TW201444865A - 治療關節損傷之肽及組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供新蛋白酶抗性多肽以及治療、改善或預防與關節損傷相關之病況(包含急性關節損害及關節炎)之組合物及方法。
Description
骨關節炎(OA)代表最常見的肌肉骨骼病症。當前有約4000萬美國人受侵襲;業內預測因老化人口及預期壽命增加,在今後20年內此數量將增加至6000萬,從而使其成為殘疾之第四個主要原因。OA之特徵在於關節之緩慢退化性崩壞,該關節包含關節軟骨(含有對關節產生潤滑及緩衝作用之細胞及基質)及下伏關節軟骨之軟骨下骨二者。OA可視為多個病原學因子之結果。例如,其可由異常生物機械應力或遺傳或獲得性關節軟骨或骨異常引起。當前OA療法包含利用口服NSAID或選擇性環氧合酶2(COX-2)抑制劑、關節內(IA)注射諸如皮質類固醇及透明質酸等藥劑以及手術方式之疼痛緩解。
關節損傷(例如急性關節損害(例如半月板或韌帶撕裂)或關節內骨折)亦可導致關節炎,例如創傷後關節炎。由於關節軟骨具有有限的修復能力,故即使不可檢測之小損傷通常仍可隨時間變壞並導致OA。對關節損害之當前治療可包含手術及致力於受損關節再生之其他侵入性程序以及使用藥劑治療以減輕疼痛及發炎。
間葉幹細胞(MSC)存在於成人關節軟骨中,且在分離後可在活體外經程式化以分化成軟骨細胞及其他間葉細胞譜系,且可用於軟骨再生。該過程部分地係由生長因子(TGFβ、BMP)、血清條件及細胞-細胞接觸來調控。WO2011/008773闡述肽組合物及彼等組合物治療或預
防關節炎及關節損害以及誘導間葉細胞分化成軟骨細胞之用途。此外,WO2012/129562闡述小分子化合物、組合物及彼等組合物改善關節炎及關節損害以及誘導間葉細胞分化成軟骨細胞之用途。
儘管手術技術及再生技術已在軟骨恢復、減緩退化及改良關節損傷之修復方面取得一定進展,但業內仍需要改良用於有效軟骨再生、治療關節損傷及改善或預防OA之組合物及方法。
本發明係關於血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)之新多肽及蛋白質變體之鑒定,該等新多肽及蛋白質變體具有例如比野生型ANGPTL3更穩定、較不易受蛋白水解及酶促降解影響之經改良醫藥特性。本發明亦提供治療關節損傷或關節損害之醫藥組合物及方法以及改善或預防哺乳動物之關節炎、關節損傷或關節損害之方法。
因此,本發明提供包括以下胺基酸序列之蛋白酶抗性多肽:與選自表1序列之任一者或多者且如本文所進一步闡述之胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性或至少96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。表1之經修飾多肽包含除位置423處之K或R外為極性胺基酸之胺基酸,如參考全長ANGPTL3多肽序列SEQ ID NO:1所確定。在一些實施例中,如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處之胺基酸為Q或S。在某些實施例中,如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處之胺基酸為Q。在某些實施例中,如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處之胺基酸為S。在某些實施例中,如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處之胺基酸缺失。此外,所提供之多肽具有軟骨形成活性。
在一些實施例中,該多肽包括與以下序列中之任一者具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID
NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。在一些實施例中,該多肽包括與以下序列中之任一者具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64。在一些實施例中,該多肽包括表1之任一序列。在一些實施例中,該多肽包括以下序列中之任一者:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。在一些實施例中,該多肽包括以下序列中之任一者:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64。在一些實施例中,多肽係表1之任一序列。在一些實施例中,多肽係以下序列中之任一者:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID
NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。在一些實施例中,多肽係以下序列中之任一者:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63及SEQ ID NO:64。
本發明之多肽可納入一或多種化學修飾(例如聚乙二醇化)。在一些實施例中,本發明之多肽可包括呈融合蛋白形式之異源肽,其可視情況在多肽之胺基端或羧基端末端融合。本發明亦提供編碼本發明多肽之多核苷酸;含有編碼該等多肽之多核苷酸之載體;及包括該等載體之宿主細胞。
本發明亦提供包括本發明之多肽及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。該等組合物可於本文所提供之方法中用於治療、改善或預防患者之關節炎或關節損傷,其中該方法包括向患者之關節投與治療有效量之本發明醫藥組合物。可自該等方法受益之病況之實例包含(但不限於)關節炎(例如骨關節炎、創傷性關節炎)及關節損傷(例如急性關節損害)。
本發明進一步提供治療個體之方法,其包括投與治療有效量之本發明多肽。所提供之方法包含治療罹患或具有罹患關節損傷及/或關節炎風險之個體,其包括向個體投與治療有效量之一或多種本發明多肽或其醫藥組合物。本發明仍進一步提供誘導間葉幹細胞分化成軟骨細胞之方法,其包括使間葉幹細胞與有效量之本發明多肽接觸以誘導間葉幹細胞分化成軟骨細胞。
包含本發明之其他特徵、優點及實施例之本發明之該等及其他
態樣將進一步詳細闡述並闡明於本發明之以下詳細描述及隨附申請專利範圍中。
圖1繪示經改造以改良蛋白質穩定性且增強蛋白水解抗性之hANGPTL3蛋白質之示意圖。在野生型蛋白及肽序列之蛋白產生期間,在Lys423與Ser424之間觀察到100%裂解。為減少蛋白水解,產生多種突變體肽,其中將Lys423突變成Gln或Ser;或將Ser424突變成Thr;或使Lys423缺失。
圖2A及B繪示軟骨特異性蛋白在ANGPTL3及經改造構築體存在或不存在下表現之圖形表示。對固定細胞進行染色用於2A 2A型原膠原量化(PIIANP)或2B II型膠原量化,以在如例示中所闡述之治療後測定分化成軟骨細胞之細胞%。圖2C繪示在ANGPTL3或經改造構築體存在或不存在下與陽性對照蛋白bFGF相比之血管生成分析之量化的圖形表示。總管長度及分枝點數係血管生成之量化量度。儘管他人已報導ANGPTL3之血管生成活性,但此研究確認了活性以及FGF之活性;結果指示在C端ANGPTL3構築體中未保留顯著活性。
圖3係顯示軟骨特異性蛋白在ANGPTL3或經改造構築體存在下之表現增加之圖形表示。3A.在治療後10天時使用qRT-PCR評估細胞以量測在如所闡述之治療後軟骨特異性蛋白之RNA表現。潤滑素、聚集蛋白聚糖及Sox9代表軟骨相關蛋白;IGF及IFITM1代表分化潛能,且骨鈣化素及X型膠原代表骨/纖維化相關蛋白。3B.在如所闡述之治療後3天時評估細胞。在使用經改造構築體或野生型ANGPTL1 C端區域多肽治療後可見聚集蛋白聚糖表現增加。
圖4繪示ANGPTL3及經改造構築體之軟骨保護活性之圖形表示。4A:糖胺聚糖(GAG)釋放,其係基質損傷之指標,其隨ANGPTL3及突變體構築體之量增加而受抑制。離體GAG釋放(基質損傷之指標)抑
制分析係使用在如所闡述之構築體存在或不存在下治療之牛軟骨來實施。4B及4C:NO釋放隨ANGPTL3及如所指示之經改造構築體之量增加而受抑制。在如所闡述之構築體存在或不存在下治療軟骨細胞,然後進行Greiss反應分析,以測定NO釋放之抑制作為軟骨保護之指標。
圖5繪示顯示在構築體存在下在肥厚條件下抑制X型膠原表現(纖維軟骨形成活性之指標)之圖形表示。在如所闡述在構築體存在或不存在下在肥厚條件下治療初代軟骨細胞,然後測定X型膠原表現,藉由免疫螢光評估,作為纖維形成及肥厚性軟骨/軟骨細胞分化之量度。5A繪示野生型C端ANGPTL3或經改造構築體之結果。5B繪示C端ANGPTL3(WT)或經改造構築體242KQ或242Kdel或C端ANGPTL1之結果。
圖6繪示投藥範例之示意性表示(6A),隨後為在經小鼠ANGPTL3(17-460)治療後如藉由外側股骨踝之軟骨侵蝕評分所量測之關節嚴重程度改良的圖形表示(6B)。
圖7.係在手術誘導軟骨損傷且隨後使用ANGPTL3構築體每週一次持續3週治療(在第7天開始)後小鼠之雙足平衡測痛量測(疼痛之指標)的圖形表示。7A表示在手術後第35天時之雙足平衡測痛量測;且7B表示在手術後第56天時進行之量測。
圖8.係在ANGPTL3構築體(所指示)之每週一次3次治療(第7、14及21天)後,關節嚴重程度總評分及由膠原酶誘導之軟骨損傷之嚴重程度改良的圖形表示。
圖9.繪示使用經改造之ANGPTL3構築體治療後關節損傷之大鼠半月板撕裂模型之結果。圖9A係治療後5週時關節中之蛋白多糖含量之圖形表示;圖9B係治療後5週時股關節嚴重程度評分之圖形表示。結果圖解說明在ANGPTL3構築體(所指示)之每週一次3次治療(第7、14及21天)後藉由手術割斷大鼠之半月板誘導的軟骨損傷之改良。
圖10繪示在使用經改造之ANGPTL3構築體治療後關節損傷之大鼠半月板撕裂模型之結果。圖10A係如藉由嚴重程度、番紅O強度、軟骨面積及軟骨厚度量測之活體內修復%之圖形表示。圖10B係在手術誘導軟骨損傷且隨後治療後大鼠之雙足平衡測痛量測(疼痛之指標)之圖形表示。
圖11係總體嚴重程度總評分(total gross severity score)之圖形表示,其圖解說明在第4天開始每兩週一次投藥(每次為1.5μg/劑量或15μg/劑量)或僅在第7天給予30μg單一劑量後,藉由手術破壞狗之內半月板誘導之軟骨損傷的改良。
本發明至少部分地基於刺激間葉幹細胞之軟骨細胞分化且抵抗蛋白酶(例如胰蛋白酶樣蛋白酶)裂解之血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)多肽的鑒定。WO2011/008773闡述ANGPTL3肽組合物及肽組合物治療或預防關節炎及關節損害以及誘導間葉細胞分化成軟骨細胞之用途。已發現野生型ANGPTL3蛋白質質經歷蛋白酶剪切且不穩定,並已鑒定出減少此效應之序列變體。因此,本發明提供用於修復軟骨之經改良肽組合物。具體而言,本發明提供根據本發明經修飾以具有與野生型ANGPTL3多肽相比增加的蛋白酶抗性之ANGPTL3肽。本發明亦提供投與ANGPTL3多肽來預防或改善關節炎或關節損害之組合物及方法,其係藉由向關節、軟骨組織或軟骨近端組織中或全身投與本發明多肽來實施。此外,本發明提供誘導間葉幹細胞分化成軟骨細胞之組合物及方法。
如本文所使用之術語「蛋白酶抗性」係指包括與相應未經修飾之野生型多肽相比使多肽較不易受胰蛋白酶樣蛋白酶裂解影響之修飾的多肽。在特定實施例中,蛋白酶抗性多肽係相對於天然野生型肽序
列在R或K殘基處具有胺基酸取代之ANGPTL3多肽。
「ANGPTL3」係指血管生成素蛋白家族之成員。ANGPTL3之胺基酸序列(GenBank登錄號NP_055310.1)陳述於SEQ ID NO:1中,且其相應多核苷酸序列陳述為SEQ ID NO:2(NCBI參考序列號NM014495.2,其中ANGPTL3編碼序列包括SEQ ID NO:2之nt 52-1434)。「ANGPTL3多肽」係指天然表現之多肽。出於本發明之目的,通常參考全長野生型人類ANGPTL3多肽序列(SEQ ID NO:1)來確定胺基酸之編號。因此,在本發明之多肽僅含有全長ANGPTL3之C端部分但不含N端部分的實施例中,儘管該肽之長度小於460個胺基酸,但位置之編號係基於SEQ ID NO:1。例如,對本發明ANGPTL3多肽之位置423之提及係指SEQ ID NO:1之位置423,即使本發明之ANGPTL3多肽本身長度僅可為200個胺基酸。在確定所關注序列中「對應於」參考序列(例如SEQ ID NO:1)中之位置的胺基酸時,此係藉由最佳比對序列(例如使用預設CLUSTAL比對參數或預設BLAST2比對參數且比較該等序列)來實施。例如,所關注序列中「參考SEQ ID NO:1確定之」位置423或「對應於」SEQ ID NO:1之位置423之胺基酸意指當所關注序列與SEQ ID NO:1最佳比對時與SEQ ID NO:1之位置423比對之胺基酸。
術語「擬肽」及「模擬物」係指具有與天然或非天然多肽(例如ANGPTL3)實質上相同之功能特徵但不同(但通常相似)之結構特徵的合成化學化合物。肽類似物通常在該領域中用作非肽活性化合物(例如藥物)且具有與模板肽之彼等類似之特性。該等非肽化合物稱為「肽模擬物」或「擬肽」(Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986);Veber及Freidinger TINS第392頁(1985);及Evans等人J.Med.Chem.30:1229(1987))。與治療上有用之肽結構類似之肽模擬物可用於產生等效或增強之治療或預防效應。通常,擬肽與範例多肽(即,
