DE602004011789T2 - Zusammensetzungen der orthogonalen Lysyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA Synthetase Paaren und ihre Verwendungen - Google Patents

Zusammensetzungen der orthogonalen Lysyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA Synthetase Paaren und ihre Verwendungen Download PDF

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Description

  • Die Erfindung fällt in das Gebiet der Translationsbiochemie. Die Erfindung betrifft Verfahren zur Produktion sowie Zusammensetzungen orthogonaler tRNAs, orthogonaler Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sowie Paaren davon, die unnatürliche Aminosäuren, z. B. Homoglutamine, als Reaktion auf Selektorcodons, wie z. B. Vier-Basen- und Stopp-Selektorcodons, in Proteine einbauen. Dies umfasst den Einbau mehrerer verschiedener unnatürlicher Aminosäuren in eine einzelne Proteinkette als Reaktion auf Stopp- und Vier-Basen-Selektorcodons. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Produktion von Proteinen in Zellen, die solche Paare verwenden, sowie entsprechende Zusammensetzungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Obwohl der genetische Code aller bekannten Organismen – mit wenigen Ausnahmen – von denselben zwanzig Aminosäuren kodiert wird, ist alles, was für das Hinzufügen einer neuen Aminosäure zum Repertoire eines Organismus erforderlich ist, ein einzigartiges tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar, eine Quelle der Aminosäure und ein einzigartiges Selektorcodon, das die Aminosäure spezifiziert (Furter, Protein Sci. 7, 419–426 (1998)). Zuvor haben die Erfinder gezeigt, dass das Amber-Nichtsinn-Codon TAG zusammen mit orthogonalen M.-jannaschii- und E.-coli-tRNA-Synthetase-Paaren verwendet werden kann, um eine Reihe von Aminosäuren mit neuen Eigenschaften in E.coli (Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 5010–5011 (2000); Wang et al., Science 292, 498–500 (2001); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 56–61 (2003); Chin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11020–11024 (2002)) bzw. in Hefe (Chin und Schultz, ChemBioChem. 3, 1135–1137 (2002)) genetisch zu kodieren. Die beschränkte Anzahl nichtkodierender Triplett-Codons schränkt die letztendliche Anzahl an Aminosäuren, für die ein beliebiger Organismus kodiert, stark ein.
  • Es gibt viele Beispiele natürlich auftretender +1-Rasterverschiebungs-Suppressoren, umfassend UAGN-Suppressoren, die von Su7 abstammen, die für Glutamin kodieren (Maglieryet et al., J. Mol. Biol. 307, 755–769 (2001)), von sufJ abstammende Suppressoren von ACCN-Codons, die für Threonin kodieren (Anderson et al., Chem. Biol. 9, 237–244 (2002)), und CAAA-Suppressoren, die von tRNALys und tRNAGln abstammen (Anderson und Schultz, Biochemistry 42 (32), 9598–608 (2003)). Weiters wurden genetische Selektionen verwendet, um wirksame Vier- und Fünf-Basen-Codon-Suppressor-tRNAs aus großen Bibliotheken von mutierten tRNAs zu identifizieren, umfassend einen E.-coli-tRNASer UCCU-Suppressor (Ibba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 418–423 (1999); Kwok und Wong, Can. J. Biochem. 58, 213–218 (1980)). Dieses natürliche Phänomen wurde unter Verwendung chemisch aminoacylierter tRNAs in vitro auf die Mutagenese unnatürlicher Aminosäuren erweitert. Es wurde eine Reihe von Aminosäuren, umfassend Fluorophor/Quencher-Paare (Terada et al., Nat. Struct. Biol. 9, 257–262 (2002)), als Reaktion auf AGGU und CGGG in Proteine eingebaut (Hou et al., Biochemistry 31, 4157–4160 (1992); Yarus et al., J. Mol. Biol. 192, 235–255 (1986); Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972)). Um den genetischen Code weiter zu erweitern, besteht die Notwendigkeit der Entwicklung verbesserter und/oder zusätzlicher Komponenten der biosynthetischen Mechanismen, z. B. orthogonaler tRNAs, orthogonaler Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und/oder einzigartiger Codons. Diese Erfindung kommt dieser und anderen Bedürfnissen nach, wie nach Lektüre der folgenden Offenbarung ersichtlich wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Translationssysteme bereit, die unter Verwendung orthogonaler tRNA und orthogonaler Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Proteinprodukte produzieren. Die Erfindung betrifft das zusammengesetzte Translationssystem, die Verfahren zur Verwendung des Translationssystems und die vom System produzierten Translationsprodukte. Dieses Verfahren findet, wie hierin beschrieben, eine Reihe von Anwendungen, beispielsweise, ohen darauf beschränkt zu sein, die Produktion therapeutischer Produkte, diagnostischer Reagenzien und industrieller Enzyme.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Translationssystem bereit, umfassend:
    eine orthogonale Lysyl-tRNA (Lysyl-O-tRNA) oder eine modifizierte Variante davon;
    eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise eine orthogonale Lysyl-tRNA oder eine modifizierte Variante davon mit Homoglutamin belädt; oder
    eine orthogonale Lysyl-tRNA (Lysyl-O-tRNA) oder eine modifizierte Variante davon und eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise die Lysyl-O-tRNA oder die modifizierte Variante davon mit Homoglutamin belädt;
    worin die O-RS- und Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon zumindest 50% so wirksam bei der Unterdrückung eines Stopp- oder Rasterverschiebungs-Selektorcodons sind wie PhΔAD mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 28 oder eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD in Kombination mit einer O-tRNA von Seq.-ID Nr. 26.
  • In manchen Ausführungsformen des Translationssystems stammt die Lysyl-O-tRNA, die Variante der O-tRNA, die O-RS oder sowohl die O-tRNA als auch die O-RS von Pyrococcus horikoshii (PhKRS). Verschiedene O-RSs, die im Translationssystem verwendet werden, umfassen PhKRS, E444G, PhΔAD und eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD. In manchen Ausführungsformen zeigt die Pyrococcus-horikoshii-O-RS bei Expression in einer E.-coli-Zelle eine Toxizität, die dasselbe oder ein geringeres Ausmaß aufweist wie/als die Toxizität einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD.
  • Die Lysyl-O-tRNA oder die O-tRNA-Variante umfasst gegebenenfalls eine Erkennungssequenz für ein Vier-Basen-Codon oder ein Amber-Codon. Die Lysyl-O-tRNA oder -Variante kann z. B. eine Erkennungssequenz für AGGA inkludieren. In verwandten Aspekten des Translationssystems verwendet die Lysyl-O-tRNA oder -Variante eine Anti-Codon-Schleife mit der Sequenz CU(X)nXXXAA. In manchen Ausführungsformen dieses Aspekts kann die CU(X)nXXXAA-Sequenz CUCUAAA oder CUUCCUAA sein. Beispiele umfassen die Lysyl-O-tRNA oder -Variante davon, die die in Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26 anzutreffenden Sequenzen inkludiert.
  • In manchen Ausführungsformen der Erfindung sind die O-RS, die Lysyl-O-tRNA oder die Varianten zumindest 50% so wirksam bei der Unterdrückung eines Stopp- oder Rasterverschiebungs-Selektorcodons sind wie E444G, PhΔAD oder eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD in Kombination mit einer O-tRNA aus Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26. In anderen Ausführungsformen verwendet das Translationssystem eine zusätzliche O-RS und eine zusätzliche O-tRNA, wo diese zusätzlichen Komponenten ein Rasterverschiebungs-Selektorcodon unterdrücken, das sich von einem Rasterverschiebungs-Selektorcodon unterscheidet, das von der Lysyl-O-tRNA oder der O-tRNA-Variante und der O-RS unterdrückt wird, die vorzugsweise die Lysyl-O-tRNA oder die O-tRNA-Variante belädt. In anderen Ausführungsformen unterdrückt das Translationssystem sowohl ein Vier-Basen-Selektorcodon als auch ein Stopp-Selektorcodon in einer Target-Nucleinsäure, die für ein Target-Polypeptid kodiert. Das Vier-Basen-Selektorcodon verwendet gegebenenfalls die Sequenz AGGA, und das Stopp-Selektorcodon verwendet gegebenenfalls die Sequenz TAG oder UAG. In manchen Ausführungsformen umfasst das Translationssystem eine Target-Nucleinsäure, die ein Vier-Basen-Selektorcodon umfasst. Das Translationssystem umfasst gegebenenfalls ein Protein, für das die Target-Nucleinsäure kodiert. Dieses Protein kann z. B. einen Homoglutamin-Rest umfassen.
  • Das Translationssystem umfasst gegebenenfalls eine Target-Nucleinsäure, die für ein Vier-Basen-Selektorcodon und ein Stopp-Selektorcodon kodiert. In manchen Aspekten umfasst das Translationssystem ein Protein, für das die Target-Nucleinsäure kodiert, wobei das Protein zumindest zwei verschiedene unnatürliche Aminosäuren inkludiert.
  • Die Erfindung stellt z. B. ein Translationssystem bereit, das eine erste orthogonale tRNA (O-tRNA), die ein Vier-Basen-Selektorcodon erkennt, eine erste orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise die O-tRNA mit einer ersten unnatürlichen Aminosäure belädt, eine zweite O-tRNA, die ein Stopp-Selektorcodon erkennt, sowie eine zweite O-RS verwendet, die vorzugsweise die zweite O-tRNA mit einer zweiten unnatürlichen Aminosäure belädt. In einer Ausführungsform ist das Vier-Basen-Selektorcodon AGGA und das Stopp-Codon UAG. Das Translationssystem liegt gegebenenfalls in einer Zelle vor.
  • In manchen Ausführungsformen des Translationssystems ist die erste oder die zweite O-tRNA eine orthogonale Lysyl-tRNA (Lysyl-O-tRNA) oder eine modifizierte Variante. Die erste O-tRNA ist gegebenenfalls eine orthogonale Lysyl-tRNA (Lysyl-O-tRNA) oder eine geeignete Variante, und die zweite O-tRNA ist eine orthogonale Tyrosyl-tRNA (Tyrosyl-O-tRNA) oder eine geeignete Variante. Gegebenenfalls umfasst das Translationssystem eine Nucleinsäure, die für zumindest ein Vier-Basen-Selektorcodon und ein Stopp-Selektorcodon kodiert. In diesen Ausführungsformen kann das Vier-Basen-Selektorcodon AGGA sein, und das Stopp-Selektorcodon kann TAG oder UAG sein, und die zu translatierende Nucleinsäure ist typischerweise eine exprimierte RNA. In manchen Ausführungsformen umfasst das von der Nucleinsäure kodierte Protein zumindest zwei verschiedene unnatürliche Aminosäuren, z. B. Homoglutamin und eine zweite unnatürliche Aminosäure, wie z. B. eine elektrophile Aminosäure. Das Translationssystem kann eine beliebige einer Reihe unnatürlicher Aminosäuren inkludieren, einschließlich z. B. Homoglutamin. In einem Beispiel ist das Protein im Translationssystem homolog zu Myoglobin, umfasst jedoch eine unnatürliche Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, welche die Aminosäuresequenzen von PhKRS, E444G, PhΔAD, einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder einer konservativen Variante dieser Proteine umfassen, diese sind jedoch nicht darauf beschränkt. In gleicher Weise stellt die Erfindung Nucleinsäuren bereit, die für PhKRS, E444G, PhΔAD, eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD und/oder eine beliebige konservative Variante dieser Sequenzen kodieren. Die Erfindung stellt Nucleinsäuren, die teilweise eine tRNA inkorporieren oder vollständig da raus bestehen, die Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26 entspricht, oder beliebige konservative Varianten dieser Sequenzen bereit.
  • In anderen Aspekten stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS) inkorporieren, ohne darauf beschränkt zu sein, wobei die O-RS vorzugsweise eine O-tRNA mit einem Homoglutamin aminoacyliert. Diese O-RS kann eine Mutation inkludieren, die einer I41- und/oder S268-Mutation von PhΔAD oder einer beliebigen konservativen Variante dieses Proteins entspricht. In diesen Aspekten aminoacyliert die O-RS die O-tRNA vorzugsweise mit einer Wirksamkeit von zumindest 50% der Wirksamkeit einer I41- und/oder S268-Mutation von PhΔAD. In manchen Ausführungsformen stammt die O-RS von Pyrococcus horikoshii. In manchen Ausführungsformen, in denen sowohl die O-RS als auch die O-tRNA in der Zusammensetzung vorhanden sind, erkennt die O-tRNA ein Vier-Basen-Selektorcodon, z. B. eine AGGA-Sequenz.
  • In manchen Ausführungsformen, in denen die oben genannte Zusammensetzung eine Zelle umfasst oder in einer Zelle vorliegt, kann die O-RS von einer oder mehreren Nucleinsäuren in der Zelle kodiert werden, die z. B. eine E.-coli-Zelle sein kann. Die Zusammensetzung kann ein Translationssystem umfassen. In Zusammensetzungen, die eine Zelle inkludieren, sowie in Fällen, in denen die O-RS von einer oder mehreren Nucleinsäuren in der Zelle kodiert wird, kann die Zelle weiters eine orthogonale tRNA (O-tRNA), die ein erstes Selektorcodon erkennt, und ein Homoglutamin umfassen, z. B. worin die O-RS die O-tRNA vorzugsweise mit dem Homoglutamin aminoacyliert. In manchen Ausführungsformen kann die Zelle eine Target-Nucleinsäure inkludieren, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, wobei die Target-Nucleinsäure für ein Selektorcodon kodiert, das von der O-tRNA erkannt wird.
  • Die O-tRNA wird gegebenenfalls ganz oder teilweise von einer Polynucleotidsequenz, wie sie in Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26 dargelegt ist, oder einer komplementären Polynucleotidsequenz davon kodiert, und die O-RS umfasst eine Aminosäuresequenz, die E444G, PhΔAD, einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder einer beliebigen konservativen Variante dieser Sequenz entspricht. Es versteht sich, dass hierin jede Nucleinsäuresequenz in RNA- oder in DNA-Form dargestellt werden kann; daher umfassen Sequenzen, wie z. B. Seq.-ID Nr. 24 oder 25 optional, falls aus dem Kontext nichts anderes hervorgeht, RNA- und/oder DNA-Formen, unabhängig davon, ob diese ausdrücklich dargestellt werden oder nicht. In manchen Ausführungsformen sind die O-RS und die O-tRNA zumindest 50% so wirksam bei der Unterdrückung eines Stopp- oder Rasterverschiebungs-Selektorcodons wie E444G, PhΔAD oder eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD in Kombination mit einer O-tRNA aus Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26. In Ausführungsformen, in denen die Zusammensetzung eine Zelle umfasst, kann es sich bei der Zelle um eine E.-coli-Zelle handeln. Eine Zelle dieser Zusammensetzung kann weiters ein zusätzliches unterschiedliches O-tRNA/O-RS-Paar und eine zusätzliche unterschiedliche unnatürliche Aminosäure inkludieren, wobei die O-tRNA ein zweites Selektorcodon erkennt und die O-RS die O-tRNA vorzugsweise mit der zweiten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Die Zelle kann gegebenenfalls weiters eine Target-Nucleinsäure inkludieren, die für das erste und das zweite Selektorcodon kodiert. Weiters kann eine Zelle dieser Zusammensetzung ein Protein inkludieren, für das die Target-Nucleinsäure kodiert, wobei das Protein zumindest zwei unterschiedliche unnatürliche Aminosäuren umfasst.
  • Die Erfindung stellt auch ein Protein bereit, das zumindest ein Homoglutamin umfasst. In manchen Ausführungsformen umfasst das Protein eine Aminosäuresequenz, die zu zumindest 75% mit einer Sequenz eines therapeutischen Wildtyp-Proteins, eines diagnostischen Proteins, eines industriellen Enzyms oder eines beliebigen Abschnitts dieser Proteine identisch ist. Gegebenenfalls liegt das Protein zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vor.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Selektion einer aktiven orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS) bereit, die ein Homoglutamin auf eine orthogonale tRNA (O-tRNA) lädt. Diese Verfahren umfassen einen ersten Schritt des Unterziehens einer Zellpopulation einer Selektion, wobei die Zellen insgesamt Folgendes umfassen: 1) die O-tRNA, wobei die O-tRNA orthogonal zu Vertretern der Zellpopulation ist, welche die O-tRNA umfassen; 2) eine Vielzahl von O-RSs, die ein oder mehrere aktive O-RS-Mitglieder aufweisen, welche die O-tRNA mit einem Homoglutamin in einer oder mehreren Zellen der Population beladen; 3) ein Polynucleotid, das für einen selektierbaren Marker kodiert, wobei das Polynucleotid für zumindest ein Selektorcodon kodiert, das von der O-tRNA erkannt wird; sowie 4) Homoglutamin. In dieser Selektion wird die Target-Zelle in der Population, welche die aktive O-RS umfasst, durch eine verstärkte Suppressionswirksamkeit des selektierbaren Markers im Vergleich zu einer Suppressionswirksamkeit einer Kontrollzelle identifiziert, der die Vielzahl von RSs fehlt, die jedoch die O-tRNA aufweist. Der zweite Schritt des Verfahrens ist das Selektionsverfahren, das die Target-Zelle selektiert, die eine aktive O-RS aufweist. Die Erfindung stellt weiters eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase bereit, die durch ein beliebiges der Selektionsverfahren identifiziert wurde.
  • In manchen Ausführungsformen dieser Verfahren werden die Zellen zusätzlich dazu selektiert, um Zellen zu eliminieren, die eine Nicht-Target-O-RS umfassen, welche die O-tRNA mit einer anderen Aminosäure als Homoglutamin belädt. In manchen Ausführungsformen ist die Selektion eine positive Selektion, und der selektierbare Marker ist ein positiver Selektionsmarker.
  • In verschiedenen Ausführungsformen dieser Verfahren kann die Vielzahl von RSs von einer beliebigen einer Reihe von Quellen stammen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf RS-Mutanten, RSs, die von einer oder mehreren anderen Spezies als der ersten Spezies stammen, oder sowohl von RS-Mutanten als auch von RSs, die von einer anderen Spezies als der ersten Spezies stammen.
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Produktion eines Proteins in einer Zelle mit einem Homoglutamin an einer spezifizierten Position bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des Züchtens einer Zelle in einem geeigneten Medium, die eine Nucleinsäure in sich trägt, die für zumindest ein Selektorcodon kodiert und für ein Protein kodiert; z. B. wenn die Zelle weiters eine orthogonale tRNA (O-tRNA) umfasst, die das Selektorcodon erkennt, sowie eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O- RS), die vorzugsweise die O-tRNA mit Homoglutamin aminoacyliert; des Bereitstellens des Homoglutamins; sowie des Einbaus des Homoglutamins in die spezifizierte Position als Reaktion auf das Selektorcodon, wodurch das Protein produziert wird. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens verwendet die Aminosäuresequenz der O-RS ganz oder teilweise die Aminosäuresequenz von E444G, PhΔAD, einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder einer konservativen Variante davon.
  • DEFINITIONEN
  • Bevor die Erfindung ausführlich beschrieben wird, ist anzumerken, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte biologische Systeme beschränkt ist, die natürlich variieren können. Es ist ebenfalls anzumerken, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht als Einschränkung gedacht ist. Wie in dieser Beschreibung und in den im Anhang befindlichen Ansprüchen verwendet, umfassen die Singularformen „ein", „eine/einer" und „der/die/das" auch Referenten im Plural, falls aus dem Kontext nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht. Daher umfasst z. B. ein Verweis auf „eine Zelle" eine Kombination zweier oder mehrerer Zellen; ein Verweis auf „Bakterien" umfasst Gemische von Bakterien und dergleichen.
  • Falls nicht hierin und nachstehend im Rest der Beschreibung definiert, besitzen alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie normalerweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, dem die Erfindung angehört, verstanden wird.
  • Orthogonale Lysyl-tRNA: Wie hierin verwendet, ist eine orthogonale Lysyl-tRNA (Lysyl-O-tRNA) eine tRNA, die zu einem Translationssystem von Interesse orthogonal ist, wobei auf die tRNA Folgendes zutrifft: (1) sie ist identisch mit oder im Wesentlichen ähnlich einer natürlich auftretenden Lysyl-tRNA, (2) sie stammt durch natürliche oder künstliche Mutagenese von einer natürlich auftretenden Lysyl-tRNA ab; (3) sie rührt von einem beliebigen Verfahren her, das eine Sequenz einer Wildtyp- oder mutierten Lysyl-tRNA-Sequenz aus (1) oder (2) in Betracht zieht; (4) sie ist homolog zu einer Wildtyp- oder mutierten Lysyl-tRNA; (5) sie ist homolog zu einer beliebigen Beispiel-tRNA, die in Tabelle 1 als Substrat für eine Lysyl-tRNA-Synthetase angegeben ist; oder (6) sie ist eine konservative Variante einer beliebigen Beispiel-tRNA, die in Tabelle 1 als Substrat für Lysyl-tRNA-Synthetase angegeben ist. Die Lysyl-tRNA kann mit einer Aminosäure beladen oder in einem unbeladenen Zustand vorliegen. Es ist ebenfalls anzumerken, dass eine „Lysyl-O-tRNA" gegebenenfalls mit einer zugehörigen Synthetase mit einer anderen Aminosäure als Lysin beladen (aminoacyliert) wird, z. B. mit der Aminosäure Homoglutamin. Dabei versteht sich natürlich, dass eine Lysyl-O-tRNA der Erfindung vorteilhaft verwendet wird, um als Reaktion auf ein Selektorcodon im Wesentlichen jede Aminosäure – unabhängig davon, ob natürlich oder künstlich – während der Translation in ein wachsendes Polypeptid zu insertieren.
  • Orthogonale Lysyl-Aminosäure-Synthetase: Wie hierin verwendet, ist eine orthogonale Lysyl-Aminosäure-Synthetase (Lysyl-O-RS) ein Enzym, das vorzugsweise die Lysyl-O-tRNA mit einer Aminosäure in einem Translationssystem von Interesse aminoacyliert. Die Aminosäure, welche die Lysyl-O-RS auf die Lysyl-O-tRNA lädt, kann eine beliebige Aminosäure sein – unabhängig davon, ob natürlich oder künstlich – und ist hierin nicht eingeschränkt. Die Synthetase ist gegebenenfalls dieselbe wie eine oder homolog zu einer natürlich auftretende(n) Lysyl-Aminosäure-Synthetase oder dieselbe wie eine oder homolog zu einer Synthetase, die in Tabelle 1 als Lysyl-O-RS bezeichnet wird. Die Lysyl-O-RS kann z. B. eine konservative Variante einer Lysyl-O-RS aus Tabelle 1 sein, und/oder sie kann zumindest 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit einer Lysyl-O-RS aus Tabelle 1 aufweisen.
  • Orthogonal: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „orthogonal" auf ein Molekül (z. B. eine orthogonale tRNA (O-tRNA) und/oder eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS)), das/die mit endogenen Komponenten einer Zelle mit reduzierter Wirksamkeit im Vergleich zu einem entsprechenden Molekül funktioniert, das zu der Zelle oder dem Translationssystem endogen ist, oder das nicht mit endo genen Komponenten der Zelle funktioniert. Im Kontext von tRNAs und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen bezieht sich orthogonal auf eine Unfähigkeit oder eine reduzierte Wirksamkeit, z. B. weniger als 20% Wirksamkeit, weniger als 10% Wirksamkeit, weniger als 5% Wirksamkeit oder weniger als 1% Wirksamkeit, einer orthogonalen tRNA, mit einer endogenen tRNA-Synthetase zu funktionieren, im Vergleich zu der Fähigkeit einer endogenen tRNA, mit der endogenen tRNA-Synthetase zu funktionieren; oder einer orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase, mit einer endogenen tRNA zu funktionieren, im Vergleich zu der Fähigkeit einer endogenen tRNA-Synthetase, mit der endogenen tRNA zu funktionieren. Dem orthogonalen Molekül fehlt ein funktionell normales, endogenes komplementäres Molekül in der Zelle. Eine orthogonale tRNA in einer Zelle wird z. B. bei Vergleich mit einer Aminoacylierung einer endogenen tRNA durch die endogene RS durch eine beliebige RS der Zelle mit reduzierter oder sogar nicht detektierbarer Wirksamkeit aminoacyliert. In einem anderen Beispiel aminoacyliert eine orthogonale RS eine beliebige endogene tRNA in einer Zelle von Interesse mit reduzierter oder sogar nicht detektierbarer Wirksamkeit im Vergleich zu einer Aminoacylierung der endogenen tRNA durch eine endogene RS. Ein zweites orthogonales Molekül kann in die Zelle eingeführt werden, das mit dem ersten orthogonalen Molekül funktioniert. Ein orthogonales tRNA/RS-Paar umfasst z. B. eingeführte komplementäre Komponenten, die zusammen in der Zelle mit einer Wirksamkeit funktionieren (z. B. 45% Wirksamkeit, 50% Wirksamkeit, 60% Wirksamkeit, 70% Wirksamkeit, 75% Wirksamkeit, 80% Wirksamkeit, 90% Wirksamkeit, 95% Wirksamkeit oder 99% oder eine noch größere Wirksamkeit) im Vergleich zu jener einer Kontrolle, z. B. einem entsprechenden endogenen tRNA/RS-Paar oder einem aktiven orthogonalen Paar (z. B. einem orthogonalen Tyrosyl-tRNA/RS-Paar).
  • Zugehörig: Der Ausdruck „zugehörig" bezieht sich auf Komponenten, die zusammen funktionieren, z. B. eine orthogonale tRNA und eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die vorzugsweise die orthogonale tRNA aminoacyliert. Die Komponenten können auch als „komplementär" bezeichnet werden.
  • Aminoacyliert vorzugsweise: Der Ausdruck „aminoacyliert vorzugsweise" gibt an, dass eine O-RS eine bestimmte tRNA mit einer bestimmten Aminosäure wirksamer belädt, als sie andere tRNAs belädt. Die O-RS kann z. B. eine zugehörige O-tRNA mit einer Wirksamkeit (z. B. 70% Wirksamkeit, 75% Wirksamkeit, 85% Wirksamkeit, 90 Wirksamkeit, 95% Wirksamkeit oder 99% oder einer höheren Wirksamkeit) im Vergleich zu der O-RS, die eine nicht zugehörige tRNA aminoacyliert (z. B. eine tRNA, die als ein Substrat zur Kreation der zugehörigen O-tRNA verwendet wird, z. B. durch Mutation) beladen.
  • Selektorcodon: Der Ausdruck „Selektorcodon" bezieht sich auf ein von einer O-tRNA in einem Translationsprozess erkanntes Codon, das von einer endogenen tRNA typischerweise nicht erkannt wird. Typische Beispiele umfassen Stopp-Codons, Codons, die 4 oder mehr Basen umfassen und/oder dergleichen. Eine O-tRNA-Anti-Codon-Schleife erkennt ein Selektorcodon, z. B. in einer exprimierten RNA, z. B. einer mRNA, und insertiert dessen Aminosäure in ein Polypeptid, das durch Translationssystemkomponenten translatiert wird. In einer Ausführungsform hierin erkennt die O-tRNA z. B. ein Selektorcodon, wie z. B. ein Vier-Basen-Codon, und fügt eine unnatürliche Aminosäure, wie z. B. ein Homoglutamin, zu einem Polypeptid hinzu, das durch das Translationsverfahren produziert wird. Selektorcodons können z. B. Nichtsinn-Codons, wie z. B. Stopp-Codons, z. B. Amber-, Ochre- und Opal-Codons; Vier- oder Mehr-Basen-Codons; seltene Codons; Codons, die von natürlichen oder unnatürlichen Basenpaaren abstammen und/oder dergleichen umfassen.
  • Suppressor-tRNA: Eine Suppressor-tRNA ist eine tRNA, welche die Ablesung einer Messenger-RNA (mRNA) in einem bestimmten Translationssystem verändert, z. B. indem sie einen Mechanismus zum Einbau einer Aminosäure in eine Polypeptidkette als Reaktion auf ein Selektorcodon bereitstellt. Eine Suppressor-tRNA kann z. B. ein Stopp-Codon, ein Vier-Basen-Codon, ein seltenes Codon etc. überlesen.
  • Suppressionsaktivität: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Suppressionsaktivität" allgemein auf die Fähigkeit einer tRNA (z. B. einer Suppressor-tRNA), ein translationales Überlesen eines Codons zu ermöglichen (z. B. eines Selektorcodons, das ein Amber-Codon oder ein 4-oder-mehr-Basen-Codon ist), das andernfalls zur Translationstermination oder einer Fehltranslation (z. B. einer Rasterverschie bung) führen würde. Die Suppressionsaktivität einer Suppressor-tRNA kann als Prozentsatz der beobachteten translationalen Überlese-Aktivität ausgedrückt werden, und zwar im Vergleich zu einer zweiten Suppressor-tRNA oder im Vergleich zu einem Kontrollsystem, z. B. einem Kontrollsystem, dem eine O-RS fehlt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Verfahren bereit, durch welche die Suppressionsaktivität quantifiziert werden kann. Der Prozentsatz der Suppression einer bestimmten O-tRNA und O-RS gegen ein Selektorcodon (z. B. ein Amber-Codon) von Interesse bezieht sich auf den Prozentsatz der Aktivität eines bestimmten exprimierten Testmarkers (z. B. LacZ), der ein Selektorcodon umfasst, und zwar in einer Nucleinsäure, die für den exprimierten Testmarker kodiert, in einem Translationssystem von Interesse, wobei das Translationssystem von Interesse eine O-RS und eine O-tRNA umfasst, im Vergleich zu einem positiven Kontrollkonstrukt, wobei der positiven Kontrolle die O-tRNA, die O-RS und das Selektorcodon fehlen. Weist daher z. B. ein aktives positives Kontrollmarkerkonstrukt, dem ein Selektorcodon fehlt, eine beobachtete Aktivität von X, in Einheiten, die für den jeweiligen Markertest von Relevanz sind, in einem bestimmten Translationssystem auf, so ist der Prozentsatz der Suppression eines Testkonstrukts, welches das Selektorcodon umfasst, der Prozentsatz von X, den das Testmarkerkonstrukt unter im Wesentlichen denselben Umgebungsbedingungen aufweist, bei denen der positive Kontrollmarker exprimiert wurde, außer, dass das Testmarkerkonstrukt in einem Translationssystem exprimiert wird, das auch die O-tRNA und die O-RS inkludiert. Typischerweise umfasst das Translationssystem, das den Testmarker exprimiert, auch eine Aminosäure, die von der O-RS und der O-tRNA erkannt wird. Gegebenenfalls kann der Prozentsatz der Suppressionsmessung durch Vergleich des Testmarkers mit einem „Hintergrund-" oder „negativen" Kontrollmarkerkonstrukt verbessert werden, das dasselbe Selektorcodon umfasst wie der Testmarker, jedoch in einem System, das nicht die O-tRNA, die O-RS und/oder relevante Aminosäure umfasst, die von der O-tRNA und/oder der O-RS erkannt wird. Diese negative Kontrolle ist bei der Normalisierung des Prozentsatzes der Suppressionsmessungen von Nutzen, um Hintergrund-Signalwirkungen des Markers im Translationssystem von Interesse zu erklären.
  • Die Suppressionswirksamkeit kann durch einen beliebigen einer Anzahl an Tests bestimmt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise kann ein β-Galactosidase-Reportertest verwendet werden, z. B. wird zusammen mit Plasmid, das eine O-tRNA der Erfindung umfasst, ein derivatisiertes lacZ-Plasmid (wobei das Konstrukt ein Selektorcodon in der lacZ-Nucleinsäuresequenz aufweist) in Zellen eines geeigneten Organismus eingeführt (z. B. eines Organismus, dessen orthogonale Komponenten verwendet werden können). Eine zugehörige Synthetase kann ebenfalls eingeführt werden (z. B. entweder als Polypeptid oder als Polynucleotid, das bei Expression für die zugehörige Synthetase kodiert). Die Zellen werden im Medium auf eine gewünschte Dichte gezüchtet, z. B. auf eine OD600 von etwa 0,5, und β-Galactosidase-Tests werden durchgeführt, z. B. unter Verwendung des BetaFluorTM-β-Galactosidase-Testsets (Novagen). Der Prozentsatz der Suppression kann als Prozentsatz der Aktivität einer Probe im Verhältnis zu einer vergleichbaren Kontrolle berechnet werden, z. B. der Wert, der beim derivatisierten lacZ-Konstrukt beobachtet wurde, wobei das Konstrukt anstelle eines Selektorcodons ein entsprechendes Sense-Codon an einer gewünschten Position aufweist.
