CN102203257B - 3-氨基酪氨酸遗传掺入还原酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含NH₂Y非天然氨基酸残基的还原酶蛋白，将NH₂Y掺入还原酶的正交组分系统和利用还原酶中的NH₂Y氨基酸残基作为分子探针检测还原酶功能、结构和活性的方法。

Description

3-氨基酪氨酸遗传掺入还原酶

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年8月25日提交的美国临时专利申请序列号61/000,491和2007年8月30日提交的临时专利申请序列号61/001,265的优先权，其内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。

资助下的研发

本发明在国家卫生研究院基金号5R01 GM62159和基金号GM29595的政府支持下作出。政府对本发明享有某些权利。

发明领域

本发明涉及蛋白质化学，例如翻译生物化学和突变分析领域。本发明涉及产生包含3-氨基酪氨酸残基的还原酶和测定所选氨基酸残基在还原酶中功能的方法和组合物。

发明背景

在所有生物中，核糖核苷酸还原酶(RNR)催化核苷酸转化成2’-脱氧核苷酸，从而提供用于DNA生物合成和修复的前体^1-3。在所有RNR中，核苷酸还原的机制是保守的，要求形成瞬时的活性位点含硫自由基(thiyl radical)(C₄₃₉·，文本中通篇使用大肠杆菌RNR编号)^4，5。然而，活性位点含硫自由基产生的机制(自由基引发事件)不是保守的，从而为区分四类RNR提供基础^6-9。主要的未解决机制问题是I类RNR和估计是最近鉴定的IV类RNR的含硫自由基形成。

大肠杆菌I类RNR由两个同二聚亚基，α2和β2构成，该二亚基在转换期间形成活性1∶1复合物^10-12。α2是该复合物的工作端(business end)。其含有发生含硫自由基介导核苷酸还原的活性位点以及调节底物特异性和转换率的多个变构效应物结合位点¹³。β2提供在α2的活性位点中形成瞬时C₄₃₉·所需的稳定二铁酪氨酰自由基(diferric tyrosyl radical)(Y₁₂₂·)^14-16辅因子^4-6。现已清楚α2^6，17和β2^18，19的结构，含有两个亚基的结构也已见报道²⁰。然而。活性α2β2复合物的结构尚未知。Uhlin和Eklund根据形状和电荷互补性以及保守的残基，从α2和β2各自的结构出发设计了α2β2复合物的对接模型(docking model)⁶。该模型提示β2中的Y₁₂₂·离α2中的C₄₃₉＞35

(图1)^21-23。在这种长距离上的自由基传播(radical propagation)需要瞬时氨基酸中间体的参与^24-26。提出参与该途径的残基在所有I类RNR中是普遍保守的。

最近利用基于机制的抑制剂，从脉冲电子-电子双共振光谱检测(pulsedelectron-electron double resonance spectroscopic measurement)²⁷获得支持Y₁₂₂·和C₄₃₉之间长距离的证据^28-32。该研究获得的距离与对接模型一致，从而确定未发生使β2中的Y₁₂₂·毗邻α2中的C₄₃₉的大构象改变³²。

为检查所提出途径的有效性，进行了定点诱变^33，34和互补研究³⁵。这些研究证明图1中的各残基在RNR功能中起重要作用。然而，这些突变体没有活性妨碍了机制研究^33，34。目前，有实质性证据证明只有一个提出的途径残基，即Y₃₅₆参与，例如本文它处详述的。相反，α2残基Y₇₃₀和Y₇₃₁在自由基传播中的作用仍不清楚。诱变研究证明它们在RNR功能中的重要性^34，44，45。然而，与β2中的残基Y₃₅₆一样，这些突变体(Y₇₃₀F-α2和Y₇₃₁F-α2)没有活性妨碍了研究Y₇₃₀和Y₇₃₁在自由基传播中的作用。

本领域需要能用非天然氨基酸残基位点特异性地替代还原酶中估计参与自由基传播的氨基酸残基的方法和组合物，所述非天然氨基酸残基能产生告知机制信息的突变体，例如可用于研究所替代的氨基酸在，例如还原酶的自由基传播中的作用的突变体。本发明提供阐明RNR反应机制的新工具和方法。

发明概述

本发明涉及包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基的重组还原酶以及产生这种还原酶的诸组分的正交系统。利用这些工具证实大肠杆菌(E.coli)RNR中动力学上活跃的自由基从RNR β2亚基的Y₁₂₂·转移穿过亚基界面，还证实NH2Y₇₃₀·或NH2Y₇₃₁·的自由基捕获。该事件显示由大肠杆菌RNR结合底物和效应物所触发。稳态活性试验结合利用自杀抑制剂N3ADP的反应表明Y₇₃₀NH2Y-α2和Y₇₃₁NH2Y-α2在核苷酸还原中是起作用的。这暗示NH2Y₇₃₀氧化C₄₃₉的氢原子转移机制。

因此，在第一方面，本发明提供包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基的重组还原酶。在一个优选实施方式中，本发明的还原酶是核糖核苷酸还原酶或衍生自核糖核苷酸还原酶，例如I类或IV类核糖核苷酸还原酶。例如，还原酶可以是衍生自大肠杆菌核糖核苷酸还原酶、人核糖核苷酸还原酶、小鼠核糖核苷酸还原酶。酵母菌核糖核苷酸还原酶、单纯疱疹病毒核糖核苷酸还原酶等的重组还原酶。例如，还原酶可以是在大肠杆菌核糖核苷酸还原酶α2亚基的Y₇₃₀；大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚基的Y₇₃₁；大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚基的Y₁₂₂；或大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚基的Y₃₅₆中一个或多个处包含NH₂Y突变的大肠杆菌核糖核苷酸还原酶。

在相关方面，本发明提供表达本发明还原酶的细胞。本发明细胞包含衍生自还原酶核酸的编码还原酶的一条或多条多肽链的重组核酸、正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)。该细胞任选包含3-氨基酪氨酸。细胞中的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)用细胞中的3-氨基酪氨酸优先氨酰化O-tRNA，编码还原酶的重组核酸包含正交tRNA(O-tRNA)识别的选择者密码子(selector codon)。编码的还原酶可任选包含I类或IV类核糖核苷酸还原酶(RNR)和/或衍生自大肠杆菌的RNR。

此外，本发明提供高产量的包含NH₂Y残基的还原酶。例如，可产生包含含有3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基的重组还原酶，例如重组核糖核苷酸还原酶的细胞浆液或提取物，其中所述细胞浆液或提取物包含至少约2和约4mg/g还原酶。在本文的一个例子中，细胞浆液包含约4至约6mg/g还原酶。

在另一方面，本发明包括测定所选氨基酸残基在还原酶中的机制功能的方法。这种方法包括使得所选氨基酸残基突变成3-氨基酪氨酸(NH₂Y)，从而产生在对应于所选氨基酸(例如，Y残基)的位点包含NH₂Y的重组突变型还原酶，将该重组还原酶与该还原酶的一种或多种底物或效应物混合并检测NH₂Y·的形成。例如，还原酶是RNR时，底物可任选包括CDP ADP、GDP或UDP，效应物可包括ATP。在所述混合前，还原酶可任选被还原(或氧化，取决于具体应用)。还原重组还原酶可任选包括从表达该重组还原酶的细胞、细胞浆液或细胞培养液中纯化该重组还原酶，以及将所得纯化的还原酶与还原剂一起培育。

检测NH₂Y的形成可包括各种技术，包括测定还原酶中NH₂Y残基的EPR光谱法，混合后实施停流光谱学以测定NH₂Y·形成的动力学或在混合后实施快速冷冻猝灭(RFQ，rapid freeze quench)EPR以测定NH₂Y·形成的动力学。

应该知道可单用或联用本发明提供的方法和组合物。

试剂盒也是本发明的特征之一。例如，这种试剂盒可装有选自下组的各种组件：容纳试剂盒组分的容器，产生(例如，表达和/或纯化)包含一个或多个3-氨基酪氨酸的还原酶，例如本文所述任何还原酶的使用说明材料，包含编码O-tRNA的多核苷酸序列的核酸，包含编码O-RS的多核苷酸的核酸，3-氨基酪氨酸和/或大肠杆菌宿主细胞的合适菌株以供表达O-tRNA/O-RS和产生包含3-氨基酪氨酸的还原酶。此外，本发明试剂盒可装有测定所选氨基酸残基在，例如还原酶的自由基传播中的功能的使用说明书和/或试剂。

附图简述

图1包括描述NH₂Y的单电子氧化和推定的自由基引发途径的示意图1。

图2包括K₇NH₂Y-Z-结构域的MALDI-TOF MS和SDS PAGE分析。

图3显示Y₇₃₁NH₂Y-α2的表达。细胞在所示有或没有IPTG和NH₂Y/DTT存在下生长，通过SDS PAGE评估表达水平。

图4提供由EPR光谱法监测，显示Y₇₃₀NH₂Y-α2/ATP与野生型β2/CDP反应的光谱曲线。

图5提供显示Y₁₂₂·和NH₂Y₇₃₀·信号强度的微波能量依赖性的图。

图6比较了NH₂Y₇₃₀·(点划线，图4)和NH₂Y₇₃₁·(虚线，图15)。

图7NH₂Y₇₃₀·(圆圈)和NH₂Y₇₃₁·(正方形)的UV-可见光谱的逐点重建。

图8显示NH₂Y₇₃₀·形成的停流动力学(stopped flow kinetics)。

图9提供显示与Y₇₃₀NH₂Y-α2、β2和dGTP温育后从N₃ADP形成N·的双重图谱。

图10N·(黑色)、Y₁₂₂·(点划线)和NH₂Y₇₃₀·(虚线)的图谱比较。

图11显示NH2Y730·氧化C439的机制选择。

图12是测定氨基酸Y₇₃₀和Y₇₃₁在大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚基中的机制作用所用方案的示意图。

图13Y₇₃₀NH₂Y-α2的表达。在所示的25℃或37℃，有或没有IPTG和NH₂Y/DTT存在下培养细胞，通过SDS PAGE评估表达水平。箭头标出了全长α和截短α的蛋白质条带的位置。

图14显示纯化的Y₇₃₀NH₂Y-α2(A)和Y₇₃₁NH₂Y-β2(B)的SDS PAGE分析。

图15描述了EPR监测的Y₇₃₁NH₂Y-α2/ATP与野生型β2/CDP反应的结果。

图16描述了NH₂Y₇₃₁·形成的停流动力学。

图17显示Y₇₃₁NH₂Y-α2的N₃ADP试验的结果。

图18提供了本发明可用的各种核苷酸序列。

发明详述

本发明涉及包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基的还原酶，例如核糖核苷酸还原酶。可利用正交元件的系统将NH₂Y残基掺入还原酶，该系统包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)特异性的氨酰tRNA合成酶、O-tRNA和任选的非天然氨基酸3-氨基酪氨酸。下文进一步详细描述了产生这种重组还原酶的方法和组合物以及包含高产量的这些重组还原酶的组合物。

一旦掺入还原酶，例如下文所述任一还原酶中，NH₂Y优选用作分析其所替代的天然氨基酸在还原酶的自由基传播中的机制作用的探针(参见，例如图1和相应的描述)。一般可通过检测非天然氨基酸自由基中间体NH₂Y·的形成而得以实现，例如通过EPR、快速冷冻猝灭EPR和/或停流光谱学监测。

掺入NH ₂ Y的正交元件的系统

用于掺入，例如NH₂Y的正交组分已见描述；参见Schultz等的WO2006/110182 A2，ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THEVIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组分)。一般可随机或选择性突变已有合成酶的活性位点，选择得到的突变型合成酶文库以筛选所需NH₂Y掺入活性，从而产生具有所需NH₂Y特异性的合成酶。通常对文库作NH₂Y掺入的正筛选，然后进行负筛选以消除用天然氨基酸氨酰化tRNA的成员。可进行重复的正和负选择从而获得合成酶，例如对NH2Y具有特异性的合成酶。筛选和选择O-RS以鉴定用NH₂Y氨酰化关联(cognate)O-tRNA的那些O-RS的其它细节见以下实施例。

除了NH₂Y非天然氨基酸，本发明还原酶任选包含额外的非天然氨基酸。采用正交组分的系统通常能将，例如1、2、3、4、5或更多种不同非天然氨基酸置于，例如蛋白质中1、2、3、4、5或更多的所选位点，例如通过将所需的选择者密码子包含在相应核酸中。细胞可包含，例如1、2、3、4、5或更多套各自识别不同的给定选择者密码子(终止密码子和4个或更多个碱基的密码子可用作选择者密码子)的关联正交组分。

产生和/或改变tRNA和/或O-RS特异性的方法、非天然氨基酸、选择者密码子和适合制备包含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统的细节通常描述于，例如国际公布号WO 2002/086075，名为“METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”(产生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶配对的方法和组合物)；WO 2002/085923，名为“IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”(非天然氨基酸的体内掺入)；WO 2004/094593，名为“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE”(扩展真核遗传密码)；2004年7月7日提交的WO 2005/019415；2004年7月7日提交的WO 2005/007870和2004年7月7日提交的WO 2005/007624。这些申请各自通过引用全文纳入本文。还可参见Wang和Schultz，“Expandingthe Genetic Code(扩展遗传密码)”，Angewandte Chemie Int.Ed.，44(1)：34-66(2005)；Deiters等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15：1521-1524(2005)；Chin等，J.Am.Chem.Soc.2002，124，9026-9027；和2005年9月20日提交的国际公布号WO2006/034332，这些文献各自的内容通过引用全文纳入本文。其它细节见美国专利号7,045,337；7,083,970；7,238,510；7,129,333；7,262,040；7,183,082；7,199,222；和7,217,809。