具有生物或藥理活性之多肽)結構相似,例如在所關注多肽中發現者,但具有一或多個視情況由選自由例如以下組成之群之連接體置換之肽連接體:-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。模擬物可完全由胺基酸之合成非天然類似物構成,或為部分天然肽胺基酸與胺基酸之部分非天然類似物之嵌合分子。模擬物亦可納入任一量之天然胺基酸保守取代,只要該等取代亦不實質上改變模擬物之結構及/或活性即可。例如,若模擬物組合物能夠具有ANGPTL3多肽之軟骨形成活性,則其係在本發明之範疇內。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。本發明之多肽、肽及蛋白質包括具有軟骨形成活性之蛋白酶抗性ANGPTL3擬肽。
術語「胺基酸」係指天然及合成胺基酸以及以與天然胺基酸相似之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係由遺傳密碼編碼之彼等以及彼等稍後經修飾之胺基酸,例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然胺基酸具有相同的基本化學結構(即,與氫、羧基、胺基及R基團結合之α碳)之化合物,例如,高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如,正白胺酸)或經修飾之肽骨架,但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。以天然方式編碼之胺基酸為20種常見胺基酸(丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸)以及吡咯離胺酸、吡咯啉-羧基-離胺酸及硒代半
胱胺酸。
「保守修飾變體」適用於胺基酸序列及核酸序列二者。關於具體核酸序列,保守修飾之變體係指彼等編碼一致或基本上一致之胺基酸序列之核酸,或在該核酸不編碼胺基酸序列之情況下係指基本上一致之序列。由於遺傳密碼之簡併性,大量功能相同之核酸編碼任一給定蛋白質。例如,密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此,在丙胺酸由密碼子指定之每一位置處,可在不改變所編碼多肽的情況下將該密碼子改變成所闡述之任一相應密碼子。該等核酸變異為「沉默變異」,其係保守修飾變異中之一種。本文之由多核苷酸編碼之每個多肽序列皆涵蓋核酸之每個可能的沉默變異。熟習此項技術者將意識到,核酸中之每一密碼子(AUG(其通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)及TGG(其通常為色胺酸之唯一密碼子)除外)可經修飾以產生功能相同之分子。因此,編碼多肽之核酸之每一沉默變異隱含在每一所闡述序列中。
熟習此項技術者將意識到,核酸、肽、多肽或蛋白質序列之參考原始編碼之胺基酸序列改變、添加或缺失單一胺基酸或小百分比胺基酸之個別取代、缺失或添加產生「保守修飾變體」,其中該變化產生經化學相似胺基酸之胺基酸取代及/或產生具有與原始蛋白質相似之功能活性之結構相似蛋白質的多肽序列。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為業內所熟知。該等保守修飾變體亦包括且不排除本發明之多態變體、種間同源物及對偶基因。
術語「保守胺基酸取代」係指一類胺基酸經來自該同一類之不同胺基酸之取代(在概念上或其他方面)。取代之一實例係基於分析同源有機體之相應蛋白質間之胺基酸變化之標準化之頻率(例如,參見Schulz,G.E.及R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。根據該等分析,可定義胺基酸之群,其中群內之胺
基酸彼此優先交換,且因此彼此在其對總體蛋白質結構之影響方面最為相似(例如,參見Schulz,G.E.及R.H.Schirmer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。以此方式定義之胺基酸群之一實例包含:(i)帶電荷之群,其係由Glu及Asp、Lys、Arg及His組成;(ii)帶正電荷之群,其係由Lys、Arg及His組成;(iii)帶負電荷之群,其係由Glu及Asp組成;(iv)芳香族群,其係由Phe、Tyr及Trp組成;(v)氮環群,其係由His及Trp組成;(vi)大脂肪族非極性群,其係由Val、Leu及Ile組成;(vii)微極性群,其係由Met及Cys組成;(viii)小殘基群,其係由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln及Pro組成;(ix)脂肪族群,其係由Val、Leu、Ile、Met及Cys組成;及(x)小羥基群,其係由Ser及Thr組成。基於共享物理特性之保守取代之其他實例係以下群組內之取代:1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G);2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E);3)天冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q);4)精胺酸(R)、離胺酸(K);5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W);7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(例如,參見Creighton,Proteins(1984))。
「序列一致性百分比」係藉由比較比較窗口內之兩個最佳比對序列來確定,其中比較窗口中之胺基酸序列或多核苷酸序列部分可包括與不包括添加或缺失之參考序列(例如本發明之多肽)相比之添加或缺失(即空位),用於兩個序列之最佳比對。該百分比係藉由以下方式來計算:測定相同核酸鹼基或胺基酸殘基在兩個序列中出現之位置數以產生匹配位置數,用匹配位置數除以比較窗口中之總位置數且用結果乘以100,產生序列一致性百分比。
術語「一致」或「一致性」%在兩個或更多個核酸或多肽序列之背景下係指兩個或更多個為相同序列之序列或子序列。在比較窗口內
或指定區域內如利用以下序列比較演算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查所量測針對最大對應比較及比對時,若兩個序列具有相同胺基酸殘基或核苷酸之指定百分比(即,在指定區域內或在未指定時在整個序列內95%一致,視情況96%、97%、98%或99%一致),則該兩個序列「實質上一致」。本發明提供分別與本文所例示之多肽(例如SEQ ID NO:11-42中之任一者)實質上一致之多肽及其用途,包含(但不限於)用於治療或預防關節炎或關節損害。視情況,對於核酸,一致性存在於至少約150個核苷酸長度之區域內,或更佳300至450或600或更多個核苷酸長度之區域內,或參考序列之整個長度。視情況,對於胺基酸序列,一致性存在於至少約50個胺基酸長度之區域內,或更佳100至150或200或更多個胺基酸長度之區域內,或參考序列之整個長度。
就序列比較而言,一個序列通常用作與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較演算法時,將測試序列及參考序列輸入電腦中,必要時指示子序列坐標,並指定序列算法程式參數。可使用預設程式參數,或可指示替代參數。隨後,序列比較演算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分數。
如本文所使用,「比較窗口」包含提及選自由50至600、通常約75至約200、更通常為約100至約150個組成之群之任一鄰接位置數的區段,在該比較窗口中,序列可與具有相同鄰接位置數之參考序列在兩個序列經過最佳比對後進行比較。對序列實施比對以供比較之方法為業內所熟知。可藉由(例如)以下方式對序列實施最佳比對以供比較:Smith及Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c之局部同源性演算法;Needleman及Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443之同源性比對演算法;Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444之對相似性方法之研究;該等演算法之電腦化執行方案
(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或人工比對及目視檢查(例如,參見Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
適用於測定序列一致性及序列相似性百分數之演算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0演算法,其分別闡述於Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402及Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法首先涉及藉由識別詢問序列中之代碼長度縮寫W來識別高評分序列對(HSP),當代碼與一個數據庫序列中具有相同長度之代碼進行比對時,其將與某一正臨限評分T相匹配或滿足其條件。T稱作相鄰代碼評分臨限值(Altschul等人,參見上文)。該等初始相鄰字符串用作種子以供起始發現含有其之更長HSP的搜尋。將字符串沿每一序列之兩個方向延伸,只要可使累積比對評分增加即可。對於核苷酸序列,累積評分係使用參數M(匹配殘基對之獎勵評分;始終>0)及N(不匹配殘基之懲罰評分;始終<0)來計算。對於胺基酸序列,使用評分矩陣來計算累積評分。字符串在每一方向上之延伸在以下時候停止:累積比對評分自其所達成之最大值降低了X數量;由於一或多個負評分殘基比對累加而使累積評分變為零或負值;或達到任一序列之端點。BLAST演算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用以下各值作為預設值:字長(W)11、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩條鏈之比較值。對於胺基酸序列,BLASTP程式使用以下各值作為預設值:字長3及預期值(E)10以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比對(B)50、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩條鏈之比較值。
BLAST演算法亦對兩個序列間之相似性實施統計學分析(例如,參見Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST演算法提供之一種相似性量測係最小總和概率(P(N)),其用於指示兩個核苷酸或胺基酸序列間偶然發生匹配之概率。例如,若在測試核酸與參考核酸之比較中最小總和概率小於約0.2、更佳小於約0.01且最佳小於約0.001,則認為該核酸與該參照序列相似。
術語「經分離」在用於核酸或蛋白質時指示核酸或蛋白質經純化以基本上不含與其然狀態締合之其他細胞組份。其通常呈均質或接近均質狀態。其可為無水或水溶液。純度及均勻性可使用業內已知且常用之分析型化學技術來測定,例如聚丙烯醯胺凝膠電泳、高效液相層析等。為製劑中所存在之主要種類之蛋白質實質上經純化。在一些實施例中,術語「經純化」指示蛋白質在電泳凝膠中產生基本上一條帶。通常,其意指蛋白質為至少85%純度,更佳至少95%純度,且最佳至少99%純度。
在本文中使用術語「透明質酸」包含透明質酸之衍生物,包含透明質酸之酯、透明質酸之鹽且亦包含術語透明質酸。該名稱亦包含透明質酸及交聯透明質酸或海蘭(hylan)之低及高分子量形式。該等透明質酸之實例係SynviscTM(Genzyme公司Cambridge,Mass.)、ORTHOVISCTM(Anika Therapeutics,Woburn,Mass.)、HYALGANTM(Sanofi-Synthelabo公司,Malvern,Pa.)及ProVisc(Alcon/Novartis)。
除非上下文另外明確指明,否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用,單數形式「一(a、an)」及「該」包含複數個指示物。
血管生成素樣蛋白3係分泌因子之血管生成素樣蛋白家族之成員。其主要在肝臟中表現,且具有血管生成素之特徵結構,由信號
肽、N端螺旋狀螺旋結構域(CCD)及C端纖維蛋白原(FBN)樣結構域組成。顯示血管生成素樣蛋白3結合αV/β3整合素,且僅FBN樣結構域足以誘導內皮細胞黏著及活體內血管生成(Camenisch等人,J.Biol.Chem.277:17281-17290,2002)。內源ANGPTL3通常在活體內裂解成胺基端及羧基端片段。如上文所概述及本文所進一步闡述,本發明涵蓋多種具有軟骨形成活性之蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白質之用途。
在一些實施例中,經分離多肽包括與選自表1之任一序列之胺基酸序列具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定。本發明之多肽具有軟骨形成活性。在一些實施例中,該多肽包括與選自以下中任一者之胺基酸序列具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在另一實施例中,該多肽包括與選自以下中任一者之胺基酸序列具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID
NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。
