KR20050073559A

KR20050073559A - 당단백질 합성

Info

Publication number: KR20050073559A
Application number: KR1020057006593A
Authority: KR
Inventors: 피터 지 슐츠; 레이 왕; 지웬 장
Original assignee: 더 스크립스 리서치 인스티튜트
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2005-07-14
Also published as: CA2500653A1; WO2004035605A3; JP2006507358A; WO2004035605A2; JP4752001B2; IL196908A0; IL196907A0; IL196904A0; US7129333B2; US6927042B2; EP1558747A4; US7560535B2; US20050209133A1; US7183082B2; HK1074855A1; SG160203A1; AU2003286436A1; US20100009425A1; US7825226B2; US7238510B2

Abstract

생체내 및 생체외에서 당단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 한 가지 방법은 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하고 하나 이상의 당 부분을 비천연 아미노산에 부착시키는 것에 관련된다. 다른 방법은 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 것에 관련된다. 두 방법에 의해 만들어진 단백질은 추가의 자당으로 더 변형될 수 있다.

Description

당단백질 합성{GLYCOPROTEIN SYNTHESIS}

본 발명은 당펩티드, 당단백질 및 관련 모방체 및 당펩티드, 당단백질 및 관련 모방체의 합성 방법에 관한 것이다.

당화에 의한 단백질의 번역후 변형은 단백질 접힘 및 안정성에 영향을 주고, 단백질의 고유의 활성을 변화시키고, 다른 생물분자와 그들의 상호작용을 조절할 수 있다. 예를 들어, Varki, A.(1993) Glycobiology 3:97-130을 참고한다. 천연 당단백질은 종종 많은 상이한 당형태(glycoform)의 집단으로 존재하는데, 이로 인해 글리칸 구조의 분석 및 단백질 구조 및 기능에 대한 당화 효과의 연구가 어려워진다. 따라서, 천연 및 비천연의 균질하게 당화된 단백질의 합성 방법이 글리칸 기능의 체계적 연구를 위해, 그리고 개선된 당단백질 치료제의 개발을 위해 필요하다.

원하는 당화 패턴을 가진 단백질을 만들기 위한 한 가지 공지의 접근법은 글리코시다제를 이용하여 비균질성의 천연 당단백질을 간단한 균질의 코어로 전환시키고, 이어서 이 코어상에 당(saccharide)이 글리코실트랜스퍼라제에 의해 순차적으로 그래프트될 수 있다. 예를 들어, Witte, K.,et al., (1997) J.Am.Chem.Soc.119:2114-2118을 참고한다. 이러한 접근법의 한계는 주요 당화 부위가 그 단백질이 발현되는 세포주에 의해 미리결정된다는 것이다. 다르게는, 원하는 글리칸 구조를 함유한 당펩티드를 고체상 펩티드 합성에 의해 합성할 수 있다. 이 당펩티드는 천연 화학적 라이게이션(예, Shin, Y., et al., (1999) J.Am.Chem.Soc. 121:11684-11689 참고), 발현된 단백질 라이게이션(예, Tolbert, T.H. and Wong, C.H.(2000) J.Am.Chem.Soc. 122:5421-5428 참고), 또는 조작된 프로테아제에 의해 다른 펩티드 또는 재조합 단백질 단편에 연결되어 더 큰 당단백질을 제공할 수 있다(예, Witte, K.,et al., (1997) J.Am.Chem.Soc. 120:1979-1989 참고). 천연 화학적 라이게이션 및 발현된 단백질 라이게이션은 모두 작은 단백질에서 가장 효과적이며, 당펩티드의 N-말단의 시스테인 잔기를 필요로 한다. 프로테아제를 이용하여 펩티드를 연결시킬 경우, 우수한 연결 수율을 위해서는 라이게이션 부위가 당화 부위와 멀리 떨어져야 한다. 예를 들어, Witte, K.,et al.,(1998) J.Am.Chem.Soc. 120:1979-1989를 참고한다. 세 번째 접근법은 화학적 방법을 이용하여 당으로 직접 단백질을 변형시키는 것이다. 시스테인의 티올기에 연결되는 할로아세트아미드 당 유도체에서 우수한 선택성이 얻어질 수 있으나 (예, Davis, N.J. and Filtsch, S.L.(1991) Tetrahedron Lett. 32: 6793-6796; 및 Macmillan, D.et al.,(2002) Org Lett 4:1467-1470 참고), 이 방법은 하나보다 많은 시스테인 잔기를 갖는 단백질에서는 문제가 될 수 있다.

따라서, 원하는 당화 패턴을 갖는 당단백질을 만들기 위한 개선된 방법이 필요하다. 본 발명은 하기 설명으로부터 명백한 것처럼, 이러한 필요 및 기타 필요를 충족시킨다.

발명의 개요

본 발명은 당단백질의 합성 방법을 제공한다. 이들 방법은, 일부 구체예에서는, 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하고; 그리고 상기 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 당 부분과 접촉시키는 것을 포함하며, 이 때 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여 당 부분을 비천연 아미노산에 부착시킨다. 이들 방법에 의해 생산된 당단백질은 또한 본 발명에 포함된다. 일부 구체예에서, 제1 반응성 기는 친전자성 부분(예, 케토 부분, 알데히드 부분 및/또는 유사 부분)이며 제2 반응성 기는 친핵성 부분이다. 일부 구체예에서, 제1 반응성 기는 친핵성 부분이고 제2 반응성 기는 친전자성 부분이다(예, 케토 부분, 알데히드 부분 및/또는 유사 부분). 예를 들어, 친전자성 부분은 당 부분에 부착되며, 친핵성 부분은 비천연 아미노산에 부착된다. 당 부분은 단일 탄수화물 부분을 포함할 수 있거나, 또는 당 부분은 2 이상의 탄수화물 부분을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 추가로 당 부분을 글리코실트랜스퍼라제, 자당 공여 부분 및 기타 글리코실트랜스퍼라제 활성에 요구되는 반응물과 충분한 시간 동안 적절한 조건 하에 접촉시켜 자당 공여 부분으로부터 자당을 당 부분으로 전달하는 것에 관련된다. 이 반응의 생성물은, 필요하면, 적절한 자당 공여 부분과 함께, 적어도 제2의 글리코실트랜스퍼라제에 의해 접촉될 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 추가로 당 부분을 하나 이상의 β1-4N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, α1,3-푸코실트랜스퍼라제, α1,2-푸코실트랜스퍼라제, α1,4-푸코실트랜스퍼라제, β1-4갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 유사물과 접촉시켜 바이안테너리(biantennary) 또는 트리안테너리(triantennary) 올리고당 구조를 형성하는 것을 포함한다.

한 가지 구체예에서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하며, 자당 공여 부분은 UDP-Gal이며 글리코실트랜스퍼라제는 β-1-4-갈락토실트랜스퍼라제이다. 한 구체예에서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하며, 자당 공여 부분은 UDP-GlcNAc이며 글리코실트랜스퍼라제는 β1-4N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제이다. 선택적으로, 상기 방법은 추가로 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 반응의 생성물을 β1-4만노실트랜스퍼라제 및 GDP-만노스와 접촉시켜 Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 부분을 α1-3만노실트랜스퍼라제와 GDP-만노스와 접촉시켜 Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 부분을 α1-6만노실트랜스퍼라제와 GDP-만노스와 접촉시켜 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc- 부분을 β1-2N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제와 UDP-GlcNAc와 접촉시켜 Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc 부분을 β1-2N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제와 UDP-GlcNAc와 접촉시켜 GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 단계는 오르소고날(orthogonal) tRNA/오르소고날 아미노아실-tRNA 신세타제(O-tRNA/O-RS) 쌍을 이용하는 것을 포함하며, 이 때 O-tRNA는 셀럭터 코돈을 인식하며, 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하며, 상기에서 O-RS는 우선적으로 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화한다. 예를 들어, O-RS는 서열 번호 1, 2 또는 3 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로, O-tRNA는 를 포함한다. 일부 구체예에서, 비천연 아미노산은 생체내에서 폴리펩티드 내로 도입된다.

본 발명은 또한 당 부분과 폴리펩티드를 포함하는 당단백질을 제공한다. 본 발명의 당단백질의 일부 구체예에서, 당 부분은 폴리펩티드에 존재하는 비천연 아미노산에 부착된 제1 반응성 기와 당 부분에 부착된 제2 반응성 기 사이의 친핵성 반응의 반응 생성물에 의해 폴리펩티드에 부착된다. 일부 구체예에서, 제1 반응성 기는 친전자성 부분(예, 케토 부분, 알데히드 부분 및/또는 유사물)이고 제2 반응성 기는 친핵성 부분이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 친핵성 부분은 하이드라자이드, 하이드록실아민, 세미카바자이드, 카보하이드라자이드, 설포닐하이드라자이드 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 친핵성 부분은 예를 들어, -NR¹-NH₂(하이드라자이드), -NR¹(C=O)NR²NH₂(세미카바자이드), --NR¹(C=S)NR²NH₂(티오세미카바자이드), -(C=O)NR¹NH₂(카보닐하이드라자이드), -(C=S)NR¹NH₂(티오카보닐하이드라자이드), -(SO₂)NR¹NH₂(설포닐하이드라자이드), -NR¹NR²(C=O)NR³NH₂(카바자이드), -NR¹NR²(C=S)NR³NH₂(티오카바자이드), -O-NH₂(하이드록실아민) 등을 포함하며 이에 한정되지 않으며, 이 때 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 H, 또는 탄소수 1∼6의 알킬이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 반응 생성물은 예를 들어, 옥심, 아미드, 하이드라존, 환원된 하이드라존, 카보하이드라존, 티오카보하이드라존, 설포닐하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존 등을 포함한다.

본 발명의 다른 태양은 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입함으로써 당단백질을 합성하는 방법을 포함한다. 상기 방법에 의해 생산된 당단백질은 또한 본 발명의 특징이다. 일부 구체예에서, 상기 도입 단계는 오르소고날 tRNA/오르소고날 아미노아실-tRNA 신세타제(O-tRNA/O-RS) 쌍을 이용하는 것을 포함하며, 이 때 O-tRNA는 셀럭터 코돈을 인식하며, 당 부분(예, β-O-GlcNAc-L-세린, 트리-아세틸-β-GlcNAc-세린, 트리-O-아세틸-GalNAc-α-트레오닌, α-GalNAc-L-트레오닌 및/또는 유사물)을 포함하는 비천연 아미노산을, 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 도입하며, 상기에서 O-RS는 우선적으로 비천연 아미노산을 가진 O-tRNA를 아미노아실화한다. 한 구체예에서, 도입 단계는 생체내에서 실시된다. 예를 들어, O-RS는 서열 번호 4, 5, 또는 6 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 또는 서열 번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 선택적으로, O-tRNA는 를 포함한다. 이들 방법은 당 부분을 글리코실트랜스퍼라제, 자당 공여 부분 및 글리코실트랜스퍼라제 활성에 필요한 다른 반응물과 충분한 시간 동안 적절한 조건 하에 접촉시켜 자당 공여 부분으로부터의 자당을 당 부분에 전달하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 글리코실트랜스퍼라제 반응의 생성물을 적어도 제2 글리코실트랜스퍼라제 및 제2 자당 공여 부분과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하며, 자당 공여 부분은 UDP-GlcNAc이며 글리코실트랜스퍼라제는 β1-4N아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제이다. 다른 구체예에서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하며, 자당 공여 부분은 UDP-Gal이며 글리코실트랜스퍼라제는 β1-4갈락토실트랜스퍼라제이다. 추가의 자당이 첨가될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 글리코실트랜스퍼라제는 예를 들어, 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산 트랜스퍼라제, 갈락투론산 트랜스퍼라제, 올리고사카릴트랜스퍼라제 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 당단백질을 합성하기 위해 유용한 숙주 세포(예, 포유류 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 식물 세포, 균류 세포, 고세균 세포, 곤충 세포 및/또는 기타)를 제공한다. 이들 숙주 세포는 a) 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산; b) 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날 tRNA; c) 오르소고날 tRNA에 대한 비천연 아미노산의 부착을 촉진하는 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS); d) 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 e) 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하며 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.

번역 시스템을 포함하는 조성물 또한 본 발명에 의해 제공된다. 번역 시스템은 오르소고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS)를 포함하며, 이 때 O-RS 는 당 부분(예, β-O-GlcNAc-L-세린, 트리-아세틸-β-GlcNAc-세린, 트리-O-아세틸-GalNAc-α-트레오닌, α-GalNAc-L-트레오닌 및/또는 유사물)을 포함하는 비천연 아미노산을 갖는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하며, O-tRNA는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 인식한다. 일부 구체예에서, O-RS는 서열 번호 4, 5, 또는 6 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 또는 서열 번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 선택적으로, O-tRNA는를 포함한다.

인공(예, 사람이 만든 및 자연 발생하지 않는) 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 특징이다. 예를 들어, 본 발명의 인공 폴리펩티드는 예를 들어, (a) 서열 번호 4∼6 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (b) 서열 번호 8∼10 중 어느 하나에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체와 특이적 면역반응성을 나타내는 폴리펩티드; 및 (d) (a), (b), 또는 (c)의 보존적 변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 인공 폴리펩티드와 특이적 면역반응성을 나타내는 항체 및 항혈청 또한 제공된다. 본 발명의 인공 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, (a) 서열 번호 8∼10 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b) (a)의 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하거나 여기에 상보적인 폴리뉴클레오티드; (c) 서열 번호 1∼6 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 보존적 변이; (d) 인공 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (e) 핵산의 전체 길이에 대하여 매우 엄격한 조건 하에 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 핵산; (f) (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리뉴클레오티드에 적어도 98% 동일한 폴리뉴클레오티드; 및 (h) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)의 보존적 변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

정의

본 발명을 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 특정 장치 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않으며 이 시스템이 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 여기서 사용된 개념은 단지 특정 구체예를 설명할 목적이며 제한하고자 하는 의도는 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 청구범위에서 사용될 때, 단수 형태는 달리 명시되지 않으면 복수를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"는 2 이상의 세포의 조합을 포함하며, "박테리아"는 박테리아의 혼합물 등을 포함한다.

오르소고날(orthogonal): 여기서 사용될 때, 용어 "오르소고날"은 세포 또는 다른 번역 시스템에 내인성인 상응하는 분자에 의해 감소된 효율로 이용되는 분자(예, 오르소고날 tRNA (0-tRNA) 및/또는 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS))를 말한다. 오르소고날은 내인성 tRNA 신세타제와 작용하는 오르소고날 tRNA 또는 대상 번역 시스템에서 내인성 tRNA와 작용하는 오르소고날 RS의 무능력 또는 감소된 효율, 예를 들어 20% 미만의 효율, 10% 미만의 효율, 5% 미만의 효율, 또는 1% 미만의 효율을 말한다. 예를 들어, 대상 번역 시스템에서 오르소고날 tRNA는, 내인성 RS에 의한 내인성 tRNA의 아미노아실화와 비교할 때, 감소된 또는 심지어는 0의 효율로, 대상 번역 시스템의 임의의 내인성 RS에 의해 아미노아실화된다. 다른 실시에에서, 오르소고날 RS는 내인성 RS에 의한 내인성 tRNA의 아미노아실화와 비교할 때, 감소된 또는 심지어는 0의 효율로, 대상 번역 시스템에서 임의의 내인성 tRNA를 아미노아실화한다.

우선적으로 아미노아실화하다: 용어 "우선적으로 아미노아실화하다"는 O-tRNA를 생성하기 위해 이용되는 자연 발생 tRNA 또는 출발 물질에 비교할 때, O-RS가 비천연 아미노산을 가진 O-tRNA를 아미노아실화하는 효율이 예를 들어, 약 70% 효율, 약 75% 효율, 약 85% 효율, 약 90% 효율, 약 95% 효율임을 말한다. 비천연 아미노산은 이어서 높은 확실성으로, 예를 들어 주어진 셀렉터 코돈에 대해 약 75%를 넘는 효율로, 주어진 셀렉터 코돈에 대해 약 80%를 넘는 효율로, 주어진 셀렉터 코돈에 대해 약 90%를 넘는 효율로, 주어진 셀렉터 코돈에 대해 약 95%를 넘는 효율로, 또는 주어진 셀렉터 코돈에 대해 약 99%를 넘는 효율로, 성장중인 폴리펩티드 쇄내로 포함된다.

셀렉터 코돈: 용어 "셀렉터 코돈"은 번역 과정에서 O-tRNA에 의해 인식되며 일반적으로 내인성 tRNA에 의해 인식되지 않는 코돈을 말한다. O-tRNA 안티코돈 루프는 mRNA상의 셀렉터 코돈을 인식하고 그 아미노산, 예를 들어 비천연 아미노산을 폴리펩티드의 이 부위에서 도입한다. 셀렉터 코돈은 예를 들어 정지 코돈, 예, 앰버, 오커 및 오팔 코돈과 같은 넌센스 코돈; 4개 이상의 염기의 코돈; 천연 또는 비천연 염기쌍에서 유래된 코돈 및/또는 기타를 포함할 수 있다. 주어진 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 또한 천연 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 이 때 내인성 시스템은 상기 3 염기 코돈을 이용하지 않아, 예를 들어, 상기 시스템은 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 없거나 또는 천연 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템이다.

억제자 tRNA: 억제자 tRNA는 주어진 번역 시스템에서 메신저 RNA(mRNA)의 판독을 바꾸는 tRNA이다. 억제자 tRNA는 예를 들어, 정지 코돈, 4 염기 코돈, 희귀 코돈 및/또는 기타를 통과해 판독할 수 있다.

번역 시스템: 용어 "번역 시스템"은 천연 발생 아미노산을 성장중인 폴리펩티드 쇄(단백질)내로 도입하는 데 필요한 성분을 말한다. 번역 시스템의 성분들은 예를 들어, 리보솜, tRNA, 신세타제, mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 성분은 생체내 또는 생체외에서 번역 시스템에 첨가될 수 있다. 번역 시스템은 원핵성 세포, 예, 이.콜라이 세포, 알키얼(archael) 세포 등 또는 진핵성 세포, 예, 효모, 포유류, 식물, 곤충 세포 등일 수 있다.

비천연 아미노산: 여기서 이용될 때, 용어 "비천연 아미노산"은 20개의 천연 발생 아미노산 또는 셀레노 시스테인 또는 피로라이신 중 어느 하나가 아닌 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 말한다.

당 부분: 여기서 이용될 때, 용어 "당 부분"은 천연 및 비천연 자당 부분(즉, 비천연 발생 자당 부분, 예, 하나 이상의 하이드록실 또는 아미노 위치에서 변형된, 예, 탈하이드록실화되거나, 탈아미노화되거나, 에스테르화된 자당 부분이며, 예를 들어 2-데옥시Gal은 비천연 자당 부분의 예임)을 말한다. 용어 "탄수화물"은 일반식 (CH₂O)_n을 가지며, 예를 들어, 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 올리고당류는 다르게는 자당으로 알려진 당 단위로 구성된 쇄이다. 당 단위는 임의의 순서로 배열될 수 있으며 두 당 단위 사이의 결합은 대략 10 가지 다른 방식 중 임의의 것으로 발생할 수 있다.

하기의 약자가 여기서 이용된다:

Ara = 아라비노실 ;

Fru = 프룩토실 ;

Fuc = 푸코실 ;

Gal = 갈락토실 ;

GalNAc = N-아세틸갈락토스아미닐;

Glc = 글루코실 ;

GlcNAc = N-아세틸글루코스아미닐;

Man = 만노실; 및

NeuAc = 시알릴(일반적으로 N-아세틸뉴라미닐).

올리고당은 환원성 말단 및 비환원성 말단을 갖는 것으로 간주되며, 환원성 말단의 당이 실제 환원성 자당인지 여부는 상관없다. 허용된 명명법에 따라, 올리고당은 여기서 좌측의 비환원성 말단과 우측의 환원성 말단을 갖는 것으로 묘사된다. 여기서 설명된 모든 올리고당은 비환원성 당(예, Gal)을 위한 명칭 또는 약자 및 후속되는 글리코시드 결합의 형태(α 또는 β), 고리 결합, 결합에 관련된 환원성 당의 고리 위치 및 이어서 환원성 당의 명칭 또는 약자(예, GlcNAc)로 설명된다. 두 자당 사이의 결합은 예를 들어 2,3,2→3,2-3, 또는 (2,3)으로 표현될 수 있다. 두 자당 사이의 천연 및 비천연 결합(예, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6, 2-3, 2-4, 2-6 등)은 본 발명에 포함된다. 각 당은 피라노스이다.

용어 "시알산"(약자"Sia")은 9-탄소 카복실화 자당의 패밀리의 임의의 구성원을 말한다. 시알산 패밀리의 가장 일반적인 구성원은 N-아세틸-뉴라민산(2-케토-5-아세트아민도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노누로피라노스-1-온산)(종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA로 약칭됨)이다. 상기 패밀리의 제2의 구성원은 N-글리콜일-뉴라민산(Neu5Gc 또는 NeuGc)이며, 여기서 NeuAc의 N-아세틸기는 하이드록실화된다. 제3의 시알산 패밀리 구성원은 2-케토-3-데옥시-노누로손산(KDN)이다(Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819). 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-0-아세틸-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac와 같은 9-O-C_l-C₆ 아실-Neu5Ac와 같은 9-치환된 시알산이 포함된다. 시알산 패밀리의 리뷰를 위해서는 예를 들어, Varki (1992) Glycobiology 2: 25-40; Sialic Acids: Chemistry. Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))를 참고한다. 시알화 과정에서 시알산 화합물의 합성 및 이용은 예를 들어 1992년 10월 1일에 공개된 국제 출원 공개 WO92/16640호에 개시된다.

글리코실트랜스퍼라제를 위한 공여 기질은 활성화된 뉴클레오티드 자당이다. 그러한 활성 자당은 일반적으로 우리딘 및 구아노신 디포스페이트 및 시티딘 모노포스페이트, 자당의 유도체로 구성되며, 상기에서 뉴클레오시드 디포스페이트 또는 모노포스페이트는 이탈기로 작용한다. 박테리아, 식물 및 진균 시스템은 때때로 다른 활성 뉴클레오티드 자당을 이용할 수 있다.

여기서 또는 본 명세서의 나머지에서 달리 정의되지 않으면, 여기서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

도 1은 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 당 부분을 부착시키기 위한 두 가지 도식(순차적 경로 및 수렴적 경로)의 예를 예시한다.

도 2는 아미노옥시 당(1)(도 1)과 p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유한 돌연변이 Z 도메인 단백질 I(도 1) 사이의 커플링 반응을 7시간과 26시간에 HPLC 분석한 것을 예시한다.

도 3은 돌연변이 Z 도메인 단백질 I(도 1), 당단백질 모방체 II, III 및 IV(도 1)의 고해상도 MALDI-FTICR MS 스펙트럼을 예시한다. 각 스펙트럼의 2⁺ 동위원소 클러스터가 나타난다.

도 4는 Gly4→A 돌연변이 미오글로빈(~ 18.5 kD)의 발현을 예시한다. 단백질은 Ni²⁺-친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었으며 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 젤을 은염색하였다.

도 5는 Gly4→A 돌연변이 미오글로빈의 분자량의 MALDI-TOF 분석을 예시한다.

도 6, 패널 A, B 및 C는 당화된 아미노산을 함유한 정제된 돌연변이 미오글로빈의 특성 규명을 예시한다. 패널 A는 GlcNAc 특이적 렉틴, 반데리래 심플리시폴리아 II(Banderiraea simplicifolia II)(BSII)의 야생형 미오글로빈 및 글리코미오글로빈에 대한 결합을 예시한다. 패널 B는 UDP-[H³]갈락토스를 이용하여 글리코미오글로빈을 표지시키는 온-블롯(on-blot) 갈락토실트랜스퍼라제를 예시한다. 패널 C는 갈락토실트랜스퍼라제 반응의 정량적 분석을 예시하며, 이 반응은 용액에서 실시되었으며, 방사성표지된 갈락토스는 1.0이 100% 전달에 해당하도록 정상화되었다.

단백질의 번역후 변형은 대사, 시그널 전달 및 유전자 발현을 비롯한 많은 생물학적 과정을 조절한다. 하지만, 선택적으로 변형된 단백질의 균질한 집단을 생성하는 것과 관련된 합성적 문제는 이들 변형이 단백질 구조와 기능에 미치는 효과를 상세히 연구하는 것을 방해해 왔다. 예를 들어, 당화는 진핵 생물에서 가장 일반적인 단백질의 번역 후 변형중의 하나이며, 접힘 및 분비에서부터 생물분자 인식 및 혈청 반감기까지 광범위한 단백질 기능에 영향을 미친다. 예를 들어, R. A. Dwek, (1996) Chem. Rev. 96: 683을 참고한다. 당화의 효과에 대한 이해에 상당한 진전이 있었지만, 올리고당 쇄의 구체적인 역할 및 그들의 구조와 기능간의 관계는 이제 이해되기 시작하고 있다. 예를 들어, C. R. Bertozzi, & L. L. Kiessling, (2001) Science 291: 2357를 참고한다. 주요 난제는 당단백질이 일반적으로 당형태들의 혼합물로 생산되어, 천연 공급원으로부터 독특한 당형태를 분리하는 것을 어렵게 한다는 것이다. 구조적으로 정의된 당형태를 합성하는 다양한 방법이 개발되었으나, 모두 생산된 당단백질의 크기, 양 및/또는 질에 심각한 제한을 가한다. 예를 들어, P. Sears, & C. H. Wong, (2001) Science 291: 2344 ; M. Wacker et al., (2002) Science 298: 1790; B. G. Davis, (2002) Chem. Rev. 102: 579; 및, H. C. Hang, & C. R. Bertozzi, (2001) Acc. Chem. Res. 34: 727를 참고한다. 본 발명은 이들 및 기타 문제를 해결하며, 당단백질과 당단백질 모방체 및 원하는 당화 패턴을 갖는 당단백질의 합성 방법을 제공한다. 본 발명의 당단백질과 당단백질 모방체는 치료적 당단백질의 균질한 당형태를 생산하고/하거나 당화된 단백질의 구조 및 기능에 대한 연구를 촉진하는 데 유용성을 갖는다.

