは、不溶性の封入体の単離後などＡＮＧＰＴＬ３タンパク質
が生物学的に活性な立体構造にリフォールディングされなければならない場合に有用な場
合もある。特定の実施形態において、システインバリアントは、未変性のポリペプチドよ
りもシステイン残基が少ない。特定の実施形態において、システインバリアントは、対に
なっていないシステインにより生じる相互作用を最小限にするために偶数のシステイン残
基を有する。

一部の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の機能的バリアントまたは改変形
態は、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の融合タンパク質および１つまたは複数の融合
ドメインを含む。融合ドメインの周知の例としては、これらに限定されるものではないが
、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チ
オレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マ
ルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）および／またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げ
られる。融合ドメインまたはそのフラグメントは、所望の特性を付与するために選択され
てもよい。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融
合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製のために、グルタチオン−、アミラー
ゼ−、およびニッケル−またはコバルト結合樹脂などのアフィニティークロマトグラフィ
ー用の関連するマトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、「キット
」の形態で入手可能であり、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよび（
ＨｉＳ_６）融合パートナーに対して有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉ
ａｇｅｎ）である。別の例として、融合ドメインは、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の検出を
容易にするために選択されてもよい。そのような検出ドメインの例としては、各種蛍光タ
ンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに通常、特異的な抗体が入手可能な短いペプチド配列
である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的なモノクローナル抗体が容易に入手でき
る周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン
（haemagglutinin）（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。ある場合には、融合ド
メインは、第Ｘａ因子またはトロンビンに対してなどのプロテアーゼ切断部位を有し、こ
れは、関連するプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、それにより、そこか
ら組換え型タンパク質を遊離させる。遊離されたタンパク質は、その後、後に続くクロマ
トグラフィー分離によって融合ドメインから単離されてもよい。特定の実施形態において
、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、インビボにおいてＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を安定化さ
せるドメイン（「安定化」ドメイン）と融合する。「安定化させること」とは、それが、
分解の低減、腎臓による除去の低減またはその他の薬物動態的効果によるか否かにかかわ
らず血中半減期を延長させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合物は、
広い範囲のタンパク質に対して望ましい薬物動態的特性を付与することが知られている。
同様に、ヒト血清アルブミンとの融合物は、望ましい特性を付与することができる。選択
可能な他の種類の融合ドメインとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメ
インおよび（所望どおり付加的な生物学的機能を付与する）機能的ドメインが挙げられる
。異種ペプチドが本発明のポリペプチドのアミノ末端および／または本発明のポリペプチ
ドのカルボキシ末端において融合するように融合物が構築されてもよい。

プロテアーゼ抵抗性アンジオポエチン様ポリペプチド３をコードする核酸
本発明はまた、本発明のプロテアーゼ抵抗性ポリペプチドをコードする核酸ならびにプ
ロテアーゼ抵抗性ポリペプチドの発現のための発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。
他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなら
びにそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。一部の
実施形態において、本ポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現のために最適化される
。一部の実施形態において、本発明は、ヒト患者の関節炎または関節傷害を改善または予
防する方法を提供し、この方法は、患者の関節に本発明のポリペプチドをコードする発現
ベクターを投与するステップを含み、その結果、本ポリペプチドの発現が患者の関節炎ま
たは関節傷害を改善または予防する。一部の実施形態において、患者は、関節炎または関
節傷害がある。一部の実施形態において、個人は、関節炎または関節傷害ではないがその
リスクがある。一部の実施形態において、関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または
自己免疫性関節炎である。

本発明のポリペプチドの発現には、組換え遺伝学の分野で定型化した技術が利用される
。本発明に使用する一般的な方法を開示している基礎テキストとしては、とりわけ当該技
術分野において既知のSambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 3rd edition；シリーズAusubel et al. eds. (2007 with updated through
2010) Current Protocols in Molecular Biologyが挙げられる。

発現には、当該技術分野において既知の任意の適切な宿主細胞を利用することができ、
例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、昆虫宿主細胞などである。
原核生物および真核生物の両方の発現系が広く利用可能である。一部の実施形態において
、発現系は、ＣＨＯ細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。一部の実施形態において
、核酸は、所望の宿主細胞における発現を容易にするためにコドンが最適化されてもよい
。

非ウイルスベクターおよび系としては、一般にタンパク質またはＲＮＡを発現するため
の発現カセットおよびヒト人工染色体を含むプラスミドならびにエピソームベクターが挙
げられる（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照）。例えば、哺
乳動物（例えば、ヒト）細胞における本発明のポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベ
クターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３． Ｉ／Ｈｉｓ、ｐ
ＥＢＶＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア
州）、ＭＰＳＶベクターならびに他のタンパク質を発現するための、当該技術分野におい
て既知の多数のその他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、これ
らに限定されるものではないが、アデノウイルスに基づくベクター、アデノ随伴ウイルス
、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタ
インバーウイルス、鳩痘ベクター、ワクチニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイ
ルス（ＳＦＶ）が挙げられる。

発現ベクターの選択は、ベクターが発現されるべき目的とする宿主細胞によって決まる
。一般に、発現ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能
可能に連結されるプロモーターおよびその他の制御配列（例えば、エンハンサー）を含む
。一部の実施形態において、誘導条件下以外で挿入配列が発現するのを防ぐために、誘導
性プロモーターが利用される。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌ
ａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーターまたは熱ショ
ックプロモーターが挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸の発現
を向上させるために、例えば、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結配列および
同種のものなどのその他の調節エレメントも組み込まれてよい。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、さらに分泌シグ
ナル配列をコードする配列を含んでもよく、それにより、宿主細胞からポリペプチドが分
泌される。そのような配列は、ベクターによって、またはベクターに存在するＡＮＧＰＴ
Ｌ３核酸の一部としてもたらされてもよい。

対象のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入するための方法は、細胞の宿主
の種類に応じて変わる。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは、一般的
に原核生物の細胞に対して利用される一方で、その他の細胞宿主に対してはリン酸カルシ
ウム処理またはエレクトロポレーションが使用されてもよい（一般にＳａｍｂｒｏｏｋら
、上記を参照）。その他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カル
シウム処理、リポソーム介在トランスフォーメーション、注入および微量注入、微粒子銃
法（ballistic method）、ビロソーム、免疫リポゾーム、ポリカチオン：核酸複合物、裸
のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合、薬剤によ
るＤＮＡの取り込み強化（agent-enhanced uptake of DNA）ならびにエクスビボ形質導入
が挙げられる。長期間にわたり高収率の組換え型タンパク質を産生させるために、安定し
た発現が望ましいことが多いであろう。例えば、本発明のポリペプチドを安定して発現す
る細胞株は、ウイルスの複製開始点または内在性の発現エレメントおよび選択可能なマー
カー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して作製されてもよい。

一部の実施形態において、本発明のプロテアーゼ抵抗性ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドを
コードする核酸は、関節関連の傷害または疾患の治療ために患者に送達されてもよい。そ
のような核酸の送達は、当該技術分野において既知の任意の手段を使用して達成されても
よいが、一般に冒された関節への直接注入を使用して行われる。一部の実施形態において
、ＤＮＡは、裸のＤＮＡとして、関節への直接注入を使用して送達される。一部の実施形
態において、以下に限定されるものではないが、アデノウイルスもしくはアデノウイルス
随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、鳩痘ウイルスまたはワクチニアウイルスベク
ターなどのウイルスベクターが利用される。

ポリペプチドの治療的使用の方法および指標
提供される本発明の方法は、対象に治療有効量の本発明のポリペプチドを投与するステ
ップを含む、対象を治療する方法を含み、対象は、関節損傷もしくは関節炎があるか、ま
たはそのリスクがある。本発明はまた、ヒト患者の関節炎または関節傷害を改善または予
防する方法を提供し、この方法は、患者の関節に有効量の本発明のポリペプチドを含む組
成物を投与するステップ含み、それにより患者の関節炎または関節傷害を改善または予防
する。一部の実施形態において、患者は、関節炎または関節傷害がある。一部の実施形態
において、個人は、関節炎または関節傷害ではないがそのリスクがある。一部の実施形態
において、関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または自己免疫性関節炎である。一部
の実施形態において、投与される本組成物は、ヒアルロン酸をさらに含む。

別の態様において、本発明は、間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化を誘導する方法を提
供し、この方法は、間葉系幹細胞を十分な量の本発明のポリペプチドと接触させて幹細胞
から軟骨細胞への分化を誘導するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、
インビボにおいて行われ、幹細胞は、ヒト患者中に存在する。