在一些實施例中,經分離多肽包括選自表1之任一序列之胺基酸序列,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在一些實施例中,該多肽包括選自以下中任一者之胺基酸序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在另一實施例中,該多肽包括選自以下中任一者之胺基酸序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。
在一些實施例中,經分離多肽與選自表1之任一序列之胺基酸序列具有至少95%之一致性或至少96%、97%、98%或99%之一致性,其
中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在一些實施例中,該多肽與選自以下中任一者之胺基酸序列具有至少95%之一致性或至少96%、97%、98%或99%之一致性:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在另一實施例中,該多肽與選自以下中任一者之胺基酸序列具有至少95%之一致性或至少96%、97%、98%或99%之一致性:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。
在一些實施例中,經分離多肽係選自表1之任一序列之胺基酸序列。在一些實施例中,多肽係選自以下中任一者之胺基酸序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID
NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。在另一實施例中,多肽係選自以下中任一者之胺基酸序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64。
本發明之經修飾ANGPTL3多肽在多肽之C端部分中具有至少一個取代以使多肽具有蛋白酶抗性。該取代位於R或K殘基處以使多肽具有例如針對胰蛋白酶樣蛋白酶之增加的抗性。在本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽中,任何胺基酸可取代R或K。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些
實施例中,取代為Q。在一些實施例中,取代為S。在一些實施例中,參考SEQ ID NO:1,蛋白酶抗性肽在位置423處具有除K或R外之胺基酸。在一些實施例中,本發明之多肽包括在位置423處為極性胺基酸之胺基酸。例如,位置423處之胺基酸可為Q或S或另一極性胺基酸。在某些實施例中,本發明之多肽在位置423處具有Q。在其他實施例中,本發明之多肽在位置423處具有S。在一些實施例中,除423處之取代外,蛋白酶抗性肽在SEQ ID NO:1或其變體之C端具有另一R或K之取代,其中該取代為除R或K外之極性胺基酸。在一些實施例中,如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處之取代為Q或S。在另一些實施例中,本發明之多肽具有如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處之缺失。
在一些實施例中,本發明多肽之長度為250個胺基酸或更短,且包括以下胺基酸序列:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。
在一些實施例中,本發明提供全長蛋白酶抗性軟骨形成ANGPTL3蛋白質之用途。在一些實施例中,本發明提供蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白質,其包括ANGPTL3序列或其軟骨形成變體之C端部分。在某些實施例中,ANGPTL3蛋白質缺少天然蛋白質之胺基末端。在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白質缺少CCD結構域及/或缺少顯著CCD活性。因此,在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白質包括人類ANGPTL3蛋白質羧基端結
構域之至少一個片段(例如至少100、150、200、220或215個連續胺基酸)或與人類羧基端ANGPTL3蛋白質序列實質上一致之序列,其中多肽及其變體保留軟骨形成活性。在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性多肽缺少C端序列之至少一部分,例如缺少來自SEQ ID NO:1之C末端之5、10、15或20個胺基酸(即,缺少SEQ ID NO:1之456-460、451-460、446-460或441-460)。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包括對應於以下胺基酸區域之連續胺基酸:SEQ ID NO:1之胺基酸241-455或241-460;SEQ ID NO:1之胺基酸242-455或242-460;SEQ ID NO:1之胺基酸233-455或233-460;SEQ ID NO:1之胺基酸228-455或228-460,SEQ ID NO:1之胺基酸226-455或226-260或胺基酸225-455或225-260,其中R或K被胺基酸取代或單一殘基缺失。在一些實施例中,取代位於如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處。在一些實施例中,缺失位於如參考SEQ ID NO:1確定之位置423處。在一些實施例中,蛋白酶抗性多肽包括對應於胺基酸區域SEQ ID NO:1之207-455或207-460之連續胺基酸,其中R或K被胺基酸取代或單一殘基缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於位置423處。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在某些實施例中,包含相對於SEQ ID NO:1之位置423處之缺失。
本發明另外提供蛋白酶抗性多肽,其中該多肽包括與SEQ ID NO:1之胺基酸240-454、SEQ ID NO:1之胺基酸241-455或SEQ ID NO:1之胺基酸242-455具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列且具有對應於SEQ ID NO:1之位置423處之胺基酸之取代或缺失,其中所取代之胺基酸不為R,且其中多肽具有軟
骨形成活性。在其他實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:1之胺基酸240-454、SEQ ID NO:1之胺基酸241-455或SEQ ID NO:1之胺基酸242-455,每一多肽皆具有對應於SEQ ID NO:1之位置423處之胺基酸之取代或缺失,其中所取代之胺基酸為Q或S。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包括與以下胺基酸具有至少95%或至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:1之胺基酸242-455或242-460;SEQ ID NO:1之241-455或241-460;SEQ ID NO:1之胺基酸233-455或233-460;SEQ ID NO:1之胺基酸228-455或228-460,SEQ ID NO:1之胺基酸226-455或226-260,或SEQ ID NO:1之胺基酸225-455或225-260,其中R或K被胺基酸取代,或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於位置423處。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在某些實施例中,所缺失殘基位於相對於SEQ ID NO:1之位置423處。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽之長度為250個或240個或更少胺基酸,且包括以下胺基酸序列:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。在一些實施例中,本發明之
蛋白酶抗性ANGPTL3多肽之長度為230個或225個或更少胺基酸,且包括以下胺基酸序列:SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白質包括與犬、牛或馬ANGPTL3蛋白質序列之C端具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白質包括天然犬(SEQ ID NO:4)、馬(SEQ ID NO:5)或牛(SEQ ID NO:6)ANGPTL3蛋白質序列之至少一個片段(例如至少100、150、200、215個連續胺基酸)或與天然犬、牛或馬ANGPTL3蛋白質序列實質上一致之序列,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在一些實施例中,經分離多肽包括與SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有至少95%一致性或至少96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在一些實施例中,該多肽與SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43具有至少95%之一致性或至少96%、97%、98%或99%之一致性,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,或該多肽在位置423處包括一個缺失,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且該多肽具有軟骨形成活性。在某些實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43。在另一實施例中,該多肽為SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3包括與以下各項具有至少95%或至少96%、97%、98%或至少99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:4之胺基酸232-454、SEQ ID NO:4之胺基酸240-454、SEQ ID NO:4之胺基酸227-454或SEQ ID NO:4之胺基酸224-454,其中R或K被胺基酸取代或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於SEQ ID NO:4之位置422處,其對應於SEQ ID NO:1之位置423。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在一些實施例中,胺基酸缺失位於SEQ ID NO:4之位置422處。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3包括與以下各項具有至少95%或至少96%、97%、98%或至少99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:5之胺基酸233-455、SEQ ID NO:5之胺基酸241-455、SEQ ID NO:5之胺基酸228-455或SEQ ID NO:5之胺基酸225-455,其中R或K被胺基酸取代或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於SEQ ID NO:5之位置423處,其對應於SEQ ID NO:1之位置423。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在一些實施例中,胺基酸缺失位於SEQ ID NO:5之位置423處。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3包括與以下各項具有至少95%或至少96%、97%、98%或至少99%一致性之胺基酸序列:SEQ ID NO:6之胺基酸233-455、SEQ ID NO:6之胺基酸241-455、SEQ ID NO:6之胺基酸228-455或SEQ ID NO:6之胺基酸225-455,其中R或K被胺基酸取代或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於SEQ ID NO:6之位置422處,其對應於SEQ ID NO:1之位置423。在一
些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在一些實施例中,胺基酸缺失位於SEQ ID NO:6之位置422處。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包括對應於以下胺基酸區域之連續胺基酸:SEQ ID NO:4之胺基酸240-454;SEQ ID NO:4之胺基酸232-454;SEQ ID NO:4之胺基酸227-454或SEQ ID NO:4之胺基酸224-454,其中R或K被胺基酸取代或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於SEQ ID NO:4之位置422處(其係如參考SEQ ID NO:1確定之位置423)。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在一些實施例中,胺基酸缺失位於SEQ ID NO:4之位置422處。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包括對應於以下胺基酸區域之連續胺基酸:SEQ ID NO:5之胺基酸241-455;SEQ ID NO:5之胺基酸233-455;SEQ ID NO:5之胺基酸228-455或SEQ ID NO:5之胺基酸225-455,其中R或K被胺基酸取代或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於位置423處(其對應於如參考SEQ ID NO:1確定之位置423)。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在一些實施例中,胺基酸缺失位於SEQ ID NO:5之位置423處。