  • Translationssystem: Der Ausdruck „Translationssystem" bezieht sich auf die Komponenten, die eine Aminosäure in eine wachsende Polypeptidkette (Protein) einbauen. Komponenten eines Translationssystems können z. B. Ribosomen, tRNA, Synthetasen, mRNA und dergleichen umfassen. Die O-tRNA und/oder die O-RSs der Erfindung können zu einem In-vitro- oder In-vivo-Translationssystem hinzugefügt werden oder Teil davon sein, z. B. in einer nichteukaryotischen Zelle, z. B. einem Bakterium (wie z. B. E.coli), oder in einer eukaryotischen Zelle, z. B. einer Hefezelle, einer Säugetierzelle, einer Pflanzenzelle, einer Algenzelle, einer Pilzzelle, einer Insektenzelle und/oder dergleichen.
  • Unnatürliche Aminosäure: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „unnatürliche Aminosäure" auf eine beliebige Aminosäure, eine modifizierte Aminosäure und/oder ein Aminosäure-Analogon, wie z. B. ein Homoglutamin, das nicht eine der 20 häufigsten natürlich auftretenden Aminosäuren oder der seltenen natürlichen Aminosäuren Selenocystein oder Pyrrolysin ist.
  • Stammt von: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „stammt von" auf eine Komponente, die aus einem beschriebenen Molekül oder Organismus isoliert oder unter Verwendung desselben oder von Informationen vom beschriebenen Molekül oder Organismus hergestellt wurde.
  • Positiver Selektions- oder Screeningmarker: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „positiver Selektions- oder Screeningmarker" auf einen Marker, der bei Vorhandensein, z. B. bei Expression, Aktivierung oder dergleichen, zur Identifikation einer Zelle führt, die ein Merkmal umfasst, das dem Marker entspricht, z. B. Zellen mit dem positiven Selektionsmarker unter jenen ohne das Merkmal.
  • Negativer Selektions- oder Screeningmarker: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „negativer Selektions- oder Screeningmarker" auf einen Marker, der bei Vorhandensein, z. B. bei Expression, Aktivierung oder dergleichen, die Identifikation einer Zelle ermöglicht, die eine ausgewählte Eigenschaft oder ein ausgewähltes Merkmal nicht umfasst (z. B. im Vergleich zu einer Zelle, welche die Eigenschaft oder das Merkmal besitzt).
  • Reporter: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Reporter" auf eine Komponente, die verwendet werden kann, um Target-Komponenten eines Systems von Interesse zu identifizieren und/oder auszuwählen. Ein Reporter kann z. B. ein Protein umfassen, z. B. ein Enzym, das Antibiotikaresistenz oder -empfindlichkeit verleiht (z. B. β-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) und dergleichen), einen fluoreszierenden Screeningmarker (z. B. grün fluoreszierendes Protein (z. B. (GFP), YFP, EGFP, RFP etc.), einen lumineszierenden Marker (z. B. ein Glühwürmchenluciferase-Protein), einen affinitätsbasierten Screeningmarker oder positive oder negative selektierbare Markergene, wie z. B. lacZ, β-gal/lacZ (β-Galactosidase), Adh (Alkoholdehydrogenase), his3, ura3, leu2, lys2 oder dergleichen.
  • Eukaryot: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Eukaryot" auf Organismen, die der phylogenetischen Domäne Eucarya angehören, wie z. B. Tiere (z. B. Säugetiere, Insekten, Reptilien, Vögel etc.), Ciliaten, Pflanzen (z. B. einkeimblättrige Pflanzen, zweikeimblättrige Pflanzen, Algen etc.), Pilze, Hefearten, Geißeltierchen, Microsporida, Einzeller etc.
  • Nicht-Eukaryot: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Nicht-Eukaryot" auf nicht eukaryotische Organismen. Ein nicht eukaryotischer Organismus kann z. B. der phylogenetischen Domäne der Eubakterien angehören (z. B. Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus etc.), oder den phylogenetischen Domänen der Archaea (z. B. Methanococcus jannaschii (Mj), Methanosarcina mazei (Mm), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mt), Methanococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Halobacterium, wie z. B. Haloferax volcanii und Halobacterium-Spezies NRC-1, Aarchaeoglobus fulgidus (Af), Pyrococcus furiosus (Pf), Pyrococcus horikoshii (Ph), Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Aeuropyrum pernix (Ap), Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanicum etc.).
  • Konservative Variante: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „konservative Variante" im Kontext einer Translationskomponente auf eine Translationskomponente, z. B. eine konservative O-tRNA-Variante oder eine konservative O-RS-Variante, die funktionell ähnlich wie eine Basen-Komponente funktioniert, wobei die konservative Variante z. B. einer O-tRNA oder einer O-RS mit Variationen in der Sequenz ähnelt, und zwar im Vergleich zu einer Verweis-O-tRNA oder O-RS. Eine O-RS aminoacyliert z. B. eine komplementäre O-tRNA oder eine konservative O-tRNA-Variante mit einer unnatürlichen Aminosäure, z. B. einem Homoglutamin, obwohl die O-tRNA und die konservative O-tRNA-Variante nicht dieselbe Sequenz aufweisen. Die konservative Variante kann z. B. eine Variation, zwei Variationen, drei Variationen, vier Variationen, oder fünf oder mehr Variationen in einer Sequenz aufweisen, solange die konservative Variante komplementär zu der entsprechenden O-tRNA oder O-RS ist.
  • Selektions- oder Screeningmittel: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Selektions- oder Screeningmittel" auf ein Mittel, das bei Vorhandensein Selektion/Screening gewisser Komponenten aus einer Population ermöglicht. Ein Selektions- oder Screeningmittel kann z. B. ein Nährstoff, ein Antibiotikum, eine Lichtwellenlänge, ein Antikörper, ein exprimiertes Polynucleotid oder dergleichen sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Das Selektionsmittel kann z. B. durch Konzentration, Intensität etc. variiert werden.
  • Als Reaktion auf: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „als Reaktion auf" auf den Vorgang, bei dem eine tRNA der Erfindung ein Selektorcodon erkennt und eine relevante Aminosäure, z. B. eine unnatürliche Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin, welche die tRNA aufweist, in die wachsende Polypeptidkette einbaut.
  • Kodieren: Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „kodieren" auf einen beliebigen Vorgang, durch den die Information in einem polymeren Makromolekül- oder Sequenz-Strang verwendet wird, um die Produktion eines zweiten Molekül- oder Sequenz-Strangs zu steuern, der sich vom ersten Molekül- oder Sequenz-Strang unterscheidet. In einem Aspekt beschreibt der Ausdruck „kodieren" das Verfahren semikonservativer DNA-Replikation, wobei ein Strang eines doppelsträngigen DNA-Moleküls als Matrize verwendet wird, um durch eine DNA-abhängige DNA-Polymerase für einen neu synthetisierten komplementären Schwester-Strang zu kodieren.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich der Ausdruck „kodieren" auf einen beliebigen Vorgang, bei dem die Information in einem Molekül verwendet wird, um die Produktion eines zweiten Moleküls zu steuern, die unterschiedlicher chemischer Natur als die des ersten Moleküls ist. Ein DNA-Molekül kann z. B. für ein RNA-Molekül kodieren (z. B. durch den Vorgang der Transkription unter Beteiligung eines DNA-abhängigen RNA-Polymeraseenyzms). Ebenso kann ein RNA-Molekül wie im Vorgang der Translation für ein Polypeptid kodieren. Bei Verwendung zur Beschreibung des Vorgangs der Translation erstreckt sich der Ausdruck „kodieren" auch auf das Triplett-Codon, das für eine Aminosäure kodiert. In manchen Aspekten kann ein RNA-Molekül für ein DNA-Molekül kodieren, z. B. durch den Vorgang der reversen Transkription unter Be teiligung RNA-abhängiger DNA-Polymerase. In einem anderen Aspekt kann ein DNA-Molekül für ein Polypeptid kodieren, wobei klar ist, dass „kodieren", wie in diesem Fall verwendet, sowohl den Vorgang der Transkription als auch jenen der Translation umfasst.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt einen Sequenzabgleich von Archaea-tRNALysSequenzen bereit. Genomische Sequenzen, die von Pa, Pyrococcus abyssi; Pf, Pyrococcus furiosus; Ph, Pyrococcus horikoshii; Pya, Pyrobaculum aerophilum; Ta, Thermoplasma acidophilum; Tv, Thermoplasma volcanum; Af, Archaeoglobus fulgidus; Hh, Halobacterium sp. NRC-1; Mj, Methanococcus jannaschii; Mt, Methanobacterium thermoautotrophicum; Mm, Methanosarcina mazei; St. Sulfolobus tokodaii; Ss, Sulfolobus solfataricus; Ap, Aeropyrum pernix abstammen, wurden mit dem GCG-Programm Pileup abgeglichen und mit dem Programm Prettybox dargestellt.
  • 2, Bilder A und B, stellt Histogramme bereit, die in vitro eine Aminoacylierung zwischen Spezies veranschaulichen. (A) Aminoacylierung der gesamten E.-coli-tRNA oder (B) der gesamten halobakteriellen tRNA durch EcKRS (☐), PhKRS
    Figure 00180001
    oder keine Synthetase
    Figure 00180002
    Es wurden Tests in 20-μl-Reaktionen durchgeführt, enthaltend 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 30 mM KCl, 20 mM MgCl2, 3 mM Glutathion, 0,1 mg/ml BSA, 10 mM ATP, 1 µM [3H] Lysin (Amersham), 750 nM Synthetase und 0, 2, 10 oder 40 µM Voll-tRNA bei 37°C für eine Zeitspanne von 20 Minuten.
  • 3 ist eine schematische Darstellung einer consensus-abgeleiteten Amber-Suppressor-tRNA. Der Consensus für die Familie der Archaea-tRNALysSequenzen wird in einer Kleeblattkonfiguration dargestellt. Die Anti-Codon-Schleife wurde vom Consensus auf CUCUAAA geändert, um AKCUA zu erzeugen.
  • 4 stellt ein Histogramm bereit, das die In-vivo-Aktivität des orthogonalen Synthetase-tRNA-Paars veranschaulicht. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde in vierfacher Ausfertigung für GeneHogs-Zellen (Invitrogen), die mit den gezeigten Plasmiden transformiert wurden, oder ohne Plasmide bestimmt. Die E444G-Mutante von PhKRS wurde aus Plasmid pKQ exprimiert. Plasmid pKQ wurde für Proben verwendet, die keine Synthetase enthalten. AKCUA wurde aus dem Plasmid pACGFP exprimiert, und das Plasmid pACGFP wurde für Proben verwendet, die keine tRNA enthielten. Die lacZ-Reportergene stammten vom Plasmid pLASC-lacZ. Die Zellen wurden in 2YT-Medium mit den geeigneten Antibiotika auf eine OD600 von 0,5 gezüchtet, anschließend durch die Verfahren von Miller getestet (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972)).
  • 5. Konstruktion von Amber- und Vier-Basen-Suppressor-tRNAs. Eine Amber-Suppressor-tRNA wurde aus den Mehrfach-Sequenzabgleichen zahleicher tRNAlys-Sequenzen konstruiert. Eine orthogonale AGGA-Suppressor-tRNA wurde durch Selektion einer Akzeptor-Stammbibliothek identifiziert.
  • 6A und 6B. 6A zeigt die Struktur der aktiven PhKRS-Stelle. Die Reste E41 und Y268 stellen spezifische Kontakte mit dem Lysin-Substrat her. Diese Reste wurden gleichzeitig zur Konstruktion aktiver Stellen-Bibliotheken randomisiert. 6B zeigt die Strukturen verschiedener Aminosäuren.
  • Die 7A und 7B stellen Chemofluoreszenz-Phosphobilder bereit, welche die Expression von Myoglobin durch AGGA-Suppression veranschaulichen: 7A, das Myoglobin-Gen mit einem AGGA-Codon an Position G24 wurde in Gegenwart der AKUCCU-tRNA und entweder von PhΔAD, einer hGln-spezifischen Variante, oder von JYRS exprimiert. Die Expression von Myoglobin durch Amber-Suppression an Position S4 wurde auf ähnliche Art und Weise mit PhΔAD oder JYRS versucht. 7B, hGln wurde durch AGGA-Suppression an Position 24 eingebaut und AzPhe durch Amber-Suppression an Position 75 in ein einziges Polypeptid eingebaut.
  • 8. MALDI-TOF-Analyse tryptischer Fragmente, die Homoglutamin oder Lysin enthielten.
  • 9. Elektrospray-MS-Analyse von Myoglobin voller Länge, enthaltend Homoglutamin an Position 24 und O-Methyl-Tyrosin an Position 75.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Um zusätzliche synthetische Aminosäuren, wie z. B. ein Homoglutamin, zum genetischen Code hinzuzufügen, werden in vivo neue orthogonale Paare aus einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase und einer tRNA benötigt, die wirksam im Translationsmechanismus funktionieren können, jedoch zum jeweiligen Translationssystem „orthogonal" sind, was bedeutet, dass die Paare unabhängig von den Synthetasen und den tRNAs funktionieren, die zum Translationssystem endogen sind. Gewünschte Merkmale des orthologen Paars umfassen tRNAs, die nur ein spezifisches neues Codon entschlüsseln oder erkennen, z. B. ein Selektorcodon, das nicht von einer beliebigen endogenen tRNA entschlüsselt wird, sowie Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, die vorzugsweise deren zugehörige tRNA mit nur einer spezifischen unnatürlichen Aminosäure, z. B. einem Homoglutamin, aminoacylieren (oder beladen). Die O-tRNA wird wünschenswerterweise auch nicht von endogenen Synthetasen aminoacyliert. In E.coli umfasst ein orthogonales Paar z. B. eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die im Wesentlichen keine der endogenen tRNAs aminoacyliert, von denen es z. B. 40 in E.coli gibt, sowie eine orthogonale tRNA, die nicht durch etwaige der endogenen Synthetasen aminoacyliert wird, z. B. von denen es z. B. 21 in E.coli gibt.
  • Die Erfinder berichten hierin von einem neuen orthogonalen Synthetase/tRNA-Paar, das von Archaea-tRNALysSequenzen abstammt, die als Reaktion auf das Vier-Basen-Selektorcodon AGGA wirksam und selektiv die Aminosäure Homoglutamin (hGln) in Myoglobin einbauen. Die Rasterverschiebungssuppression mit hGln stellt keine wesentliche Beeinträchtigung der Proteinausbeute oder der Zellwachstumsraten dar, und es wurde gezeigt, dass sie gegenseitig orthogonal mit der Suppression von TAG durch ein zweites O-tRNA-ORS-Paar war. Diese Arbeiten zeigen, dass weder die Anzahl verfügbarer Triplett-Codons noch der Translationsmechanismus selbst eine signifikante Barriere für die weitere Ausweitung des Codes darstellt.
  • Um für unnatürliche Aminosäuren in vivo mit Codons in vierfacher Ausfertigung zu kodieren, muss eine orthogonale tRNA (O-tRNA) erzeugt werden, die dieses Codon auf einzigartige Art und Weise erkennt, sowie eine entsprechende Synthetase, die nur diese O-tRNA mit einer unnatürlichen Aminosäure von Interesse auf einzigartige Art und Weise aminoacyliert. Da es sich bei der Anti-Codon-Schleife der zuvor erzeugten orthogonalen M.-jannaschii-Amber-Suppressor-tRNA um ein entscheidendes Erkennungselement für die zugehörige Synthetase JYRS handelt, war es schwierig, diese Schleife zu erweitern, um ein Vier-Basen-Codon zu entschlüsseln. Obwohl es möglich sein könnte, die Anti-Codon-Bindungsspezifität von JYRS zu entspannen, wäre es wahrscheinlich schwierig, gegenseitig orthogonale Paare zu konstruieren, die Amber- und Vier-Basen-Suppressoren nur unter Verwendung der Anti-Codon-Sequenz unterscheiden. Daher wird hierin unter Verwendung orthogonaler Paare mit unterschiedlichen Ursprüngen ein System erzielt, das als Reaktion auf zwei oder mehrere unterschiedliche Selektorcodons den gleichzeitigen Einbau von zwei oder mehreren unnatürlichen Aminosäuren in ein Polypeptid ermöglicht.
  • Diese Erfindung stellt Zusammensetzungen von sowie Verfahren zur Identifikation und Produktion zusätzlicher orthogonaler tRNA-Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paare(n) bereit, z. B. O-tRNA/O-RS-Paare, die verwendet werden können, um unnatürliche Aminosäuren, wie z. B. Homoglutamin, einzubauen. Ein Beispiel einer O-tRNA der Erfindung ist in der Lage, den Einbau eines Homoglutamins in ein Protein zu vermitteln, für das ein Polynucleotid kodiert, das ein Selektorcodon umfasst, das z. B. von der O-tRNA in vivo erkannt wird. Die Anti-Codon-Schleife der O-tRNA erkennt das Selektorcodon auf einer mRNA und baut dessen Aminosäure, z. B. ein Homoglutamin, an dieser Stelle im Polypeptid ein. Eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase der Erfindung aminoacyliert (oder belädt) vorzugsweise seine O-tRNA mit nur einer spezifischen unnatürlichen Aminosäure.
  • Orthogonale tRNA/orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und Paare davon
  • Translationssysteme, die zur Herstellung von Proteinen geeignet sind, die eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren umfassen, werden in den Internationalen Veröf fentlichungen mit den Nr. WO 2002/086075 mit dem Titel „Methods and composition for the production of orthogonal tRNA-Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Pairs" und WO 2002/085923 , mit dem Titel „In vivo incorporation of unnatural amino acids" beschrieben. Zusätzlich dazu siehe die Internationale Anmeldung mit der Nr. PCT/US 2004/011786, eingereicht am 16. April 2004. Solche Translationssysteme umfassen allgemein Zellen (die nichteukaryotische Zellen, wie z. B. E.coli, oder eukaryotische Zellen, wie z. B. Hefe, sein können), die eine orthogonale tRNA (O-tRNA), eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS) und eine unnatürliche Aminosäure umfassen (in der vorliegenden Erfindung ist Homoglutamin ein Beispiel einer solchen unnatürlichen Aminosäure), worin die O-RS die O-tRNA mit dem Homoglutamin aminoacyliert. Ein orthogonales Paar der Erfindung umfasst eine O-tRNA, z. B. eine Suppressor-tRNA, eine Rasterverschiebungs-tRNA oder dergleichen, sowie eine O-RS. Einzelne Komponenten werden auch in der Erfindung bereitgestellt.
  • Allgemein wird davon ausgegangen, dass das orthogonale Paar das Selektorcodon „unterdrückt", wenn ein orthogonales Paar ein Selektorcodon erkennt und eine Aminosäure als Reaktion auf das Selektorcodon lädt. Das heißt, ein Selektorcodon, das von den endogenen Mechanismen des Translationssystems (der Zelle) nicht erkannt wird, wird normalerweise nicht translatiert, was zur Blockade der Produktion eines Polypeptids führen kann, das andernfalls aus der Nucleinsäure translatiert werden würde. Eine O-tRNA der Erfindung erkennt ein Selektorcodon und bietet eine Suppressionswirksamkeit von zumindest etwa 45%, 50%, 60%, 75%, 80% oder 90% oder mehr in Gegenwart einer zugehörigen Synthetase als Reaktion auf ein Selektorcodon im Vergleich zu einer O-tRNA, die eine Polynucleotidsequenz umfasst oder dafür kodiert, wie sie im Sequenzprotokoll hierin angeführt ist. Die O-RS aminoacyliert die O-tRNA mit einer unnatürlichen Aminosäure von Interesse, wie z. B. einem Homoglutamin. Die Zelle verwendet das O-tRNA/O-RS-Paar zum Einbau der unnatürlichen Aminosäure in eine wachsende Polypeptidkette, z. B. durch eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, wobei das Polynucleotid ein Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird. In gewissen wünschenswerten Aspekten kann die Zelle ein zusätzliches O-tRNA/O-RS-Paar umfassen, wobei die zusätzliche O-tRNA von der zusätzlichen O- RS mit einer anderen unnatürlichen Aminosäure beladen wird. Eine der O-tRNAs kann z. B. ein Vier-Basen-Codon erkennen, und die andere kann ein Stopp-Codon erkennen. Alternativ dazu können mehrere unterschiedliche Stopp-Codons oder mehrere unterschiedliche Vier-Basen-Codons unterschiedliche Selektorcodons spezifisch erkennen.
  • In gewissen Ausführungsformen der Erfindung umfasst eine Zelle, wie z. B. eine E.-coli-Zelle, eine orthogonale tRNA (O-tRNA), eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), ein Homoglutamin und eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, wobei das Polynucleotid das Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird. Das Translationssystem kann auch ein zellfreies System sein, z. B. eines einer Reihe im Handel erhältlicher Transkriptions-/Translationssysteme „in vitro" in Kombination mit einem O-tRNA/O-RS-Paar und einer unnatürlichen Aminosäure, wie hierin beschrieben.
  • In einer Ausführungsform liegt die Suppressionswirksamkeit der O-RS und der O-tRNA zusammen bei etwa z. B. dem 5fachen, 10fachen, 15fachen, 20fachen oder 25fachen der oder noch höher als die Suppressionswirksamkeit der O-tRNA, der die O-RS fehlt. In einem Aspekt beträgt die Suppressionswirksamkeit der O-RS und der O-tRNA zusammen z. B. zumindest etwa 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 75%, 80% oder 90% oder mehr der Suppressionswirksamkeit eines orthogonalen Synthetasepaars, wie in den hierin aufgezählten Sequenzprotokollen dargelegt.
  • Wie angemerkt, umfasst die Erfindung gegebenenfalls mehrere O-tRNA/O-RS-Paare in einer Zelle oder in anderem Translationssystem, was den Einbau von mehr als einer unnatürlichen Aminosäure, z. B. eines Homoglutamins und einer anderen unnatürlichen Aminosäure, ermöglicht. Die Zelle kann z. B. weiters ein zusätzliches unterschiedliches O-tRNA/O-RS-Paar und eine zweite unnatürliche Aminosäure umfassen, wobei diese zusätzliche O-tRNA ein zweites Selektorcodon erkennt, und diese zusätzliche O-RS vorzugsweise die O-tRNA mit der zweiten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Eine Zelle, die z. B. ein O-tRNA/O-RS-Paar umfasst (wobei die O-tRNA z. B. ein Amber-Selektorcodon erkennt), kann weiters ein zweites orthogona les Paar umfassen, z. B. Leucyl, Lysyl, Glutamyl etc. (wobei die zweite O-tRNA ein unterschiedliches Selektorcodon erkennt, z. B. ein Opal-, Vier-Basen-Boden oder dergleichen). Wünschenswerterweise stammen die unterschiedlichen orthogonalen Paare von unterschiedlichen Quellen, was die Erkennung verschiedener Selektorcodons erleichtern kann.
  • Die O-tRNA und/oder die O-RS kann natürlich auftreten, oder sie kann z. B. von einer Mutation einer natürlich auftretenden tRNA und/oder RS abstammen, z. B. durch Erzeugung von Bibliotheken von tRNAs und/oder Bibliotheken von RSs einer Vielzahl von Organismen und/oder unter Verwendung einer beliebigen einer Reihe von verfügbaren Mutationsstrategien. Eine Strategie zur Herstellung eines orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetasepaars umfasst z. B. das Importieren eines (zur Wirtszelle) heterologen tRNA/Synthetasepaars aus z. B. einer anderen Quelle als der Wirtszelle oder aus mehreren Quellen in die Wirtszelle. Die Eigenschaften des heterologen Synthetasekandidaten umfassen z. B., dass er keine Wirtszellen-tRNA belädt, und die Eigenschaften des heterologen tRNA-Kandidaten umfassen z. B., dass er nicht durch eine etwaige Wirtszellen-Synthetase aminoacyliert wird. Zusätzlich dazu ist die heterologe tRNA orthogonal zu allen Wirtszellen-Synthetasen.
  • Eine zweite Strategie zur Erzeugung eines orthogonalen Paars umfasst die Erzeugung von Mutanten-Bibliotheken, aus denen eine O-tRNA oder O-RS herausgescreent und/oder -selektiert wird. Diese Strategien können auch kombiniert werden.
  • Orthogonale tRNA (O-tRNA)
  • Eine orthogonale tRNA (O-tRNA) der Erfindung vermittelt wünschenswerterweise den Einbau einer unnatürlichen Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin, in ein Protein, für das ein Polynucleotid kodiert, das ein Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA z. B. in vivo oder in vitro erkannt wird. In gewissen Ausführungsformen umfasst eine O-tRNA der Erfindung zumindest etwa eine Suppressionswirksamkeit von 45%, 50%, 60%, 75%, 80% oder 90% oder mehr in Gegenwart einer zugehörigen Synthetase als Reaktion auf ein Selektorcodon, im Vergleich zu einer O-tRNA, die eine Polynucleotidsequenz umfasst oder dafür kodiert, wie sie in den O-tRNA-Sequenzen im hierin enthaltenen Sequenzprotokoll angeführt ist.
  • Die Suppressionswirksamkeit kann durch einen beliebigen einer Reihe von Tests bestimmt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Ein β-Galactosidase-Reportertest kann verwendet werden, indem z. B. ein derivatisiertes lacZ-Plasmid (wobei das Konstrukt ein Selektorcodon in der lacZ-Nucleinsäuresequenz aufweist) zusammen mit Plasmid, das eine O-tRNA der Erfindung umfasst, in Zellen eines geeigneten Organismus eingeführt wird (z. B. eines Organismus, bei dem die orthogonalen Komponenten verwendet werden können). Eine zugehörige Synthetase kann auch eingeführt werden (entweder als Polypeptid oder als Polynucleotid, das bei Expression für die zugehörige Synthetase kodiert). Die Zellen werden in Medium auf eine gewünschte Dichte gezüchtet, z. B. auf eine OD600 von etwa 0,5, und β-Galactosidase-Tests werden durchgeführt, z. B. unter Verwendung des BetaFluorTM-β-Galactosidase-Testsets (Novagen). Der Prozentsatz der Suppression kann als Prozentsatz der Aktivität einer Probe im Verhältnis zu einer vergleichbaren Kontrolle berechnet werden, z. B. der beobachtete Wert des derivatisierten lacZ-Konstrukts, wobei das Konstrukt ein entsprechendes Sense-Codon an einer gewünschten Position anstelle eines Selektorcodons aufweist.
  • Beispiele von O-tRNAs der Erfindung werden hierin im Sequenzprotokoll dargelegt. Siehe auch die Tabellen, Beispiele und Figuren, die hierin enthalten sind, von Sequenzen beispielhafter O-tRNA- und O-RS-Moleküle. Siehe auch den hierin enthaltenen Abschnitt mit dem Titel „Nucleinsäure- und Polypeptidsequenz und Varianten". In einem RNA-Molekül, wie z. B. einer O-RS-mRNA oder einem O-tRNA-Molekül, wird Thymidin (T) mit Uracil (U) im Verhältnis zu einer bestimmten Sequenz (oder umgekehrt bei einer kodierenden DNA) oder einem Komplement davon ersetzt. Zusätzliche Modifikationen an den Basen können auch vorhanden sein.
  • Die Erfindung umfasst auch konservative Variationen von O-tRNAs, die hierin bestimmten O-tRNAs entsprechen. Konservative Variationen von O-tRNA umfassen z. B. jene Moleküle, die wie die bestimmten O-tRNAs funktionieren, z. B. wie im Sequenzprotokoll hierin beschrieben, und welche die L-förmige tRNA-Struktur durch die geeignete Selbstkomplementarität beibehalten, die jedoch keine Sequenz aufweisen, die z. B. zu jenen im Sequenzprotokoll, in den Figuren und Beispielen hierin identisch ist (und wünschenswerterweise keine Wildtyp-tRNA-Moleküle sind). Siehe auch den hierin enthaltenen Abschnitt mit dem Titel „Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen und -varianten".
  • Die Zusammensetzung, die eine O-tRNA umfasst, kann weiters eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS) umfassen, wobei die O-RS vorzugsweise die O-tRNA mit einer unnatürlichen Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin, aminoacyliert. In gewissen Ausführungsformen kann eine Zusammensetzung, die eine O-tRNA umfasst, weiters ein Translationssystem umfassen (z. B. in vitro oder in vivo). Eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, wobei das Polynucleotid ein Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird, oder eine Kombination einer oder mehrerer dieser, kann auch in der Zelle vorhanden sein. Siehe auch den hierin enthaltenen Abschnitt mit dem Titel „Orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetasen".
  • Verfahren zur Produktion einer orthogonalen tRNA (O-tRNA) sind auch ein Merkmal der Erfindung. Eine O-tRNA, die durch das Verfahren hergestellt wird, ist auch ein Merkmal der Erfindung. In gewissen Ausführungsformen der Erfindung können die O-tRNAs durch Erzeugung einer Mutanten-Bibliothek produziert werden. Die Bibliothek an mutierten tRNAs kann unter Verwendung verschiedener Mutageneseverfahren erzeugt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Die mutierten tRNAs können durch ortsspezifische Mutationen, Zufalls-Punktmutationen, homologe Rekombination, DNA-Shuffling oder andere rekursive Mutageneseverfahren, Chimärenkonstruktion oder eine beliebige Kombination davon erzeugt werden.
  • Zusätzliche Mutationen können an einer oder mehreren spezifischen Positionen eingeführt werden, z. B. an einer oder mehreren nicht konservativen Positionen, oder an einer konservativen Position, an einer oder mehreren randomisierten Positionen oder an einer Kombination von beidem in einer gewünschten Schleife oder Region einer t-RNA, z. B. einer Anti-Codon-Schleife, dem Akzeptorstamm, dem D-Arm oder der D-Schleife, der variablen Schleife, dem TPC-Arm oder der TPC-Schleife, anderen Regionen des tRNA-Moleküls, oder einer Kombination davon. Typischerweise umfassen Mutationen in einer tRNA das Mutieren der Anti-Codon-Schleife eines jeden Mitglieds der Bibliothek mutierter tRNAs, um die Erkennung eines Selektorcodons zu ermöglichen. Das Verfahren kann weiters das Hinzufügen einer zusätzlichen Sequenz (CCA) an einen Terminus der O-tRNA umfassen. Typischerweise besitzt eine O-tRNA eine Verbesserung der Orthogonalität für einen gewünschten Organismus im Vergleich zum Ausgangsmaterial, z. B. die Vielzahl von tRNA-Sequenzen, während sie ihre Affinität für eine gewünschte RS beibehält.
  • Die Verfahren umfassen gegebenenfalls das Analysieren der Ähnlichkeit (und/oder der abgeleiteten Homologie) von Sequenzen von tRNAs und/oder Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, um potentielle Kandidaten für eine O-tRNA, O-RS und/oder Paare davon zu bestimmen, die für einen spezifischen Organismus orthogonal zu sein scheinen. Computer-Programme, die nach dem Stand der Technik bekannt sind und hierin beschrieben werden, können zur Analyse verwendet werden, z. B. kann das BLAST- und das Pileup-Programm verwendet werden. In einem Beispiel wird, um potentielle orthogonale Translationskomponenten zur Verwendung in E.coli auszuwählen, ein prokaryotischer Organismus, eine Synthetase und/oder eine tRNA ausgewählt, die keine starke Sequenzähnlichkeit mit prokaryotischen Organismen aufweist.