还原酶

还原酶是催化还原反应的酶。然而，大多数还原酶在适当条件下可用作还原酶或氧化酶。因此，术语“氧化还原酶”也用于描述这种广泛的酶家族，其中任一种可根据本发明作修饰从而包含，例如一个或多个NH₂Y残基。通常可将合适的选择者密码子掺入编码还原酶的核酸并在细胞中表达该还原酶得以实现，所述细胞包含合适的NH₂Y特异性O-RS、识别该选择者密码子的关联O-tRNA和NH₂Y。

可以该方法修饰的还原酶从而包含NH₂Y残基的例子包括酶委员会编号(EC编号)为“EC1”的那些酶。包括EC 1.1(作用于供体上CH-OH基团的氧化还原酶(例如醇氧化还原酶))；EC 1.2(作用于供体上醛或氧代基团的氧化还原酶)；作用于供体上CH-CH基团的EC 1.3氧化还原酶(例如，CH-CH氧化还原酶)；EC 1.4(作用于供体上CH-NH2基团的氧化还原酶(氨基酸氧化还原酶，单胺氧化酶))；EC 1.5(作用于供体上CH-NH基团的氧化还原酶)；EC 1.6(作用于NADH或NADPH的氧化还原酶)；EC 1.7(作用于作为供体的其它含氮化合物的氧化还原酶)；EC 1.8(作用于供体上硫基团的氧化还原酶)；EC 1.9(作用于供体上血红素基团的氧化还原酶)；EC 1.10(作用于作为供体的联苯酚和相关物质的氧化还原酶)；EC 1.11(作用于作为受体的过氧化物的氧化还原酶(例如，过氧化物酶))；EC 1.12(作用于作为供体的氢的氧化还原酶)；EC 1.13(作用于单供体掺入分子氧的氧化还原酶(例如，加氧酶))；EC 1.14(作用于成对供体掺入分子氧的氧化还原酶)；EC 1.15(作用于作为接受体的过氧化物基团的氧化还原酶)；EC 1.16(氧化金属离子的氧化还原酶)；EC 1.17(作用于CH或CH2基团的氧化还原酶)；EC 1.18(作用于作为供体的铁-硫蛋白质的氧化还原酶)；EC 1.19(作用于作为供体的还原型黄素氧还蛋白的氧化还原酶)；EC 1.20(作用于供体中磷或砷的氧化还原酶)；EC 1.21(作用于X-H和Y-H以消除X-Y键的氧化还原酶)；EC 1.97(其它氧化还原酶)；EC 1.98(利用H₂作为还原剂的酶)；和EC 1.99(利用O₂作为氧化剂的酶)。

本发明的一个特别优选的实施方式涉及将NH₂Y掺入EC 1.17所示还原酶(作用于CH或CH2基团的还原酶)，包括黄嘌呤氧化酶，特别是核糖核苷酸还原酶(RNR)。核糖核苷酸还原酶(在所有生物中，RNR能催化核糖核苷酸，例如CDP、ADP、GDP和UDP还原成脱氧核糖核苷酸)。由于RNR维持细胞dNTP水平的相对比例，这些酶在核酸代谢、DNA修复、基因组维持和细胞增殖中起核心作用(Sjoberg(1997)“Ribonucleotide reductases-a group of enzymes withdifferent metallosites and a similar reaction mechanism.(核糖核苷酸还原酶-具有不同金属位点和相似反应机制的酶)”Struct Bonding(Berlin)88：139-173；Reichard(1993)“From RNA to DNA，why so many reductases？(从RNA到DNA，为何有如此多的还原酶？)”Science 260：1773-1777)。(胸苷酸合酶产生dTDP)。RNR还原NDP的机制涉及复杂而高度调节的氧化还原化学反应(Stubbe(1990)“Ribonucleotide reductases：amazing and confusing.(核糖核苷酸还原酶：令人惊奇而困惑的)”J Biol Chem 265：5329-5332；Jordan等，(1998)“Ribonucleotidereductases.(核糖核苷酸还原酶)”Annu Rev Biochem 67：71-98)。除了疱疹病毒的那些外，RNR通常受脱氧核糖核苷酸三磷酸和ATP的变构调控，从而提供的DNA前体库能根据不同基因组的碱基组成作出平衡(Hendricks等，(1997)“Regulation of T4 phage aerobic ribonucleotide reductase.Simultaneous assay ofthe four activities.(调节T4噬菌体需氧核糖核苷酸还原酶.同时检验4种活性)”J Biol Chem 272：2861-2865；Hendricks等，(1998)“Allosteric regulation ofvaccinia virus ribonucleotide reductase，analyzed by simultaneous monitoring of itsfour activities.(变构调节痘苗病毒核糖核苷酸还原酶，通过同时监测其四种活性来分析)”J Biol Chem 273：29512-29518)。除了控制RNR活性，变构机制还调节底物特异性(Jordan等，(1998)“Ribonucleotide reductases.(核糖核苷酸还原酶)”Annu Rev Biochem 67：71-98)。

RNR在结构上相异，它们需要的金属辅因子，例如电子供体也类似地在结构和化学性质上有差异。事实上，可依据金属辅因子将RNR分成四类。I类rRNR通过变构中心的O₂活化而在蛋白质上产生稳定的酪氨酰自由基。I类还原酶可根据酶调控中的差异而再分成IA类和IB类。IA类还原酶分布在真核生物、细菌噬菌体和病毒中。IB类还原酶在真细菌中发现，其可利用锰产生自由基。无论有无O₂存在，II类RNR均可起作用，其通过切割腺苷钴胺素(AdoCbl)中的C-CO键而产生瞬时5’-脱氧腺苷自由基。III类RNR通常是厌氧的，通过切割S-腺苷甲硫氨酸而在蛋白质上产生稳定的甘氨酰自由基。有人提出IV类RNR包含毗邻酪氨酰自由基的锰辅因子。

I类RNR包含RNR1和RNR2亚基，二者可结合形成活性异二聚四聚体。I类RNR的通用机制模型包括三步：1)通过亚基R2中的二铁中心产生酪氨酰自由基；2)自由基转移从而在结合于亚基R1中的底物附近产生所述的含硫自由基；和3)催化还原结合的核糖核苷酸。氨基酸-或底物衍生-的自由基参与所有三个主要反应。在本发明的优选实施方式中，I类RNR中的酪氨酸残基优选被非天然氨基酸NH₂Y替代，例如以阐明各天然产生的酪氨酸残基在自由基传播中的机制功能。可采用本发明提供的方法替代的酪氨酸残基，例如大肠杆菌I类RNR中的可包括在β2亚基的Y₇₃₀、Y₇₃₁、Y₁₂₂和/或Y₃₅₆中一个或多个处含有NH₂Y突变的核糖核苷酸还原酶。

核糖核苷酸还原酶的结构、机制和/或调控的其它细节见，例如Stubbe和van der Donk(1995)“Ribonucleotide reductases：radical enzymes with suicidaltendencies.(核糖核苷酸还原酶：具有自杀倾向的自由基酶)”Chem Biol 2：793-801；Torrents等.(2002)“Ribonucleotide Reductases：Divergent Evolution ofan Ancient Enzyme(核糖核苷酸还原酶：古老酶的趋异演化)”Journal of Molecular Evolution 55：138-152；Norlund等，(2006)“Ribonucleotidereductases.(核糖核苷酸还原酶)”Annu Rev Biochem 75：681-706；Kolberg等，(2004)“Structure，function，and mechanism of ribonucleotide reductases.(核糖核苷酸还原酶的结构、功能和机制)”Biochim Biophys Acta 1699：1-34。以下实施例解释了阐明自由基传播在I类RNR中机制的其它细节。

表达、纯化和分离包含NH ₂ Y残基的还原酶

可按照标准克隆方法产生本发明核酸(例如，衍生自还原酶核酸，包含选择者密码子并(例如)编码还原酶的一条或多条多肽链的核酸)。分离、克隆和扩增核酸；提供核酸构建物和在细胞及无细胞系统中表达核酸构建物的方法见参考文献，该方法可用于本发明以提供和表达包含选择者密码子的核酸，从而例如产生包含NH₂Y残基的还原酶蛋白，如I类或IV类核糖核苷酸还原酶。重组还原酶可衍生自各种来源，包括真核生物，例如人、酵母菌和其它生物，原核生物、古细菌和病毒，例如单纯疱疹病毒。在一些实施方式中，本发明核酸能编码在α2亚基的Y₇₃₀、Y₇₃₁、Y₁₂₂和/或Y₃₅₆中一个或多个处含有NH₂Y突变的重组大肠杆菌核糖核苷酸还原酶。或者，本发明核酸可任选编码属于I-IV类的任何核糖核苷酸还原酶或具有EC编号1.1-1.99的任何还原酶，如本文它处所述。

核酸克隆和表达技术的其它细节见Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology(分子克隆技术指导，酶学方法)第152卷 学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，圣迭戈，加利福尼亚州(Berger)；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第3版)，第1-3卷，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，纽约，2000(“Samhrook”)；The Nucleic Acid Protocols Handbook(核酸方案手册)Ralph Rapley(编)(2000)冷泉港，休玛娜出版公司(Humana Press Inc)(Rapley)；Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols(最新方法)，格林出版联合公司(GreenePublishing Associates，Inc)和约翰威利父子公司(John Wiley & Sons，Inc.)的合资公司，(2007增补)(“Ausubel”))；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(PCR方案-方法和应用指导)(Innis等编)学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(1990)(Innis)；Chen等(编)PCR Cloning Protocols，Second Edition(PCR克隆方案，第二版)(Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)，第192卷)休玛娜出版社；刊于Viljoen等.(2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook(分子诊断PCR手册)斯普林格公司(Springer)；Demidov和Broude(编)(2005)DNA Amplification：Current Technologies and Applications.(DNA扩增：最新技术和应用)地平线生物科学公司(Horizon Bioscience)，怀蒙汉姆(Wymondham)，英国。其它有用的参考文献，例如用于细胞分离和培养的(例如，用于随后的核酸分离)包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells(动物细胞培养)，a Manual of Basic Technique(基础技术手册)，第三版，W-L公司(Wiley-Liss)，纽约和其中引用的参考文献；Payne等.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems(液体系统中的植物细胞和组织培养)约翰威利父子公司.纽约，纽约州；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell，Tissueand Organ Culture(植物细胞、组织和器官培养)；Fundamental Methods(基础方法)Springer Lab Manual(斯普林格实验室手册)，S-V公司(Springer-Verlag)(伯林 海德堡 纽约)及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(微生物培养基手册)(1993)CRC出版社，伯克莱屯，佛罗里达州。

评估氨基酸，例如酪氨酸在还原酶，例如大肠杆菌衍生的核糖核苷酸还原酶中的机制作用要求纯化重组其中感兴趣的天然氨基酸被NH₂Y残基替代的还原酶。可从细胞浆液或提取物，例如从表达本发明重组还原酶的细胞获得高产量的重组还原酶。细胞浆液或提取物包含，例如约2mg/g还原酶，或者更优选4-6mg/g重组还原酶。各种蛋白质纯化方法是本领域熟知的1可应用于包含至少一个NH₂Y残基的还原酶变体的纯化和分析。这些技术和多肽分析所需的其它技术包括以下文献所列的：R.Scopes，Protein Purification(蛋白质纯化)，S-V公司，纽约(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology Vol.182：Guide to Protein Purification(酶学方法第182卷：蛋白质纯化指南)，学术出版社公司.纽约.(1990)；Sandana(1997)Bioseparation of Proteins(蛋白质的生物分离)，学术出版社公司；Bollag等，(1996)Protein Methods(蛋白质方法)，第2版，W-L公司，纽约；Walker (1996)The Protein Protocols Handbook(蛋白质方案手册)休玛娜出版社，新泽西州；Harris和Angal(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach(蛋白质纯化应用：实用方案)IRL牛津出版社(IRL Press atOxford)，牛津，英格兰；Harris和Angal Protein Purification Methods：A Practical Approach(蛋白质纯化应用：实用方案)IRL牛津出版社，牛津，英格兰；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice 3rd Edition(蛋白质纯化：原理和实践，第三版)S-V公司，纽约；Janson和Ryden(1998)Protein Purification： Principles，High Resolution Methods and Applications，Second Edition(蛋白质纯化：原理、高分辨方法和应用，第二版)W-V公司(Wiley-VCH)，纽约；和Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM(蛋白质方案-光盘版)休玛娜出版社，新泽西州；和其中引用的参考文献。

表达和分离还原酶蛋白，例如大肠杆菌RNR的其它细节描述于下文的实施例中。

检测还原酶中NH ₂ Y的方法

以下实施例1提供了检测还原酶中NH₂Y残基，例如检测NH₂Y残基掺入，和例如作为检测自由基形成的分子探针的细节。可用的两种常规方法包括EPR光谱学和图谱分析，例如采用UV-可见光光谱学。这些方法常规可用，技术人员熟悉它们在检测氨基酸残基、自由基和感兴趣的其它部分中的应用。

电子顺磁共振(EPR)也称为电子自旋共振(ESR)和电子磁共振(EMR)是一种光谱学形式，其可用于检测和鉴定自由基和顺磁中心。EPR光谱学检测当未成对电子置于强的静磁场B₀并接触与B₀垂直的低振幅、高频率磁场B₁时，其吸收的微波辐射。在许多情况中，高度不稳定的自由基可通过EPR特征性的自旋捕获而稳定。事实上，优选将EPR自旋-捕获应用于检测和分析金属蛋白产生的自由基中间体，例如本文所述的某些RNR还原酶。

与之相关地，快速冷冻猝灭(RFQ)EPR可用于检测EPR活性的反应中间体，例如自由基形成和分解的动力学。RFQ EPR要求在反应进行特定时间后通过快速冷冻和维持低温抑制该反应，例如RNR催化的反应。然后通过EPR分析捕获的物质。该方法优选应用于检测，例如本发明重组还原酶形成的NH2Y自由基。简言之，在RFQ EPR中，将反应物快速混合在一起，反应进行预定的时期，例如毫秒到秒的时间量程。将混合物快速喷入，例如维持于-140℃的液体异戊烷来终止或猝灭反应。反应猝灭后形成的晶体压入EPR管，随后获得EPR光谱以测定所监测自由基的动力学和结构。