在一些實施例中,本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包括對應於以下胺基酸區域之連續胺基酸:SEQ ID NO:6之胺基酸241-455;SEQ ID NO:6之胺基酸233-455;SEQ ID NO:6之胺基酸228-455或SEQ
ID NO:6之胺基酸225-455,其中R或K被胺基酸取代或R或K缺失。在一些實施例中,取代或缺失位於SEQ ID NO:6之位置422處(其係如參考SEQ ID NO:1確定之位置423)。在一些實施例中,取代為極性胺基酸,例如H、N、Q、S、T、A或Y。在一些實施例中,取代為H、N、Q、S、T或Y。在一些實施例中,取代為S或Q。在一些實施例中,取代為Q。在一些實施例中,缺失位於SEQ ID NO:6之位置422處。
如上文所闡述之本發明ANGPTL3蛋白質可包含側接上文所闡述區域之天然ANGPTL3蛋白質序列。另一選擇為,在一些實施例中,本發明之ANGPTL3蛋白質可包含非天然ANGPTL3蛋白質側接序列。例如,可將ANGPTL3蛋白質之軟骨形成活性部分融合至一或多個融合伴侶及/或異源胺基酸以形成融合蛋白。融合伴侶序列可包含(但不限於)胺基酸標籤、非L(例如D-)胺基酸或其他胺基酸模擬物以延長活體內半衰期及/或蛋白酶抗性,從而靶向序列或其他序列。
在一些實施例中,本發明之多肽經聚乙二醇化。在一些實施例中,本發明之多肽融合至異源肽。在某些實施例中,多肽融合至以下各項中之任一者:人類血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、聚組胺酸、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G、麥芽糖結合蛋白質(MBP)或任一前述異源多肽之片段。在具體實施例中,異源多肽係在本發明多肽之胺基末端融合。在其他或替代實施例中,異源多肽係在本發明多肽之羧基末端融合。
本發明之ANGPTL3蛋白質具有軟骨形成活性且具有蛋白酶抗性。如本文所定義,軟骨形成或軟骨形成活性係指軟骨細胞自MSC之發育。軟骨形成活性之指標包含(但不限於)軟骨基質產生。軟骨基質產生可藉由多種標記來量測,例如Sox9、II型膠原或糖胺聚糖(GAG)產生。在一些實施例中,GAG產生經量測作為軟骨基質產生之標記。在一些實施例中,GAG產生以及軟骨特異性蛋白表現之3倍增加指示
陽性軟骨基質產生。
可使用量測絲胺酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)裂解之任何已知分析來評估多肽之蛋白酶抗性。在一些實施例中,用於評估蛋白水解敏感性之蛋白酶係絲胺酸蛋白酶胰蛋白酶。若多肽在與其野生型對應部分相比時具有對胰蛋白酶降低的敏感度,則認為其具有蛋白酶抗性。分析之實例係量測當將多肽暴露於胰蛋白酶下一定時間段時產生之與相應天然人類肽相比之裂解產物量。裂解可使用任何已知之分析(例如SDS PAGE或LCMS)來量測。說明性分析提供於實例部分中。
在說明性分析中,藉助胰蛋白酶水解之限制性蛋白水解係藉由以下方式來實施:在室溫下將10ng欲評估蛋白質與胰蛋白酶以8000:1(蛋白質:胰蛋白酶)之質量比一起培育1hr。然後可藉由添加乙酸使反應達到pH 3.0來驟冷胰蛋白酶水解反應。然後藉由SDS-PAGE例如在4%-12% Tris-Bis凝膠上分離所驟冷之樣品,以自彼等藉由出現胰蛋白酶裂解所產生之片段裂解者鑒定出抵抗裂解之蛋白質。在蛋白酶抗性多肽中,與其野生型對應部分相比,裂解產物不存在或有所減少。
在一些實施例中,本發明之ANGPTL3多肽將包括至少一個非天然編碼之胺基酸。在一些實施例中,該多肽包括1個、2個、3個、4個或更多個非天然胺基酸。製備非天然胺基酸且將其引入蛋白質中之方法為業內已知。例如,參見美國專利第7,083,970號及第7,524,647號。與產生正交翻譯系統之一般方法一樣,產生適於製備包括一或多個期望非天然胺基酸之蛋白質之正交翻譯系統的一般原則為業內已知。例如,參見國際公開案第WO 2002/086075號,標題為「METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS」;WO 2002/085923,標題為「IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS」;WO 2004/094593,標題為
「EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE」;WO 2005/019415,於2004年7月7日提出申請;WO 2005/007870,於2004年7月7日提出申請;WO 2005/007624,於2004年7月7日提出申請;WO 2006/110182,於2005年10月27日提出申請,標題為「ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS」及WO 2007/103490,於2007年3月7日提出申請,標題為「SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS」。關於納入非天然胺基酸之正交翻譯系統及其產生方法及用途之論述,亦參見Wang及Schultz,(2005)「Expanding the Genetic Code.」Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66;Xie及Schultz,(2005)「An Expanding Genetic Code.」Methods 36:227-238;Xie及Schultz,(2005)「Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire.」Curr Opinion in Chemical Biology 9:548-554;及Wang等人,(2006)「Expanding the Genetic Code.」Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249;Deiters等人,(2005)「In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli.」Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524;Chin等人,(2002)「Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.」J Am Chem Soc 124:9026-9027;及國際公開案第WO2006/034332號,於2005年9月20日提出申請。其他細節參見美國專利第7,045,337號;第7,083,970號;第7,238,510號;第7,129,333號;第7,262,040號;第7,183,082號;第7,199,222號;及第7,217,809號。
「非天然編碼之胺基酸」係指不為普通胺基酸或吡咯離胺酸、吡咯啉-羧基-離胺酸或硒代半胱胺酸中之一者之胺基酸。可與術語
「非天然編碼之胺基酸」同義使用之其他術語為「非天然胺基酸(non-natural amino acid、unnatural amino acid、non-naturally-occurring amino acid)」及其帶不同連字符及無連字符形式。術語「非天然編碼之胺基酸」亦包含(但不限於)藉由修飾(例如翻譯後修飾)天然編碼之胺基酸(包含(但不限於)20種普通胺基酸或吡咯離胺酸、吡咯啉-羧基-離胺酸及硒代半胱胺酸)出現但本身並非藉由翻譯複合物天然納入生長多肽鏈中之胺基酸。該等非天然胺基酸之實例包含(但不限於)N-乙醯葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯葡糖胺基-L-蘇胺酸及O-磷酸酪胺酸。
非天然編碼之胺基酸通常係具有除20種天然胺基酸中所使用外之任何取代基側鏈之任何結構。由於本發明之非天然編碼之胺基酸通常與天然胺基酸僅在側鏈結構方面有所不同,故非天然編碼之胺基酸與其他胺基酸形成醯胺鍵,其他胺基酸包含(但不限於)以與其在天然多肽中所形成相同之方式天然或非天然編碼之胺基酸。然而,非天然編碼之胺基酸具有區別其與天然胺基酸之側鏈基團。例如,R視情況包括烷基-、芳基-、醯基-、酮-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒代-、磺醯基-、硼酸鹽、酸鹽、磷酸、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺基或諸如此類或其任何組合。可適用於本發明中之所關注之其他非天然胺基酸包含(但不限於)包括光可活化交聯劑之胺基酸、自旋標記之胺基酸、螢光胺基酸、金屬結合胺基酸、含有金屬之胺基酸、放射性胺基酸、含有新穎官能基之胺基酸、與其他分子共價或非共價相互作用之胺基酸、光捕獲及/或光可異構化胺基酸、包括生物素或生物素類似物之胺基酸、糖基化胺基酸(例如經糖取代之絲胺酸)、經其他碳水化合物修飾之胺基酸、含酮胺基酸、包括聚乙二醇或聚醚之胺基酸、經重原子取代之胺基酸、化學可裂解及/或光可裂解胺基
酸、具有與天然胺基酸相比延長之側鏈(包含(但不限於)聚醚或長鏈烴,包含(但不限於)大於約5個或大於約10個碳)之胺基酸、含有碳連接糖之胺基酸、氧化還原活性胺基酸、含有胺基硫代酸之胺基酸及包括一或多個毒性部分之胺基酸。
可適用於本發明中且可用於與水溶性聚合物反應之例示性非天然編碼之胺基酸包含(但不限於)具有羰基、胺基氧基、肼、醯肼、半卡肼、疊氮化物及炔烴反應基團之彼等。在一些實施例中,非天然編碼之胺基酸包括糖部分。該等胺基酸之實例包含N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-半乳糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-蘇胺酸、N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-天冬醯胺及O-甘露糖胺基-L-絲胺酸。該等胺基酸之實例亦包含其中胺基酸與糖間之天然N-或O-連接體經不常於自然界中發現之共價連接體置換之實例,該等共價連接體包含(但不限於)烯烴、肟、硫醚、醯胺及諸如此類。該等胺基酸之實例亦包含不常於天然蛋白質中發現之糖,例如2-去氧-葡萄糖、2-去氧半乳糖及諸如此類。
可視情況引入本發明之ANGPTL3蛋白質(例如在多肽鏈內或在N端或C端)中以例如延長活體內半衰期之另一類型之修飾係聚乙二醇化或納入長鏈聚乙二醇聚合物(PEG)。引入PEG或PEG之長鏈聚合物會增加本發明多肽之有效分子量以例如防止快速過濾至尿中。在一些實施例中,ANGPTL3序列中之離胺酸殘基係直接或經由連接體偶聯至PEG。該連接體可為例如含有硫醇官能基之Glu殘基或醯基殘基以連接至經適當修飾之PEG鏈。引入PEG鏈之替代方法係首先在C端或溶劑暴露之殘基處引入Cys殘基例如置換Arg或Lys殘基。然後將此Cys殘基位點特異性附接至含有例如馬來醯亞胺官能基之PEG鏈。納入PEG或PEG長鏈聚合物之方法為業內所熟知(闡述於例如Veronese,F.M.等人,Drug Disc.Today 10:1451-8(2005);Greenwald,R.B.等人,Adv. Drug Deliv.Rev.55:217-50(2003);Roberts,M.J.等人,Adv.Drug Deliv.Rev.,54:459-76(2002)),該等文獻之內容皆以引用方式併入本文中。業內已知之聚合物偶聯之其他方法亦可用於本發明中。在一些實施例中,引入聚(2-甲基丙烯醯基氧基乙基磷酸膽鹼)(PMPC)作為與本發明ANGPTL3蛋白質之聚合物偶聯物(例如,參見WO2008/098930;Lewis等人,Bioconjug Chem.,19:2144-55(2008))。在一些實施例中,與ANGPTL3蛋白質之含有磷酸膽鹼之聚合物偶聯物可用於本發明中。熟習此項技術者將容易地意識到,可使用其他生物相容性聚合物偶聯物。
最近報導,經由納入非天然胺基酸納入PEG或PEG聚合物(如上文所闡述)之替代方式可與本發明多肽一起實施。此方式利用所形成之tRNA/tRNA合成酶對且在表現質體中由琥珀阻抑基因密碼子編碼(Deiters,A等人(2004).Bio-org.Med.Chem.Lett.14,5743-5)。例如,可將對疊氮基苯丙胺酸納入本發明多肽中,且然後在還原劑及銅離子存在下與具有乙炔部分之PEG聚合物反應,以促進稱為「Huisgen[3+2]環加成」之有機反應。