本発明のポリペプチド、組成物および方法は、例えば、外傷事故から生じた損傷または
腱もしくは靱帯裂傷を含むあらゆるタイプの関節軟骨損傷（例えば、関節損傷または傷害
）を治療、改善または予防するために使用できると考えられる。一部の実施形態において
、本発明のタンパク質は、例えば、関節炎もしくは関節損傷の遺伝歴もしくは家族歴があ
る場合の関節炎もしくは関節損傷または関節傷害あるいは関節手術の前またはその最中に
予防または改善するために投与される。一部の実施形態において、ポリペプチド、組成物
および方法は、関節損傷を治療するために使用される。特定の実施形態において、関節損
傷は、外傷性関節傷害である。他の実施形態において、関節損傷は、年齢または不活動に
より生じる損傷である。さらに別の実施形態において、関節損傷は、自己免疫性障害から
生じる損傷である。本発明の一部の実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物お
よび方法は、変形性関節症を治療、改善または予防するために使用されてもよい。一部の
実施形態において、本ポリペプチド、組成物および方法は、関節炎があるリスクまたは関
節炎になるリスクのある対象の関節炎を改善または予防するために使用される。一部の実
施形態において、本ポリペプチド、組成物および方法は、関節損傷があるリスクまたは関
節損傷になるリスクがある対象の関節損傷を改善または予防するために使用される。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、例えば、外傷
性傷害または軟骨疾患により損傷した軟骨組織の軟骨細胞増殖および軟骨産生を刺激する
ための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、組成物および
方法は、関節、例えば、関節でつながった表面、例えば、脊椎、肩、肘、手首、指の関節
、尻、膝、足首および足の関節の軟骨損傷の治療に有用である。治療から利益を得ること
ができる疾患または障害の例としては、変形性関節症、関節リウマチ、その他の自己免疫
疾患または離断性骨軟骨炎（osteochondritis dessicans）が挙げられる。さらに、特定
の遺伝子的または代謝的障害の結果として、軟骨損傷または破壊が起こり、軟骨の形成異
常は、ヒトの低身長症の形で見られることが多く、かつ／または軟骨損傷もしくは破壊は
、再建手術の結果である場合も多い。したがって、単独であろうと、その他のアプローチ
との併用であろうとポリペプチド、組成物および方法は、こうした患者の有用な治療法に
なるであろう。

本発明のポリペプチド、組成物および方法は、さまざまな軟骨の障害および／またはそ
のような状態の関連する症状もしくは影響を治療、改善または予防するために使用できる
とさらに考えられる。本発明のポリペプチド、組成物および方法による治療、改善および
／または予防に対する例となる状態または障害としては、これらに限定されるものではな
いが、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、変
性性椎間板疾患、脊椎関節症、エーラースダンロス症候群、全身性硬化症（強皮症）また
は腱の疾患が挙げられる。関連する影響の改善に関してポリペプチドによる治療から利益
を得ることができるその他の状態または障害としては、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、
多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血
性貧血（免疫性汎血球減少症（immune pancytopenia）、発作性夜間ヘモグロビン尿症）
、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症（immu
ne-mediated thrombocytopenia））、甲状腺炎（グレーブス病、橋本病、若年性リンパ性
甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎（atrophic thyroiditis））、糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸
球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢性および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬
化症、突発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギランバレー症候群および慢性炎症性脱髄
性多発ニューロパチー、肝胆道系疾患、例えば、感染性肝炎（肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅお
よびその他の非肝臓指向性ウイルス（hepatotropic viruse））、自己免疫性慢性活動性
肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大
腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸症およびウィップル病、水疱性皮膚症、多形紅斑
および接触皮膚炎を含む自己免疫性または免疫介在性皮膚疾患、乾癬、アレルギー性疾患
、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーおよび蕁麻疹、
肺の免疫疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺臓炎、移植片拒絶
および移植片対宿主病を含む移植関連疾患が挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「患者」とは、本発明の治療効果のあるポリペプチドが
投与される任意の対象を指す。本発明のポリペプチド、組成物および方法は、哺乳動物を
治療するために使用できると考えられる。本明細書中で使用される場合、「対象」とは、
ヒト、飼育動物および家畜ならびに動物園の動物、スポーツ用動物または愛玩動物を含む
あらゆる哺乳動物を指し、例えば、ウシ（例えば、乳牛）、ウマ、イヌ、ヒツジ、ブタ、
ウサギ、ヤギ、ネコなどである。本発明の一部の実施形態において、対象はヒトである。
特定の実施形態において、対象はウマである。他の実施形態において、対象はイヌである
。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、治療対象の哺乳動物と異種のもの
であってもよい。例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質またはそのフラグメント、ヒト
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質由来のタンパク質またはペプチド（例えば、改変ヒトＡＮＧＰ
ＴＬ３タンパク質、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の保存的バリアント、ヒトＡＮＧＰＴ
Ｌ３タンパク質由来のペプチド模倣物）が、ウマ、ウシまたはイヌなどの動物の治療に使
用される。一部の実施形態において、移植用培養物中の軟骨細胞集団を増やすために、異
種ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が使用されてもよい。一部の実施形態において、増やされた
培養物は、その後、任意に治療対象の哺乳動物と同一源のポリペプチドおよび組成物と混
合され、関節腔または直接軟骨欠損に入れられることになる。あるいは、本発明のポリペ
プチドは、同じ種由来のものである。すなわち、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質またはそ
のフラグメント、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質由来のタンパク質またはペプチド（例え
ば、改変ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の保存的バリア
ント、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質由来のペプチド模倣物）が、ヒト患者の治療に使用
される。治療されるのと同種の哺乳動物由来のタンパク質を使用することによって、偶発
性の免疫応答を避けてもよい。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび組成物は、単独もしくはタンパ
ク質の放出を延長するために適した担体と複合体形成されてのいずれかで、関節の関節液
中への直接注入、全身投与（経口もしくは静脈内）によってまたは軟骨欠損へ直接適用さ
れる。一部の実施形態において、ポリペプチドまたは組成物は、生体適合性マトリックス
または足場に投与される。本発明のポリペプチド、組成物および方法はまた、冒された関
節の外科的手技と併せて使用されてもよい。本発明のポリペプチドの投与は、外科的手技
に先立って、その最中にもしくはそれと併せておよび／またはその後に行われてもよい。
例えば、本発明のポリペプチド、組成物および方法は、自家または同種軟骨細胞移植（Ａ
ＣＩ）のための培養物中の軟骨細胞集団を増やすために使用されてもよい。軟骨細胞は、
任意に、本発明のポリペプチドおよび組成物の投与からなる同時処置とともに移植されて
もよい。これらの手技において、例えば、軟骨細胞は、損傷を受けた関節の無傷で荷重負
荷の小さい領域から関節鏡で採取されてもよく、移植に先立って細胞の数を増加させるた
めに、インビトロにおいて任意に本発明のポリペプチドおよび組成物ならびに／またはそ
の他の成長因子の存在下で培養されてもよい。増やした培養物は、その後、任意に本発明
のポリペプチドおよび組成物と混合され、かつ／または関節腔もしくは直接欠損に入れら
れる。特定の実施形態において、増やした培養物（任意に本発明のポリペプチドとともに
）は、基質または膜内に浮遊させられて関節腔に入れられる。他の実施形態において、本
発明のポリペプチドおよび組成物は、軟骨形成細胞を含み、かつ／または移植された軟骨
細胞もしくは軟骨前駆細胞を所定の位置に保持する助けをする１つまたは複数の骨膜また
は軟骨膜移植片と組み合わせて使用されてもよい。一部の実施形態において、本発明のポ
リペプチドおよび組成物は、以下に限定されるものではないが、関節の洗浄、骨髄の刺激
、アブレーション関節形成（abrasion arthroplasty）、肋軟骨下ドリリング（subchondr
al drilling）または基部の軟骨下骨のマイクロフラクチャーを含むその他の手技と併せ
て軟骨損傷を修復するために使用される。任意に、本発明のポリペプチドおよび組成物の
投与ならびに軟骨の成長の後に続く、付加的な外科的処置が、新たに形成された軟骨表面
に適切な起伏をつけるために有益である場合もある。