  • Typischerweise wird eine O-tRNA z. B. durch Unterziehen einer Zellpopulation einer ersten Spezies einer negativen Selektion erhalten, wo die Zellen ein Mitglied einer Vielzahl potentieller O-tRNAs umfassen. Die negative Selektion eliminiert Zellen, die ein Mitglied der Bibliothek potentieller O-tRNAs umfassen, das durch eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase (RS) aminoacyliert wird, die zu der Zelle endogen ist. Dies stellt einen Pool von tRNAs bereit, die zu der Zelle der ersten Spezies orthogonal sind.
  • In gewissen Ausführungsformen in der negativen Selektion werden ein oder mehrere Selektorcodons in ein Polynucleotid eingeführt, das für einen negativen Selektionsmarker kodiert, z. B. ein Enzym, das Antibiotikaresistenz verleiht, z. B. β-Lactamase, ein Enzym, das ein detektierbares Produkt liefert, z. B. β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), z. B. ein toxisches Produkt, wie z. B. Barnase, an einer nicht entscheidenden Position (z. B. immer noch eine funktionelle Barnase produzierend) etc. Das Screening bzw. die Selektion wird gegebenenfalls durch Züchten der Zellpopulation in Gegenwart eines Selektionsmittels durchgeführt (z. B. eines Antibiotikums, z. B. Ampicillin). In einer Ausführungsform wird die Konzentration des Selektionsmittels variiert.
  • Um die Aktivität von Suppressor-tRNAs zu messen, wird z. B. ein Selektionssystem verwendet, das auf der In-vivo-Suppression von Selektorcodon-, z. B. Nichtsinn- oder Rasterverschiebungs-Mutationen basiert, die in ein Polynucleotid eingeführt werden, das für einen negativen Selektionsmarker kodiert, z. B. ein Gen für β-Lactamase (bla). Es werden z. B. Polynucleotidvarianten, z. B. bla-Varianten, mit einem Selektorcodon an einer gewissen Position (z. B. A184) konstruiert. Zellen, z. B. Bakterien, werden mit diesen Polynucleotiden transformiert. Im Fall einer orthogonalen tRNA, die nicht wirksam von endogenen E.-coli-Synthetasen beladen werden kann, sollte die Antibiotikaresistenz, z. B. die Ampicillinresistenz, etwa die oder weniger als die eines Bakteriums betragen, das ohne Plasmid transformiert wurde. Ist die tRNA nicht orthogonal oder wird eine heterologe Synthetase, die zum Beladen der tRNA in der Lage ist, im System coexprimiert, so wird ein höheres Ausmaß an Antibiotikaresistenz, z. B. Ampicillinresistenz, beobachtet. Zellen, z. B. Bakterien, werden ausgewählt, die nicht in der Lage sind, auf LB-Agarplatten mit Antibiotikakonzentrationen sich etwa gleich stark wie Zellen zu vermehren, die ohne Plasmide transformiert werden.
  • Im Fall eines toxischen Produkts (z. B. Ribonuclease oder Barnase) wird, wenn ein Mitglied der Vielzahl potentieller tRNAs vom endogenen Wirt aminoacyliert wird, z. B. Escherichia-coli-Synthetasen (d. h. nicht orthogonal zum Wirt ist, z. B. Escherichia-coli-Synthetasen), das Selektorcodon unterdrückt, und das produzierte toxische Poly nucleotidprodukt führt zu Zelltod. Zellen, die orthogonale tRNAs oder nicht funktionelle tRNAs in sich tragen, überleben.
  • In einer Ausführungsform wird der Pool von tRNAs, die zu einem gewünschten Organismus orthogonal sind, anschließend einer positiven Selektion unterzogen, bei der ein Selektorcodon in einem positiven Selektionsmarker platziert wird, z. B. von einem Arzneimittelresistenz-Gen, wie z. B. einem β-Lactamase-Gen, kodiert wird. Die positive Selektion wird an einer Zelle durchgeführt, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Mitglied des Pools an tRNAs, die zu der Zelle orthogonal sind, kodiert oder dieses umfasst, ein Polynucleotid, das für einen positiven Selektionsmarker kodiert, sowie ein Polynucleotid, das für eine zugehörige RS kodiert. In gewissen Ausführungsformen umfasst die zweite Zellpopulation Zellen, die durch die negative Selektion nicht eliminiert wurden. Die Polynucleotide werden in der Zelle exprimiert, und die Zelle wird in Gegenwart eines Selektionsmittels, z. B. Ampicillin, gezüchtet. tRNAs werden anschließend auf ihre Fähigkeit, durch die coexprimierte zugehörige Synthetase aminoacyliert zu werden und eine Aminosäure als Reaktion auf dieses Selektorcodon zu insertieren, ausgewählt. Typischerweise zeigen diese Zellen eine Verbesserung der Suppressionswirksamkeit im Vergleich zu Zellen, die nichtfunktionelle tRNA(s) oder tRNAs, die nicht wirksam von der Synthetase von Interesse erkannt werden können, in sich tragen. Die Zelle, welche die nicht funktionelle(n) tRNA(s) oder tRNAs, die nicht wirksam von der Synthetase von Interesse erkannt werden, in sich trägt, reagiert auf das Antibiotikum empfindlich. Daher überleben jene tRNAs beide Selektionen, die: (i) keine Substrate für endogene Wirte sind, z. B. Escherichia coli, Synthetasen; (ii) von der Synthetase von Interesse aminoacyliert werden können; sowie (iii) funktionell in der Translation sind.
  • Dementsprechend kann derselbe Marker entweder ein positiver oder ein negativer Marker sein, in Abhängigkeit vom Kontext, in dem er gescreent wird. Das heißt, der Marker ist ein positiver Marker, wenn darauf gescreent wird, jedoch ein negativer Marker, wenn gegen ihn gescreent wird.
  • Die Stringenz der Selektion, z. B. die positive Selektion, die negative Selektion oder sowohl die positive als auch die negative Selektion, umfasst in den oben beschriebenen Verfahren gegebenenfalls das Variieren der Selektionsstringenz. Da Barnase z. B. ein besonders toxisches Protein ist, kann die Stringenz der negativen Selektion durch Einführung unterschiedlicher Anzahlen an Selektorcodons in das Barnase-Gen und/oder durch Verwendung eines induzierbaren Promotors kontrolliert werden. In einem anderen Beispiel wird die Konzentration des Selektions- oder Screeningmittels variiert (z. B. die Ampicillinkonzentration). In einem Aspekt der Erfindung wird die Stringenz variiert, da die gewünschte Aktivität während der ersten Runden gering sein kann. Daher werden weniger stringente Kriterien in den ersten Runden angewandt und stringentere Kriterien in den späteren Selektionsrunden eingesetzt. In gewissen Ausführungsformen kann die negative Selektion, die positive Selektion oder sowohl die negative als auch die positive Selektion mehrmals wiederholt werden. Mehrere unterschiedliche negative Selektionsmarker, positive Selektionsmarker oder sowohl negative als auch positive Selektionsmarker können verwendet werden. In gewissen Ausführungsformen können der positive und der negative Selektionsmarker derselbe sein.
  • Andere Arten von Selektionen/Screenings können in der Erfindung zur Produktion orthogonaler Translationskomponenten verwendet werden, z. B. einer O-tRNA, einer O-RS und eines O-tRNA/O-RS-Paars, das als Reaktion auf ein Selektorcodon eine unnatürliche Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin, lädt. Der negative Selektionsmarker, der positive Selektionsmarker oder sowohl der positive als auch der negative Selektionsmarker kann/können z. B. einen Marker umfassen, der in Gegenwart eines geeigneten Recktanten fluoresziert oder eine Lumineszenzreaktion katalysiert. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Produkt des Markers mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder anhand von Lumineszenz detektiert. Gegebenenfalls umfasst der Marker einen affinitätsbasierten Screeningmarker. Siehe auch J. A. Francisco et al., Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment an the external surface, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10444–8 (1993).
  • Zusätzliche Verfahren zur Produktion einer rekombinanten orthogonalen tRNA sind z. B. in den Internationalen Patentanmeldungen WO 2002/086075 mit dem Titel „Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase pairs"; sowie USSN 60/479.931 und 60/496.548 mit dem Titel „Expanding the eukaryotic genetic code" zu finden. Siehe auch Forster et al., Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo, PNAS 100 (11), 6353–6357 (2003); sowie Feng et al., Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100 (10), 5676–5681 (2003)).
  • Orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS)
  • Eine O-RS der Erfindung aminoacyliert vorzugsweise eine O-tRNA mit einer unnatürlichen Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin, in vitro oder in vivo. Eine O-RS der Erfindung kann dem Translationssystem, z. B. einer Zelle, von einem Polypeptid bereitgestellt werden, das eine O-RS umfasst und/oder durch ein Polynucleotid, das für eine O-RS oder einen Abschnitt davon kodiert. Ein Beispiel einer O-RS kann etwa eine Aminosäuresequenz umfassen, wie sie im Sequenzprotokoll und in den Beispielen hierin angeführt ist, oder eine konservative Variation davon. In einem weiteren Beispiel wird eine O-RS oder ein Abschnitt davon von einer Polynucleotidsequenz kodiert, die für eine Aminosäure kodiert, die eine Sequenz im Sequenzprotokoll oder in den Beispielen hierin enthält, oder von einer komplementären Polynucleotidsequenz davon. Siehe z. B. die hierin enthaltenen Tabellen und Beispiele für Sequenzen beispielhafter O-RS-Moleküle. Siehe auch den hierin enthaltenen Abschnitt mit dem Titel „Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen und -Varianten".
  • Verfahren zur Identifikation einer orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), z. B. einer O-RS, zur Verwendung mit einer O-tRNA, sind ebenfalls ein Aspekt der Erfindung. Ein Verfahren umfasst z. B. das Unterziehen einer Zellpopulation einer ersten Spezies einer Selektion, z. B. einer positiven Selektion, wobei die Zellen jeweils Folgendes umfassen: 1) ein Mitglied einer Vielzahl von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (RSs), (z. B. kann die Vielzahl von RSs mutierten RSs, RSs, die von einer anderen Spezies abstammen als die erste Spezies, oder sowohl mutierten RSs als auch RSs, die von einer anderen Spezies als der ersten Spezies abstammen, umfassen); 2) die orthogonale tRNA (O-tRNA) (z. B. aus einer oder mehreren Spezies); sowie 3) ein Polynucleotid, das für einen (z. B. positiven) Selektionsmarker kodiert und zumindest ein Selektorcodon umfasst. Zellen werden für jene selektiert oder gescreent, die eine Verbesserung der Suppressionswirksamkeit im Vergleich zu Zellen aufweisen, denen das Mitglied der Vielzahl von RSs fehlt oder die eine reduzierte Menge des Mitglieds der Vielzahl von RSs aufweisen. Die Suppressionswirksamkeit kann durch Verfahren gemessen werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind und hierin beschrieben werden. Zellen mit einer Verbesserung der Suppressionswirksamkeit umfassen eine aktive RS, welche die O-tRNA aminoacyliert. Ein Ausmaß der Aminoacylierung (in vitro oder in vivo) durch die aktive RS einer ersten Gruppe von tRNAs aus der ersten Spezies wird mit dem Ausmaß der Aminoacylierung (in vitro oder in vivo) durch die aktive RS einer zweiten Gruppe von tRNAs aus der zweiten Spezies verglichen. Das Ausmaß der Aminoacylierung kann durch eine detektierbare Substanz bestimmt werden (z. B. eine markierte Aminosäure oder eine unnatürliche Aminosäure, z. B. ein markiertes Homoglutamin). Die aktive RS, welche die zweite Gruppe von tRNAs im Vergleich zu der ersten Gruppe von tRNAs wirksamer aminoacyliert, wird typischerweise selektiert, wodurch eine wirksame (optimierte) orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase zur Verwendung mit der O-tRNA bereitgestellt wird. Eine O-RS, die vom Verfahren identifiziert wird, stellt ebenfalls einen Aspekt der Erfindung dar.
  • Es kann ein beliebiger einer Reihe von Tests zur Bestimmung der Aminoacylierung verwendet werden. Diese Tests können in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Invitro-Aminoacylierungstests werden z. B. in Hoben und Soll, Methods Enzymol. 113, 55–59 (1985), beschrieben. Die Aminoacylierung kann auch unter Verwendung eines Reporters zusammen mit orthogonalen Translationskomponenten und Detektieren des Reporters in einer Zelle, die ein Polynucleotid exprimiert, das zumindest ein Selektorcodon umfasst, das für ein Protein kodiert, bestimmt werden. Siehe auch WO 2002/085923 mit dem Titel „In vivo incorporation of unnatural amino acids"; sowie die Internationale Anmeldung Nr. PCT/US2004/011786, eingereicht am 16. April 2004.
  • Identifizierte O-RS können weiters manipuliert werden, um die Substratspezifität der Synthetase so zu verändern, dass nur eine gewünschte unnatürliche Aminosäure, z. B. ein Homoglutamin, jedoch nicht eine beliebige der häufig vorkommenden 20 Aminosäuren, an die O-tRNA geladen wird. Verfahren zur Erzeugung einer orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase mit einer Substratspezifität für eine unnatürliche Aminosäure umfassen das Mutieren der Synthetase, z. B. an der aktiven Stelle in der Synthetase, an der Editierungsmechanismus-Stelle in der Synthetase, an verschiedenen Stellen durch Kombinieren unterschiedlicher Domänen von Synthetasen oder dergleichen, sowie durch Anwenden eines Selektionsprozesses. Es wird eine Strategie verwendet, die auf der Kombination einer positiven Selektion, gefolgt von einer negativen Selektion basiert. In der positiven Selektion ermöglicht es die Suppression des Selektorcodons, das an einer oder mehreren nicht essentiellen Positionen eines positiven Markers eingeführt ist, Zellen, unter dem Druck positiver Selektion zu überleben. In der Gegenwart von sowohl natürlichen als auch unnatürlichen Aminosäuren kodieren Überlebende daher für aktive Synthetasen, welche die orthogonale Suppressor-tRNA entweder mit einer natürlichen oder mit einer unnatürlichen Aminosäure beladen. In der negativen Selektion entfernt die Suppression eines Selektorcodons, das an einer oder mehreren nicht essentiellen Positionen eines negativen Markers eingeführt ist, Synthetasen mit Spezifitäten natürlicher Aminosäuren. Überlebende der negativen und der positiven Selektion kodieren für Synthetasen, welche die orthogonale Suppressor-tRNA ausschließlich mit unnatürlichen Aminosäuren aminoacylieren (beladen). Diese Synthetasen können anschließend einer weiteren Mutagenese unterzogen werden, z. B. DNA-Shuffling oder anderen rekursiven Mutageneseverfahren.
  • Eine Bibliothek von mutierten O-RSs kann unter Verwendung verschiedener Mutagenese-Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Die mutierten RSs können z. B. durch ortsspezifische Mutationen, Zufalls-Punktmutationen, homologe Rekombination, DNA-Shuffling oder andere rekursive Mutageneseverfahren, Chimärenkonstruktion oder eine beliebige Kombination davon erzeugt werden. Es kann z. B. eine Bibliothek von mutierten RSs aus zwei oder mehr anderen, z. B. kleineren, weniger unterschiedlichen „Sub-Bibliotheken" hergestellt werden.
  • Chimärenbibliotheken von RSs sind auch von der Erfindung umfasst. Es ist anzumerken, dass Bibliotheken von tRNA-Synthetasen verschiedener Organismen (z. B. Mikroorganismen, wie etwa Eubakterien oder Archaea-Bakterien), wie z. B. Bibliotheken, die eine natürliche Diversität umfassen (siehe z. B. US-Patent Nr. 6.238.884 an Short et al.; US-Patent Nr. 5.756.316 an Schallenberger et al.; US-Patent Nr. 5.783.431 an Petersen et al.; US-Patent Nr. 5.824.485 an Thompson et al.; US-Patent Nr. 5.958.672 an Short et al.), gegebenenfalls konstruiert und auf orthogonale Paare gescreent werden.
  • Wurden die Synthetasen einmal dem Verfahren der positiven und der negativen Selektion bzw. Screenings unterzogen, so können diese Synthetasen anschließend einer weiteren Mutagenese unterzogen werden. Eine Nucleinsäure, die z. B. für die O-RS kodiert, kann isoliert werden; eine Gruppe von Polynucleotiden, die für die mutierten O-RSs kodieren (z. B. durch Zufalls-Mutagenese, ortsspezifische Mutagenese, Rekombination oder eine beliebige Kombination davon), kann aus der Nucleinsäure erzeugt werden; und diese einzelnen Schritte oder eine Kombination dieser Schritte kann wiederholt werden, bis eine mutierte O-RS erhalten wird, die vorzugsweise die O-tRNA mit der unnatürlichen Aminosäure, z. B. einem Homoglutamin, aminoacyliert. In einem Aspekt der Erfindung werden die Schritte mehrfach, z. B. zumindest zwei Mal, durchgeführt.
  • Zusätzliche Grade der Selektions/Screening-Stringenz können in den Verfahren der Erfindung auch zur Produktion von O-tRNA, O-RS oder von Paaren davon verwendet werden. Die Selektions/Screening-Stringenz kann in einem oder beiden Schritten des Verfahrens variiert werden, um eine O-RS zu produzieren. Dies sollte z. B. das Variieren der Menge an Selektions-/Screeningmittel, das verwendet wird, inkludieren etc. Zusätzliche Runden positiver und/oder negativer Selektionen können ebenfalls durchgeführt werden. Das Selektieren oder Screening kann auch eine oder mehrere von Veränderung der Aminosäurepermeabilität, Veränderung der Translationseffizienz, Veränderung der Translationstreue etc umfassen. Typischerweise basiert/basieren diese eine oder die mehreren Veränderungen auf einer Mutation in einem oder mehreren Genen in einem Organismus, in dem ein orthogonales tRNA-tRNA-Synthetase-Paar zur Produktion eines Proteins verwendet wird.
  • Zusätzliche allgemeine Details zur Produktion von O-RS sowie zur Veränderung der Substratspezifität der Synthetase sind in der WO 2002/086075 mit dem Titel „Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase pairs", sowie in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US2004/011786, eingereicht am 16. April 2004, zu finden.
  • Quellen- und Wirtsorganismen
  • Die Translationskomponenten der Erfindung können von nichteukaryotischen Organismen stammen. Die orthogonale O-tRNA kann z. B. von einem nichteukaryotischen Organismus (oder einer Kombination von Organismen) stammen, z. B. einem Archaebakterium, wie z. B. Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, wie z. B. Haloferax volcanii und Halobacterium-Spezies NRC-1, Aarchaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Methanococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosarcina mazei (Mm), Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium oder dergleichen, oder einem Eubakterium, wie z. B. Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus oder dergleichen, während die orthogonale O-RS von einem nichteukaryotischen Organismus (oder einer Kombination an Organismen) stammen kann, z. B. einem Archaeabacterium, wie z. B. Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, wie z. B. Haloferax volcanii und Halobacterium-Spezies NRC-1, Aarchaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Methanococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosarcina mazei, Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium oder dergleichen, oder einem Eubakterium, wie z. B. Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus oder dergleichen. In einer Ausführungsform können eukaryotische Quellen, wie z. B. Pflanzen, Algen, Einzeller, Pilze, Hefearten, Tiere (z. B. Säugetiere, Insekten, Arthropoden etc.) oder dergleichen auch als Quellen von O-tRNAs und O-RS verwendet werden.
  • Die einzelnen Komponenten eines O-tRNA/O-RS-Paars können von demselben Organismus oder von unterschiedlichen Organismen abstammen. In einer Ausführungsform stammt das O-tRNA/O-RS-Paar von demselben Organismus. Alternativ dazu stammen die O-tRNA und die O-RS des O-tRNA/O-RS-Paars von unterschiedlichen Organismen. Im Beispiel einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lysyl-Synthetase/tRNA-Paar der Archaea-Art Pyrococcus horikoshii als orthogonales Paar verwendet, z. B. in einem E.-coli-basierten Translationssystem. Wie hierin beschrieben, kann dieses Paar modifiziert werden, um ein Vier-Basen-Selektorcodon zu erkennen, und es kann modifiziert werden, um die O-tRNA mit einer unnatürlichen Aminosäure, wie z. B. Homoglutamin, zu beladen. Dieses orthogonale Paar (oder modifizierte Formen davon) kann auch mit zuvor beschriebenen orthogonalen Paaren kombiniert werden, z. B. jene, die von Methanococcus jannaschii abstammen, die z. B. modifiziert wurden, um Stopp-Selektorcodons zu erkennen. Dies ermöglicht die Produktion von Proteinen, die zwei unterschiedliche unnatürliche Aminosäuren in einem Translationssystem von Interesse umfassen, durch Inkludieren einer kodierenden Nucleinsäure für Proteine, die zwei oder mehr Selektorcodons umfassen, die jeweils von einem O-tRNA/O-RS-Paar erkannt werden.
  • Die O-tRNA, die O-RS oder das O-tRNA/O-RS-Paar kann in vivo oder in vitro selektiert oder gescreent werden und/oder in einer Zelle verwendet werden, z. B. in nichteukaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen, um ein Polypeptid mit einem Homoglutamin oder einer anderen unnatürlichen Aminosäure von Interesse zu produzieren. Eine nicht eukaryotische Zelle kann aus einer beliebigen einer Reihe von Quellen stammen, z. B. von einem Eubacterium, wie z. B. Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus oder dergleichen, oder einem Arachaebacterium, wie z. B. Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, wie z. B. Haloferax volcanii und Halobacterium-Spezies NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Methanococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosarcina mazei (Mm), Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium oder dergleichen. Eine eukaryotische Zelle kann aus einer beliebigen einer Reihe von Quellen stammen, z. B. von einer Pflanze (z. B. von komplexen Pflanzen, wie z. B. einkeimblättrigen Pflanzen oder zweikeimblättrigen Pflanzen), einer Alge, einem Einzeller, einem Pilz, einer Hefeart (z. B. Saccharomyces cerevisiae), einem Tier (z. B. einem Säugetier, einem Insekt, einem Arthropoden etc.) oder dergleichen. Zusammensetzungen von Zellen mit Translationskomponenten der Erfindung stellen ebenfalls einen Aspekt der Erfindung dar.
  • Siehe auch die Internationale Anmeldung Nr. PCT/US2004/011786, eingereicht am 16. April 2004, zum Screening von O-tRNA und/oder O-RS in einer Spezies zur Verwendung in einer anderen Spezies.
  • Selektorcodons
  • Selektorcodons der Erfindung erweitern den Rahmen des genetischen Codons des biosynthetischen Proteinmechanismus. Ein Selektorcodon umfasst z. B. ein einzigartiges Drei-Basen-Codon, ein Nichtsinn-Codon, wie z. B. ein Stopp-Codon, z. B. ein Amber-Codon (UAG), oder ein Opal-Codon (UGA), ein unnatürliches Codon, zumindest ein Vier-Basen-Codon (z. B. AGGA), ein seltenes Codon oder dergleichen. Eine Reihe von Selektorcodons kann in ein gewünschtes Gen eingeführt werden, z. B. eines oder mehr, zwei oder mehr, mehr als drei etc. Unter Verwendung unterschiedlicher Selektorcodons können mehrere orthogonale tRNA/Synthetase-Paare verwendet werden, welche den gleichzeitigen ortsspezifischen Einbau mehrerer unterschiedlicher unnatürlicher Aminosäuren unter Verwendung dieser unterschiedlichen Selektorcodons ermöglichen.
  • In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren die Verwendung eines Selektorcodons, das ein Stopp-Codon für den In-vivo-Einbau eines Homoglutamins in eine Zelle darstellt. Es wird z. B. eine O-tRNA produziert, die ein Vier-Basen-Selektorcodon erkennt und von einer O-RS mit einem Homoglutamin aminoacyliert wird. Die se O-tRNA wird von den endogenen Aminoacyl-tRNA-Synthetasen des Translationssystems nicht erkannt. Die herkömmliche ortsspezifische Mutagenese kann verwendet werden, um das Selektorcodon an der Stelle von Interesse in einem Target-Polynucleotid einzuführen, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert. Siehe z. B. auch J. R. Sayers et al., „5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotidedirected mutagenesis", Nucleic Acids Res 791–802 (1988). Werden die O-RS, die O-tRNA und die Nucleinsäure, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, kombiniert, z. B. in vivo, so wird das Homoglutamin als Reaktion auf das Selektorcodon eingebaut, um ein Polypeptid zu ergeben, welches das Homoglutamin an der spezifizierten Position enthält.
  • Der Einbau unnatürlicher Aminosäuren, wie z. B. Homoglutamin, kann in vivo ohne signifikante Störung der Wirtszelle erfolgen. Da z. B. bei nicht eukaryotischen Zellen, wie z. B. Escherichia coli, die Suppressionswirksamkeit eines Stopp-Selektorcodons, des UAG-Codons, vom Wettbewerb zwischen der O-tRNA, z. B. der Amber-Suppressor-tRNA, und dem Freisetzungsfaktor 1 (RF1) abhängt (der an das UAG-Codon bindet und die Freisetzung des wachsenden Peptids vom Ribosom initiiert), kann die Suppressionswirksamkeit moduliert werden, z. B. entweder durch Erhöhung des Expressionsausmaßes von O-tRNA, z. B. der Suppressor-tRNA, oder Verwendung eines RF1-defizienten Stamms. Da bei eukaryotischen Zellen die Suppressionswirksamkeit bei einem UAG-Codon vom Wettbewerb zwischen der O-tRNA, z. B. der Amber-Suppressor-tRNA, und einem eukaryotischen Freisetzungsfaktor (z. B. eRF) abhängt (der an ein Stopp-Codon bindet und die Freisetzung des wachsenden Peptids vom Ribosom initiiert), kann die Suppressionswirksamkeit moduliert werden, z. B. durch Erhöhung des Expressionsausmaßes von O-tRNA, z. B. der Suppressor-tRNA. Zusätzlich dazu können auch zusätzliche Verbindungen vorhanden sein, welche die Wirkung des Freisetzungsfaktors modulieren, z. B. Reduktionsmittel, wie z. B. Dithiothreit (DTT).
  • Unnatürliche Aminosäuren, unter anderem z. B. Homoglutamine, können auch von seltenen Codons kodiert werden. Wird z. B. die Argininkonzentration in einer In-vitro-Proteinsynthesereaktion verringert, so hat sich das seltene Arginin-Codon AGG als für die Insertion von Ala durch eine synthetische tRNA, die mit Alanin acyliert wird, als wirksam erwiesen. Siehe z. B. Ma et al., Biochemistry 32, 7939 (1993). In diesem Fall steht die synthetische tRNA mit der natürlich auftretenden tRNAArg in Konkurrenz, die als untergeordnete Spezies in Escherichia coli vorliegt. Zusätzlich dazu verwenden manche Organismen nicht alle Triplett-Codons. Ein nicht zugewiesenes Codon AGA in Micrococcus luteus wurde zur Insertion von Aminosäuren in einem In-vitro-Transkriptions-/Translations-Extrakt verwendet. Siehe z. B. Kowal und Oliver, Nucl. Acid Res. 25, 4685 (1997). Komponenten der Erfindung können zur Verwendung dieser seltenen Codons in vivo erzeugt werden.
  • Selektorcodons können auch erweiterte Codons umfassen, z. B. Vier- oder Mehr-Basen-Codons, wie z. B. Vier-, Fünf-, Sechs- oder Mehr-Basen-Codons. Beispiele für Vier-Basen-Codons umfassen z. B. AGGA, CUAG, UAGA, CCCU und dergleichen. Beispiele für Fünf-Basen-Codons umfassen z. B. AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC und dergleichen. Verfahren der Erfindung umfassen die Verwendung erweiterter Codons basierend auf der Rasterverschiebungssuppression. Vier- oder Mehr-Basen-Codons können z. B. eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren, wie z. B. ein Homoglutamin, in dasselbe Protein insertieren. In anderen Ausführungsformen können die Anticodon-Schleifen z. B. zumindest ein Vier-Basen-Codon, zumindest ein Fünf-Basen-Codon oder zumindest ein Sechs-Basen-Codon oder mehr entschlüsseln. Da es 256 mögliche Vier-Basen-Codons gibt, können mehrere unnatürliche Aminosäuren unter Verwendung eines Vier- oder Mehr-Basen-Codons in derselben Zelle kodiert werden. Siehe auch Anderson et al., Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology 9, 237–244 (2002); sowie Magliery, Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Fourbase Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Appraoch in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307, 755–769 (2001).
  • Es wurden z. B. Vier-Basen-Codons für den Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine unter Verwendung biosynthetischer In-vitro-Verfahren verwendet. Siehe z. B. Ma et al., Biochemistry 32, 7939 (1993); sowie Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 34 (1999). CGGG und AGGU wurden verwendet, um 2-Naphthylalanin und ein NBD-Derivat von Lysin gleichzeitig mit zwei chemisch acetylierten Rasterverschiebungs-Suppressor-tRNAs in vitro in Streptavidin zu inkorporieren. Siehe z. B. Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 12194 (1999). In einer In-vivo-Studie untersuchten Moore et al. die Fähigkeit von tRNALeu-Derivaten mit NCUA-Anticodons, UAGN-Codons zu unterdrücken (N kann U, A, G oder C sein), und fanden heraus, dass die Vierergruppe UAGA von einer tRNALeu mit einem UCUA-Anticodon mit einer Wirksamkeit von 13 bis 26% entschlüsselt werden kann, wobei ein geringer Anteil der Entschlüsselung im 0- oder -1-Rahmen stattfindet. Siehe Moore et al., J. Mol. Biol. 298, 195 (2000). In einer Ausführungsform können erweiterte Codons, die auf seltenen Codons oder Nichtsinn-Codons basieren, in der Erfindung verwendet werden, wodurch ein Fehlsinn-Überlesen sowie eine Rasterverschiebungssuppression an anderen ungewollten Stellen verringert werden kann. In den hierin enthaltenen Beispielen wird ein orthogonales Paar beschrieben, das ein AGGA-Selektorcodon erkennt und ein Homoglutamin während der Proteintranslation insertiert.
  • Bei einem bestimmten System kann ein Selektorcodon auch eines der natürlichen Drei-Basen-Codons umfassen, und zwar wenn das endogene System das natürliche Basen-Codon nicht verwendet (oder selten verwendet). Dies umfasst z. B. ein System, dem eine tRNA fehlt, die das natürliche Drei-Basen-Codon erkennt und/oder ein System, in dem das Drei-Basen-Codon ein seltenes Codon ist.
  • Selektorcodons umfassen gegebenenfalls unnatürliche Basenpaare. Diese unnatürlichen Basenpaare stellen eine weitere Erweiterung des genetischen Alphabets dar. Ein zusätzliches Basenpaar erhöht die Anzahl an Triplett-Codons von 64 auf 125. Eigenschaften dritter Basenpaare umfassen eine stabile und selektive Basenpaarung, eine wirksame enzymatische Inkorporation in DNA mit hohem Treuegrad durch eine Polymerase, sowie die wirksame fortgesetzte Primer-Extension nach der Synthese des entstehenden unnatürlichen Basenpaars. Beschreibungen unnatürlicher Basenpaare, die für Verfahren und Zusammensetzungen angepasst werden können, umfassen z. B. Hirao et al., An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into Protein, Nature Biotechnology 20, 177–182 (2002). Siehe auch Y. Wu et al., J. Am. Chem. Soc. 124, 14626–14630 (2002). Andere relevante Publikationen werden nachstehend aufgelistet.