在某些實施例中,本發明亦涵蓋ANGPTL3蛋白質之特異性突變以改變多肽之糖基化。該等突變可經選擇以引入或消除一或多個糖基化位點,包含(但不限於)O-連接或N-連接糖基化位點。在某些實施例中,相對於天然ANGPTL3蛋白質,本發明之ANGPTL3蛋白質具有糖基化位點及未經改變之模式。在某些實施例中,ANGPTL3蛋白質之變體包含糖基化變體,其中糖基化位點之數目及/或類型相對於天然ANGPTL3蛋白質已經改變。在某些實施例中,多肽之變體包括相對於天然多肽更大或更小數目之N-連接糖基化位點。N-連接糖基化位點之特徵在於以下序列:Asn-X-Ser或Asn-X-Thr,其中命名為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基。用於產生此序列之胺基酸
殘基取代為添加N-連接碳水化合物鏈提供潛在的新位點。另一選擇為,消除此序列之取代將移除現有的N-連接碳水化合物鏈。在某些實施例中,提供N-連接碳水化合物鏈之重排,其中消除一或多個N-連接糖基化位點(通常為天然存在之彼等)且產生一或多個新N-連接位點。
例示性ANGPTL3蛋白質變體包含半胱胺酸變體,其中相對於天然ANGPTL3蛋白質之胺基酸序列一或多個半胱胺酸殘基缺失或取代另一胺基酸(例如絲胺酸)。在某些實施例中,半胱胺酸變體可用於例如在分離不溶性包涵體後必須將ANGPTL3蛋白質再摺疊成生物活性構型時。在某些實施例中,半胱胺酸變體具有少於天然多肽之半胱胺酸殘基。在某些實施例中,半胱胺酸變體具有偶數個半胱胺酸殘基以使源自未配對半胱胺酸之相互作用最小化。
在一些實施例中,ANGPTL3蛋白質之功能變體或經修飾形式包含本發明ANGPTL3蛋白質與一或多個融合結構域之融合蛋白。融合結構域之熟知實例包含(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G、免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)及/或人類血清白蛋白(HSA)。融合結構域或其片段可經選擇以確認期望特性。例如,一些融合結構域尤其可用於藉由親和層析分離融合蛋白。出於親和純化之目的,使用親和層析之相關基質,例如麩胱甘肽-、澱粉酶-及鎳-或鈷-偶聯樹脂。許多該等基質係以「套組」形式獲得,例如可與(HIS6)融合伴侶一起使用之Pharmacia GST純化系統及QLAexpressTM系統(Qiagen)。作為另一實例,融合結構域可經選擇以幫助檢測ANGPTL3蛋白質。該等檢測結構域之實例包含多種螢光蛋白(例如GFP)以及「表位標籤」,其通常係用於獲得特異性抗體之短肽序列。業內可容易地獲得針對特異性單株抗體之熟知表位標籤,包含FLAG、流行性感冒病毒紅血球凝集素(HA)及c-myc標籤。在一些情形下,融合結構域具有例如針對因子
Xa或凝血酶之蛋白酶裂解位點,此允許相關蛋白酶部分地消化融合蛋白且由此釋放來自其之重組蛋白。然後可藉由隨後層析分離分離所釋放蛋白質與融合結構域。在某些實施例中,ANGPTL3蛋白質融合有在活體內穩定ANGPTL3蛋白質之結構域(「穩定子」結構域)。「穩定化」意指增加血清半衰期之任何事項,無論其係因破壞減少、腎臟清除率減小或係其他藥物代謝動力學效應引起。已知與免疫球蛋白Fc部分之融合賦予大量蛋白質期望藥物代謝動力學特性。同樣,與人類血清白蛋白融合可賦予期望特性。可選擇之其他類型之融合結構域包含多聚(例如二聚、四聚)結構域及功能結構域(其視需要賦予其他生物功能)。融合物可經構築以使異源肽在本發明多肽之胺基端及/或本發明多肽之羧基端融合。
本發明亦提供編碼本發明之蛋白酶抗性多肽之核酸以及用於表現蛋白酶抗性多肽之表現載體及宿主細胞。在其他態樣中,本發明提供編碼本發明多肽之多核苷酸以及包括該多核苷酸之表現載體及宿主細胞。在一些實施例中,多核苷酸經最佳化以在宿主細胞中進行表現。在一些實施例中,本發明提供改善或預防人類患者之關節炎或關節損害之方法,該方法包括:向患者之關節投與編碼本發明多肽之表現載體,由此多肽之表現改善或預防患者之關節炎或關節損害。在一些實施例中,患者患有關節炎或關節損害。在一些實施例中,個體並不患有但處於罹患關節炎或關節損害之風險。在一些實施例中,關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。
本發明多肽之表現採用重組遺傳領域中之常規技術。業內已知揭示本發明中所使用之一般方法之基礎教科書尤其包含Sambrook及Russell編輯(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版;Ausubel等人編輯(2007年,且經2010年更新)Current Protocols in
Molecular Biology系列。
表現可採用業內已知之任何適宜宿主細胞,例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。原核及真核表現系統二者均可廣泛地使用。在一些實施例中,表現系統係哺乳動物細胞表現(例如CHO細胞表現)系統。在一些實施例中,核酸可經密碼子最佳化以有助於在期望宿主細胞中表現。
非病毒載體及系統包含質體及附加型載體,通常包括用於表現蛋白質或RNA之表現盒及人類人工染色體(例如,參見Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。例如,可用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現本發明多肽之非病毒載體包含pThioHis A、B及C、pcDNA3。業內已知I/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及多種其他載體用於表現其他蛋白質。有用病毒載體包含(但不限於)基於腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒之載體、基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)之載體、禽痘載體、痘瘡病毒載體及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus,SFV)。
表現載體之選擇端視欲表現載體之預期宿主細胞而定。通常,表現載體含有啟動子及可操作地連接至編碼本發明多肽之多核苷酸之其他調控序列(例如增強子)。在一些實施例中,採用誘導型啟動子以防止插入序列在除誘導條件外之條件下表現。誘導型啟動子包含例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子或熱休克啟動子。此外,亦可納入其他調控元件以改良編碼本發明多肽之核酸之表現,其他調控元件係例如增強子、核糖體結合位點、轉錄終止序列及諸如此類。
在一些實施例中,編碼本發明多肽之核酸亦可包含編碼分泌信號序列之序列以使得多肽自宿主細胞分泌。該序列可由載體提供或作
為存在於載體中之ANGPTL3核酸之一部分。
用於引入含有所關注多核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而變化。例如,通常將氯化鈣轉染用於原核細胞,而可將磷酸鈣處理或電穿孔用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人,參見上文)。其他方法包含例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉化、注射及顯微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、聚陽離子:核酸偶聯物、裸DNA、人工病毒粒子、與皰疹病毒結構蛋白VP22之融合物、DNA之藥劑增強攝取及離體轉導。對於重組蛋白之長期、高產率產生而言,通常期望穩定表現。例如,可使用含有病毒複製起點或內源表現元件及可選擇標記基因之本發明表現載體來製備穩定表現本發明多肽之細胞系。
在一些實施例中,可將編碼本發明之蛋白酶抗性ANGPTL3多肽之核酸遞送至患者用於治療關節相關損害或疾病。該等核酸之遞送可使用業內已知之任何方式來達成,但通常利用直接注射至受侵襲關節中來實施。在一些實施例中,DNA係以裸DNA形式利用直接注射至關節中來遞送。在一些實施例中,採用病毒載體,包含(但不限於)腺病毒或腺病毒相關載體、皰疹病毒載體、禽痘病毒或痘瘡病毒載體。
本發明所提供之方法包含治療個體之方法,其包括向個體投與治療有效量之本發明多肽,其中該個體患有或具有關節損傷或關節炎之風險。本發明亦提供改善或預防人類患者之關節炎或關節損害之方法,該方法包括:向患者之關節投與包括有效量之本發明多肽之組合物,由此改善或預防患者之關節炎或關節損害。在一些實施例中,患者患有關節炎或關節損害。在一些實施例中,個體並不患有但處於罹患關節炎或關節損害之風險。在一些實施例中,關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。在一些實施例中,所投與之組合物進
一步包括透明質酸。
在另一態樣中,本發明提供誘導間葉幹細胞分化成軟骨細胞之方法,該方法包括使間葉幹細胞與足夠量之本發明多肽接觸以誘導幹細胞分化成軟骨細胞。在一些實施例中,該方法係在活體內實施且幹細胞存在於人類患者中。
預期本發明之多肽、組合物及方法可用於治療、改善或預防任何類型之關節軟骨損傷(例如關節損傷或損害),包含例如源自創傷性事件或腱或韌帶撕裂之損傷。在一些實施例中,例如倘若存在關節炎或關節損傷或關節損害之遺傳或家族病史或處在關節手術之前或期間,則投與本發明之蛋白質來預防或改善關節炎或關節損傷。在一些實施例中,使用多肽、組合物及方法來治療關節損傷。在具體實施例中,關節損傷為創傷性關節損害。在其他實施例中,關節損傷係源自年齡或殘疾之損傷。在另一些實施例中,關節損傷係源自自體免疫病症之損傷。在本發明之一些實施例中,可使用本發明之多肽、組合物及方法來治療、改善或預防骨關節炎。在一些實施例中,使用多肽、組合物及方法來改善或預防具有罹患或獲得關節炎風險之個體之關節炎。在一些實施例中,使用多肽、組合物及方法來改善或預防具有罹患或獲得關節損傷風險之個體之關節損傷。
在一些實施例中,本發明之多肽、組合物及方法提供在因例如創傷性損害或軟骨病而損傷之軟骨組織中刺激軟骨細胞增殖及軟骨產生的方法。在具體實施例中,本發明之多肽、組合物及方法可用於治療例如鉸接表面處之關節(例如脊柱、肩、肘、腕、手指關節、臀部、膝、踝及足關節)中之軟骨損傷。可自治療受益之疾病或病症之實例包含骨關節炎、類風濕性關節炎、其他自體免疫疾病或肱骨內環軟骨炎。此外,軟骨損傷或破壞作為某些遺傳或代謝病症之結果出現,軟骨畸形通常可見呈人類侏儒症形式,且/或軟骨損傷或破壞通
常係重構手術之結果;因此,多肽、組合物及方法不論單獨抑或與其他方式結合在該等患者中將係有用療法。
進一步預期,本發明之多肽、組合物及方法可用於治療、改善或預防多種軟骨性病症及/或該等病況之相關症狀或效應。使用本發明之多肽、組合物及方法治療、改善及/或預防之例示性病況或病症包含(但不限於)全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、骨關節炎、椎間盤退化性疾病、脊柱關節病、艾登二氏症候群(Ehlers Danlos syndrome)、全身性硬化(硬皮病)或腱疾病。可自使用多肽治療受益以改善相關效應之其他病況或病症包含特發性發炎性肌病(皮肌炎、多發性肌炎)、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、全身性脈管炎、類肉瘤病、自體免疫溶血性貧血(免疫全血球減少症、陣發性夜間血紅素尿症)、自體免疫血小板減少症(特發性血小板減少性紫瘢症、免疫介導之血小板減少症)、甲狀腺炎(格雷氏病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、幼年型淋巴球性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導之腎疾病(腎小球腎炎、腎小管間質炎);中樞及外周神經系統之脫髓鞘疾病,例如多發性硬化、特發性脫髓鞘多發性神經病變或格林-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome)及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變;肝膽管疾病,例如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型及其他非親肝病毒肝炎)、自體免疫慢性活性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎及硬化性膽管炎、發炎性腸病(潰瘍性結腸炎:克羅恩氏病(Crohn's disease))、麩質敏感性腸病及惠普爾病(Whipple's disease);自體免疫或免疫介導之皮膚病,包含大皰性皮膚病、多形性紅斑及接觸性皮炎、牛皮癬;過敏性疾病,例如氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎、食物過敏及蕁麻疹;肺之免疫性疾病,例如嗜伊紅性肺炎、特發性肺部纖維化及過敏性肺炎;移植相關疾病,包含移植物排斥及移植物抗宿主病。
如本文所使用之「患者」係指投與本發明之治療性多肽之任何個體。預期本發明之多肽、組合物及方法可用於治療哺乳動物。如本文所使用,「個體」係指任何哺乳動物,包含人類、家養及農場動物以及動物園動物、運動用動物或寵物,例如牛(例如乳牛)、馬、狗、綿羊、豬、兔、山羊、貓等。在本發明之一些實施例中,個體為人類。在某些實施例中,個體為馬。在其他實施例中,個體為狗。
在一些實施例中,本發明之多肽可與欲治療之哺乳動物異源。例如,使用人類ANGPTL3蛋白質或其片段、衍生自人類ANGPTL3蛋白質之蛋白質或肽(例如經修飾之人類ANGPTL3蛋白質、人類ANGPTL3蛋白質之保守變體、衍生自人類ANGPTL3蛋白質之擬肽)來治療諸如馬、牛或犬等動物。在一些實施例中,可使用異源ANGPTL3蛋白質來擴增培養物中之軟骨細胞群以供移植。在一些實施例中,然後視情況將所擴增培養物與欲治療哺乳動物同源之多肽及組合物混合,且置於關節間隙中或直接置於軟骨缺損中。另一選擇為,本發明之多肽係衍生自相同物種,即人類ANGPTL3蛋白質或其片段、衍生自人類ANGPTL3蛋白質之蛋白質或肽(例如經修飾之人類ANGPTL3蛋白質、人類ANGPTL3蛋白質之保守變體、衍生自人類ANGPTL3蛋白質之擬肽),且用於治療人類患者。藉由使用衍生自與所治療哺乳動物相同之物種之蛋白質,可避免偶然的免疫反應。