당화

본 발명은 당단백질의 합성 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하고; 그리고 상기 제1 반응성 기를 당 부분에 부착된 제2 반응성 기와 반응시켜 공유 결합을 형성시키고 당 부분을 단백질에 부착시키는 것에 관련된다.

다양한 적합한 반응성 기가 당업계에 공지되어 있다. 그러한 적합한 반응성 기는 예를 들어, 아미노, 하이드록실, 카복실, 카복실레이트, 카보닐, 알케닐, 알키닐, 알데히드, 에스테르, 에테르(예, 티오-에테르), 아미드, 아민, 니트릴, 비닐, 설파이드, 설포닐, 포스포릴, 또는 유사한 화학적 반응성 기를 포함할 수 있다. 추가의 적절한 반응성 기는 말레이미드, N-하이드록시석신이미드, 설포-N-하이드록시석신이미드, 니트릴로트리아세트산, 활성 하이드록실, 할로아세틸(예, 브로모아세틸, 이오도아세틸), 활성 카복실, 하이드라자이드, 에폭시, 아지리딘, 설포닐클로라이드, 트리플루오로메틸디아지리딘, 피리딜디설파이드, N-아실-이미다졸, 이미다졸카바메이트, 비닐설폰, 석신이미딜카보네이트, 아릴아지드, 안하이드리드, 디아조아세테이트, 벤조페논, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 이미도에스테르, 플루오로벤젠, 비오틴 및 아비딘을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 반응성 기중 하나는 친전자성 부분이고, 제2의 반응성 기는 친핵성 부분이다. 친핵성 부분 또는 친전자성 부분은 비천연 아미노산의 측쇄에 부착될 수 있으며, 상응하는 기는 이어서 당 부분에 부착된다. 공유 결합을 형성하기 위하여 친핵성 부분과 반응하는 적합한 친전자성 부분은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 친전자성 부분은 예를 들어, 카보닐 기, 설포닐 기, 알데히드 기, 케톤 기, 방해된 에스테르 기, 티오에스테르 기, 안정한 이민 기, 에폭시드 기, 아지리딘 기 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 친전자성 부분과 반응할 수 있는 적합한 친핵성 부분은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 친핵체는 예를 들어, 지방족 또는 방향족 아민을 포함하며, 예를 들어 에틸렌디아민이 있다. 다른 구체예에서, 반응성 기는 -NR¹-NH₂(하이드라자이드), -NR¹(C=O)NR²NH₂(세미카바자이드), --NR¹(C=S)NR²NH₂(티오세미카바자이드), -(C=O)NR¹NH₂(카보닐하이드라자이드), -(C=S)NR¹NH₂(티오카보닐하이드라자이드), -(SO₂)NR¹NH₂(설포닐하이드라자이드), -NR¹NR²(C=O)NR³NH₂(카바자이드), -NR¹NR²(C=S)NR³NH₂(티오카바자이드), -O-NH₂(하이드록실아민) 등이며, 이 때 R¹, R²및 R³는 독립적으로 H, 또는 탄소수 1∼6의 알킬 부분이며, 바람직하게는 수소이다. 본 발명의 한 태양에서, 반응성 기는 하이드라자이드, 하이드록실아민, 세미카바자이드, 카보하이드라자이드, 설포닐하이드라자이드 등이다.

친핵체와 친전자성 부분 사이의 반응 생성물은 일반적으로 원래 친핵성 부분에 존재하는 원자를 포함한다. 알데히드 또는 케톤과 친핵성 부분을 반응시켜 얻어진 일반적인 결합은 사용된 친핵성 부분 및 상기 친핵성 부분과 반응된 친전자성 부분(예, 알데히드, 케톤 및/또는 기타)에 따라, 옥심, 아미드, 하이드라존, 환원된 하이드라존, 카보하이드라존, 티오카보하이드라존, 설포닐하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 또는 유사한 관능기와 같은 반응 생성물을 포함한다. 카복실산과의 결합은 일반적으로 카보하이드라자이드 또는 하이드록삼산으로 불린다. 설폰산과의 결합은 일반적으로 설포닐하이드라자이드 또는 N-설포닐하이드록실아민으로 불린다. 생성된 결합은 이어서 화학적 환원에 의해 안정화될 수 있다.

일부 구체예에서, 당단백질은 당 부분이 부착된 비천연 아미노산을 폴리펩티드내로 도입하여 합성된다. 예를 들어, 오르소고날 O-tRNA/O-RS를 이용하여 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 당 부분을 가진 비천연 아미노산을 성장중인 폴리펩티드쇄내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 여기서 "비천연 아미노산을 갖는 단백질의 제조" 섹션을 참고한다.

글리코실트랜스퍼라제

본 발명은 아미노산-연결된 당 부분 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산이 추가로 당화되는 방법을 제공한다. 이들 당화 단계는 바람직하게는 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제, 글리코시다제, 또는 당업계에 공지된 다른 효소를 이용하여 효소적으로 수행된다. 일부 구체예에서, 복수의 효소적 단계를 2 이상의 상이한 글리코실트랜스퍼라제를 함유한 단일 반응 혼합물에서 실시한다. 예를 들어, 반응 혼합물에 시알릴트랜스퍼라제와 갈락토실트랜스퍼라제 둘 다를 포함시켜 갈락토실화 및 시알화 단계를 동시에 수행할 수 있다.

글리코실트랜스퍼라제 반응에 관련된 효소적 당 합성을 위하여, 본 발명의 재조합 세포는 선택적으로 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 이종성 유전자 적어도 하나를 함유한다. 많은 글리코실트랜스퍼라제 및 그들의 폴리뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다. 예를 들어, "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases," (www. vei. co. uk/TGN/gt guide. htm의 웹사이트에 있음)를 참고한다.

글리코실트랜스퍼라제 아미노산 서열 및 아미노산 서열이 추론될 수 있는, 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또한 GenBank, Swiss-Prot, EMBL 및 기타를 비롯한 다양한 공지의 데이터베이스에서 발견된다.

본 발명의 세포에서 이용될 수 있는 글리코실트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산 트랜스퍼라제, 갈락투론산 트랜스퍼라제, 올리고사카릴트랜스퍼라제 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 적합한 글리코실트랜스퍼라제는 원핵 생물뿐만 아니라 진핵 생물에서 얻어진 것들을 포함한다.

글리코실트랜스퍼라제의 수용체는 본 발명 방법에 의해 변형될 당단백질상에 존재할 것이다. 적합한 수용체는 예를 들어 Galβ1,4GalNAc-, Galβ1,3GalNAc-, 락토-N-테트라오즈-, Galβ1,3GlcNAc-, Galβ1,4GlcNAc-, Galβ1,3Ara-, Galβ1, 6GlcNAc- 및 Galβ1,4Glc-(락토스)와 같은 갈락토실 수용체를 포함한다. 다른 수용체는 당업자에게 공지되어 있다(예, Paulson et al. (1978) J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 참고). 일반적으로, 수용체는 당단백질에 부착되는 당 부분 쇄의 일부를 형성한다.

효소 양 또는 농도는 촉매작용의 초기 속도의 측정값인 활성 유닛으로 표현된다. 1 활성 유닛은 주어진 온도(일반적으로 37℃) 및 pH 값(일반적으로 7.5)에서 분당 1 μmol의 생성물의 형성을 촉매한다. 따라서 효소 10 유닛은 10 μmol의 기질이 37℃의 온도와 7.5의 pH에서 1분동안 10 μmol의 생성물로 전환되는 효소의 촉매적 양이다. 효소는 용액중에서 자유롭게 이용되거나 또는 중합체와 같은 지지체에 결합될 수 있다. 따라서 반응 혼합물은, 일부 침전물이 반응동안 형성될 수 있기는 하지만, 초기에는 실질적으로 균질하다.

당화 반응은 적절한 글리코실트랜스퍼라제 및 수용체에 더하여, 글리코실트랜스퍼라제를 위한 자당 공여자로 작용하는 활성 뉴클레오티드 자당을 포함한다. 반응물은 또한 글리코실트랜스퍼라제 활성을 촉진하는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 이들 성분은 2가 양이온(예, Mg⁺² 또는 Mn⁺²), ATP 재생에 필요한 물질, 포스페이트 이온 및 유기 용매를 포함할 수 있다. 상기 과정에 이용되는 다양한 반응물의 농도 또는 양은 온도 및 pH 값과 같은 반응 조건 및 당화될 수용체 당의 선택 및 양을 비롯한 많은 인자들에 의존한다. 반응 매질은 또한 가용화 세제(예, 트리톤 또는 SDS) 및 필요하면 메탄올 또는 에탄올과 같은 유기 용매를 포함한다.

본 발명의 방법을 이용하여 생산된 올리고당은 당업계에 공지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 예를 들어, 탄수화물 유닛은 예를 들어 알카라인 β-제거에 의해 탄수화물 부분으로부터 방출되고, 젤 여과에 의해 폴리펩티드로부터 분리될 수 있다. 이어서 생성된 올리고당은 젤 여과, HPLC, 박층 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 또는 그 조합과 같은 하나 이상의 표준 기법을 이용하여 서로 분리되며, 완전히 분석된다. 정제된 올리고당 유닛의 완전한 구조적 분석은 단당류 유닛, 그들의 고리 형태, 형태(D 또는 L), 아노머 결합(α또는 β), 자당 사이의 결합의 위치 및 그 순서의 결정을 필요로 한다. 또한, 임의의 치환기의 위치도 확립된다. 메틸화 분석은 단당류 사이의 글리코시드 결합의 위치를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 자당 잔기의 아노머 형태는 예를 들어, ¹H NMR 분광법을 이용하여 확인할 수 있다. 완전한 구조적 탄수화물 분석을 수행하기 위해 이용되는 조건 및 방법은 일반적으로 Beeley, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. Burdon and Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1985), Hounsell,"Glycoanalysis Protocols", Meth. Mol. Biol. Vol. 76,1998 및 El Rassi, Carbohydrate Analysis: High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis, Elsevier Science Ltd, Vol. 58 (1994)에 개시된다.

올리고당의 자당을 완전히 특징짓기 위한 추가의 기법은 FAB-MS(고속 원자 충격-질량 분광법), HPAE(고 pH 음이온 교환 크로마토그래피) 및 NMR(핵 자기 공명 분광법, 특히 ¹H -NMR 및 ¹³C-NMR)을 포함한다. 이들 기법은 상보적이다. 올리고당의 구조를 완전히 특징짓기 위해 이들 기법을 어떻게 이용하는 지 그 예는 Spellman et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 14100 및 Stanley et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 11374에 의한 분석에서 발견할 수 있다. 다른 방법은 양이온 고속 원자 충격 질량 분광법(FAB-MS) 및 가스 크로마토그래피-전자 충격 질량 분광법(GC/EI-MS)에 의한 메틸화 분석을 포함한다(EPO 출원 89305153.2호 참고).

당단백질의 생체내 합성

당단백질을 생체내에서 합성하기 위하여, 대상 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터내로 도입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 당부분을 부착하고자 하는 위치에서 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 발현 벡터는 비천연 아미노산, 예를 들어 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산; 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날 tRNA; 및 오르소고날 tRNA에 비천연 아미노산의 부착을 촉진하는 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS)를 포함하는 숙주 세포내로 도입된다. O-RS는 비천연 아미노산을 오르소고날 tRNA에 부착시키며, 이어서 이 tRNA는 비천연 아미노산을 생성중인 단백질 내로 도입한다.

일부 구체예에서, 숙주 세포는 추가로 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 숙주 세포는 비천연 아미노산에 부착된 당 부분에 하나 이상의 자당의 부가를 촉매할 수 있다.

표적 핵산을 박테리아 숙주내로 도입하는 몇 가지 공지의 방법이 이용가능하며, 이들은 본 발명에 이용될 수 있다. 이들은 DNA를 함유한 박테리아 원형질체와 수용자 세포의 융합, 전기천공, 투사 충격 및 바이러스 벡터를 이용한 감염 등을 포함한다. 박테리아 세포를 이용하여 본 발명의 DNA 구조체를 함유한 플라스미드의 수를 증폭시킬 수 있다. 박테리아를 로그 단계까지 성장시키고 박테리아 내의 플라스미드를 공지의 다양한 방법으로 분리할 수 있다(예, 상기의 Sambrook 참고). 또한, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 많은 키트가 시판되고 있다(예, 파마시아 바이오텍에서 판매하는 EasyPrep^TM,FlexiPrep^TM; 스트라타젠에서 판매하는 StrataClean^TM; 및 퀴아젠에서 판매하는 QIAprep^TM). 분리되고 정제된 플라스미드는 이어서 추가로 조작되어, 세포를 형질감염시키거나 유기체를 감염시키기 위한 관련 벡터내로 포함될 다른 플라스미드를 생산한다.

조작된 숙주 세포는 예를 들어 스크리닝 단계, 프로모터 활성화 또는 형질전환체 선별과 같은 활동에 적합하도록 변형된 통상의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 이들 세포는 선택적으로 형질전환 유기체로 배양될 수 있다.

예를 들어, (예, 후속되는 핵산 분리를 위한) 세포 분리와 배양을 위한 다른 유용한 참고 문헌은 Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York 및 그 안에 인용된 문헌; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 및 Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL를 포함한다.

분자 생물학적 기법을 개시한 일반적인 교과서는 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001 ("Sambrook") 및 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al.,eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.와 John Wiley & Sons, Inc.의 연합 벤쳐 (2003년까지 보충됨) ("Ausubel"))를 포함한다. 이들 교과서는 돌연변이유발법, 벡터의 이용, 프로모터 및 예를 들어 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 생산을 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 신세타제 및 그 쌍의 생성에 관련된 다수의 관련 토픽을 개시한다.

비천연 아미노산을 갖는 단백질의 제조

본 발명의 특징은 예를 들어, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 포함하는 당단백질을 생산하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 제2 반응성 기와 반응될 때 공유 결합을 형성할 수 있는 적절한 반응성 기가 부착된 비천연 아미노산 하나 이상을 포함하는 당단백질을 생산하는 것에 관련된다. 일부 구체예에서, 비천연 아미노산은 친전자성 부분, 예, 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산을 포함하며, 그리고 알데히드- 또는 케토-부분은 친핵성 부분과 반응하여 당 부분을 폴리펩티드 또는 단백질에 부착시킨다. 비천연 아미노산 함유 단백질은 단백질 생합성 기계가 오르소고날 tRNA/아미노아실 tRNA 신세타제(O-tRNA/O-RS) 쌍을 이용하여 추가의 유전적으로 코딩된 아미노산을 수용하도록 변화된 세포에 의해 합성된다. 구체적으로, 상기 세포는 셀렉터 코돈(예, 정지 코돈, 4 염기 코돈 및 기타)을 인식하는 오르소고날 tRNA 및 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산을 오르소고날 tRNA에 부착시킬 수 있는 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산 하나 이상을 포함하는 당단백질을 생산하는 것에 관련된다. 비천연 아미노산 함유 단백질은 단백질 생합성 기계가 오르소고날 tRNA/아미노아실 tRNA 신세타제(O-tRNA/O-RS) 쌍을 이용하여 추가의 유전적으로 코딩된 아미노산을 수용하도록 변화된 세포에 의해 합성된다. 구체적으로, 상기 세포는 셀렉터 코돈(예, 정지 코돈, 4 염기 코돈 및 기타)을 인식하는 오르소고날 tRNA 및 당 부분을 가진 비천연 아미노산을 오르소고날 tRNA에 부착시킬 수 있는 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제를 포함한다.

이 기법은 비천연 아미노산이 생체내에서 부위 특이적으로 직접 단백질 내로 도입되도록 한다. 중요하게는, 비천연 아미노산은 일반적인 20개 아미노산 중 하나를 대신하기 보다는, 유전적 레파토리에 부가된다. 단백질은 단백질내의 특정 위치에서 하나 또는 다수(동일하거나 상이함)의 비천연 아미노산을 가질 수 있다. 단백질을 유도체화하기 위한 초기 방법과는 달리, O-tRNA/O-RS 쌍의 이용은 필요하다면, 특정 아미노산을 그것이 단백질에서 발생하는 각 위치에서 유도체화시키기보다는, 특정 아미노산이 단백질에서 발생하는 위치중 단지 하나에서만 비천연 아미노산을 갖는 단백질을 만들수 있도록 한다.

당단백질을 만들기 위하여, 오르소고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 도입에 적응된 숙주 세포와 유기체를 이용할 수 있다. 숙주 세포는 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 신세타제를 발현하는 벡터 하나 이상 및 유도체화될 단백질을 코딩하는 벡터로 유전적 조작된다(예, 형질전환, 형질도입, 또는 형질감염됨). 이들 성분의 각각은 동일한 벡터상에 있거나, 또는 각각이 별도의 벡터상에 있을 수 있으며, 두 성분이 한 벡터에 그리고 제3의 성분은 제2의 벡터에 존재할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 천연 폴리뉴클레오티드, 또는 접합된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 신세타제 및 유도체화될 단백질을 위한 코딩 영역은 원하는 숙주 세포에서 기능하는 유전자 발현 조절 성분에 작동적으로 연결된다. 일반적인 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 전사 및 번역 개시 서열 및 특정 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 선택적으로 적어도 하나의 독립적인 종결인자 서열을 함유한 포괄적인 발현 카세트, 진핵 생물 또는 원핵 생물 또는 둘 다(예, 셔틀 벡터)에서 카세트의 복제를 허용하는 서열 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 다를 위한 선별 마커를 포함한다. 벡터는 원핵, 진핵 또는 바람직하게는 둘 다에서의 복제 및/또는 도입에 적합하다. Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435: 10 (1995); Berger and Kimmel(상기) ; Sambrook(상기) 및 Ausubel(상기)를 참고한다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파아지의 카탈로그는 예를 들어, ATCC에 의해 발행된 The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)에 의해 제공된다. 서열 결정, 클로닝 및 분자 생물학의 다른 태양을 위한 부가적인 기본 과정 및 그 이론적 참고 사항은 또한 Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Proteins and Polypeptides of Interest에서 발견된다.

예를 들어, 당단백질을 생산하는 방법은 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하며 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 적절한 배지에서 성장시키는 단계, 비천연 아미노산, 예를 들어, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 제공하는 단계 및 상기 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 가진 핵산의 번역동안 단백질내의 특정 위치내로 상기 비천연 아미노산을 도입하여 단백질을 생산하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 추가로 하기를 포함한다: 세포에서 작용하고 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날-tRNA(O-tRNA); 및 예를 들어 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 오르소고날 아미노아실-tRNA 신세타제(O-RS). "비천연 아미노산의 생체내 도입"이라는 제목의 WO 2002/085923호는 이 과정을 개시하며 여기서 참고로 도입된다. 예를 들어, O-tRNA/O-RS 쌍이 숙주 내로 도입될 때, 상기 쌍은 성장 배지에 외부에서 첨가될 수 있는 비천연 아미노산, 예, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산이 생체내에서 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 도입되도록 한다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 생체외 번역 시스템중에 또는 생체내 시스템중에 있을 수 있다. 2003년 10월 15일에 출원되고 대리인 문서 번호 54-000170PCT의 "케토 아미노산의 단백질 내로의 부위 특이적 도입"이라는 제목의 해당 출원을 참고하며 이것은 참고로 본원에 통합된다.

본 발명의 세포는 많은 유용한 양으로 당단백질을 합성하거나 생산하는 능력을 제공한다. 한 태양에서, 상기 조성물은 선택적으로, 예를 들어 적어도 10 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 200 ㎍, 적어도 250 ㎍, 적어도 500 ㎍, 적어도 1 ㎎, 적어도 10 ㎎, 또는 그 이상의 당단백질, 또는 생체내 단백질 생산 방법으로 얻어질 수 있는 양의 당단백질을 포함한다(재조합 단백질 생산 및 정제에 대한 상세 사항은 여기서 제공된다). 다른 태양에서, 단백질은 선택적으로 예를 들어, (예, 약 1 nl∼약 100 L의 부피의) 세포 용해물, 완충액, 약학적 완충액, 또는 기타 액체 현탁액중에, 적어도 리터 당 10 ㎍, 적어도 리터 당 50 ㎍, 적어도 리터 당 75 ㎍, 적어도 리터 당 100 ㎍, 적어도 리터 당 200 ㎍, 적어도 리터 당 250 ㎍, 적어도 리터 당 500 ㎍, 적어도 리터 당 1 mg, 또는 적어도 리터당 10 mg의 단백질의 농도로 조성물에 존재한다. 예를 들어, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산 하나 이상을 포함하는 세포에서 단백질의 대량 생산(예를 들어 생체외 번역과 같은 다른 방법으로 가능한 것보다 많은)은 본 발명의 특징이다.

당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산의 도입은 예를 들어, 크기, 산성도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성, 단백질 부분에의 표적 접근 등을 변화시키기 위해, 예를 들어 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 맞추기 위해 이루어질 수 있다. 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 개선된, 또는 전혀 새로운 촉매적 또는 물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 특성은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 단백질 내로 포함시켜 선택적으로 변형된다: 독성, 생물분포, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매적 능력, 반감기(예, 혈청 반감기), 다른 분자와 공유적 또는 비공유적으로 반응하는 능력 등. 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산 적어도 하나를 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들어, 신규의 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업적 효소, 결합 단백질(예, 항체) 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 위해 유용하다. 예를 들어, Dougherty, (2000) Natural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4: 645-652를 참고한다.

본 발명의 한 태양에서, 조성물은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산 적어도 하나, 예를 들어, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯, 적어도 일곱, 적어도 여덟, 적어도 아홉, 또는 적어도 열 또는 그 이상을 갖는 단백질 하나 이상을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 그 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 그 이상의 상이한 부위가 있을 수 있다. 다른 태양에서, 조성물은 단백질에 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상 모두 미만이, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산으로 치환된 단백질을 포함한다. 하나보다 많은 비천연 아미노산을 가진 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(예, 단백질은 둘이상의 상이한 타입의 비천연 아미노산을 포함하거나 또는 동일한 비천연 아미노산 둘을 포함할 수 있다). 둘보다 많은 비천연 아미노산을 가진 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나, 또는 적어도 하나의 상이한 비천연 아미노산과 동일한 종류의 비천연 아미노산 다수의 조합일 수 있다.

본질적으로 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은 당 부분이 부착된 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 단백질(또는 그 일부)(및 예를 들어, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 임의의 상응하는 코딩 핵산)은 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 관련 번역 시스템에서 하나 이상의 적절한 셀렉터 코돈을 포함하도록 임의의 이용가능한 돌연변이 방법을 맞춤으로써 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 수많은 공지 단백질을 확인하려고는 하지 않는다. 공지 단백질을 위한 일반적인 서열 저장소는 GenBank EMBL, DDBJ 및 NCBI를 포함한다. 다른 저장소는 인터넷을 서치함으로써 쉽게 확인될 수 있다.

일반적으로, 상기 단백질은 임의의 이용가능한 단백질(예, 치료 단백질, 진단 단백질, 산업적 효소, 또는 그 일부 등)과 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상 동일하며, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 당 부분이 부착되는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하도록 변형될 수 있는 치료, 진단 및 기타 단백질의 예는 상기한 WO2002/085923호에 개시되며 이에 한정되지 않는다. 당 부분이 연결된 아미노산 및/또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 치료, 진단 및 기타 단백질의 예는 예를 들어, 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체(항체에 대한 추가의 상세 사항은 하기에 개시됨), 아포지질단백질, 아포단백질, 심방 나트륨뇨 배설 항진 인자, 심방 나트륨뇨 배설 항진 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인(예, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), 칼시토닌, CC 케모카인(예, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), CD40 리간드, C-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제자, 보체 수용체 1, 사이토카인(예, 상피 중성구 활성화 펩티드-78, GROα/MGSA, GROβ, GROγ, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1), 상피 성장 인자(EGF), 에리트로포이에틴("EPO", 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입에 의한 변형을 위한 바람직한 표적), 박피 독소 A와 B, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, G-CSF, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 헤지호그 단백질(예, 소닉(Sonic), 인디안(Indian), 디저트(Desert)), 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(HGF), 히루딘, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린형 성장 인자(IGF), 인터페론(예, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 인터루킨 (예, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 등), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 중성구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬(예, 인간 성장 호르몬), 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, 발열성 외독소 A, B 및 C, 릴랙신, 레닌, SCF, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체(IL-1,2, 3,4, 5,6, 7,9, 10,11, 12,13, 14, 15), 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 즉 스타필로코커스 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD), 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-1), 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성인자, 종양 괴사 인자 베타(TNF 베타), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 종양 괴사 인자-알파(TNF 알파), 혈관 내피 성장 인자(VEGEF), 유로키나제 및 기타 다수를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

예를 들어, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 여기서 개시된 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 상기 조성물과 방법을 이용하여 만들어질 수 있는 한 가지 단백질 부류는 전사 조절인자 또는 그 일부를 포함한다. 예시적인 전사 조절인자는 세포 성장, 분화, 조절 또는 기타를 조절하는 유전자 및 전사 조절인자 단백질을 포함한다. 전사 조절 인자는 원핵생물, 바이러스 및 진균, 식물, 효모, 곤충 및 포유류를 포함한 동물을 비롯한 진핵생물에서 발견되며, 광범위한 치료 표적을 제공한다. 발현 및 전사 활성인자는 예를 들어, 수용체에 대한 결합, 시그널 전달 캐스캐이드의 자극, 전사 인자의 발현 조절, 프로모터와 인핸서에 대한 결합, 프로모터와 인핸서에 결합하는 단백질에 대한 결합, DNA의 풀림, 프리-mRNA의 스플라이싱, RNA의 폴리아데닐화 및 RNA 분해에 의한 것과 같은 많은 기작에 의해 전사를 조절하는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 단백질의 한 부류(예, 당 부분이 연결된 아미노산 및/또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 하나 이상을 갖는 단백질)는 사이토카인, 염증 분자, 성장 인자, 그 수용체 및 종양유전자 생성물, 예, 인터루킨(예, IL-1, IL-2, IL-8 등), 인터페론, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-α, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA- 4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1 및 히아루린/CD44; 시그널 전달 분자 및 상응하는 종양유전자 생성물, 예, Mos, Ras, Raf 및 Met; 및 전사 활성인자 및 억제인자, 예, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel 및 에스트로젠, 프로제스테론, 테스토스테론, 알도스테론, LDL 수용체 리간드 및 코르티코스테론을 위한 것과 같은 스테로이드 호르몬 수용체와 같은 발현 활성인자를 포함한다.