  • Bei der In-vivo-Verwendung ist das unnatürliche Nucleosid membrandurchlässig und phosphoryliert, um das entsprechende Triphosphat zu bilden. Zusätzlich dazu ist die erhöhte genetische Information stabil und wird nicht durch zelluläre Enzyme zerstört. Zuvor erfolgte Anstrengungen von Brenner und anderen machen sich den Vorteil von Wasserstoffbrückenbindungsmustern zu Nutze, die sich von jenen in kanonischen Watson-Crick-Paaren unterscheiden, wobei das bedeutendste Beispiel davon das Iso-C:iso-G-Paar ist. Siehe z. B. Switzer et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 8322 (1989); sowie Piccirilli et al., Nature 343, 33 (1990); Kool, Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 602 (2000). Bei diesen Basen tritt allgemein in einem gewissen Ausmaß eine Fehlpaarung mit natürlichen Basen auf, und sie können nicht enzymatisch repliziert werden. Kool und Mitarbeiter zeigten, dass hydrophobe Packungswechselwirkungen zwischen Basen eine Wasserstoffbrückenbindung ersetzen können, um die Bildung eines Basenpaars voranzutreiben. Siehe Kool, Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 602 (2000); sowie Guckian und Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36, 2825 (1998). In einem Versuch, ein unnatürliches Basenpaar zu entwickeln, das alle der oben genannten Anforderungen erfüllt, haben Schultz, Romesberg und Mitarbeiter systematisch eine Reihe unnatürlicher hydrophober Basen synthetisiert und untersucht. Von einem PICS:PICS-Selbstpaar wurde herausgefunden, dass es stabiler war als natürliche Basenpaare, und es kann durch ein Klenow-Fragment von Escherichia-coli-DNA-Polymerase I (KF) wirksam in DNA eingebaut werden. Siehe z. B. McMinn et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 11586 (1999); und Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 3274 (2000). Ein 3MN:3MN-Selbstpaar kann durch KF mit ausreichender Wirksamkeit und Selektivität für eine biologische Funktion synthetisiert werden. Siehe z. B. und Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 8803 (2000). Beide Basen reagieren jedoch als Kettenterminator für eine weitere Replikation. Es wurde vor kurzem eine mutierten DNA-Polymerase entwickelt, die zur Replikation des PICS-Selbstpaars verwendet werden kann. Zusätzlich dazu kann ein 7AI-Selbstpaar repliziert werden. Siehe z. B. Tae et al., J. Am. Chem. Soc. 123, 7439 (2001). Es wurde ebenfalls ein neues Metallobasenpaar, Dipic:Py, entwickelt, das nach der Bindung von Cu(II) ein stabiles Paar bildet. Siehe Meggers et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 10714 (2000). Da erweiterte Codons und unnatürliche Codons intrinsisch orthogonal zu natürlichen Codons sind, können sich die Verfahren der Erfindung den Vorteil dieser Eigenschaft für die Erzeugung orthogonaler tRNAs selbst zu Nutze machen.
  • Es kann auch ein Translations-Bypass-System zum Einbau eines Homoglutamins oder einer anderen unnatürlichen Aminosäure in ein gewünschtes Polypeptid verwendet werden. In einem Translations-Bypass-System wird eine große Sequenz in ein Gen insertiert, jedoch nicht in ein Protein translatiert. Die Sequenz enthält eine Struktur, die als Signal zur Induktion des Ribosoms dient, die Sequenz zu überspringen und die Translation stromab der Insertion wiederaufzunehmen.
  • Unnatürliche Aminosäuren
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich eine unnatürliche Aminosäure auf eine beliebige Aminosäure, eine modifizierte Aminosäure oder ein anderes Aminosäure-Analogon als Selenocystein und/oder Pyrrolysin und die folgenden zwanzig genetisch kodierten α-Aminosäuren: Alanin, Arginin, Asparagin, Aparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin. Die allgemeine Struktur einer α-Aminosäure wird in Formel I veranschaulicht:
    Figure 00420001
  • Eine unnatürliche Aminosäure ist typischerweise jede beliebige Struktur der Formel I, worin die R-Gruppe ein beliebiger anderer Substituent als einer ist, der in den zwanzig natürlichen Aminosäuren verwendet wird. Siehe z. B. L. Stryer, Biochemistry, 3. Aufl., Freeman and Company, New York (1988), bezüglich Strukturen der zwanzig natürlichen Aminosäuren. Es ist anzumerken, dass die unnatürlichen Aminosäuren der Erfindung andere natürlich auftretende Verbindungen sein können als die zwanzig oben stehenden α-Aminosäuren (oder freilich künstlich hergestellte, synthetische Verbindungen).
  • Da die unnatürlichen Aminosäuren der Erfindung sich typischerweise von den natürlichen Aminosäuren in der Seitenkette unterscheiden, bilden die unnatürlichen Aminosäuren Amidbindungen mit anderen Aminosäuren, z. B. natürlich oder unnatürlich, und zwar auf dieselbe Art und Weise, auf die sie in natürlich auftretenden Proteinen gebildet werden. Die unnatürlichen Aminosäuren besitzen Seitenkettengruppen, die sie von den natürlichen Aminosäuren unterscheiden.
  • Von besonderem Interesse beim Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine ist es, die Fähigkeit zu besitzen, ein Homoglutamin einzubauen. In anderen unnatürlichen Aminosäuren umfasst z. B. R in Formel I gegebenenfalls ein Alkyl-, Aryl-, Acyl-, Keto-, Azido-, Hydroxyl-, Hydrazin, Cyano-, Halogen-, Hydrazid, Alkenyl, Alkynyl, Ether, Thiol, Seleno-, Sulfonyl-, Borat, Boronat, Phospho, Phosphono, Phosphin, Heterozyklus, Enon, Imin, Aldehyd, Ester, Thioacid, Hydroxylamin, Amin und dergleichen oder eine Kombination davon. Andere unnatürliche Aminosäuren von Interesse umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Aminosäuren, die einen photoaktivierbaren Vernetzer umfassen, spinmarkierte Aminosäuren, fluoreszierende Aminosäuren, metallbindende Aminosäuren, metallhältige Aminosäuren, radioaktive Aminosäuren, Aminosäuren mit neuen funktionellen Gruppen, Aminosäuren, die kovalent oder nicht kovalent mit anderen Molekülen Wechselwirken, photogebundene und/oder photoisomerisierbare Aminosäuren, Biotin- oder Biotin-Analogon-hältige Aminosäuren, Keto-hältige Aminosäuren, glycosylierte Aminosäuren, Aminosäuren, die Polyethylenglykol oder Polyether umfassen, schweratomsubstituierte Aminosäuren, chemisch spaltbare oder photospaltbare Aminosäuren, Aminosäuren mit einer verlängerten Seitenkette im Vergleich zu natürlichen Aminosäuren (z. B. Polyether oder langkettige Kohlenwasserstoffe, z. B. mit mehr als etwa 5, mehr als etwa 10 Kohlenstoffen etc.), kohlenstoffgebundene, zuckerhältige Aminosäuren, Redox-aktive Aminosäuren, Aminothioacid, das Aminosäuren enthält, sowie Aminosäuren, die eine oder mehrere toxische Gruppierungen enthalten. In manchen Ausführungsformen weisen die unna türlichen Aminosäuren einen photoaktivierbaren Vernetzer auf. In einer Ausführungsform weisen die unnatürlichen Aminosäuren eine an die Aminosäure-Seitenkette gebundene Saccharid-Gruppierung und/oder eine andere Kohlenhydrat-Modifikation auf.
  • Zusätzlich zu unnatürlichen Aminosäuren, die neue Seitenketten enthalten, umfassen unnatürliche Aminosäuren gegebenenfalls auch modifizierte Hauptketten-Strukturen, wie z. B. in den Strukturen in Formel II und III veranschaulicht wird:
    Figure 00440001
    worin Z typischerweise OH, NH2, SH, NH-R' oder S-R' umfasst; X und Y, die gleich oder unterschiedlich sein können, umfassen typischerweise S oder O; und R und R', die gleich oder unterschiedlich sein können, werden typischerweise aus derselben Liste von Bestandteilen der R-Gruppe, die oben für die unnatürlichen Aminosäuren der mit Formel I beschrieben wurden, sowie aus Wasserstoff ausgewählt. Unnatürliche Aminosäuren der Erfindung umfassen z. B. gegebenenfalls Substitutionen in der Amino- oder Carboxylgruppe, wie von den Formeln II und III veranschaulicht wird. Unnatürliche Aminosäuren dieses Typs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf α-Hydroxysäuren, α-Thiosäuren, α-Aminothiocarboxylate, z. B. mit Seitenketten, die den häufig auftretenden zwanzig natürlichen Aminosäuren oder unnatürlichen Seitenketten entsprechen. Zusätzlich dazu umfassen Substitutionen am α-Kohlenstoff gegebenenfalls L-, D- oder α-α-disubstituierte Aminosäuren, wie z. B. D-Glutamat, D-Alanin, D-Methyl-O-Tyrosin, Aminobuttersäure und dergleichen. Andere strukturelle Alternativen umfassen zyklische Aminosäuren, wie z. B. Prolin-Analoga, sowie 3-, 4-, 6-, 7-, 8- und 9er-Ring-Prolin-Analoga, β- und γ-Aminosäuren, wie z. B. substituiertes β-Alanin und γ-Aminobuttersäure. Zusätzliche unnatürliche Aminosäure-Strukturen der Erfindung umfassen Homo-β-Typ-Strukturen, z. B. wo es etwa eine Methylen- oder Aminogruppe gibt, die neben dem α-Kohlenstoff in Sandwichstruktur vorliegt, z. B. Isomere von Homo-β-Tyrosin, α-Hydrazinn-Tyrosin. Siehe z. B.
  • Figure 00450001
  • Viele unnatürliche Aminosäuren basieren auf natürlichen Aminosäuren, wie z. B. Tyrosin, Glutamin, Phenylalanin und dergleichen. Tyrosin-Analoga umfassen z. B. parasubstituierte Tyrosine, orthosubstituierte Tyrosine und metasubstituierte Tyrosine, worin das substituierte Tyrosin eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Aminogruppe, ein Hydrazin, ein Hydroxyamin, eine Thiolgruppe, eine Carboxygruppe, eine Isopropylgruppe, eine Methylgruppe, einen unverzweigten oder verzweigten C6-C20-Kohlenwasserstoff, einen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff, eine O-Methylgruppe, eine Polyethergruppe, eine Nitrogruppe oder dergleichen umfasst. Zusätzlich dazu werden auch mehrfach substituierte Arylringe in Betracht gezogen. Glutamin-Analoga der Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf α-Hydroxy-Derivate, γ-substituierte Derivate, zyklische Derivate und amidsubstituierte Glutamin-Derivate. Beispiele für Phenylalanin-Analoga umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf parasubstituierte Phenylalanine, orthosubstituierte Phenylalanine und metasubstituierte Phenylalanine, worin der Substituent eine Hydroxygruppe, eine Methoxygruppe, eine Methylgruppe, eine Allylgruppe, ein Aldehyd oder eine Ketogruppe oder dergleichen umfasst. Spezifische Beispiele unnatürlicher Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Homoglutamin, ein 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin, ein p-Acetyl-L-phenylalanin, ein p-Propargyloxyphenylalanin, O-Methyl-L-tyrosin, ein L-3-(2-Naphthyl)alanin, ein 3-Methylphenylalanin, ein O-4-Allyl-L-tyrosin, ein 4-Propyl-L-tyrosin, ein Tri-O-acetyl-GlcNAcβ-Serin, ein L-Dopa, ein fluoriertes Phenylalanin, ein Isopropyl-L-phenylalanin, ein p-Azido-L-phenylalanin, ein p-Acyl-L-phenylalanin, ein p-Benzoyl-L-phenylalanin, ein L-Phosphoserin, ein Phosphonoserin, ein Phosphonotyrosin, ein p-lodphenylalanin, ein p-Bromphenylalanin, ein p-Amino-L-phenylalanin und ein Isopropyl-L-phenylalanin und dergleichen. Die Strukturen einer Reihe unnatürlicher Aminosäuren werden z. B. in den 16, 17, 18, 19, 26 und 29 aus WO 2002/085923 mit dem Titel „In vivo incorporation of unnatural amino acids" bereitgestellt.
  • Chemische Synthese unnatürlicher Aminosäuren
  • Zahlreiche der oben bereitgestellten unnatürlichen Aminosäuren sind im Handel erhältlich, z. B. bei Sigma (USA) oder Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Jene, die nicht im Handel erhältlich sind, werden gegebenenfalls synthetisiert, wie in verschiedenen Publikationen oder unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann nach dem Stand der Technik bekannt sind, bereitgestellt. Für organische Syntheseverfahren siehe z. B. Fessendon und Fessendon, Organic Chemistry, 2. Aufl., Willard Grant Press, Boston, Mass. (1982); March, Advanced Organic Chemistry, 3. Auflage, Wiley and Sons, New York (1985); sowie Carey und Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3. Auflage, Teile A und B, Plenum Press, New York (1990). Zusätzliche Publikationen, welche die Synthese unnatürlicher Aminosäuren beschreiben, umfassen z. B. WO 2002/085923 mit dem Titel „In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"; Matsoukas et al., J. Med. Chem. 38, 4660–4669 (1995); F. E.King & D. A. A. Kidd, A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates, J. Chem. Soc. 3315–3319 (1949); O. M. Friedman & R. Chatterrji, Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents, J. Am. Chem. Soc. 81, 3750–3752 (1959); J. C. Craig et al., Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbuyl]amino]-quinoline (Chloroquine), J. Org. Chem. 53, 1167–1170 (1988); M. Azoulay, M. Vilmont & F. Frappier, Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201–5 (1991); A. M. P. Koskinen & H. Rapoport, Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues, J. Org. Chem. 54, 1859–1866 (1989); B. D. Christie & H. Rapoport, Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization, J. Org. Chem. 1989, 1859–1866 (1985); Barton et al., Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-α-Aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives, Tetrahedron Lett. 43, 4297–4308 (1987); sowie Subasinghe et al., Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quis-qualate-sensitized site, J. Med. Chem. 35, 4602–7 (1992). Siehe auch die Internationale Anmeldung mit der Nr. PCT/US 03/41346 mit dem Titel „Protein Arrays", eingereicht am 22. Dezember 2003.
  • Zelluläre Aufnahme unnatürlicher Aminosäuren
  • Die Aufnahme unnatürlicher Aminosäuren durch eine Zelle ist ein Thema, das typischerweise bei der Schaffung und der Auswahl unnatürlicher Aminosäuren in Betracht gezogen wird, z. B. zum Einbau in ein Protein. Die hohe Beladungsdichte von α-Aminosäuren deutet z. B. an, dass diese Verbindungen wahrscheinlich nicht zelldurchlässig sind. Natürliche Aminosäuren werden in die Zelle durch eine Sammlung proteinbasierter Transportsysteme aufgenommen, die oftmals variierende Ausmaße an Aminosäurespezifität aufweisen. Ein schnelles Screening kann durchgeführt werden, das untersucht, welche unnatürlichen Aminosäuren, falls überhaupt, von Zellen aufgenommen werden. Siehe z. B. Toxizitätstests, z. B. in der Internationalen Anmeldung mit der Nr. PCT/US 03/41346 mit dem Titel „Protein Arrays", eingereicht am 22. Dezember 2003; sowie D. R. Liu & P. G. Schultz, Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code, PNAS United States 96, 4780–4785 (1999). Obwohl die Aufnahme leicht mit verschiedenen Tests analysiert wird, ist die Bereitstellung biosynthetischer Wege zur In-vivo-Erzeugung von Aminosäuren eine Alternative zur Kreation unnatürlicher Aminosäuren, die für zelluläre Aufnahmewege zugänglich sind.
  • Biosynthese unnatürlicher Aminosäuren
  • Zahlreiche biosynthetische Wege für die Produktion von Aminosäuren und anderen Verbindungen existieren bereits in Zellen. Während ein biosynthetisches Verfahren für eine bestimmte unnatürliche Aminosäure in der Natur, z. B. in einer Zelle, nicht vorhanden sein muss, stellt die Erfindung solche Verfahren bereit. Biosynthetische Wege für unnatürliche Aminosäuren werden z. B. gegebenenfalls in einer Wirtszelle erzeugt, und zwar durch das Hinzufügen neuer Enzyme oder durch Modifizieren existierender Wirtszellwege. Zusätzliche neue Enzyme sind gegebenenfalls natürlich auftretende Enzyme oder künstlich entwickelte Enzyme. Die Biosynthese von p-Aminophenylalanin (wie in einem Beispiel in WO 2002/085923 , s. o., angeführt) beruht auf dem Zusatz einer Kombination bekannter Enzyme aus anderen Organismen. Die Gene für diese Enzyme können in eine Zelle durch Transformieren der Zelle mit einem Plasmid eingeführt werden, das die Gene umfasst. Die Gene stellen bei Expression in der Zelle einen enzymatischen Weg bereit, um die gewünschte Verbindung zu synthetisieren. Beispiele der Typen an Enzymen, die gegebenenfalls hinzugefügt werden, werden in den unten stehenden Beispielen bereitgestellt. Zusätzliche Enzymsequenzen sind z. B. in GenBank zu finden. Künstlich entwickelte Enzyme werden gegebenenfalls ebenso auf dieselbe Art und Weise in eine Zelle hinzugefügt. Auf diese Art und Weise werden der zelluläre Mechanismus und die Ressourcen einer Zelle manipuliert, um unnatürliche Aminosäuren zu produzieren.
  • Tatsächlich kann ein beliebiges einer Reihe von Verfahren zur Produktion neuer Enzyme zur Verwendung in biosynthetischen Wegen oder zur Evolution existierender Wege verwendet werden, zur Produktion unnatürlicher Aminosäuren in vitro oder in vivo. Zahlreiche erhältliche Verfahren zur Entwicklung von Enzymen und anderen biosynthetischen Wegkomponenten können auf die vorliegende Erfindung angewandt werden, um unnatürliche Aminosäuren zu produzieren (oder tatsächlich, um Synthetasen weiterzuentwickeln, so dass sie neue Substratspezifitäten oder andere Aktivitäten von Interesse aufweisen). DNA-Shuffling wird z. B. gegebenenfalls verwendet, um in vitro oder in vivo neue Enzyme und/oder Wege solcher Enzyme für die Produktion unnatürlicher Aminosäuren (oder die Produktion neuer Synthetasen) zu entwickeln. Siehe z. B. Stemmer, Rapid evolution of a Protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4), 389–391 (1994); und Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751 (1994). Ein verwandter Ansatz führt ein Shuffling von Familien verwandter (z. B. homologer) Gene durch, um Enzyme mit gewünschten Merkmalen schnell weiterzuentwickeln. Ein Beispiel solcher „Familien-Gen-Shuffling"-Verfahren ist in Crameri et al., DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution, Nature 391 (6664), 288–291 (1998), zu finden. Neue Enzyme (unabhängig davon, ob biosynthetische Wegkomponenten oder Synthetasen) können auch unter Verwendung eines DNA-Rekombinationsverfahrens erzeugt werden, das als „inkrementelle Trunkierung zur Erzeugung von Hybridenzymen" („ITCHY") bezeichnet wird, z. B. wie in Ostermeier et al., A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology, Nature Biotech 17, 1205 (1999), beschrieben wird. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um eine Bibliothek von Enzym- oder anderen Weg-Varianten zu erzeugen, die als Substrate für ein oder mehrere In-vitro- oder In-vivo-Rekombinationsverfahren dienen können. Siehe auch Ostermeier et al., Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3562–67 (1999); sowie Ostermeier et al., Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts, Biological and Medicinal Chemistry 7, 2139–44 (1999). Ein anderer Ansatz verwendet die exponentielle Ensemble-Mutagenese zur Produktion von Enzym- oder anderen Weg-Varianten, die z. B. auf eine Fähigkeit selektiert werden, eine biosynthetische Reaktion zu katalysieren, die zur Produktion einer unnatürlichen Aminosäure (oder einer neuen Synthetase) von Bedeutung ist. In diesem Ansatz werden kleine Gruppen von Resten in einer Sequenz von Interesse parallel randomisiert, um an jeder veränderten Position Aminosäuren zu identifizieren, die zu funktionellen Proteinen führen. Beispiele solcher Verfahren, die an die vorliegende Erfindung angepasst werden können, um neue Enzyme zur Produktion unnatürlicher Aminosäuren (oder neuer Synthetasen) zu produzieren, sind in Delegrave & Youvan, Biotechnology Research 11, 1548–1552 (1993), zu finden. In einem weiteren Ansatz kann eine Zufalls- oder Semi-Zufalls-Mutagenese unter Verwendung dotierter oder degenerierter Oligonucleotide zum Enzym- und/oder Weg-Komponenten-Engineering verwendet werden, z. B.
  • durch Verwendung der allgemeinen Mutageneseverfahren von z. B. Arkin und Youvan, Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis, Biotechnology 10, 297–300 (1992); oder Reidhaar-Olson et al., Random mutagenesis of Protein sequences using oligonucleotide cassettes, Methods Enzymol. 208, 564–86 (1991). Ein weiterer Ansatz, oftmals „als „nichtstochastische" Mutagenese bezeichnet, der eine Polynucleotid-Neuanordnung und eine Orts-Sättigungsmutagenese verwendet, kann verwendet werden, um Enzyme und/oder Weg-Komponenten zu produzieren, die anschließend auf eine Fähigkeit zur Durchführung einer oder mehrer Synthetase- oder biosynthetischer Weg-Funktionen gescreent werden können (z. B. zur In-vivo-Produktion unnatürlicher Aminosäuren). Siehe z. B. Short „Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzymes" WO 00/46344 .
  • Eine Alternative zu solchen Mutationsverfahren umfasst die Rekombination gesamter Genome von Organismen, sowie das Selektieren der resultierenden Nachkommenschaft auf bestimmte Weg-Funktionen (oftmals als „Gesamtgenom-Shuffling" bezeichnet). Dieser Ansatz kann auf die vorliegende Erfindung angewandt werden, z. B. durch genomische Rekombination und Selektion eines Organismus (z. B. einer E.-coli- oder einer anderen Zelle) auf eine Fähigkeit, eine unnatürliche Aminosäure (oder ein Zwischenprodukt davon) zu produzieren. Es können z. B. Verfahren, die in den folgenden Publikationen gelehrt werden, auf das Weg-Design zur Entwicklung existierender und/oder neuer Wege in Zellen angewandt werden, um in vivo unnatürliche Aminosäuren zu produzieren: Patnaik et al., Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance, Nature Biotechnology 20 (7), 707–712 (2002); und Zhang et al., Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria, Nature 415 (6872), 7. Februar, 644–646 (2002).
  • Andere Verfahren zum Engineerung von Organismen und Stoffwechselwegen, z. B. zur Produktion gewünschter Verbindungen, sind ebenso verfügbar und können auch auf die Produktion unnatürlicher Aminosäuren angewandt werden. Beispiele von Publikationen, die Lehren bezüglich nützlicher Ansätze zum Weg-Engineering enthalten, umfassen: Nakamura und White, Metabolic engineering for the microbial produc tion of 1,3 propanediol, Curr. Opin. Biotechnol. 14 (5), 454–9 (2003); Berry et al., Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo, J. Industrial Microbiology and Biotechnology 28, 127–133 (2002); Banta et al., Optimizing an artificial metabolic pathway: Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis, Biochemistry 41 (20), 6226–36 (2002); Selivonova et al., Rapid Evolution of Novel Traits in Micororganisms, Applied and Environmental Microbiology 67, 3645 (2001), und viele andere.
  • Unabhängig vom verwendeten Verfahren wird die mit einem durch Engineering veränderten biosynthetischen Weg der Erfindung produzierte unnatürliche Aminosäure in einer Konzentration produziert, die für eine wirksame Proteinbiosynthese ausreicht, z. B. eine natürliche zelluläre Menge, jedoch nicht in solch einem Ausmaß, um die Konzentration anderer zellulärer Aminosäuren wirksam zu beeinflussen oder um zelluläre Ressourcen zu erschöpfen. Typische Konzentrationen, die auf diese Art und Weise in vivo produziert wurden, sind etwa 10 mM bis etwa 0,05 mM. Ist eine Zelle einmal gentechnisch verändert, um Enzyme zu produzieren, die für einen spezifischen Weg gewünscht werden, und wird eine unnatürliche Aminosäure erzeugt, so werden gegebenenfalls In-vivo-Selektionen verwendet, um die Produktion der unnatürlichen Aminosäure sowohl für die ribosomale Proteinsynthese als auch für das Zellwachstum weiter zu optimieren.
  • Orthogonale Komponenten zum Einbau von Homoglutamin
  • Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Produktion orthogonaler Komponenten zum In-vivo-Einbau eines Homoglutamins in eine wachsende Polypeptidkette als Reaktion auf ein Selektorcodon, z. B. ein Stopp-Codon, ein Nichtsinn-Codon, ein Vier- oder Mehr-Basen-Codon etc., bereit. Die Erfindung stellt z. B. orthogonale tRNAs (O-tRNAs), orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (O-RSs) sowie Paare davoneser bereit. Diese Paare können zum Einbau von Homoglutaminen in wachsende Polypeptidketten verwendet werden.
  • Eine Zusammensetzung der Erfindung umfasst eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), wobei die O-RS vorzugsweise eine O-tRNA mit einem Homoglutamin aminoacyliert. In gewissen Ausführungsformen umfasst die O-RS eine Aminosäuresequenz, umfassend Seq.-ID Nr. 1, oder eine konservative Variation davon. In gewissen Ausführungsformen der Erfindung aminoacyliert die O-RS vorzugsweise die O-tRNA mit einer Wirksamkeit von zumindest 50% der Wirksamkeit eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
  • Eine Zusammensetzung, die eine O-RS umfasst, kann weiters gegebenenfalls eine orthogonale tRNA (O-tRNA) umfassen, wobei die O-tRNA ein Selektorcodon erkennt. Typischerweise umfasst eine O-tRNA der Erfindung eine Suppressionswirksamkeit von z. B. zumindest etwa 45%, 50%, 60%, 75%, 80% oder 90% oder mehr in Gegenwart einer zugehörigen Synthetase als Reaktion auf ein Selektorcodon im Vergleich zu der O-tRNA, die eine Polynucleotidsequenz umfasst oder davon kodiert wird, wie sie in den Sequenzprotokollen und den Beispielen hierin dargelegt ist. In einer Ausführungsform liegt die Suppressionswirksamkeit der O-RS und der O-tRNA zusammen z. B. beim 5fachen, 10fachen, 15fachen, 20fachen, 25fachen oder einem noch höheren Wert als jener der Suppressionswirksamkeit der O-tRNA, der die O-RS fehlt. In einem Aspekt liegt die Suppressionswirksamkeit der O-RS und der O-tRNA zusammen bei zumindest 45% der Suppressionswirksamkeit eines orthogonalen Tyrosyl-tRNA-Synthetase-Paars, das von Methanococcus jannaschii stammt.
  • Eine Zusammensetzung, die eine O-tRNA umfasst, kann gegebenenfalls eine Zelle (z. B. eine nicht eukaryotische Zelle, wie z. B. eine E.-coli-Zelle oder dergleichen, oder eine eukaryotische Zelle), und/oder ein Translationssystem umfassen.
  • Eine Zelle (z. B. eine nicht eukaryotische Zelle oder eine eukaryotische Zelle), umfassend ein Translationssystem, wird ebenfalls von der Erfindung bereitgestellt, wobei das Translationssystem eine orthogonale tRNA (O-tRNA), eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS) und ein Homoglutamin umfasst. Typischerweise aminoacyliert die O-RS vorzugswise die O-tRNA mit einer Wirksamkeit von zumindest 50% der Wirksamkeit eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 1 umfasst. Die O-tRNA erkennt das erste Selektorcodon und die O-RS aminoacyliert vorzugsweise die O-tRNA mit dem Homoglutamin. In einer Ausführungsform umfasst die O-tRNA eine Polynucleotidsequenz, wie sie in Seq.-ID Nr. 2 dargelegt ist, oder wird von dieser kodiert, oder eine komplementäre Polynucleotidsequenz dieser. In einer Ausführungsform umfasst die O-RS eine Aminosäuresequenz, wie sie in einer beliebigen aus Seq.-ID Nr. 1 dargelegt ist, oder eine konservative Variation dieser.
  • Eine Zelle der Erfindung kann gegebenenfalls weiters ein zusätzliches unterschiedliches O-tRNA/O-RS-Paar und eine zweite unnatürliche Aminosäure umfasen, z. B. wo diese O-tRNA ein zweites Selektorcodon erkennt und diese O-RS vorzugsweise die O-tRNA mit der zweiten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Gegebenenfalls umfasst eine Zelle der Erfindung eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, wobei das Polynucleotid ein Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird.
  • In gewissen Ausführungsformen umfasst eine Zelle der Erfindung eine E.-coli-Zelle, die eine orthgonale tRNA (O-tRNA), eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-tRNA), ein Homoglutamin und eine Nucleinsäure umfasst, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, wobei das Polynucleotid das Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird. In gewissen Ausführungsformen der Erfindung aminoacyliert die O-RS vorzugsweise die O-tRNA mit einer Wirksamkeit von zumindest 50% der Wirksamkeit eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz einer beliebigen hierin aufgelisteten O-RS umfasst.
  • In gewissen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die O-tRNA der Erfindung eine Polynucleotidsequenz, wie sie in den Sequenzprotokollen oder Beispielen hierin dargelegt ist, oder wird von dieser kodiert, oder eine komplementäre Polynucleotidsequenz dieser. In gewissen Ausführungformen der Erfindung umfasst eine O-RS eine Aminosäuresequenz, wie sie in den Sequenzprotokollen dargelegt ist, oder eine konservative Variation dieser. In einer Ausführungsform wird die O-RS oder ein Abschnitt dieser von einer Polynucleotidsequenz kodiert, die für eine Aminosäure ko diert, wie sie in den Sequenzprotokollen oder Beispielen hierin dargelegt ist, oder einer komplementären Polynucleotidsequenz davon.
  • Die O-tRNA und/oder die O-RS der Erfindung kann von einem beliebigen einer Reihe von Organismen abstammen (z. B. eukaryotischen und/oder nichteukaryotischen Organismen).
  • Polynucleotide stellen ebenfalls einen Aspekt dieser Erfindung dar. Ein Polynucleotid der Erfindung umfasst ein künstliches (z. B. vom Menschen erzeugtes und nicht natürlich auftretendes) Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, wie es in den Sequenzprotokollen hierin dargelegt ist, und/oder ist komplementär zu jener Polynucleotidsequenz. Ein Polynucleotid der Erfindung kann auch eine Nucleinsäure umfassen, die unter hochgradig stringenten Bedingungen an ein oben stehend beschriebenes Polynucleotid hybridisiert, und zwar im Wesentlichen über die gesamte Länge der Nucleinsäure. Ein Polynucleotid der Erfindung umfasst auch ein Polynucleotid, das z. B. zumindest zu 75%, zumindest zu 80%, zumindest zu 90%, zumindest zu 95%, zumindest zu 98% oder mehr identisch mit jenem einer natürlich auftretenden tRNA oder entsprechenden kodierenden Nucleinsäure ist (ein Polynucleotid der Erfindung ist jedoch ein anderes als eine natürlich auftretende tRNA oder eine entsprechende kodierende Nucleinsäure), wobei die tRNA ein Selektorcodon erkennt, z. B. ein Vier-Basen-Codon. Künstliche Polynucleotide, die z. B. zumindest zu 80%, zumindest zu 90%, zumindest zu 95%, zumindest zu 98% oder mehr identisch mit einem beliebigen oben stehenden Polynucleotid und/oder einem Polynucleotid sind, das eine konservative Variation eines beliebigen oben stehender Polynucleotide umfasst, fallen auch unter Polynucleotide der Erfindung.
  • Vektoren, die ein Polynucleotid der Erfindung umfassen, sind ebenfalls ein Merkmal der Erfindung. Ein Vektor der Erfindung kann z. B. ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen, ein Virus, einen Expressionsvektor und/oder dergleichen umfassen. Eine Zelle, die einen Vektor der Erfindung umfasst, ist ebenfalls ein Merkmal der Erfindung.