在一些實施例中,本發明之多肽及組合物係以單獨或與適於延長蛋白質釋放之載劑複合形式藉由直接注射至關節之滑液中、全身性投與(口服或靜脈內)或直接注射至軟骨缺損中來施加。在一些實施例中,多肽或組合物係在生物相容性基質或支架中投與。本發明之多肽、組合物及方法亦可與受侵襲關節處之手術程序組合使用。本發明多肽之投與可在手術程序之前、期間或與其組合及/或在其之後進行。例如,可使用本發明之多肽、組合物及方法來擴增培養物中之軟
骨細胞群以供自體或同種異體軟骨細胞植入(ACI)。可視情況植入軟骨細胞,同時進行由投與本發明之多肽及組合物組成之治療。在該等程序中,例如,可自受損關節之未受損小承載區域以關節鏡方式收穫軟骨細胞,且可視情況在本發明之多肽及組合物及/或其他生長因子存在下進行活體外培養以增加細胞數目,然後進行移植。然後視情況將所擴增培養物與本發明之多肽及組合物混合及/或置於關節間隙中或直接置於缺損中。在某些實施例中,將所擴增培養物(視情況含有本發明多肽)置於懸浮於基質或膜中之關節間隙中。在其他實施例中,本發明之多肽及組合物可與一或多個含有軟骨形成細胞之骨膜或軟骨膜移植物組合使用及/或幫助所移植之軟骨細胞或軟骨細胞前體細胞固持就位。在一些實施例中,本發明之多肽及組合物係與其他程序組合使用來修復軟骨損傷,該等其他程序包含(但不限於)關節灌洗、骨髓刺激、磨削關節成形術、軟骨下骨鑽孔或近端軟骨下骨之微小骨折。視情況,在投與本發明之多肽及組合物且軟骨生長後,其他手術治療可有益於適宜地與新形成軟骨表面之輪廓相符。
包括所提供多肽之治療性組合物係在本發明之範疇內,且根據展現增強的穩定性及蛋白酶抗性之若干多肽序列之鑒定特別地涵蓋。因此,在另一態樣中,本發明提供包括治療有效量之本發明多肽之醫藥組合物。在某些實施例中,醫藥組合物進一步包括醫藥上或生理上可接受之載劑。在一些實施例中,醫藥組合物進一步包括透明質酸或其衍生物。
此外,本發明提供改善或預防人類患者之關節炎或關節損害之方法,該方法包括:向患者之關節投與包括有效量之本發明多肽之組合物,由此改善或預防患者之關節炎或關節損害。在一些實施例中,患者患有關節炎或關節損害。在一些實施例中,個體並不患有但處於
罹患關節炎或關節損害之風險。在一些實施例中,關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。在一些實施例中,所投與之組合物進一步包括透明質酸。
在另一態樣中,本發明提供誘導間葉幹細胞分化成軟骨細胞之方法,該方法包括使間葉幹細胞與足夠量之本發明多肽接觸以誘導幹細胞分化成軟骨細胞。在一些實施例中,該方法係在活體內實施,幹細胞存在於人類患者中,且接觸包括向患者之關節投與包括有效量之本發明多肽之組合物,由此誘導幹細胞分化成軟骨細胞,並產生軟骨。
可將包括編碼本發明多肽之核酸之治療性組合物遞送至患者用於治療關節相關損害或疾病,且亦在本發明之範疇內。在一些實施例中,醫藥組合物包括編碼本發明多肽之裸DNA。在一些實施例中,採用病毒載體來實現遞送,且醫藥組合物包括編碼本發明多肽之載體,包含(但不限於)腺病毒或腺病毒相關載體、皰疹病毒載體、禽痘病毒或痘瘡病毒載體。醫藥組合物包括治療有效量之編碼本發明多肽之核酸與醫藥上或生理上可接受之載劑。
在本發明之另一態樣中,涵蓋所提供多肽用作治療關節損傷之藥劑。在某些實施例中,提供本發明之多肽用作改善關節炎或關節損傷之藥劑。在一些實施例中,關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。在一些實施例中,關節損傷為創傷性關節損害、自體免疫損傷、年齡相關損傷或與殘疾相關之損傷。在其他實施例中,提供編碼本發明多肽之核酸用於藥劑中。
適於投與之調配物包含賦形劑,包含(但不限於)水性及非水性溶液;等滲無菌溶液,其可含有使調配物等滲之抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及溶質;及水性及非水性無菌懸浮液,其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。在某些實施例中,醫藥組合物包括治療有效量之肽與針對投與模式、遞送格式及期望劑量之適宜性選擇之
醫藥上可接受之調配劑的混合物。例如,參見Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.R.Gennaro編輯,Mack Publishing公司1990)及其後續版本。醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可在性質上為水性或非水性。例如,適宜注射用媒劑或載劑可為水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液,視情況補充有非經腸投與用組合物中常見之其他材料。例如,可使用緩衝劑將組合物維持在生理學pH或稍低pH下,通常介於約pH 5至約pH 8範圍內,且可視情況包含山梨醇、血清白蛋白、洗滌劑或其他額外組份。在某些實施例中,包括多肽或編碼本發明多肽之核酸之醫藥組合物可經製備以使用適宜賦形劑(例如蔗糖)以凍乾形式儲存。
在另一些實施例中,提供多肽或編碼本發明多肽之核酸的可控或持續釋放之含有藥劑之調配物(例如可注射微球、生物可蝕性粒子、聚合物化合物、珠粒或脂質體或其他生物相容性基質)則可經由積存注射來遞送。例如,多肽或編碼本發明多肽之核酸可囊封於脂質體中,或調配成微粒或微膠囊,或可納入其他媒劑中,例如生物可降解聚合物、水凝膠、環糊精(例如參見Gonzalez等人,1999,Bioconjugate Chem.,10,1068-1074;Wang等人,國際PCT公開案第WO 03/47518號及第WO 03/46185號)、聚(乳-共-乙醇)酸(PLGA)及PLCA微球(例如參見美國專利第6,447,796號及美國專利申請公開案第US 2002130430號)、生物可降解奈米膠囊及生物黏著微球,或藉助蛋白質性載體(O'Hare及Normand,國際PCT公開案第WO 00/53722號)或藉由使用偶聯物。其他適宜遞送機制包含可植入之遞送裝置。
用於治療上文所提及疾病或病症之本發明化合物之劑量端視投與方式、個體之年齡及/或體重以及欲治療個體之病況而變化,且最終將由主治醫師或獸醫來決定。在本發明上下文中,投與患者之劑量應足以隨時間在患者中實現有益反應。該劑量為「治療有效量」。因
此,適宜劑量可由所採用之具體蛋白質或編碼本發明多肽之核酸的功效及個體之病況以及體重或欲治療區域之表面積來確定。劑量大小亦將由伴隨具體個體中具體蛋白質或載體之投與出現之任何不良副作用的存在、性質及程度來決定。投與可經由單一或分開劑量或經由植入裝置或導管連續輸注來完成。投藥頻率將端視所使用調配物中多肽或編碼本發明多肽之核酸之藥物代謝動力學參數而定。臨床醫師可滴定劑量及/或改變投與以達成期望治療性效應。典型劑量介於約0.01μg/kg至約100mg/kg範圍內,此端視多個因素而定。在某些實施例中,劑量介於以下範圍內:約0.1μg/kg至約10mg/kg;或約0.1μg/kg;約0.5μg/kg;約1μg/kg;約2μg/kg;約5μg/kg;約10μg/kg;約15μg/kg;約20μg/kg;約25μg/kg;約30μg/kg;約35μg/kg;約40μg/kg;約45μg/kg;約50μg/kg;約55μg/kg;約60μg/kg;約65μg/kg;約75μg/kg;約85μg/kg;約100μg/kg。在某些實施例中,劑量係約50μg/kg;約100μg/kg;約150μg/kg;約200μg/kg;約250μg/kg;約300μg/kg;約350μg/kg;約400μg/kg;約450μg/kg;約500μg/kg;約550μg/kg;約600μg/kg;約650μg/kg;約700μg/kg;約750μg/kg;約800μg/kg;約850μg/kg;約900μg/kg;約950μg/kg;約1mg/kg;約2mg/kg;約3mg/kg;約4mg/kg;約5mg/kg;約6mg/kg;約7mg/kg;約8mg/kg;約9mg/kg;約10mg/kg。
可使用任何方法將本發明之蛋白質或編碼本發明多肽之核酸遞送至受侵襲關節。在本發明之實踐中,組合物可非經腸投與,例如注射,例如關節內(即,注射至關節中)、靜脈內、肌內、皮下;輸注或植入,例如植入膜、基質、裝置中等。在注射、輸注或植入時,可將遞送引導至適宜組織或關節中,且遞送可為直接濃注遞送或連續遞
送。在一些實施例中,遞送可在適宜組織中於極為靠近受侵襲關節處定位。在一些實施例中,遞送可經由擴散或定時釋放濃注來實施。在一些實施例中,可將可控釋放系統(例如幫浦)置於治療靶(例如投與多肽之關節)附近。在其他實施例中,組合物可經選擇來攝取,例如吸入或口服遞送。
本發明之治療性多肽或編碼本發明多肽之核酸亦可有效地與以下各項組合使用:一或多種其他活性劑(例如透明質酸或其衍生物或鹽、生長因子(例如FGF18、BMP7)、軟骨形成劑(例如,口服鮭降鈣素、SD-6010(iNOS抑制劑)、維生素D3(膽鈣化醇)、膠原水解產物、乙酸蘆沙拉肽(rusalatide acetate)、鱷梨大豆非皂化物(ASU)、WO2012/129562中所闡述之化合物、卡徒葛寧(kartogenin))、類固醇、非類固醇抗發炎劑(NSAID)等),此端視改良或增強任一治療效應之期望療法或效應而定。此過程可涉及向患者同時投與呈包含兩種藥劑之單一組合物或藥理調配物形式之兩種藥劑,或藉由投與兩種不同組合物或調配物來實施,其中一種組合物包含多肽或編碼本發明多肽之多核苷酸,且另一者包含第二藥劑。包括多肽或編碼本發明多肽之多核苷酸之治療性組合物可在投與第二藥劑之前或之後以介於幾分鐘至幾週範圍內之間隔來投與。
可將化合物之調配物以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或去水或凍乾粉末形式儲存在無菌小瓶中。調配物可存在於單位劑量或多劑量密封容器中,例如安瓿及小瓶。在一些實施例中,調配物可存在於單室或多室預填充注射器(例如液體注射器、來蘇爾注射器(lysosyringe))中。溶液及懸浮液可自先前所闡述種類之無菌粉末、顆粒及錠劑製備。
本發明亦提供包括本發明之多肽或編碼本發明多肽之核酸之套組。在一實施例中提供產生單一劑量投與單元之套組。該套組包括包
含乾燥多肽或編碼本發明多肽之核酸的第一容器及具有水性重構配方之第二容器。在某些實施例中,一容器包括單室預填充注射器。在其他實施例中,涵蓋多個容器作為多室預填充注射器。
提供以下實例進行說明,而非限制所主張之本發明。
構築多種N端截短突變體以移除O-連接糖基化並幫助表徵生物物理蛋白質。為鑒定蛋白酶抗性肽,將胺基酸取代引入人類Angptl3肽片段之對應於肽C端區域之多個位置中。圖1顯示人類Angptl3突變之位置。首先利用His標籤製備構築體。突變體蛋白為:225-460 K423Q(225KQ)、225-460 S424T(225ST)、226-460 K423Q(226KQ)、226-460 K423S(226KS)、228-460 K423Q(228KQ)、228-460 S424T(228ST)、233-460 K423Q(233KQ)、233-460 K423S(233KS)、241-460 K423Q(241KQ)、241-460 K423S(241KS)、241-460 Kdel(241Kdel)、242-460 K423Q(242KQ)、242-460 K423S(242KS)及242-460 Kdel(242Kdel)。
在HEK FreestyleTM細胞中表現His標記之蛋白質且藉由Ni-NTA管柱層析純化。亦選殖無標籤之C端構築體,藉由先前所闡述之方法純化(Gonzalez R等人PNAS 2010)。簡言之,將具有信號序列(1-16)之靶蛋白選殖至含有巨細胞病毒啟動子之哺乳動物表現載體中。在HEK 293 Freestyle(Invitrogen)中DNA/PEI轉染後96h時,收穫含有分泌靶蛋白之培養基且藉由Hi-Trap SP管柱(GE Healthcare)純化。在50mM MES(pH 6.0)、125mM NaCl與50mM MES(pH 6.0)、150mM NaCl之間溶析蛋白質。SDS-PAGE確認經純化蛋白質為至少95%純。
蛋白酶抗性評估如下。藉由在室溫下將10ng各自製備之蛋白質與胰蛋白酶以8000:1(蛋白質:胰蛋白酶)之質量比一起培育1hr來實施限制性胰蛋白酶水解。然後藉由添加乙酸使反應達到pH 3.0來驟冷胰
蛋白酶水解反應,且藉由LC/MS分析所驟冷樣品。對於各別野生型蛋白質構築體,對應於C端43個胺基酸(S424-E460)質量之5min RP HPLC峰顯而易見。剪切位點位於與在全長野生型ANGPLT3蛋白質產生期間所觀察到相同之位點處,即介於K423與S424之間。此峰當剪切位點處之Lys突變成Gln時不存在。製備且分析肽構築體225KQ、228KQ、233KQ、233KS、241KQ及242KQ中之每一者及野生型225肽。對於每一構築體,對應於C端43胺基酸之質量之峰當剪切位點處之Lys突變成Gln或Ser時或當位置423處之Lys缺失時不存在。
αVβ3整合素 在活體外測試所製備肽225KQ、228KQ、233KQ、24lKQ及242KQ與αVβ3整合素之結合。簡言之,用2μg/ml整合素αVβ3包覆Maxisorp板,且添加不同濃度之多肽構築體(所指示)。藉由添加抗ANGPTL3 mAb、然後添加辣根過氧化物酶偶聯之山羊抗小鼠IgG抗體來檢測結合肽。所有所測試之肽保留或改良整合素結合能力。根據結合數據確定每一者之EC50,且結果顯示於表2中。