医薬組成物
提供されるポリペプチドを含む治療効果のある組成物は本発明の範囲内であり、特に、
安定性およびプロテアーゼ抵抗性が向上したいくつかのポリペプチド配列の特定に照らし
て考えられる。したがって、別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明のポリペ
プチドを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、医薬組成物は、薬学的ま
たは生理学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、
ヒアルロン酸またはその誘導体をさらに含む。

さらに、本発明は、ヒト患者の関節炎または関節傷害を改善または予防する方法を提供
し、この方法は、患者の関節に有効量の本発明のポリペプチドを含む組成物を投与するス
テップを含み、それにより、患者の関節炎または関節傷害を改善または予防する。一部の
実施形態において、患者は、関節炎または関節傷害がある。一部の実施形態において、個
人は、関節炎または関節傷害ではないがそのリスクがある。一部の実施形態において、関
節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または自己免疫性関節炎である。一部の実施形態に
おいて、投与される本組成物は、ヒアルロン酸をさらに含む。

別の態様において、本発明は、間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化を誘導する方法を提
供し、この方法は、間葉系幹細胞を十分な量の本発明のポリペプチドと接触させて幹細胞
から軟骨細胞への分化を誘導するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、
インビボにおいて行われ、幹細胞は、ヒト患者中に存在し、接触させるステップは、患者
の関節に有効量の本発明のポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、それに
より、幹細胞から軟骨細胞への分化および軟骨の形成を誘導する。

本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む治療効果のある組成物は、関節関連の傷
害または疾患の治療のために患者に送達されてもよく、これもまた、本発明の範囲内であ
る。一部の実施形態において、医薬組成物は、本発明のポリペプチドをコードする裸のＤ
ＮＡを含む。一部の実施形態において、送達を行うためにウイルスベクターが利用され、
医薬組成物は、以下に限定されるものではないが、アデノウイルスもしくはアデノウイル
ス随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、鳩痘ウイルスまたはワクチニアウイルスベ
クターなどの本発明のポリペプチドをコードするベクターを含む。医薬組成物は、薬学的
または生理学的に許容される担体とともに本発明のポリペプチドをコードする治療有効量
の核酸を含む。

本発明の別の態様において、関節損傷の治療のための医薬として使用するために提供さ
れるポリペプチドが意図される。特定の実施形態において、関節炎または関節損傷の改善
のための医薬として使用するために本発明のポリペプチドが提供される。一部の実施形態
において、関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または自己免疫性関節炎である。一部
の実施形態において、関節損傷は、外傷性関節傷害、自己免疫性損傷、加齢性損傷または
不活動に関連する損傷である。他の実施形態において、医薬に使用するための本発明のポ
リペプチドをコードする核酸が提供される。

投与に適した製剤は、以下に限定されるものではないが、水溶液および非水溶液、酸化
防止剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を等張にする溶質を含んでもよい等張滅菌溶液、なら
びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存料を含んでもよい水性および非水性
滅菌懸濁液などの賦形剤を含む。特定の実施形態において、医薬組成物は、投与様式、送
達形式および所望の投与量（dosage）との適合性に関して選択される薬学的に許容される
配合薬剤（formulation agent）と混合した治療有効量のペプチドを含む。例えば、Remin
gton’s Pharmaceutical Sciences(18^th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Com
pany 1990）および同じものの次の版を参照。医薬組成物の主要なビヒクルまたは担体は
、水性または非水性の性質であってもよい。例えば、注入に適したビヒクルまたは担体は
、任意に非経口投与用の組成物に一般的な他の材料を加えた水、生理的食塩水または人工
髄液であってもよい。例えば、生理的なｐＨまたはそれよりわずかに低いｐＨ、一般に、
ｐＨ約５からｐＨ約８の範囲内に組成物を維持するために、緩衝剤が使用されてもよく、
任意にソルビトール、血清アルブミン、洗浄剤またはその他の追加の構成成分を含んでも
よい。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする
核酸を含む医薬組成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を使用して凍結乾燥状態
で保管するために調製されてもよい。

さらに別の実施形態において、注入可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、高分子化
合物、ビーズまたはリポソームあるいは本ポリペプチドもしくは本発明のポリペプチドを
コードする核酸の制御されたもしくは持続する放出をもたらすその他の生体適合性マトリ
ックスなどの薬剤を含む製剤は、その後、デポー注射により送達されてもよい。例えば、
本発明のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸は、リポソーム中に封入され
てもよく、または微粒子もしくはマイクロカプセルとして製剤化されてもよく、あるいは
生分解可能な重合体、ハイドロゲル、サイクロデキストリン（例えば、Gonzalez et et a
l., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074；Ｗａｎｇら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０
３／４７５１８号および同第ＷＯ０３／４６１８５号を参照）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリ
コール酸）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号お
よび米国特許出願公報第ＵＳ２００２１３０４３０号を参照）、生分解可能なナノカプセ
ルならびに生体接着性ミクロスフェアなどのその他のビヒクル中に、またはタンパク質性
ベクター（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５３７２２
号）によって、または複合物の使用によって組み込まれてもよい。さらに他の適した送達
メカニズムとして、埋め込み型の送達デバイスが挙げられる。

上記の疾患または障害を治療するための本発明の化合物の用量は、投与の様式、対象の
年齢および／または体重ならびに治療される対象の状態により変化し、最終的に担当の医
師または獣医師によって決定されることになる。対象に投与される用量は、本発明の状況
においては、長期間にわたって対象に有益な反応を引き起こすのに十分でなければならな
い。そのような用量が、「治療有効量」である。したがって、適切な用量は、利用される
特定のタンパク質または本発明のポリペプチドをコードする核酸の効力および対象の状態
ならびに体重または治療される領域の表面積によって決定されてもよい。用量の範囲はま
た、特定の対象において特定のタンパク質またはベクターの投与に伴うあらゆる有害な副
作用の存在、性質および程度によって決定されることになる。単一もしくは分割された用
量により、または注入デバイスもしくはカテーテルによる継続的な注入として投与が行わ
れてもよい。投薬の頻度は、使用される製剤中の本ポリペプチドまたは本発明のポリペプ
チドをコードする核酸の薬物動態的パラメータにより決まることになる。所望の治療効果
を達成するために、臨床医は力価投与量でもよく（may titer dosage）、および／または
投与を修正してもよい。一般的な投与量は、要因により約０．０１μｇ／ｋｇから約１０
０ｍｇ／ｋｇの範囲で変動する。特定の実施形態において、投与量は、約０．１μｇ／ｋ
ｇから最大約１０ｍｇ／ｋｇ；または約０．１μｇ／ｋｇ；約０．５μｇ／ｋｇ；約１μ
ｇ／ｋｇ；約２μｇ／ｋｇ；約５μｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ；約１５μｇ／ｋｇ；約
２０μｇ／ｋｇ；約２５μｇ／ｋｇ；約３０μｇ／ｋｇ；約３５μｇ／ｋｇ；約４０μｇ
／ｋｇ；約４５μｇ／ｋｇ；約５０μｇ／ｋｇ；約５５μｇ／ｋｇ；約６０μｇ／ｋｇ；
約６５μｇ／ｋｇ；約７５μｇ／ｋｇ；約８５μｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇの範囲で
変動する。特定の実施形態において、投与量は、約５０μｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ
；約１５０μｇ／ｋｇ；約２００μｇ／ｋｇ；約２５０μｇ／ｋｇ；約３００μｇ／ｋｇ
；約３５０μｇ／ｋｇ；約４００μｇ／ｋｇ；約４５０μｇ／ｋｇ；約５００μｇ／ｋｇ
；約５５０μｇ／ｋｇ；約６００μｇ／ｋｇ；約６５０μｇ／ｋｇ；約７００μｇ／ｋｇ
；約７５０μｇ／ｋｇ；約８００μｇ／ｋｇ；約８５０μｇ／ｋｇ；約９００μｇ／ｋｇ
；約９５０μｇ／ｋｇ；約１ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ；約３ｍｇ／ｋｇ；約４ｍｇ／
ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ；約６ｍｇ／ｋｇ；約７ｍｇ／ｋｇ；約８ｍｇ／ｋｇ；約９ｍｇ／
ｋｇ；約１０ｍｇ／ｋｇである。