  • Verfahren zur Produktion von Komponenten eines O-tRNA/O-RS-Paars sind ebenfalls Merkmale der Erfindung. Komponenten, die durch diese Verfahren produziert werden, sind ebenfalls ein Merkmal der Erfindung. Verfahren zur Produktion von z. B. zumindest einer tRNA, die orthogonal zu einer Zelle (O-tRNA) ist, umfassen die Erzeugung einer Bibliothek an mutierten tRNAs; das Mutieren einer Anti-Codon-Schleife eines jeden Mitglieds der Bibliothek an mutierten tRNAs, um die Erkennung eines Selektorcodons zu ermöglichen, wodurch eine Bibliothek potentieller O-tRNAs bereitgestellt wurde, sowie das Unterziehen einer ersten Zellpopulation einer ersten Spezies einer negativen Selektion, wobei die Zellen ein Mitglied der Bibliothek potentieller O-tRNAs umfassen. Die negative Selektion eliminiert Zellen, die ein Mitglied der Bibliothek potentieller O-tRNAs umfassen, das von einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase (RS), die zu der Zelle endogen ist, aminoacyliert wird. Dies stellt einen Pool von tRNAs bereit, die zu der Zelle der ersten Spezies orthogonal sind, wodurch zumindest eine O-tRNA bereitgestellt wird. Es wird ebenso eine O-tRNA bereitgestellt, die durch die Verfahren der Erfindung produziert wurde.
  • In gewissen Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiters das Unterziehen einer zweiten Zellpopulation der ersten Spezies einer positiven Selektion, wobei die Zellen ein Mitglied des Pools von tRNAs, die zu der Zelle der ersten Spezies orthogonal sind, eine zugehörige Aminoacyl-tRNA-Synthetase und einen positiven Selektionsmarker umfassen. Unter Verwendung der positiven Selektion werden Zellen selektiert, oder es wird auf jene Zellen gescreent, die ein Mitglied des Pools von tRNAs umfassen, das von der zugehörigen Aminoacyl-tRNA-Synthetase aminoacyliert wird und das eine gewünschte Antwort in Gegenwart des positiven Selektionsmarkers zeigt, wobei eine O-tRNA bereitgestellt wurde. In gewissen Ausführungsformen umfasst die zweite Zellpopulation Zellen, die nicht durch die negative Selektion eliminiert wurden.
  • Es werden auch Verfahren zur Identifikation einer orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase bereitgestellt, die ein Homoglutamin auf eine O-tRNA lädt. Verfahren umfassen z. B. das Unterziehen einer Zellpopulation einer ersten Spezies einer Selektion, wobei die Zellen jeweils Folgendes umfassen: 1) ein Mitglied einer Vielzahl von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (RSs), (z. B. kann die Vielzahl von RSs mutierten RSs umfassen, sowie RSs, die von einer anderen Spezies als einer ersten Spezies stammen, oder sowohl mutierte RSs als auch RSs, die von einer anderen Spezies als der ersten Spezies stammen); 2) die orthogonale tRNA (O-tRNA) (z. B. von einer oder mehreren Spezies); sowie 3) ein Polynucleotid, das für einen positiven Selektionsmarker kodiert und zumindest ein Selektorcodon umfasst.
  • Zellen (z. B. eine Wirtszelle), die eine Verbesserung der Suppressionswirksamkeit im Vergleich zu Zellen aufweisen, denen das Mitglied der Vielzahl von RSs fehlt oder die eine reduzierte Menge desselben aufweisen, werden selektiert oder auf jene gescreent. Diese selektierten/gescreenten Zellen umfassen eine aktive RS, welche die O-tRNA aminoacyliert. Eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die vom Verfahren identifiziert wird, ist ebenfalls ein Merkmal der Erfindung.
  • Verfahren zur Produktion eines Proteins in einer Zelle (z. B. einer nichteukaryotischen Zelle, wie z. B. einer E.-coli-Zelle oder dergleichen, oder einer eukaryotischen Zelle) mit einem Homoglutamin an einer spezifizierten Position sind ebenfalls ein Merkmal der Erfindung. Ein Verfahren umfasst z. B. das Züchten einer Zelle in einem geeigneten Medium, wobei die Zelle eine Nucleinsäure umfasst, die zumindest ein Selektorcodon umfasst und für ein Protein kodiert, das Bereitstellen des Homoglutamins, sowie den Einbau des Homoglutamins in die spezifizierte Position im Protein während der Translation der Nucleinsäure mit dem zumindest einen Selektorcodon, wodurch das Protein produziert wird. Die Zelle umfasst weiters: eine orthogonale tRNA (O-tRNA), die in der Zelle funktioniert und das Selektorcodon erkennt; sowie eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise die O-tRNA mit dem Homoglutamin aminoacyliert. Ein Protein, das durch dieses Verfahren produziert wird, ist ebenfalls ein Merkmal der Erfindung.
  • Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die Proteine umfassen, wobei die Proteine z. B. ein Homoglutamin umfassen. In gewissen Ausführungsformen umfasst das Protein eine Aminosäuresequenz, die zumindest zu 75% identisch mit jener eines bekannten Proteins ist, z. B. eines therapeutischen Proteins, eines diagnos tischen Proteins, eines industriellen Enzyms oder eines Abschnitts davon. Gegebenenfalls umfasst die Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  • Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen und -Varianten
  • Wie oben und nachstehend beschrieben, stellt die Erfindung Nucleinsäure-Polynucleotidsequenzen bereit, z. B. O-tRNAs und O-RS, sowie Polypeptid-Aminosäuresequenzen, z. B. O-RSs, und z. B. Zusammensetzungen, Systeme und Verfahren, die diese Sequenzen umfassen. Beispiele dieser Sequenzen, z. B. O-tRNAs und O-RSs, werden hierin offenbart (siehe die hierin angeführten Sequenzprotokollen und Beispiele). Dem Fachmann ist klar, dass die Erfindung nicht auf genau jene Sequenzen beschränkt ist, wie sie z. B. in den Beispielen und der Auflistung angeführt sind. Der Fachmann weiß auch, dass die Erfindung z. B. viele verwandte und nicht verwandte Sequenzen mit den hierin beschriebenen Funktionen, z. B. Kodieren für eine geeignete O-tRNA oder eine O-REAKTIONSSYSTEM, bereitstellt.
  • Die Erfindung stellt Polypeptide (O-RSs) und Polynucleotide bereit, z. B. O-tRNA, Polynucleotide, die für O-RSs oder Abschnitte dieser kodieren, Oligonucleotide, die zur Isolierung von Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Klonen verwendet werden etc. Polynucleotide der Erfindung umfassen jene, die für Proteine oder Polypeptide von Interesse der Erfindung mit einem oder mehreren Selektorcodon(s) kodieren. Zusätzlich dazu umfassen Polynucleotide der Erfindung z. B. ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, wie z. B. in den Sequenzprotokollen dargelegt; ein Polynucleotid, das komplementär zu einer Polynucleotidsequenz davon ist oder für diese kodiert. Ein Polynucleotid der Erfindung umfasst auch ein Polynucleotid, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die beliebige jener in den hierin enthaltenen Sequenzprotokollen oder Beispielen umfasst. Ein Polynucleotid der Erfindung umfasst auch ein Polynucleotid, das für ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Auf ähnliche Art und Weise ist eine künstliche Nucleinsäure, die unter hochgradig stringenten Bedingungen über im Wesentlichen die gesamte Länge der Nucleinsäure an ein oben angeführtes Polynucleotid hybridisiert (und bei der es sich nicht um ein natürliches Polynucleotid handelt), ein Polynucleotid der Erfindung. In einer Ausführungsform umfasst eine Zusam mensetzung ein Polypeptid der Erfindung und einen Exzipienten (z. B. einen Puffer, Wasser, einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten etc.). Die Erfindung stellt auch einen Antikörper oder Antisera bereit, der/die mit einem Polypeptid der Erfindung spezifisch immunreaktiv ist/sind. Ein künstliches Polynucleotid ist ein Polynucleotid, das vom Menschen hergestellt wird und nicht natürlich vorkommt.
  • Ein Polynucleotid der Erfindung umfasst auch ein künstliches Polyncleotid, das z. B. zumindest zu 75%, zumindest zu 80%, zumindest zu 90%, zumindest zu 95%, zumindest zu 98% oder einem höheren Wert mit jenem einer natürlich auftretenden tRNA (wobei es sich jedoch nicht um eine natürlich auftretende tRNA handelt) oder einer beliebigen tRNA oder kodierenden Nucleinsäure davon in einer hierin enthaltenen Auflistung oder einem hierin enthaltenen Beispiel identisch ist. Ein Polynucleotid umfasst auch ein künstliches Polynucleotid, das z. B. zumindest zu 75%, zumindest zu 80%, zumindest zu 90%, zumindest zu 95%, zumindest zu 98% oder einem höheren Wert mit jenem einer natürlich auftretenden tRNA identisch ist.
  • In gewissen Ausführungsformen umfasst ein Vektor (z. B. ein Plasmid, ein Cosmid, ein Phage, ein Virus etc.) ein Polynucleotid der Erfindung. In einer Ausführungsform ist der Vektor ein Expressionsvektor. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor einen Promotor, der operabel an eines oder mehrere Polynucleotide der Erfindung gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Zelle einen Vektor, der ein Polynucleotid der Erfindung inkludiert.
  • Der Fachmann weiß auch, dass zahlreiche Varianten der offenbarten Sequenzen Teil der Erfindung sind. Es sind z. B. konservative Variationen der offenbarten Sequenzen, die eine funktionell ähnliche Sequenz ergeben, Teil der Erfindung. Es werden Varianten der Nucleinsäure-Polynucleotidsequenzen als Teil der Erfindung angesehen, wobei die Varianten an zumindest eine offenbarte Sequenz hybridisieren und ein Selektorcodon erkennen. Einzigartige Subsequenzen der hierin offenbarten Sequenzen, wie z. B. durch Standard-Sequenzvergleichsverfahren bestimmt, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
  • Konservative Variationen
  • Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sind „stille Mutationen" (d. h. Substitutionen in einer Nucleinsäuresequenz, die nicht zu einer Veränderung in einem kodierten Polypeptid führen) ein impliziertes Merkmal jeder Nucleinsäuresequenz, die für eine Aminosäure kodiert. Auf ähnliche Art und Weise werden „konservative Aminosäuresubstitutionen" in einer oder einigen Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz mit unterschiedlichen Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften substituiert und werden ebenfalls leicht als sehr ähnlich zu einem offenbarten Konstrukt identifiziert. Solche konservativen Variationen jeder offenbarten Sequenz sind ein Merkmal der vorliegenden Erfindung.
  • „Konservative Variationen" einer bestimmten Nucleinsäuresequenz bezieht sich auf jene Nucleinsäuren, die für identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder, wenn die Nucleinsäure nicht für eine Aminosäuresequenz kodiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Der Fachmann erkennt, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz an Aminosäuren (typischerweise weniger als 5%, noch typischer weniger als 4%, 2% oder 1%) in einer kodierten Sequenz ändern, addieren oder deletieren, „konservativ modifizierte Variationen" sind, wobei die Änderungen zur Deletion einer Aminosäure, zur Addition einer Aminosäure oder zur Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure führen. Daher umfassen „konservative Variationen" einer aufgelisteten Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung Substitutionen eines geringen Prozentsatzes, typischerweise weniger als 5%, noch typischer weniger als 2% oder 1%, der Aminosäuren der Polypeptidsequenz durch eine Aminosäure derselben konservativen Substitutionsgruppe. Schließlich handelt es sich bei der Addition von Sequenzen, welche die Kodierungsaktivität eines Nucleinsäuremoleküls nicht verändern, wie z. B. die Addition einer nichtfunktionellen Sequenz, um eine konservative Variation der grundlegenden Nucleinsäure.
  • Tabellen konservativer Substitutionen, die funktionell ähnliche Aminosäuren zeigen, sind auf dem Gebiet wohlbekannt, wobei ein anderer Aminosäure-Rest mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. aromatische Seitenketten oder positiv geladene Seitenketten) durch einen anderen Aminosäure-Rest ersetzt wird, der die funktionellen Eigenschaften des Polypeptidmoleküls nicht wesentlich verändert. Im Folgenden werden Beispielgruppen dargelegt, die natürliche Aminosäuren ähnlicher chemischer Eigenschaften enthalten, wobei es sich bei Substitutionen innerhalb einer Gruppe um „konservative Substitutionen" handelt.
    apolare und/oder aliphatische Seitenketten polare, ungeladene Seitenketten aromatische Seitenketten positiv geladene Seitenketten negativ geladene Seitenketten
    Glycin Serin
    Alanin Threonin Phenylalanin Lysin
    Valin Cystein Tyrosin Arginin Aspartat
    Leucin Methionin Tryptophan Histidin Glutamat
    Isoleucin Asparagin
    Prolin Glutamin
  • Nucleinsäure-Hybridisierung
  • Vergleichende Hybridisierung kann verwendet werden, um Nucleinsäuren der Erfindung zu identifizieren, wie z. B. jene der hierin enthaltenen Sequenzprotokolle, einschließlich konservativer Variationen von Nucleinsäuren der Erfindung, und dieses vergleichende Hybridisierungsverfahren ist ein Verfahren zur Unterscheidung von Nucleinsäuren der Erfindung von nicht verwandten Nucleinsäuren. Zusätzlich dazu sind Target-Nucleinsäuren, die an eine Nucleinsäure hybridisieren, die von jenen der Sequenzprotokolle unter Bedingungen hoher, sehr hoher und sehr sehr hoher Stringenz repräsentiert wird, ein Merkmal der Erfindung. Beispiele solcher Nucleinsäuren umfassen jene mit einer oder einigen stillen oder konservativen Nucleinsäuresubstitutionen im Vergleich zu einer bestimmten Nucleinsäuresequenz.
  • Von einer Test-Nucleinsäure wird angenommen, dass sie spezifisch an eine Sonden-Nucleinsäure hybridisiert, wenn sie zumindest ½ so gut an die Sonde hybridisiert wie an das perfekt übereingestimmte komplementäre Target, d. h. mit einem Signal-Rausch-Verhältnis, das zumindest ½ so hoch ist wie die Hybridisierung der Sonde an das Target unter Bedingungen, unter denen sich die perfekt übereingestimmte Sonde an das perfekt übereingestimmte komplementäre Target mit einem Signal-Rausch-Verhältnis bindet, das zumindest 5× bis 10× so groß ist wie jenes, das bei der Hybridisierung an beliebige der nicht übereingestimmten Target-Nucleinsäuren beobachtet wurde.
  • Nucleinsäuren „hybridisieren", wenn sie sich, typischerweise in Lösung, assoziieren. Nucleinsäuren hybridisieren aufgrund einer Reihe gut beschriebener physikochemischer Kräfte, wie z. B. Wasserstoffbrückenbindungen, Lösungsmittelausschluss, Basenstapelung und dergleichen. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nucleinsäuren ist in Tijssen, Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York (1993), sowie in Ausubel, s. o., zu finden. Hames und Higgins, Gene Probes 1, IRL Press, Oxford University Press, Oxford, England (1995) (Hames und Higgins 1), und Hames und Higgins, Gene Probes 2, IRL Press, Oxford University Press, Oxford, England (1995) (Hames and Higgins 2), stellen ausführliche Informationen über die Synthese, Markierung, Detektion und Quantifizierung von DNA und RNA, die Oligonucleotide umfassen, bereit.
  • Ein Beispiel stringenter Hybridisierungsbedingungen zur Hybridisierung komplementärer Nucleinsäuren, die mehr als 100 komplementäre Reste aufweisen, auf einem Filter in einem Southern- oder Northern-Blot ist 50% Formalin mit 1 mg Heparin bei 42°C, wobei die Hybridisierung über Nacht durchgeführt wird. Ein Beispiel stringenter Waschbedingungen ist ein 0,2-×-SSC-Waschschritt bei 65°C für eine Zeitspanne von 15 Minuten (siehe Sambrook, s. o., für eine Beschreibung des SSC-Puffers). Oftmals geht dem Waschschritt hoher Stringenz ein Waschschritt niedriger Stringenz voraus, um das Hintergrund-Sondensignal zu entfernen. Ein Beispiel eines Waschschritts geringer Stringenz ist 2 × SSC bei 40°C für eine eine Zeitspanne von 15 Minuten. Allgemein zeigt ein Signal-Rausch-Verhältnis von 5× (oder mehr) jenes, das bei einer nicht verwandten Sonde in dem bestimmten Hybridisierungstest beobachtet wird, die Detektion einer spezifischen Hybridisierung.
  • „Stringente Hybridisierungs-Waschbedingungen" im Kontext von Nucleinsäure-Hybridisierungsexperimenten, wie z. B. Southern- und Northern-Hybridisierungen, sind sequenzabhängig und unterschiedlich bei verschiedenen Umgebungsparametern. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nucleinsäuren ist in Tijssen, s. o. (1993), und in Hames und Higgins, 1 und 2, zu finden. Stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen können für eine beliebige Test-Nucleinsäure leicht empirisch bestimmt werden. Bei der Bestimmung stringenter Hybridisierungs- und Waschbedingungen z. B. werden die Hybridisierungs- und Waschbedingungen allmählich erhöht (z. B. durch Erhöhung der Temperatur, Verringerung der Salzkonzentration, Erhöhung der Detergenskonzentration und/oder Erhöhung der Konzentration organischer Lösungsmittel, wie z. B. Formalin, bei der Hybridisierung oder beim Waschen), bis einer ausgewählten Gruppe von Kriterien entsprochen wird. Bei hochgradig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen werden die Hybridisierungs- und Waschbedingungen allmählich erhöht, bis eine Sonde an ein perfekt übereingestimmtes komplementäres Target mit einem Signal-Rausch-Verhältnis bindet, das zumindest 5× so hoch ist wie jenes, das bei der Hybridisierung der Sonde an ein ungebundenes Target beobachtet wurde.
  • „Sehr stark stringente" Bedingungen werden beim thermischen Schmelzpunkt (Tm) einer bestimmten Sonde liegend ausgewählt. Die Tm ist jene Temperatur (bei definierter Ionenstärke und pH), bei der 50% der Testsequenz an eine perfekt übereingestimmte Sonde hybridisieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden allgemein „hochgradig stringente" Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit einer etwa 5°C niedrigeren Temperatur als die Tm der jeweiligen Sequenz bei definierter Ionenstärke und pH ausgewählt.
  • Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit „äußerst hoher Stringenz" sind jene, bei denen die Stringenz der Hybridisierungs- und Waschbedingungen erhöht wird, bis das Signal-Rausch-Verhältnis zur Bindung der Sonde an die perfekt übereingestimmte komplementäre Target-Nucleinsäure zumindest 10× so hoch ist, wie jenes, das für die Hybridisierung einer beliebigen der nicht übereingestimmten Target-Nucleinsäuren beobachtet wurde. Von einer Target-Nucleinsäure, die unter solchen Bedingungen mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von zumindest ½ jenes der perfekt übereingestimmten komplementären Target-Nucleinsäure an eine Sonde hybridisiert, wird gesagt, sie würde unter Bedingungen äußerst hoher Stringenz an die Sonde binden.
  • Auf ähnliche Art und Weise können sogar noch höhere Stringenzausmaße durch allmähliches Erhöhen der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen des relevanten Hybridisierungstests bestimmt werden. Jene, bei denen z. B. die Stringenz der Hybridisierungs- und Waschbedingungen erhöht wird, bis das Signal-Rausch-Verhältnis zur Bindung der Sonde an die perfekt überengestimmte komplementäre Target-Nucleinsäure zumindest 10×, 20×, 50×, 100× oder 500× (oder noch höher) jenen Wert beträgt, der bei der Hybridisierung beliebiger der nichtübereingestimmten Target-Nucleinsäuren beobachtet wird. Von einer Target-Nucleinsäure, die unter solchen Bedingungen mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von zumindest ½ jenes der perfekt übereingestimmten komplementären Target-Nucleinsäure an eine Sonde hybridisiert, wird angenommen, dass sie unter Bedingungen extrem hoher Stringenz an die Sonde bindet.
  • Nucleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht aneinander hybridisieren, sind trotzdem im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, für die sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies tritt z. B. auf, wenn eine Kopie einer Nucleinsäure unter Verwendung der maximalen, vom genetischen Code zugelassenen Codon-Degeneration erzeugt wird.
  • Einzigartige Subsequenzen
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die eine einzigartige Subsequenz in einer Nucleinsäure umfasst, die aus den Sequenzen der hierin offenbarten O-tRNAs und O-RSs ausgewählt wurde. Die einzigartige Subsequenz ist einzigartig im Vergleich zu einer Nucleinsäure, die einer etwaigen, bereits bekannten tRNA- oder RS-Nucleinsäuresequenz entspricht. Es kann z. B. unter Verwendung von BLAST, eingestellt auf Standardparameter, ein Abgleich durchgeführt werden. Eine beliebige einzigartige Subsequenz ist z. B. als Sonde nützlich, um die Nucleinsäuren der Erfindung zu identifizieren.
  • Auf ähliche Art und Weise umfasst die Erfindung ein Polypeptid, das eine einzigartige Subsequenz in einem Polypeptid umfasst, das aus den Sequenzen der hierin offenbarten O-RSs ausgewählt wird. Hier ist die einzigartige Subsequenz einzigartig im Vergleich zu einem Polypeptid, das einer beliebigen einer zuvor bekannten RS-Sequenz entspricht.
  • Die Erfindung stellt auch Target-Nucleinsäuren bereit, die unter stringenten Bedingungen an ein einzigartiges kodierendes Oligonucleotid hybridisieren, das für eine einzigartige Subsequenz in einem Polypeptid kodiert, das aus den Sequenzen von O-RSs ausgewählt wurde, worin die einzigartige Subsequenz einzigartig im Vergleich zu einem Polypeptid ist, das einem beliebigen der Kontroll-Polypeptide entspricht (z. B. parentale Sequenzen, von denen Synthetasen der Erfindung stammen, z. B. durch Mutation). Einzigartige Sequenzen werden bestimmt, wie oben angeführt wurde.
  • Sequenzvergleich, -identiät und -homologie
  • Die Ausdrücke „identisch” oder prozentuelle „Identität" beziehen sich im Kontext von zwei oder mehr Nucleinsäure- oder Polypeptidsequenzen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Subsequenzen, die bei Vergleich und Anordnung zur maximalen Übereinstimmung dieselben sind oder einen spezifizierten Prozentsatz an Aminosäureres ten oder Nucleotiden aufweisen, die dieselben sind, wie unter Verwendung eines der unten beschriebenen Sequenzvergleichsalgorithmen (oder anderer, dem Fachmann zugänglicher Algorithmen) oder durch visuelle Inspektion gemessen wurde.
  • Der Ausdruck „im Wesentlichen identisch" bezieht sich im Kontext von zwei Nucleinsäuren oder Polypeptiden (z. B. DNAs, die für eine O-tRNA oder O-RS kodieren, oder die Aminosäuresequenz einer O-RS) auf zwei oder mehr Sequenzen oder Subsequenzen, die bei Vergleich und Anordnung zur maximalen Übereinstimmung zumindest ewa 60%, etwa 80%, etwa 90–95%, etwa 98%, etwa 99% oder mehr Nucleotid- oder Aminosäurerest-Identität aufweisen, wie unter Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus oder durch visuelle Inspektion gemessen wurde. Solche „im Wesentlichen identischen" Sequenzen werden typischerweise als „homolog" betrachtet, ohne Verweis auf tatsächliche Vorgänger. Die „im Wesentlichen bestehende Identität" liegt vorzugsweise über eine Region der Sequenzen hinweg vor, die zumindest etwa 50 Reste lang ist, noch bevorzugter über eine Region mit zumindest etwa 100 Resten, und insbesondere sind die Sequenzen über zumindest etwa 150 Reste oder über die volle Länge der zwei zu vergleichenden Sequenzen im Wesentlichen identisch.
  • Proteine und/oder Proteinsequenzen sind „homolog", wenn sie, natürlich oder künstlich, von einem/einer gemeinsamen Vorgängerprotein oder -Proteinsequenz herrühren. Auf ähliche Art und Weise sind Nucleinsäuren und/oder Nucleinsäuresequenzen homolog, wenn sie, natürlich oder künstlich, von einer gemeinsamen Vorgängernucleinsäure oder -nucleinsäuresequenz herrühren. Jede natürlich auftretende Nucleinsäure kann z. B. durch ein beliebiges vorhandenes Mutageneseverfahren modifiziert werden, um ein oder mehr Selektorcodon(s) zu inkludieren. Bei Expression kodiert diese mutagenisierte Nucleinsäure für ein Polypeptid, das ein oder mehrere Homoglutamin(e), z. B. eine unnatürliche Aminosäure, umfasst. Der Mutationsprozess kann natürlich zusätzlich ein oder mehrere Standardcodons verändern, wodurch auch eine oder mehrere Standard-Aminosäuren im resultierenden mutierten Protein verändert werden. Homologie wird allgemein von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Proteinen (oder Sequenzen davon) abge leitet. Der genaue Prozentsatz der Ähnlichkeit zwischen Sequenzen, der bei der Festlegung der Homologie von Nutzen ist, variiert mit der jeweiligen Nucleinsäure und dem jeweiligen Protein, es wird jedoch die geringe Sequenzähnlichkeit von 25% routinemäßig zur Festlegung der Homologie verwendet. Höhere Ausmaße an Sequenzähnlichkeit, z. B. 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 99% oder mehr, können ebenefalls zur Bestimmung der Homologie verwendet werden. Verfahren zur Bestimmung der Prozentsätze der Sequenzähnlichkeit (z. B. BLASTP und BLASTN unter Verwendung von Standardparametern) werden hierin beschrieben und sind allgemein verfügbar.
  • Für den Sequenzvergleich und die Homologiebestimmung fungiert typischerweise eine Sequenz als Bezugssequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Bezugssequenzen in einen Computer eingegeben, Subsequenzkoordinaten werden bezeichnet, und, falls erforderlich, werden Sequenzalgorithmus-Programmparameter bezeichnet. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet anschließend den Prozentsatz der Sequenzidentität für die Testsequenz(en) im Verhältnis zur Bezugssequenz, basierend auf den bezeichneten Programmparametern.
  • Die optimale Anordnung von Sequenzen zum Vergleich kann z. B. durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), durch den Homologie-Anordnungsalgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), durch das Ähnlichkeitssuchverfahren von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988), durch computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA im Wisconsin-Genetics-Software-Packet, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch visuelle Inspektion (allgemein siehe Ausubel et al., siehe unten) durchgeführt werden.
  • Ein Beispiel eines Algorithmus, der zur Bestimmung des Prozentsatzes der Sequenzidentität und der Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990), beschrieben wird. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist beim National Center for Biotechnology Information öffentlich erhältich (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus umfasst zuerst das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hohem Score (HSPs) durch Identifikation kurzer Worte der Länge W in der Abfragesequenz, die bei Anordnung mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz entweder mit manchen positiv bewerteten Schwellen-Scores T übereinstimmen oder deren Kriterien gerecht werden. T wird dabei als die Nachbarschaftswort-Score-Schwelle bezeichnet (Altschul et al., s. o.). Diese anfänglichen Nachbarschaftswort-Hits dienen als Seeds für initiierende Suchen, um längere HSPs zu finden, die diese enthalten. Die Wort-Hits werden anschließend in beide Richtungen entlang jeder Sequenz erweitert, soweit der kumulative Anordnungsscore erhöht werden kann. Kumulative Scores werden bei Nucleotidsequenzen unter Verwendung der Parameter M (Reward-Score für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Penalty-Score für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) berechnet. Bei Aminosäuresequenzen wird eine Scoring-Matrix verwendet, um den kumulativen Score zu berechnen. Die Erweiterung der Wort-Hits in jede Richtung wird in folgenden Fällen angehalten: wenn der kumulative Anordnungsscore einen Abfall um die Menge X vom maximalen erreichten Wert aufweist; wenn der kumulative Score aufgrund der Akkumulierung einer oder mehrerer Rest-Anordnungen mit negativem Score auf Null oder darunter absinkt; oder wenn das Ende einer der beiden Sequenzen erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Anordnung. Das BLASTN-Programm (für Nucleotidsequenzen) verwendet eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Cutoff von 100, M = 5, N = 4, sowie einen Vergleich beider Stränge als Standardwerte. Bei Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Scoring-Matrix als Standardwerte (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).
  • Zusätzlich zur Berechnung des Prozentsatzes der Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90, 5873–5787 (1993)). Ein Maßstab der Ähnlichkeit, der vom BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe (P(N)), die einen Indikator der Wahrscheinlichkeit darstellt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig aufteten würde. Eine Nucleinsäure wird z. B. dann als zu einer Bezugssequenz ähnlich angesehen, wenn die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe in einem Vergleich der Test-Nucleinsäure mit der Bezugsnucleinsäure weniger als etwa 0,1, noch bevorzugter weniger als 0,01 und insbesondere weniger als etwa 0,001 beträgt.
  • Mutagenese und andere molekularbiologische Verfahren
  • Polynucleotide und Polypeptide der Erfindung sowie jene, die in der Erfindung verwendet werden, können unter Anwendung molekularbiologischer Verfahren manipuliert werden. Allgemeine Texte, die molekularbiologische Verfahren beschreiben, umfassen Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laborstory Manual, 3. Auflage, Band 1–3, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York (2001) („Sambrook") und Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols, einer Arbeitsgemeinschaft zwischen Greene Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc. (ergänzt im Lauf des Jahres 2003) („Ausubel")). Diese Texte beschreiben die Mutagenese, die Verwendung von Vektoren, Promotoren und viele andere relevante Themen, die z. B. mit der Erzeugung von Genen verwandt sind, die Selektorcodons zur Produktion von Proteinen umfassen, die Homolgutamine, orthogonale tRNAs, orthogonale Synthetasen und Paare davon inkludieren.
  • Verschiedene Typen der Mutagenese werden in der Erfindung verwendet, z. B. um tRNA-Moleküle zu mutieren, um Bibliotheken von tRNAs zu produzieren, um Bibliotheken von Synthetasen zu produzieren, um Selektorcodons zu insertieren, die für ein Homoglutamin in einem Protein oder einem Polypeptid von Interesse kodieren. Sie umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die ortsspezifische, die Zufalls-Punktmutagenese, die homologe Rekombination, das DNA-Shuffling oder andere rekursive Mutageneseverfahren, die Chimärenkonstruktion, die Mutagenese unter Verwen dung von Uracil-hältigen Matrizen, die oligonucleotidgerichtete Mutgenese, die thiophosphatmodifizierte Mutagenese, die Mutagenese unter Verwendung von Duplex-DNA mit Lücken oder dergleichen, oder eine beliebige Kombination davon. Zusätzliche geeignete Verfahren umfassen die Punkt-Fehlpaarungsreparatur, die Mutagenese unter Verwendung reparaturdefizienter Wirtsstämme, die Restriktionsselektion und die Restriktionsreinigung, die Deletionsmutagenese, die Mutagenese durch die vollständige Gen-Synthese, die Doppelstrangbruchreparatur und dergleichen. Die Mutagenese, z. B. unter Miteinbeziehung chimärer Konstrukte, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform kann die Mutagenese von bekannten Informationen des natürlich auftretenden Moleküls oder des veränderten oder mutierten natürlich auftretenden Moleküls geleitet werden, z. B. von der Sequenz, von Sequenzvergleichen, physischen Eigenschaften, der Kristallstruktur oder dergleichen.