α5β1整合素 在活體外測試所製備肽225KQ、228KQ、233KQ、241KQ及242KQ與α5β1整合素之結合。如上文所闡述使用2μg/ml包覆板,但使用整合素α5β1來包覆,且添加不同濃度之多肽構築體(所指示),並如上文所闡述實施檢測。所有所測試之肽保留或改良整合素
結合能力。根據結合數據確定每一者之EC50,且結果顯示於表2中。
細胞培養及分化 對初代人類骨髓源性間葉幹細胞(hMSC)進行FACS分選,且證明對CD29、CD44、CD166及CD105為>98%陽性且對CD45為<0.1%陽性;並使用來自第2-8代之細胞進行實驗。人類軟骨常駐MSC(hCR-MSC)係衍生自人類初代關節軟骨細胞,將其分離成單細胞,在MSCGM中生長成純系,且經由軟骨形成、成骨及脂肪生成分化作用,驗證為MSC。對細胞進行FACS分選且證明對CD166及CD105為>98%陽性。在不改變細胞型態下將hCR-MSC培養高達20代,鑒定生長或分化速率。
軟骨形成. 在物理及功能分析中評估本發明之肽構築體,以評估軟骨形成活性。
本文所提供之經改造構築體係衍生自屬於7種經鑒定ANGPTL蛋白質家族之ANGPTL3,該等ANGPTL蛋白質具有與血管生成素相似之結構,但缺少結合Tie2受體之能力,且因此具有不同功能。ANGPTL蛋白質含有N端螺旋狀螺旋結構域(CCD)及C端纖維蛋白原樣結構域(FLD),且認為係受到其微環境及與細胞外基質(ECM)(例如纖連蛋白及整合素)之相互作用嚴格調控。Conklin等人,Genomics 62(3):477-482(1999);Goh YY等人,Am J Pathol 177(6):2791-2803(2010);Goh YY等人J Biol Chem 285(43):32999-33009(2010)。與ANGPTL3、ANGPTL1(全長及C端結構域)及ANGPTL4(全長及C端結構域)最密切相關之ANGPTL家族成員之序列提供於表3中;且表5B繪示該等家族成員之C端結構域之比對。細胞外結構域與C端結構域ANGPTL1、ANGPTL4以及其他血管生成素蛋白質ANGPTL7、ANGPT1及ANGPT2之序列一致性提供於表5A中。ANGPTL3之C端結構域(CT)與CT ANGPTL1共享37%序列一致性,且與CT ANGPTL4共
享40%序列一致性。
如先前Johnson,K.等人,(2012)Science 336,717中所闡述,在活體外誘導基於細胞之2D軟骨形成作用,並評估。簡言之,將初代人類骨髓源性間葉幹細胞(hMSC)塗覆於生長培養基中,然後更換成含或不含構築體之刺激軟骨形成培養基。
為了先形成影像小結,將孔固定且用羅丹明(Rhodamine)B染色,其中容易由肉眼檢測小結,且藉由光學顯微鏡捕獲影像。為了促進基於高通量成像之檢測及定量法,採用會與膠原非特異性結合之尼羅紅(Nile red)對軟骨形成小結進行染色。在Acumen eX3(高含量成像裝置)上,藉由用488雷射激發,定量經尼羅紅染色之小結,即可快速檢測小結。
如先前Johnson,K.等人,(2012)Science 336,717中所闡述在活體外誘導基於細胞之2D軟骨形成並評估。簡言之,將初代人類骨髓源性間葉幹細胞(hMSC)平鋪於生長培養基中,然後更換成含或不含構築體之軟骨形成刺激培養基,且培養7或14天。然後用甲醛固定細胞,洗滌且然後使用標準免疫細胞化學技術進行染色,以檢測初代軟骨蛋白2A型原膠原(PIIANP)(圖2A)及II型膠原(圖2B)。為檢測II型膠原,用0.2%膠原酶II(Worthington Biochemical,Lakewood,NJ)消化細胞,將其添加至滲透溶液中。使用多波長細胞評分腳本且如先前所闡述經由高含量成像(Image Express Ultra(Molecular Devices,Sunnyvale,CA))量化所檢測每一蛋白質之免疫螢光。參見圖2。藉由如下製備細胞來監測聚集蛋白聚糖表現:簡言之,將初代hMSC(5000個細胞)平鋪於Griener 384孔板中。24小時後,移除生長培養基且更換成25μl含有1% FBS之DMEM。然後將蛋白質構築體以指示劑量添加至每一孔中,且使培養物在37℃下生長3天。用10%福馬林固定細胞且使其經歷免疫細胞化學方法,以檢測聚集蛋白聚糖蛋白質表現。使孔在ImageXpress Ultra上成像且用多波長細胞評分腳本、n=6/蛋白質濃度量化。WT野生型C端(225-460)ANGPTL3、經改造構築體242KQ或242Kdel或全長ANGPTL1、ANGPTL蛋白質之相關家族成員
相對於對照(在不含構築體下刺激之細胞,僅含稀釋劑)之結果例示於圖3B中。對使用225WT、225KQ、226KQ、228KQ、233KQ、241KQ及242KQ構築體中之每一者之實驗可見相似結果。
使用先前及本文針對其他ANGPTL相關家族成員闡述之分析及方法實施軟骨形成分析。實施實驗以檢查密切相關之蛋白質是否賦予軟骨形成活性,且該活性是否保留在蛋白質之C末端。在小結形成分析中,ANGPTL1及ANGPTL4展示活性;然而,在軟骨形成分析中,僅ANGPTL1顯示II型膠原之誘導。參見表4。II型膠原分析之小結形成活性及誘導之結果概述於表4中。ANGPTL1之其他表徵闡述於本文中。參見此實例之其他部分及圖3-5。
表5:人類血管生成素樣蛋白家族成員之序列同源性
5A:人類血管生成素樣蛋白家族成員(ECD或CTD)之序列一致性
5B:人類血管生成素樣蛋白家族成員C端結構域之序列比對
hANGPTL1(271-491)/hANGPTL3(241-460)/hANGPTL4(179-406)
亦利用RNA表現分析來評估軟骨特異性蛋白之表現。簡言之,在無血清DMEM、1×ITS加構築體(如所指示)中,使qRT-PCR hMSC在顆粒培養物(1×106個細胞/顆粒)中生長3、7、10、21天。每3天更換培養基。使用Roche LightCycler(自3個一式兩份(n=6)實施之實驗彙集之數據)量化潤滑素、聚集蛋白聚糖、Sox9、IGF1、IFITM1、骨鈣化素及X型膠原mRNA表現。圖3A表示第10天時242KQ及225WT之表現數據在第3、7及21天時所有基因之基因表現數據相似。
先前已顯示,全長ANGPTL3在人類及小鼠間葉幹細胞二者中皆具有軟骨形成活性。測試構築體在人類、小鼠、大鼠及犬間葉幹細胞中之活性以展示其他物種交叉反應性之能力。將小鼠、大鼠、人類及狗之CR-MSC與上文如所闡述之構築體一起培養18天。將培養物固定且使用標準免疫細胞化學技術進行染色以檢測軟骨細胞特異性蛋白II型膠原,且使用高含量成像量化II型膠原陽性細胞。對於所評估細胞之每一物種確認所量化II型膠原之量的相似增加倍數。
軟骨保護. 在功能分析中評估肽構築體以評估軟骨保護活性。
如Johnson,K.等人,(2012)Science 336,717-721中所闡述實施離體糖胺聚糖(GAG)釋放抑制分析(基質損傷之指標)。簡言之,分離牛軟骨,衝壓成對稱圓且置於器官培養物中。用20ng/ml TNFα及10
ng/ml製瘤素M(OSM)(發炎性調介劑)將切片治療48小時,以在蛋白質構築體存在或不存在下誘導軟骨基質之降解來鑒定糖胺聚糖(GAG)釋放之抑制%。圖4A中所顯示之結果繪示自4種供體(n=12)以及如所指示之經改造構築體及WT 225-460彙集之數據。
如Johnson,K.等人,(2012)Science 336,717-721中所闡述實施活體外一氧化氮(NO)抑制分析(軟骨保護之指標)。簡言之,將初代軟骨細胞與如所指示之蛋白質構築體一起處理48hr。實施Greiss反應,以測定構築體對NO釋放之抑制效應,如圖4B中所顯示之結果繪示利用如所指示之經改造構築體及WT C端片段225-460獲得之結果。圖4C中所顯示之結果繪示利用野生型C端ANGPTL1、經改造之ANGPTL3242KQ或對照獲得之結果。
纖維軟骨形成之抑制. 如上文所闡述藉由添加抗壞血酸且在構築體(所指示)存在或不存在下將初代人類關節軟骨細胞培養14天以誘導肥厚,且藉由免疫螢光來評估X型膠原表現。圖5A中所顯示之結果繪示利用如所指示之構築體225WT或242KQ獲得之數據。圖5B中所顯示之結果繪示利用如所指示之野生型C端ANGPTL1、經改造之ANGPTL3 242KQ或242Kdel或野生型C端ANGPTL3片段225-460獲得之數據。野生型或活性構築體之存在賦予肥厚條件下對纖維軟骨形成之抑制效應,如藉由X型膠原之表現所檢測。
血管生成. 已報導在大鼠角膜模型中,ANGPTL3蛋白質之WT C端結構域具有血管生成活性及活體外及活體內特性。參見Camenisch等人,J.Biol.Chem.277(19):17281-17290(2002)。為解決在活體內投與C端ANGPTL3後誘導新血管之可能風險,檢查活體外血管生成分析。簡言之,利用內皮細胞基礎培養基將初代人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)血清饑餓過夜。然後用綠色細胞示蹤劑標記細胞,且添加至包埋有蛋白質構築體(所指示)之預包覆基質凝膠板中。在用作陽性對
照之全長ANGPTL3(50ng/mL)或242KQ(50ng/mL)或bFGF(50ng/mL)存在下培養18小時後,使用高含量成像量化所形成之分枝點數及總管長度作為血管生成活性之量度。與在全長ANGPTL3或陽性對照存在下可見之效應相比,當細胞與242KQ一起培育時檢測到任一參數無顯著增加。參見圖2C。
CR-MSC存在於透明關節軟骨內且其數目因應損害而增加。軟骨組織受損後,該等細胞具有參與修復過程之能力,但其本身並不足以正確地進行軟骨修復。因此,使得患者剩下缺乏用以支持無痛關節運動之適當能力之關節軟骨,且通常需要手術干預及/或關節置換以維持其生活品質。已發現,ANGPTL3及尤其經改造之蛋白酶抗性ANGPTL3肽具有以下能力:引導人類CR-MSC分化成軟骨細胞,特定分泌透明關節軟骨蛋白II型膠原及Sox9,同時抑制藉由X型膠原之表現顯示之纖維軟骨形成。
已報導,據悉在研究中使用西方墨點(western blotting)觀察到ANGPTL3在人類軟骨細胞、人類MSC或人類滑液纖維母細胞中未表現。在齧齒類動物關節中,經由免疫組織化學(IHC)發現極少至無表現。然而,在人類骨關節炎滑液(n=2)中,藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)檢測到少量ANGPTL3(1.3-6.0ng/mL),此表明在受損關節中,全身性循環蛋白可進入滑液腔中。
小鼠急性損害手術模型. 對C57BL/6小鼠(n=12/組)右膝之前十字韌帶(ACL)、內半月板脛韌帶(MMTL)及內側側韌帶(MCL)實施手術橫斷,以引起膝關節不穩定,且因此產生OA表型,改編自先前所闡述之模型Glasson,S.S.等人,Osteoarthritis Cartilage 15,1061(2007)。為評估ANGPTL3治療之潛在治療益處,在手術後15週時,如圖6A中所指示在第17-19週向小鼠關節內投藥一次/每週:mANGPTL3
劑量=200ng/膝。以0-4等級對脛平臺進行量化評估,0為正常且5為嚴重骨關節炎(軟骨之全厚度破壞)。由2名獨立觀察者對來自每一小鼠之兩個切片以盲性方式進行分級(圖6B)。
藉由雙足平衡測痛測試、或使用雙足平衡測痛監測裝置測定小鼠以手術治療之腿站立對未經治療之腿站立之時間百分比來量測動物之骨關節炎誘導之疼痛的減輕。圖7繪示讀數之結果,此表示將手術後第35天及第56天時之疼痛反應報告為手術肢體對非手術肢體之承重%。治療繪示如上文所闡述投用全長鼠類ANGPTL3(WT17-460)或C端人類ANGPTL3(WT225-460)之動物之結果。
小鼠慢性OA模型(膠原酶VII誘導) 另一廣泛使用之骨關節炎動物模型為膠原酶VII誘導之慢性關節損害模型,其用於評估構築體之活體內功效。該模型及評估係如先前所闡述來實施。參見van der Kraan,P.M.等人,Am.J.Pathol. 135,1001(1989);及Johnson,K.等人,Science 336,717(2012)。簡言之,三(3)天時段之發炎後,膠原酶誘導關節之去穩定,從而造成輕度至中度的軟骨破壞。在膝中誘導後,關節內投與一次/週構築體,持續3週,在添加膠原酶VII後3週時開始。在治療後四十二(42)天時,收集關節且進行切片。股及脛平臺之組織學關節嚴重程度評分允許量化組織修復。經由如上文所闡述之組織學評分確定關節評分之嚴重程度。圖8繪示利用225WT、225KQ、228KQ、233KQ及241KQ構築體之修復。為確認蛋白質在關節中之存在(長期關節內保留),將組織固定且經由免疫組織化學針對WT蛋白質構築體之存在進行染色。分析確認蛋白質之存在,此指示ANGPTL3之關節內保留(且未見對脂質/三酸甘油酯之效應,使用標準代謝面板進行評估,數據未顯示)。
對內側脛平臺之番紅O染色切片(用於檢測損害位點處之蛋白多糖,如上文所闡述)之組織學分析及分級揭露軟骨基質之再生(數據未
顯示)。量化分析確認蛋白多糖之置換與未經處理小鼠中可見之水準相似,而媒劑對照未顯示相似置換。在對損害注射後8週時,亦如上文所闡述針對II型膠原對組織切片進行染色。量化分析確認經構築體治療之關節中II型膠原之增加與未經處理小鼠中可見之水準相似;而媒劑治療之對照未顯示相似增加(數據未顯示)。
大鼠半月板撕裂模型
亦使用大鼠手術損害模型來評估構築體之活體內功效。首先如先前Gerwin N.等人Osteoarthritis Cartilage. 增刊3:S24(2010)所闡述實施模型及評估。簡言之,將膝關節範圍內之皮膚剃毛,且經由切口分離內側側韌帶(MCL),並使MCL穩定且使用解剖刀製造半月板之遠端切口。在手術後第1、2及3週時,關節內注射蛋白質構築體或媒劑對照,然後在手術後第4及6週時收集關節且進行切片。實施股及脛平臺之組織學關節嚴重程度評分以如上文所闡述量化組織修復。顯示6週分析之數據。