投与の方法
本発明のタンパク質または本発明のポリペプチドをコードする核酸を冒された関節に送
達するために任意の方法が使用されてもよい。本発明の実施において、組成物は、非経口
投与されてもよい、例えば、関節内（すなわち、関節中）、静脈内、筋肉内、皮下に注入
；インフュージョンまたは例えば、膜、基質、デバイスなどとして移植されてもよい。注
入、インフュージョンまたは移植されるとき、送達は、適切な組織または関節に向けられ
てもよく、送達は、直接的なボーラス投与送達または継続的な送達であってもよい。一部
の実施形態において、冒された関節に極めて接近した場所にある適切な組織に送達されて
もよい。一部の実施形態において、拡散または徐放性ボーラス投与（timed release bolu
s）により送達されてもよい。一部の実施形態において、本ポリペプチドが投与される治
療の対象物、例えば、関節の近くに制御放出システム（例えば、ポンプ）が配置されても
よい。他の実施形態において、組成物は、摂取、例えば、吸入または経口送達に関して選
択されてもよい。

本発明の治療効果のあるポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードする核酸は
また、所望の治療法または治療効果のいずれかを改善もしくは向上させる効果に応じて、
効果的に１つまたは複数の追加の活性物質（例えば、ヒアルロン酸またはその誘導体もし
くは塩、成長因子（例えば、ＦＧＦ１８、ＢＭＰ７）、軟骨形成剤（chondrogenic agent
）（例えば、経口用サケカルシトニン、ＳＤ−６０１０（ｉＮＯＳ阻害剤）、ビタミンＤ
３（コレカルシフェロール）、コラーゲン加水分解物、酢酸ルサラチド（rusalatide ace
tate）、アボカドダイズ不けん化物（ＡＳＵ）、ＷＯ２０１２／１２９５６２に記載され
ている化合物、カルトゲニン、ステロイド、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）など
）と組み合わせて使用されてもよい。このプロセスは、両薬剤を含む単一の組成物もしく
は薬理学的製剤のいずれかとして両薬剤を患者に同時に投与すること、あるいは一方の組
成物が、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
み、他方が第２の薬剤を含む２つの別個の組成物または製剤を投与することによって投与
することを含んでもよい。本発明のポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む治療用組成物の投与は、何分から何週間に及ぶ間隔だけ先または後に第
２の薬剤の投与が行われてもよい。

化合物の製剤は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体または乾燥もしくは凍結乾
燥粉末として滅菌したバイアルに保存されてもよい。製剤は、単位用量または複数用量の
アンプルおよびバイアルなどの密閉容器として提示されてもよい。一部の実施形態におい
て、製剤は、シングルまたはマルチチャンバ型プレフィルドシリンジ（multi-chambered
pre-filled syringe）（例えば、液体シリンジ（liquid syringe）、リソシリンジ）とし
て提示されてもよい。溶液および懸濁液は、前に記載した種類の滅菌された粉末、顆粒お
よび錠剤から調製されてもよい。

本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むキットも提
供される。一実施形態では、一投与単位をもたらすためのキットが提供される。キットは
、本発明の乾燥ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を含む第１の容器と、
水性再構成配合を有する第２の容器とを含む。特定の実施形態において、１つの容器は、
シングルチャンバ型プレフィルドシリンジを含む。他の実施形態において、容器は、マル
チチャンバ型プレフィルドシリンジとして包含される。

以下の実施例は、説明のために提供するものであり、特許請求される発明を限定するも
のではない。

実施例１：プロテアーゼ抵抗性Ａｎｇｐｔｌ３ペプチド構築物
Ｏ−結合型グリコシル化を排除し、生物物理学的なタンパク質の性質決定を容易にする
ために、さまざまなＮ末端短縮型変異体（N-terminal truncation mutant）を構築した。
プロテアーゼ抵抗性ペプチドを特定するために、ペプチドのＣ末端領域に対応するヒトＡ
ｎｇｐｔｌ３ペプチドフラグメントのさまざまな位置にアミノ酸置換を導入した。図１は
、ヒトＡｎｇｐｔｌ３における変異の位置を示す。Ｈｉｓタグを含む構築物を最初に作製
した。変異体タンパク質は、以下のものとした：２２５−４６０ Ｋ４２３Ｑ（２２５Ｋ
Ｑ）、２２５−４６０ Ｓ４２４Ｔ（２２５ＳＴ）、２２６−４６０ Ｋ４２３Ｑ（２２
６ＫＱ）、２２６−４６０ Ｋ４２３Ｓ（２２６ＫＳ）、２２８−４６０ Ｋ４２３Ｑ（
２２８ＫＱ）、２２８−４６０ Ｓ４２４Ｔ（２２８ＳＴ）、２３３−４６０ Ｋ４２３
Ｑ（２３３ＫＱ）、２３３−４６０ Ｋ４２３Ｓ（２３３ＫＳ）、２４１−４６０ Ｋ４
２３Ｑ（２４１ＫＱ）、２４１−４６０ Ｋ４２３Ｓ（２４１ＫＳ）、２４１−４６０
Ｋｄｅｌ（２４１Ｋｄｅｌ）、２４２−４６０ Ｋ４２３Ｑ（２４２ＫＱ）、２４２−４
６０ Ｋ４２３Ｓ（２４２ＫＳ）および２４２−４６０ Ｋｄｅｌ（２４２Ｋｄｅｌ）。

ＨＥＫ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞でＨｉｓ−タグタンパク質を発現させ、Ｎｉ
−ＮＴＡカラムクロマトグラフィーによって精製した。タグのないＣ末端構築物もクロー
ン化し、以前に記載された方法によって精製した（Gonzalez R et al PNAS 2010）。簡単
にいえば、シグナル配列（１−１６）を有する標的タンパク質を、サイトメガロウイルス
プロモーターを有する哺乳動物発現ベクターにクローン化した。ＨＥＫ ２９３ Ｆｒｅ
ｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＤＮＡ／ＰＥＩトランスフェクションの
９６時間後に、分泌された標的タンパク質を含む培地を回収し、Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＳＰカ
ラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０
）、１２５ｍＭのＮａＣｌから５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ
の間でタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製したタンパク質が少なくと
も９５％純粋なであることを確認した。

以下のとおりプロテアーゼ抵抗性を評価した。１０ｎｇの作製された各タンパク質を質
量比８０００：１（タンパク質：トリプシン）でトリプシンとともに室温で１時間インキ
ュベートすることによってトリプシン限定分解を行った。その後、トリプシン分解反応を
、酢酸を添加して反応をｐＨ３．０にすることによってクエンチし、クエンチしたサンプ
ルをＬＣ／ＭＳによって分析した。Ｃ末端の４３個のアミノ酸（Ｓ４２４−Ｅ４６０）の
質量に相当する５分のＲＰ ＨＰＬＣピークを、それぞれの野生型タンパク質構築物につ
いて明らかにした。切断部位は、完全長の野生型ＡＮＧＰＬＴ３タンパク質の産生の過程
で観察されるのと同じ部位、すなわち、Ｋ４２３とＳ４２４の間であった。切断部位のＬ
ｙｓがＧｌｎに変異した場合、このピークはなかった。ペプチド構築物２２５ＫＱ、２２
８ＫＱ、２３３ＫＱ、２３３ＫＳ、２４１ＫＱおよび２４２ＫＱのそれぞれ；ならびに野
生型２２５ペプチドを作製し、分析した。構築物のそれぞれについて切断部位のＬｙｓが
ＧｌｎもしくはＳｅｒに変異した場合または４２３位のＬｙｓが欠失していた場合は、Ｃ
末端の４３個のアミノ酸の質量に相当するピークがなかった。

実施例２：インテグリン結合アッセイ
αＶβ３インテグリン 作製されたペプチド２２５ＫＱ、２２８ＫＱ、２３３ＫＱ、２
４１ＫＱおよび２４２ＫＱを、αＶβ３インテグリンとの結合についてインビトロにおい
て試験した。簡単にいえば、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、２μｇ／ｍｌのインテグリン
αＶβ３によりコーティングし、各種濃度の（示した）ポリペプチド構築物を添加した。
抗ＡＮＧＰＴＬ３ｍＡｂに続く西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体
の添加によって結合したペプチドを検出した。試験したペプチドすべてがインテグリン結
合能力を保持するか、またはそれが改善された。結合データからそれぞれについてのＥＣ
_５０を求め、結果を表２に示す。