  • Wirtszellen werden mit den Polynucleotiden der Erfindung oder Konstrukten, die ein Polynucleotid der Erfindung inkludieren, z. B. einem Vektor der Erfindung, der z. B. ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein kann, gentechnisch verändert (z. B. transformiert, transduziert oder transfiziert). Die kodierenden Regionen für die orthogonale tRNA, die orthogonale tRNA-Synthetase und das zu derivatisierende Protein sind z. B. operabel an Genexpressions-Kontrollelemente gebunden, die in der gewünschten Wirtszelle funktionieren. Typische Vektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Transkriptions- und Translationsinhibierungssequenzen und Promotoren, die zur Regulierung der Expression der bestimmten Target-Nucleinsäure von Nutzen sind. Die Vektoren umfassen gegebenenfalls allgemeine Expressionskassetten, die zumindest eine unabhängige Terminatorsequenz, Sequenzen, welche die Replikation der Kassette in Eukaryoten oder Prokaryoten oder beiden ermöglichen (z. B. Shuttle-Vektoren), sowie Selektionsmarker sowohl für prokaryotische als auch für eukaryotische Systeme enthalten. Vektoren sind zur Replikation und/oder Integration in Prokaryoten, Eukaryoten oder vorzugsweise beiden geeignet. Siehe Giliman & Smith, Gene 8, 81 (1979); Roberts et al., Nature 328, 731 (1987); B. Schneider et al., Protein Expr. Purif. 6435, 10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (siehe alle oben stehenden). Der Vektor kann z. B. die Form eines Plasmids, eines Bakteriums, eines Virus, eines nackten Polynucleotids oder eines konjugierten Polynucleotids aufweisen. Die Vektoren werden mittels Standardverfahren, unter anderem durch Elektroporation (From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), durch Infektion mittels viraler Vektoren, mittels ballistischer Hochgeschwindigkeitspenetration mit Kleinpartikeln mit der Nucleinsäure entweder innerhalb der Matrix kleiner Perlen oder Partikel oder auf der Oberfläche, und/oder dergleichen in Zellen und/oder Mikroorganismen eingeführt (Klein et al., Nature 327, 70–73 (1987)).
  • Ein Katalog von Bakterien und Bakteriophagen, die zum Klonieren nützlich sind, wird z. B. von der ATCC bereitgestellt, z. B. The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage, Gherna et al. (Hrsg.) (1996), veröffentlicht von der ATCC. Zusätzliche grundlegende Verfahren zur Sequenzierung, Klonierung, sowie andere Aspekte der Molekularbiologie und zugrunde liegende theoretische Überlegungen sind auch bei Sambrook (s. o.), Ausubel (s. o.) und Watson et al., Recombinant DNA, 2. Aufl., Scientific American Books, NY (1992), zu finden. Zusätzlich dazu kann im Wesentlichen jede Nucleinsäure(und nahezu jede markierte Nucleinsäure, unabhängig davon, ob Standard- oder Nicht-Standard-)bedarfsspezifisch oder standardgemäß bei einer Reihe kommerzieller Quellen bestellt werden, wie etwa bei der Midland Certified Reagent Company (Midland, TX, mcrc.com), bei The Great American Gene Company (Ramona, CA, erhältlich im Internet unter genco.com), bei ExpressGen Inc. (Chicago, IL, zugänglich im Internet unter expressgen.com), bei Operon Technologies Inc. (Alameda, CA), und vielen anderen.
  • Die gentechnisch veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährstoffmedien gezüchtet werden, die je nach Eignung für Aktivitäten wie etwa Screening-Schritte, Aktivierung von Promotoren oder Selektion von Transformanten modifiziert wurden. Diese Zellen können gegebenenfalls zu transgenen Organismen gezüchtet werden. Andere nützliche Verweise, z. B. zum Isolieren und Züchten von Zellen (z. B. zur darauf folgenden Nucleinsäureisolierung) umfassen Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 3. Auflage, Wiley-Liss, New York (1994), sowie die darin zitierten Verweise; Payne et al., Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1992); Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Gamborg und Phillips (Hrsg.) (1995); Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York), sowie The Handbook of Mircrobiological Media, Atlas und Parks (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, FL (1993).
  • Proteine und Polypeptide von Interesse
  • Proteine und Polypeptide von Interesse, z. B. mit zumindest einem Homoglutamin, sind ein Merkmal der Erfindung, sowie auch Polypeptide, die zwei oder mehr unterschiedliche unnatürliche Aminosäuren umfassen. Ein Exzipient (z. B. ein pharmazeutisch annehmbarer Exzipient) kann auch zusammen mit dem Protein vorliegen. Gegebenenfalls umfasst ein Protein der Erfindung eine posttranslationale Modifikation.
  • Verfahren zur Produktion eines Proteins in einer Zelle mit einem Homoglutamin oder einer anderen unnatürlichen Aminosäure an einer spezifizierten Position sind ebenfalls ein Merkmal der Erfindung. Ein Verfahren umfasst z. B. das Züchten der Zelle in einem geeigneten Medium, wobei die Zelle eine Nucleinsäure umfasst, die zumindest ein Selektorcodon umfasst und für ein Protein kodiert; sowie das Bereitstellen des Homoglutamins oder der anderen unnatürlichen Aminosäure; wobei die Zelle weiters Folgendes umfasst: eine orthogonale tRNA (O-tRNA), die in der Zelle funktioniert und das Selektorcodon erkennt; sowie eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise die O-tRNA mit dem Homoglutamin oder der anderen unatürlichen Aminosäure aminoacyliert. In gewissen Ausführungsformen umfasst die O-tRNA z. B. zumindest etwa 45%, 50%, 60%, 75%, 80% oder 90% oder eine noch höhere Suppressionswirksamkeit in der Gegenwart einer zugehörigen Synthetase als Reaktion auf das Selektorcodon im Vergleich zu der O-tRNA, die eine Polynucleotidsequenz umfasst oder von dieser kodiert wird, wie sie im Sequenzprotokoll und den Beispielen dargelegt ist. Ein durch dieses Verfahren produziertes Protein ist ebenfalls ein Merkmal der Erfindung.
  • Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die Proteine umfassen, wobei die Proteine ein Homoglutamin umfassen. In gewissen Ausführungsformen umfasst das Protein eine Aminosäuresequenz, die zumindest zu 75% identisch mit jener eines Target-Proteins ist, wie z. B. eines therapeutischen Proteins, eines diagnostischen Proteins, eines industriellen Enzyms oder eines Abschnitts davon, wobei es sich vom Target-Protein durch Einführung einer oder mehrerer unnatürlicher Aminosäuren, wie z. B. Homoglutamin, unterscheidet.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung sowie Zusammensetzungen, die durch Verfahren der Erfindung hergestellt werden, sind gegebenenfalls in einer Zelle vorhanden. Die O-tRNA/O-RS-Paare oder einzelne Komponenten der Erfindung können anschließend in einem Translationsmechanismus eines Wirtssystems verwendet werden, was zum Einbau eines Homoglutamins in ein Protein führt. Die Internationale Anmeldung mit der Nr. PCT/US2004/011786, eingereicht am 16. April 2004, mit dem Titel „Expanding the Eukaryotic Genetic Code", sowie WO 2002/085923 mit dem Titel „In vivo Incorporation of unnatural amino acids" beschreiben dieses Verfahren. Wird z. B. ein O-tRNA/O-RS-Paar in einen Wirt eingeführt, z. B. in Escherichia coli, so führt das Paar zum In-vivo-Einbau von Homoglutamin, z. B. einer synthetischen Aminosäure, wie z. B. ein Derivat einer Tyrosin- oder Phenylalanin-Aminosäure, die exogen zum Wachstumsmedium hinzugefügt werden kann, in ein Protein als Reaktion auf ein Selektorcodon. Gegebenenfalls können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einem In-vitro-Translationssystem oder in einem In-vivo-Translationssystem vorliegen.
  • Eine Zelle der Erfindung weist die Fähigkeit auf, Proteine zu synthetisieren, die unnatürliche Aminosäuren in großen, nützlichen Mengen umfassen. In einem Aspekt umfasst die Zusammensetzung gegebenenfalls z. B. zumindest 10 Mikrogramm, zumindest 50 Mikrogramm, zumindest 75 Mikrogramm, zumindest 100 Mikrogramm, zumindest 200 Mikrogramm, zumindest 250 Mikrogramm, zumindest 500 Mikrogramm, zumindest 1 Milligramm, zumindest 10 Milligramm oder mehr des Proteins, das ein Homoglutamin oder mehrere unnatürliche Aminosäuren umfasst, oder eine Menge, die mit In-vivo-Protein-Produktionsverfahren erreicht werden kann (Details bezüglich der rekombinanten Proteinproduktion und -reinigung werden hierin bereitgestellt). In einem anderen Aspekt ist das Protein gegebenenfalls in der Zusammensetzung in einer Konzentration von z. B. zumindest 10 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 50 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 75 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 100 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 200 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 250 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 500 Mikrogramm Protein pro Liter, zumindest 1 Milligramm Protein pro Liter oder zumindest 10 Milligramm Protein pro Liter oder mehr vorhanden, und zwar z. B. in einem Zelllysat, einem Puffer, einem pharmazeutischen Puffer oder einer anderen flüssigen Suspension (z. B. in einer beliebigen Menge von z. B. etwa 1 nl bis etwa 100 l). Die Produktion großer Mengen (mehr als mit anderen Verfahren, z. B. In-vitro-Translation, typischerweise möglich) eines Proteins in einer Zelle, die zumindest ein Homoglutamin umfasst, ist ein Merkmal der Erfindung.
  • Der Einbau eines Homoglutamins oder anderer unnatürlicher Aminosäuren kann z. B. durchgeführt werden, um Veränderungen der Proteinstruktur und/oder -funktion maßzuschneidern, z. B. um die Größe, Azidität, Nucleophilie, Wasserstoffbrückenbindung, Hydrophobie, die Zugänglichkeit von Protease-Target-Stellen zu verändern, um auf eine Gruppierung abzuzielen (z. B. für eine Proteinanordnung) etc. Proteine, die ein Homoglutamin umfassen, können verstärkte oder sogar vollkommen neue katalytische oder physische Eigenschaften aufweisen. Es werden z. B. die folgenden Eigenschaften gegebenenfalls durch Einbau eines Homoglutamins oder einer anderen unnatürlichen Aminosäure in ein Protein modifiziert: Toxizität, Bioverteilung, strukturelle Eigenschaften, spektroskopische Eigenschaften, chemische und/oder photochemische Eigenschaften, die Katalysefähigkeit, die Halbwertszeit (z. B. die Serum-Halbwertszeit), die Fähigkeit, mit anderen Molekülen zu reagieren, z. B. kovalent oder nichtkovalent, und dergleichen. Zusammensetzungen, die Proteine umfassen, die zumindest ein Homoglutamin umfassen, sind z. B. für neue Therapeutika, Diagnostika, katalytische Enzmye, industrielle Enzyme, Bindungsproteine (z. B. Antikörper) und z. B. die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion, von Nutzen. Siehe z. B. Dougherty, Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology 4, 645–652 (2000). Zusätzlich dazu können eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren in ein Polypeptid eingebaut werden, um eine molekulare Markierung bereitzustellen, z. B. um das Polypeptid an einen festen Träger zu fixieren. Siehe z. B. „Protein Arrays" von Wang und Schultz, eingereicht am 22.
  • Dezember 2003, Attorney Docket Number 54-000810PC, für eine ausführliche Beschreibung der Verfahren zur Herstellung von Anordnungen unter Verwendung von Polypeptiden, die unnatürliche Aminosäuren umfassen.
  • In einem Aspekt der Erfindung umfasst eine Zusammensetzung zumindest ein Protein mit zumindest einer, z. B. zumindest zwei, zumindest drei, zumindest vier, zumindest fünf, zumindest sechs, zumindest sieben, zumindest acht, zumindest neun oder zumindest zehn oder mehr unnatürlichen Aminosäuren, z. B. Homoglutaminen und/oder anderen unnatürlichen Aminosäuren. Die unnatürlichen Aminosäuren können dieselben oder unterschiedlich sein, es kann z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder mehr unterschiedliche Stellen im Protein geben, die 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder mehr unterschiedliche unnatürliche Aminosäuren umfassen. In einem anderen Aspekt umfasst eine Zusammensetzung ein Protein mit zumindest einer, jedoch weniger als der Gesamtanzahl, einer bestimmten Aminosäure, die in dem Protein vorhanden ist, das mit dem Homoglutamin substituiert ist. Für ein bestimmtes Protein mit mehr als einer unnatürlichen Aminosäure können die unnatürlichen Aminosäuren identisch oder unterschiedlich sein (z. B. kann das Protein zwei oder mehr unterschiedliche Typen unnatürlicher Aminosäuren umfassen, oder es kann zwei derselben unnatürlichen Aminosäure umfassen). Für ein bestimmtes Protein mit mehr als zwei unnatürlichen Aminosäuren können die unnatürlichen Aminosäuren dieselben, unterschiedlich oder eine Kombination mehrerer unnatürlicher Aminosäuren derselben Art mit zumindest einer unterschiedlichen Aminosäure sein.
  • Im Wesentlichen kann ein beliebiges Protein (oder Teil davon), das eine unnatürliche Aminosäure, wie z. B. ein Homoglutamin, umfasst, oder das für mehrere unterschiedliche unnatürliche Aminosäuren kodiert (und eine beliebige entsprechende kodierende Nucleinsäure, die z. B. ein oder mehrere Selektorcodons umfasst), unter Verwendung der hierin enthaltenen Zusammensetzungen und Verfahren produziert werden. Es wird kein Versuch unternommen, die hunderttausenden bekannten Proteine zu identifizieren, von denen jedes modifiziert werden kann, um eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren zu inkludieren, z. B. durch Maßschneidern beliebiger verfügbarer Mutationsverfahren, um ein oder mehrere geeignete Selektorcodons in einem re levanten Translationssystem zu umfassen. Häufige Sequenzhinterlegungsstellen für bekannte Proteine umfassen GenBank EMBL, DDBJ und NCBI. Andere Hinterlegungsstellen können durch Durchsuchen des Internets leicht identifiziert werden.
  • Typischerweise sind die Proteine z. B. zumindest zu 60%, zumindest zu 70%, zumindest zu 75%, zumindest zu 80%, zumindest zu 90%, zumindest zu 95% oder zumindest zu 99% oder mehr identisch mit einem beliebigen verfügbaren Protein (z. B. einem therapeutischen Protein, einem diagnostischen Protein, einem industriellen Enzym oder einem Abschnitt davon oder dergleichen), und sie umfassen eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren. Beispiele therapeutischer, diagnostischer und anderer Proteine, die modifiziert werden können, um ein oder mehrere Homoglutamine zu umfassen, sind, wenn auch nicht eingeschränkt auf, jene, die in der Internationalen Anmeldung mit der Nr. PCT/US 2004/011786, eingereicht am 16. April 2004, mit dem Titel „Expanding the Eucaryotic Genetic Code" sowie in WO 2002/085923 mit dem Titel „In vivo incorporation of unnatural amino acids" zu finden sind. Beispiele therapeutischer, diagnostischer und anderer Proteine, die modifiziert werden können, um ein oder mehrere Homoglutamine zu umfassen, umfassen z. B., sind jedoch nicht eingeschränkt auf, α-1-Antitrypsin, Angiostatin, den Antihämolytischen Faktor, Antikörper (weitere Details bezüglich Antikörper sind nachstehend zu finden), Apolipoprotein, Apoprotein, den atrialen natriuretischen Faktor, das atriale natriuretische Polypeptid, atriale Peptide, C-X-C-Chemokine (z. B. T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), Calcitonin, CC-Chemokine (z. B. das chemische Monozyten-Lockstoff-Protein-1, das chemische Monozyten-Lockstoff-Protein-2, das chemische Monozyten-Lockstoff-Protein-3, das Monozyten-Entzündungsprotein-1α, das Monozyten-Entzündungsprotein-1β, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), CD40-Ligand, C-Set-Ligand, Collagen, den das Koloniewachstum stimulierenden Faktor (CSF), den Komplementfaktor 5a, den Komplementinhibitor, den Komplementrezeptor 1, Zytokine (z. B. das Epithel-Neutrophilen-aktivierende Peptid 78, GROα/MGSA, GROB, GROγ, MIP-1α, MIP-1δ, MCP-1), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Erythropoetin („EPO"), exfoliative Toxine A und B, Faktor IX, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor X, den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Fibrinogen, Fibronectin, G-CSF, GMCSF, Glucozerebrosidase, Gonadotropin, Wachstumsfaktoren, Hedgehog-Proteine (Sonic-, Indian-, Desert-), Hämoglobin, den Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Hirudin, menschliches Serumalbumin, Insulin, den insulinartigen Wachstumsfaktor (IGF), Interferone (z. B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ), Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 etc.), den Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF), Lactoferrin, den leukämieinhibierenden Faktor, Luciferase, Neurturin, den Neutrophile inhibierenden Faktor (NIF), Oncostatin M, das osteogene Protein, das Nebenschilddrüsenhormon, PD-ECSF, PDGF, Peptidhormone (z. B. das menschliche Wachstumshormon), Pleiotropin, Protein A, Protein G, pyrogene Exotoxine A, B und C, Relaxin, Renin, SCF, den löslichen Komplementrezeptor I, lösliches I-CAM 1, lösliche Interleukin-Rezeptoren (IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15), den löslichen TNF-Rezeptor, Somatomedin, Somatostatin, Somatotropin, Streptokinase, Superantigene, d. h., Staphylokokken-Enterotoxine (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), Superoxiddismutase (SOD), das Toxin des Toxischen Schocksyndroms (ISST-1), Thymosin-α-1, den Gewebe-Plasminogenaktivator, den Tumornekrosefaktor-β (TNF-β), den Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR), den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), den vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGEF), Urokinase, sowie viele andere.
  • Eine Proteinklasse, die unter Verwendung der Zusammensetzungen und Verfahren zum In-vivo-Einbau von hierin beschriebenen Homoglutaminen hergestellt werden kann, umfasst Transkriptionsmodulatoren oder einen Teil davon. Beispiele von Transkriptionsmodulatoren umfassen Gene und Transkriptionsmodulator-Proteine, die Zellwachstum, -differenzierung, -regulierung oder dergleichen modulieren. Transkriptionsmodulatoren sind in Prokaryoten, Viren und Eukaryoten zu finden, unter anderem in Pilzen, Pflanzen, Hefearten, Insekten, sowie in Tieren, unter anderem in Säugetieren, wodurch eine große Bandbreite therapeutischer Ziele bereitgestellt wird. Es versteht sich dabei, dass Expressions- und Transkriptionsaktivatoren die Transkription durch zahlreiche Mechanismen regulieren, z. B. durch Bindung an Rezeptoren, Stimulierung einer Signalübertragungskaskade, Regulierung der Expres sion von Transkriptionsfaktoren, Bindung an Promotoren und Enhancer, Bindung an Proteine, die an Promotoren und Enhancer binden, Entwinden von DNA, Spleißen von Prä-mRNA, Polyadenylierung von RNA und Abbau von RNA.
  • Eine Proteinklasse der Erfindung (z. B. Proteine mit einem oder mehreren Homoglutaminen) umfasst Expressionsaktivatoren, wie z. B. Zytokine, Entzündungsmoleküle, Wachstumsfaktoren, ihre Rezeptoren, sowie onkogene Produkte, z. B. Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-8 etc.), Interferone, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-α, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Set, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1 und Hyalurin/CD44; Signalübertragungsmoleküle und entsprechende onkogene Produkte, z. B. Mos, Ras, Raf und Met; sowie Transkriptionsaktivatoren und -suppressoren, z. B. p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel und Steroidhormonrezeptoren, wie z. B. jene für Östrogen, Progesteron, Testosteron, Aldosteron, den LDL-Rezeptor-Liganden und Corticosteron.
  • Enzyme (z. B. industrielle Enzyme) oder Abschnitte davon mit zumindest einem Homoglutamin werden ebenfalls in der Erfindung bereitgestellt. Beispiele von Enzymen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf beispielsweise Amidasen, Aminosäure-Racemasen, Acylasen, Dehalogenasen, Dioxygenasen, Diarylpropanperoxidasen, Epimerasen, Epoxidhydrolasen, Esterasen, Isomerasen, Kinasen, Glucoseisomerasen, Glycosidasen, Glycosyltransferasen, Haloperoxidasen, Monooxygenasen (z. B. p450s), Lipasen, Ligninperoxidasen, Nitrilhydratasen, Nitrilasen, Proteasen, Phosphatasen, Subtilisine, Transaminase und Nucleasen.
  • Viele dieser Proteine sind im Handel erhältlich (siehe z. B. den Sigma-BioSciences Katalog des Jahres 2003 und die Preisliste), und die entsprechenden Proteinsequenzen und Gene, sowie typischerweise viele Varianten davon, sind wohlbekannt (siehe z. B. GenBank). Jedes davon kann durch die Insertion von einem oder mehreren Homoglutaminen oder anderen unnatürlichen Aminosäuren der Erfindung gemäß modifiziert werden, z. B. um das Protein hinsichtlich einer oder mehrerer therapeutischer, diagnostischer oder enzymatischer Eigenschaften von Interesse zu verändern. Bei spiele therapeutisch relevanter Eigenschaften umfassen die Serum-Halbwertszeit, die Lagerhalbwertszeit, die Stabilität, die Immunogenität, die therapeutische Aktivität, die Detektierbarkeit (z. B. durch den Einschluss von Reportergruppen (z. B. Markierungen oder Markierungsbindungsstellen) in den unnatürlichen Aminosäuren, z. B. Homoglutaminen), die Reduktion von LD50 oder anderen Nebenwirkungen, die Fähigkeit, durch den Magentrakt in den Körper zu gelangen (z. B. orale Verfügbarkeit), oder dergleichen. Beispiele diagnostischer Eigenschaften umfassen die Lagerhalbwertszeit, die Stabilität, die diagnostische Aktivität, die Detektierbarkeit oder dergleichen. Beispiele relevanter enzymatischer Eigenschaften umfassen die Lagerhalbwertszeit, die Stabiltät, die enzymatische Aktivität, die Produktionsfähigkeit oder dergleichen.
  • Eine Reihe anderer Proteine kann auch modifiziert werden, um ein oder mehrere Homoglutamine oder andere unnatürliche Aminosäuren der Erfindung zu inkludieren. Die Erfindung kann z. B. das Substituieren einer oder mehrerer natürlicher Aminosäuren in einem oder mehreren Vakzinenproteinen durch ein Homoglutamin umfassen, z. B. in Proteinen infektiöser Pilze, z. B. Aspergillus, Candida-Arten; in Bakterien, insbesondere E.coli, das als Modell für pathogene Bakterien dient, sowie in medizinisch bedeutsamen Bakterien, wie z. B. Staphylokokken (z. B. aureus) oder Streptokokken (z. B. pneumoniae); Protozoa, wie z. B. Sporozoa (z. B. Plasmodia), Rhizopoden (z. B. Entamoeba) und Geißeltierchen (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia etc.); Viren, wie z. B. (+)-RNA-Viren (Beispiele umfassen Pockenviren, z. B. Vakzinia; Picornaviren, z. B. Polio; Togaviren, z. B. Röteln; Flaviviren, z. B. HCV; sowie Coronaviren), (–)-RNA-Viren (z. B. Rhabdoviren, z. B. VSV; Paramyxoviren, z. B. RSV; Orthomyxoviren, z. B: Influenza; Bunyaviren; sowie Arenaviren), dsDNA-Viren (z. B. Reoviren), RNA-zu-DNA-Viren, d. h. Retroviren, z. B. HIV und HTLV, sowie gewisse DNA-zu-RNA-Viren, wie z. B. Hepatitis B.
  • Verwandte Proteine aus dem Bereich der Landwirtschaft, wie z. B. Insektenresistenz-Proteine (z. B. die Cry-Proteine), Stärke- und Lipidproduktionsenzyme, Pflanzen- und Insektentoxine, Toxinresistenzproteine, Mycotoxin-Entgiftungsproteine, Pflanzenwachstumsenzyme (z. B. Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase, „RUBIS CO"), Lipoxygenase (LOX) sowie Phosphoenolpyruvat-(PEP-)Carbolase, sind ebenfalls geeignete Ziele für eine Modifikation von Homoglutamin oder anderer unnatürlicher Aminosäuren.
  • In gewissen Ausführungsformen wird das Protein oder Polypeptid von Interesse (oder ein Abschnitt davon) in den Verfahren und/oder Zusammensetzungen der Erfindung von einer Nucleinsäure kodiert. Typischerweise umfasst die Nucleinsäure zumindest ein Selektorcodon, zumindest zwei Selektorcodons, zumindest drei Selektorcodons, zumindest vier Selektorcodons, zumindest fünf Selektorcodons, zumindest sechs Selektorcodons, zumindest sieben Selektorcodons, zumindest acht Selektorcodons, zumindest neun Selektorcodons, zehn oder mehr Selektorcodons.
  • Gene, die für Proteine oder Polypeptide von Interesse kodieren, können unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind und hierin in „Mutagenese und andere molekularbiologische Verfahren" beschrieben werden, mutagenisiert werden, um z. B. ein oder mehrere Selektorcodons zum Einbau eines Homoglutamins zu inkludieren. Es wird z. B. eine Nucleinsäure für ein Protein von Interesse mutagenisiert, um ein oder mehrere Selektorcodons zu inkludieren, wodurch für die Insertion des einen oder mehrerer Homoglutamine gesorgt wird. Die Erfindung umfasst eine beliebige solche Variante, z. B. eine Mutante, Versionen eines beliebigen Proteins, z. B. umfassend zumindest ein Homoglutamin. Auf ähnliche Art und Weise umfasst die Erfindung auch entsprechende Nucleinsäuren, z. B. eine beliebige Aminosäure mit einem oder mehreren Selektorcodons, die für ein oder mehrere Homoglutamine kodiert.
  • Um ein Protein herzustellen, das ein Homoglutamin umfasst, können Wirtszellen und Organismen verwendet werden, die für den In-vivo-Einbau des Homoglutamins durch orthogonale tRNA/RS-Paare angepasst werden. Es werden Wirtszellen mit einem oder mehreren Vektoren gentechnisch verändert (z. B. transformiert, transduziert oder transfiziert), welche die orthogonale tRNA, die orthogonale tRNA-Synthetase und einen Vektor exprimieren, der für ein zu derivatisierendes Protein kodiert. Jede dieser Komponenten kann auf demselben Vektor vorliegen, oder es kann jede auf einem separaten Vektor vorliegen, oder es können zwei Komponenten auf einem Vektor und die dritte Komponente auf einem zweiten Vektor vorliegen. Der Vektor kann z. B. die Form eines Plasmids, eines Bakteriums, eines Virus, eines nackten Polynucleotids oder eines konjugierten Polynucleotids aufweisen.
  • Definition von Polvpeptiden anhand der Immunreaktivität
  • Da die Polypeptide der Erfindung eine Vielzahl neuer Polypeptidsequenzen bereitstellen (z. B. umfassend Homoglutamine im Fall von Proteinen, die in den hierin enthaltenen Translationssystemen synthetisiert werden, oder z. B. im Fall neuer Synthetasen, neuer Sequenzen von Standard-Aminosäuren), stellen die Polypeptide auch neue strukturelle Eigenschaften bereit, die z. B. in immunologischen Tests erkannt werden können. Die Erzeugung von Antisera, die spezifisch an die Polypeptide der Erfindung binden, sowie die Polypeptide, die von solchen Antisera gebunden werden, stellen ein Merkmal der Erfindung dar. Der Ausdruck „Antikörper" umfasst, wie hierin verwendet, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Polypeptid, das im Wesentlichen von einem Immunglobulin-Gen oder von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten davon kodiert wird, die einen Analyten (Antigen) spezifisch binden und erkennen. Beispiele umfassen polyklonale, monoklonale, chimäre und Einzelketten-Antikörper und dergleichen. Fragmente von Immunglobulinen, unter anderem Fab-Fragmente und Fragmente, die von einer Expressionsbibliothek produziert werden, einschließlich Phagen-Display-, sind auch, wie hierin verwendet, im Ausdruck „Antikörper" umfasst. Siehe z. B. Paul, Fundamental Immunology, 4. Aufl., Raven Press, New York (1999), bezüglich Antikörperstruktur und -terminologie.
  • Um Antisera zur Verwendung in einem Immuntest zu produzieren, werden ein oder mehrere der immunogenen Polypeptide produziert und gereinigt, wie hierin beschrieben. Rekombinantes Protein kann z. B. in einer rekombinanten Zelle produziert werden. Ein durch Inzucht gezüchteter Mäusestamm (wird in diesem Test verwendet, da die Resultate aufgrund der praktischen genetischen Identität der Mäuse besser reproduzierbar sind) wird mit dem/den immunogenen Protein(en) in Kombination mit einem Standard-Adjuvans, wie z. B. Freund-Adjuvans, und einem Standard-Maus-Im munisierungsprotokoll immunisiert (siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), für eine Standardbeschreibung der Antikörpererzeugung, der Immuntestformate und -bedingungen, die zur Bestimmung der spezifischen Immunreaktivität verwendet werden können). Zusätzliche Informationen über Proteine, Antikörper, Antisera etc. können z. B. in USSN 60/479.931 , 60/463.869 und 60/496.548 mit dem Titel „Expanding the Eukaryotic Genetic Code", WO 2002/085923 mit dem Titel „In vivo incorporation of unnatural amino acids", Patent Anmeldung mit dem Titel „Glycoprotein synthesis", eingereicht am 16. Jänner 2003, USSN 60/441.450 ; sowie der Patentanmeldung mit dem Titel „Protein Arrays", Attorney Docket Number P1001US00, eingereicht am 22. Dezember 2002, erhalten werden.
  • Verwendung von O-tRNA und O-RS und O-tRNA/O-RS-Paaren Die Zusammensetzungen der Erfindung sowie Zusammensetzungen, die durch die Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, liegen gegebenenfalls in einer Zelle vor. Die O-tRNA/O-RS-Paare oder einzelne Komponenten der Erfindung können anschließend in einem Translationsmechanismus eines Wirtssystems verwendet werden, was zum Einbau eines Homoglutamins in ein Protein führt. Die Patentanmeldung „In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids", WO 2002/085923 von Schultz et al. beschreibt dieses Verfahren. Wird z. B. ein O-tRNA/O-RS-Paar in einen Wirt, z. B. Escherichia coli, eingeführt, so führt das Paar zum In-vivo-Einbau eines Homoglutamins als Reaktion auf ein Selektorcodon, z. B. ein Amber-Nichtsinn-Codon, das exogen zum Wachstumsmedium hinzugefügt werden kann, in ein Protein, z. B. Myoglobin oder ein therapeutisches Protein. Gegebenenfalls können die Zusammensetzungen der Erfindung in einem In-vitro-Translationssystem oder in (einem) In-vivo-System(en) vorliegen. Proteine mit dem Homoglutamin können als therapeutische Proteine verwendet werden und können verwendet werden, um Studien der Proteinstruktur, von Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, von Elektronenübertragungsvorgänge in Proteinen und dergleichen zu erleichtern.
  • Sets
  • Ein weiteres Merkmal der Erfindung sind Sets. Es wird z. B. ein Set zur Herstellung eines Proteins bereitgestellt, das zumindest ein Homoglutamin in einer Zelle umfasst, wobei das Set einen Behälter umfasst, der eine Polynucleotidsequenz, die für eine O-tRNA kodiert, und/oder eine O-tRNA, und/oder eine Polynucleotidsequenz, die für eine O-RS kodiert, und/oder eine O-RS enthält. In einer Ausführungsform umfasst das Set weiters ein Homoglutamin. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Set weiters Anleitungen zur Herstellung des Proteins. Es kann ein(e) beliebige(s) Zusammensetzung, System oder Vorrichtung der Erfindung auch mit geeigneten Verpackungsmaterialien (z. B. Behältern etc.) zur Produktion in Setform assoziiert werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden angeführt, um die beanspruchte Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht einzuschränken. Ein Fachmann erkennt eine Reihe nicht entscheidender Parameter, die verändert werden können, ohne vom Umfang der beanspruchten Erfindung abzuweichen.
  • Beispiel 1: Produktion eines orthogonalen Synthetase/tRNA-Paars, das von ArchaeatRNALYS abstammt
  • Ein orthogonales Synthetase/tRNA-Paar wurde aus der Lysyl-tRNA-Synthetase von Pyrococcus horikoshii konstruiert. Unter Verwendung einer Amber-Suppressor-tRNA, die vom Consensus einer mehrfachen Sequenzanordnung von Archaea-tRNALYS-Sequenzen abstammt, wurde eine Amber-Suppression von 32% in β-Galactosidase-Tests beobachtet. Als solches ist dieses Paar ein hochgradig wirksames System zum selektiven Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Protein in E.coli.