EPR技术的其它细节可见Weil和Bolton(2007)Electron Paramagnetic Resonance：Elementary Theory and Practical Applications Second Edition(电子顺磁共振：基础理论和实际应用，第二版)，威利公司(Wiley)和

等，(1996)“Electron Paramagnetic Resonance and Nuclear Magnetic Resonance Studies ofClass I Ribonucleotide Reductase(I类核糖核苷酸还原酶的电子顺磁共振和核磁共振研究)”Annu Rev Biophys Biomolec Struct 25：259-286。还可采用其它共振方法，例如核磁共振(NMR)分析还原酶蛋白中的NH₂Y残基。NMR技术的总体讨论参见，例如Introduction to Solid-State NMR Spectroscopy(固相NMR光谱学的导言)(2004)Melinda J.Duer(编)，威利出版社。

例如，还可采用包括停流光谱学在内的其它光谱学方法获得在，例如RNR-催化反应期间的自由基形成和/或传播的动力学数据。分析还原酶蛋白中NH₂Y残基的机制作用和/或监测还原酶反应动力学可用的UV-可见光光谱学和其它光谱学技术的讨论见，例如Tong等，(1998)“Characterization of Y122F R2 ofEscherichia coli Ribonucleotide Reductase by Time-Resolved Physical BiochemicalMethods and X-ray Crystallography(通过时间辨析的物理生物化学方法和X-射线晶体学表征大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的Y122F R2)”Biochem 37：5840-5848；Lassman等，(2005)“An advanced EPR stopped-flow apparatus based on adielectric ring resonator(基于介电环谐振器的高级EPR停流设备)”J Mag Res172：312-323；Pavia(1996)Introduction to Spectroscopy：A Guide for Students of Organic Chemistry(光谱学导言：有机化学学生指南)，哈考特大学出版社(Harcourt College Pub)；Sorrel(1998)Interpreting Spectra of Organic Molecules(有机分子的图谱解析)大学科学书籍公司(University Science Books)；和Mohan(2007)Molecular Spectroscopy：An Introduction(分子光谱学：导言)ISBN：978-81-7319-549-5。

术语定义的其它细节

“还原酶”是催化还原反应的酶。由于这种酶催化任一方向的反应，大多数还原酶在适当条件下可用作还原酶或氧化酶；因此，术语“氧化还原酶”也用于描述这种结构多样性的广泛酶家族。本发明可用的还原酶的例子包括酶学委员会编号(EC编号)为“EC1”的那些。还原酶类别的其它细节如本文它处所述。

衍生自：本文所用的术语“衍生自”指从某特定分子或生物体分离或利用该特定分子或生物体，或来自该特定分子或生物体的信息制备的组分。例如，衍生自第二多肽的多肽可编号与该第二多肽的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列，例如除了在该第二多肽中掺入非天然氨基酸。以多肽为例，可通过，例如诱变获得衍生的物质。用于衍生多肽的诱变可以是有意定向的或无意随机的，或二者的组合。诱变多肽以产生衍生自第一种的不同多肽可以是随机事件(例如，聚合酶失真所致)，可通过合适的筛选方法，例如本文所述的鉴定衍生的多肽。诱变多肽通常要求操作编码该多肽的多核苷酸。

可通过检测分子之间的同源性来鉴定一种蛋白质或核酸序列自另一种的衍生情况。当两种分子衍生自共同的祖先分子时，称二者是同源的。一般通过检测序列相同性或相似性来检测同源性。通过评估序列相同性或相似性来识别同源性的精确截断值有所不同，但通常在序列相似性低至约25％时鉴定同源性。较高的相似性百分比，例如35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％、98％或更高可用于鉴定同源性。可利用公众可得的程序，例如BLASTP(对于蛋白质)和BLASTN(对于核酸)鉴定序列相似性/相同性，例如采用默认参数(BLASTP和BLASTN可从，例如NCBI普遍获得，例如ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/blast的万维网)。

正交：本文所用的术语“正交”指与某细胞或翻译系统的内源性相应分子(tRNA或RS)相比，与该细胞内源性组分的作用差或根本不起作用的分子，例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)。正交组分可有用地作为关联组分提供，例如，提供的O-RS可有效氨酰化细胞中的关联O-tRNA，即使作为该细胞的内源性RS的底物，该O-tRNA作用差或根本不起作用，而O-RS与该细胞的内源性tRNA作用差或根本不起作用。可评估正交和内源性组分的各种比较性效率。例如，在典型的生理条件下，作为内源性RS的底物O-tRNA通常显示差或不持久的活性，例如作为底物，O-tRNA对于任何内源性RS的效率低于内源性tRNA的10％，一般低于5％，通常低于1％。同时，该tRNA作为该O-tRNA的底物可以是高度有效的，例如是任何内源性tRNA作为氨酰化底物对其内源性RS的效率的至少50％、常是75％、95％或甚至100％或更高。

正交氨酰基-tRNA合成酶：本文所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)是在感兴趣翻译系统内用氨基酸优先氨酰化O-tRNA的酶。在本发明中，O-RS加载到O-tRNA上的氨基酸是3-氨基酪氨酸酸(NH₂Y)。

正交-tRNA：本文所用的正交tRNA(O-tRNA)是与感兴趣翻译系统正交的tRNA。该O-tRNA可加载有，例如3-氨基酪氨酸，或处于非负载状态。还应知道O-tRNA任选被关联正交氨酰基-tRNA合成酶加载3-氨基酪氨酸。应该知道，实际上本文所述的O-tRNA用于在翻译期间对选择者密码子起反应而将3-氨基酪氨酸插入延伸的多肽。

关联：术语“关联”指共同起作用的组分，例如正交tRNA和正交氨酰基-tRNA合成酶。这些组分也可互称为“互补的”。

优先氨酰化：对于本文所用正交翻译系统，当某表达系统中O-RS使O-tRNA带上3-氨基酪氨酸的效率高于其加载任何内源性tRNA的效率时，该O-RS“优先氨酰化”关联O-tRNA。即，当翻译系统中存在摩尔比大致相等的O-tRNA与任何给定的内源性tRNA时，O-RS加载O-tRNA的频率高于它加载内源性tRNA的频率。当翻译系统中存在等摩尔浓度的O-tRNA与内源性tRNA时，O-RS加载的O-tRNA与O-RS加载的内源性tRNA的相对比例优选较高，最好导致O-RS仅加载或几乎仅加载O-tRNA。当存在等摩尔浓度的O-tRNA与O-RS时，O-RS加载的O-tRNA与内源性tRNA的相对比例大于1∶1，优选至少约2∶1，更优选5∶1，更优选10∶1，更优选20∶1，更优选50∶1，更优选75∶1，更优选95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。当(a)与内源性tRNA相比，O-RS优先氨酰化O-tRNA，和(b)与O-RS用任何天然氨基酸氨酰化O-tRNA相比，氨酰化对3-氨基酪氨酸特异时，称O-RS“用3-氨基酪氨酸优先氨酰化O-tRNA”。例如，当包含本文序列表所示相关O-RS和本文序列表所示相关O-tRNA的翻译系统中存在等摩尔量的3-氨基酪氨酸和天然氨基酸时，O-RS用3-氨基酪氨酸加载O-tRNA的频率高于加载任何天然氨基酸的频率。加载有3-氨基酪氨酸的O-tRNA与加载有天然氨基酸的O-tRNA的相对比例优选较高。O-RS最好使O-tRNA仅仅加载，或者几乎仅仅加载有3-氨基酪氨酸。当翻译系统中存在等摩尔浓度的天然氨基酸和3-氨基酪氨酸时，使O-tRNA带上3-氨基酪氨酸与使O-tRNA带上天然氨基酸的相对比例大于1∶1，优选至少约2∶1，更优选5∶1，更优选10∶1，更优选20∶1，更优选50∶1，更优选75∶1，更优选95∶1、98∶1、99∶1、100∶1、500∶1、1,000∶1、5,000∶1或更高。

选择者密码子：术语“选择者密码子”指翻译过程中O-tRNA识别但内源性tRNA不识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择者密码子并在多肽的此位置掺入其所负载的氨基酸，例如3-氨基酪氨酸。选择者密码子可包括，例如无义密码子，如终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)；四碱基或四碱基以上密码子；罕用密码子；非编码密码子；和衍生自天然或非天然碱基对的密码子，等等。

抑制活性：本文所用的术语“抑制活性”总体上指tRNA(例如，抑制型tRNA)翻译连读在其它情况中可导致翻译终止或错译(例如，移码)的密码子(例如，作为选择者密码子的琥珀密码子或四个或以上个碱基的密码子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表示为与第二抑制型tRNA，或与对照系统，例如缺乏O-RS的对照系统相比，观察到的翻译连读活性的百分比。

抑制型tRNA：抑制型tRNA是在多肽翻译期间通常对终止密码子起反应而掺入氨基酸(即，“连读”)来改变给定的翻译系统中信使RNA(mRNA)阅读的tRNA。在一些方面，本发明的选择者密码子是抑制型密码子，例如，终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)、四碱基密码子、罕用密码子等。

翻译系统：术语“翻译系统”指将氨基酸掺入延伸中的多肽链(蛋白质)的各组分。翻译系统的组分可包括，例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等。本发明的O-tRNA和/或O-RS可加入体外或体内翻译系统或是其一部分，例如存在于非真核细胞，如细菌(如大肠杆菌)中，或存在于真核细胞中，如酵母菌、哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞等。

非天然氨基酸：本文所用的术语“非天然氨基酸”指不在20种常见天然氨基酸之列的任何氨基酸，修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。例如，本发明可使用非天然氨基酸，3-氨基酪氨酸。

实施例

实施例1：将3-氨基酪氨酸位点特异性插入大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的亚基α2中：Y₇₃₀和Y₇₃₁参与自由基传播的直接证据

大肠杆菌核糖核苷酸还原酶(RNR)利用复杂的自由基化学反应催化产生脱氧核苷酸。活性RNR由两个亚基：α2和β2的1∶1复合物构成。α2结合核苷二磷酸底物和脱氧核苷酸/ATP变构效应物，其是核苷酸还原的位点。β2含有启动脱氧核苷酸形成的稳定二铁(diiron)酪氨酰自由基(Y₁₂₂·)辅因子。有人提出该过程包括在＞35

距离上，在β2的Y₁₂₂·和α2活性位点中的C₄₃₉之间的可逆自由基传播。根据各亚基的结构，α2β2的对接模型提示自由基引发涉及瞬时途径，芳族氨基酸自由基中间体，包含α2中的Y₇₃₀和Y₇₃₁。在该项研究中，通过用3-氨基酪氨酸(NH₂Y)位点特异性替代来研究残基Y₇₃₀和Y₇₃₁的功能。采用体内抑制型tRNA/氨酰基-tRNA合成酶方法，高保真地产生Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2，产量为4-6毫克/克细胞浆液。在有β2、CDP和ATP存在下，通过停流UV-可见光和EPR光谱学方法检测中心突变体。结果显示以动力学有效的方式形成NH₂Y自由基(NH₂Y₇₃₀·或NH₂Y₇₃₁·)。活性试验证明两种NH₂Y-α2制备脱氧核苷酸。这些结果显示NH₂Y·可氧化C₄₃₉，从而提示α2内自由基传播途径的氢原子转移机制。观察到的NH₂Y·可以构成转换期间所述自由基传播途径的氨基酸自由基中间体的第一检测结果。

引言

在所有生物体中，核糖核苷酸还原酶(RNR)催化核苷酸转化成2’-脱氧核苷酸，从而提供DNA生物合成和修复所需的前体^1-3。在所有RNR中，核苷酸还原的机制是保守的，要求形成瞬时的活性位点含硫自由基(C₄₃₉·，文本中通篇使用大肠杆菌RNR编号)^4，5。然而，活性位点含硫自由基产生的机制(自由基引发事件)不是保守的，从而为区分四类RNR提供基础^6-9。主要的未解决机制问题是I类RNR和估计是最近鉴定的IV类RNR的含硫自由基形成。在本文中，我们报道了3-氨基酪氨酸(NH₂Y)位点特异性掺入大肠杆菌RNR，并通过这些突变体了解了自由基引发的机制。

大肠杆菌I类RNR由两个同二聚亚基，α2和β2构成，该二亚基在转换期间形成活性1∶1复合物^10-12。α2是该复合物的工作端。其含有发生含硫自由基介导核苷酸还原的活性位点以及调节底物特异性和转换率的多个变构效应物结合位点¹³。β2提供在α2的活性位点中形成瞬时C₄₃₉·所需的稳定二铁酪氨酰自由基(Y₁₂₂·)^14-16辅因子^4-6。现已清楚α2^6，17和β2^18，19的结构，含有两个亚基的结构也已见报道²⁰。然而。活性α2β2复合物的结构尚未知。Uhlin和Eklund根据形状和电荷互补性以及保守的残基，从α2和β2各自的结构出发设计了α2β2复合物的对接模型⁶。该模型提示β2中的Y₁₂₂·离α2中的C₄₃₉＞35

(图1)^21-23。在这种长距离上的自由基传播需要瞬时氨基酸中间体的参与^24-26。提出参与该途径的残基在所有I类RNR中是普遍保守的。

最近利用基于机制的抑制剂(mechanism based inhibitor)，从脉冲电子-电子双共振光谱检测²⁷获得了支持Y₁₂₂·和C₄₃₉之间长距离的证据^28-32。该研究获得的距离与对接模型一致，从而确定未发生使β2中的Y₁₂₂·毗邻α2中的C₄₃₉的大构象改变³²。