α５β１インテグリン 作製されたペプチド２２５ＫＱ、２２８ＫＱ、２３３ＫＱ、２
４１ＫＱおよび２４２ＫＱを、α５β１インテグリンとの結合についてインビトロにおい
て試験した。プレートを上記のとおりであるが２μｇ／ｍｌのインテグリンα５β１によ
りコーティングし、各種濃度の（示した）ポリペプチド構築物を添加し、上記のとおり検
出を行った。試験したペプチドすべてがインテグリン結合能力を保持するか、またはそれ
が改善された。結合データからそれぞれについてのＥＣ_５０を求め、結果を表２に示す。

実施例３：構築物の機能分析
細胞培養および分化。 ヒト骨髄由来の初代間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）をＦＡＣＳに
より選別し、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６およびＣＤ１０５陽性が９８％超であり、
ＣＤ４５陽性が０．１％未満であることが証明された。継代数２〜８の細胞を実験のため
に使用した。ヒト軟骨内在ＭＳＣ（ｈＣＲ−ＭＳＣ）は、ヒト初代関節軟骨細胞に由来す
るものとし、これを、１つの細胞に分け、ＭＳＣＧＭでクローン的に増殖させ、軟骨形成
、骨形成および脂肪生成分化によりＭＳＣと確認した。細胞をＦＡＣＳにより選別し、Ｃ
Ｄ１６６およびＣＤ１０５陽性が９８％超であることが証明された。ｈＣＲ−ＭＳＣを最
大２０回継代培養し、細胞プロファイル、増殖または分化速度に変化がないことが確認さ
れた。

軟骨形成。 軟骨形成活性を評価するために、本発明のペプチド構築物を物理的および
機能的アッセイにおいて評価した。

本明細書で提供される人工構築物は、７つの特定されたＡＮＧＰＴＬタンパク質の一フ
ァミリーに属するＡＮＧＰＴＬ３に由来し、構造的にアンジオポエチンと類似しているが
、Ｔｉｅ２受容体と結合する能力がなく、したがって別個の官能基を有する。ＡＮＧＰＴ
Ｌタンパク質は、Ｎ末端のコイルドコイルドメイン（ＣＣＤ）およびＣ末端のフィブリノ
ーゲン様ドメイン（ＦＬＤ）を含み、それらの微小環境ならびにフィブロネクチンおよび
インテグリンなどの細胞外基質（ＥＣＭ）との相互作用によってきびしく制御されている
と考えられている。Conklin et al., Genomics 62(3): 477-482 (1999)；Goh YY, et al.
, Am J Pathol 177(6): 2791-2803 (2010)； Goh YY, et al J Biol Chem 285(43): 3299
9-33009(2010)。ＡＮＧＰＴＬ３と最も密接に関連するＡＮＧＰＴＬファミリーメンバー
についての配列、ＡＮＧＰＴＬ１（完全長型およびＣ末端ドメイン）ならびにＡＮＧＰＴ
Ｌ４（完全長型およびＣ末端ドメイン）を表３に提供する。表５Ｂは、これらのファミリ
ーメンバーのＣ末端ドメインの全体にわたるアライメントを示す。細胞外ドメインおよび
Ｃ末端ドメインにわたる配列同一性ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ４ならびにその他のア
ンジオポエチンタンパク質のＡＮＧＰＴＬ７、ＡＮＧＰＴ１およびＡＮＧＰＴ２を表５Ａ
に提供する。ＡＮＧＰＴＬ３のＣ末端ドメイン（ＣＴ）は、ＣＴ ＡＮＧＰＴＬ１と３７
％の配列同一性およびＣＴ ＡＮＧＰＴＬ４と４０％の配列同一性を共有する。

Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717に過去に記載されたとおりに細胞ベー
スの二次元軟骨形成をインビトロで誘導し、評価した。簡単にいえば、ヒト骨髄由来の初
代間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地にまき、その後、それに続いて構築物を含むおよ
び含まない軟骨形成刺激培地に変えた。

初めに小塊形成をイメージ化するために、ウェルを固定し、ローダミンＢにより着色し
た。この場合、小塊は、目で容易に見つけられ、光学顕微鏡によってイメージを取り込ん
だ。ハイスループットのイメージ化ベースの検出および定量化を容易にするために、非特
異的にコラーゲンと結合するナイルレッドにより軟骨形成小塊を着色した。ナイルレッド
により着色した小塊を、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３（ハイコンテンツ撮像装置）で、小塊の急
速な検出のために４８８レーザーを用いた励起によって定量した。

Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717に過去に記載されたとおりに細胞ベー
スの二次元軟骨形成をインビトロで誘導し、評価した。簡単にいえば、ヒト骨髄由来の初
代間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地にまき、その後、それに続いて構築物を含むおよ
び含まない軟骨形成刺激培地に変え、７日または１４日間培養した。細胞を、その後、ホ
ルムアルデヒドにより固定し、洗浄した後、主要な軟骨タンパク質である２Ａ型プロコラ
ーゲン（ＰＩＩＡＮＰ）（図２Ａ）およびＩＩ型コラーゲン（図２Ｂ）を検出するために
標準的な免疫細胞化学技術を使用して着色した。ＩＩ型コラーゲンの検出のために、透過
処理溶液に添加した０．２％のＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、レークウッド、ニュージャージー州）により細胞を分解させ
た。検出したそれぞれのタンパク質についての免疫蛍光を、多波長細胞スコアリングスク
リプトを使用して、以前に記載されたとおりにハイコンテンツイメージング（Ｉｍａｇｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーヴェール
、カリフォルニア州））により定量した。図２を参照。以下のとおり細胞を作製すること
によってアグリカンの発現を観察した。簡単にいえば、初代ｈＭＳＣ（５０００細胞）を
Ｇｒｉｅｎｅｒ３８４ウェルプレートにまいた。２４時間後に、増殖培地を除去し、１％
のＦＢＳを含む２５μｌのＤＭＥＭと置き換えた。タンパク質構築物を、その後、各ウェ
ルに示した用量で添加し、培養物を３７℃で３日間増殖させた。この細胞を１０％のホル
マリンで固定し、免疫細胞化学的方法に供してアグリカンタンパク質の発現を検出した。
ウェルをＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａでイメージ化し、多波長細胞スコアリング
スクリプトにより定量した。ｎ＝６／タンパク質濃度。対照（構築物により刺激をしなか
った細胞、希釈剤単独）のＷＴ、野生型Ｃ末端（２２５−４６０）ＡＮＧＰＴＬ３に対す
る、人工構築物２４２ＫＱもしくは２４２ＫｄｅｌまたはＡＮＧＰＴＬタンパク質の関連
ファミリーメンバーである完全長型ＡＮＧＰＴＬ１に関する結果を図３Ｂに示す。２２５
ＷＴ、２２５ＫＱ、２２６ＫＱ、２２８ＫＱ、２３３ＫＱ、２４１ＫＱおよび２４２ＫＱ
構築物のそれぞれを使用した実験に関して同様の結果が見られた。

追加のＡＮＧＰＴＬ関連ファミリーメンバーに関して過去におよび本明細書中に記載さ
れたアッセイおよび方法を使用して軟骨形成アッセイを行った。密接に関連するタンパク
質が軟骨形成活性を与えるか否か、さらに、タンパク質のＣ末端の活性が保持されたかど
うかを調べるための実験を行った。ＡＮＧＰＴＬ１およびＡＮＧＰＴＬ４は、小塊形成ア
ッセイで活性を示したが、軟骨形成アッセイではＩＩ型コラーゲンの誘導を示したのはＡ
ＮＧＰＴＬ１のみであった。表４を参照。小塊形成活性およびＩＩ型コラーゲンの誘導ア
ッセイの結果については、表４に概要を示す。ＡＮＧＰＴＬ１の追加の性質決定について
は、本明細書に記載されている。この実施例の他の部分および図３〜５を参照。

軟骨に特異的なタンパク質の発現を評価するためにＲＮＡ発現分析も使用した。簡単に
いえば、ｑＲＴ−ＰＣＲ ｈＭＳＣを、血清を含まないＤＭＥＭ、１×ＩＴＳおよび（示
した）構築物においてペレット培養（１×１０^６細胞／ペレット）で３、７、１０、２１
日間増殖させた。培地を３日毎に交換した。ラブリシン、アグリカン、Ｓｏｘ９、ＩＧＦ
１、ＩＦＩＴＭ１、オステオカルシンおよびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現を、Ｒｏｃｈ
ｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用して定量した（デュプリケートで行われた３回の実験
からプールされたデータ（ｎ＝６））。図３Ａは、２４２ＫＱおよび２２５ＷＴに関する
１０日目の発現データを表わす。遺伝子発現データは、３、７および２１日目のすべての
遺伝子に関して類似していた。