당 부분이 부착되는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산 하나 이상을 갖는 효소(예, 산업적 효소) 또는 그 일부가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 효소의 예는 예를 들어, 아미다제, 아미노산 라세마제, 아실라제, 디할로게나제, 디옥시게나제, 디아릴프로판 퍼옥시다제, 에피머라제, 에폭시드 하이드롤라제, 에스테라제, 이소머라제, 키나제, 글루코스 이소머라제, 글리코시다제, 글리코실 트랜스퍼라제, 할로퍼옥시다제, 모노옥시게나제(예, p450), 리파제, 리그닌 퍼옥시다제, 니트릴 하이드라타제, 니트릴라제, 프로테아제, 포스파타제, 서브틸리진, 트랜스아미나제 및 뉴클레아제를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 변형될 수 있는 많은 단백질이 시판되며(예, 시그마 바이오사이언스 2002 카탈로그 및 가격 리스트 참고), 상응하는 단백질 서열 및 유전자, 그리고 일반적으로 많은 그 변이체가 공지되어 있다(예, Genbank). 이들 중 임의의 것은 예를 들어, 하나 이상의 치료적, 진단적 또는 효소적 특성에 대해 단백질을 변화시키기 위하여, 본 발명에 따른 당 부분이 연결된 아미노산을 포함하거나 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 하나 이상을 삽입시켜 변형될 수 있다. 치료적으로 관련된 특성의 예는 혈청 반감기, 저장 반감기, 안정성, 면역원성, 치료적 활성, 검출가능성(예, 비천연 아미노산에서 리포터기(예, 표지 또는 표지 결합 부위)의 포함에 의해), 특이성, LD₅₀ 또는 기타 부작용의 감소, 위장관을 통해 신체로 들어가는 능력(예, 경구 이용성) 등을 포함한다. 관련 진단 특성의 예는 저장 반감기, 안정성, 진단 활성, 검출성, 특이성 등을 포함한다. 관련 효소적 특성의 예는 저장 반감기, 안정성, 특이성, 효소 활성, 생산 능력 등을 포함한다.

다양한 다른 단백질이 본 발명의 비천연 아미노산 하나 이상을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 예를 들어, 감염성 진균, 예, 아스퍼질러스, 캔디다 종; 박테리아, 특히 병원성 박테리아의 모델인 이.콜라이 및 포도상구균(예, 아우레우스), 또는 연쇄상 구균(예, 뉴모니에)와 같은 의학적으로 중요한 박테리아; 포자충류(예, 플라스모디아), 근족충류(예, 엔타모에바) 및 편모충(트리파노소마, 레이쉬마니아, 트리코모나스, 기아르디아 등)과 같은 원생 동물; (+) RNA 바이러스(예, 폭스바이러스, 예, 백시니아; 피코르나바이러스, 예, 폴리오; 토가바이러스, 예, 루벨라; 플라비바이러스, 예, HCV; 및 코로나바이러스), (-) RNA 바이러스(예, 랍도바이러스, 예, VSV; 파라믹소바이러스, 예, RSV; 오르토믹소바이러스, 예, 인플루엔자; 부냐바이러스; 및 아레나바이러스), dsDNA 바이러스(레오바이러스), RNA 에서 DNA 바이러스, 즉 레트로바이러스, 예, HIV와 HTLV 및 B형 간염 바이러스와 같은 DNA 에서 RNA 바이러스로부터의 단백질에서, 하나 이상의 백신 단백질중의 천연 아미노산 하나 이상을 당 부분이 연결된 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산으로 치환시키거나, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 도입하는 것을 포함할 수 있다.

곤충 내성 단백질(예, Cry 단백질), 전분 및 지질 생산 효소, 식물 및 곤충 독소, 독소-내성 단백질, 미코독소 탈독성화 단백질, 식물 성장 효소(예, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제, "RUBISCO"), 리폭시게나제(LOX) 및 포스포에놀피루베이트(PEP) 카복실라제와 같은 농업적으로 관련된 단백질 또한 본 발명의 비천연 아미노산의 도입 및/또는 당 첨가에 의한 변형을 위한 적합한 표적이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 대상 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 일부)는 핵산에 의해 코딩된다. 일반적으로, 상기 핵산은 적어도 하나의 셀렉터 코돈, 적어도 2개의 셀렉터 코돈, 적어도 3개의 셀렉터 코돈, 적어도 4개의 셀렉터 코돈, 적어도 5개의 셀렉터 코돈, 적어도 6개의 셀렉터 코돈, 적어도 7개의 셀렉터 코돈, 적어도 8개의 셀렉터 코돈, 적어도 9개의 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

면역반응성에 의한 폴리펩티드의 한정

본 발명의 당폴리펩티드는 다양한 새로운 폴리펩티드 서열(예, 당 부분이 연결될 수 있는 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 여기서 번역 시스템에서 합성된 단백질의 경우에는 당부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 신규 신세타제의 경우에는, 표준 아미노산의 신규 서열을 포함하는)을 제공하므로, 당폴리펩티드는 또한 예를 들어 면역 분석에서 인식될 수 있는 새로운 구조적 특징을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항혈청 및 그러한 항혈청에 의해 결합되는 폴리펩티드의 생성은 본 발명의 특징이다. 여기서 이용될 때, 용어 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 코딩되는 폴리펩티드, 또는 애널라이트(항원)에 특이적으로 결합하여 인식하는 그 단편을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 그 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 단일쇄 항체 등을 포함한다. Fab 단편 및 파아지 디스플레이를 비롯한 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편을 비롯한 면역글로불린 단편 또한 여기서 이용되는 용어 "항체"에 포함된다. 예를 들어, 항체 구조 및 용어를 위해서는 Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New York를 참고한다.

예를 들어, 본 발명은 본 발명의 다양한 서열중의 하나 이상의 서열로부터 선택된 신세타제 아미노산 서열을 포함하는 면역원에 대해 생성된 항체 또는 항혈청에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 면역반응하는 신세타제 단백질을 포함한다. 다른 상동체와의 교차 반응성을 제거하기 위하여, 항체 또는 항혈청은 야생형 메타노코커스 잔나쉬(M.jannaschii) 티로실 신세타제(TyrRS)와 같은 이용가능한 신세타제, 또는 WO 2002/085923호에 개시된 것중 임의의 것과 같은 이용가능한 신세타제로 차감된다. 야생형 엠. 잔나쉬 티로실 신세타제(TyrRS), 또는 이전 서열이 핵산에 해당하는 경우, 그 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 선택적으로 생성되고 항체/항혈청 차감 목적을 위해 이용된다.

한 가지 일반적인 형태에서, 면역분석법은 본 발명의 신세타제 서열 중 하나 이상 또는 그 실질적 부분 서열(즉, 제공된 전 길이 서열의 적어도 약 30%)을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 이용한다. 이들 서열로부터 유래된 잠재적인 폴리펩티드 면역원 세트는 이하에 총체적으로 "면역원성 폴리펩티드"로 불린다. 생성된 항혈청은 선택적으로 대조 신세타제 상동체(야생형 TyrRs 및/또는 WO 2002/085923호에 개시된 신세타제)에 대한 낮은 교차반응성을 갖도록 선택되며 임의의 그러한 교차 반응성은 예를 들어, 면역분석에서 폴리클로날 항혈청을 사용하기에 앞서 대조 신세타제 상동체중 하나 이상과 면역흡착시킴으로써 제거된다.

면역분석에 사용하기 위한 항혈청을 생산하기 위하여, 면역원성 폴리펩티드중 하나 이상이 여기서 개시된 대로 생산되고 정제된다. 예를 들어, 재조합 단백질은 재조합 세포에서 생산될 수 있다. 동종 교배된 마우스(마우스의 사실상 유전적 동일성으로 인해 결과가 보다 재현성이므로 이 분석에 이용됨)를 프로인트 애쥬번트와 같은 표준 애쥬번트와 함께 면역원성 단백질을 이용하고, 표준 마우스 면역 프로토콜(예, 항체 생성, 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 이용될 수 있는 면역분석 형태 및 조건의 표준 설명을 위해서는 Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor를 참고한다. 항체의 추가적인 참고문헌 및 설명은 또한 본원에서 개시되며 면역반응성에 의해 폴리펩티드를 정의하는 데 적용될 수 있다)로 면역된다. 다르게는, 여기서 개시된 서열로부터 유래된 합성 또는 재조합 폴리펩티드 하나 이상이 담체 단백질에 접합되어 면역원으로 이용된다. 단백질, 항체, 항혈청 등에 대한 추가의 상세 사항은 상기한 WO 2002/085923호에 개시된다.

폴리클로날 혈청은 예를 들어, 고체 지지체상에 고정된 면역원성 단백질 하나 이상을 이용한 고체상 면역분석과 같은 면역분석에서 면역원성 폴리펩티드에 대해 수집되고 적정된다. 10⁶ 이상의 역가를 갖는 폴리클로날 항혈청을 선별하여 모으고 대조 신세타제 폴리펩티드로 차감하여 차감되어 모아진 적정된 폴리클로날 항혈청을 생산한다.

차감된 모아진 적정된 폴리클로날 항혈청을 비교용 면역분석에서 대조 상동체에 대해 교차반응성에 대해 시험한다. 이 비교 분석에서, 대조 신세타제 상동체에 대한 결합과 비교할 때, 면역원성 신세타제에 대한 적정된 폴리클로날 항혈청의 결합을 위해 적어도 약 5-10배 더 높은 시그날 대 노이즈 비가 생성되는 차별적 결합 조건이, 차감되고 적정된 폴리클로날 항혈청을 위해 결정된다. 즉, 결합 반응의 엄격도는 알부민 또는 탈지건조유와 같은 비특이적 경쟁자의 첨가에 의해 및/또는 염 조건, 온도 및/또는 기타를 조절하여 조절된다. 이들 결합 조건은 시험 폴리펩티드(면역원성 폴리펩티드 및/또는 대조 폴리펩티드에 비교되는 폴리펩티드)가 모아지고 차감된 폴리클로날 항혈청에 의해 특이적으로 결합되는 지 여부를 결정하기 위해 후속 분석에서 이용된다. 구체적으로, 차별적 결합 조건 하에 대조 신세타제 상동체보다 적어도 2-5배 더 높은 시그날 대 노이즈 비 및 면역원성 폴리펩티드에 비하여 적어도 약 1/2 시그날 대 노이즈 비를 나타내는 시험 폴리펩티드는 공지의 신세타제와 비교할 때 면역원성 폴리펩티드와 상당한 구조적 유사성을 공유하며, 그리고 따라서 본 발명의 폴리펩티드이다.

다른 예에서, 경쟁적 결합 형태의 면역분석이 시험 폴리펩티드의 검출을 위하여 이용된다. 예를 들어, 상기한 대로, 교차 반응성 항체는 대조 폴리펩티드와의 면역흡착에 의해, 모아진 항혈청 혼합물로부터 제거된다. 이어서 면역원성 폴리펩티드를 차감된 수집 항혈청에 노출된 고체 지지체에 고정시킨다. 시험 단백질을 분석에 첨가하여 차감된 수집 항혈청에 대한 결합을 위해 경쟁시킨다. 고정된 단백질과 비교하여, 차감된 수집 항혈청에 대한 결합을 위해 경쟁하는 시험 단백질의 능력을 분석에 첨가된 면역원성 폴리펩티드가 결합을 위해 경쟁하는 능력과 비교한다(면역원성 폴리펩티드는 수집 항혈청에 대한 결합을 위해 고정된 면역원성 폴리펩티드와 효과적으로 경쟁한다). 시험 단백질을 위한 퍼센트 교차반응성을 표준 계산법을 이용하여 계산한다.

평행 분석에서, 대조 단백질이 차감된 수집 항혈청에 대한 결합을 위해 경쟁하는 능력은 선택적으로 면역원성 폴리펩티드가 항혈청에 대한 결합을 위해 경쟁하는 능력과 비교하여 결정된다. 다시, 대조 폴리펩티드를 위한 퍼센트 교차 반응성을 표준 계산법을 이용하여 계산한다. 퍼센트 교차반응성이 대조 폴리펩티드와 비교하여 시험 폴리펩티드에 대해 적어도 5-10배 높거나 또는 시험 폴리펩티드의 결합이 대략 면역원성 폴리펩티드의 결합 범위내일 경우, 시험 폴리펩티드는 수집된 차감 항혈청에 특이적으로 결합한다고 한다.

일반적으로, 면역흡착되고 수집된 항혈청은 임의의 시험 폴리펩티드를 면역원성 및/또는 대조 폴리펩티드에 비교하기 위하여 여기서 개시된 대로 경쟁적 결합 면역분석에 이용될 수 있다. 이 비교를 하기 위하여, 면역원성, 시험 및 대조 폴리펩티드를 각각 광범위한 농도에서 분석하고, 예를 들어 고정된 대조, 시험 또는 면역원성 단백질에의 차감된 항혈청의 결합의 50%를 억제하는 데 요구되는 각 폴리펩티드의 양을 표준 기법을 이용하여 결정한다. 만일 경쟁적 분석에서 결합에 요구되는 시험 폴리펩티드의 양이 필요한 면역원성 폴리펩티드의 양의 2배 미만이면, 그 양이 대조 폴리펩티드를 위한 양보다 적어도 약 5-10배 높으면, 시험 폴리펩티드는 면역원성 단백질에 대해 생성된 항체에 특이적으로 결합하는 것으로 말한다.

특이성의 추가의 결정으로서, 수집된 항혈청은 선택적으로, 생성된 면역원성 폴리펩티드 차감된 수집 항혈청이 면역흡착에 이용된 면역원성 폴리펩티드에 거의 또는 전혀 결합하지 않을 때까지, (대조 폴리펩티드가 아닌) 면역원성 폴리펩티드와 완전히 면역흡착된다. 이어서 상기 완전히 면역흡착된 항혈청을 시험 폴리펩티드와의 반응성에 대해 시험한다. 만일 반응성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않으면(즉, 면역원성 폴리펩티드에 대한 완전히 면역흡착된 항혈청의 결합에 대해 2배 이하의 시그날 대 노이즈 비가 관찰됨), 시험 폴리펩티드는 면역원성 단백질에 의해 유도된 항혈청에 의해 특이적으로 결합된다.

오르소고날 tRNA 및 오르소고날 아미노아실-tRNA 신세타제 쌍

하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 제조하는 데 적합한 번역 시스템이 제목 "오르소고날 tRNA-아미노아실tRNA 신세타제 쌍의 생산을 위한 방법 및 조성물"의 국제 특허 출원 공개 WO2002/086075호 및 상기한 WO 2002/085923호에 개시된다. 이들 출원의 각각은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다. 그러한 번역 시스템은 일반적으로 오르소고날 tRNA(O-tRNA), 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS) 및 비천연 아미노산(예를 들어, 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산)을 포함하는 세포를 포함하며, 이 때 O-RS는 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화한다. 상기 세포는 비천연 아미노산을 성장중인 폴리펩티드 쇄내로 포함시키기 위해 상기 성분들을 이용한다.

오르소고날 쌍은 O-tRNA, 예, 억제자 tRNA, 프레임쉬프트 tRNA 등 및 O-RS로 구성된다. O-tRNA는 내인성 신세타제에 의해서는 아실화되지 않으며 전술한 대로 셀렉터 코돈을 디코딩할 수 있다. O-RS는 예를 들어, 연장된 안티코돈 루프를 가진 O-tRNA를 인식하며, 비천연 아미노산, 예를 들어, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 다수의 오르소고날 tRNA/신세타제 쌍의 개발은 다른 코돈을 이용하는 다수의 비천연 아미노산이 동시에 도입되도록 할 수 있다. 예시적인 O-tRNA 및 O-RS 서열을 위해서는 실시예 5를 참고한다.

O-tRNA와 O-RS는 자연 발생일 수도 있으며 또는 공급원과 숙주하에 설명되는 다양한 유기체로부터의 자연 발생 tRNA 및/또는 RS의 돌연변이에 의해 유도될 수 있다. 다양한 구체예에서, O-tRNA와 O-RS는 적어도 하나의 유기체로부터 유래된다. 다른 구체예에서, O-tRNA는 제1의 유기체의 자연 발생 또는 돌연변이된 자연 발생 tRNA로부터 유래되고 O-RS는 제2의 유기체로부터의 자연 발생 또는 돌연변이된 자연 발생 RS로부터 유래된다.

구체적으로, 이들 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 제1의 유기체로부터의 적어도 하나의 tRNA로부터 유래된 tRNA 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1의 유기체로부터의 RS의 부재하에 제2의 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 신세타제(RS)에 의해 아미노아실화되는 tRNA를 위해 상기 라이브러리를 음성적으로 선별하여 tRNA 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르소고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원을 위해 상기 tRNA 집단을 선별하여, 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계. 상기 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하며 제2의 유기체로부터의 RS에 의해 효과적으로 인식되지 않으며 O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 상기 방법은 또한 하기 단계를 포함한다: (d) 제3의 유기체로부터의 적어도 하나의 아미노아실-tRNA 신세타제(RS)로부터 유래된 돌연변이 RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연 아미노산과 천연 아미노산의 존재하에 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원을 위해 RS 라이브러리를 선별하여 활성 RS의 집단을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연 아미노산의 부재하에 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS를 위한 집단을 음성적으로 선별하여 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 제공하며, 이 때 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연 아미노산, 예, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산에 대해 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS 및 재조합 O-tRNA를 포함하는 단계.

오르소고날 쌍을 생성하기 위한 한 가지 전략은 O-tRNA 또는 O-RS를 스크린하고/하거나 선별하기 위한 돌연변이 라이브러리를 생성하는 것에 관련된다.

오르소고날 tRNA/신세타제 쌍을 생성하기 위한 제2의 전략은 이종성 tRNA/신세타제 쌍을 들여오는 것, 예를 들어, 다른 것, 예, 공급원 유기체로부터의 쌍을 숙주 세포내로 도입하는 것에 관련된다. 이종성 신세타제 후보의 특성은 예를 들어, 임의의 숙주 세포 tRNA를 충전시키지 않는 것을 포함하며, 이종성 tRNA 후보의 특성은 예를 들어, 임의의 숙주 세포 신세타제에 의해 아실화되지 않는 것을 포함한다. 또한, 이종성 tRNA로부터 유래된 이종성 tRNA는 모든 숙주 세포 신세타제에 오르소고날이다.

오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS)

본 발명의 O-RS는 생체내 또는 생체외에서, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 본 발명의 O-RS는 O-RS를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부에 의해 번역 시스템, 예를 들어 세포, 또는 생체내 번역 시스템에 제공될 수 있다. 예를 들어, O-RS는 서열 번호 1∼6에 개시된 아미노산 서열, 또는 그 보존적 변이체를 포함한다. 다른 예에서, O-RS 또는 그 일부는 서열 번호 1∼6을 포함하는 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나, 또는 서열 번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 예시적인 O-RS 분자의 서열을 위해서는 본원의 표 2 및 실시예 5를 참고한다. 또한 본원의 "핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체" 섹션을 참고한다.

O-RS의 생산 방법은 야생형 신세타제의 골격으로부터 돌연변이 신세타제의 집단을 생성하고, 이어서 일반적인 20개 아미노산에 비하여 알데히드- 또는 케토-부분 또는 당 부분을 갖는 비천연 아미노산에 대한 그들의 특이성에 기초하여 돌연변이 RS를 선별하는 것에 기초한다. 그러한 신세타제를 분리하기 위하여, 본 발명의 선별 방법은 하기와 같다: (i) 시작 라운드로부터의 원하는 신세타제의 활성이 낮을 수 있으며 집단이 작으므로, 민감하며; (ii) 다른 선별 라운드에서 선별 엄격도를 변화시키는 것이 바람직하므로, "변화가능하며"; 그리고 (iii) 다른 비천연 아미노산을 위해 이용될 수 있도록 일반적이다.

오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제를 생성하는 방법은 예를 들어, 신세타제내의 활성 부위에서, 신세타제의 편집 기작 부위에서, 신세타제의 상이한 도메인들을 결합시켜 다른 부위들에서, 신세타제를 돌연변이시키고 선별 과정을 적용하는 것을 포함한다. 양성 선별 및 후속되는 음성 선별의 조합에 기초한 전략이 이용된다. 양성 선별에서는, 양성 마커의 비필수 위치에서 도입된 셀렉터 코돈의 억제는 세포가 양성 선별 압력하에 생존하도록 한다. 천연 및 비천연 아미노산 둘 다의 존재하에서, 생존자는 천연 또는 비천연 아미노산으로 오르소고날 억제자 tRNA를 충전시키는 활성 신세타제를 코딩한다. 비천연 아미노산의 부재하에서의 음성 선별에서는, 음성 마커의 비필수 위치에서 도입된 셀렉터 코돈의 억제는 천연 아미노산 특이성을 갖는 신세타제를 제거한다. 음성 및 양성 선별의 생존자는 비천연 아미노산만으로 오르소고날 억제자 tRNA를 아미노아실화(충전)하는 신세타제를 코딩한다. 이들 신세타제는 이어서 예를 들어, DNA 셔플링, 다른 회귀성 돌연변이 유발 법 등과 같은 추가의 돌연변이유발에 노출될 수 있다.

돌연변이 RS의 라이브러리는 공지의 다양한 돌연변이 유발법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 RS는 부위특이적 돌연변이, 임의 점 돌연변이, 상동성 재조합, 키메라 구성 등에 의해 생성될 수 있다. RS의 키메라 라이브러리는 또한 본 발명에 포함된다.

양성 선별은 선별 마커 유전자에 셀렉터 코돈, 예, 앰버 정지 코돈을 포함하는 양성 선별 마커중의 셀렉터 코돈의 억제에 기초할 수 있다. 항생제 또는 다른 선별 제제가 양성 선별 압력으로 적용될 수 있다. 또한, 선별 마커는 비천연 아미노산의 존재 및 부재하에서, 여기서 개시된 대로, 양성 마커와 음성 마커 둘 다로서 이용될 수 있다. 선택적으로는, 셀렉터 코돈을 포함하는 선별 마커 유전자는 양성 선별을 위해 이용되며, 적어도 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 바나제(barnase) 유전자와 같은, 음성 선별 마커, 예, 독성 마커는 음성 선별에 이용된다.

양성 선별은 또한 β-락타마제 유전자의 비필수 위치에서의 셀렉터 코돈의 억제에 기초하여 세포가 앰피실린에 내성이 되도록 할 수 있으며, 리보뉴클레아제 바나제를 음성 마커로 이용하는 음성 선별이 이용된다. 원형질내로 분비되는 β-락타마제와 대조적으로, 세포질내에 위치하는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자가 이용될 수 있으며; 더욱이, 앰피실린은 살균성인 반면, 클로람페니콜은 박테리아의 성장을 정지시킨다.

일단 신세타제가 양성 및 음성 선별/스크리닝 전략에 적용되면, 이들 신세타제는 이어서 추가의 돌연변이유발가 발생할 수 있다. 예를 들어, O-RS를 코딩하는 핵산이 분리될 수 있으며; (예, 임의 돌연변이유발, 부위 특이적 돌연변이유발, 재조합 또는 임의의 그 조합에 의해) 돌연변이된 O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 세트가 상기 핵산으로부터 생성될 수 있으며; 그리고 이들 개별 단계 또는 이들 단계의 조합은 비천연 아미노산, 예, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 돌연변이된 O-RS가 얻어질 때까지 반복될 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 상기 단계들은 여러 번, 예, 적어도 두번 실시된다. 선택적으로, 선별 제제의 농도는 변화된다.