为检查所提出途径的有效性，进行了定点诱变^33，34和互补研究³⁵。这些研究证明图1中的各残基在RNR功能中起重要作用。然而，这些突变体没有活性妨碍了机制研究^33，34。

目前，有实质性证据证明只有一个提出的途径残基，即Y₃₅₆参与。证明该残基的参与特别重要，因为其位于β2的无序区域内，因此其与β2中的W₄₈和α2中的Y₇₃₁的距离长且未知(图1)。我们最近采用表达蛋白质连接方法将非天然氨基酸掺入残基356处，从而产生提供机制信息的突变体^36，37。在一个变体中，用自由基捕获剂3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)替代Y₃₅₆ ³⁸。有底物和/或效应物存在下，DOPA₃₅₆-β2和α2的研究显示DOPA自由基(DOPA·)以动力学有效的方式形成，从而证明残基356是氧化还原-活性的³⁸。我们还利用DOPA异二聚体DOPA-ββ′(其中β′-单体缺乏C-末端22个残基)显示，残基356反向空穴迁移至Y₁₂₂ ³⁹。然而，Y₃₅₆的氧化还原作用的最引人注目的证据来自一系列半合成的F_nY₃₅₆-β2，其中氟酪氨酸类似物(F_nYs，n＝2，3或4)位点特异性地插入该残基^40-43。这些F_nY₃₅₆-β2衍生物能系统性调节该残基的还原电位和pK_a，即，了解该途径内质子-偶联电子转移的作用的关键^21，40。F_nY₃₅₆-β2的活性试验显示自由基引发，和由此导致的核苷酸还原是根据F_nY和Y之间还原电位的差异而开启或关闭⁴³。此外，我们通过调节F_nY-β2中的pK_a证明自由基转运期间该残基的电子和质子之间没有专性偶联⁴³。由此，利用半合成β2的研究确定了残基356在自由基传播中的功能和机制。

相反，α2残基Y₇₃₀和Y₇₃₁在自由基传播中的作用仍不清楚。诱变研究证明它们在RNR功能中的重要性^34，44，45。然而，与β2中的残基Y₃₅₆一样，这些突变体(Y₇₃₀F-α2和Y₇₃₁F-α2)没有活性妨碍了研究Y₇₃₀和Y₇₃₁在自由基传播中的作用。此外，鉴于专性残基的位置，通过表达蛋白质连接不可能将非天然氨基酸掺入α2。因此，我们找寻替代方法来位点特异性地掺入非天然氨基酸。

目前，我们报道了NH₂Y-特异性詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)氨酰基-tRNA合成酶(NH₂Y-RS)及其与合适的詹氏甲烷球菌琥珀抑制型tRNA一起体内应用从而将NH₂Y掺入α2亚基中的残基Y₇₃₀和Y₇₃₁处^46-50。选择NH₂Y作为探针是因为其还原电位(pH 7.0时是0.64V，参见图1，示意图1)⁵¹比Y的低0.19V，从而表示其可用作类似于DOPA的自由基捕获剂，并直接报道了残基Y₇₃₀和Y₇₃₁参与空穴迁移(图1)。此外，NH₂Y比DOPA对氧化更稳定，因而是更实际的靶标^51，52。采用该方法，产生了100mg的各NH₂Y-α2。Y₇₃₀NH₂Y-α2(或Y₇₃₁NH₂Y-α2)与α2、底物和变构效应物温育导致以动力学有效方式形成NH₂Y自由基(NH₂Y·)，如停流(SF)UV-可见光和EPR光谱学所示。NH₂Y-α2保留了产生脱氧核苷酸的能力，提示观察到的NH₂Y·是在核苷酸还原有效的复合物中的自由基传播期间产生。这些结果提示直接氢原子转移是α2内空穴迁移的工作机制。

材料与方法

材料.Luria Bertani(LB)培养基、Bacto琼脂、2YT培养基及大小两种直径(100和150mm)的培养皿购自B-D公司(Becton-Dickinson)。NH₂Y、M9盐、四环素(Tet)、卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、L-阿拉伯糖(L-Ara)、氯霉素(Cm)、L-亮氨酸(Leu)、D-生物素、硫胺素HCl、ATP、胞苷-5′-二磷酸(CDP)、NADPH、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘油、Bradford试剂、葡聚糖G-25、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、硫酸链霉素、羟基脲、2′-脱氧胞苷和2′-脱氧胍-5′-三磷酸(dGTP)购自西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、DL-二硫苏糖醇(DTT)和T4 DNA连接酶购自普罗迈格公司(Promega)。DH10B感受态细胞和寡核苷酸购自英杰公司(Invitrogen)。利用斯特拉她基因公司的快变试剂盒(Quickchange Kit，Stratagene)进行定点诱变。小牛-肠碱性磷酸酶(CAP，20U/μL)购自罗氏公司(Roche)。KpnI和XboI限制性酶购自NEB。pTrc载体由麻省理工学院生物系(DepartmentofBiology，M.I.T.)的Sinskey教授馈赠。大肠杆菌硫氧还蛋白⁵³(TR，40单位/毫克)、大肠杆菌硫氧还蛋白还原酶⁵⁴(TRR，1400单位/毫克)和野生型β²⁵⁵(6200-7200纳摩尔/分钟·毫克，每个二聚体1-1.2个自由基)的纯化已见描述。采用ε_280nm＝189mM^-1cm^-1测定α2、Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2的浓度。甘油基本培养基亮氨酸(GMML)的终浓度为1％(v/v)甘油、1×M9盐、0.05％(w/v)NaCl、1mM MgSO₄、0.1mM CaCl₂和0.3mM L-亮氨酸。RNR试验缓冲液由50mM Hepes、15mM MgSO₄、1mM EDTA，pH 7.6构成。

通过LC-MS定量检验NH₂Y的细胞摄取.如前所述稍作变动进行摄取试验48。37℃，在有1mM NH₂Y和0.1mM DTT存在下，用GMML培养DH10B大肠杆菌细胞至饱和，随后收集并如常规一样裂解。对粗提物进行层析：ZorbaxSB-C18(5μm，4.6×150mm)柱，线性梯度为5％-25％MeCN的0.1％TFA溶液，8分钟，0.5毫升/分钟。在这些条件下，NH₂Y大致在13％MeCN洗脱。对于HPLC-ESI-MS分析，用水制备NH₂Y标准溶液。

大肠杆菌中NH₂Y-RS的定向开发.如以前所述进行正和负选择⁴⁸。简言之，质粒pBK-JYRS在大肠杆菌GlnRS启动子的控制下编码詹氏甲烷球菌TyrRS变体的文库，所述变体在Tr结合缺口6.5内的6个残基处随机化，该质粒含有Kan^R标记⁴⁶。质粒pREP/YC-J17用于正选择⁵⁶；其编码含非必需琥珀突变，Asp₁₁₂TAG的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因，和含两个非必需琥珀突变，Met₁TAG和Gln₁₀₇TAG的T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)基因。其还含有由TyrRS文库加载的关联突变型tRNA_CUA(mutRNA_CUA)的基因；GFPuv基因，其表达由T7 RNAP驱动；和Tet^R标记。质粒pLWJ17B3用于负选择^57，58；其在Ara启动子控制下编码含有三个非必需琥珀突变，Gln₂TAG、Asp₄₄TAG和Gly₆₅TAG的毒性芽孢杆菌RNA酶基因。其还含有mutRNA_CUA基因和Amp^R标记(表1)。

在各正选择轮次中，将含有突变型TyrRS文库的pBK-JYRS质粒文库通过电穿孔转化入含有质粒pREP/YC-J17的大肠杆菌DH10B感受态细胞⁴⁸。37℃，使细胞在SOC培养基中恢复1小时。然后用GMML洗涤它们两次，涂布在6-8块含有12μg/mL Tet、25μg/mL Kan、60μg/mL氯霉素(Cm)、1mM NH₂Y和100μM DTT的GMML琼脂平板上(150mm)。DTT包含在所有含NH₂Y的溶液或平板中以维持还原环境。37℃，温育平板72小时。从平板上刮下存活的细胞，合并入GMML液体培养基。然后利用恰根迷你制备试剂盒(QiagenMiniprep Kit)对细胞进行质粒分离。通过琼脂糖凝胶电泳从pREP/YC-J17(约10kb)分离pBK-JYRS文库(约3kb)，并用恰根凝胶提取试剂盒(Qiagen GelExtraction Kit)从凝胶中提取。采用OD_260nm定量测定质粒DNA。

为进行负选择，通过电穿孔将从正选择分离的质粒DNA转化入含有pLWJ17B3的大肠杆菌DH10B感受态细胞⁴⁸。细胞在SOC培养基中恢复，37℃震荡1小时，涂布于含有100μg/mL Amp、50μg/mL Kan和0.2％L-Ara的LB琼脂板上。37℃，温育诸平板10-12小时。如上所述回收存活细胞并分离质粒。

总共6轮(3次正选择和3次负选择)后，将细胞分布在两套平板上进行第4轮正选择。一套含有正轮次所述的NH₂Y/DTT，另一套只含有DTT。检测两套平板的GFPuv绿色荧光染色差异，其表达由正选择质粒上的T7 RNAP驱动(表1)。从含有NH₂Y/DTT的平板选择总共48个单菌落，将它们接种入96孔板的100μL GMML中。在有和没有1mM NH₂Y存在下，将各1毫升的所得细胞悬液涂布在含有0、20、40、60、80和110μg/mL Cm及0.1mM DTT的两套GMML平板上。37℃，温育诸平板72-120小时。候选克隆能在含NH₂Y/DTT和高浓度Cm(约100μg/mL)的平板上存活并在紫外光下放出绿色荧光，但在没有NH₂Y而Cm浓度低(20μg/mL)的平板上死亡。将候选克隆接种入含有24μg/mL Tet和50μg/mL Kan的5mL 2YT培养基，生长至饱和。然后如上所述分离质粒DNA，通过DNA测序分析。通过上述方法选择的含NH₂Y-RS基因的质粒是pBK-NH₂Y-RS。

表达-K₇NH₂Y-Z-结构域.利用A蛋白的C-末端His-标记Z-结构域(Z-结构域)检验利用pBK-NH₂Y-RS掺入NH₂Y的效率)，如前所述⁴⁸。将在残基7处含有琥珀终止密码子和mutRNA_CUA的编码Z-结构域的LEIZ^57，59和pBK-NH₂Y-RS共同转化入BL21(DE3)感受态细胞。所有的培养在37℃，有Kan(50μg/mL)和Cm(35μg/mL)存在下进行。将单菌落接种入5mL 2YT培养基并生长至饱和(约13小时)。用25mL 2YT培养基稀释1mL这种饱和的培养液，生长过夜至饱和(约11小时)。然后各用2×250mL GMML培养基稀释10ml这种培养液。当OD_600nm达到0.65时(9小时)，给培养液之一补充NH₂Y和DTT(终浓度分别为1mM和0.1mM)；另一培养液只补充DTT(0.1mM)。加入NH₂Y/DTT(或DTT)后15分钟，向各培养液中加入IPTG至终浓度为1mM。5小时后，通过离心收集细胞。然后通过Ni²⁺亲和力层析纯化有和没有NH₂Y存在下培养的Z-结构域，如前所述，随后进行SDS PAGE和MALDI-TOFMS分析⁴⁸。对于MALDI-TOF MS分析，Z-结构域通过透析交换入水中，随后由斯克利普斯质谱中心(Scripps Center for Mass Spectrometry)以正电离模式获得质谱。

克隆pTrc-nrdA.为产生载体pTrc-nrdA，利用Pfu Turbo聚合酶，用引物1，例如SEQ ID NO：1(5′-AT AAT TGG TAC CCA A AA ACA GGT ACG ACATAC ATG AAT C-3′)和2，例如SEQ ID NO：2(5′-GCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG ATC CCC CCT TCT TAT C-3′)扩增nrdA基因。这些引物分别在基因的5’和3’端含有KpnI和XboI切割位点(下划线所示)。利用恰根公司的PCR纯化试剂盒(PCR Purification Kit，Qiagen)纯化片段。然后温育分离的DNA与KpnI和XboI，用琼脂糖凝胶分离得到的产物并用恰根凝胶提取试剂盒提取。将基因片段连接入已用洗脱的限制性酶切割的pTrc。16℃，以3∶1的比例温育插入物-载体并用T4 DNA连接酶连接，持续30分钟，获得pTrc-nrdA。

如以前从质粒pMJ1-nrdA表达所述，在BL21(DE3)细胞中从载体pTrc-nrdA表达野生型α2，每升培养液获得3g湿细胞浆液^55，62。纯化α2(见下文)从每克湿细胞浆液获得10mgα2，分光光度法RNR试验所测定到纯度＞95％，比活性为2500纳摩尔/分钟·毫克(见下文)。

产生pTrc-nrdA₇₃₀TAG和pTrc-nrdA₇₃₁TAG.利用斯特拉塔基因公司块变试剂盒将TAG密码子插入载体pMJ1-nrdA中nrdA基因的的730或731位。利用引物3，例如SEQ ID NO：3(5′-G GTC AAA ACA CTG TAG TAT CAGAAC ACC CG-3′)和4，SEQ ID NO：4(5′-CG GGT GTT CTG ATA CTA CAGTGT TTT GAC C-3′)将TAG掺入α2的730位。利用引物5，例如SEQ ID NO：5(5′-G GTC AAA ACA CTG TAT TAG CAG AAC ACC CG-3′)和6，例如SEQID NO：6(5′-CG GGT GTT CTG CTA ATA CAG TGT TTT GAC C-3′)用于将TAG掺入α2的731位。在MIT生物聚合物实验室(MIT Biopolymers Laboratory)测序整个基因来确认突变。然后用引物1和2扩增nrdA₇₃₀TAG和nrdA₇₃₁TAG基因，如野生型nrdA所述连接入载体pTrc。