完全長型ＡＮＧＰＴＬ３は、ヒトとマウスの両方の間葉系幹細胞において軟骨形成活性
を有することが以前に示された。追加の種交差反応性の能力を実証するために、ヒト、マ
ウス、ラットおよびイヌの間葉系幹細胞における活性について構築物を試験した。マウス
、ラット、ヒトおよびイヌのＣＲ−ＭＳＣを、上記のとおり構築物とともに１８日間培養
した。軟骨細胞に特異的なタンパク質であるＩＩ型コラーゲンを検出するために、培養物
を固定し、標準的な免疫細胞化学的技術を使用して着色し、ハイコンテンツイメージング
を使用してＩＩ型コラーゲン陽性細胞を定量した。評価したそれぞれ種の細胞に関して、
定量されたＩＩ型コラーゲンの量は類似した倍率増加をしたことが確認された。

軟骨保護。 軟骨保護活性を評価するためにペプチド構築物を機能的アッセイにおいて
評価した。

エクスビボにおけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）放出阻害アッセイ（基質損傷の指
標）を、Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721に記載のとおりに行った。
簡単にいえば、ウシの軟骨を摘出し、打ち抜いて対称的な円形にし、器官培養した。タン
パク質構築物の存在下または不在下における軟骨基質の分解を誘導するために、２０ｎｇ
／ｍｌのＴＮＦαおよび１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（炎症メディエー
ター）とともに薄片を４８時間処理してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）放出のパーセン
ト阻害を確認した。図４Ａに示した結果は、示した人工構築物およびＷＴ２２５−４６０
に関する４ドナーからプールしたデータ、ｎ＝１２を示す。

インビトロにおける一酸化窒素（ＮＯ）阻害アッセイ（軟骨保護の指標）を、Johnson,
K., et al., (2012) Science 336, 717-721に記載されるとおりに行った。簡単にいえば
、初代軟骨細胞を、示したタンパク質構築物により４８時間処理した。Ｇｒｉｅｓｓ反応
を行って、構築物のＮＯ放出を阻害する効果を確認した。図４Ｂに示した結果は、示した
人工構築物およびＷＴのＣ末端フラグメント２２５−４６０に関する結果を示す。図４Ｃ
に示す結果は、野生型Ｃ末端ＡＮＧＰＴＬ１、人工ＡＮＧＰＴＬ３ ２４２ＫＱまたは対
照に関する結果を示す。

線維軟骨形成の阻害。 初代ヒト関節軟骨細胞を、アスコルビン酸を添加し、（示した
）構築物の存在または不在下において上記のとおり１４日間培養して肥大化を誘導し、Ｘ
型コラーゲン発現を、免疫蛍光法によって評価した。図５Ａに示される結果は、示した構
築物２２５ＷＴまたは２４２ＫＱに関するデータを示す。図５Ｂに示される結果は、示し
たとおり、野生型Ｃ末端ＡＮＧＰＴＬ１、人工ＡＮＧＰＴＬ３ ２４２ＫＱもしくは２４
２Ｋｄｅｌまたは野生型Ｃ末端ＡＮＧＰＴＬ３フラグメント２２５−４６０に関するデー
タを示す。Ｘ型コラーゲンの発現によって検出されるとおり、野生型または活性構築物の
存在が肥大条件下における線維軟骨形成に対して阻害効果をもたらす。

血管形成。 ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のＷＴ Ｃ末端ドメインは、インビトロおよび
インビボにおいて血管形成活性および特性があることがラット角膜モデルで報告されてい
る。Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277(19): 17281-17290 (2002)を参照。Ｃ末端Ａ
ＮＧＰＴＬ３のインビボ投与後に新しい血管を誘導するリスクの可能性に対処するために
、インビトロにおける血管形成アッセイを行った。簡単にいえば、初代ヒト臍帯静脈内皮
細胞（ＨＵＶＥＣ）を、基本的な内皮細胞培地とともに一晩血清不足にした。細胞を、そ
の後、セルトラッカーグリーンにより標識化し、（示した）タンパク質構築物が埋め込ま
れたプレコートされたマトリゲルプレートに加えた。完全長型ＡＮＧＰＴＬ３（５０ｎｇ
／ｍＬ）または２４２ＫＱ（５０ｎｇ／ｍＬ）または陽性対照として使用したｂＦＧＦ（
５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で１８時間培養した後、形成された分岐点の数および合計の管
の長さを血管形成活性の基準として、ハイコンテンツイメージングを使用して量化した。
細胞が２４２ＫＱとともにインキュベートされた場合、完全長型ＡＮＧＰＴＬ３または陽
性対照の存在下で見られた影響とは対照的に、いずれのパラメータにも有意な増加は検出
されなかった。図２Ｃを参照。

ＣＲ−ＭＳＣは、関節硝子軟骨（hyaline articular cartilage）内に存在し、傷害に
反応して数が増加する。軟骨組織の傷害後、これらの細胞は、修復プロセスに関与する能
力があるが、それ自体に対して適切に軟骨を修復させるには十分でない。したがって、患
者は、痛むことなく関節の動きを支える適切な能力を欠いた関節軟骨を持ち続けることに
なり、患者の生活の質を維持するために外科的処置および／または関節置換が必要になる
場合が多い。本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ３および特に、人工のプロテアーゼ抵抗性ＡＮ
ＧＰＴＬ３ペプチドが、ヒトＣＲ−ＭＳＣの分化を軟骨細胞へ向ける能力をもち、特異的
に関節硝子軟骨タンパク質、ＩＩ型コラーゲンおよびＳｏｘ９を分泌する一方でＸ型コラ
ーゲンの発現によって示される線維軟骨形成を抑制することを発見した。

ヒト軟骨細胞、ヒトＭＳＣまたはヒト滑膜線維芽細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現は
、本発明者の知る限り報告されておらず、ウエスタンブロッティングを使用した本発明者
らの試験でも観察されなかった。齧歯類の関節では、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によ
り発現は、全く見つからないかそれに近かった。しかしながら、ヒトの骨関節炎の関節液
（ｎ＝２）では、低濃度のＡＮＧＰＴＬ３（１．３〜６．０ｎｇ／ｍＬ）が、酵素結合免
疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）によって検出され、これは、損なわれた関節では、全身に循環
するタンパク質が滑膜の空洞に入る可能性があることを示唆している。

実施例４：構築物のインビボ分析
マウス外科的急性傷害モデル。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１２／群）の右膝の前十
字靱帯（ＡＣＬ）、内側半月脛骨靱帯（ｍｅｄｉａｌ ｍｅｎｉｓｃａｌ ｔｉｂｉａｌ
ｌｉｇａｍｅｎｔ）（ＭＭＴＬ）および内側側副靭帯（ＭＣＬ）に外科的切断を行って
膝関節を不安定にし、それにより、ＯＡ表現形にした。これは、過去に示されたモデルGl
asson, S.S., et al., Osteoarthritis Cartilage 15, 1061 (2007)を変更したものであ
る。ＡＮＧＰＴＬ３処置の治療上の利益の可能性を評価するために、手術後の１５週間、
図６Ａに示したとおり、１７〜１９週目は１週間に１回、ｍＡＮＧＰＴＬ３用量＝２００
ｎｇ／膝でマウスの関節内に投与した。脛骨プラトーの量的評価を０〜４段階で行った。
０は正常であり、５は重篤な変形性関節症（軟骨の全層破壊）である。各マウスから２つ
の切片を、２人の独立した観察者が盲検的に等級付けした（図６Ｂ）。

変形性関節症により誘発された動物の痛みの緩和については、インキャパシタンステス
ト（incapacitance testing）またはインキャパシタンス監視装置を使用してマウスが外
科的処置をしていない足に対して処置をした足で立つ時間の割合を求めることによって判
定した。図７は、読み取りの結果を示し、手術後３５および５６日目の疼痛反応を、手術
していない肢に対する手術した肢の％荷重として報告したものである。処置は、完全長型
マウスＡＮＧＰＴＬ３（ＷＴ１７〜４６０）またはＣ末端ヒトＡＮＧＰＴＬ３（ＷＴ２２
５−４６０）を上記のとおりに投与した動物の結果を示す。