또 다른 수준의 선별/스크리닝 엄격도가 또한 O-tRNA, O-RS, 또는 그 쌍을 생성하기 위해 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 선별 또는 스크리닝 엄격도는 O-RS를 생산하기 위한 방법의 한 단계 또는 두 단계에서 변화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 이용되는 선별/스크리닝 제제의 양 등을 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 양성 및/또는 음성 선별의 추가적인 라운드가 또한 실시될 수 있다. 선별 또는 스크리닝은 또한 아미노산 투과성의 변화, 번역 효율의 변화, 번역 확실성의 변화 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 하나 이상의 변화는 오르소고날 tRNA-tRNA 신세타제 쌍이 단백질 생산을 위해 이용되는 유기체에서 하나 이상의 유전자에서의 돌연변이에 기초한다.

신세타제의 기질 특이성을 변화시키기 위한, O-RS를 생산하기 위한 추가의 상세 사항 및 O-RS의 다른 예는 상기의 WO 2002/086075호에서 발견될 수 있다.

오르소고날 tRNA(O-tRNA)

본 발명의 오르소고날 tRNA(O-tRNA)는 비천연 아미노산, 예, 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을, O-tRNA에 의해 인식되는 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질 내로 생체내 또는 생체외에서 도입하는 것을 매개한다.

본 발명의 O-tRNA의 예는 서열 번호 7이다. 예시적인 O-tRNA 및 O-RS 분자의 서열을 위해서는 표 2와 실시예 5를 참고한다. 또한 "핵산과 폴리펩티드 서열 및 변이체" 섹션을 참고한다. tRNA 분자에서, 티민(T)은 우라실(U)로 대체된다. 염기에 대한 추가의 변형 또한 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 O-tRNA의 보존적 변이체를 포함한다. 예를 들어, O-tRNA의 보존적 변이체는 서열 번호 7의 O-tRNA처럼 기능하며 tRNA L-모양 구조를 유지하지만, 동일한 서열을 갖지 않는(그리고 야생형 tRNA 분자가 아닌) 분자들을 포함한다. "핵산과 폴리펩티드 서열 및 변이체" 섹션을 참고한다.

재조합 오르소고날 tRNA(O-tRNA)를 생성하는 방법은 국제 특허 출원 WO 2002/086075호에 제공된다.

예를 들어, 원하는 RS에 대한 친화성을 보존하면서 tRNA의 오르소고날성을 개선시키기 위하여, 상기 방법은 짝 신세타제의 부재 및 존재하 각각에서 돌연변이 억제자 tRNA 라이브러리를 이용하는 음성 및 양성 선별의 조합을 포함한다. 음성 선별에서는, 셀렉터 코돈이 비필수 위치에서 마커 유전자, 예, 바나제와 같은 독소 유전자내로 도입된다. 예를 들어 메타노코커스 잔나쉬로부터 유래된 돌연변이된 tRNA 라이브러리의 구성원이 내인성 숙주, 예, 에스케리챠 콜라이 신세타제(즉, 숙주, 예, 에스케리챠 콜라이 신세타제에 오르소고날이 아님)에 의해 아미노아실화될 때, 셀렉터 코돈, 예, 앰버 코돈은 억제되며 생성된 독성 유전자 산물은 세포를 사멸시킨다. 오르소고날 tRNA 또는 비기능성 tRNA를 가진 세포는 생존한다. 이어서 생존자는 셀렉터 코돈, 예, 앰버 코돈이 양성 마커 유전자, 예, β-락타마제 유전자와 같은 약물 내성 유전자에 위치된 양성 선별에 적용된다. 이들 세포는 또한 짝 RS를 갖는 발현 벡터를 함유한다. 이들 세포는 선별 제제, 예, 앰피실린의 존재하에 성장된다. 이어서 tRNA를, 그들이 동시발현된 짝 신세타제에 의해 아미노아실화되고 이 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 아미노산을 삽입하는 능력에 대해 선별한다. 비기능성 tRNA, 즉 대상 신세타제에 의해 인식될 수 없는 tRNA를 보유한 세포는 항생제에 민감하다. 따라서, (i) 내인성 숙주, 예, 에스케리챠 콜리, 신세타제를 위한 기질이 아니며; (ii) 대상 신세타제에 의해 아미노아실화될 수 있으며; (iii) 번역에서 기능하는 tRNA는 두가지 선별 모두에서 생존한다.

돌연변이된 tRNA의 라이브러리를 구성한다. 돌연변이는 예를 들어 안티코돈 루프, (D 아암, V 루프, TψC 아암), 또는 루프의 조합 또는 모든 루프와 같은 tRNA의 원하는 루프의 특정 위치, 예, 비보존적 위치, 또는 보존적 위치, 임의의 위치, 또는 둘의 조합에서 도입될 수 있다. tRNA의 키메라 라이브러리 또한 본 발명에 포함된다. 천연 다양성을 포함하는 라이브러리(Short et al의 미국 특허 6,238,884호; Schallenberger et al의 미국 특허 5,756,316호 ; Petersen et al의 미국 특허 5,783,431호; Thompson et al의 미국 특허 5,824,485호 ; Short et al의 미국 특허 5,958,672호 참고)와 같은 다양한 유기체(예, 진세균 또는 고세균과 같은 미생물)로부터의 tRNA 신세타제의 라이브러리가 선택적으로 구성되며 오르소고날 쌍을 위해 스크린된다.

추가의 돌연변이는 예를 들어 안티코돈 루프, 수용체 줄기, D 아암 또는 루프, 가변성 루프, TψC 아암 또는 루프, tRNA 분자의 다른 영역 또는 그 조합과 같은 tRNA의 원하는 루프 또는 영역의, 특정 위치, 예, 비보존적 위치, 또는 보존적 위치, 임의의 위치, 또는 둘의 조합에서 도입될 수 있다. 일반적으로, tRNA의 돌연변이는 돌연변이 tRNA의 라이브러리의 각 구성원의 안티코돈 루프를 돌연변이시켜 셀렉터 코돈의 인식을 허용하는 것을 포함한다. 상기 방법은 추가로 추가의 서열(CCA)을 O-tRNA의 3' 말단에 추가하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, O-tRNA는 원하는 RS에 대한 그 친화성을 보존하는 한편, 출발 물질, 예, 다수의 tRNA 서열과 비교한 원하는 유기체를 위한 오르소고날성의 개선을 보유한다.

예를 들어, 음성 선별에서, 셀렉터 코돈은 음성 선별 마커, 예, β-락타마제와 같은 항생제 내성을 부여하는 효소, β-갈락토시다제와 같은 검출가능한 생성물을 부여하는 효소, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 예, 바나제와 같은 독성 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드내로 비필수 위치에서(예, 여전히 기능적 바나제를 생산) 도입된다. 스크리닝/선별은 선별 제제(예, 암피실린과 같은 항생제)의 존재하에 성장중인 세포 집단에 의해 선택적으로 이루어진다. 한 구체예에서, 선별 제제의 농도는 변화된다.

예를 들어, 억제자 tRNA의 활성을 측정하기 위하여, 예를 들어 β-락타마제를 위한 유전자(bla)와 같은 음성 선별 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드내로 도입된 넌센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이와 같은, 셀렉터 코돈의 생체내 억제에 기초한 선별 시스템이 이용된다. 예를 들어, 일부 위치에서 셀렉터 코돈을 갖는, 폴리뉴클레오티드 변이체, 예, bla 변이체를 구성한다. 세포, 예, 박테리아를 이들 폴리뉴클레오티드로 형질전환시킨다. 내인성 이.콜라이 신세타제에 의해 효율적으로 충진될 수 없는 오르소고날 tRNA의 경우에는, 항생제 내성, 예, 암피실린 내성은 플라스미드로 형질전환되지 않은 박테리아를 위한 것 이하이어야 한다. 만일 tRNA가 오르소고날이 아니면, 또는 tRNA를 충전시킬 수 있는 이종성 신세타제가 시스템에서 동시발현되면, 높은 수준의 항생제, 예, 암피실린 내성이 관찰된다. 플라스미드로 형질전환되지 않은 세포와 대략 동일한 항생제 농도를 갖는 LB 아가 플레이트에서 자랄 수 없는 세포, 예, 박테리아가 선택된다.

독성 생성물(예, 리보뉴클레아제 바나제)의 경우, 다수의 잠재적인 tRNA의 구성원이 내인성 숙주, 예, 이 콜라이 신세타제에 의해 아미노아실화될 때(즉, 숙주, 예, 에스케리챠 콜라이 신세타제에 오르소고날이 아닐 때), 셀렉터 코돈이 억제되고 생산된 독성 폴리뉴클레오티드 생성물은 세포 사멸을 야기한다. 오르소고날 tRNA 또는 비기능성 tRNA를 보유한 세포는 생존한다. 선택적으로는, 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 2 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다. 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 이용하여 선별될 수 있다.

한 구체예에서, 원하는 유기체에 오르소고날인 tRNA 집단을, 셀렉터 코돈이 β-락타마제 유전자와 같은 약물 내성 유전자에 의해 코딩되는 양성 성별 마커에 위치하는 양성 선별에 적용한다. 양성 선별은 세포에 오르소고날인 tRNA 집단의 구성원을 코딩하거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 양성 선별 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 짝 RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에서 실시된다. 일부 구체예에서, 제2의 세포 집단은 음성 선별에 의해 제거되지 않은 세포를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현되며 세포는 암피실린과 같은 선별 제제의 존재하에 성장된다. 이어서 tRNA를, 그들이 동시발현된 짝 신세타제에 의해 아미노아실화되고 이 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 아미노산을 삽입하는 능력에 대해 선별한다. 일반적으로, 이들 세포는 비기능성 tRNA, 즉 대상 신세타제에 의해 효과적으로 인식될 수 없는 tRNA를 보유한 세포에 비하여 억제 효율의 개선을 보여준다. 비기능성 tRNA, 즉 대상 신세타제에 의해 효과적으로 인식될 수 없는 tRNA를 보유한 세포는 항생제에 민감하다. 따라서, (i) 내인성 숙주, 예, 에스케리챠 콜리, 신세타제를 위한 기질이 아니며; (ii) 대상 신세타제에 의해 아미노아실화될 수 있으며; (iii) 번역에서 기능하는 tRNA는 두가지 선별 모두에서 생존한다.

전술한 방법에서, 양성 선별, 음성 선별 또는 양성 및 음성 선별 둘 다와 같은 선별의 엄격도는 선택적으로 선별 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 바나제는 매우 독성인 단백질이므로, 음성 선별의 엄격도는 상이한 수의 셀렉터 코돈을 바나제 유전자내로 도입함으로써 및/또는 유도성 프로모터를 이용함으로써 조절될 수 있다. 다른 예에서는, 선별 또는 스크리닝 제제의 농도를 변화시킨다(예, 암피실린 농도). 본 발명의 한 태양에서는, 원하는 활성이 스크리닝의 초기 라운드동안 낮을 수 있으므로 엄격도를 변화시킨다. 따라서, 초기 라운드에서는 덜 엄격한 선별 기준이 적용되며 선별의 후반에는 더 엄격한 기준이 적용된다. 일부 구체예에서, 음성 선별, 양성 선별, 또는 양성 및 음성 선별 둘 다는 여러번 반복될 수 있다. 다수의 상이한 음성 선별 마커, 양성 선별 마커, 또는 양성 및 음성 선별 마커 둘 다를 이용할 수 있다. 일부 구체예에서, 양성 및 음성 선별 마커는 동일할 수 있다.

예를 들어, 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 이용하는 O-RS, O-tRNA 및 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하기 위해 다른 타입의 선별이 본 발명에 이용될 수 있다. 예를 들어, 양성 선별 단계, 음성 선별 단계, 또는 양성 및 음성 선별 단계 둘 다 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 검출되는 리포터를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 양성 선별은 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자와 같은 양성 선별 마커로 먼저 이루어질 수 있으며, 이 때 CAT 유전자는 CAT 유전자에서 앰버 정지 코돈과 같은 셀렉터 코돈을 포함하며, 후속하여 예를 들어, GFP와 같은 다른 유전자의 전사에 영향을 주는 T7 RNA 폴리머라제 유전자와 같은 음성 마커내의 위치에서 2 이상의 코돈과 같은 셀렉터 코돈을 억제하지 못하는 능력에 기초한 음성 선별 스크린이 이루어진다. 한 구체예에서, 양성 선별 마커와 음성 선별 마커는 동일한 벡터, 예, 플라스미드에서 발견될 수 있다. 음성 마커의 발현은 리포터, 예, 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 유도한다. 선별과 스크린의 엄격도는 변화될 수 있으며, 예를 들어 리포터에 형광을 부여하는 데 필요한 빛의 강도가 변화될 수 있다. 다른 구체예에서, 양성 선별은 FAC에 의해 스크린되는 양성 선별 마커로서 리포터를 이용하여 이루어질 수 있으며, 이어서 음성 마커, 예, 바나제 유전자내의 위치에서 셀렉터 코돈, 예, 2 이상을 억제하지 못하는 능력에 기초한 음성 선별 스크린이 후속된다. 또한 실시예 4를 참고한다.

선택적으로, 리포터는 세포 표면, 파아지 디스플레이 등에 디스플레이된다. 세포 표면 디스플레이, 예, OmpA-계 세포 표면 디스플레이 시스템은 특정 에피토프, 예, 외막 포린 OmpA에 융합된 폴리오바이러스 C3 펩티드가 에스케리챠 콜라이 세포의 표면상에 발현되는 것에 의존한다. 에피토프는 단백질 메세지내의 셀렉터 코돈이 번역동안 억제될 때만 세포 표면에 디스플레이된다. 이어서 디스플레이된 펩티드는 라이브러리에서 돌연변이 아미노아실-tRNA 신세타제 중 하나에 의해 인식되는 아미노산을 함유하며, 상응하는 신세타제 유전자를 함유한 세포는 특정 비천연 아미노산을 함유한 펩티드에 대해 생성된 항체를 이용하여 분리할 수 있다. OmpA-계 세포 표면 디스플레이 시스템은 파아지 디스플레이에 대한 대안으로서 게오르규 등에 의해 개발되고 최적화되었다. 예를 들어, Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L. & Georgoiu, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibodyfragment on the external surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10444-8 (1993)를 참고한다.

선별 단계는 또한 생체외에서 실시될 수 있다. 선별된 성분, 예, 신세타제 및/또는 tRNA는 이어서 비천연 아미노산의 생체내 도입에 사용하기 위해 세포내로 도입될 수 있다.

재조합 오르소고날 tRNA를 생산하기 위한 추가의 방법은 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2002/086075호에 개시된다. 또한 Forster et al., (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100 (11): 6353-6357; 및, Feng et al., (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100 (10): 5676-5681를 참고한다.

공급원 및 숙주 유기체

본 발명의 당단백질을 생산하기 위한 번역 성분은 일반적으로 비진핵성 유기체로부터 유래된다. 예를 들어, 오르소고날 O-tRNA는 비진핵성 유기체(또는 유기체의 조합), 예, 메카노코커스 잔나쉬, 메타노박테리움 설모오토트로피쿰, 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1과 같은 할로박테리움, 아키오글로부스 풀지더스, 피로코커스 푸리오서스, 피로코커스 호리코쉬, 에우로피룸 페르닉스, 메타노코커스 마리파루디스, 메타노피루스 칸드레리, 메타노살시나 마제이(Mm), 피로바쿠룸 아에로피룸, 피로코커스 아비시, 설포로부스 솔파타리쿠스(Ss), 설포로부스 토코다이, 설모플라스마 애시도필룸, 설모플라스마 볼카니움 등과 같은 고세균, 또는 에스케리챠 콜리, 설무스 설모필루스, 바실러스 스테아로설모필루스 등과 같은 진세균으로부터 유래될 수 있으며, 오르소고날 O-RS는 비진핵성 유기체(또는 유기체 조합), 예, 메카노코커스 잔나쉬, 메타노박테리움 설모오토트로피쿰, 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1과 같은 할로박테리움, 아키오글로부스 풀지더스, 피로코커스 푸리오서스, 피로코커스 호리코쉬, 에우로피룸 페르닉스, 메타노코커스 마리파루디스, 메타노피루스 칸드레리, 메타노살시나 마제이(Mm), 피로바쿠룸 아에로피룸, 피로코커스 아비시, 설포로부스 솔파타리쿠스(Ss), 설포로부스 토코다이, 설모플라스마 애시도필룸, 설모플라스마 볼카니움 등과 같은 고세균, 또는 에스케리챠 콜리, 설무스 설모필루스, 바실러스 스테아로설모필루스 등과 같은 진세균으로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 진핵성 공급원, 예, 식물(예, 단자엽 또는 쌍자엽과 같은 복잡한 식물), 조류, 원생생물, 진균류, 효모, 동물(예, 포유류, 곤충, 절지동물 등)은 또한 O-tRNA와 O-RS의 공급원으로 이용될 수 있다.

O-tRNA/O-RS 쌍의 개별 성분은 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 오르소고날 tRNA-RS 쌍은 다양한 숙주 세포, 예, 제2 유기체에서 이용될 수 있다. 한 구체예에서, O-tRNA와 O-RS 쌍은 동일한 유기체로부터 유래한다. 다르게는, O-tRNA/O-RS 쌍의 O-tRNA와 O-RS는 다른 유기체로부터 유래한다.

셀렉터 코돈

본 발명의 셀렉터 코돈은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산과 같은 비천연 아미노산의 도입을 위해 단백질 생합성 기계의 유전자 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 예를 들어, 독특한 3염기 코돈, 정지 코돈과 같은 넌센스 코돈, 예, 앰버 코돈, 오팔 코돈, 비천연 코돈, 적어도 4염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상, 둘 또는 그 이상, 셋 초과 등의 많은 셀렉터 코돈이 원하는 유전자내로 도입될 수 있다.

64개의 유전자 코돈이 20개의 아미노산과 세 개의 정지 코돈을 코딩한다. 번역 종결을 위해서는 단지 하나의 정지 코돈만이 필요하므로, 나머지 2개는 원칙적으로 비단백질성 아미노산을 코딩하기 위해 이용될 수 있다. 앰버 정지 코돈, UAG는 생체외 생합성 시스템 및 제노푸스 난모세포에서 비천연 아미노산의 도입을 지시하도록 성공적으로 이용되어 왔다. 세 가지 정지 코돈 중에서, UAG는 에스케리챠 콜리에서 가장 덜 이용되는 정지 코돈이다. 일부 에스케리챠 콜라이 균주는 천연 억제자 tRNA를 함유하며, 이는 UAG를 인식하고 천연 아미노산을 삽입한다. 또한, 이들 앰버 억제자 tRNA는 일반적인 단백질 돌연변이유발에서 이용되어 왔다. 일부 본 발명의 구체예에서, 다른 정지 코돈이 본 발명에 이용된다.

한 구체예에서, 상기 방법은 생체내에서 비천연 아미노산의 도입을 위해 정지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것에 관련된다. 예를 들어, 정지 코돈, 예, UAG를 인식하는 O-tRNA가 생성되고 원하는 비천연 아미노산으로 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 이 O-tRNA는 자연발생 아미노아실-tRNA 신세타제에 의해 인식되지 않는다. 통상적인 부위 지시된 돌연변이유발은 단백질 유전자에서 대상 부위에 정지 코돈, 예, TAG를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, Sayers, J. R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3'Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802 (1988)를 참고한다. O-RS, O-tRNA 및 돌연변이 유전자가 생체내에서 결합될 때, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 반응하여 특정 위치에서 비천연 아미노산을 함유한 단백질을 생성한다.

생체내 비천연 아미노산의 도입은 숙주, 예, 에스케리챠 콜리의 큰 동요없이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 에스케리챠 콜리와 같은 비진핵 세포에서는, UAG 코돈을 위한 억제 효율이 O-tRNA, 예, 앰버 억제자 tRNA와 방출 인자 1(RF 1)(UAG 코돈에 결합하며 리보솜으로부터 성장중인 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 의존하므로, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA, 예, 억제자 tRNA의 발현 수준을 증가시키거나 또는 RF1 결핍 균주를 이용하여 조절될 수 있다.

비천연 아미노산, 예, 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산이 또한 희귀 코돈으로 코딩될 수 있다. 예를 들어, 생체외 단백질 합성 반응에서 아르기닌 농도가 감소될 때, 희귀 아르기닌 코돈 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입에 효율적임이 입증되었다. 예를 들어, Ma et al., Biochemistry, 32: 7939 (1993)를 참고한다. 이 경우에, 합성 tRNA는 에스케리챠 콜리에서 소수 종으로 존재하는 자연 발생 tRNA Arg과 경쟁한다. 일부 유기체는 모든 트리플렛 코돈을 사용하지는 않는다. 마이크로코커스 루테우스에서 할당되지 않은 코돈 AGA는 생체외 전사/번역 추출물에서 아미노산 삽입을 위해 이용되었다. 예를 들어, Kowal and Oliver, Nucl. Acid.Res., 25: 4685 (1997)를 참고한다. 본 발명의 성분은 이들 희귀 코돈을 생체내에서 사용하기 위해 생성될 수 있다.

셀렉터 코돈은 또한 4,5,6 또는 그 이상의 염기의 코돈과 같은 4 이상의 염기의 코돈을 포함한다. 4염기 코돈의 예는 예를 들어, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함한다. 5 염기 코돈의 예는 예를 들어, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함한다. 예를 들어, 안티코돈 루프, 예, 적어도 8∼10 뉴클레오티드 안티코돈 루프를 갖는 돌연변이된 O-tRNA, 예, 특별 프레임쉬프트 억제자 tRNA의 존재하에서, 4 이상 염기의 코돈은 단일 아미노산으로 읽힌다. 다른 구체예에서, 안티코돈 루프는 예를 들어, 적어도 4-염기 코돈, 적어도 5-염기 코돈, 또는 적어도 6-염기 코돈 또는 그 이상을 해독할 수 있다. 256개의 가능한 4-염기 코돈이 있으므로, 다수의 비천연 아미노산이 4개 이상 염기의 코돈을 이용하여 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. Anderson et al., Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, Vol. 9,237-244 (2002); 및, Magliery, Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769 (2001)를 참고한다.

본 발명의 방법은 프레임쉬프트 억제에 기초한 연장된 코돈을 이용하는 것을 포함한다. 4 이상 염기의 코돈은 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 동일한 단백질 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 4염기 코돈은 생체외 생합성 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 이용되어 왔다. 예를 들어, Ma et al., Biochemistry, 1993,32, 7939 (1993); 및 Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 34 (1999)를 참고한다. CGGG 및 AGGU를 동시에 이용하여 2-나프틸알라닌과 라이신의 NBD 유도체를 두 개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 억제자 tRNA를 이용하여 생체외에서 스트렙타비딘내로 도입시켰다. 예를 들어, Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 12194 (1999)를 참고한다. 생체내 연구에서는, 무어 등은 NCUA 안티코돈을 가진 tRNA^Leu유도체가 UAGN 코돈(N은 U, A, G, 또는 C일 수 있음)을 억제하는 능력을 검사하고, 4염기 UAGA가 0 또는 -1 프레임으로 해독하는 것 없이 13∼26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNA^Leu에 의해 해독될 수 있음을 발견하였다. Moore et al., J. Mol.Biol., 298: 195 (2000)를 참고한다. 한 구체예에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈에 기초한 확장된 코돈이 본 발명에 이용될 수 있으며, 이들은 다른 원치않는 부위에서 미스센스 판독(readthrough)과 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.

번역 우회 시스템은 또한 비천연 아미노산, 예, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함한 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 원하는 폴리펩티드에 도입하기 위해 이용될 수 있다. 번역 우회 시스템에서는, 큰 서열이 유전자내로 삽입되지만 단백질로 번역되지 않는다. 상기 서열은 리보솜이 상기 서열을 뛰어넘어 삽입 부위 하부에서 번역을 재개하도록 유도하는 단서로서 작용하는 구조를 함유한다.

다르게는, 또는 비천연 아미노산, 예, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함한 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 도입하기 위해 상기에서 개시된 다른 방법들과 함께, 트랜스-번역 시스템이 이용될 수 있다. 이 시스템은 에스케리챠 콜리에 존재하는 tmRNA로 불리는 분자에 관련된다. 이 RNA 분자는 구조적으로 알라닐 tRNA에 관련되며 알라닐 신세타제에 의해 아미노아실화된다. tmRNA와 tRNA 사이의 차이는 안티코돈 루프가 특별한 큰 서열로 치환되는 것이다. 이 서열은 리보솜이 주형으로서 tmRNA내에서 코딩되는 오픈 리딩 프레임을 이용하여, 정지된 서열에서 번역을 재개하도록 한다. 본 발명에서, 오르소고날 신세타제로 우선적으로 아미노아실화되고 비천연 아미노산으로 로드되는 오르소고날 tmRNA가 생성될 수 있다. 상기 시스템을 이용하여 유전자를 전사함으로써, 리보솜은 특이적 부위에서 멈추며; 비천연 아미노산이 그 부위에서 도입되며, 이어서 오르소고날 tmRNA내에 코딩된 서열을 이용하여 번역이 재개된다.

주어진 시스템의 경우, 셀렉터 코돈이 또한 천연 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 이 때 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 이용하지 않는다(또는 드물게 이용함). 예를 들어, 이것은 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 없는 시스템 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 선택적으로 비천연 염기쌍을 포함한다. 이들 비천연 염기 쌍은 추가로 기존의 유전적 알파벳을 확장시킨다. 하나의 여분의 염기쌍은 3염기 코돈의 수를 64에서 125로 증가시킨다. 세번째 염기쌍의 특성은 안정하고 선택적인 염기 쌍결합, 폴리머라제에 의한 높은 확실성을 갖는 DNA내로의 효율적인 효소적 도입 및 초기의 비천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 지속적인 프라이머 확장을 포함한다. 상기 방법과 조성물을 위해 적응될 수 있는 비천연 염기쌍의 설명은 예를 들어, Hirao, et al., An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20: 177-182 (2002)를 포함한다. 다른 관련 문헌은 하기에 열거된다.