  • Die Erweiterung des genetischen Codes eines Organismus, um zusätzliche Aminosäuren über die häufig anzutreffenden zwanzig hinaus zu inkludieren, erfordert ein Minimum von zwei neuen Genen: eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die selektiv die unnatürliche Aminosäure aktiviert und die Aminosäure nicht zu endogenen tRNAs transferiert; sowie eine zugehörige orthogonale tRNA, welche die unnatürliche Aminosäure akzeptiert und nicht von endogenen Synthetasen beladen wird (Furter, Protein Sci. 7, 419–426 (1998)). Zusätzlich dazu liefert die tRNA die Aminosäure als Reaktion auf ein nichtkodierendes Codon, z. B. ein Nichtsinn-Codon oder ein Rasterverschiebungs-Codon, an. Varianten eines Methanococcus-jannaschii-Tyrosyl-tRNA-Synthetase- und zugehörigen Amber-Suppressor-tRNA-Paars (Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 122, 5010–5011 (2000); Wang et al., Science 292, 498–500 (2001)) wurden identifiziert, die diese Kriterien erfüllen und sie wurden verwendet, um eine Reihe unnatürlicher Aminosäuren, unter anderem ketohältige (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 56–61 (2003)) und photovernetzende Aminosäuren, mit hoher Zuverlässigkeit (Chin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11020–11024 (2002); Chin und Schultz, ChemBioChem 3, 1135–1137 (2002)) wirksam in Proteine in E.coli einzubauen. Die Ausweitung des Umfangs und der Anzahl unnatürlicher Aminosäuren, die genetisch kodiert werden können, verwendet wahrscheinlich neue orthogonale Synthetase-tRNA-Paare und neue Codons, um für diese zu kodieren (Magliery et al., J. Mol. Biol. 307, 755–769 (2001); Anderson et al., Chem. Biol. 9, 237–244 (2002)).
  • Vor kurzem wurde ein neuer Ansatz angewandt, um ein orthogonales Paar zu konstruieren, das von der Methanobacterium-thermoautotrophicum-Leucyl-tRNA-Synthetase und zugehörigen orthogonalen Amber-, Opal- und Vier-Basen-SuppressortRNAs herrührt, die von der Halobacterium-Spezies NRC-1 stammen (Anderson und Schultz, Biochemistry 42 (32), 9598–608 (2003)). Das Design dieser Suppressor-tRNAs der Consensus-Sequenz einer mehrfachen Sequenzanordnung von Archaea-Leucyl-tRNAs brachte wirksame orthogonale Rasterverschiebungs- und Opal-Suppressoren hervor. Robuste orthogonale Suppressor-tRNAs besaßen CU(X)XXXAA-Anticodon-Schleifen (worin (X)XXX die reverse Komplementsequenz des Codons ist) und keine fehlgepaarten Basen in Stammregionen. Nun berichten die Erfinder über die Verwendung dieser „Consensus-Suppressor"-Strategie im rationalen Design eines wirksamen orthogonalen Synthetase-tRNA-Paars, das von Archaea-tRNALys-Sequenzen herrührt, sowie der Lysyl-tRNA-Synthetase des Archaea-Pyrococcushorikoshii.
  • Dieses tRNA/Synthetase-Paar besitzt eine Reihe attraktiver Merkmale für die Konstruktion eines orthogonalen Suppressor-Paars in E.coli. Eine orthogonale tRNA zur Verwendung in E.coli sollte nicht mit E.-coli-Aminoacyl-tRNA-Synthetasen kreuzreagieren. Trotz der Ähnlichkeit zwischen den tRNALys-Sequenzen von Prokaryoten und Archaea ist die Unterscheidungsbase 73 bei Prokaryoten A und bei Archaea G (Ibba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 418–423 (1999)), was verhindert, dass Archaea-tRNALyss als Substrate für E.-coli-Synthetasen verwendet werden. Tatsächlich wurde herausgefunden, dass E.-coli-Gesamtzell-Lysate tRNA aus dem Archaea-Halobacterium-cutirubrum schlecht acetylierten (Kwok und Wong, Can. J. Biochem. 58, 213–218 (1980)). Um Suppressor-tRNAs zu konstruieren, sind Veränderungen der Sequenz des Anticodons möglich, ohne die Aminoacetylierungsaktivität negativ zu beeinflussen. Studien bezüglich der tRNA-Erkennung durch die Lysyl-tRNA-Synthetase des Archaea-horikoshii (PhKRS) (Terada et al., Nat. Struct. Biol. 9, 257–262 (2002)) zeigten, dass das Anticodon verändert werden kann, ohne die Erkennung der tRNA zu stören. Daher ist es wahrscheinlich, dass Suppressor-tRNAs für Codons, wie z. B. das Amber-Nichtsinn-Codon, UAG, aus diesen tRNAs konstruiert werden können. Schließlich ist die Kristallstruktur der Archaea-Typ-I-Lysyl-tRNA-Synthetase, PhKRS, zugänglich (Terada et al., Nat. Struct. Biol. 9, 257–262 (2002)), um Veränderungen der Aminosäure-Spezifität der Aminoacyl-tRNA-Synthetase zu erleichtern.
  • Um zu bestimmen, ob PhKRS in E.coli orthogonal ist, war es von Nutzen zu zeigen, dass die Synthetase E.-coli-tRNA nicht in einem signifikanten Ausmaß belädt. Das Gen für PhKRS wurde aus genomischer DNA PCR-amplifiziert, in das Plasmid pBAD-Myc/HisA (Invitrogen) insertiert und überexprimiert. Das resultierende PhKRS-Protein wurde bis zur Homogenität gereinigt. Es wurden auf Gesamt-tRNA der Halobacterium-Spezies NRC-1 oder von E.coli Aminoacylierungstests durchgeführt. Die Sequenzen der tRNALyss aus der Halobacterium-Spezies NRC-1 und Pyrococcus horikoshii sind hochgradig homolog (1). Die Halobacterium-tRNA wurde daher als leicht von PhKRS beladen antizipiert. Tatsächlich belädt PhKRS in 20 Minuten eine 14fach höhere Menge halobacterieller Gesamt-tRNA als E.-coli-Gesamt-tRNA (2; 10 µM [tRNA]). Obwohl PhKRS zu einer schwachen Beladung von E-coli-tRNA in der Lage ist, ist die Rate um das 28fache niedriger als die Aktivität der E.-coli-Syn thetase gegenüber derselben Konzentration an E.-coli-Gesamt-tRNA und nur um das 7fache über der Hintergrundbeladung. Weiters konnte die hochgradig homologe Archaea-Synthetase aus M. mariplaudis eine lysSllysU-Doppelmutante, die bezüglich E.-coli-Lysyl-tRNA-Synthetase defizient ist, nur schwach komplementieren (Ibba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 418–423 (1999)). Daher ist bei PhKRS wahrscheinlich eine schwache Konkurrenz mit endogenen E.-coli-Synthetasen zur Beladung von E.-coli-tRNAs in vivo festzustellen.
  • Um die Orthogonalität von PhKRS näher zu beschreiben, versuchten die Erfinder, das PhKRS-Gen in den konstitutiven Expressionsvektor, pKQ, zu insertieren. Dieses Plasmid enthält die Ribosomenbindungsstelle, die mehrfache Klonierungsstelle, sowie den rmB-Terminator aus dem Plasmid pBAD-Myc/HisA (Invitrogen) unter der Steuerung des konstitutivenGlutamin-Promotors. Das Plasmid enthält auch einen ColE1-Replikationsstartpunkt und einen selektierbaren Kanamycin-Resistenzmarker zum Erhalt des Plasmids. Unglücklicherweise schien das Wildtyp-PhKRS-Gen bei konstitutiver Expression toxisch zu sein. Es wurde jedoch eine zufällig entdeckte E444G-Mutante (Plasmid pKQ-PhE444G) identifiziert, die bei Expression in E.coli reduzierte Toxizität zeigte. Der Mechanismus, mit dem die E444G-Mutation eine scheinbare Toxizität in diesem System mindert, wurde nicht geklärt. Eine Möglichkeit ist, dass die Mutation das geringe, in vitro beobachtete Ausmaß der Fehlbeladung unter verschiedenen Spezies von E.-coli-tRNA verhindert.
  • Der nächste Schritt umfasste die Konstruktion einer Nichtsinn-Suppressor-tRNA, die durch PhKRS beladen werden konnte. Die schwachen Anticodon-Bindungsdeterminanten, die bei PhKRS beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass das Enzym tRNAs mit einer Reihe von Anticodon-Sequenzen akzeptieren sollte (Terada et al., Nat. Struct. Biol. 9, 257–262 (2002)). Da die Amber-Suppression die am besten beschriebene und wirksamste Form der Suppression in E.coli ist (Anderson et al., Chem. Biol. 9, 237–244 (2002)), konstruierten die Erfinder eine orthogonale Archaea-Amber-Suppressions-tRNA, AKCUA, aus der Consensus-Sequenz (Anderson und Schultz, Biochemistry 42 (32), 9598–608 (2003)). Eine mehrfache Sequenzanordnung aller Archaea-tRNALys-Sequenzen aus erhältlichen genomischen Sequenzen wurde unter Verwendung des GCG-Programms Pileup durchgeführt (1). Die Consensus-Sequenz der angeordneten tRNAs wurde bestimmt, und es wurde eine Kleeblatt-Darstellung erzeugt (3). Die Sequenz wurde anschließend auf nichtkanonische Basenpaare oder Basen-Fehlpaarungen in Stammregionen untersucht, von denen herausgefunden wurde, dass sie die Suppressor-Wirksamkeit reduzieren (Hou et al., Biochemistry 31, 4157–4160 (1992)). Es waren keine solchen Fehlpaarungen in der tRNALys-Consensus-Sequenz vorhanden. Die Anticodon-Schleife wurde anschließend zu CUCUAAA geändert, da diese Sequenz als optimal für die Amber-Suppression entdeckt wurde (Yarus et al., J. Mol. Biol. 192, 235–255 (1986)). Die kreierte tRNA-Sequenz wurde durch die Überlappungsextension synthetischer Oligonucleotide (Genosys) konstruiert und unter der Steuerung des starken konstitutiven Ipp-Promotors zwischen die EcoRI- und PstI-Restriktionsstellen des Plasmids pACGFP insertiert (Magliery et al., J. Mol. Biol. 307, 755–769 (2001)). Das resultierende Plasmid, pAC-AKCUA, enthält auch den p15A-Replikationsstartpunkt, sowie einen selektierbaren Chloramphenicolresistenz-Marker.
  • Um die Suppressionswirksamkeit dieses potentiellen orthogonalen Synthetase-tRNA-Paars zu untersuchen, wurden GeneHogs-E.-coli-Zellen (Invitrogen) mit pKQ-PhE-444G, pAC-AKCUA und einem lacZ-Reporterplasmid pLASC-lacZ(TAG) cotransformiert (Anderson und Schultz, Biochemistry 42 (32), 9598–608 (2003)). Dieses Plasmid, das von pSC101 abstammt, enthält einen selektierbaren Ampicillin-Resistenzmarker und das lacZ-Gen, das unter der Steuerung des Ipp-Promotors für β-Galactosidase kodiert. Es ist ein Amber-Codon an einer permissiven Stelle, Rest 25, des lacZ-Gens vorhanden, das eine verfrühte Termination hervorruft. Bei Abwesenheit einer Amber-Suppressor-tRNA besitzen Zellen, die pLASC-lacZ(TAG) in sich tragen, nur 0,17% der β-Galactosidase-Aktivität, die beim Plasmid pLASC-lacZ(Lys) beobachtet wird, das ein AAA-(Lysin-)Sense-Codon an Position 25 enthält, sowie nur eine 2fach höhere Aktivität als Zellen, die keine Plasmide enthalten. Falls AKCUA nicht von endogenen E.-coli-Synthetasen beladen werden kann, so sollte eine geringe Amber-Suppression beobachtet werden, wenn die tRNA mit pLASC-lacZ(TAG) coexprimiert wird. Nur 1,7% Suppression (im Verhältnis zu der Expression von lacZ(lys)) wird bei Zellen beobachtet, die pAC-AKCUA und pLASC-lacZ(TAG) in sich tragen. Falls PhKRS in der Lage ist, die orthogonale tRNA zu beladen, so sollte ein höheres Ausmaß der Amber-Suppression beobachtet werden, wenn das Plasmid pKQ-PhE444G in das System eingeführt wird. Tatsäclich wird eine Suppression von 32% beobachtet. Im Vergleich dazu zeigt das orthogonale von M. jannaschii stammende Tyrosin-Synthetase-tRNA-Paar, das zuvor für E.coli beschrieben wurde, eine Suppressionswirksamkeit von 18,5% in Gegenwart der zugehörigen Synthetase und eine Suppression von 0,2% in Abwesenheit der Synthetase. Das von M. thermoautotrophicum stammende orthogonale Leucin-Amber-Paar ergibt 33,2% und 1,5% Suppression mit der bzw. ohne die zugehörige(n) Synthetase (Anderson und Schultz, Biochemistry 42 (32), 9598–608 (2003)).
  • In diesem Beispiel haben die Erfinder die Typ-I-Lysyl-tRNA-Synthetase und eine Amber-Suppressor-tRNA, die von der mehrfachen Sequenzanordnung von ArchaeatRNALys-Sequenzen stammt, als orthogonales Synthetase-tRNA-Paar für den ortsspezifischen Einbau unnatürlicher Aminosäuren in E.coli identifiziert. Die hochgradige Wirksamkeit (32% Suppression), die für das PhKRS/AKCUA-Paar beobachtet wurde, zeigt die Wirksamkeit der Consensussequenz-Strategie bei der Konstruktion wirksamer orthogonaler Suppressor-tRNAs.
  • Beispiel 2: Rasterverschiebungssuppression mit einer unnatürlichen Aminosäure, welche die Toxizität von PhKRS eliminiert
  • Ein orthogonales tRNA-Synthetase-Paar, das von der Typ-I-Lysyl-tRNA-Synthetase von Pyrococcus horikoshii stammte, wurde zur Verwendung in E.coli entwickelt. Der tRNA-Abschnitt des Systems funktionierte sehr gut als orthogonaler Amber-Suppressor. Das Synthetase-Expressionsplasmid pKQ-PhE444G war in der Lage, diese tRNA zu beladen, es wurden jedoch immer noch Toxizitätswirkungen beobachtet. Bei alleiniger Expression wachsen Zellen, die pKQ-PhE444G in sich tragen, auf 56% der Dichte, die bei Zellen ohne das Plasmid beobachtet wurde. Die Reporter-Plasmide pAC-AKCUA und pAC-AKCUA zeigen auch mäßige Toxizität und wachsen auf 71% und 52%. Wird pKQ-PhE444G mit dem Plasmid pAC-AKCUA cotransformiert, so steigt die Zelldichte auf 17%. Zusätzlich dazu erreichen die Zellen eine Dichte von nur 5%, wenn sie mit dem β-Lactamase-Reporter-Plasmid pAC-AKCUA coexprimiet werden (ein Derivat des Plasmids pACKO-A184TAG). Daher ist es klar, dass es in diesem System Toxizität sowohl mit der tRNA als auch mit der Synthetase gibt. Weiters scheint es eine Synergiewirkung zu geben, im Rahmen derer Zellen, die mit beiden Plasmiden cotransformiert werden, eine drastische Reduktion ihrer Lebensfähigkeit zeigen. Um dieses Thema zu untersuchen, suchten die Erfinder eine weniger toxische Mutante von PhKRS.
  • Es wurde angenommen, dass Punkt- oder andere Mutationen in PhKRS unter Beibehaltung der Beladungsaktivität zu einer Reduktion der Toxizität der Synthetase führen könnten. Daher wurde pKQ-PhE444G zu chemisch kompetenten roten XL1-Zellen (Stratagene) transformiert, und die Zellen wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 25 µg/ml Kanamycin enthielten. Dieser Stamm besitzt mehrere genomische Mutationen, die ein hohes Ausmaß an Mutagenese in transformierten Plasmiden hervorrufen. Es wurden etwa 100 Kolonien von dieser Platte abgekratzt und in 25 ml flüssigem LB-Medium amplifiziert, das mit Kanamycin ergänzt wurde. Es wurde angenommen, dass nichttoxische Mutanten von pKQ-PhE444G schneller wachsen würden als der Wildtyp und dass eine serielle Kultur der Zellen zur Akkumulation dieser Mutanten führen würde. Nach 2 seriellen Kulturen mit 10.000facher Verdünnung bei jedem Schritt wurden die Zellen MiniPrep unterzogen und in Genehog-Zellen eingeführt, die das Plasmid pAC-AKCUA enthielten, und auf LB-Agarplatten ausplattiert, die jeweils 25 µg/ml Kanamycin und Chloramphenicol enthielten, sowie verschiedene Konzentrationen an Ampicillin. Mehr als 90% der transformierten Zellen zeigten keine offensichtliche Toxizität und konnten auf LB-Agarplatten, die 1000 µg/ml Ampicillin enthielten, überleben. Kleinere Kolonien wurden sogar bei 1500 µg/ml Ampicillin beobachtet, was auf eine wirksame Amber-Suppression hindeutete. Eine mutierte Synthetase, genannt pKQ-PhKep, wurde isoliert und durch Restriktionskartierung und Sequenzierung des offenen Leserasters von PhKRS beschrieben. Das mutierten Gen enthält eine Insertion von 778 bp nach dem Rest S357, weist jedoch ansonsten dieselbe Sequenz auf wie das Plasmid pKQ-PhE444G. Eine BLAST-Suche zeigte, dass diese Insertion homolog zu einer Sequenz ist, die als „insAcpl" aus Plasmid p1658/97 bezeichnet wird, in der Literatur war jedoch keine weitere Erwähnung dieser Sequenz zu finden, und die Quelle dieser Sequenz ist unbekannt. Bei Translation aus dem Start-Codon von PhKRS wird das prognostizierte Produkt dieses Gens 6 Aminosäuren stromab von S357 trunkiert. Um zu testen, ob die Trunkierung von PhKRS für die Eliminierung der Toxizität verantwortlich war, wurde der Primer CA510R mit der Sequenz 5'-CAGTGGAATTCAGTAAGTTGGCAGCATCAC-3' synthetisiert, um ausdrücklich die Trunkierungsmutante im Plasmid pKQ zu konstruieren. Das Plasmid pKQ-PhKep wurde mit CA279 und CA510R PCR-amplifiziert, und das Produkt wurde in die Ncol- und EcoRI-Stellen des Plasmids pKQ subkloniert. Das resultierende Plasmid, pKQ-PhΔAD (auch als pKQ-Ph510 bekannt) wurde mit dem Plasmid pAC-AKCUA cotransformiert, und von den resultierenden Transformanten wurde herausgefunden, dass sie eine ähnliche IC50 aufwiesen wie pKQ-PhKep-transformierte Zellen, sowie keine offensichtliche Toxizität.
  • Die Trunkierung nach dem Rest S357 scheint die Anti-Codon-Bindungsdomäne von PhKRS zu deletieren, und die Erfinder wollten untersuchen, wie diese Deletion die tRNA-Erkennungseigenschaften der Synthetase beeinträchtigt. Daher haben die Erfinder die Synthetase überexprimiert, um in vitro Aminoacylierungstests durchzuführen. Das Gen wurde aus pKQ-PhKep mit CA279 und CA511 (5'-CATTGGAATTCGAGTAAGTTGGCAGCATCAC-3') PCR-amplifiziert und in die Ncol- und EcoRI-Stellen von pBAD-Myc/HisA im Rahmen mit der C-terminalen Myc/His-Markierung subkloniert. Das Protein wurde mittels Ni-NTA-Chromatographie gereinigt.
  • Beispiel 3: Erweiterung des genetischen Codes mit Vier-Basen-Codons und unnatürlichen Aminosäuren
  • Obwohl, mit wenigen Ausnahmen, die genetischen Codes aller bekannten Organismen für dieselben zwanzig Aminosäuren kodieren, so ist alles, was zum Hinzufügen eines neuen Bausteins erforderlich ist, ein einzigartiges tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar, eine Quelle der Aminosäure und ein einzigartiges Codon, das die Aminosäure spezifiziert (Wang et al., Expanding the genetic code, Science 292, 498–500 (2001)). Die Erfinder haben zuvor gezeigt, dass das Amber-Nichtsinn-Codon TAG zusammen mit orthogonalen M.-jannaschii- und E.-coli-tRNA/Synthetase-Paaren verwendet werden kann, um genetisch für eine Reihe von Aminosäuren mit neuen Eigenschaften in E.coli (Wang et al., Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 56–61 (2003); Santoro et al., An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA-Synthetase specificity, Nat. Biotechnol. 20, 1044–8 (2002); Chin et al., Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11020–11024 (2002); Mehl et al., Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, J. Am. Chem. Soc. 125, 935–9 (2003)), bzw. in Hefe (Chin et al., An expanded eukaryotic genetic code, Science 301, 964–7 (2003)) zu kodieren. Die beschränkte Anzahl an nicht kodierenden Triplett-Codons schränkt jedoch die letztendliche Anzahl an Aminosäuren, die von einem beliebigen Organismus kodiert werden, stark ein. Hierin berichten die Erfinder von der Erzeugung eines neuen orthogonalen Synthetase/tRNA-Paars, das von Archaea-tRNALys-Sequenzen abstammt und das die Aminosäure Homoglutamin (hGln) wirksam und selektiv als Reaktion auf das Vier-Basen-Codon AGGA in Myoglobin inkorporiert. Die Rasterverschiebungssuppression mit hGln führt zu keiner signifikanten Beeinträchtigung der Proteinausbeute oder der Zellwachstumsraten und es wurde gezeigt, dass sie wechselseitig orthogonal mit der Suppression von TAG war. Diese Arbeit legt nahe, dass weder die Anzahl der verfügbaren Triplett-Codons noch der Translationsmechanismus selbst ein signifikantes Hindernis für die weitere Expansion des Codes darstellt.
  • Es gibt viele Beispiele natürlich auftretender +1-Rasterverschiebungs-Suppressoren, unter anderem UAGN-Suppressoren (N = A, G, C oder T), die von Su7 abstammen, das für Glutamin kodiert (Curran und Yarus, Reading frame selection and transfer RNA anticodon loop stacking, Science 238, 1545–50 (1987)), von sufJ abstammende Suppressoren von ACCN-Codons, die für Threonin kodieren (Bossi und Roth, Fourbase codons ACCA, ACCU und ACCC are recognized by frameshift suppressor sufJ, Cell 25, 489–96 (1981)), sowie CAAA-Suppressoren, die von tRNALys und tRNAGln abstammen (O'Connor, Insertions in the anticodon loop of tRNA (1) (Gln) (sufG) und tRNA(Lys) promote quadruplet decoding of CAAA, Nucleic Acids Res. 30, 1985–1990 (2002)). Weiters wurden genetische Selektionen verwendet, um wirksame Vier- und Fünf-Basen-Codon-Suppressor-tRNAs aus großen Bibliotheken von mutierten tRNAs zu identifizieren, umfassend einen E.-coli-tRNASer UCCU-Suppressor (Magliery et al., Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of „shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307, 755–769 (2001); Anderson et al., Exploring the limits of codon and anitcodon size, Chem. Biol. 9, 237–244 (2002); Hohsaka et al., Incorporation of two nonnatural amino acids into Proteins through extension of the genetic code, Nucleic Acids Symp. Ser 42. 79–80 (1999); Hohsaka et al., Five-base codons für incorporation of nonnatural amino acids into Proteins, Nucleic Acids Res. 29, 3646–51 (2001); Hohsaka and Sisido, Incorporation of non-natural amino acids into Proteins, Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 809–15 (2002)).
  • Um für unnatürliche Aminosäuren mit Vierergruppen-Codons in vivo zu kodieren, muss eine tRNA erzeugt werden, die einzig und allein dieses Codon erkennt und eine entsprechende Synthetase, die einzig und allein nur diese tRNA mit der unnatürlichen Aminosäure von Interesse aminoacyliert. Da die Anti-Codon-Schleife der zuvor erzeugten orthogonalen M.-jannaschii-Amber-Suppressor-tRNA ein entscheidendes Erkennungselement für die zugehörige Synthetase, JYRS, ist, war es schwierig, diese tRNA gentechnisch zu verändern, um ein Vier-Basen-Codon zu entschlüsseln. Obwohl es möglich sein kann, die Anti-Codon-Bindungsspezifität von JYRS zu entspannen, wäre es wahrscheinlich schwierig, unter ausschließlicher Verwendung der Anti-Codon-Sequenz wechselseitig orthogonale Paare zu konstruieren, die Amber- und Vier-Basen-Suppressoren unterscheiden. Daher wäre es unter Verwendung zweier orthogonaler Paare unterschiedlichen Ursprungs, welche die Entwicklung eines neuen orthogonalen tRNA-Synthetase-Paars erfordern, am wahrscheinlichsten, ein System zu erzielen, das die simultane Einbau zweier unnatürlicher Aminosäuren in ein Polypeptid ermöglicht.
  • Die Erfinder setzten den Schwerpunkt anfänglich auf das Lysyl-Synthetase/tRNA-Paar der Archaea-Art Pyrococcus horikoshii (PhKRS) als orthogonales Kandidatenpaar, da 1) dieses Paar aufgrund der Konservierung von A73 in Prokaryoten und G73 in Archaea wahrscheinlich orthogonal ist (Ibba et al., Substrate recognition by class I lysyl-tRNA synthetases: a molecular basis for gene displacement, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 418–423 (1999)); 2) PhKRS tolerant gegenüber Substitutionen der tRNA-Anti-Codon-Schleife ist, wodurch die Beladung von Suppressor-tRNAs ermöglicht wird (Terada et al., Functional convergence of two lysyl-tRNA synthetases with unrelated topologies, Nat. Struct. Biol. 9, 257–262 (2002)); sowie 3) die Kristallstruktur von PhKRS verfügbar ist (Terada et al., Functional convergence of two lysyl-tRNA synthetases with unrelated topologies, Nat. Struct. Biol. 9, 257–262 (2002)), um Veränderungen der Aminosäurespezifität zu erleichtern. Unglücklicherweise fanden die Erfinder heraus, dass PhKRS bei konstitutiver Expression toxisch für E.-Coli-Zellen ist. Trotzdem führte die serielle Kultur im Mutator-Stamm XL1-rot zur Isolierung einer nichttoxischen Variante, PhΔAD, die 6 Aminosäuren stromab von Rest S357 aufgrund eines 778-bp-Insertionselements, das als insAcpl bezeichnet wird, trunkiert ist. Als solche wurde die Anti-Codon-Schleifen-Bindungsdomäne deletiert, wodurch ein etwaiger Verlust der Aktivität, der aus dem Ersatz der Anti-Codon-Schleife resultieren könnte, weiter minimiert wird.
  • Wie in Beispiel 1 ausführlicher angeführt, war es zur Bestimmung der Tatsache, ob diese Trunkierungsmutante in E.coli funktionell und orthogonal ist, von Nutzen zu zeigen, dass die Synthetase E.-coli-tRNA nicht in einem signifikanten Ausmaß beladen kann, jedoch Aktivität gegenüber zugehöriger Archaea-tRNA beibehält. Gene für PhΔAD und EcKRS wurden kloniert und überexprimiert, und das Protein wurde bis zur Homogenität gereinigt. Die Aminoacylierung der gesamten tRNA aus einem Archaebacterium, Halobacterium-Spezies NRC-1 oder aus E.coli wurde getestet. PhΔAD belädt über eine Zeitspanne von 20 Minuten eine größere Menge an Halobacterium-Gesamt-tRNA als E.-coli-tRNA (2; 10 µM [tRNA]). Obwohl PhΔAD in der Lage ist, E.-coli-tRNA schwach zu beladen, ist die Rate um das 28fache geringer als die Aktivität der E.-coli-Synthetase gegenüber derselben Konzentration von Gesamt-E.-coli-tRNA und liegt nur 7fach über der Hintergrundbeladung. Weiters war PhΔAD nicht in der Lage, das Wachstum des Stamms PALΔSΔUTR (pMAKlysU) (Chen et al., Properties of the lysyl-tRNA synthetase gene and product from the extreme thermophile Thermus thermophilus, J. Bacteriol. 176, 2699–705 (1994)), einer lysSllysU-Doppelmutante, die bezüglich E.-coli-lysyl-tRNA-Synthetase defizient ist, bei 43°C zu komplementieren. EcKRS (kloniert aus dem lysU-Locus des E.-coli-Stamms HB101) wies jedoch ein normales Wachstum auf. Daher ist PhΔAD nicht in der Lage, EcKRS zu ersetzen und würde wahrscheinlich schlecht mit endogenen E.-coli-Synthetasen zum Beladen von E-coli-tRNAs in vivo konkurrieren.
  • Um zu zeigen, dass PhΔAD in E.coli funktionell war, verwendeten die Erfinder einen β-Lactamase-Suppressionstest mit einer orthogonalen Amber-Suppressor-tRNA für PhΔAD. Dieser Ansatz ermöglichte es den Erfindern ebenfalls, die zuvor für das orthogonale M.-jannaschii-Paar entwickelten Selektionsschemata zu verwenden. Es wurde unter Verwendung einer vor kurzem beschriebenen Consensus-Suppressor-Strategie eine Suppressor-tRNACUA (AKCUA) erzeugt (Anderson und P. G. Schultz, Adaptation of an Orthogonal Archaeal Leucyl-tRNA and Synthetase Pair for Fourbase, Amber, and Opal Suppression, Biochemistry 42, 9598–608 (2003)). Es wurde eine mehrfache Sequenzanordnung aller Archaea-tRNALys-Sequenzen aus erhältlichen genomischen Sequenzen durchgeführt, und es wurde eine Consensus-Sequenz bestimmt. Die Anti-Codon-Schleifen-Sequenz wurde zu CUCUAAA geändert, um eine Amber-Suppressor-tRNA aufzuweisen (1). Das Gen für AKCUA wurde synthetisiert und in das Plasmid pACKO-A184TAG insertiert (Anderson und P. G. Schultz, Adaptation of an Orthogonal Archaeal Leucyl-tRNA and Synthetase Pair for Four-base, Amber, and Opal Suppression, Biochemistry 42, 9598–608 (2003)), um die Amber-Suppressionswirksamkeit zu untersuchen. Dieses Plasmid enthält ein Gen für β-Lactamase (bla) mit einem TAG-Codon an der permissiven Stelle A184. Ohne tRNA weist die Translation keine beobachtbare β-Lactamase voller Länge und Empfindlichkeit für 5 µg/ml Ampicillin auf. Bei Expression mit AKCUA wurde keine Zunahme der Ampicillin-Resistenz beobachtet, was zeigt, dass die tRNA durch E.-coli-Synthetasen nicht beladen wird. Bei Coexpression mit PhΔAD wurde die orthogonale tRNA beladen, was zu einer wirksamen Amber-Suppression und Resistenz gegenüber 1000 µg/ml Ampicillin führt. Das orthogonale PhΔAD/AKCUA-Paar ist daher ein wirksames und orthogonales Amber-Suppressionssystem.
  • Bereits zuvor wurde gezeigt, dass das Vier-Basen-Codon AGGA von einer E.-coli-tRNASer UCCU wirksam unterdrückt werden kann. In diesem Fall steht die Suppression des Vier-Basen-Codons in Konkurrenz mit dem seltenen Codon AGG, das zu der Wirksamkeit und dem Fehlen von Toxizität der Suppressor-tRNA beitragen kann. Eine AGGA-Suppressor-tRNA wurde aus AKCUA durch Änderung der Anti-Codon-Schleife zu CUUCCUAA erzeugt und in das Plasmid pACKO-A184AGGA insertiert. Ähnlich wie pACKO-A184TAG enthält dieses Plasmid ein AGGA-Codon an Position A184, das zu einer abortiven Translation und Resistenz gegen nur 5 µg/ml Ampicillin führt. Unglücklicherweise ist diese tRNA nicht länger zu E.-coli-Synthetasen orthogonal. Zellen, welche die kreierte tRNA enthalten, überleben bis zu 200 µg/ml Ampicillin, sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von PhΔAD.