マウス慢性ＯＡモデル（コラゲナーゼＶＩＩにより誘発） 広く使用されている別の変
形性関節症の動物モデルであるコラゲナーゼＶＩＩ誘発慢性関節傷害モデルを、インビボ
における構築物の効力を評価するために使用した。モデルおよび評価は、過去に記載され
たとおり行った。van der Kraan, P.M., et al., Am. J. Pathol. 135, 1001 (1989)；
およびJohnson, K., et al., Science 336, 717 (2012)を参照。簡単にいえば、三（３）
日間の炎症の後にコラゲナーゼに誘発された関節の不安定化が起こり、結果として軽度か
ら中程度の軟骨破壊が生じた。誘発後に構築物の関節内投与を膝に週１回、３週間行った
。これは、コラゲナーゼＶＩＩを与えた３週間後に開始した。処置の四十二（４２）日後
、関節を採取し、切片を作った。大腿および脛骨プラトーに対する組織学的な関節の重症
度についてのスコアリングにより、組織修復の量化ができた。関節スコアの重症度は、上
記のとおりの組織学的なスコアリングにより決定した。図８は、２２５ＷＴ、２２５ＫＱ
、２２８ＫＱ、２３３ＫＱおよび２４１ＫＱ構築物による修復を示す。関節にタンパク質
があることを確認するために（長期間、関節内に保持されている）、免疫組織化学的検査
によるＷＴタンパク質構築物の存在のために組織を固定し、着色した。分析により、ＡＮ
ＧＰＴＬ３が関節内に保持されていることを示すタンパク質の存在が確認された（脂質／
トリグリセリドに対する影響は見られなかった、これは、標準的な生化学検査を使用して
評価した。データは示していない）。

（傷害部位におけるプロテオグリカンの検出のために、上記のとおりの）サフラニンＯ
により着色した内側脛骨プラトーの切片に対する組織学的分析および等級付けにより、軟
骨基質における再生が明らかになった（データは示していない）。量的な分析により、未
処置マウスに見られる量と同様の量のプロテオグリカンの補充が確認された一方で、ビヒ
クル対照は、同様の補充が示されなかった。傷害への注射の８週間後に組織切片も上記の
とおりＩＩ型コラーゲン用の着色をした。量的な分析により、構築物により処置された関
節に未処置マウスに見られる量と同様の量のＩＩ型コラーゲンの増加が確認された一方で
、ビヒクルにより処置された対照は、同様の増加を示さなかった（データは示していない
）。

ラット半月板断裂モデル
構築物のインビボにおける効力を評価するために、ラット外科的傷害モデルをまた使用
した。まず、モデルおよび評価を、Gerwin N. et al. Osteoarthritis Cartilage. Suppl
3: S24 (2010)に過去に記載されたとおりに行った。簡単にいえば、膝関節の皮膚を剪毛
し、内側側副靭帯（ＭＣＬ）を切開により切り離し、ＭＣＬを安定化させ、メスを使用し
て半月板の遠位の切断を行った。手術の１、２および３週間後にタンパク質構築物または
ビヒクル対照を節腔内に注入し、その後、手術の４および６週間後に関節を採取し、切片
を作った。上記のとおりの組織修復の量化のために、大腿および脛骨プラトーに対する組
織学的な関節の重症度のスコアリングを行った。６週間の分析に関するデータを示す。

処置後に健康な硝子軟骨が損傷を置換した。外側脛骨プラトーのサフラニンＯにより着
色した軟骨の組織学的分析および等級付けを上記のとおり行い、量化した。結果から、２
４２ＫＱ構築物により処置した動物が軟骨基質の再生および未処置のラットに見られる量
と同様の量のプロテオグリカンの補充を示した一方で、ビヒクル対照は、同様の補充を示
さなかったことが証明された。図９を参照。２２５ＷＴに関しても同様の結果が見られた
。

インビボで軟骨修復を促進する２４２ＫＱの効力を試験するために、上記のものとわず
かに変更した外科的誘発半月板断裂モデルを使用して、雄のＬｅｗｉｓラットに軟骨損傷
を起こした。内側側副靭帯および内側半月板を完全に切断するためにラットの手術を行っ
て関節を不安定にし、それにより、その後の荷重が軟骨を急速に変性させることとなった
。針の両側の靱帯を切断するよう切開が行われ、それにより確実に完全に切断した。その
後、メスの刃を使用して、膝蓋靱帯の下を滑膜腔に滑らせ、鋭い先端部を使用して半月板
を切断した。関節が外側に脱臼した場合、切断は成功した。手術の１週後、２５ｕＬの体
積で２４２ＫＱまたは生理的食塩水を、関節内の滑膜腔に関節内注射することによってラ
ットに投与した。

半月板断裂手術の２８日後および生理的食塩水または構築物の関節内注射の２１日後に
、試験動物を安楽死させ、分析のために冒された関節を採取し、１０％のホルマリンＰＢ
Ｓ溶液中で固定し、ギ酸により脱灰し、パラフィンに包埋した後、切片を作った。冠状断
面を切り、サフラニンＯにより着色するか、またはその後の免疫組織化学的染色のために
染色しないままにした。分析により、内側脛骨プラトーに最大量の軟骨損傷があったこと
が明らかになり、関節のこの領域のみ２４２ＫＱの効力について評価することを決定した
。ＯＡＲＳＩスコアリングシステムを使用して、各動物（Ｎ＝１０）の脛骨軟骨の横の端
から端までの６つの切片に軟骨の重症度スコアを盲検様式で割り当てた。スコアリングを
、異なる時点で２回行った後、そのスコアを平均して軟骨損傷のスコア出した。さらに、
Ｍａｔｌａｂで生成されたカスタムスクリプトにより客観的なスコアリング分析を行った
。アルゴリズムは、関節軟骨表面を特定し、追加の軟骨パラメータを客観的に量化した（
ゾーン分析、サフラニンＯ強度、軟骨面積、軟骨厚さ）。結果を図１０Ａに示す。

少なくともヒトでは、軟骨の構造的な修復が常に疼痛の緩和につながる訳ではない。齧
歯類の生理学および歩行は、ヒトとは著しく異なるが、処置後の歩行または外科的処置し
た肢を使う時間の長さに何らかの改善があったかどうかを確認するために２４２ＫＱを評
価した。２４２ＫＱにより処置されたラットに対してインキャパシタンスモニタリングを
行った。ラットを、上記のとおりの変更した半月板手術に供した。手術の１週間後、２４
２ＫＱを、滑膜腔に注射した。２８日目に、そのラットを後ろ足で立たせてインキャパシ
タンスモニタに置き、それぞれラットに対して１０分間にわたって続いて起る３０回の読
み取りを行ってそれぞれの後肢を使った時間のパーセント（体重分散）を求めた。これら
のデータは、疼痛により体重が分配し直されることを示唆する。ラット半月板断裂モデル
では、手術後の１週間の２４２ＫＱによる処置が、ラットの等しく体重をかける能力の部
分的な修復につながることが確認された。図１０Ｂを参照。

自然または外科的な軟骨修復の過程における主要な問題の１つは、関節硝子軟骨が線維
軟骨に代わることである。ＡＮＧＰＴＬ３が介在する軟骨修復のタイプを調べるために、
ＩＩ型コラーゲン（関節硝子軟骨のしるしである）およびＸ型コラーゲン（線維軟骨のし
るしである）の存在のために、上で行ったラットの半月板断裂試験から採取したラットの
膝の切片を着色した。２０μｇの２４２ＫＱの１回の注射後に、Ｘ型コラーゲン発現の量
に質的低下があった。

タンパク質の^１２４Ｉ標識化および投与に続く、保持を観察するためのＰＥＴ／ｕＣＴ
イメージングにより、ラットの膝への静脈内および関節内注射後に２４２ＫＱの長期間の
保持が確認された。Gerwin, N., et al. (2006) Advanced drug delivery reviews 58, 2
26-242を参照。関節への２４２ＫＱのＩＡ注射後の平均滞留時間（ＭＲＴ）を、約１７．
３時間と確認した。これは、報告されている標準的な２〜３時間を超えて著しく増加して
いる（表６を参照）。