생체내 사용을 위하여, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성이며 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 추가로, 증가된 유전적 정보는 안정하며 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너와 다른 사람들에 의한 이전의 노력은 왓슨-크릭쌍의 것들과는 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였으며, 가장 주목할만한 예는 iso-C:iso-G 쌍이다. 예를 들어, Switzer et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 8322 (1989); 및 Piccirilli et al., Nature, 1990,343: 33 (1990); Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602 (2000)를 참고한다. 이들 염기는 일반적으로 어느 정도 천연 염기와 잘못된 짝을 이루며 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨 등은 염기들 사이의 소수성 패킹 상호작용이 수소 결합을 대신하여 염기쌍의 형성을 야기할 수 있음을 증명하였다. Kool, Curr. Opin. Chem.Biol., 4: 602 (2000); 및 Guckian and Kool,Angew. Chem. Int. Ed.End.. 36,2825 (1998)를 참고한다. 상기의 모든 요건을 만족하는 비천연 염기쌍을 개발하기 위한 노력으로, 슐츠, 로메스베르그 및 동료들은 비천연 소수성 염기 시리즈를 체계적으로 합성하고 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍은 천연 염기쌍보다 더욱 안정하며, 에스케리챠 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편(KF)에 의해 DNA내로 효율적으로 도입될 수 있음이 발견되었다. 예를 들어, McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 11586 (1999); 및 Ogawa et al., J. Am. Chem.Soc., 122: 3274 (2000)를 참고한다. 3MN:3MN 자가쌍은 생물학적 기능을 위해 충분한 효율과 선택성으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, Ogawa et al., J. Am. Chem.Soc., 122: 8803 (2000)를 참고한다. 하지만, 두 염기 모두 추가 복제를 위한 쇄 종결인자로서 작용한다. PICS 자가쌍을 복제하기 위해 이용될 수 있는 돌연변이 DNA 폴리머라제가 최근에 개발되었다. 추가로, 7AI 자가쌍이 복제될 수 있다. 예를 들어, Tae et al., J. Am. Chem.Soc., 123: 7439 (2001)를 참고한다. Cu(II)에 결합시 안정한 쌍을 형성하는 신규의 메탈로염기쌍, Dipic:Py 또한 개발되었다. Meggers et al., J.Am.Chem.Soc., 122:10714(2000)을 참고한다. 확장된 코돈 및 비천연 코돈은 본래 천연 코돈에 오르소고날이므로, 본 발명의 방법은 이 특성을 이용하여 그들을 위한 오르소고날 tRNA를 생성시킬 수 있다.

비천연 아미노산

여기서 이용될 때, 비천연 아미노산은 셀레노시스테인 및/또는 피로라이신 및 하기 20개의 유전적으로 코딩되는 알파-아미노산외의 임의의 아미노산, 변형 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 말한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린. 알파-아미노산의 일반 구조는 화학식 I에 의해 예시된다:

[화학식 I]

비천연 아미노산은 일반적으로 화학식 I을 갖는 임의의 구조이며 이 때 R기는 20개의 천연 아미노산에 이용된 것 외의 임의의 치환체이다. 예를 들어, 20개의 천연 아미노산의 구조를 위해서는 Biochemistry by L. Stryer, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York를 참고한다. 본 발명의 비천연 아미노산은 상기의 20개의 알파-아미노산외의 천연 발생 화합물일 수 있음을 주목한다.

본 발명의 비천연 아미노산은 선택적으로 측쇄에서만 천연 아미노산과 상이하므로, 비천연 아미노산은 일반적으로 다른 아미노산, 예, 천연 또는 비천연 아미노산과, 천연 발생 단백질에서 아미드 결합이 형성되는 것과 동일한 방식으로 아미드 결합을 형성할 수 있다. 하지만, 비천연 아미노산은 그들을 천연 아미노산과 구별되게 하는 측쇄기를 갖는다.

본 발명의 당단백질을 제조하는 데 있어 특히 관심이 되는 것은 화학식 I의 R이 당부분에 부착되어 당 부분을 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 연결시키는 반응성 기와 반응할 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산이다. 적합한 R기는 예를 들어, 케토-, 아지도-, 하이드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 아미노옥시-, 알케닐, 알키닐, 카보닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데하이드, 에스테르, 티오산, 티오에스테르, 방해된 에스테르, 하이드록실아민, 아민 등, 또는 그 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 비천연 아미노산은 광활성화가능한 교차결합기를 갖는다.

신규의 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산에 더하여, 비천연 아미노산은 또한 선택적으로 화학식 II와 III의 구조에 의해 예시된 대로, 변형된 백본 구조를 포함한다:

[화학식 II]

[화학식 III]

상기 식에서 Z는 일반적으로 OH, NH₂, SH, NH-R', 또는 S-R'을 포함하며; 동일하거나 상이할 수 있는 X와 Y는 일반적으로 S 또는 O를 포함하며, 그리고 선택적으로 동일하거나 상이한 R과 R'은 일반적으로 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산을 위해 전술한 R기를 위한 성분과 동일한 리스트 및 수소로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 비천연 아미노산은 선택적으로 화학식 II와 III에 의해 예시된 대로 아미노 또는 카복실기에 치환기를 포함한다. 이러한 타입의 비천연 아미노산은 예를 들어, 일반적인 20개 천연 아미노산에 해당하는 측쇄 또는 비천연 측쇄를 가진 α-하이드록시산, α-티오산, α-아미노티오카복실레이트를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, α-탄소의 치환기는 선택적으로 L, D, 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예, D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함한다. 다른 구조적인 대안은 프롤린 유사체와 같은 시클릭 아미노산 및 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 고리 프롤린 유사체, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노부티르산과 같은 β 및 γ 아미노산을 포함한다.

예를 들어, 많인 비천연 아미노산은 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등과 같은 천연 아미노산에 기초한다. 티로신 유사체는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하며, 이 때 치환된 티로신은 아세틸기, 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 하이드록시아민, 티올기, 카복시기, 이소프로필기, 메틸기, C₆-C₂₀직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸기, 폴리에테르기, 니트로기 등을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 고리도 고려된다. 본 발명의 글루타민 유사체는 α-하이드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 고리형 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예시적인 페닐알라닌 유사체는 메타-치환된, 오르토-치환된 및/또는 파라-치환된 페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않으며, 이 때 치환기는 하이드록시기, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 알데히드 또는 케토기 등을 포함한다.

비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, β-O-GlcNAc-L-세린, 트리-O-아세틸-GlcNAc-α트레오닌, α-GlcNAc-L-트레오닌, L-Dopa, 플루오르화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 하기 또는 다른 부분에 열거된 것 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 다양한 비천연 아미노산의 구조는 예를 들어 WO2002/085923호의 도 17, 18, 19, 26 및 29에 제공된다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 비천연 아미노산은 또한 아미노산 측쇄에 부착된 당 부분을 갖는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 당 부분을 갖는 비천연 아미노산은 Man, GaINAc, Glc, Fuc, 또는 Gal 부분을 가진 세린 또는 트레오닌 아미노산을 포함한다. 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산의 예는 예를 들어, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, β-O-GlcNAc-L-세린, 트리-O-아세틸-GalNAc-α-트레오닌, α-GalNAc-L-트레오닌, 0-Man-L-세린, 테트라-아세틸-O-Man-L-세린, O-GalNAc-L- 세린, 트리-아세틸-O-GalNAc-L-세린, Glc-L-세린, 테트라아세틸-Glc-L-세린, fuc-L-세린, 트리-아세틸-fuc-L-세린, O-Gal-L-세린, 테트라-아세틸-O-Gal-L-세린, β-0-GlcNAc-L-트레오닌, 트리-아세틸-베타-GlcNAc-L-트레오닌, O-Man-L-트레오닌, 테트라- 아세틸-O-Man-L-트레오닌, O-GalNAc-L-트레오닌, 트리-아세틸-O-GalNAc-L-트레오닌, Glc-L-트레오닌, 테트라아세틸-Glc-L-트레오닌, fuc-L-트레오닌, 트리-아세틸-fuc-L-트레오닌, O-Gal-L-트레오닌, 테트라-아세틸-O-Gal-L-세린 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 상기한 것들의 보호되지 않고 아세틸화된 형태를 포함한다. 또한 "펩티드의 리모델링 및 당접합"이라는 제목의 WO2003/031464A2호 및 "당 조성물, 그들의 합성을 위한 방법 및 장치" 제목의 미국 특허 6,331,418호를 참고한다.

비천연 아미노산의 화학적 합성

상기에 제공된 비천연 아미노산의 다수는 예를 들어 시그마(미국) 또는 알드리치(미국, 윌밍턴주의 밀워키)에서 판매한다. 시판되지 않는 것들은 선택적으로 하기의 실시예에 제공된 대로 또는 공지된 표준 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성 기법의 경우, 예를 들어, Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); 및 Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg(Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)을 참고한다. 또한 비천연 아미노산의 추가 합성을 위해서는 WO2002/085923호를 참고한다.

예를 들어, 메타-치환된 페닐알라닌은 WO2002/085923호에 개시된 과정으로 합성된다(이 문헌의 도 14 참고). 일반적으로, NBS(N-브로모석신이미드)는 메타-치환된 메틸벤젠 화합물에 첨가되어 메타-치환된 벤질 브로마이드를 생성하며, 이것은 이어서 말로네이트 화합물과 반응하여 메타 치환된 페닐알라닌을 생성한다. 메타 위치를 위해 이용되는 일반적인 치환기는 케톤, 메톡시기, 알킬, 아세틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 3-아세틸-페닐알라닌은 NBS를 3-메틸아세토페논 용액과 반응시켜 제조한다. 보다 상세한 사항을 위해서는 하기 실시예를 참고한다. 유사한 합성을 이용하여 3-메톡시 페닐알라닌을 생산한다. 이 경우 벤질 브로마이드의 메타 위치의 R기는 -OCH₃이다. 예를 들어, Matsoukas et al., J.Med.Chem.,1995, 38, 4660-4669를 참고한다.

일부 구체예에서, 비천연 아미노산의 디자인은 오르소고날 tRNA를 아미노아실화하기 위해 이용되는 오르소고날 tRNA 신세타제와 같은 신세타제의 활성 부위에 대한 공지의 정보에 의해 변형된다. 예를 들어, 아미드의 질소에서 치환된 유도체(1), γ-위치의 메틸기(2) 및 N-C^γ-시클릭 유도체(3)를 비롯한 글루타민 유사체의 세 부류가 제공된다. 핵심 결합 부위 잔기가 효모 GlnRS와 상동인 이.콜라이 GlnRS의 x-레이 결정 구조에 기초하여, 상기 유사체는 글루타민의 측쇄의 10Å 쉘내의 잔기의 측쇄 돌연변이의 배열을 보충하도록 디자인되었으며, 활성 부위 Phe233의 작은 소수성 아미노산으로의 돌연변이가 Gln의 C^γ위치에서의 증가된 입체 벌크에 의해 보충될 수 있다.

예를 들어, N-프탈로일-L-글루타믹 1,5-안하이드라이드(WO2002/085923호의 도 23의 화합물 번호 4)는 선택적으로 아미드의 질소에서 치환기를 갖는 글루타민 유사체를 합성하기 위하여 이용된다. 예를 들어, King, F.E & Kidd, D.A.A. A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediate. J.Chem.Soc.,3315-3319(1949); Friedman, O.M.& Chatterrji, R. Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J.Am.Chem.Soc. 81, 3750-3752(1959); Craig, J.C.et al. Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem. 53, 1167-1170(1988); 및 Azoulay, M.,Vilmont, M.& Frappier, F.Glutamine analogues as Potential Antimalariats., Eur.J.Med.Chem. 26, 201-5(1991)을 참고한다. 안하이드라이드는 일반적으로 프탈이미드로서 아민을 먼저 보호하고 이어서 아세트산에서 환류시켜 글루탐산으로부터 제조된다. 이어서 안하이드라이드는 다수의 아민으로 개방되어 아미드에서 치환체를 야기한다. 하이드라진을 이용한 프탈로일기의 탈보호는 WO2002/085923호의 도 23에 나타난 대로 자유 아미노산을 생성한다.

γ-위치에서의 치환은 일반적으로 글루탐산의 알킬화를 통해 이루어진다. 예를 들어, Koskinen, A.M.P.& Rapoport, H. Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J.Org.Chem. 54, 1859-1866(1989)를 참고한다. 예를 들어, WO2002/085923호의 도 24에 화합물 번호 5로 나타낸 보호된 아미노산은 선택적으로 9-브로모-9-페닐플루오렌(PhflBr)을 이용하여 아미노 부분을 알킬화 시키고(예, Christie, B.D.& Rapoport, H.Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J.Org.Chem.1989, 1859-1866(1985)) 이어서 O-tert-부틸-N,N'-디이소프로필이소우레아를 이용하여 산 부분을 에스테르화 시켜 제조된다. KN(Si(CH₃)₃)₂)의 첨가는 메틸 에스테르의 α-위치에서 입체선택적으로 탈양성자화하여 에놀레이트를 형성하고, 이것은 이어서 선택적으로 다양한 알킬 이오다이드로 알킬화된다. t-부틸 에스테르와 Phfl 기의 가수분해에 의해 원하는 γ-메틸 글루타민 유사체(WO2002/085923호의 도 24의 화합물 번호 2)를 생성한다.

WO2002/085923호의 도 25의 화합물 번호 3에 의해 예시된 대로, N-C^γ 시클릭 유사체는 선택적으로 이전에 개시된 대로 Boc-Asp-Ot-Bu로부터 4단계로 제조된다. 예를 들어, Barton et al., Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-α-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43, 4297-4308(1987) 및 Subasinghe et al., Quisqualic acid analogue:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J.Med.Chem. 35: 4602-7(1992)를 참고한다. N-t-Boc-피롤리디논, 피롤리디논 또는 옥사졸리돈의 음이온의 생성 및 이어지는 화합물 7의 첨가는 도 25에 나타난 대로, 마이클 첨가 생성물을 생성한다. 이어서 TFA를 이용한 탈보호는 자유 아미노산을 생성시킨다.

상기 비천연 아미노산에 더하여, 티로신 유사체의 라이브러리 또한 고안되었다. 그 활성 부위가 엠.잔나쉬 신세타제와 매우 상동성인 비.스테아로설모필루스 TyrRS의 결정 구조에 기초하여, 티로신의 방향족 측쇄의 10Å 쉘내의 잔기를 돌연변이시켰다(Y32, G34, L65, Q155, D158, A167, Y32 및 D158). WO2002/085923호의 도 26에 나타난 것처럼, 티로신 유사체의 라이브러리는 이들 활성 부위 아미노산에 치환기 배열을 보충하도록 고안되었다. 이들은 다양한 페닐 치환 패턴을 포함하며, 이것은 상이한 소수성 및 수소결합 특성을 제공한다. 티로신 유사체는 선택적으로 WO2002/085923호에 의해 예시된 일반적 전략을 이용하여 제조된다(예, WO2002/085923호의 도 27 참고). 예를 들어, 디에틸 아세트아미도말로네이트의 에놀레이트는 선택적으로 소듐 에톡사이드를 이용하여 생성된다. 이어서 원하는 티로신 유사체는 적절한 벤질 브로마이드의 첨가 및 가수분해에 의해 제조될 수 있다.

비천연 아미노산의 세포 흡수

비천연 아미노산 흡수는 예를 들어, 단백질 내로의 도입을 위해, 비천연 아미노산을 고안하고 선별할 때 일반적으로 고려되는 한 가지 사안이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이들 화합물이 세포 투과성이기 어려움을 제안한다. 천연 아미노산은 다양한 정도의 아미노산 특이성을 나타내는 단백질계 수송 시스템의 집합을 통해 박테리아내로 흡수된다. 본 발명은 따라서, 만일 있다면, 어느 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수될 것인지를 평가하기 위한 신속한 스크린을 제공한다.

예를 들어, 다양한 비천연 아미노산이 선택적으로 세포에 대한 독성에 대해 최소 배지에서 스크린된다. 독성은 일반적으로 다섯 가지 그룹으로 분류된다: (1) 무독성, 이 경우 세포가 두배로 되는 시간에 큰 변화가 없음; (2) 저 독성, 이 경우 세포가 두배로 되는 시간이 약 10% 미만만큼 증가함; (3) 중간 독성, 이 경우 세포가 두배로 되는 시간이 약 10%∼약 50% 증가함; (4) 고독성, 이 경우 세포가 두배로 되는 시간이 약 50%∼약 100% 증가함; 및 (5) 심한 독성, 이 경우 세포가 두배로 되는 시간이 약 100%보다 많이 증가함. 예를 들어, Liu, D. R. & Schultz, P. G. Progress toward the evolution of an organism with atz expanded genetic code. PNAS, USA 96,4780-4785 (1999)를 참고한다. 높은 독성 또는 심한 독성을 나타내는 아미노산의 독성은 일반적으로 IC₅₀ 값을 얻기 위한 그들의 농도의 함수로 측정된다. 일반적으로, 천연 아미노산의 매우 가까운 유사체이거나 또는 반응성 관능기를 나타내는 아미노산은 가장 높은 독성을 나타낸다. 전자는 이들 비천연 아미노산을 위한 독성의 기작이 단백질 내로의 도입 또는 천연 아미노산을 처리하는 필수 효소의 억제일 수 있음을 제안한다.

독성 아미노산을 위한 가능한 흡수 경로를 확인하기 위하여, 독성 분석은 선택적으로 예를 들어, 과량의 구조적으로 유사한 천연 아미노산으로 보충된 배지에서 IC₅₀ 수준에서 반복된다. 독성 아미노산의 경우, 과량의 천연 아미노산의 존재는 일반적으로 세포가 독소의 존재하에 성장하는 능력을 회복시키며, 이는 아마도 천연 아미노산이 세포 흡수 또는 필수 효소에 대한 결합에 대해 독소와 효과적으로 경쟁하여 이기기 때문이다. 이들 경우에, 독성 아미노산은 선택적으로 가능한 흡수 경로가 할당되고 세포 생존을 위해 그 보충이 요구되는 "치사 대립유전자"로 표지된다. 이들 치사 대립유전자는 세포가 비독성 비천연 아미노산을 흡수하는 능력을 분석하는 데 매우 유용하다. 세포 성장의 회복에 의해 입증되는, 독성 대립유전자의 보충은 비독성 아미노산이, 아마도 치사 대립유전자에 할당된 것과 동일한 흡수 경로에 의해 세포에 의해 흡수됨을 제안한다. 보충의 결핍은 아직 결정되지 않았다. 예시적인 연구와 결론을 위해서는 하기에 제시된 실시예를 참고한다.

예를 들어, 하기 실시예에 개시된 대로 얻어진 결과는 치사 비천연 아미노산 대립유전자의 보충이 아미노산 흡수를 질적으로 평가하기 위한 효율적인 방법임을 증명한다. 상기 방법은 일반적으로 많은 수의 화합물을 방사성표지하는 것보다 노력을 덜 요하며 따라서 대상 비천연 아미노산을 분석하기 위한 보다 유리한 방법이다. 이러한 일반적인 전략은 선택적으로 핵산 염기 유사체, 탄수화물 유사체, 또는 펩티드 유사체와 같은 광범위한 분자의 세포 흡수를 신속하게 평가하기 위해 이용된다. 예를 들어, 이 전략은 선택적으로 여기서 개시된 비천연 아미노산의 세포 흡수를 평가하기 위해 이용된다.

본 발명은 또한 모든 아미노산 흡수 경로와 독립적인, 비천연 아미노산을 전달하기 위한 일반적인 방법을 제공한다. 이 일반적 방법은 세포질 막을 가로질러 디펩티드와 트리펩티드를 수송하는 펩티드 퍼미아제를 통한 흡수에 의존한다. 펩티드 퍼미아제는 측쇄 특이적이지 않으며, 그들의 기질에 대한 KD 값은 아미노산 퍼미아제의 KD 값에 비교할만하여, 예를 들어 약 0.1 mM∼약 10 mM이다. 예를 들어, Nickitenko et al., A structure of DppA, a periplasmic depeptide transport chemosensory receptor. Biochemistry 34,16585-16595 (1995) 및 Dunten, P., Mowbray, S. L. Crystal structure of the dipeptide binding protein from Escherichia coli involved in active transport and chemotaxis. Protein Science 4,2327-34 (1995)를 참고한다. 비천연 아미노산은 이어서 라이신과 같은 천연 아미노산의 접합체로서 흡수되어, 내인성 이.콜라이 펩티다제 중 하나에 의한 디펩티드의 가수분해시 세포질내로 방출된다. 이 접근법을 시험하기 위하여, 몇몇 Unn-Lys 및 Lys-Unn 디펩티드를 고체 상 합성에 의해 합성하고, 이들 디펩티드의 존재 및 부재하에 라이신 최소 배지에서 라이신 생합성이 결핍된 이.콜라이 균주의 성장을 시험한다. 이들 세포에 이용가능한 유일한 라이신 공급원은 비천연 아미노산을 함유한 디펩티드이다. 포스포노세린, 포스포노티로신, 펜타플루오로페닐알라닌 및 갖힌 세린의 흡수를 이 방식으로 분석하였다. 모든 네 경우에, 성장은 10 mM 및 그 이상의 디펩티드 농도에서 관찰되었다. 흡수는 여기서 제공된 방법으로 쉽게 분석됨에도 불구하고, 세포 흡수 경로에 순응하는 비천연 아미노산을 고안하는 것에 대한 대안은 생체내에서 아미노산을 만들어내는 생합성 경로를 제공하는 것이다.

비천연 아미노산의 생합성

아미노산 및 다른 화합물의 생산을 위한 많은 생합성 경로가 이미 세포에 존재한다. 구체적인 비천연 아미노산을 위한 생합성 방법이 천연에, 예, 이.콜리에 존재하지 않을 수 있으나, 본 발명은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 위한 생합성 경로는 선택적으로 새로운 효소를 첨가하거나 기존의 이.콜라이 경로를 변형시킴으로써 이.콜리에서 선택적으로 생성된다. 추가의 새로운 효소는 선택적으로 자연 발생 효소 또는 인공적으로 생성된 효소이다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성(예, WO2002/085923호에 개시)은 다른 유기체로부터의 공지 효소의 조합의 첨가에 의존한다. 이들 효소를 위한 유전자는 상기 유전자를 포함한 플라스미드로 세포를 형질전환시켜 세포, 예, 이.콜라이 세포내로 도입될 수 있다. 세포에서 발현될 때, 상기 유전자는 원하는 화합물을 합성하기 위한 효소 경로를 제공한다. 선택적으로 첨가되는 효소의 타입의 예는 하기 실시예에 제공된다. 추가의 효소 서열은 예를 들어 Genbank에서 발견된다. 인공적으로 발생된 효소는 또한 동일한 방식으로 세포내에 첨가된다. 이러한 방식으로, 세포성 기계와 세포의 자원은 비천연 아미노산을 생산하도록 조작된다.

생합성 경로에 사용하거나 기존의 경로의 진화를 위한 신규 효소를 생산하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 맥시젠 인크.(www.maxygen.com)에 의해 개발된 회귀성 재조합은 선택적으로 신규 효소와 경로를 개발하기 위해 이용된다. 예를 들어, Stemmer 1994, "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, "Nature Vol. 370 No. 4: Pg. 389-391 ; 및 Stemmer, 1994, "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.91: Pg.10747-10751를 참고한다. 유사하게 진코어(www.genencor.com)에 의해 개발된 DesignPath^TM는 선택적으로 예를 들어, 이.콜리에서 비천연 아미노산을 생성하기 위한 경로를 조작하기 위하여 대사 경로 조작을 위해 이용된다. 이 기법은 예를 들어 기능 게놈학 및 분자 진화 및 고안을 통해 확인된 새로운 유전자의 조합을 이용하여 숙주 유기체에서 기존의 경로를 재구성한다. 디버사 코포레이션(www.deversa.com)은 또한 새로운 경로를 생성하기 위하여 유전자 라이브러리와 유전자 경로를 신속하게 스크리닝하기 위한 기법을 제공한다.

일반적으로, 본 발명의 생합성 방법, 예, 코리스메이트로부터 p-아미노페닐알라닌(pAF)를 생성하는 경로는 세포에서 생산된 다른 아미노산의 농도에는 영향을 주지 않는다. 예를 들어, 코리스메이트로부터 pAF를 생산하기 위해 이용된 경로는 세포에서 pAF를 생산하는 한편, 코리스메이트로부터 일반적으로 생산되는 다른 방향족 아미노산의 농도는 실질적으로 영향을 받지 않는다. 일반적으로 본 발명의 조작된 생합성 경로로 생산된 비천연 아미노산은 효과적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도, 예, 천연 세포 양으로 생산되지만, 다른 아미노산의 농도에 영향을 주거나 세포 자원을 고갈시킬 정도로 생산되지는 않는다. 이 방식으로 생체내 생산된 일반적인 농도는 약 10 mM∼약 0.05 mM이다. 일단 박테리아가 특정 경로에 필요한 효소를 생산하기 위해 이용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고 21번째 아미노산, 예, pAF, dopa, O-메틸-L-티로신 등이 생성되면, 생체내 선별이 리보솜 단백질 합성 및 세포 성장을 위한 비천연 아미노산의 생산을 최적화하기 위해 선택적으로 이용된다.

핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체

상기 및 하기에서 개시된 대로, 본 발명은 핵산 폴리뉴클레오티드 서열, 예, O-tRNA 및 O-RS 및 폴리펩티드 아미노산 서열, 예, O-RS 및 예, 상기 서열을 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 서열, 예, O-tRNA 및 O-RS의 예는 여기서 개시된다(표 2, 예, 서열 번호 1-10 참고). 하지만, 당업자는 본 발명이 여기, 예, 실시예에서 개시된 서열들에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 당업자는 본 발명이 또한 예를 들어, O-tRNA 또는 O-RS를 코딩하는, 여기서 개시된 기능을 가진 무관한 많은 서열을 제공함을 이해할 것이다.

본 발명은 폴리펩티드(예, O-RS)와 폴리뉴클레오티드, 예, O-tRNA, O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부, 아미노아실-tRNA 신세타제 클론을 분리하기 위해 시용되는 올리고뉴클레오티드 등을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 비천연 아미노산을 가진 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 인공 폴리펩티드, 예, (a) 서열 번호 4∼6 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (b) 서열 번호 8∼10 중 어느 하나에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (c) (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 특이적인 항체와 특이적 면역반응성을 나타내는 폴리펩티드; 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 보존적 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 인공 폴리펩티드와 특이적 면역반응성을 나타내는 항체 및 항혈청이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 조성물은 본 발명의 폴리펩티드와 부형제(예, 완충액, 물, 약학적 허용 부형제 등)를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 본 발명의 대상 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 서열 번호 8, 9, 또는 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그 보존적 변이체를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1∼6을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 유사하게, 매우 엄격한 조건 하에 핵산의 거의 전체 길이에 대하여 상기 표시된 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 (그리고 천연 폴리뉴클레오티드 외의 것인)인공 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드이다. 인공 폴리뉴클레오티드는 사람이 만든 것이며 자연 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드이다.

일부 구체예에서, 벡터(예, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 등)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.

당업자는 또한 개시된 서열의 많은 변이체가 본 발명에 포함됨을 이해할 것이다. 예를 들어, 기능적으로 동일한 서열을 낳는 개시된 서열의 보존적 변이체는 본 발명에 포함된다. 적어도 하나의 개시된 서열에 하이브리드화하는 핵산 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체는 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 표준 서열 비교 기법에 의해 결정할 때, 여기서 개시된 서열의 독특한 부분 서열 또한 본 발명에 포함된다.

보존적 변이체

유전자 코드의 축퇴성으로 인해, "침묵 치환"(즉, 코딩된 폴리펩티드에서 변화를 야기하지 않는 핵산 서열의 치환)은 아미노산을 코딩하는 모든 핵산 서열의 함축된 특징이다. 유사하게, 아미노산 서열중의 하나 또는 몇몇 아미노산이 매우 유사한 특성을 가진 상이한 아미노산으로 치환된, "보존적 아미노산 치환"은 또한 개시된 구조체와 매우 유사한 것으로 쉽게 확인된다. 각 개시된 서열의 그러한 보존적 변이체는 본 발명의 특징이다.

특정 핵산 서열의 "보존적 변이체"는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 서열을 말한다. 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 퍼센티지의 아미노산(일반적으로 5% 미만, 더욱 일반적으로는 4%, 2%, 1% 미만)을 변경, 추가 또는 결실시키는 개별 치환, 결실 또는 추가는, 상기 변화가 아미노산 결실, 아미노산 첨가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산 치환을 야기하는 경우에 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 열거된 폴리펩티드 서열의 "보존적 변이체"는 당부분이 연결된 아미노산을 포함하는 보존적 비천연 아미노산 및/또는 동일한 보존적 치환기의 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산으로, 폴리펩티드 서열의 아미노산의 작은 퍼센티지, 일반적으로 5% 미만, 더욱 일반적으로 2% 미만 또는 1% 미만이 치환된 것을 포함한다. 마지막으로, 비기능성 서열의 첨가와 같이, 핵산 분자의 코딩된 활성을 변화시키기 않는 서열의 첨가는 기본 핵산의 보존적 변이이다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 공지되어 있다. 하기는 서로를 위한 "보존적 치환"을 포함하는 천연 아미노산을 함유한 예시적인 그룹을 개시한다.

보존적 치환 그룹
1	알라닌(A) 세린(S) 트레오닌(T)
2	아스파르트산(D) 글루탐산(E)
3	아스파라긴(N) 글루타민(Q)
4	아르기닌(R) 라이신(K)
5	이소루이신(I) 루이신(L) 메티오닌(M) 발린(V)
6	페닐알라닌(F) 티로신(Y) 트립토판(W)

핵산 하이브리드화

비교 하이브리드화를 이용하여 본 발명의 핵산의 보존적 변이체를 비롯한, 서열 번호 7, 8, 9 또는 10과 같은 본 발명의 핵산을 확인할 수 있으며, 이 비교 하이브리드화 방법은 본 발명의 핵산을 구별하는 바람직한 방법이다. 또한, 예를 들어 서열 번호 7, 8, 9 또는 10에 의해 나타내지는 핵산에 높은, 매우 높은 및 매우 매우 높은 엄격도 조건 하에 하이브리드화하는 표적 핵산이 본 발명의 특징이다. 그러한 핵산의 예는 주어진 핵산 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 침묵 또는 보존적 핵산 치환을 갖는 것들을 포함한다.

시험 핵산은, 완전히 매치되는 프로브가 매치되지 않는 표적 핵산 중 어느 것에 하이브리드화할 때 관찰되는 것의 적어도 약 5∼10배인 시그널 대 노이즈 비로 완전히 매치되는 프로브가 완전히 매치되는 상보적 표적에 결합하는 조건 하에, 표적에의 프로브의 하이브리드화의 적어도 1/2의 시그널 대 노이즈 비로, 완전히 매치되는 상보적 표적에 비해 적어도 1/2 로 프로브에 하이브리드화할 때 프로브 핵산에 특이적으로 하이브리드화한다고 말해진다.

핵산은 일반적으로 용액에서 연합할 때 "하이브리드화"한다. 핵산은 수소 결합, 용매 배제, 염기 적층 등과 같은 잘 규명된 다양한 물리화학적 힘으로 인해 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 안내는 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, New York), 상기한 Ausubel에 제공된다. Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1) 및 Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2)는 올리고뉴클레오티드를 비롯한 DNA와 RNA의 합성, 표지화, 검출 및 정량에 대한 상세한 사항을 제공한다.

서던 또는 노던 블롯에서 필터상의 100개 초과 상보성 잔기를 갖는 상보성 핵산의 하이브리드화를 위한 엄격한 하이브리드화의 예는 42℃에서 헤파린 1mg 및 50% 포르말린이며, 하이브리드화는 밤새 실시된다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분간 0.2x SSC 세척이다(SSC 완충액을 위해서는 상기 Sambrook을 참고). 종종 높은 엄격도 세척에 앞서 낮은 엄격도 세척이 이루어져 배경 프로브 시그널을 제거한다. 예시적인 낮은 엄격도 세척은 15분간 40℃에서 2x SSC이다. 일반적으로, 구체적 하이브리드화 분석에서 무관한 프로브에 대해 관찰된 것보다 5배 이상인 시그널 대 노이즈 비는 특이적 하이브리드화의 검출을 나타낸다.

서던 및 노던 하이브리드화와 같은 핵산 하이브리드화 실험의 내용에서 "엄격한 하이브리드화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 다른 환경적 변수하에 상이하다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 안내는 상기의 Tijssen(1993) 및 Hames and Higgins 1,2에 나타난다. 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건은 임의의 시험 핵산에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건을 결정하는 데 있어서, 하이브리드화 및 세척 조건은 선택된 기준이 충족될 때까지 점차 증가된다(예, 온도를 증가, 염 농도를 감소, 세제 농도를 증가 및/또는 하이브리드화 또는 세척에서 포르말린과 같은 유기 용매의 농도를 증가시킴으로써). 예를 들어, 매우 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건에서, 하이브리드화 및 세척 조건은, 프로브가 매치되지 않는 표적에 하이브리드화하는 것에 대해 관찰되는 것보다 적어도 5x배 높은 시그널 대 노이즈 비로 프로브가 완전히 매치되는 상보적 표적에 결합할 때까지 점차 증가된다.

"매우 엄격한" 조건은 구체적 프로브를 위한 열적 용융점(Tm)과 동일하도록 선택된다. Tm은 (한정된 이온 강도 및 pH에서) 시험 서열의 50%가 완전히 매치되는 프로브에 하이브리드화하는 온도이다. 본 발명의 목적을 위하여, "매우 엄격한" 하이브리드화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열을 위한 Tm보다 약 5℃ 낮도록 선택된다.

"매우 높은 엄격도" 하이브리드화 및 세척 조건은 하이브리드화 및 세척 조건의 엄격도가, 완전히 매치되는 상보적 표적 핵산에의 프로브의 결합을 위한 시그널 대 노이즈 비가 임의의 매치되지 않는 표적 핵산에의 하이브리드화에 대해 관찰된 것보다 적어도 10배 높을 때까지 증가된다. 그러한 조건 하에 완전히 매치되는 상보적 표적 핵산의 것의 적어도 1/2인 시그널 대 노이즈 비로 프로브에 하이브리드화하는 표적 핵산은 매우 높은 엄격도 조건 하에 프로브에 결합하는 것으로 말해진다.

유사하게, 관련 하이브리드화 분석의 하이브리드화 및/또는 세척 조건을 점진적으로 증가시켜 심지어 더 높은 수준의 엄격도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화 및 세척 조건의 엄격도는 완전히 매치되는 상보적 표적 핵산에의 프로브의 결합을 위한 시그널 대 노이즈 비가 임의의 매치되지 않는 표적 핵산에 대한 하이브리드화에 대해 관찰된 것의 적어도 lOx, 20X, 50X, 100X, 또는 500X일 때까지 증가된다. 그러한 조건 하에, 완전히 매치되는 상보적 표적 핵산의 적어도 1/2의 시그널 대 노이즈 비로, 프로브에 하이브리드화하는 표적 핵산은 매우 매우 높은 엄격도 조건 하에 프로브에 결합하는 것으로 말해진다.

엄격한 조건 하에 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은 만일 그들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하면 실질적으로 동일하다. 이것은 예를 들어, 핵산의 한 카피가 유전적 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 생성될 때 발생한다.

독특한 부분 서열

한 태양에서, 본 발명은 여기서 개시된 O-tRNA와 O-RS의 서열로부터 선택된 핵산내의 독특한 하위 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 독특한 부분 서열은 임의의 공지의 O-tRNA 또는 O-RS 핵산 서열에 해당하는 핵산과 비교할 때 독특하다. 배열은 예를 들어, 디폴트 파라미터에 고정된 BLAST를 이용하여 실시될 수 있다. 임의의 독특한 하위 서열은 예를 들어, 본 발명의 핵산을 동정하기 위한 프로브로서 유용하다.

유사하게, 본 발명은 여기서 개시된 O-RS의 서열로부터 선택된 폴리펩티드중의 독특한 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 여기서, 독특한 부분 서열은 이전에 공지된 폴리펩티드 서열에 해당하는 폴리펩티드와 비교하여 독특하다.

본 발명은 또한 O-RS의 서열로부터 선택된 폴리펩티드중의 독특한 부분 서열을 코딩하는 독특한 코딩 올리고뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 표적 핵산을 제공하며, 이 때 독특한 부분 서열은 임의의 대조 폴리펩티드(예, 본 발명의 신세타제가 예를 들어 돌연변이에 의해 유도된 모 서열)에 해당하는 폴리펩티드에 비하여 독특하다. 독특한 서열은 상기한 대로 결정된다.

서열 비교, 동일성 및 상동성

2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 내용에서 용어 "동일한", 또는 퍼센트 "동일성"은 하기하는 서열 비교 알고리즘 중 하나(또는 당업자가 이용가능한 알고리즘)를 이용하거나 시각적 관찰로 측정할 때, 최대 일치를 위해 배열되고 비교될 때, 동일하거나 특정 퍼센티지의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2 이상의 서열 또는 하위 서열을 말한다.

2개의 핵산 또는 폴리펩티드(예, O-tRNA 또는 O-RS를 코딩하는 DNA, 또는 O-RS의 아미노산 서열)의 내용에서 "실질적으로 동일한"은 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 시각적 관찰에 의해 측정할 때, 최대 일치를 위해 배열되고 비교될 때, 적어도 약 60%, 약 80%, 약 90-95%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다. 그러한 "실질적으로 동일한" 서열은 일반적으로 실제 조상에 관계없이 "상동성"인 것으로 간주된다. 바람직하게는, "실질적인 동일성"은 적어도 약 50 잔기 길이인 서열의 영역, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100 잔기 영역에 걸쳐 존재하며, 가장 바람직하게는, 상기 서열은 적어도 약 150 잔기에 걸쳐, 또는 비교될 두 서열의 전길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.

단백질 및/또는 단백질 서열은 그들이 공통된 조상 단백질 또는 단백질 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래될 때 "상동성"이다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통된 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래될 때 "상동성"이다. 예를 들어, 임의의 자연 발생 핵산은 임의의 이용가능한 돌연변이유발 방법에 의하여 변형되어 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 발현될 때, 이 돌연변이된 핵산은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 돌연변이 과정은 물론 추가적으로 하나 이상의 표준 코돈을 변형시켜 생성된 돌연변이 단백질에서 하나 이상의 표준 아미노산을 변화시킬수 있다. 상동성은 일반적으로 2 이상의 핵산 또는 단백질(또는 그 부분 서열)간의 서열 유사성으로부터 추론된다. 상동성을 확립하는 데 유용한 서열간의 유사성의 정확한 퍼센티지는 대상 핵산 및 단백질에 따라 다르지만, 최소 25% 서열 유사성이 상동성 확립을 위해 일상적으로 이용된다. 더 높은 수준의 서열 유사성, 예, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 또는 그 이상이 또한 상동성 확립을 위해 이용될 수 있다. 서열 유사성 퍼센티지를 결정하는 방법(예, 디폴트 파라미터를 이용하는 BLASTP 및 BLASTN)이 여기서 개시되며 일반적으로 이용가능하다.

서열 비교 및 상동성 결정을 위해, 일반적으로 한 서열이 시험 서열이 비교될 기준 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되며, 부분 서열 코디네이트가 필요에 따라 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 비한 시험 서열을 위한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

비교를 위한 적절한 서열의 배열은 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 배열 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)의 유사성 조사 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (와이오밍주, 매디슨, 575 사이언스 드라이버의 제네틱스 소프트웨어 그룹의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 시각적 관찰에 의해 (일반적으로 Ausubel et al., 하기 참고) 실시될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 알고리즘이며, 이것은 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)에 개시된다. BLAST 분석 실시를 위한 소프트웨어는 바이오테크놀러지 정보를 위한 국립 센터(www. ncbi. nlm. nih. gov/)를 통해 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 같은 길이의 단어와 배열될 때 일부 양성값 역치 점수 T를 만족하거나 매치되는 질의 서열중의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것에 관련된다. T는 이웃 단어 점수 역치로 불린다(상기의 Altschul et al.,). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 함유한 더 긴 HSP를 찾기 위한 조사를 개시하기 위한 시드로써 작용한다. 이어서 상기 단어 히트는 축적 배열 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 축적 점수는 뉴클레오티드 서열을 위해, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍을 위한 리워드 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매치 잔기를 위한 페널티 점수; 항상 <0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 이용하여 축적 점수를 계산한다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 축적 배열 점수가 그 최대 가능 값으로부터 양 X만큼 떨어질때; 축적 점수가 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 배열의 축적으로 인해 0 이하로 갈때; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달할 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 배열의 민감성과 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열을 위한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 단어길이(W) 11, 기대치(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=4 및 두 가닥 모두의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이(W) 3, 예상치 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용한다(Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 참고).

퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열간의 유사성의 통계적 분석을 실시한다(예, Karlin & Altschul, Proc.Nat'1. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) 참고). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한가지 측정은 최소 합계 확률(P(N))이며, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 매치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에의 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 기준 서열에 유사한 것으로 간주된다.

돌연변이유발 및 기타 분자 생물학 기법

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 분자 생물학적 기법을 이용하여 조작될 수 있다. 분자 생물학적 기법을 개시하는 일반 교과서는 상기의 Berger and Kimmel; Sambrook 및 Ausubel을 포함한다. 이들 교과서는 돌연변이유발, 벡터의 이용, 프로모터 및, 본 발명의 당단백질의 생산을 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 신세타제 및 그 쌍의 생성에 관련된 많은 다른 관련 토픽을 개시한다.

다양한 타입의 돌연변이유발을 본 발명에 이용하여 예를 들어, tRNA 분자를 돌연변이시키고, tRNA 라이브러리를 생산하고, 신세타제 라이브러리를 생산하고, 비천연 아미노산, 예, 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산, 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈을 대상 단백질 또는 폴리펩티드에 삽입한다. 이들은 부위-지시된, 임의 점 돌연변이유발, 상동성 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 회귀성 돌연변이유발 법, 키메라 구성, 우라실 함유 주형을 이용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발, 포스포로티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발, 갭을 가진 이중 DNA를 이용한 돌연변이 유발 등 또는 임의의 그 조합을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 추가의 적합한 방법은 점 미스매치 회복, 회복-결핍 숙주 균주를 이용한 돌연변이유발, 제한-선별 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 이중쇄 브레이크 회복 등을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구성에 관련되는 돌연변이 유발 또한 본 발명에 포함된다. 한 구체예에서, 돌연변이유발은 자연 발생 분자 또는 변화된 또는 돌연변이된 자연 발생 분자의 알려진 정보, 예, 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 결정 구조 등에 의해 안내될 수 있다.

숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 예, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된다(예, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염). 예를 들어, 오르소고날 tRNA, 오르소고날 tRNA 신세타제 및 예를 들어 알데히드- 또는 케토-유도체화된 아미노산과 같은 당 부분이 부착될 수 있는 부분을 포함하는 비천연 아미노산 또는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 이용하여 유도될 단백질을 위한 코딩 영역은 원하는 숙주 세포에서 기능하는 유전자 발현 조절 성분에 작동적으로 연결된다. 일반적인 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 전사 및 번역 개시 서열 및 특정 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 상기 벡터는 선택적으로 적어도 하나의 독립적인 종결인자 서열을 함유한 포괄적인 발현 카세트, 진핵 세포, 또는 원핵 세포 또는 둘 다(셔틀 벡터)에서 카세트의 복제를 허용하는 서열 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 다를 위한 선별 마커를 포함한다. 벡터는 원핵 생물, 진핵 생물, 또는 바람직하게는 둘 다에서의 복제 및/또는 도입에 적합하다. Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr.Purif. 6435: 10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (모두 상기함)를 참고한다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 쳔연 폴리뉴클레오티드, 또는 접합된 폴리뉴클레오티드 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공(From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,5824 (1985)), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스내, 또는 표면상에(Klein et al., Nature 327, 70-73(1987)) 핵산을 갖는 작은 입자에 의한 고속 충돌 투과 및/또는 기타를 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물내로 도입된다.

클로닝에 유용한 박테리아와 박테리오파아지의 카탈로그는 예를 들어 ATCC에 의해 발행된 ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1996) Gherna et al. (eds)에 의해 제공된다. 서열 결정, 클로닝 및 분자 생물학의 다른 태양을 위한 추가의 기본적인 과정 및 그 이론적 고려사항은 또한 Sambrook (상기), Ausubel (상기) 및 Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY에 제공된다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산(및 표준 또는 비표준이건 간에, 임의의 표지된 핵산)은 Midland Certified Reagent Company (Midland, TX mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA, genco. com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL, expressgen. com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) 및 다수의 기타와 같은 다양한 시판 공급원으로부터 주문된 맞춤 또는 표준 핵산일 수 있다.

조작된 숙주 세포는 예를 들어, 스크리닝 단계, 프로모터 활성화 또는 형질전환체의 선별과 같은 활동을 위해 적절하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 이들 세포는 선택적으로 형질전환 유기체내에서 배양될 수 있다. 예를 들어, (예, 후속 핵산 분리를 위한) 세포 분리 및 배양을 위한 다른 유용한 참고문헌은 Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York 및 그안에 인용된 참고문헌; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture ; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL를 포함한다.

키트

키트는 또한 본 발명의 특징이다. 예를 들어, 적어도 당 부분을 포함하는 당단백질을 생산하기 위한 키트가 제공되며, 이 때 키트는 O-tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 O-tRNA 및/또는 O-RS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 O-RS를 함유한 용기를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 추가로 당 부분을 가진 비천연 아미노산, 또는 당 부분이 부착될 부분을 가진 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 추가로 당단백질을 생산하기 위한 지시 재료를 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해서 제공되며, 제한하기 위한 것이 아니다. 여기서 개시된 실시예와 구체예는 단지 예시의 목적이며 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며 본 출원 및 첨부된 청구범위의 정신 및 관점내에 포함될 것이다.

실시예 1: 케토 기능기를 단백질 내로 도입하기 위한 시스템

본 실시예는 p-아세틸-L-페닐알라닌을 제조하고 이 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 시스템을 개시한다.

대부분의 공지 유기체의 유전적 코드는 단백질의 생합성을 위한 빌딩 블록으로서 동일한 일반적인 20개의 아미노산을 코딩한다. 드문 경우에만, 셀레노시스테인(예, Bock, A., et al.. (1991) Mol. Microbiol. 5: 515-520 참고) 또는 피로라이신(예, Srinivasan, G., et al., (2002) Science 296: 1459-1462; 및, Hao, B., et al., (2002) Science 296: 1462-1466 참고)이 추가된다. 일반적인 아미노산의 측쇄는 놀라울정도로 제한된 수의 기능기-질소 염기, 카복실산 및 아미드, 알콜 및 티올기를 포함하며, 나머지는 간단한 알칸 또는 소수성기이다. 새로운 아미노산, 예, 금속 킬레이팅 측쇄, 형광 측쇄, 산화환원 활성 측쇄, 광활성 또는 스핀-표지된 측쇄를 가진 아미노산을 이용하여, 유전적으로 코딩된 아미노산을 증대시키는 능력은 단백질 및 아마도 살아있는 유기체 자체의 구조 및 기능을 조작하는 능력을 상당히 증가시킬 것이다. 최근에는, 본 발명자들은 에스케리챠 콜리(E.coli)의 번역 기계에 새로운 성분을 첨가함으로써 많은 수의 비천연 아미노산을 높은 확실성을 갖고 생체내에서 단백질 내로 부위 특이적으로 도입시킬 수 있음을 보고하였다.(예, Wang, L., et al. (2001) Science 292: 498-500; Wang, L., et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 1836-1837; 및, Zhang, Z., et al. (2002) Angew. Chem. Int. Ed.Engl. 41: 2840-2842 참고). 이 실시예는 이 접근법이 케토 함유 아미노산을 유기체, 예, 이.콜리의 유전적 코드에 추가하기 위해 확장될 수 있으며, 케토 기의 독특한 반응성이 다양한 시약을 이용하여 생체외에서 단백질을 선택적으로 변형시키기 위해 이용될 수 있음을 입증한다.

케토기는 유기 화학에서 흔하며, 첨가 반응에서 알돌 응축에 이르기까지 다수의 반응에 참여한다. 더욱이, 케토기의 독특한 반응성은 다른 아미노산 측쇄의 존재하에 하이드라자이드 및 하이드록실아민 유도체로 선택적으로 변형되도록 한다. 예를 들어, Cornish, V. W., et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151; Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G. (1992) Bioconjug. Chem. 3: 138-146; 및, Mahal, L. K., et al. (1997) Science 276: 1125-1128를 참고한다. 보조인자에서(예, Begley, T. P., et al. (1997) in Top. Curr. Chem.. eds. Leeper, F. J. & Vederas, J. C. (Springer-Verlag, New York), Vol. 195, pp. 93-142 참고), 대사물에서(예, Diaz, E., et al. (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 523- 569 참고) 그리고 단백질의 번역후 변형(예, Okeley, N. M. & van der Donk, W. A. (2000) Chem. Biol. 7:R159-R171 참고)으로서 존재함에도 불구하고, 이 중요한 기능기는 일반적인 아미노산의 측쇄에는 없다. 이.콜리에서 p-아세틸-L-페닐알라닌의 형태로 이 기능기를 유전적으로 코딩하기 위해, 앰버 넌센스 코돈에 대한 반응으로(그리고 이 코돈에만 반응하여) 이.콜리에서 이 아미노산을 부위 특이적으로 단백질 내로 삽입할 수 있는 tRNA-신세타제 쌍이 개발되었다. 중요하게도 이 tRNA-신세타제 쌍은 일반적인 20개 아미노산을 위한 그 대응부에 대해 오르소고날이며, 즉, 오르소고날 신세타제(및 이 신세타제만)는 비천연 아미노산만을 이용하여 오르소고날 tRNA(및 이 tRNA만)를 아미노아실화하며, 생성된 아실화된 tRNA는 앰버 코돈에 대한 반응에서만 비천연 아미노산을 삽입한다.