克隆pAC-NH₂Y-RS.pAC载体类似于已描述的载体pSup，除了其含有Tet^R选择标记，而非Cm^R标记⁶³。此外，pAC-NH₂Y-RS含有glnS′启动子和rrnB终止子控制下的NH₂Y-RS基因及proK启动子和终止子控制下的6拷贝mutRNA_CUA基因。为产生pAC-NH₂Y-RS，利用PstI和NdeI限制性位点将NH₂Y-RS基因从pBK-NH₂Y-RS亚克隆入pAC载体，该两位点分别是NH₂Y-RS基因的3′和5′。

表达Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2.利用pTrc-nrdA₇₃₀TAG/pAC-NH₂Y-RS表达系统成功表达Y₇₃₀NH₂Y-α2，其中载体pTrc-nrdA₇₃₀TAG含有在730位具有琥珀密码子、在trp/lac(trc)启动子和rrnB终止子控制下的nrdA基因以及Amp^R标记。用载体pTrc-nrdA₇₃₀TAG和pAC-NH₂Y-RS转化大肠杆菌DH10B细胞，37℃，在含有Amp(100μg/rnL)和Tet(25μg/mL)的LB/琼脂平板上培养两天。所有液体生长培养基含有Amp(100μg/mL)和Tet(25μg/mL)，在摇床/孵育箱中以37℃、200rpm进行培养。将平板的单菌落接种入5mL 2YT培养基，生长至饱和(约2天)。然后用180mL 2YT培养基稀释5mL饱和培养液，生长至饱和(约1天)。然后将25mL该培养液接种入各含补加了D-生物素(1μg/mL)、硫胺素(1μg/mL)和1×重金属储备液的1L GMML培养基的6×6L锥形瓶。1000×重金属储备液中每升含有以下所述物质：⁶⁴500mgMoNa₂O₄·2H₂O、250mg CoCl₂、175mg CuSO₄·5H₂O、1g MnSO₄·H₂O、8.75gMgSO₄·7H₂O、1.25g ZnSO₄·7H₂O、1.25g FeCl₂·4H₂O、2.5g CaCl₂·2H₂O、1gH₃BO₃和1M HCl。当OD_600nm达到0.6(12-18小时)，分别加入NH₂Y和DTT至终浓度为1mM和0.1mM。15分钟后，加入IPTG至终浓度为1mM，持续培养4.5小时，在该时刻通过离心收集细胞，冷冻在液体N₂中并保存于-80℃。每升培养液通常获得1.5g湿细胞浆液。利用载体pTrc-nrdA₇₃₁TAG和pAC-NH₂Y-RS以相同方式表达Y₇₃₁NH₂Y-α2。

纯化Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2.通常从10g湿细胞浆液中纯化NH₂Y-α2。所有纯化步骤在4℃进行。将每克湿细胞浆液悬浮在5mL补加了1mM PMSF和5mM DTT的α2缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH 7.6)中。使细胞通过在14,000psi下操作的弗氏压碎器使之裂解。离心(15,000×g，35分钟，4℃)除去细胞碎片后，滴加0.2体积的含8％(w/v)硫酸链霉素的α2缓冲液以沉淀DNA。再搅拌混合物15分钟，离心(15,000×g，35分钟，4℃)除去沉淀的DNA。然后在15分钟期间，在每10mL上清液中加入3.9g固体(NH₄)₂SO₄(66％饱和)。将溶液再搅拌30分钟，离心分离(15,000×g，45分钟，4℃)沉淀的蛋白质。将沉淀物再溶解于最少量的α2缓冲液中，利用葡聚糖G-25柱(1.5×25cm，45mL)脱盐。将脱盐的蛋白质以0.5毫升/分钟的流速直接加载于已在α2缓冲液中平衡的dATP柱(1.5×4cm，6mL)。用10个柱体积的α2缓冲液洗涤柱。然后用3-4个柱体积的含10mM ATP、15mM MgSO₄和10mM DTT的α2缓冲液洗脱NH₂Y-α2。随后经葡聚糖G-25层析除去ATP。用液体N₂快速冻干蛋白质的小等份试样，保存于-80℃。每克湿细胞浆液通常能获得4-6mg纯NH₂Y-α2。

通过EPR光谱学方法监测NH₂Y-α2与β2、CDP和ATP的反应.将各变体(40μM)与35mM DTT在室温下温育40分钟产生预-还原的野生型-α2或NH₂Y-α2。加入羟基脲和额外的DTT至终浓度为15mM，室温下再温育20分钟。然后用已在试验缓冲液(见材料)中平衡的葡聚糖G-25柱(1.5×25cm，45mL)对各蛋白质脱盐。

将预-还原的NH₂Y-α2和ATP与野生型β2和CDP在试验缓冲液中混合得到终浓度分别为20-24μM、3mM、20-24μM和1mM。在液体N₂中手工猝灭反应10秒-12分钟。在化学检测设备科(Department of ChemistryInstrumentation Facility)，利用装配了充有液体N₂的石英指形杜瓦瓶的布鲁克ESP-300X-谱带分光光度计(Bruker ESP-300 X-band spectrometer)记录77K的EPR图谱。EPR参数如下所示：微波频率＝9.34GHz，功率＝30μW，调制幅度＝1.5G，调制频率＝100kHz，时间常数＝5.12毫秒，扫描时间＝41.9秒。利用WinEPR(布鲁克公司(Bruker))和内部编写的Excel程序分析得到的图谱。这些程序有助于从记录的图谱部分扣除未反应的Y₁₂₂·信号，从而产生NH₂Y·-α2的图谱。通过比较各曲线的二重积分强度评估Y·和NH₂Y·信号之比。利用Cu^II作为标准品定量测定EPR自旋⁶⁵。

通过停流(SF)UV-可见光谱学方法检测与β2、CDP和ATP形成NH₂Y·-α2的动力学.以图标所示λs采用PMT检测，利用应用光物理学DX.17MV仪器(Applied Photophysics DX.17MV instrument)检测SF动力学，该仪器装配了原数据升级装置(Pro-Data upgrade)。用Lauda RE106循环水浴将温度维持于25℃。将一个注射器内的预-还原Y₇₃₀NH₂Y-α2(或Y₇₃₁NH₂Y-α2)和ATP与第二注射器中的野生型β2和CDP在试验缓冲液中以1∶1的比例混合，从而获得终浓度分别为8-10μM、3mM、8-10μM和1mM。以分裂时间-基础模式(splittime-base mode)收集数据。所示时程是至少6条曲线的平均值。对于逐点重建Y₇₃₀NH₂Y·-α2和Y₇₃₁NH₂Y·-α2吸光度分布曲线，以5nm为间隔计算305-365nm之间2-4条曲线的平均值。对于Y₁₂₂·在该区域的吸光度，根据这些λs的公布ε^66-68校正吸光度改变，然后对λ作图。采用Y₁₂₂·的ε(ε_410nm＝3700M^-1cm^-1)⁶⁸并假定各摩尔Y₁₂₂·导致α2中形成一摩尔NH₂Y·来计算Y₇₃₀NH₂Y·-α2(10500M^-1cm^-1)和Y₇₃₁NH₂Y·-α2(11000M^-1cm^-1)的ε。利用OriginPro或KaleidaGraph软件进行曲线拟合。

RNR的分光光度法和放射性试验.如前所述进行分光光度法和放射性RNR试验^36，43。NH₂Y-α2的浓度是0.2、1或3μM；存在的β2是5-倍摩尔过量。[5-³H]-CDP(1190cpm/nmol)用于放射性试验。

通过EPR光谱学方法监测NH₂Y-α2与β2、N₃ADP和dGTP的反应.由SS公司(Scott Salowe)预先制备2′-叠氮基-2′-脱氧腺苷-5′-二磷酸(N₃ADP)⁶²。将预-还原的Y₇₃₀NH₂Y-α2(Y₇₃₁NH₂Y-α2或野生型α2)和dGTP与野生型β2和N₃ADP在试验缓冲液中混合，得到终浓度分别为20μM、1mM、20μM和250μM。20秒后，在液体N₂中手工猝灭反应。如上所述进行EPR数据获取和Cu^II的自旋定量测定。利用WinEPR(布鲁克公司)和内部编写的Excel程序分析得到的图谱。首先扣除已报道并且在此处随野生型α2/β2反应再次产生的N·信号对这些实验中观察到的信号进行去卷积(deconvolution)。然后，从该图谱中扣除未反应的Y₁₂₂·从而得到NH₂Y·-α2图谱。通过比较各曲线的二重积分强度来评估三种信号之比。

结果

NH₂Y的毒性和摄取.开发NH₂Y-特异性氨酰基-tRNA合成酶(RS)要求大肠杆菌摄入NH₂Y，要求其是无毒的并且任何内源性RS不将其掺入蛋白质。NH₂Y满足所有这三条要求。当DH10B大肠杆菌细胞在有NH₂Y(1mM)或NH₂Y和DTT(分别是1mM和0.1mM)存在下生长于液体GMML培养基中，通过HPLC和ESI-MS判断在所有细胞提取物中观察到NH₂Y⁴⁸。通过在有NH₂Y或NH₂Y/DTT存在下，在液体GMML培养基和琼脂平板上培养DH10B大肠杆菌细胞来评估NH₂Y的毒性。NH₂Y的存在未显著影响生长速度。然而，DTT的存在导致细胞的生长速度比只有NH₂Y存在下或没有NH₂Y/DTT存在下的慢25-35％。

开发NH₂Y-特异性RS.舒尔茨实验室(Schultz 1ab)开发了将非天然氨基酸掺入任何靶蛋白质的有力的体内方法^46-50。在该方法中，RS选自詹氏甲烷球菌TyrRS突变体的文库。关联琥珀抑制型詹氏甲烷球菌tRNA，muhRNA_CUA无需修饰，因为文库中mutRNA_CUA和RS之间的相互作用区域无变化⁶⁹。对已在Y结合缺口中和附近的6个残基处作随机化的RS文库进行迭代轮次的正和负选择：Tyr32、Leu65、Phe108、Gln109、Asp158和Leu162。正选择是依据有NH₂Y/DTT和关联tRNA存在下CAT基因中允许位点处琥珀终止密码子的抑制作用(表1)⁴⁶。存活克隆携带可利用宿主细胞翻译机制并对琥珀终止密码子起反应而掺入NH₂Y或其它氨基酸的RS。负选择是依据没有NH₂Y存在下毒性芽孢杆菌RNA酶中的三个琥珀密码子缺乏抑制作用(表1)⁷⁰。存活的克隆携带不对琥珀终止密码子起反应而掺入任何天然氨基酸的RS。

7轮选择后，检查48个菌落抑制琥珀终止密码子的能力。从最后的正选择(第7轮)挑取含有pBK-NH₂Y-RS和pREP/YC-J17的单菌落，涂布于含不同浓度Cm(0-110μg/mL)、有或没有NH₂Y的GMML琼脂上。有NH₂Y/DTT存在下能生长表明CAT基因中的琥珀密码子被掺入的NH₂Y抑制。此外，T7RNAP基因中的琥珀密码子以类似方式得到抑制，并驱动表达GFPuv，从而在用紫外光照射细胞时发出绿色荧光。所需的菌落是在高浓度Cm(约100μg/mL)和NH₂Y/DTT中生长并在照射后发出绿色荧光，但没有NH₂Y存在时在低Cm浓度(约20μg/mL)中死亡的那些菌落。测试的48个菌落中，2个符合这些标准而作进一步研究。

对这些菌落的质粒作DNA测序显示在随机位置含有以下残基的相同RS：Gln32、Glu65、Gly108、Leu109、Ser158和Tyr162。令人感兴趣的是，野生型詹氏甲烷球菌TyrRS的残基32是Tyr，其位于结合的Tyr配体的羟基邻位C-原子的2

之内，但其在选择的RS中是Gln^71，72。野生型詹氏甲烷球菌TyrRS的晶体结构提示Gln能容纳o-NH₂基团，可能提供有利的氢键相互作用。从这些克隆鉴定的RS用于所有后续实验。

表达K₇NH₂Y-Z-结构域.为检验所选RS掺入NH₂Y的效率和保真度，将在允许的Lys7残基处具有琥珀终止密码子的C-末端作His-标记的Z-结构域蛋白(Z-结构域)用作模型^57，73。有NH₂Y/DTT存在下在GMML培养基中表达，纯化后每升培养液获得5mg Z-结构域。SDS PAGE分析(图2，插入图)证明没有NH₂Y存在下，Z-结构域蛋白的表达量低于检测水平。对纯化的蛋白质作MALDI-TOF MS分析。以前的研究显示Z-结构域通过除去N-末端Met，然后酰化得到的N-末端氨基酸而作翻译后修饰⁵⁷。因此，对有NH₂Y/DTT存在下表达的Z-结构域作MALDI-TOF MS分析显示分子量＝7812、7854、7943和7985Da的四个峰(图2)。这些特征分别对应于K₇NH₂Y-Z-结构域减去第一个Met(MW_预计＝7813Da)、其酰化形式(MW_预计＝7855Da)、全长K₇NH₂Y-Z-结构域(MW_预计＝7944Da)及其酰化形式(MW_预计＝7986Da)。重要的是，未检测到K₇Y-Z-结构域(全长形式的MW_预计＝7929Da)。综合来看，Z-结构域的研究证明开发的RS对NH₂Y有特异性，其能有效掺入其靶蛋白。

NH₂Y-α2的表达和纯化.开发了NH₂Y-特异性RS并证实NH₂Y插入的效率和保真度后，我们找寻与NH₂Y掺入的质粒/宿主要求相容的α2的过表达系统。研究了几种不同的生长条件和表达系统以图尽可能提高α2表达和NH₂Y插入残基730。研究了在厌氧条件下或在有羟基脲存在下的生长以尽可能减少野生型β2与NH₂Y-α2反应，该反应可能导致NH₂Y·的过早捕获并破坏该探针。在前一情况中，在大肠杆菌中操作厌氧III类RNR，因此，野生型I类β2不表达^1，74。在后一情况中，有羟基脲存在导致I类β2中必需Y₁₂₂·的还原，因此其不能与NH₂Y-α2反应^75，76。还研究了温度操控以尽可能减少包涵体。