イヌ半月板部分切除関節傷害モデル 本発明者らは、イヌの関節傷害モデルでもＡＮＧ
ＰＴＬ３活性を評価した。Connor, J.R., et al., Osteoarthritis and cartilage / OAR
S, Osteoarthritis Research Society 17, 1236-1243 (2009)に記載されるとおりにモデ
ルを完成し、評価を行った。簡単にいえば、膝関節の皮膚を剪毛し、内側側副靭帯（ＭＣ
Ｌ）を切開により切り離し、ＭＣＬを安定化させ、メスを使用して半月板の遠位の切断を
行った。手術の四（４）日後に、動物は、タンパク質構築物（完全長型イヌＡＮＧＰＴＬ
３）またはビヒクル対照の週２回の投薬（１．５ｕｇまたは１５ｕｇ）もしくは７日目に
単回投与（３０ｕｇ）を受けた（関節内に注射した）。２８日目にイヌを安楽死させ、ラ
ットおよびマウスの実験に関して上に記載したとおり膝の組織学的な切片の作製および等
級付けをした。図１１は、イヌＡＮＧＰＴＬ３の処置に関連する修復の総スコアの合計を
示す。サフラニンＯにより着色したイヌの関節の切片の組織学的等級付けおよび評価の際
、生理的食塩水群において最も深刻な軟骨減少が起った領域が３０μｇのｃＡＮＧＰＴＬ
３の単回投与後に病変領域が最も減少した関節の部分であった。

本明細書に記載される例および実施形態は、説明のためのものであり、それを鑑みさま
ざまな改変または変更が当業者に示唆されるであろうし、それらは本出願の趣旨および範
囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることは理解されたい。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
表１の配列の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１を参照して決定される４２３位がＫまたはＲ以外の極性アミノ酸であるアミノ酸を含み、前記ポリペプチドは、軟骨形成活性がある、ポリペプチド。
［２］
前記ポリペプチドが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のポリペプチド。
［３］
前記ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記［２］に記載のポリペプチド。
［４］
前記ポリペプチドが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載のポリペプチド。
［５］
前記ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、上記［４］に記載のポリペプチド。
［６］
前記ポリペプチドが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、上記［１］に記載のポリペプチド。
［７］
前記ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、上記［６］に記載のポリペプチド。
［８］
前記ポリペプチドが、表１の配列の群から選択されるアミノ酸配列である、上記［１］に記載のポリペプチド。
［９］
前記ポリペプチドが、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７０のいずれか１つである、上記［８］に記載のポリペプチド。
［１０］
前記ポリペプチドが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６４のいずれか１つである、上記［９］に記載のポリペプチド。
［１１］
前記４２３位のアミノ酸はＱもしくはＳであるか、または前記４２３位のアミノ酸は欠失している、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１２］
前記４２３位のアミノ酸はＱである、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１３］
前記４２３位のアミノ酸はＳである、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１４］
前記ポリペプチドがペグ化されている、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１５］
前記ポリペプチドが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、ポリヒスチジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧもしくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはそのフラグメントのいずれかと融合している、上記［１］から［１４］のいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１６］
前記異種ペプチドは、前記ポリペプチドのアミノ末端において融合している、上記［１５］に記載のポリペプチド。
［１７］
前記異種ペプチドは、前記ポリペプチドのカルボキシ末端において融合している、上記［１５］に記載のポリペプチド。
［１８］
上記［１］から［１７］のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
［１９］
ヒアルロン酸またはその誘導体をさらに含む、上記［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］
経口用サケカルシトニン、ＳＤ−６０１０（ｉＮＯＳ阻害剤）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、コラーゲン加水分解物、ＦＧＦ１８、ＢＭＰ７、酢酸ルサラチド、アボカドダイズ不けん化物（ＡＳＵ）、カルトゲニン、ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）からなる群から選択される薬剤をさらに含む、上記［１８］に記載の医薬組成物。
［２１］
患者において関節炎または関節損傷を治療、改善または予防する方法であって、前記方法は、前記患者の関節に治療有効量の上記［１８］に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、前記患者において関節炎または関節損傷を治療、改善または予防する、方法。
［２２］
前記患者は、関節炎または関節損傷がある、上記［２１］に記載の方法。
［２３］
前記患者は、関節炎または関節損傷のリスクがある、上記［２１］に記載の方法。
［２４］
前記関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または自己免疫性関節炎である、上記［２２］または上記［２３］に記載の方法。
［２５］
前記組成物は、ヒアルロン酸をさらに含む、上記［２１］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
冒された関節への外科的手技をさらに含む、上記［２１］から［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
前記医薬組成物を投与するステップは、外科的手技の間または後に行われる、上記［２１］から［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
前記医薬組成物を投与するステップは、骨髄刺激、軟骨置換、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）、マトリックス誘導自家軟骨細胞移植（matrix-induced autologous chondrocyte implantation）（ＭＡＣＩ）のいずれか１つと併せて行われる、上記［２６］に記載の方法。
［２９］
前記医薬組成物を投与するステップは、１つまたは複数の追加の軟骨形成因子と併せて行われる、上記［２１］〜［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
前記医薬組成物を投与するステップは、マトリックスまたは生体適合性の足場において行われる、上記［２１］〜［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導する方法であって、前記方法は、間葉系幹細胞を有効量の上記［１］から［１７］のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させて前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導するステップを含む、方法。
［３２］
前記方法はインビボにおいて行われ、前記幹細胞はヒト対象中に存在する、上記［３１］に記載の方法。
［３３］
前記対象は、関節炎または関節損傷がある、上記［３２］に記載の方法。
［３４］
前記対象は、関節炎または関節損傷のリスクがある、上記［３２］に記載の方法。
［３５］
前記関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または自己免疫性関節炎である、上記［３３］または上記［３４］に記載の方法。
［３６］
対象の冒された関節への外科的手技をさらに含む、上記［３２］から［３５］のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
前記ポリペプチドを投与するステップは、外科的手技の間または後に行われる、上記［３２］から［３５］のいずれか一項に記載の方法。
［３８］
前記ポリペプチドを投与するステップは、１つまたは複数の追加の軟骨形成因子と併せて行われる、上記［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］
前記ポリペプチドを投与するステップは、骨髄刺激、軟骨置換、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）、マトリックス誘導自家軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）のいずれか１つと併せて行われる、上記［３６］に記載の方法。
［４０］
前記ポリペプチドを投与するステップは、マトリックスまたは生体適合性の足場において行われる、上記［３６］に記載の方法。
［４１］
対象を治療する方法であって、前記方法は、前記対象に治療有効量の上記［１］から［１７］のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与するステップを含み、前記対象は関節損傷もしくは関節炎があるか、またはそのリスクがある、方法。
［４２］
前記患者は、関節炎または関節損傷がある、上記［４１］に記載の方法。
［４３］
前記患者は、関節炎または関節損傷のリスクがある、上記［４１］に記載の方法。
［４４］
前記関節炎は、変形性関節症、外傷性関節炎または自己免疫性関節炎である、上記［４２］または上記［４３］に記載の方法。
［４５］
ヒアルロン酸を投与するステップをさらに含む、上記［４１］から［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
冒された関節への外科的手技をさらに含む、上記［４１］から［４５］のいずれか一項に記載の方法。
［４７］
前記ポリペプチドを投与するステップは、外科的手技の間または後に行われる、上記［４１］から［４５］のいずれか一項に記載の方法。
［４８］
前記ポリペプチドを投与するステップは、骨髄刺激、軟骨置換、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）、マトリックス誘導自家軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）のいずれか１つと併せて行われる、上記［４６］に記載の方法。
［４９］
前記ポリペプチドを投与するステップは、１つまたは複数の追加の軟骨形成因子と併せて、またはそれに加えて行われる、上記［４１］〜［４６］のいずれか一項に記載の方法。
［５０］
前記ポリペプチドを投与するステップは、マトリックスもしくは生体適合性の足場とともに、またはそれに加えられる、上記［４１］〜［４６］のいずれか一項に記載の方法。

Claims (5)

1. 外科的手技と併せて関節炎または関節損傷を治療、改善または予防するための医薬組成物であって、
   配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７０の配列のいずれか一つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、
   当該ポリペプチドにおいて、配列番号１を参照して決定される４２３位のアミノ酸がＱもしくはＳであるか、または４２３位のアミノ酸が欠失しており、
   前記ポリペプチドは、軟骨形成活性がある、医薬組成物。
2. 前記外科的手技は、関節の洗浄、骨髄の刺激、アブレーション関節形成（abrasion arthroplasty）、肋軟骨下ドリリング（subchondral drilling）および基部の軟骨下骨のマイクロフラクチャーからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 脊椎、肩、肘、手首、指の関節、尻、膝、足首または足の関節における軟骨損傷を治療するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記ポリペプチドが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記ポリペプチドが、配列番号２８のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の医薬組成物。

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