재료 및 방법

p-아세틸-L-페닐알라닌의 제조: Fmoc-p-아세틸-L-페닐알라닌을 RSP 아미노산 아날로그, 인크.(Worcester, MA)로부터 구입하였다. 이 화합물(1.0g, 2.3 mmol)을 실온에서 2시간 동안 피페리딘 4 mL(디메틸 포름아미드(DMF)중에 20%)과 함께 교반하였다. 용매를 증발시켜 백색 분말을 얻었다. 이어서 고체를 10 mL의 차가운 물(0.1% 트리플루오로아세트산(TFA))에 재현탁시키고, 상등액을 여과에 의해 수집하였다. 제조성 역상 HPLC(MicrosorbC18, Rainin Instrument Co., Inc.,Woburn, MA)를 이용하여 반응 혼합물로부터 원하는 생성물을 분리하였다(30분동안 0. 1% TFA 를 이용하여 H₂0중의 5-30% CH₃CN). 용출액(t_R = 12분)을 동결건조하여 백색 고체를 얻었다(0.45 g, 88%).

C₁₁H₁₃NO₃의 계산치 208.09, 실측치 208.47

p-아세틸-(±)-페닐알라닌의 합성(예, Cleland, G. H. (1969) J. Org. Chem. 34: 744-747 참고): N-브로모석신이미드(NBS)를 사용에 앞서 재결정화하였다. NBS(18.5 g, 105 mmol)를 사염화탄소 400 mL중의 4-메틸 아세토페논(13.4 g, 100 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 이어서 2',2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN)(0.43 g, 2.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 환류로 가열시켰다. 반응 완결 후(TLC: 8:1/헥산:EtOAc), 상기 용액을 물(1 X 100 mL), 1 M 수성 HCl (3 X 100 mL), 0.5% 수성 NaHCO₃ (3 X 100 mL) 및 염수 (1 X 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 수집하고 무수 MgSO₄에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 노란색 고체를 얻고 이를 헥산으로 재결정시켜 원하는 1-(4-브로모에틸-페닐)타논을 고체로 얻었다(16.8 g, 78%). 건조 에탄올(50 ml)을 펜탄-세척된 소듐 조각((2.3 g, 0.1 mol)에 아르곤 분위기하에 15분동안 적가하고 상기 용액을 다시 15분동안 교반하였다. 고체 디에틸 아세트아미도말로네이트(2.7 g, 10 mmol)를 교반하면서 30분동안 첨가하고, 이어서 건조 에탄올중의 1-(4-브로모에틸-페닐)타논(2.1 g, 10 mmol)을 90분동안 적가하였다. 혼합물을 밤새 가열하여 환류시키고, 냉각시키고, 디에틸 에테르(150 mL) 및 물(100 mL)을 상기 용액에 첨가하였다. 유기층을 분리하고 연속해서 0.5% NaHCO₃ (3 X 100 mL) 및 염수 (1 X 100 mL)로 세척하였다. 무수 MgSO₄에서 건조시킨 후, 용매를 진공에서 건조시켜 갈색 고무상의 고체를 얻었다. 헥산-디클로로메탄(4:1)을 잔류물에 첨가하고, 불용성 물질을 여과하고 10:1 디클로로메탄-벤젠으로 완전히 세척하여 2-아세틸아미노-2-(4-아세틸-벤질)말론산 디에틸 에스테르를 황색 고체로서 얻었다(3.3 g, 95% 조 수율). 이 화합물을 디옥산중의 4M HCl과 함께 밤새 교반하였다. 이어서 상기 혼합물을 건조할 때까지 증발시키고 물로 재결정하여 p-아세틸-(±)-페닐알라닌을 백색 고체로 얻었다(13.2 g, 64% 전체 수율).

C₁₁H₁₃NO₃를 위한 계산치 208.09, 실측치 208.07

돌연변이 신세타제 발생: 양성 선별에서, 플라스미드 pYC-J17을 이용하여 유전자 및 Asp 112에서 TAG 정지 코돈을 갖는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 발현시켰다. 예를 들어, Wang, L., et al. (2001) Science 292: 498- 500를 참고한다. 티로실-tRNA 신세타제(TyrRS) 라이브러리를 코딩하는 수퍼코일된 DNA를 pYC-J17을 함유하는 이.콜라이 DH10B 컴피턴트 세포내로 형질전환시켰다. 이어서 세포를 1% 글리세롤 및 0.3 mM 루이신(GMML)을 17 ㎍/mL 테트라사이클린, 25 ㎍/mL 카나마이신, 60㎍/mL의 클로람페니콜 및 1 mM p-아세틸-L-페닐알라닌과 함께 함유한 최소 배지 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 40시간 동안 항온처리한 후, 콜로니를 모으고, 플라스미드를 분리하였다. 돌연변이 신세타제를 코딩하는 플라스미드(pBK 플라스미드)를 젤 전기영동을 이용하여 pYC-J17로부터 분리하고 음성 선별을 위하여 pLWJ17B3을 함유한 이.콜라이 DH10B 컴피턴트 세포내로 형질전환시켰다. 플라스미드 pLWJ17B3는 lpp 프로모터와 rrnC 종결인자의 조절하에를 발현하며, 아라비노스 프로모터의 조절하에 Gln2, Asp44 및 Gly65에서 세 개의 앰버 코돈을 갖는 바나제 유전자를 발현한다. 형질전환된 세포를 0.2% 아라비노스, 50 ㎍/ml 카나마이신 및 35 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유한 LB(Luria-Bertani) 플레이트에서 성장시켰다. 8시간 후, 세포를 플레이트로부터 제거하고, 추가 선별을 위하여 pBK 플라스미드를 정제하였다. 제2 및 제3의 양성 선별에서, 클로람페니콜의 농도를 각각 80 및 100 ㎍/ml로 증가시켰다. 2번의 음성 선별과 교번하는 3 번의 양성 선별 후, 생체내 CAT 분석에서 p-아세틸-L-페닐알라닌의 부재하에 9 ㎍/ml 클로람페니콜의 IC₅₀ 값 및 p-아세틸-L-페닐알라닌의 존재하에 120 ㎍/ml 클로람페니콜의 IC₅₀ 값을 갖는 11개 돌연변이 TyrRS를 동정하였다. 예를 들어, Wang, L. & Schultz, P. G. (2001) Chem. Biol. 8: 883-890를 참고한다. 이들 돌연변이 TyrRS의 단백질 서열은 각 돌연변이 TyrRS의 코돈 이용이 상이함에도 불구하고 3개의 독립적인 클론 LW1, LW5 및 LW6에서 수렴하였다.

단백질 발현 및 정제: 플라스미드 pLEIZ를 이용하여 7번째 위치에서 앰버 코돈을 가지며 COOH-말단 His6 태그를 갖는 Z-도메인 유전자를 박테리오파아지 T5 프로모터와 t₀ 종결인자의 조절하에 발현시키고, lpp 프로모터와 rrnC 종결인자의 조절하에유전자를 발현시켰다. 클론 LW1(LW1RS)로부터 분리된 돌연변이 신세타제 유전자는 구성적 이.콜라이 GlnRS 프로모터와 종결인자의 조절하에 플라스미드 pBK-LW1RS에서 코딩되었다. pLEIZ와 pBK-LW1RS로 동시형질전환된 이.콜라이 DH10B 세포를 1% 글리세롤 및 0.3 mM 루이신(GMML 배지)과 25 ㎍/ml 카나마이신, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1.0 mM p-아세틸-(±)-페닐알라닌을 함유한 최소 배지에서 성장시켰다. 세포가 0.5의 OD₆₀₀에 도달할 때, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)(1 mM)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 5시간 후, 세포를 침전시키고 단백질을 제조자의 프로토콜(Qiagen, Valencia, CA)에 따라 변성 조건 하에 Ni²⁺ 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서 단백질을 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)으로 탈염시키고 물에 용출시켰다. 단백질 수율을 브래드포드 분석에 의해 측정하였다(BCA kit, Biorad, Hercules, CA). 단백질 분취액을 이용하여 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)와 질량 분광법을 하였다.

플루오르세인 하이드라자이드 및 비오틴 하이드라자이드를 이용한 생체외 단백질 변형: 정제된 야생형(wt) 및 돌연변이 Z 도메인 단백질을 포스페이트 완충된 염수 용액(PBS 완충액, 100 mM 포타슘 포스페이트, pH 6.5, 0.5 M 소듐 클로라이드)내로 투석에 의해 교환시켰다. 플루오르세인 하이드라자이드 1(Molecular Probe, Eugene, OR) 또는 비오틴 하이드라자이드 2(Molecular Probe, Eugene, OR)를 DMF에 용해시키고, 실란화된 에펜돌프 튜브내의 각 단백질 0.07 μmol내로 1mM의 최종 농도로 첨가하였다. PBS 완충액(pH 6.5)을 첨가하여 최종 부피를 0.5 ml로 만들었다. 반응 혼합물을 18시간 동안 25℃에서 유지하였다. 미반응 염료 또는 비오틴을 PD-10 컬럼을 이용하여 단백질로부터 제거하고(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), 단백질을 PBS 완충액으로 용출시켰다. 표지화 효율을 결정하기 위하여, 이어서 용출된 단백질 샘플을 역상 HPLC(ZORBAX SB-C18, 4.6 mm x 250 mm, 유속 1.0 mL/min, 수성 50 mM 트리에틸아민 아세테이트 완충액중의 10 → 40 % CH₃CN, pH 7.0 70 분, Agilent, Palo Alto, CA)에 의해 분석하였다. 표지화없는 돌연변이 Z 도메인을 위한 보유 시간(t_R)은 39.3 분이었으며; 플루오르세인 하이드라자이드 표지된 돌연변이 Z 도메인을 위한 t_R은 40.7분이고; 비오틴 하이드라자이드 표지된 돌연변이 Z 도메인을 위한 t_R은 40.9분이었다.

형광 스펙트럼 측정: 모든 형광 방출 스펙트럼을 490 nm에서의 여기를 가지고 FluoroMax-2 스펙트로플루오로미터 (Instruments S. A., Inc., Edison, NJ)를 이용하여 기록하였으며; 여기 및 방출 밴드 패스는 4 nm이며; 광증폭기 튜브 전압은 950 V이고; 그리고 1 nm/sec의 스캔 속도였다. 각 표지된 단백질 10 nmol을 이용하였다. 보고된 스펙트럼은 3 스캔의 평균을 나타낸다.

결과 및 고찰

케토 아미노산

케토기는 카보닐기 또는 산성 Cα위치에 관련된 부가 반응에 참여하는 능력으로 인해 일반적인 20개 아미노산에 존재하지 않는 독특한 화학적 반응성을 제공한다. 이 기는 또한 광범위한 화학적 시약을 이용한 단백질의 선택적 변형을 위한 천연 아미노산 시스테인에 대한 대안을 제공한다. 시스테인의 반응성 티올기는 다양한 생물물리적 프로브를 단백질에 부착하기 위해 많이 이용되어 왔다. 예를 들어, Creighton, T. E. (1986) MethodsEnzymol. 131: 83-106; Altenbach, C., et al., (1990) Science 248: 1088∼1092; Brinkley, M. (1992) Bioconjug. Chem. 3: 2-13; Giuliano, K. A., et al. (1995) Annu. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 24: 405-434; Mannuzzu, L. M., et al., (1996) Science 271: 213-216; Griffin, B. A., et al. (1998) Science 281: 269-272; Llopis, J., et al., (2000) MethodsEnzymol 327: 546-564; 및, Gaietta, G., et al., (2002) Science 296: 503-507를 참고한다. 불행히도, 단일 시스테인 잔기의 표지화는 종종 단백질내의 하나보다 많은 반응성 잔기의 존재 및 디설파이드 결합이 이용될 때 유리 티올의 존재하에서의 교환 반응에 의해 복잡해진다. 따라서, 오르소고날 반응성을 갖는 비프로테인성 아미노산의 이용가능성은, 단일 시스테인이 선택적으로 표지화될 수 없거나 두 가지 상이한 표지가 필요한 경우에 단백질의 선택적 변형을 가능하게 한다. 케토기는 수용액에서 온화한 조건 하에 하이드라자이드, 하이드록실아민 및 세미카바지드와 쉽게 반응하여, 히드라존, 옥심 및 세미카바존 결합을 각각 형성하며, 이들은 생리학적 상태하에 안정하다. 예를 들어, Jencks, W. P. (1959) J. Am. Chem. Soc. 81: 475-481; 및, Shao, J. & Tam, J. P. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899를 참고한다.

카보닐 기를 펩티드 및 작은 단백질 내로 선택적으로 도입하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다. 처음에는, N-말단 세린 또는 트레오닌을 페리오데이트로 산화시켜 알데히드를 펩티드의 N-말단에 도입하였다. 알데히드기는 히드라존 결합을 통해 비오틴 및 형광 리포터(예, Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G. (1992)Bioconjug. Chem. 3: 138-146) 또는 COOH-말단 하이드라자이드를 함유한 단백질 단편에 결합되었다(예, Gaertner, H. F., et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 참고). 이 방법에 의해 도입된 카보닐기는 N-말단에 제한되고 단백질은 산화에 안정해야 한다. 나중에는 하이드라자이드 또는 히드록실아민을 함유하는 펩티드 절편의 제조를 위해 고체상 펩티드 합성(SPPS)를 이용하였으며, 이 기들은 이어서 가지친 알데히드 코어 매트릭스와 반응하여 펩티드 덴드리머를 형성하거나(예, Shao, J. & Tam, J. P. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899; 및, Rose, K. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:30-33 참고), 케토 함유 펩티드 절편과 반응하여 합성 단백질을 형성한다(예, Canne, L. E., et al., (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 2998-3007 참고). SPPS는 케토기가 단백질 전체에 걸쳐 도입되도록 하지만, 큰 펩티드 또는 단백질 합성과 관련된 내재적인 어려움을 겪는다. 이러한 크기 제한은 일부 경우에, 합성 펩티드가 재조합 단백질의 COOH-말단에 화학적으로 연결되는 발현된 단백질 라이게이션(EPL)에 의해 극복될 수 있다. 예를 들어, Muir, T. W., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95: 6705-6710를 참고한다. 케톤기 함유 펩티드는 SPPS에 의해 제조되었으며 아벨손 단백질 티로신 키나제의 Src 상동성 3 도메인에 연결된다. 예를 들어, Ayers, B.,et al., (1999) Biopolymers 51: 343-354를 참고한다.

생체외 생합성 방법이 또한 케토기를 단백질 내로 도입하기 위해 이용되었다. 예를 들어, Cornish, V. W., et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 8150- 8151를 참고한다. 이 방법에서, 케토기를 함유한 비천연 아미노산은 앰버 억제자 tRNA로 화학적으로 아실화된다. 아실화된 tRNA와 돌연변이 유전자가 단백질 생합성을 지지할 수 있는 생체외 추출물에서 합쳐지면, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 대한 반응으로 선택적으로 도입된다. 이 방법은 억제자 tRNA가 생체외에서 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화될 것을 요하며, 아실화된 tRNA는 번역동안 입체화학량론적 시약으로 소비되며 재생될 수 없어, 단백질 수율이 낮아진다. p-아세틸-L-페닐알라닌에 대한 특이성을 갖는 오르소고날 tRNA-신세타제를 개발함으로써, 케토 아미노산은 예를 들어, 살아있는 이.콜라이 세포에서 직접 UAG 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 도입될 수 있다. 단백질이 유기체, 예, 이.콜리에서 발현될 수 있는 한 표적 단백질에 대한 크기 제한은 없으며, 다량의 돌연변이 단백질을 발현하는 것이 가능하다. 더욱이, 표지 시약이 세포 투과성이고 비독성인 한, 전체 세포에서 표지를 선택적으로 도입하는 것이 가능할 수 있다.

p-아세틸-L-페닐알라닌을 위한 특이성을 갖는 돌연변이 신세타제의 개발

메타노코커스 잔나쉬 티로실-tRNA 신세타제(TyrRS) 및 돌연변이 티로신 앰버 억제자 tRNA()를 오르소고날 tRNA-신세타제 쌍의 생성을 위한 출발점으로 이용하였다. 이전에는, 이 쌍은 이.콜리에서 오르소고날인 것으로 나타났다. 예를 들어, Wang, L. & Schultz, P. G. (2001) Chem. Biol. 8: 883- 890; 및, Wang, L., et al. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 5010-5011를 참고한다. TyrRS의 아미노산 특이성을 변화시켜 일반 20개 아미노산이 아닌 p-아세틸-L-페닐알라닌을 충전하기 위해, 엠. 잔나쉬 TyrRS 돌연변이 라이브러리를 생성시켜 스크린했다. 상동성 바실러스 스테아로설모필루스 TyrRS의 결정 구조(예, Brick, P., et al. (1989) J. Mol. Biol. 208: 83-98 참고)를 이용하여 결합된 티로신의 아릴 고리의 파라 위치의 6.5Å내에 있는 잔기를 확인하였다. 엠. 잔나쉬 TyrRS의 활성 부위내의 5개의 상응하는 잔기(Tyr32, Glu107, Asp158, Ile159 및 Leu162)를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 임의로 돌연변이시켜 1.6 X 10⁹ 크기의 라이브러리를 생성하였다(예, Wang, L., et al. (2001) Science 292: 498-500 참고). 이 TyrRS 돌연변이 라이브러리를 먼저 1 mM p-아세틸-L-페닐알라닌의 존재하에 양성 선별을 거쳤으며, 이 선별은 이.콜리에서 플라스미드 pYC-J17(예, Wang, L., et al. (2001) Science 292: 498-500 참고)상에 코딩된 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 유전자의 비필수 잔기(Asp 112)에서 앰버 정지 코돈의 억제에 기초한다. 클로람페니콜에서 생존하는 세포는 일반적인 아미노산 또는 p-아세틸-L-페닐알라닌으로 를 아미노아실화하는 돌연변이 신세타제를 코딩해야 한다. 이어서 돌연변이 신세타제를 코딩하는 DNA를 분리하고, 허용 부위에서 세 개의 앰버 코돈을 함유한 독성 단백질, 바나제의 유전자를 발현하는 음성 선별 균주내로 형질전환시킨다. 천연 아미노산으로를 충전하는 돌연변이 신세타제를 코딩하는 세포는 바나제를 생산하고 죽을 것이다. p-아세틸-L-페닐알라닌이 음성 선별에서는 성장 배지에 첨가되지 않았기 때문에, 생존자는 비천연 아미노산에 대해 특이성을 갖는 신세타제를 코딩해야 한다. 증가된 클로람페니콜 농도에서 2번의 음성 선별과 교대하면서 3번의 양성 선별 후, 클로람페니콜에서의 생존이 p-아세틸-L-페닐알라닌의 첨가에 의존하는 많은 클론이 나타났다. 이들 TyrRS는 CAT 유전자에서 Asp112TAG 코돈의 억제에 기초한 생체내 분석을 이용하여 특성을 확인하였다. 예를 들어, Wang, L. & Schultz, P. G. (2001) Chem. Biol. 8: 883-890를 참고한다. 11개의 TyrRS 돌연변이를 확인하였다. 선택된 신세타제 및를 발현하는 세포는 1% 글리세롤 및 0.3 mM 루이신을 함유한 최소 배지 플레이트(GMML 플레이트)에서 9 ㎍/ml 클로람페니콜에서 p-아세틸-L-페닐알라닌의 부재하에 생존하였으며; 이 비천연 아미노산의 존재하에서는, 세포는 GMML 플레이트에서 120 ㎍/ml 클로람페니콜에서 생존하였다. 이 결과는 선택된 돌연변이 신세타제가 천연 아미노산에 대해서보다 p-아세틸-L-페닐알라닌에 대해 더 높은 활성을 가짐을 제안한다. 이들 돌연변이의 DNA의 서열 결정 결과 그들이 아미노산을 위한 상이한 코돈 사용을 가짐에도 불구하고, 이들이 단백질 수준에서 3개의 독립적인 돌연변이에서 수렴함(LW1, LW5 및 LW6)을 밝혔다. 돌연변이 신세타제의 활성 부위 돌연변이는 표 1에 열거된다. 비.스테아로설로필루스로부터의 상동성 TyrRS의 결정 구조에 기초하여, 엠.잔나쉬 Tyr32 및 Asp158의 보존된 측쇄는 기질 티로신의 하이드록실기와 수소 결합을 형성하기 쉽다. 돌연변이 신세타제에서, Tyr32는 Leu 또는 Ala으로 돌연변이되며, Asp158은 Gly158로 돌연변이된다. 이들 돌연변이는 티로신의 결합을 선호하지 않으며 동시에 p-아세틸-L-페닐알라닌의 메틸기를 수용할 여지를 생성할 수 있다. 돌연변이의 X-선 결정 구조의 결정은 이들 돌연변이의 정확한 역할을 명확히 할 것이다.

[표 1]

야생형 엠.잔나쉬(MJ) TyrRS에서 아미노산 잔기 및 p-아세틸-L-페닐알라닌을 위한 특이성을 갖는 개발된 돌연변이 신세타제
아미노산 잔기	32	158	159	162	167
WT Mj TyrRS	Tyr	Asp	Ile	Leu	Ala
LW1	Leu	Gly	Cys	Arg	Ala
LW5	Leu	Gly	Thr	Arg	Ala
LW8	Ala	Gly	Gly	Leu	Ile

p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유한 돌연변이 단백질의 특성 규명

개발된 신세타제 및가 p-아세틸-L-페닐알라닌을 단백질 내로 선택적으로 도입하는 능력을 시험하기 위하여, 앰버 정지 코돈을 COOH-말단 His6 태그를 가진 스타필로코커스 단백질 A의 Z 도메인을 위한 유전자(예, Nilsson, B., et al. (1987) Protein Eng. 1: 107-113 참고)에서 허용 부위에서(Lys7) 치환하였다. Z 도메인은 약 7.9 kDa의 분자량을 가지며, 그 질량은 이온 사이클로트론 공명(ICR) 질량 분광법을 이용하여 매우 높은 정확도로 측정될 수 있다. , LW1RS 및 Z 도메인 유전자(Lys7TAG)로 형질전환된 세포를 1 mM p-아세틸-(±)-페닐알라닌의 존재하에 성장시켰다. 비천연 아미노산의 첨가는 세포의 성장 속도에 영향을 주지 않았다. 돌연변이 단백질은 전체 분리 수율 3.6 mg/l 최소 배지로 Ni²⁺ 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 비교를 위하여, 돌연변이 TyrRS를 야생형 TyrRS로 대체하였을 때 Z 도메인의 수율은 9.2 mg/l 최소 배지였다. p-아세틸-(±)-페닐알라닌,, LW1RS의 부재하에서는 Z 도메인이 얻어지지 않아, 이 부위에서 비천연 아미노산의 도입의 매우 높은 확실성을 나타낸다. 또한 Cdc42와 같은 다른 단백질 내로 p-아세틸-L-페닐알라닌을 도입하는 데도 성공적이었다.

/WT TyrRS에 의해 발현된 야생형 Z 도메인 단백질과 /LW1RS에 의해 발현된 돌연변이 Z 도메인 단백질 둘 다 전기분사 이온화 푸리에르 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분광법(FT-ICR MS)에 의해 분석하였다. 야생형 Z 도메인 단백질의 경우, 본래의 단백질, 첫 번째 메티오닌이 없는 단백질 및 첫 번째 메티오닌이 없는 단백질의 아세틸화된 형태에 해당하는 질량에서 세 개의 피크가 관찰되었다(N-말단 트립신 분해된 펩티드 단편의 탠덤 질량 분광 분석에 의해 확인됨). 돌연변이 Z 도메인 단백질의 경우, 본래 단백질의 실험적 모노아이소토픽(monoisotopic) 질량은 7949.893 Da이었으며, 이것은 7949.874 Da의 이론적 질량의 2.2 ppm 이내이다. 두 가지 다른 피크는 첫 번째 메티오닌이 없는 단백질(M_Experimental =7818.838 Da, M_Theoretical = 7818.833 Da) 및 그것의 아세틸화된 형태(M_Experimental = 7860.843 Da, M_Theoretical = 7860.844 Da)에 각각 해당한다. 앰버 코돈 위치에서 임의의 다른 아미노산을 가진 돌연변이 단백질에 해당하는 피크는 스펙트럼에서 관찰되지 않았다. 본래의 단백질 질량 스펙트럼에서 관찰된 1500을 넘는 시그널-대-노이즈 비는 99.8%보다 좋은 p-아세틸-L-페닐알라닌의 도입의 확실성으로 해석된다. 트립신 분해물의 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법을 수행하여 NH₂-말단 펩티드의 서열을 확인하였다. NH₂-말단의 트립신 분해 펩티드 MTSVDNY*INK의 이중 하전된 분자 이온에 해당하는 606.23 Da의 전구체 이온을 분리하고, 이온 트랩 질량 분광기(ITMS)로 단편화하였다. 단편 이온 질량은 명확하게 할당되어 p-아세틸-L-페닐알라닌의 부위 특이적 도입을 확인할 수 있었다. 이들 결과는 개발된 신세타제와가 앰버 코돈에 의해 코딩되는 위치에서만 p-아세틸-L-페닐알라닌을 도입하며 임의의 천연 아미노산을 도입하지 않음을 입증한다.