研究了三种不同的表达系统(细节见下文)：(1)pBK-NH₂Y-RS/pBAD-nrdA，(2)pBK-NH₂Y-RS/pMJ1-nrdA和(3)pAC-NH₂Y-RS/pMJ1-nrdA(参见表1)。利用系统(1)，观察到全长α2的表达水平是内源性α2的1.5-倍。利用系统(2)，只观察到截短的α2；利用系统(3)，截短α2的过表达伴有与α2的内源性水平相似的全长α2表达。不表达或低水平的表达可能是因为限制了细胞内的mutRNA_CUA和/或pBAD-nrdA和pMJ1-nrdA表达的α2水平低。

利用pTrc成功表达并将非天然氨基酸掺入大肠杆菌硝基还原酶的最近报道⁷⁷促使我们研究pAC-NH₂Y-RS/pTrc-nrdA表达系统。pTrc-nrdA载体携带trp/lac(trc)启动子控制下的α2基因，其在所需残基处含有琥珀终止密码子⁷⁸。重要的是，pAC-NH₂Y携带6拷贝的mutRNA_CUA，从而增加细胞内关联tRNA的浓度⁶³。

首先检查从pTrc-nrdA表达野生型α2。过量产生和后续纯化后每克湿细胞浆液获得10mg纯α2。该表达水平是我们实验室常规用于表达α2和α2突变体的从pMJ1表达α2的2到4倍。此外，α2的比活性类似于自pMJ1-nrdA产生(2500纳摩尔/分钟·毫克)。

用pAC-NH₂Y-RS和pTrc-nrdA双重转化的DH10B细胞表达Y₇₃₁NH₂Y-α2示于图3。有IPTG诱导物和NH₂Y/DTT存在下，琥珀终止密码子受抑制，NH₂Y-α2过量表达。没有NH₂Y存在下，只观察到截短的α2过量产生。最后，没有诱导物IPTG和NH₂Y存在下，α2未发生过量表达。Y₇₃₀NH₂Y-α2的表达类似(图13)。采用dATP亲和层析纯化NH₂Y-α2，每升培养液获得4-6mg靶蛋白，均质性＞90％^55，62。纯化过程中，突变型蛋白与野生型α2情况类似(图14)。

通过EPR光谱学方法监测NH₂Y-α2与β2、CDP和ATP的反应.有NH₂Y-α2可用使得我们能评估Y₇₃₀和Y₇₃₁在经β2-α2界面的自由基传播中的参与情况。实验设计根据以前用DOPA-β2建立的自由基捕获方法^38，39。在该方法中，用比Y更易氧化的非天然Y类似物捕获稳定的自由基。如果捕获需要有β2、底物和变构效应物存在，则其为该残基在自由基传播期间的氧化还原活性提供直接证据。缺乏自由基形成可表明该残基不是氧化还原活性的，或者氧化产物不稳定。我们提出NH₂Y易于氧化(pH 7时，E°比Y低190mV)将导致NH₂Y·产生，从而能通过UV-可见光和EPR方法检测⁵¹。NH₂Y·的光谱学表征以前未见报道。

根据我们对DOPA-β2的研究³⁸，我们估计在一定程度上，蛋白质环境可稳定NH₂Y·。利用DOPA-β2，5秒时产生最大量的DOPA·，其稳定2.5分钟38，39。因此，将Y₇₃₀NH₂Y-α2(或Y₇₃₁NH₂Y-α2)与野生型β2、底物(CDP)和效应物(ATP)混合，25℃温育不同时期(10秒-12分钟)，在液体N₂中手工猝灭。这些反应的EPR图谱揭示在10秒时间点，最大量中存在新信号(图4)。没有CDP或ATP的对照只显示Y₁₂₂·(图4，插入图)。因此，与以前DOPA-β2的相似研究观察到的一样，新信号的形成受控于底物和效应物的存在³⁸。

观察到的图谱是至少两种物质的复合物：未反应的Y₁₂₂·和推定的NH₂Y₇₃₀·。为揭示新自由基的特征，从复合信号中扣除具有明显的、良好表征的低场特征的Y₁₂₂·谱¹⁴。得到的几乎各向同性的信号(图4，虚线)的表观g_av为2.0043，峰-谷宽度为24G⁷⁹。我们将该新信号归属于NH₂Y₇₃₀·。

10秒(s)时间点的自旋定量测定显示8％的总起始自旋(相对于起始Y₁₂₂·)损失。其余自旋中，47％与Y₁₂₂·有关，53％与新信号有关。为进一步表征该信号，进行功率饱和研究(power saturation study)。Y₁₂₂·毗邻二铁簇，从而极大改变其舒张特性(relaxation property)。如果新自由基事实上位于α2内，如对接模型所示离该二铁簇＞35

则其P_1/2将极大降低。功率依赖性实验(power dependence experiment)的结果示于图5。按照方程1⁸⁰拟合数据，其中K是取决于样品和仪器的比例因子，P是微波功率，b是均一性(b＝3)或非均一性(b＝1)光谱增宽的指标，P_1/2是EPR信号半饱和时的微波功率^79，81。对于Y₁₂₂·，P_1/2测定为28±4mW，类似于以前检测的^81，82。新信号的饱和情况得到P_1/2为0.42±0.08，与远离二铁中心的自由基一致。

还用Y₇₃₁NH₂Y-α2进行类似实验。只有CDP/ATP存在下，还观察到新信号，即推定的NH₂Y₇₃₁·(图15)。扣除Y₁₂₂·图谱，显示与NH₂Y₇₃₀·的相似但不同的图谱(图6)。与NH₂Y₇₃₁·相关的几乎各向同性的信号包括g_av为2.0044和峰-谷宽度为22G。10秒时间点时，14％的总起始自旋损失。其余自旋中，45％与NH₂Y₇₃₁·相关，55％与Y₁₂₂·相关。

通过SF UV-可见光光谱学方法监测NH₂Y·-α2形成的动力学.进行前稳态实验以评估野生型RNR中NH₂Y·-α2形成的速度常数是否足够快，从而能进行核苷酸还原。监测核苷酸还原的大肠杆菌RNR的早先稳态和预-稳态动力学分析显示自由基传播之前有缓慢的构象改变⁸³。该缓慢的物理步骤产生在传播过程中形成的中间体。有CDP/ATP存在下，以及在本项研究所用的α2和β2浓度下，该构象改变的速度常数约4-17s^-1不等⁸³。dCDP形成的稳态速度常数的数量级为2s^-1，据信受到与dCDP形成相伴的活性位点二硫键再还原(re-reduction)，或再还原相关构象改变的限制。DOPA-β2的早先研究中，α2和CDP/ATP、DOPA·形成在两个快速动力学阶段(38.和6.8s^-1)和一个慢速阶段(0.7s^-1)中发生。因此，在DOPA-β2实验中，该两个快速阶段和可能的第三阶段⁸⁴对于限制第一转换中dCDP形成的构象改变是动力学有效的⁸³。

为监测NH₂Y·浓度的变化，必须测定其光谱和消光系数。我们首先假设其UV-可见光光谱与DOPA·的相似(λ_max为315nm，ε约为12000M^-1cm^-1)^38，85。在310-365nm之间，Y₁₂₂·相关消光系数低(ε约为500-1900M^-1cm^-1)，可用于光谱去卷积^66，67。因此，我们采用SF光谱学方法逐点分析新自由基的UV-可见光特性。将一个注射器中的Y₇₃₀NH₂Y-α2(或Y₇₃₁NH₂Y-α2)和ATP与第二注射器中的野生型β2和CDP混合，以5nm间隔监测305-365nm的吸光度。根据Y₁₂₂·的吸光度校正1.5秒时各λ的吸光度改变^66，67，然后对λ作图。结果示于图7，表明NH₂Y₇₃₀·和NH₂Y₇₃₁·具有类似但不同的吸光度特征。NH₂Y₇₃₀·的UV-可见光光谱包括宽特征，其中λ_max在325nm(ε约为10500M^-1cm^-1)。NH₂Y₇₃₁·光谱显示λ_max在320nm(ε约为11000M^-1cm^-1)以及350nm处更确定的肩峰。采用410nm处Y₁₂₂·的ε⁶⁸并假定每损失一摩尔Y₁₂₂·形成一摩尔NH₂Y·来测定NH₂Y·-α2的消光系数。

对于Y₇₃₀NH₂Y-α2，监测Y₁₂₂·损失(410nm)和NH₂Y·形成(325nm)的动力学的SF UV-可见光实验示于图8。在410nm，观察到双-指数动力学，其中速度常数为12.0±0.1s^-1和2.4±0.1s^-1，类似于在325nm获得的NH₂Y·形成的速度常数(13.6±0.1s^-1和2.5±0.1s^-1)。用Y₇₃₁NH₂Y-α2进行的类似实验显示Y₁₂₂·损失(17.3±0.2和2.3±0.1s^-1)与NH₂Y₇₃₁·形成(21.0±0.1s^-1和3±0.1s^-1，图16)相伴以双-指数方式发生。两种反应的速度常数和幅度总结于表2。在没有底物和效应物存在下，用Y₇₃₀NH₂Y-α2(或Y₇₃₁NH₂Y-α2)和β2进行对照实验。如EPR实验所示，相同条件下没有发生Y₁₂₂·损失或NH₂Y·形成。

如上所述，观察到的NH₂Y-α2的较快速度常数在RNR转换中是动力学有效的。因此，利用这些突变体的研究为它们参与自由基传播提供了直接证据。在DOPA-β2实验中还观察到慢速常数，其类似于RNR转换的稳态速度常数。下文讨论了该慢速阶段的可能解释。

最后，分析2秒时各自由基的含量显示利用Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2，分别消耗39％和35％的总起始Y₁₂₂·。相反，利用DOPA-β2，NH₂Y·不那么稳定。需要详细评估不稳定性，要求采用快速冷冻猝灭方法进行动力学分析以揭示其涉及的机制。

NH₂Y-α2的活性.最近，我们利用一系列F_nY₃₅₆-β2发现当残基356的还原电位比酪氨酸的高80-200mV时，核苷酸还原活性与其还原电位之间相关^40，43。DOPA的还原电位比Y低260mV(pH 7)，其中利用DOPA-β2³⁸的脱氧核糖核苷酸形成低于我们的检测极限。利用NH₂Y-α2，NH₂Y的电位比Y低190mV(pH 7)⁵¹。为检验该能障是否足够大从而能关闭自由基向C₄₃₉转移，以及由此的核苷酸还原，对NH₂Y-α2进行了活性试验。

通过间接(分光光度计试验)或直接(放射性试验)监测dCDP来测定活性。采用这些试验测定的活性总结于表3。结果显示Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2的核苷酸还原活性分别是野生型α2的4％和7％。观察到的活性可能是NH₂Y-α2固有的；另一方面，可能是因为共同纯化内源性野生型α2或宿主细胞因Tyr-加载的mutRNA_CUA替代NH₂Y-加载的tRNA_CUA的琥珀密码子抑制而产生的野生型α2。

为区分这两种可能性，进行利用N₃ADP的试验。N₃ADP是I类RNR的基于机制的抑制剂，其产生共价连接于核苷酸和α2活性位点中半胱氨酸的适度稳定的N-中心定位核苷酸自由基(N·)^28-31，86。该自由基可用于报道NH₂Y·产生C₄₃₉·并启动核苷酸上化学反应的能力。用N₃ADP/dGTP灭活野生型α2β2的早先研究提示在20秒的时间量程上，50-60％的起始Y₁₂₂·损失，从而导致形成等量的N·^30，62。因此，如果用NH₂Y-α2观察到的活性表明野生型α2，则估计有约2％和约3.5％的总起始Y₁₂₂·将分别与Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2形成N·。

将各NH₂Y-α2(或野生型α2)和dGTP与野生型β2和N₃ADP混合以进行利用N₃ADP的试验。20秒后，在液体N₂中手工猝灭反应。获得的Y₇₃₀NH₂Y-α2的EPR光谱示于图9。观察到的光谱是至少3个自由基的组合：Y₁₂₂·、NH₂Y₇₃₀·和N·。可利用这些区域内独特的光谱特征和光谱宽度中的差异使得光谱去卷积(图10)。因此，首先扣除N·光谱来分析数据，该光谱含有三种信号中最宽的。然后从得到的光谱部分扣除Y₁₂₂·组分，从而产生NH₂Y₇₃₀·信号。采用标准EPR定量测定方法测定各自由基的浓度⁶⁵。

该定量分析的结果示于表4。它们显示20秒时间点时18％的总自旋损失。其余自旋中，19±2％与N·有关；43％是Y₁₂₂·，39％是NH₂Y₇₃₀·。考虑到20秒后损失的自旋，15±2％的总起始Y₁₂₂·(即，t＝0时)导致N·形成。利用Y₇₃₁NH₂Y-α2(图17和表4)，20秒后25％的总自旋损失，其中20±2％表示N·，41％是Y₁₂₂·，而39％是NH₂Y₇₃₁·。考虑到20秒后损失的自旋，15±2％的总起始Y₁₂₂·导致N·形成。因此，预计如果稳态活性是污染的野生型α2所致，利用两种突变体观察到的N·量均超过2％或3.5％N·(分别对于Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2)。这些结果强烈提示NH₂Y-α2在C₄₃₉·形成中有效，因此在核苷酸还原中有效。

表1：本项研究所用的载体.

表2：NH₂Y·-α2形成的动力学数据总结.