  • Um orthogonale Varianten zu identifizieren, konstruierten die Erfinder eine Bibliothek, in der die letzten vier Basenpaare des Akzeptorstamms, Positionen 1–4 und 69–72, gleichzeitig einer Randomisation unterzogen wurden (Anderson und P. G. Schultz, Adaptation of an Orthogonal Archaeal Leucyl-tRNA and Synthetase Pair for Fourbase, Amber, and Opal Suppression, Biochemistry 42, 9598–608 (2003)). Diese tRNAs wurden mit PhΔAD coexprimiert und die Zellen wurden bei 200 µg/ml zwei Runden Ampicillinselektion unterzogen, was zu einem Pool aktiver AGGA-Suppressor-tRNAs führte. Um orthogonale Varianten zu identifizieren, wurden tRNA-Plasmide isoliert, und 384 einzelne Klone wurden in Abwesenheit von PhΔAD auf Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin gescreent. Von diesen ist der Klon mit der größten Wirksamkeit und Orthogonalität resistent gegen 700 µg/ml Ampicillin in Gegenwart von PhΔAD, überlebt jedoch nur bis zu 5 µg/ml bei dessen Abwesenheit. Diese tRNA, AKUCCU, enthält mehrere Akzeptorstamm-Substitutionen und eine zufällig entdeckte A37C-Mutation unbekannter Bedeutung (5).
  • Um Homoglutamin als Reaktion auf AGGA einzubauen, erwies es sich als Nächstes als nützlich, die Spezifität von PhΔAD zu verändern. Homoglutamin wurde als anfängliches Target ausgewählt, um die Zuverlässigkeit einer modifizierten Synthetase zu testen, da es bezüglich der Größe Lysin ähnelt und sowohl Donor- als auch Akzeptor-Eigenschaften bei Wasserstoffbrückenbindungen aufweist. Bei Untersuchung der PhKRS-Kristallstruktur zeigte sich, dass nur zwei Reste, E41 und Y268, die ε-Aminogruppe von Lysin spezifisch erkennen. Sie wurden gleichzeitig durch Sättigungsmutagenese in der Konstruktion einer kleinen aktiven Stellenbibliothek randomisiert, die von PhΔAD herrührte. Um auf hGln-spezifische Synthetasen zu screenen, verwendeten die Erfinder ein GFP-Reporterplasmid, pREP2-AKCUA (Santoro et al., An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity, Nat. Biotechnol. 20, 1044–8 (2002)), das für das Gen für AKCUA kodiert, ein T7-RNA-Polymerase-Gen mit zwei TAG-Codons an den Positionen M1 und Q107, sowie GFPuv unter der Steuerung eines T7-Promotors. Bei Cotransformation mit pREP2-AKCUA und PhΔAD werden die Amber-Codons in T7RNAP unterdrückt, was zur GFPuv-Expression sowie zur grünen Fluoreszenz führt. In Abwesenheit der Synthetase sind die Zellen weiß. Als solches können Zellen, die aktive Synthetasen in sich tragen, durch Beobachtung der Fluoreszenz identifiziert werden. Zellen wurden mit pREP2-AKCUA cotransformiert, und anschließend wurde die Bibliothek auf Platten ausgebreitet, die hGln enthielten. Einzelne grüne Kolonien wurden isoliert und mit der sowie ohne die unnatürliche(n) Aminosäure gezüchtet, um Klone zu identifizieren, deren Fluoreszenz hGln erforderte. Von den 15 gescreenten Kolonien zeigten 5 eine stärkere Fluroeszenz auf Platten, die hGln enthielten. Von diesen konservierten alle außer einer eine Y268S-Substitution; die Synthetase mit der stärksten Selektivität unter diesen, hGlnRS, wies I41 und S268 auf und wurde näher charakterisiert.
  • Die 5 Mutanten, die den 5 Kolonien entsprachen, wiesen die folgenden Sequenzveränderungen im Vergleich zu PhΔAD auf:
    Klon Y268(Codon) E41(Codon)
    Klon 2 Ser(TCT) Val(GTT)
    Klon 3 Ser(TCG) Thr(ACG)
    Klon 4 Ser(AGT) Ser(AGT)
    Klon 5 Ser(TCG) Ile(ATT)
    Klon 6 Gly(GGT) Pro(CCG)
  • Das Myoglobin-Protein mit einer Gly24→AGGA-Mutation wurde anschließend unter Verwendung des orthogonalen hGlnRS/AKTCCT-Paars exprimiert, um zu bestimmen, ob der beobachtete hGln-abhängige Phänotyp aus dem spezifischen Einbau der unnatürlichen Aminosäure resultierte. Nach der Expression des mutierten Myoglobin-Gens bei Abwesenheit von hGlnRS wurde kein detektierbares Protein produziert. Bei Coexpression mit hGlnRS wurden 1,8 mg/ml Myoglobin isoliert. Im Vergleich wurden 3,8 mg/ml Myoglobin nach der Expression des Plasmids pBAD-JYAMB produziert, welches das Wildtyp-Myoglobin-Gen enthält. Eine MALDI-TOF-Analyse tryptischer Fragmente des gereinigten Proteins zeigte ein Peptid mit einer Masse von 1676,85 Da, in Einklang mit der prognostizierten Masse von 1676,88 Da. Es wurde kein Nachweis von Peptiden beobachtet, die Lysin oder Glutamin an Position 24 enthielten. Weiters beobachteten die Erfinder eine geringe Toxizität während des hGln-Einbaus als Reaktion auf AGGA. Während Midlog-Wachstums unter jenen Bedingungen, die für die Myoglobin-Expression ohne Arabinose-Induktion verwendet wurden, ist die Verdopplungszeit für GeneHogs-Zellen zwei Mal so hoch wie jene von Zellen, die hGln enthalten. Diese Reduktion der Wachstumsrate wurde sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von hGln beobachtet, was zeigt, dass die geringe Toxizität das Resultat von Synthetase- und tRNA-Expression anstatt von AGGA-Suppression ist. Daher schränkt die Kreuzreaktivität des AGGA-Suppressors mit seltenen AGG-Codons die praktische Anwendung der Rasterverschiebungssuppression nicht ein.
  • Die Expression von Myoglobin durch die AGGA-Suppression, um einen hGln-Rest einzubauen, wird in 7A gezeigt. Diese Figur stellt einen Western-Blot dar, der mit einem Anti-His-C-terminalen Antikörper sondiert wurde. Protein wurde aus dem Myoglobin-Gen mit einem AGGA-Codon an Position G24 produziert (Myo24AGGA), und zwar nur in Gegenwart aller drei Komponenten AK514-tRNA, hGlnRS (einer hGln-spezifischen Variante von PhKRSΔ) und hGln (Spuren 2 bis 5). Die Expression von Myoglobin durch Amber-Suppression an Position 75 (Myo75TAG) war nur mit JYRS möglich, sowie dessen zugehöriger Amber-tRNA, was die wechselseitige Orthogonalität der Lysyl- und Tyrosyl-Paare zeigt (Spuren 6 bis 9).
  • Die Erfinder untersuchten auch die Möglichkeit der Verwendung des PhΔAD/AKUCCU-Paars in Kombination mit der M.-jannaschii-Tyrosin-Synthetase (JYRS) zur simultanen Expression von TAG und AGGA in einem einzigen Polypeptid. Bei Coexpression mit JYRS im Plasmid pBK-JYRS benötigt pMyo-AKUCCU kein detektierbares Myoglobin. Daher ist JYRS nicht in der Lage, AKUCCU zu beladen. Im Gegensatz dazu versuchten die Erfinder, Myoglobin aus dem Plasmid pBAD/JYAMB-4TAG durch Beladung mit PhΔAD zu exprimieren. Dieses Expressionsplasmid enthält das Myogloblin-Gen mit einem Tag-Codon an Position 4, sowie eine orthogonale tRNATyr, J17 (Mehl et al, Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, J. Am. Chem. Soc. 125, 935–9 (2003)). Die Coexpression mit JYRS führt zu 3,8 mg/ml Myoglobin, bei PhΔAD wird jedoch kein Protein beobachtet. Daher ist PhΔAD nicht in der Lage, J17 zu beladen. Als solche sind diese Synthetase/t-RNA-Paare wechselseitig orthogonal und konnten in Kombination ohne Kreuzreaktion verwendet werden.
  • Zum Einbau zweier unnatürlicher Aminosäuren in Myoglobin wurden AKUCCU und J17 zu einem einzigen Plasmid kombiniert, das ein mutierten Myoglobin mit Gly24→AGGA und Ala75→TAG exprimiert. Eine O-Methyl-L-Tyrosin-spezifische Synthetase (OMeYRS) (Chin et al., Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11020–11024 (2002)), die von JYRS und hGlnRS stammte, wurde in einem zweiten Plasmid kombiniert. Wurden Zellen, die mit beiden Plasmiden cotransformiert wurden, in Gegenwart von beiden Aminosäuren wachsen gelassen, so wurden 1,7 mg/l Myoglobin produziert. Es wurde kein Protein produziert, wenn beide der zwei unnatürlichen Aminosäuren oder Synthetasen ausgeschlossen wurden.
  • Die gleichzeitige Verwendung von zwei orthogonalen tRNA-Systemen zur Einbau zweier unterschiedlicher unnatürlicher Aminosäuren unter Verwendung des Myoglobin-Modellsystems wird in 7B veranschaulicht. Diese Figur stellt einen Western-Blot dar, der mit einem Anti-His-C-terminalen Antikörper sondiert wurde. Das Protein wurde aus dem Myoglobin-Gen, das ein AGGA-Codon an Position 24 und ein TAG-Codon an Position 75 enthielt (Myo24AGGA/75TAG), in Gegenwart von sowohl orthogonalen Lysyl- als auch Tyrosyl-Paaren exprimiert. hGln wurde durch AGGA-Suppression an Position 24 und O-Methyl-Tyrosin (OMeTyr) durch Amber-Suppression an Position 75 in ein einziges Polypeptid unter Verwendung von hGlnRS und OMeTyrRS eingebaut. Wie in der Figur dargestellt ist, wird ein Polypeptid nur produziert, wenn beide unnatürlichen Aminosäuren vorhanden sind, und weiters nur, wenn die beiden orthogonalen Lysyl- und Tyrosyl-Systeme vorhanden sind.
  • Die in den Western-Blots der 7A und 7B beobachteten Resultate werden in den in 8 und 9 bereitgestellten Analysen weiter bestätigt. 8 stellt eine matrixbasierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Analyse tryptischer Fragmente des Wildtyp-Myoglobins bereit (MyoWT; wahrscheinlich enthaltend Lysin an Position 24) und mutierten Myoglobin (24AGGA; wahrscheinlich enthaltend hGln), wie in 7A produziert. Die Analysen dieser Myoglobin-Spezies sind im oberen bzw. im unteren Bild wiedergegeben. Die Analysen ergaben tryptische Petpidfragmente des gereinigten Proteins und zeigten ein Peptid mit einer Masse von 1.676,85 Da, was im Einklang mit der prognostizierten Masse von 1676,88 Da stand. Es wurden keine Beweise für Peptide beobachtet, die Lysin enthielten (beobachtete Masse von 950,46 Da des Proteins, das mit PhKRSΔ für das trypsingespaltete Peptid exprimiert wurde, und berechnete Masse von 950,53 oder 1.661,91 Da für das Peptid voller Länge), oder Glutamin an Position 24 (berechnete Masse 1661,87 Da).
  • 9 stellt eine Elektrospray-MS-Analyse des doppelt mutierten Proteins voller Länge bereit (wiedergegeben in 7B). Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 18.546,40 Ds (SD 0,11), was im Einklang mit der prognostizierten Masse von 18,546,60 (SD 0,81) für Myoglobin steht, das beide unnatürlichen Aminosäuren enthielt, im Vergleich mit der berechneten Masse von 18,518,3 Da für Myoglobin mit der G24K- und der A75Y-Substitution.
  • Zusammenfassend zeigten die Erfinder die Verwendung von Rasterverschiebungssuppression zum ortsspezifischen Einbau einer unnatürlichen Aminosäure in vivo. Weiters zeigten die Erfinder die wechselseitige Orthogonalität dieser von P. horikoshii abstammenden tRNA-Synthetase und ein orthogonales Paar, das von der M.- jannaschii-Tyrosyl-tRNA-Synthetase abstammt, und sie zeigten, dass sie gleichzeitig zwei. unnatürliche Aminosäuren in ein einziges Polypeptid einbauen können. Es sollte möglich sein, Synthetase-Varianten zu identifizieren, welche den Einbau von wechselseitig orthogonalen reaktiven Handles oder sogar von Fluorophor-Aminosäuren erlauben. Mit solchen Materialien ist es möglich, ein Fluorophor-Paar für FREI-Studien in vivo in ein Polypeptid einzubauen. Auf ähnliche Art und Weise ist es möglich, andere Gruppierungen als Aminosäuren, wie z. B. α-Hydroxysäuren, zur ribosomalen Produktion unnatürlicher Polymere einzubauen. Es können zusätzliche Codons, wie z. B. CCCU oder CUAG, verwendet werden, die wirksam in E.coli unterdrückt werden. Alternativ dazu könnte das Genom von E.coli erneut mit eingeschränkter Codon-Degeneration synthetisiert werden, wodurch bis zu 43 Codons zur erneuten Codierung zugänglich gemacht werden.
  • Materialien und Verfahren
  • Klonierung und Expression von Synthetase-Genen: Genomische DNA wurde aus P. horikoshii, erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC; Nr. 700860), präpariert. PhKRS wurde mittels PCR amplifiziert und zur Überexpression in die Ncol- und EcoRI-Stellen des Plasmids pBAD/Myc-HisA (Invitrogen) kloniert. Zur konstitutiven Expression wurden die Synthetase-Gene unter der Steuerung des Glutamin-Promotors in pGLN und pKQ kloniert (Anderson und Schultz, Adaptation of an Orthogonal Archaeal Leucyl-tRNA und Synthetase Pair for Four-base, Amber and Opal Suppression, Biochemistry 42, 9598–608 (2003)). Diese Plasmide, die von pBAD/Myc-HisA herrühren, verleihen Resistenz gegenüber Ampicillin bzw. Kanamycin. Auf ähnliche Art und Weise wurde EcKRS aus dem lysU-Locus des E.-coli-Stamms HB101 kloniert. Das Protein wurde durch das für das Qiagen-QIAexpressionist-Set beschriebene Protokoll in 2YT-Medium überexprimiert und anschließend gegen 100 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl und 10% Glycerin dialysiert.
  • In-vitro-Aminoacylierungstests: Gesamte E.-coli-tRNA wurde von Roche erstanden, und halobakterielle tRNA wurde aus Kulturen der Halobacterium-Spezies NCR-1 (ATTC; Nr. 700922) mit dem RNA/DNA-Extraktionsset (Qiagen) extrahiert. Tests wurden in 20-µl-Reaktionen, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 30 mM KCl, 20 mM MgCl2, 3 mM Glutathion, 0,1 mg/ml BSA, 10 mM ATP, 1 µM [3H] Lysin (Amersham), 750 nM Synthetase und 0, 2, 10 oder 40 µM Gesamt-tRNA, bei 37°C 20 Minuten lang durchgeführt.
  • Komplementationsanalyse: PALΔSΔUTR(pMAKlysU)-Zellen wurden mit pGLN-Derivaten zur Expression von PhΔAD, EcKRS oder ohne Synthetasen transformiert und auf LB-Agar-Platten, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, bei 30°C isoliert. Die Kompiementierung des synthetasedefizienten Wachstumsdefekts des Stamms PALΔSΔUTR wurde auf LB-Agar-Platten oder flüssigen Medien bei 43°C ohne Antibiotika durchgeführt. Das Wachstum in GeneHogs wurde als positive Kontrolle verwendet, um die Möglichkeit toxischer Wirkungen aus der Synthetase-Expression zu eliminieren. Für flüssige Medien wurden gesättigte Kulturen 10.000fach in frischem Medium verdünnt, und das Wachstum wurde bei 600 nm 8 Stunden lang beobachtet.
  • Bibliothekskonstruktion: Gene für tRNAs wurden durch Überlappungsextension synthetischer Oligonucleotide (Genosys) konstruiert und in die EcoRI- und PstI-Stellen von pACKO-A184TAG oder pACKO-A184AGGA subkloniert. Diese Reporterplasmide, die von pACYC184 abstammen, enthalten den p15A-Replikationsstartpunkt, ein Chloramphenicol-Resistenzgen und einen starken konstitutiven Promotor, der die Expression der tRNA-Gene steuert. Die von PhΔAD stammende Bibliothek wurde im Plasmid pKQ durch EIPCR konstruiert (Stemmer und S. K. Morris, Enzymatic inverse PCR: a restriction site indpendent, single-fragment method for high-efficiency, sitedirected mutagenesis, Biotechniques 13, 214–20 (1992)). Vorgemischte Phosphoramidite wurden während der Oligonucleotidsynthese zur Konstruktion von Bibliotheken verwendet. Die Bibliotheksdiversität war um das 9fache höher als die theoretische Diversität, und es wurde durch Sequenzierung gezeigt, dass sie frei von Sequenzverzerrungen war.
  • Bestimmung der Suppressionswirksamkeit: Die Suppressionswirksamkeit wurde durch Ausplattieren auf LB-Agar-Medium bestimmt, das mit 25 µg/ml Kanamycin und Chloramphenicol, sowie verschiedenen Konzentrationen von Ampicillin zwischen 5 und 1000 µg/ml ergänzt war. Zellen wurden bei Dichtewerten unter 100 Zellen pro Platte ausplattiert. Die Wirksamkeit ist als die höchste Konzentration angegeben, bei der Zellen überlebten, um Kolonien bei einer Reihe von Platten zu bilden, für die die nächsthöchsten und -niedrigsten Konzentrationen innerhalb von 20% des berichteten Werts liegen würden.
  • Expression und Charakterisierung von Myoglobin, enthaltend hGln: Für Einzelstellen-Einbauexperimente wurde pMyo-AKUCCU mit einem p15A-Replikationsstartpunkt, sowie Genen für Chloramphenicol-Acetyltransferase, AKUCCU, und Pottwal-Myoglobin konstruiert. Das Myoglobin-Gen wurde unter der Steuerung des Arabinose-Promotors platziert und enthält ein AGGA-Codon an Position G24. Für eine Zwei-Stellen-Einbau wurde ein anderes Plasmid durch Einführung eines TAG-Codons an Position A74 des Myoglobin-Gens in pMyo-AKUCCU konstruiert. Die orthogonale tRNATyr, J17, wurde unter der Steuerung eines zweiten Ipp-Promotors hinzugefügt. Die Synthetasen hGlnRS und AzPheRS wurden aus dem Plasmid pKQ unter unabhängigen Glutamin-Promotoren exprimiert. GeneHogs-Zellen, die geeignete Synthetase- und Myoglobin-Expressionsplasmide in sich tragen, wurden bei 37°C auf eine OD600 = 0,7 in GMML-Medium wachsen gelassen, das mit den 19 Aminosäuren außer Lysin mit jeweils 0,4 mg/ml, Vitaminen und 1 mg/ml hGln (Sigma) ergänzt war, mit 0,02% Arabinose induziert und anschließend bis zur Sättigung wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Beschalllung lysiert, und das Myoglobin wurde mit dem Qiagen-QIAexpressionist-Set gereinigt. Eine MALDI-MS-Analyse tryptischer Fragmente wurde bei TSRI Proteomics durchgeführt.
  • Beispiel 4: Beispielhafte Lysyl-O-RSs und Lysyl-O-tRNAs
  • Beispiele für O-tRNAs sind in den Beispielen und/oder in Tabelle 1 zu finden. Beispiele für O-RSs sind ebenfalls in den Beispielen und/oder in Tabelle 1 zu finden. Beispiele für Polynucleotide, die für O-RSs oder Abschnitte dieser kodieren, umfassen jene, die in den Beispielen und/oder in Tabelle 1 beschrieben sind.
  • Nähere Details dieser Erfindung und insbesondere Details bezüglich der Experimente sind in John Christopher Anderson, Pathway Engineering of the Expanding Genetic Code, Ph.D. Dissertation, The Scripps Research Institute (2003), zu finden.
  • Es wird davon ausgegangen, dass die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zur Veranschaulichung dienen und, dass dem Fachmann verschiedene Modifikationen oder Veränderungen hinsichtlich dieser Tatsache nahe gelegt werden und im Geiste und Gebiet dieser Anwendung sowie im Schutzumfang der im Anhang befindlichen Ansprüche liegen.
  • Obwohl die vorangehende Erfindung aus Gründen der Klarheit und der Verständlichkeit ziemlich ausführlich beschrieben wurde, geht für den Fachmann aus der Lektüre dieser Offenbarung klar hervor, dass verschiedene Veränderungen der Form und der Details vorgenommen werden können. Es können beispielsweise all die oben beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen in verschiedenen Kombinationen verwendet werden.
  • TABELLE 1
    Figure 01030001
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Claims (39)

  1. Translationssystem, umfassend: eine orthogonale Lysyl-tRNA (Lysyl-O-tRNA) oder eine modifizierte Variante davon sowie eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon mit Homoglutamin belädt; worin die O-RS und Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon zumindest 50% so wirksam bei der Unterdrückung eines Stopp- oder Rasterverschiebungs-Selektorcodons sind wie PhΔAD mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 28 oder eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD in Kombination mit einer O-tRNA aus Seq.-ID Nr. 26.
  2. Translationssystem nach Anspruch 1, worin das Translationssystem eine Zelle umfasst.
  3. Translationssystem nach Anspruch 2, worin die Zelle eine E.-coli-Zelle ist und worin die O-RS bei Expression in einer E.-coli-Zelle eine Toxizität aufweist, die dasselbe oder ein geringeres Ausmaß aufweist wie/als die Toxizität einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD.
  4. Translationssystem nach Anspruch 1, worin die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon, die O-RS oder beide von Pyrococcus horikoshii abstammen (PhKRS).
  5. Translationssystem nach Anspruch 4, worin: (a) die O-RS PhKRS, E444G, PhΔAD oder eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD ist; oder (b) die O-RS bei Expression in einer E.-coli-Zelle eine Toxizität aufweist, die dasselbe oder ein geringeres Ausmaß aufweist wie/als eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD.
  6. Translationssystem nach Anspruch 1, worin: (a) die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon eine Erkennungssequenz für ein Vier-Basen-Codon oder ein Amber-Codon aufweist; oder (b) die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon eine Erkennungssequenz für AGGA aufweist; oder (c) die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon eine Anti-Codon-Schleife aufweist, die eine CU(X)nXXXAA-Sequenz umfasst.
  7. Translationssystem nach Anspruch 6 (c), worin die CU(X)nXXXAA-Sequenz CUCUAAA oder CUUCCUAA umfasst.
  8. Translationssystem nach Anspruch 1, worin die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26 umfasst.
  9. Translationssystem nach Anspruch 1, umfassend eine zusätzliche O-RS und eine zusätzliche O-tRNA, worin die zusätzliche O-RS und die zusätzliche O-tRNA ein Rasterverschiebungs-Selektorcodon unterdrücken, das sich von einem Rasterverschiebungs-Selektorcodon, das von der Lysyl-O-tRNA oder einer Variante davon unterdrückt wird, und von der O-RS, die vorzugsweise die Lysyl-O-tRNA oder eine modifizierte Variante davon belädt, unterscheidet.
  10. Translationssystem nach Anspruch 1, worin das Translationssystem sowohl ein Vier-Basen-Selektorcodon als auch ein Stopp-Selektorcodon in einer Target-Nucleinsäure, die für ein Target-Polypeptid kodiert, unterdrückt.
  11. Translationssystem nach Anspruch 10, worin das Vier-Basen-Selektorcodon die Sequenz AGGA umfasst und das Stopp-Selektorcodon die Sequenz TAG oder UAG umfasst.
  12. Translationssystem nach Anspruch 1, umfassend eine Target-Nucleinsäure, die ein Vier-Basen-Selektorcodon umfasst.
  13. Translationssystem nach Anspruch 12, umfassend ein Protein, das von der Target-Nucleinsäure kodiert wird.
  14. Translationssystem nach Anspruch 1, umfassend eine Target-Nucleinsäure, die ein Vier-Basen-Selektorcodon und ein Stopp-Selektorcodon umfasst.
  15. Translationssystem nach Anspruch 14, umfassend ein Protein, das von der Target-Nucleinsäure kodiert wird, worin das Protein zumindest zwei verschiedene unnatürliche Aminosäuren umfasst.
  16. Zusammensetzung, umfassend: PhKRS, E444G, PhΔAD mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 28, eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder eine konservative Variante davon, die in E.coli orthogonal ist und in der Lage ist, die tRNA aus Seq.-ID Nr. 24 oder 26 mit Homoglutamin zu beladen.
  17. Nucleinsäure, die für PhKRS, E444G, PhΔAD mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 28, eine I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder eine konservative Variante davon kodiert, die in E.coli orthogonal ist und in der Lage ist, die tRNA aus Seq.-ID Nr. 24 oder 26 mit Homoglutamin zu beladen.
  18. Nucleinsäure, die eine tRNA umfasst oder dafür kodiert, wobei diese Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26 oder einer konservativen Variation davon entspricht, die in E.coli orthogonal ist und in der Lage ist, durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase aus Seq.-ID Nr. 28 mit Homoglutamin beladen zu werden.
  19. Zusammensetzung, umfassend eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), worin die O-RS vorzugsweise eine O-tRNA mit einem Homoglutamin aminoacyliert, worin die O-RS die O-tRNA vorzugsweise mit einer Wirksamkeit von zumindest 50% jener einer O-RS, die einer I41- und/oder S268-Mutation von PhΔAD mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 28 entspricht, bezüglich der Aminoacylierung einer O-tRNA, die Seq.-ID Nr. 26 entspricht, aminoacyliert
  20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin die O-RS eine I41- und/oder S268-Mutation von PhΔAD oder eine konservative Variation davon umfasst.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin die O-RS von einem Pyrococcus horikoshii abstammt.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 19, umfassend die O-tRNA, worin die O-tRNA ein Vier-Basen-Selektorcodon erkennt.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin das Vier-Basen-Selektorcodon eine AGGA-Sequenz umfasst.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 19, umfassend eine Zelle, worin die O-RS von einer oder mehreren Nucleinsäuren in der Zelle kodiert wird.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, worin die Zelle eine E.-coli-Zelle ist und worin die O-RS bei Expression in einer E.coli-Zelle eine Toxizität aufweist, die dasselbe oder ein geringeres Ausmaß aufweist wie/als die Toxizität einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD.
  26. Zusammensetzung nach Anspruch 19, umfassend ein Translationssystem.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 19, umfassend eine Zelle, worin die O-RS von einer oder mehreren Nucleinsäuren in der Zelle kodiert wird, wobei die Zelle wieters Folgendes umfasst: eine orthogonale tRNA (O-tRNA); sowie ein Homoglutamin; worin die O-tRNA ein erstes Selektorcodon erkennt und die O-RS vorzugsweise die O-tRNA mit dem ersten Homoglutamin aminoacyliert.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin die Zelle eine Target-Nucleinsäure umfasst, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, worin die Target-Nucleinsäure ein Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird.
  29. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin die O-tRNA eine Polynucleotidsequenz, wie in Seq.-ID Nr. 24 oder Seq.-ID Nr. 26 dargelegt, umfasst oder davon kodiert wird oder eine komplementäre Polynucleotidsequenz davon umfasst oder davon kodiert wird und worin die O-RS eine Aminosäuresequenz umfasst, die E444G, PHΔAD, einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder einer konservativen Variation davon entspricht.
  30. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin die Zelle eine E.-coli-Zelle ist und worin die O-RS bei Expression in einer E.coli-Zelle eine Toxizität aufweist, die dasselbe oder ein geringeres Ausmaß aufweist wie/als die Toxizität einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD.
  31. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin die Zelle weiters ein zusätzliches unterschiedliches O-tRNA/O-RS-Paar und eine zusätzliche unterschiedliche unnatürliche Aminosäure umfasst, worin die O-tRNA ein zweites Selektorcodon erkennt und die O-RS die O-tRNA vorzugsweise mit der zweiten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert.
  32. Zusammensetzung nach Anspruch 31, worin die Zelle eine Target-Nucleinsäure umfasst, welche die ersten und zweiten Selektorcodons umfasst.
  33. Zusammensetzung nach Anspruch 32, worin die Zelle ein Protein umfasst, das von der Target-Nucleinsäure kodiert wird, wobei das Protein zumindest zwei unterschiedliche unnatürliche Aminosäuren umfasst.
  34. Verfahren zur Selektion einer aktiven orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die ein Homoglutamin auf eine orthogonale tRNA (O-tRNA) lädt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Unterziehen einer Zellpopulation der Selektion, worin die Zellen kollektiv Folgendes umfassen: 1) die O-tRNA, worin die O-tRNA orthogonal zu Mitgliedern der Zellpopulation ist, welche die O-tRNA umfassen; 2) eine Vielzahl an O-RSs, die eine oder mehrere aktive O-RS-Mitglieder umfassen, welche die O-tRNA mit einem Homoglutamin in einer oder mehreren Zellen der Population beladen, worin das eine oder mehrere aktive O-RS-Mitglied(er) die O-tRNA vorzugsweise mit einer Wirksamkeit von zumindest 50% jener einer O-RS, die einer I41- und/oder S268-Mutation von PhΔAD mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 28 entspricht, bezüglich der Aminoacylierung einer O-tRNA, die Seq.-ID Nr. 26 entspricht, aminoacyliert/aminoacylieren; 3) ein Polynucleotid, das für einen selektierbaren Marker kodiert, worin das Polynucleotid zumindest ein Selektorcodon umfasst, das von der O-tRNA erkannt wird; sowie 4) Homoglutamin; worin eine Targetzelle in der Population, welche die aktive O-RS umfasst, durch eine verstärkte Unterdrückungswirksamkeit des selektierbaren Markers im Vergleich zu einer Unterdrückungswirksamkeit einer Kontrollzelle identifiziert wird, der die Vielzahl an RSs fehlt, die jedoch die O-tRNA umfasst; sowie das Auswählen der Targetzelle, wodurch die aktive O-RS selektiert wird.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Zellen zusätzlich selektiert werden, um Zellen zu eliminieren, die eine Non-Target-O-RS umfassen, welche die O-tRNA mit einer anderen Aminosäure als Homoglutamin belädt.
  36. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Selektion eine positive Selektion umfasst und der selektierbare Marker einen positiven Selektionsmarker umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Vielzahl an RSs RS-Mutanten, RSs, die von einer oder mehreren anderen Spezies als der ersten Spezies abstammen, oder sowohl RS-Mutanten als auch RSs, die von einer anderen Spezies als der er'sten Spezies abstammen, umfasst.
  38. Orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die durch das Verfahren nach Anspruch 34 identifiziert wurde.
  39. Verfahren zur Herstellung eines Proteins in einer Zelle mit einem Homoglutamin an einer spezifizierten Position, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Züchten der Zelle in einem geeigneten Medium, wobei die Zelle eine Nucleinsäure umfasst, die zumindest ein Selektorcodon umfasst und für ein Protein kodiert, sowie das Breitstellen des Homoglutamins; worin die Zelle weiters Folgendes umfasst: eine orthogonale tRNA (O-tRNA), die das Selektorcodon erkennt; sowie eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (O-RS), die vorzugsweise die O-tRNA mit den Homoglutaminen aminoacyliert, worin die O-RS eine Aminosäuresequenz umfasst, die PhΔAD mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 28, einer I41- und/oder S268-Mutante von PhΔAD oder einer konservativen Variation davon entspricht; sowie das Inkorporieren des Homoglutamins in die spezifizierte Position als Reaktion auf das Selektorcodon, wodurch das Protein produziert wird.
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