在治療後,健康透明軟骨置換損傷。如上文所闡述實施番紅O染色軟骨外側脛平臺之組織學分析及分級且量化。結果展示,經242KQ構築體治療之動物揭露軟骨基質之再生且蛋白多糖之置換與未經處理大鼠中可見之水準相似,而媒劑對照未顯示相似置換。參見圖9。利用225WT可見相似結果。
使用與上文所闡述稍作改變之手術誘導之半月板撕裂模型來起始雄性路易士大鼠(Lewis rat)中之軟骨損傷,以測試242KQ在促進活體內軟骨修復方面之功效。對大鼠實施手術,完全切斷內側側韌帶及內半月板以使關節去穩定,從而使得將來承重造成軟骨快速退化。製造切口切斷針兩側之韌帶,從而確保完全切割。然後使用解剖刀刀片在膝蓋骨韌帶下滑入滑液間隙中,且使用較尖的尖端切割半月板。當關節外側脫位時完成成功的切割。在手術後一週時,藉由將25μL體
積之242KQ或生理鹽水關節內注射至關節內滑液間隙中來對大鼠投藥。
在半月板撕裂手術後28天及關節內注射生理鹽水或構築體後21天時,對研究動物實施安樂死且收穫受侵襲關節以供分析,在PBS中之10%福馬林中固定,用甲酸脫鈣,且包埋於石蠟中,然後進行切片。切割成冠狀切片且針對番紅O染色或不進行染色以供將來免疫組織化學染色。分析揭露內側脛平臺具有最大量之軟骨損傷,且決定僅評估關節之此區域用於242KQ之功效。使用OARSI評分系統,以盲性方式對每一動物(N=10)脛軟骨寬度範圍內之6個切片指派軟骨嚴重程度評分。在不同時間點下進行兩次評分,且然後將評分平均以產生軟骨損傷之評分。此外,利用Matlab產生之自定義腳本實施客觀評分分析。演算法鑒定出關節軟骨表面且客觀量化其他軟骨參數(區域分析、番紅O強度、軟骨面積、軟骨厚度)。結果繪示於圖10A中。
至少在人類中,軟骨之結構修復並不始終與疼痛之緩解相關。儘管齧齒類動物生理學及步伐與人類顯著不同,但242KQ經評估以確定在治療後步伐或花費在手術肢體上之時間長度是否存在任何改良。對經242KQ治療之大鼠實施雙足平衡測痛監測。使大鼠經歷如上文所闡述之經修改的半月板手術。在手術後一週時,將242KQ注射至滑液間隙中。在第28天時,將大鼠之後肢置於雙足平衡測痛監測器上且經10分鐘對每一大鼠採集30次後續讀數,以測定每一後肢上所花費之時間%(重量分佈)。該等數據指示疼痛誘導之重量再分佈。確定在大鼠半月板撕裂模型中,在手術後一週時使用242KQ治療使得大鼠之相同承重能力部分恢復。參見圖10B。
在自發或手術軟骨修復期間之主要挑戰之一係用纖維軟骨置換透明關節軟骨。為探究由ANGPTL3調介之軟骨修復之類型,針對II型膠原(以指示透明關節軟骨)及X型膠原(以指示纖維軟骨)之存在對自上
文實施之大鼠半月板撕裂研究收集之大鼠膝切片進行染色。單次注射20μg242KQ後,X型膠原表現之量之量化減小。
經由蛋白質之124I標記及投與、然後進行PET/uCT成像監測保留來確定242KQ在靜脈內及關節內注射至大鼠膝中後之長期保留。參見Gerwin,N.等人(2006)Advanced drug delivery reviews 58,226-242。將242KQ IA注射至關節中後之平均滯留時間(MRT)經測定為約17.3h,此與所報導之標準2-3h相比顯著增加(參見表6)
狗部分半月板切除關節損害模型 亦在犬關節損害模型中評估ANGPTL3活性。該模型係如Connor,J.R.等人,Osteoarthritis and cartilage/OARS,Osteoarthritis Research Society 17,1236-1243(2009)中所闡述來實施及評估。簡言之,將膝關節範圍內之皮膚剃毛,且經由切口分離內側側韌帶(MCL),並使MCL穩定且使用解剖刀製造半月板之遠端切口。手術後四(4)天時,使動物接受每週兩次投藥(1.5μg或15μg)或在第7天時接受單一劑量(30μg)之蛋白質構築體(全長犬ANGPTL3)或媒劑對照(關節內注射)。在第28天時對狗實施安樂死,且如上文針對大鼠及小鼠實驗所闡述使膝經歷組織學、切片並分級。圖10繪示與犬ANGPTL3之治療相關之修復之總體評分。在對經番紅O染色之狗關節切片進行組織學分級及評估後,其中在生理鹽水組中出現最嚴重軟骨損失之區域係關節之在30μg單一劑量之cANGPTL3後具有最大病灶面積減小的部分。
應理解,本文所闡述之實例及實施例係出於說明之目的,且基
於其之各種修改或變化應為熟習此項技術者所瞭解且欲包含在本申請案之精神與範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 家馬
<400> 5
<210> 6
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<213> 智人
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<210> 8
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<212> PRT
<213> 智人
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<400> 49
<210> 50
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
<400> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
<400> 51
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<212> DNA
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<212> DNA
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<400> 55
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<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<223> 編碼犬227KQ之核酸序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
<400> 69
<210> 70
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<213> 人工序列
<220>
<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
<400> 70
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
<400> 72
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 如所闡述蛋白質或編碼該蛋白質之核酸之合成序列
<400> 73
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 包括如所闡述蛋白質或編碼如所闡述蛋白質之核酸之合成序列
<400> 74
Claims (50)
- 一種經分離多肽,其包括與選自表1序列群之胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列,其中該多肽在位置423處包括一個除了K或R以外之極性胺基酸,其係如參考SEQ ID NO:1所確定,且其中該多肽具有軟骨形成活性。
- 如請求項1之多肽,其中該多肽包括與以下任一者之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。
- 如請求項2之多肽,其中該多肽包括與以下任一者之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64。
- 如請求項1之多肽,其中該多肽包括以下任一者之胺基酸序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。
- 如請求項4之多肽,其中該多肽包括以下任一者之胺基酸序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64。
- 如請求項1之多肽,其中該多肽與以下任一者之胺基酸序列具有至少95%之序列一致性:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70。
- 如請求項6之多肽,其中該多肽與以下任一者之胺基酸序列具有至少95%之序列一致性:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64。
- 如請求項1之多肽,其中該多肽係選自表1序列群之胺基酸序列。
- 如請求項8之多肽,其中該多肽係以下任一序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:70。
- 如請求項9之多肽,其中該多肽係以下任一序列:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64。
- 如請求項1至10中任一項之多肽,其中位置423處之胺基酸為Q或S,或位置423處之該胺基酸缺失。
- 如請求項1至10中任一項之多肽,其中位置423處之胺基酸為Q。
- 如請求項1至10中任一項之多肽,其中位置423處之胺基酸為S。
- 如請求項1至10中任一項之多肽,其中該多肽經聚乙二醇化。
- 如請求項1至10中任一項之多肽,其中該多肽融合至以下任一者:人類血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、聚組胺酸、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G或麥芽糖結合蛋白質(MBP)或其片段。
- 如請求項15之多肽,其中異源肽係在該多肽之胺基末端融合。
- 如請求項15之多肽,其中異源肽係在該多肽之羧基末端融合。
- 一種醫藥組合物,其包括如請求項1至17中任一項之多肽。
- 如請求項18之醫藥組合物,其進一步包括透明質酸或其衍生物。
- 如請求項18之醫藥組合物,其進一步包括選自由以下組成之群之藥劑:口服鮭降鈣素、SD-6010(iNOS抑制劑)、維生素D3(膽鈣化醇)、膠原水解物、FGF18、BMP7、乙酸蘆沙拉肽(rusalatide acetate)、鱷梨大豆非皂化物(ASU)、卡徒葛寧(kartogenin)、類固醇及非類固醇抗發炎劑(NSAID)。
- 一種如請求項18至20中任一項之醫藥組合物之用途,其用於製造用來治療、改善或預防患者之關節炎或關節損傷之藥劑。
- 如請求項21之用途,其中該患者患有關節炎或關節損傷。
- 如請求項21之用途,其中該患者處於罹患關節炎或關節損傷之風險。
- 如請求項22或23之用途,其中該關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。
- 如請求項21至23中任一項之用途,其中該組合物進一步包括透明質酸。
- 如請求項21至23中任一項之用途,其中該患者進一步在受侵襲關節處接受手術程序。
- 如請求項21至23中任一項之用途,其中該藥劑係在手術程序期間或之後投與。
- 如請求項26之用途,其中該藥劑係與以下任一者組合投與:骨髓刺激、軟骨置換、自體軟骨細胞植入(ACI)、基質誘導之自體軟骨細胞植入(MACI)。
- 如請求項21至23中任一項之用途,其中該藥劑係與一或多種其他軟骨形成因子組合投與。
- 如請求項21至23中任一項之用途,其中該藥劑係在基質或生物相容性支架中投與。
- 一種如請求項1至17中任一項之多肽之用途,其用於製造用來誘 導間葉幹細胞分化成軟骨細胞之藥劑。
- 如請求項31之用途,其中該等幹細胞存在於人類個體中。
- 如請求項32之用途,其中該個體患有關節炎或關節損傷。
- 如請求項32之用途,其中該個體處於罹患關節炎或關節損傷之風險。
- 如請求項33或34之用途,其中該關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。
- 如請求項32至34中任一項之用途,其中該個體進一步在受侵襲關節處接受手術程序。
- 如請求項32至34中任一項之用途,其中該藥劑係在手術程序期間或之後投與。
- 如請求項32至34中任一項之用途,其中該藥劑係與一或多種其他軟骨形成因子組合投與。
- 如請求項36之用途,其中該藥劑係與以下任一者組合投與:骨髓刺激、軟骨置換、自體軟骨細胞植入(ACI)、基質誘導之自體軟骨細胞植入(MACI)。
- 如請求項36之用途,其中該藥劑係在基質或生物相容性支架中投與。
- 一種如請求項1至17中任一項之多肽之用途,其用於製造用來治療個體之藥劑,其中該個體患有關節損傷或關節炎或處於罹患關節損傷或關節炎之風險。
- 如請求項41之用途,其中該個體患有關節炎或關節損傷。
- 如請求項41之用途,其中該個體處於罹患關節炎或關節損傷之風險。
- 如請求項42或43之用途,其中該關節炎為骨關節炎、創傷關節炎或自體免疫關節炎。
- 如請求項41至43中任一項之用途,其中該藥劑進一步包括透明質酸。
- 如請求項41至43中任一項之用途,其中該個體進一步在受侵襲關節處接受手術程序。
- 如請求項41至43中任一項之用途,其中該藥劑係在手術程序期間或之後投與。
- 如請求項46之用途,其中該藥劑係與以下任一者組合投與:骨髓刺激、軟骨置換、自體軟骨細胞植入(ACI)、基質誘導之自體軟骨細胞植入(MACI)。
- 如請求項41至43中任一項之用途,其中該藥劑係與一或多種其他軟骨形成因子組合投與或外加在該一或多種其他軟骨形成因子中投與。
- 如請求項41至43中任一項之用途,其中該藥劑係與一或多種基質或生物相容性支架組合投與或外加在該一或多種基質或生物相容性支架中投與。
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