^a报道的速度常数是在410nm(对于Y₁₂₂·损失)和在320nm(对于NH₂Y₇₃₁·形成)或325nm(对于NH₂Y₇₃₀·形成)检测的平均值。误差对应于这些检测值两两之间的标准偏差。^b Ampl，幅度；各动力学阶段捕获的Y₁₂₂·量表示占总起始Y₁₂₂·的百分数。由于依据Y₁₂₂·测定NH₂Y·的ε，410nm和320或325nm的幅度几乎相同。^c未观察到改变。

表3：通过检测脱氧核苷酸和N·形成监测NH₂Y-α2的活性.

^a活性报道为％野生型活性，其是2500纳摩尔/分钟·毫克。对于分光光度法试验，误差是3次独立检测值的标准偏差，对于放射性试验，误差是2次独立检测值的标准偏差。^bN·的量表示20秒时的％总自旋；误差与EPR自旋定量测定方法有关。^cN·的量表示为％总起始Y₁₂₂·；误差与EPR自旋定量测定有关。

表4：分析20秒时野生型α2或NH₂Y-α2与β2和N₃ADP/dGTP的反应.^a

             [自旋]_T    [N·]    [Y₁₂₂·]    [NH₂Y·]

α2变体

             (μM)^b     (μM)    (μM)       (μM)

野生型α2    22.9       11.9     11.0        -

Y₇₃₀NH₂Y-α2 19.5       3.7      8.4         7.6

Y₇₃₁NH₂Y-α2 18.1       3.6      7.5         7.1

^aEPR定量测定相关的误差约为10％。^b在各情况中，起始[Y₁₂₂·]是24μM。

pBAD-nrdA的克隆和TAG密码子的插入.载体pBAD-JYCUA获自舒尔茨实验室(参考文献61，文本)。利用NcoI和KpnI限制性位点，通过标准方法将nrdA基因从pMJ1-nrdA克隆入pBAD-JYCUA，从而产生pBAD-nrdA。如pTrc-nrdA所述，利用引物3-6将TAG密码子插入730和731位(参见方法)。在MIT生物聚合物实验室对整个基因进行测序来证实突变。

产生pMJ1-nrdA730TAG和pMJ1-nrdA731TAG.载体pMJ1-nrdA已有报道(参考文献60，文本)。如pTrc-nrdA所述，利用引物3-6将TAG密码子插入730和731位(参见方法)。在MIT生物聚合物实验室对整个基因进行测序来证实突变。

表达Y₇₃₀NH₂Y-α2的尝试.为尽可能提高含有NH₂Y的α2的产量，而不产生NH₂Y·，检查不同温度下、需氧和厌氧条件下以及培养基中含有羟基脲以还原野生型β2中的Y₁₂₂·下的生长情况。

在各情况中，利用DH10B或BL21(DE3)大肠杆菌细胞的单菌落接种少量的5mL 2YT培养基。饱和后，用2×100mL GMML培养基对该培养液作100-倍稀释。当OD_600nm约为0.6-0.8时以及下述改变后，给一个烧瓶补加NH₂Y和DTT至终浓度分别为1mM和0.1mM。另一生长情况用作对照。15分钟后，向两份100mL培养液中加入IPTG来诱导NH₂Y-α2表达(或者表达系统(1)加入0.2％(w/v)L-阿拉伯糖-参见下文)。规定是时间(5-12小时)后从各烧瓶取出少量试样，在有和没有NH₂Y/DTT存在下通过SDS PAGE分析评估α2的表达。

测试温度对Y₇₃₀NH₂Y-α2表达的影响时，少量培养液的生长情况与上述相同。当OD_600nm约为0.6-0.8时，将温度设置改变至25或30℃。15分钟后，加入NH₂Y和DTT，如上所述继续培养。

测试Y₁₂₂·-β2对Y₇₃₀NH₂Y-α2表达的影响时，少量培养液的生长情况与上述相同。当OD_600nm约为0.6-0.8时，加入羟基脲至终浓度为65mM。15分钟后，加入NH₂Y和DTT至终浓度分别是1mM和0.1mM。再过了15分钟后，如上所述进行诱导。诱导后的每一小时给培养液补加额外的15mM羟基脲。

测试O₂对Y₇₃₀NH₂Y-α2表达的影响时，少量培养液的生长情况与上述相同。当该少量培养液饱和时，在1L锥形瓶中用250mL含合适抗生素的2YT培养基对其作100-倍稀释。饱和时，在锥形瓶中用含合适抗生素的5-7L GMML培养基对其作50-倍稀释。当OD_600nm达到0.6-0.8时，将空气替换为N_2(气体)。15分钟后，加入NH2Y和DTT分别至终浓度为1mM和0.1mM，如上所述继续培养。

测试了几种表达系统：(1)研究了pBK-NH₂Y-RS/pBAD-α2表达系统，其中pBK-NH₂Y-RS携带在组成型大肠杆菌Gln-RS启动子和终止子控制下的NH₂Y-RS基因及Kan^R标记，而载体pBAD-α2携带含合适琥珀终止密码子并在L-Ara-诱导型启动子和rrnB终止子控制下的α2基因以及lpp启动子和rrnC终止子控制下的mutRNA_CUA基因及Tet^R标记；(2)检验了pBK-NH₂Y-RS/pMJ1-nrdA载体组合，其中载体pMJ1-nrdA携带含琥珀终止密码子并在T7启动子和终止子控制下的nrdA基因及Amp^R标记；(3)还检验了pAC-NH₂Y-RS/pMJ 1-nrdA系统，其中pAC-NH₂Y-RS携带在glnS′启动子和rrnB终止子控制下的NH₂Y-RS基因、六拷贝在proK启动子和终止子控制下的mutRNA_CUA基因及Tet^R标记(表1)。

讨论

产生Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2.在该项研究中，我们用NH₂Y位点特异性替换残基Y₇₃₀和Y₇₃₁而评估了它们在自由基传播中所提出的作用(图1)。我们采用体内抑制型tRNA/RS方法，该方法由舒尔茨实验室首创⁴⁶和开发^47-50，并宣称对蛋白质生物化学有极大影响。我们采用该技术开发了所需的tRNA/RS配对，从而能获得Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2，产量为每克湿细胞浆液4-6毫克。α2(172kDa)的大体积以及NH₂Y和Y之间体积差异小造成不能通过直接ESI或MALDI TOF质谱学方法定量评估NH₂Y掺入α2。目前开发了采用该172kDa蛋白质胰蛋白酶消化物的LC/MS的分析方法来评估NH₂Y-α2中NH₂Y相对于Y的水平。然而，我们利用模型Z-结构域蛋白质的研究表明NH₂Y的掺入是有效而特异性的。此外，采用N₃ADP和dCDP试验评估我们的NH₂Y-α2制品还提示有低水平的野生型α2存在。

能将NH₂Y位点特异性地掺入蛋白质会有广泛应用。我们表征NH₂Y·的UV-可见光和EPR光谱特性使得NH₂Y可用作据信在催化或金属核心之间的电子转移中利用瞬时Y·的酶的探针。此外，Francis及同事最近证明可用荧光染料衍生NH₂y^87，88。因此，NH₂Y还可用作将感兴趣探针位点特异性附加于靶蛋白的工具。

新自由基的结构分配.当有CDP/ATP存在下NH₂Y-α2与β2反应时，观察到新的EPR-活性信号。然而，如上所述，NH₂Y·的UV-可见光或EPR光谱特性以前均未见报道。我们将新信号分配给NH₂Y·是依据SF UV-可见光和EPR光谱学检测值结合对DOPA、儿茶酚和邻-氨基苯酚自由基特性的了解^89，90。首先，通过SF方法逐点重建新自由基的UV-可见光光谱显示吸收光谱类似于DOPA·，根据该两种氨基酸之间的结构相似性这点可以预见到。其次，从观察到的EPR信号扣除Y₁₂₂·EPR光谱，从而产生g_av为2.0043±0.0001的有机自由基典型的光谱。环质子和胺氮的小超精细偶联(＜10G)类似于早先报道的邻-氨基苯酚自由基⁸⁹。再次，通过功率饱和研究获得新自由基相对于二铁簇的定位的信息。这些研究显示P_1/2为28mW的Y₁₂₂·饱和是因其邻近二铁簇(距离该簇中最接近的铁4.6

)¹⁹。共价标记α2的活性位点(距离该簇＞35

)的基于机制的抑制剂的P_1/2值为0.16mW⁸²。新自由基的P_1/2为0.42±0.08mW，与远离二铁中心的物质一致。综合来看，这些数据强烈提示新自由基是NH₂Y·(图1，示意图1)⁹¹。正在进行的高场EPR和ENDOR实验、¹⁵N和²H的同位素标记研究结合计算研究进一步支持该分配。

NH₂Y·-α2形成的动力学.SF动力学研究得到Y₇₃₀NH₂Y-α2的速度常数为12.8和2.5s^-1，Y₇₃₁NH₂Y-α2的速度常数为19.2和2.7s^-1。较快速度常数表示限速构象改变，早先在野生型β2中发现单一转换条件下构象改变在自由基传播之前⁸³。因此，以动力学有效的方式形成NH₂Y·以Y₁₂₂·为代价³⁸。此外，与DOPA一样，NH₂Y用作构象探针，并能直接检测该物理步骤，报道NH₂Y-α2β2复合物的调控状态。检测DOPA₃₅₆·形成时，还在这些动力学研究中观察到慢速常数(不同底物/效应物配对为0.4-0.8s^-1)^38，84。这些速度常数均在同一范围内，类似于在这些实验所用蛋白质浓度下的RNS转换数。我们早先的研究提示在稳态，二硫键的再还原或该过程相关的构象改变是限速步骤。如果是后一种情况，则该速度常数为2-3s^-1，可能表示一种形式的RNR缓慢转变成活性更高的形式。或者，掺入NH₂Y可导致α2的酪氨酸类似物具有不快速互变的两种构象，或者α2本身具有两种不同构象。NH₂Y·形成的不同动力学阶段表明这两种构象在SF实验的时间量程上不互变。其它动力学分析可进一步指定观察到的慢速常数的性质。

NH₂Y-α2的活性试验.稳态转换检测值显示两种突变体均能产生dNDP。如上所述，该活性可能与内源性野生型α2有关，其与NH₂Y-α2共同纯化；或与Tyr-加载的tRNA_CUA替代NH₂Y而抑制琥珀密码子所产生的野生型α2有关。或者，该活性可能是NH₂Y-α2固有的。

为区分这些可能性，进行利用基于机制的抑制剂，N₃ADP的试验。结果表明Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2形成15±2％N·。这些值分别超过了预计的2％和3.5％，如果稳态转换是因野生型α2的背景水平所致的话。因此，这些结果提示NH₂Y-α2在核苷酸产生中有效。这暗示推定的NH₂Y·是活性自由基运输期间的中间体。毫秒时间量程上的详细动力学分析进一步检验了这种主张。如果是正确的，这些观察结果标志着在dNDP形成中有效的RNR变体的远程空穴迁移期间首次检测到氨基酸自由基。

涉及氧化机制.核苷酸还原中的能力对于Y₇₃₀NH₂Y-α2内的自由基传播具有令人感兴趣的机制。为NH₂Y₇₃₀·氧化C₄₃₉设想了三种机制：该反应可通过(1)分步过程，即电子转移后是质子转移，(2)正交质子-偶联电子转移(PCET)或(3)同线(co-linear)PCET(即，氢原子转移，图11)而发生^92-94。由于热化学偏好妨碍在非-极性α2活性位点中形成高能量负载中间体以及NH₂Y·/NH₂Y^-配对形成半胱氨酸阳离子自由基的能量壁垒不可克服，可排除分步过程的可能性(图11A)⁹³。正交PCET要求pH 7时E°为0.64V的NH₂Y·氧化pH 7时溶液还原电位(solution reduction potential)为1.33V的C₄₃₉(图11B)^1，51，因此，第二种可能性要求不利的16千卡/摩尔的热力学升高过程。然而，氢原子转移机制在热力学上是更可能达到的(图11C)。该可行性是依据对R-SH(88-91千卡/摩尔)和邻-氨基苯酚(计算为78-83千卡/摩尔)的均裂键裂解能(homolytic bond dissociation energy)的了解^1，95-97。因此，假定蛋白质环境没有干扰，NH₂Y₇₃₀·通过氢原子转移机制氧化C₄₃₉“只”上升5-13千卡/摩尔。因此，Y₇₃₀NH₂Y-α2中的核苷酸还原活性在热力学上有利于NH₂Y₇₃₀·形成C₄₃₉·的氢原子转移机制。

令人感兴趣的是，儿茶酚的键裂解能(82-83千卡/摩尔)类似于邻-氨基苯酚⁹⁵。然而，DOPA₃₅₆-β2在核苷酸还原中无活性。以DOPA-β2正交PCET为例，在该残基处氧化的功能机制(即，类似于图11B)要求有效自由基传播与核苷酸还原的氧化还原电位匹配。尽管氧化还原电位不匹配(约0.69V差异)，但Y₇₃₀NH₂Y-α2在核苷酸还原中有活性因为是通过氢原子转移的不同氧化机制而看来是一致的，该途径中该机制看来在该残基处起作用。

总之，我们报道开发了非天然氨基酸NH₂Y的特异性抑制型tRNA/RS配对。位点特异性地插入NH₂Y对于在催化中利用Y·的其它系统和将感兴趣探针连接于靶蛋白是有用的。采用该技术，我们制备了Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2并检验了这些残基在远程自由基传播中的参与情况。结果证明自由基从β2中的Y₁₂₂·穿过亚单位界面的动力学有效转移和捕获NH₂Y₇₃₀·或NH₂Y₇₃₁·。该事件由底物和效应物的结合触发。稳态活性试验结合自杀抑制剂N₃ADP的反应表明Y₇₃₀NH₂Y-α2和Y₇₃₁NH₂Y-α2在核苷酸还原中有效。这暗示了NH₂Y₇₃₀·氧化C₄₃₉的氢原子转移机制。NH₂Y-α2活性的确定证据要求基于机制的抑制剂N₃NDP分解NH₂Y·和形成N·的详细动力学分析。目前正在进行这些研究。

支持信息.试图在各种条件下从载体pBAD-nrdA和pMJ1-nrdA表达Y₇₃₀NH₂Y-α2，利用pTrc-nrdA的Y₇₃₀NH₂Y-α2表达凝胶，NH₂Y-α2的纯化凝胶，SF UV-可见光表征和Y₇₃₁NH₂Y-α2与β2、CDP/ATP反应的10秒EPR光谱及Y₇₃₁NH₂Y-α2/β2与N₃ADP和dGTP反应的EPR光谱。该材料可从因特网http://pubs.acs.org免费获得。

图标

图1：从α2和β2的对接模型获得的推定自由基引发途径⁶。Y₃₅₆在任何结构中不可见，因为其在β2的无序C-末端尾部。因此，Y₃₅₆到β2-W₄₈和到β2-Y₇₃₁的距离未知。α2侧的距离来自Uhlin和Eklund测定的结构⁶，β2侧的那些距离来自氧化β2的高分辨率结构¹⁹。

图2：K₇NH₂Y-Z-结构域的MALDI-TOF MS和SDS PAGE分析。正电离模式下获得的纯化K₇NH₂Y-Z-结构域的MALDI-TOF MS。m/z[M+H]⁺标于图谱的主峰。它们对应于K₇NH₂Y-Z-结构域的N-末端切割Met形式(指数7814)及其酰化形式(指数7856)、全长K₇NH₂Y-His-Z-结构域(指数7945)及其酰化形式(指数7987)。插入图显示没有(泳道2)或有(泳道3)NH₂Y存在下，表达后的纯化Z-结构域的SDS凝胶。箭头指示K₇NH₂Y-Z-结构域条带。蛋白质梯和相应的分子量(MW)示于泳道1。

图3：表达Y₇₃₁NH₂Y-α2。如所示，在有或没有IPTG和NH₂Y/DTT存在下培养细胞，通过SDS PAGE评估表达水平。全长α和截短α的蛋白质条带的位置如箭头所示。

图4：通过EPR光谱学方法监测Y₇₃₀NH₂Y-α2/ATP与野生型β2/CDP的反应。25℃，混合反应组分以获得终浓度为20μM Y₇₃₀NH₂Y-α2β2、1mMCDP和3mM ATP。10秒后，在液体N₂中猝灭反应，随后记录77K时的EPR光谱(实线)。扣除未反应的Y₁₂₂·(点划线，47％总自旋)显示NH₂Y₇₃₀·的光谱(虚线，53％总自旋)。插入图显示没有CDP/ATP存在下Y₇₃₀NH₂Y-α2与野生型β2的反应。

图5：Y₁₂₂·和NH₂Y₇₃₀·信号强度的微波功率依赖性。记录与微波功率呈函数关系的Y₁₂₂·和NH₂Y₇₃₀·的EPR光谱，各信号的积分强度对功率的平方根作图。黑线表示采用方程1拟合数据⁸⁰，分别获得Y₁₂₂·(圆圈)和NH₂Y₇₃₀·(正方形)的P_1/2为28±4mW(b＝1.3±0.2)和0.42±0.08mW(b＝1.2±0.2)。

图6：比较NH₂Y₇₃₀·(点划线，图4)和NH₂Y₇₃₁·(虚线，图15)。

图7：逐点重建NH₂Y₇₃₀·(圆圈)和NH₂Y₇₃₁·(正方形)的UV-可见光光谱。将一个注射器中的预还原的Y₇₃₀NH₂Y-α2和ATP与另一注射器中的野生型β2和CDP混合，产生终浓度分别为10μM、3mM、10μM和1mM。对于Y₇₃₁NH₂Y-α2，进行反应的终浓度为9μM Y₇₃₁NH₂Y-α2β2、1mM CDP和3mM ATP。以5nm为间隔监测吸光度改变；在各λ，计算2-4个时程的平均值，采用该光谱范围内的以前测定的ε校正Y₁₂₂·的吸光度^66，67。经校正的ΔOD转换成ε⁶⁸，然后对λ作图。

图8：NH₂Y₇₃₀·形成的SF动力学。将一个注射器中预还原的Y₇₃₀NH₂Y-α2(20μM)和CDP(2mM)与另一注射器中的β2(20μM)和ATP(3mM)以1∶1的比例混合。计算监测NH₂Y₇₃₀·形成和Y₁₂₂·消失的总共7条曲线在325和410nm的平均值。黑线表示双指数拟合数据(动力学参数见表2)。

图9：与Y₇₃₀NH₂Y-α2、β2和dGTP温育后从N₃ADP形成的N·。反应的终浓度为20μM Y₇₃₀NH₂Y-α2β2(1.2Y₁₂₂·/β2)、1mM N₃ADP和0.25mMdGTP。20秒后，将其在液体N₂中快速猝灭，记录其EPR光谱。(A)从观察到的光谱(虚线)扣除N·(点划线，19％总自旋)得到黑色曲线，其包含Y₁₂₂·和NH₂Y₇₃₀·信号。(B)从(A)中得到的光谱扣除Y₁₂₂·(点划线，43％总)显示NH₂Y₇₃₀·的光谱(虚线，39％总自旋)。各自由基浓度的定量测定见表4。

图10：比较N·(黑色)、Y₁₂₂·(点划线)和NH₂Y₇₃₀·(虚线)的光谱。N·和Y₁₂₂·在光谱下侧的不同特征有助于图4、9、15和17中的复杂光谱解卷积。

图11：NH₂Y₇₃₀·氧化C₄₃₉的机制选择。(A)分步电子转移/质子转移。最初的电子转移事件产生含有含硫阳离子自由基和3-氨基酪氨酸(NH₂Y₇₃₀ ^-)的不同中间体。随后的质子-转移产生中性含硫自由基和NH₂Y₇₃₀。该反应是极其不利的(参见文本)。(B)正交PCET。ET和质子转移偶联，但电子和质子具有不同的目的地。C₄₃₉的质子正交转移至碱性残基；其电子转移至NH₂Y₇₃₀·，从而产生C₄₃₉·和NH₂Y₇₃₀。(C)共-线性PCET。氢原子从C₄₃₉转移至NH₂Y₇₃₀·。质子和电子源自并到达同一部分。

图12提供测定氨基酸Y₇₃₀和Y₇₃₀在大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位中机制作用所用方案的示意图。

图13：表达Y₇₃₀NH₂Y-α2。如所示在25或37℃，在有或没有IPTG和NH₂Y/DTT存在下培养细胞，通过SDS PAGE评估表达水平。全长α和截短α的蛋白质条带的位置如箭头所示。

图14：纯化Y₇₃₀NH₂Y-α2(A)和Y₇₃₁NH₂Y-α2(B)的SDS PAGE分析。(A)泳道(1)和(4)，分子量标记。示出了各条带的分子量。泳道(2)纯化的Y₇₃₀NH₂Yα2(1.5μg)。泳道(3)纯化的野生型α2(1.5μg)。(B)泳道(1)分子量标记。示出了各条带的分子量。泳道(2)纯化的Y₇₃₁NH₂Y-α2(1.5μg)。

图15：通过EPR监测Y₇₃₁NH₂Y-α2/ATP与野生型β2/CDP的反应。25℃，混合反应组分以获得终浓度为20μM Y₇₃₁NH₂Y-α2β2复合物、1mMCDP和3mM ATP。10秒后，在液体N₂中手工冷冻猝灭反应，随后记录77K时的EPR光谱。扣除未反应的Y₁₂₂·(点划线，55％总自旋)显示NH₂Y₇₃₀·的光谱(虚线，45％总自旋)。插入图：显示没有CDP/ATP存在下Y₇₃₀NH₂Y-α2与野生型β2的反应。

图16：NH₂Y₇₃₁·形成的动力学。将一个注射器中预还原的Y₇₃₁NH₂Y-α2(18μM)和CDP(2mM)与另一注射器中的β2(18μM)和ATP(3mM)以1∶1的比例混合。计算监测NH₂Y₇₃₁·形成和Y₁₂₂·消失的总共6条曲线在320和410nm的平均值。黑线表示双指数拟合数据-动力学参数见表2)。

图17：Y₇₃₁NH₂Y-α2的N₃ADP试验。反应含有终浓度为20μM的Y₇₃₁NH₂Y-α2β2(1.2Y₁₂₂·/β2)、1mM的N₃ADP和250μM的dGTP。20秒后，在液体N₂中将其手工冷冻猝灭，记录其EPR光谱。(A)从观察到的光谱(虚线)扣除N·(点划线，20％总自旋)得到实心黑色曲线，其包含Y₁₂₂·和NH₂Y₇₃₁·信号。(B)从(A)中得到的光谱扣除Y₁₂₂·(点划线，41％总)显示NH₂Y₇₃₁·的光谱(虚线，39％总自旋)。各自由基浓度的定量测定见表4。

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84.监测内蛋白-产生的野生型β2形成dCDP的快速化学猝灭研究不再显示dCDP形成激增(如野生型β2那样)，但显示单速度常数约1s^-1(M.Seyedsayamdost，J.Stubbe，未公布的结果)，因此，用DOPA-β2观察到的慢速阶段在转换中也可能是动力学有效的。

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91.对邻-氨基苯酚的早先计算研究显示苯酚羟基的BDE低于胺的。对邻-氨基苯酚的EPR研究符合这些计算值，从而证明在氧化状态中存在两个N-结合质子(见参考文献88和94)。我们自己的基础EPR模拟和DFT计算也提示自由基的结构如示意图1所示(M.Seyedsayamdost，M.Bennati，J.Stubbe，未公布的结果)。

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应该知道本文所述的实施例和实施方式只是出于说明的目的，本领域技术人员鉴于这些实施例和实施方式可想到各种改进或改变，这些改进或改变应包括在本申请的构思和权限以及随附权利要求书的范围内。

虽然出于清楚和理解的目的描述了上述发明的一些细节，但本领域技术人员通过阅读本文应该明白可作出各种改变而不脱离本发明的实际范围。例如，上述所有技术和设备可以各种组合使用。如同各份出版物、专利、专利申请和/或其它文件单独表明出于所有目的通过引用纳入本文的程度一样，本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文件出于所有目的通过引用全文纳入本文。

Claims (18)

1.一种重组还原酶，其包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基，其中所述还原酶是或衍生自在以下一处或多处包含NH₂Y突变的大肠杆菌核糖核苷酸还原酶：

(a)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的730位置的酪氨酸；

(b)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的731位置的酪氨酸；

(c)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的122位置的酪氨酸；或

(d)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的356位置的酪氨酸。

2.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述还原酶是I类或IV类核糖核苷酸还原酶。

3.如权利要求1所述的重组还原酶，其特征在于，所述重组还原酶衍生自野生型还原酶，且其中所述重组还原酶中的所述3-氨基酪氨酸残基替换所述野生型还原酶氨基酸序列中的酪氨酸残基。

4.一种细胞，其包含：

衍生自编码还原酶的一条或多条多肽链的还原酶核酸的重组核酸，所述重组核酸包含选择者密码子；

该细胞还包含正交氨酰tRNA合成酶和识别该选择者密码子的正交tRNA，其中该正交氨酰tRNA合成酶用3-氨基酪氨酸优先氨酰化该正交tRNA；和

其中所述还原酶是或衍生自在以下一处或多处包含NH₂Y突变的大肠杆菌核糖核苷酸还原酶：

(a)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的730位置的酪氨酸；

(b)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的731位置的酪氨酸；

(c)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的122位置的酪氨酸；或

(d)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的356位置的酪氨酸。

5.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述核酸编码与I类或IV类核糖核苷酸还原酶的多肽链同源的一条或多条多肽链。

6.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含3-氨基酪氨酸。

7.一种重组还原酶的细胞浆液或提取物，所述重组还原酶包含3-氨基酪氨酸(NH₂Y)残基，其中所述还原酶是或衍生自在以下一处或多处包含NH₂Y突变的大肠杆菌核糖核苷酸还原酶：

(a)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的730位置的酪氨酸；

(b)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的α2亚单位的731位置的酪氨酸；

(c)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的122位置的酪氨酸；或

(d)大肠杆菌核糖核苷酸还原酶的β2亚单位的356位置的酪氨酸，和

其中所述细胞浆液或提取物包含至少约2至约4mg/g的还原酶。

8.如权利要求12所述的细胞浆液或提取物，其特征在于，所述细胞浆液包含约4至约6mg/g的还原酶。

9.如权利要求12所述的细胞浆液或提取物，其特征在于，所述重组还原酶是核糖核苷酸还原酶。

10.一种测定所选氨基酸残基在还原酶中的功能的方法，该方法包括：

使所选氨基酸残基突变成3-氨基酪氨酸(NH₂Y)从而产生在对应于所选氨基酸的位置包含NH₂Y的重组突变型还原酶；

将该重组还原酶与该还原酶的一种或多种底物或效应物混合；和

检测NH₂Y·的形成。

11.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述还原酶是核糖核苷酸还原酶。

12.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的所选氨基酸残基是Y残基。

13.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述底物包括CDP、ADP、GDP或UDP，所述效应物包括ATP。

14.如权利要求15所述的方法，其特征在于，包括在所述混合之前先还原该还原酶。

15.如权利要求19所述的方法，其特征在于，还原所述重组还原酶包括从表达所述重组还原酶的细胞或细胞培养物中纯化所述重组还原酶，以及将所得纯化的还原酶与还原剂一起培育。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，检测NH₂Y的形成包括测定该还原酶中NH₂Y残基的电子顺磁共振谱。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，检测NH₂Y的形成包括在所述混合之后进行停流光谱学方法以测定NH₂Y·形成的动力学。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，检测NH₂Y的形成包括在所述混合之后进行快速冷冻猝灭电子顺磁共振以测定NH₂Y·形成的动力学。

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