플루오르세인 하이드라자이드를 이용한 부위 특이적 단백질 변형

본 발명자들은 p-아세틸-L-페닐알라닌의 케토기가 생체외에서 단백질의 부위 특이적 변형을 위한 화학적 핸들로서 작용할 수 있는지 여부를 결정하였다. 정제된 돌연변이 p-아세틸-L-페닐알라닌 Z 도메인 단백질(돌연변이 Z 도메인) 및 야생형 Z 도메인 단백질을 포스페이트 완충액에서 18시간 동안 25℃에서 1 mM 플루오르세인 하이드라자이드(도식 1)로 처리하였다. 반응 후, 단백질을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과다한 플루오르세인 하이드라자이드로부터 분리하고, 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하였다. 젤을 먼저 형광영상화 시스템으로 영상화하고, 이어서 은 염색하였다. 돌연변이 Z 도메인을 위한 밴드는 형광 시그널을 나타내는 반면, 야생형 Z 도메인 밴드로부터는 형광이 검출될 수 없다. 이들 두 단백질의 분취액을 이용하여 490 nm 여기를 갖는 형광 스펙트럼을 측정하였다. p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유한 Z 도메인 단백질만이 플루오르세인과 유사한 형광 스펙트럼을 나타낸다. 야생형 Z 도메인에 대해서는 형광 시그널이 검출되지 않아, 표지화 반응이 하이드라자이드와 케톤 사이에서만 일어났으며 야생형 단백질의 임의의 기존 기능기에서는 일어나지 않았음을 나타낸다. 표지된 생성물을 4중 타임-오브-플라이트 질량 분광법(QTOF MS)를 이용하여 분석하였다. 8425.160 Da(M_Theoretical= 8424.958 Da)의 실험적 모노이소토픽 질량을 얻어, 플루오르세인 하이드라자이드가 1:1의 몰비로 돌연변이 Z 도메인 단백질과 반응하였음을 확인하였다. 표지화 정도를 결정하기 위하여, 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분리하였다. 비표지된 Z 도메인의 피크 영역에 대한 표지된 Z 도메인의 피크 영역의 비는 90 ± 5% 였다.

비오틴 하이드라자이드를 이용한 부위 특이적 단백질 변형

이 접근법의 일반성을 입증하기 위하여, 또한 비오틴 하이드라자이드 유도체를 이용하여 Z 도메인을 표지하였다(구조 C). 정제된 돌연변이 및 야생형 Z 도메인을 25 ℃에서 18시간 동안 포스페이트 완충액에서 1 mM 비오틴 하이드라자이드로 처리하였다. 과량의 비오틴 하이드라자이드를 제거하기 위하여 포스페이트 완충액에 대해 투석한 후, 단백질을 SDS-PAGE 시켰다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 비오틴-특이적인 아비딘-HRP 접합체로 탐침하였다. 예상한 대로, 단지 p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유한 돌연변이 Z 도메인만이 검출되어, 이 도메인이 비오틴 하이드라자이드로 표지되었음을 나타내었다. 야생형 Z 도메인에 대해서는 시그널이 관찰되지 않았다. 표지 효율은 플루오르세인 표지화 실험에서 개시된 대로 HPLC 분석에 의해 결정할 때 80 ± 10%였다. 표지된 단백질은 QTOF MS(M_Experimental = 8416.236, M_Theoretical= 8416.146 Da)에 의해 비오틴 하이드라자이드 한 분자와 돌연변이 Z 도메인 한분자 사이에 형성된 생성물임이 확인되었다. 이들 실험은 단백질의 생체외 변형을 위한 케톤 핸들의 우수한 특이성을 입증한다.

요약하면, 본 발명자들은 신규의 화학적 기능기, 케토기를 생체내에서 단백질 내로 부위 특이적으로 도입시켰다. 이 기능기는 생체외에서 케토기와 하이드라자이드 유도체 사이의 특이적 화학적 반응에 의해 예를 들어, 플루오르세인 및 비오틴으로 선택적으로 그리고 효율적으로 표지될 수 있다. 이 접근법은 증강된 촉매적 또는 치료적 특성을 갖는 단백질을 생성하기 위해 단백질 구조와 기능의 프로브로서, 또는 단백질을 이용하는 생물분석의 개발을 위해, 광범위한 다른 하이드라자이드 또는 히드록실아민 유도체(자당, 스핀 표지, 금속 킬레이터, 가교제, 폴리에테르, 지방산 및 독소를 포함)로 단백질을 선택적으로 표지하는 것이 가능하도록 한다. 독특한 화학적 핸들을 살아있는 세포에서 직접 단백질 내로 부위 특이적으로 도입하는 능력은 단백질 국소화, 단백질 운동 및 분자적 해상도에서 단백질의 형태 변화의 생체내 영상화를 위해 작은 분자 형광발색단으로 단백질을 생체내 변형시키는 것을 가능하게 한다. p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유한 단백질을 이.콜리에서 형광발색단으로 생체내 표지화하는 것이 또한 이 기술에 의해 가능하다.

또한 2003년 10월 15일에 출원된 대리인 참고번호 54A-000170PCT의 "케토 아미노산의 단백질 내로의 부위 특이적 도입"이라는 명칭의 해당 출원을 참고하며, 이것은 참고로 본원에 통합된다.

실시예 2: 메타-티로신 유사체의 생체내 도입

메타-티로신 유사체를 이용하여 mtRNA_CUA ^Tyr을(WO 2002/085923호의 실시예 1에 개시됨) 아미노아실화하기 위해 오르소고날 TyrRS를 생성시켰다.

돌연변이 TyrRS 라이브러리 플라스미드의 제조: 메타-치환된 티로신 유도체에 지시된 돌연변이 엠. 잔나쉬 TyrRS를 코딩하는 플라스미드 라이브러리를 일반적으로 WO 2002/085923호의 실시예 1에 개시된 방법에 따라 구성하였다. 요약하면, 바실러스 스테아로설모필러스 TyrRS의 결정 구조내의 결합된 티로신의 아릴 고리의 메타-위치의 6.9 Å내에 있는 엠. 잔나쉬 TyrRS의 활성 부위내의 여섯 잔기(Tyr³², Ala⁶⁷, His⁷⁰, Gln¹⁵⁵, Asp¹⁵⁸, Ala¹⁶⁷)를 상기 실시예 1에서 개시된 대로 NNK 코돈 도식을 이용하여 DNA 수준에서 모든 20개 아미노산으로 돌연변이시켰다. 구성된 플라스미드 라이브러리 pBK-lib는 약 1 x 10⁹ 독립적 클론을 함유하였다.

m-아세틸 페닐알라닌의 도입을 위한 오르소고날 tRNA-신세타제 쌍의 개발: 3번의 양성 선별 및 2번의 음성 선별 후, 클로람페니콜에서의 그 생존이 비천연 아미노산의 첨가에 의존하는 다섯 개의 후보 클론(WO 2002/085923호의 서열 번호 17∼21 및 WO 2002/085923호의 서열 번호 49∼53)이 나타났다. m-아세틸 페닐알라닌의 부재하에서, 세 개의 돌연변이 TyrRS 플라스미드 중 하나를 보유한 세포를 위한 클로람페니콜 내성의 IC₅₀은 20 ㎍/ml 이다. m-아세틸 페닐알라닌의 존재하에서, 동일한 세포를 위한 클로람페니콜에 대한 내성의 IC₅₀은 100 ㎍/ml 이다. 이들 두 숫자 사이의 큰 차이는 선택된 신세타제가 세포내의 천연 아미노산에 비해 m-아세틸 페닐알라닌의 도입을 특정하는 능력을 반영한다. m-메톡시 페닐알라닌을 위한 데이터는 유사하였으며; 다섯 개의 클론이 분리되었다(WO 2002/085923호의 서열 번호 22∼26 및 WO 2002/085923호의 서열 번호 54∼58).

비천연 아미노산 도입된 DHFR의 단백질 발현: 상기에서 선별된 m-메톡시 페닐알라닌 및 m-아세틸 페닐알라닌 신세타제를 이용하여, 이전에 WO 2002/085923호의 실시예 1에 개시된 대로 앰버 코돈에 대한 반응으로 관련 비천연 아미노산을 DHFR에 도입시켰다. 음성 대조군으로서, tRNA-신세타제의 오르소고날쌍 및 DHFR을 코딩하는 앰버-돌연변이 벡터 둘 다를 함유한 세포를 비천연 아미노산의 부재하에 성장시켰다. 단백질 발현의 결과는 WO2002/085923호의 도 10에 나타난다. 이들 결과는 tRNA-신세타제의 오르소고날쌍이 비천연 m-메톡시 페닐알라닌 및 m-아세틸 페닐알라닌을 도입하는 특이성을 명확하게 입증하였다. 발현된 DHFR 단백질의 수율은 두 경우 모두에서 약 0.5 mg/L 배양물이다.

한 구체예에서, 화합물(예, 하이드라자이드 유도체)을 이용하여 적어도 하나의 비천연 아미노산, 예, 메타-티로신 유사체로 단백질을 생체내 표지화시킬 수 있다.

실시예 3: 당단백질 모방체의 합성

독특한 반응성을 갖는 비단백질성 기능기의 이용가능성은 단백질의 선택적인 화학적 변형을 크게 촉진시킨다. 케토기가 그러한 화학적 핸들이며, 이것은 천연 아미노산의 측쇄에는 없으며, 일반적인 아미노산의 존재하에 온화한 조건 하에 하이드라자이드 및 히드록실아민 유도체와 쉽게 그리고 선택적으로 반응한다. 예, Cornish, V. W, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 및 그안에 인용된 참고문헌을 참고한다. 케토기는 고체상 펩티드 합성에 의해 펩티드에 포함되었으며, 친핵성 당 유도체와 결합되어 네오글리코펩티드를 구성하였다. 예를 들어, Rodriguez, E. C., et al., (1998) J. Org. Chem. 63: 7134-7135를 참고한다. 본 발명자들은 최근에는 살아있는 세포에서 비천연 아미노산을 직접 단백질 내로 부위특이적으로 도입하기 위한 일반적인 방법을 개발하였다(예, WO2002/085923호; 및 2003년 10월 15일에 출원된 대리인 참고번호 54A-000170PCT의 "케토 아미노산의 단백질 내로의 부위 특이적 도입"이라는 명칭의 해당 출원을 참고하며, 이것은 참고로 본원에 통합된다). 또한, 예를 들어, Wang, L., et al., (2001) Science 292: 498-500를 참고한다. 케토 함유 아미노산, p-아세틸-L-페닐알라닌은 99.8%를 넘는 번역 확실성으로 앰버 넌센서 코돈에 대한 반응으로 성공적으로 도입되었다. 예를 들어, Wang, L., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100: 56-61를 참고한다. 이 실시예는 아미노옥시 당 유도체와 함께 유전적으로 코딩된 케토 기능기를 이용하여 균질한 당단백질 모방체를 제조하는 것을 개시한다.

두 가지 경로를 이용하여 당단백질 모방체를 생성하였다(도 1 참고). 첫 번째 접근에서는, 아미노옥시기로 유도체화된 하나의 당을 먼저 케토기에 결합시키고, 추가의 당을 글리코실트랜스퍼라제를 이용하여 효소적으로 부착시킨다. 보다 수렴성의 제2의 경로에서는, 한정된 구조를 갖는 글리칸을 아미노옥시 유도체로서 제조하고, 한 단계로 직접 단백질에 연결시킨다. 스타필로코커스 단백질 A의 Z 도메인을 모델 단백질로 이용하였으며(예, Nilsson, B., et al., (1987). Protein Eng. 1: 107-113 참고) 이는 그것의 상대적으로 작은 크기(분자량 7.9 kD)가 매우 높은 정확성으로 질량 분광법에 의한 특성 규명을 촉진하기 때문이다.

상응하는 유전자의 7번째 코돈을 앰버 정지 코돈 TAG로 돌연변이시키고 His6 태그를 C-말단에 첨가하여 단백질 정제를 촉진하였다. P-아세틸-L-페닐알라닌을 앰버 위치에서 도입하여 이전에 보고된 프로토콜에 따라 돌연변이 Z 도메인 단백질을 생성시켰다. 예를 들어, Wang, L., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100: 56-61를 참고한다. 니켈 친화성 크로마토그래피 후 약 3.6 mg/L 단백질을 얻었다. 도 1의 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 1의 베타-연결된 아미노옥시 유사체를 이어서 공지의 과정을 따라 합성하였다. 예를 들어, Cao, S., et al., (1995) Tetrahedron 51: 6679-6686를 참고한다. 돌연변이 Z 도메인 단백질(10 mg/ml) 및 아미노옥시 당 1(21 mM)을 수성 100 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)에서 혼합하고 37℃에서 7∼26시간 동안 항온처리하였다. 반응 혼합물을 280 nm에서의 흡광도를 모니터함으로써 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석하였다(도 2 참고). 단지 두 개의 주요 피크가 관찰되었으며, 상응하는 용출물은 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-푸리에르 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분광법(MALDI-FTICR MS)에 의해 특성을 밝혔다(도 3 참고). 얻어진 모노이소토픽 질량은 하나의 피크(t_R = 44.8 분)가 미반응 돌연변이 Z 도메인에 해당하며(M_theoretical = 7818.833 Da, M_experimental = 7818.836 Da), 다른 피크 (t_R = 43.2 분)가 아미노옥시 당 1로 유도체화된 돌연변이 Z 도메인에 해당함(M_theoretical = 8036.924 Da, M_experimental = 8036.914 Da)을 나타낸다. 이.콜리에서 발현될 때, Z 도메인 단백질은 세 가지 형태를 갖는다: 본래의 단백질, 첫 번째 메티오닌이 없는 단백질 및 메티오닌이 없는 단백질의 아세틸화된 형태. 본래의 단백질은 역상 HPLC를 이용하여 다른 두 형태로부터 분리될 수 있다. 질량 분광법 분석을 간단히 하기 위하여, 첫 번째 메티오닌이 없는 Z 도메인 및 그것의 아세틸화 형태를 함유한 정제된 분획을 이 실시예에서 이용하였다. 모든 질량 스펙트럼에서 이들 두 형태에 해당하는 두가지 분자 피크가 관찰될 수 있으며, 도 2에서 III 및 IV로 스펙트럼에서 표지된다. 구조를 위해서는 도 1을 참고한다. 대조군으로서, 티로신이 Z 도메인의 7번째 위치에서 도입될 때, 당 유도체화된 단백질이 관찰되지 않는다. 이 사실은 당 변형된 Z 도메인에 대해 관찰된 고정확성의 질량(오차가 1.2 ppm 미만)과 함께, 아미노옥시 당 1이 선택적으로 케토기에 부착됨을 확인하였다. 커플링 효율은 시간에 따라 증가하며(출발 물질 및 생성물에 해당하는 HPLC 피크의 영역으로부터 결정됨); 출발 물질의 생성물로의 전환은 7시간 후 42%였고 26시간 후 95%를 넘었다(도 2 참고).

이어서 두 번째 당이 첫 번째 당에 효소적으로 결합될 수 있는지를 결정하였다. 정제된 부가물 II(5 mg/ml)(구조를 위해서는 도 1 참고)을 UDP-갈락토스(UDP-Gal)(16 mM) 및 150 mM HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산) 완충액(pH 7.4)중의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(0.4 유닛/ml)와 함께 48시간 동안 주위 온도에서 항온처리하였다. 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 자당 뉴클레오티드로부터의 갈락토스를 GlcNAc 부분의 4 위치로 옮겨 Galβ1,4GlcNAc를 형성하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, Schanbacher, F. L., and Ebner, K. E. (1970) J. Biol. Chem. 245: 5057-5061를 참고한다. HPLC에 의한 분리 후, 새로운 피크가 확인되었다(t_R = 42.5 분). MALDI-FTICR MS에 의해 측정된 용출액의 모노이소토픽 질량(M_theoretical = 8198.977, M_experimental = 8198.969)은 갈락토스가 GlcNAc에 연결되어 부가물 III을 생성함을 확인하였다(도 3 참고). 구조를 위해서는 도 1을 참고한다. HPLC에 의해 결정된 커플링 효율은 약 60%였으며, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제에 대해 이전에 보고된 것에 가까운 값이다. 예를 들어, Witte, K., et al., (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 2114-2118를 참고한다. 이 결과는 첫 번째 당과 단백질 사이의 비천연 결합이 글리코실트랜스퍼라제 반응에 크게 영향을 주지 않음을 나타낸다. 이 이당 표지된 단백질을 CMP-시알산 및 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제와 추가 반응시킨 결과(Kitagawa, H., and Paulson, J. C. (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394- 1401 참고) 시알산이 갈락토스에 첨가되어 IV(t_R = 41.7 분)를 생성하였으며, 이것은 MALDI-FTICR MS에 의해 확인되었다(M_theoretical = 8490.072, M_experimental = 8490.014)(도 3 참고). III의 IV로의 전환을 위한 커플링 효율은 HPLC 분석에 기초할 때 65%였다. 구조를 위해서는 도 1을 참고한다.

당단백질 모방체 III 및 IV를 또한 수렴적 경로를 이용하여 제조하였다. 도 1을 참고한다. 150 mM HEPES 완충액(pH 7.4)에서 70%의 전체 수율로 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(0.75 유닛/ml)와 글리코실 공여자 UDP-갈락토스를 이용하여 아미노옥시 GlcNAc(0.05 M)을 2로 전환시켰다. 아미노프로필 실리카겔 HPLC에 의해 정제한 후, 시알산을 2(0.03 M)에 첨가하여 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제(0.22 유닛/ml) 및 CMP-시알산(0.03 M)을 이용하여 약 80% 수율로 전술한 동일한 완충액에서 3을 얻었다. 정제된 아미노옥시 유사체 2와 3(각각 13 및 7.2 mM)을 주위 온도에서 100 mM 수성 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)중의 p-아세틸-L-페닐알라닌을 함유한 Z 도메인 단백질(5 mg/ml)에 결합시켜 각각 당단백질 모방체 III 및 IV를 얻었다. 도 1을 참고한다. 얻어진 III과 IV는 HPLC와 MALDI-FTICR MS 분석에 의해 확인할 때, 첫 번째 순차적 경로에 의해 제조된 상응하는 부가물과 동일하였다. 26시간 동안 동일한 반응 조건 하에 2의 I에의 그리고 3의 I에의 커플링 효율은 각각 약 76%와 60%였다. 수율은 글리칸이 더욱 복잡해짐에 따라 증가하는 입체 효과로 인해 1의 I에 대한 결합 수율(95%)보다 낮았다.

요약하면, 잘 한정된 당 치환체를 함유한 균질한 당단백질 모방체의 합성을 위한 일반적인 방법을 입증하였다.

실험 재료와 방법:

일반적: UDP-Gal, CMP-NeuAc, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(β-1,4-GalT) 및 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제(α-2,3-SialT)를 칼바이오켐으로부터 구입하였다. 달리 표시되지 않으면, 모든 화합물은 알드리치, 아크로스 또는 시그마로부터 구입하였으며, 추가 정제없이 사용되었다. 전개 시약으로서 닌히드린 또는 세륨 몰리브데이트 염색을 이용하여 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 반응을 모니터하였다. 모든 비수성 반응은 불활성 아르곤 대기하에 오븐 건조된 유리용기에서 실시되었다. 모든 비수성 용매는 사용전에 증류시켰다. NMR 스펙트럼은 Bruker AMX- 400, AMX-500 또는 AMX-600 MHz 분광계로 기록하였으며 잔여 용매 피크에 참고되었다(CDCl₃: ¹H δ 7.24, ¹³C δ 77.0 ; CD₃0D: ¹H δ 3.30, ¹³C δ 49.0 ; D₂0 ; ¹H δ 4.76).

도 1의 화합물 2: 도 1의 화합물 1(5 mg, 0.021 mmol) 및 UDP-Gal(21 mg, 0.032 mmol)을 새로 제조된 MnCl₂ 용액(2 mmol)을 함유한 350 ㎕ HEPES 완충액(150 mM, pH 7.4)에 용해시켰다. β-1,4-GalT(0.3 U, 0.1 U/㎕)와 알카라인 포스파타제(0.5 U, 1 U/㎕)를 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 2일동안 부드럽게 흔들었다. 상기 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액을 1 ml/min의 유속으로 90분에 걸쳐 100:0 A:B∼50:50 A:B의 구배 용출을 이용하는 아미노프로필 실리카겔 HPLC에 의해 정제하였으며, 이 때 A=MeCN이고 B=H₂O이다. 원하는 생성물의 보유 시간은 53분이었다. 컬럼 분획의 동결건조에 의해 도 1의 순수한 화합물 2를 백색 분말로서 얻었다(6 mg, 70%);

C₁₄H₂₆N₂0₁₁[M+Na]⁺ 를 위한 계산치 = 421.1429, 실측치 421.1448.

도 1의 화합물 3: 도 1의 화합물 2(5.3 mg, 0.013 mmol)와 CMP-NeuAc(10 mg, 0.016 mmol)을 새로 제조된 MnCl₂ 용액(5 mmol)을 함유한 450 ㎕ HEPES 완충액(150 mM, pH 7.4)에 용해시켰다. α-2,3-SialT(22 mU, 3.7 mU/㎕)와 알카라인 포스파타제(50 mU, 50 mU/㎕)를 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 2일동안 부드럽게 흔들었다. 상기 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액을 1 ml/min의 유속으로 30분에 걸쳐 100:0 A:B∼0:100 A:B의 구배 용출을 이용하는 아미노프로필 실리카겔 HPLC에 의해 정제하였으며, 이 때 A=MeCN이고 B=H₂O이다. 해당 분획(27분)을 수집하고 동결건조하여 백색 분말(7 mg, 76%)을 얻었다.

C₂₅H₄₃N₃O₁₉[M-H]^-를 위한 계산치 = 688, 실측치 688.

아미노옥시 당 유도체를 돌연변이 Z 도메인 단백질에 결합시키기 위한 일반적인 과정: 일반적인 반응에서, 아미노옥시 당 유도체(500 ㎍) 및 ~ 1 mg의 돌연변이 Z 도메인 단백질을 100 mM NaOAc 완충액, pH 5.5에 용해시켰다. 물을 100 ㎕의 총 부피가 되도록 첨가하고 반응 혼합물을 26시간 동안 37℃에서 흔들었다. 상기 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액을 1 ml/min의 유속으로 70분에 걸쳐 90:10 A:B∼60:40 A:B의 구배 용출을 이용하는 Agilent ZORBAX SB-C18 4.6 mm x 250 mm 컬럼에서의 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이 때 A는 0.1% TFA를 가진 H₂O이고 B는 0.1% TFA를 가진 MeCN이다. 컬럼 분획을 TrisCl 완충액(pH 7.0)으로 중화시키고 크기 배제 컬럼으로 탈염시켰다. 물로 용출시킨 후, 용출액을 동결건조하여 각각 96%, 76% 및 60% 수율로 순수한 도 1의 II, III 및 IV를 백색 분말로 얻었다.

순차적 경로를 이용하는 (도 1의) 당단백질 모방체 III 및 IV의 제조: 도 1의 III의 제조를 위하여, 도 1의 II(~ 0.5 mg) 및 UDP-Gal(1 mg)을 새로 제조된 MnCl₂ 용액(0.5 mmol)을 함유한 150 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 90 ㎕ 에 용해시켰다. β-1,4-GalT(40 mU, 40 mU/㎕)와 알카라인 포스파타제(50 mU, 50 mU/㎕)를 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 2일동안 부드럽게 흔들었다. 상기 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 도 1의 IV의 제조를 위하여, 도 1의 III(~ 0.5 mg) 및 CMP-NeuAc(0.5 mg)을 새로 제조된 MnCl₂ 용액(0.5 mmol)을 함유한 150 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 90 ㎕ 에 용해시켰다. α-2,3-SialT(10 mU, 3.7 mU/㎕)와 알카라인 포스파타제(50 mU, 50 mU/㎕)를 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 2일동안 부드럽게 흔들었다. 상기 반응 혼합물을 원심분리하고 상등액을 역상 HPLC에 의해 정제하였다.

MALDI-FTICR MS: APEX II 콘솔 및 브루커 달토닉스(Billerica, MA)로부터의 9.4 T 마그넷을 가진 집에서 만든 기구를 MALDI-FTICR MS 실험에 이용하였다. 자당 부분은 TFA에 관련되는 정상 MALDI 샘플 제조를 이용하면 떨어지는 경향이 있다. 본 발명자들은 덜 민감하지만 더 차가운 매트릭스를 이용하였다. 매트릭스는 3-하이드록시피콜린산(20 mg/ml) 및 디암모늄 시트레이트(1 mg/ml)의 혼합물이다. 당단백질의 분해는 공급원에서 충돌성 냉각을 제공하여 준안정 단편화를 감소시키는 FTICR의 특별한 중간압 MALDI 공급원에 의해 추가로 최소화되었다.

실시예 4: 당단백질의 합성을 위한 다른 전략

본 발명의 한 구체예에서, 당화된 아미노산의 동시번역성 도입에 의해 유기체, 예,이.콜리에서 균질한 당단백질을 합성하기 위한 다른 전략이 개발되었다. 예를 들어, 한정된 위치에서 β-GlcNAc-세린을 함유하는 미오글로빈은 우수한 수율과 높은 확실성으로 이.콜리에서 발현될 수 있다. β-GlcNAc 부분은 탄수화물 결합 단백질에 의해 인식되거나 또는 후속하여 갈락토실트랜스퍼라제에 의해 변형될 수 있다. 이 접근법은 다른 번역후 변형, 예, 단백질 인산화, 아세틸화, 메틸화 등에 적용할 수 있다.

당화는 진핵생물에서 단백질의 가장 일반적인 번역후 변형중의 하나이며 접힘 및 분비에서부터 생물분자 인식 및 혈청 반감기까지 광범위한 단백질 기능에 영향을 준다. 예를 들어, R. A. Dwek, (1996) Chem. Rev. 96: 683를 참고한다. 당화의 효과에 대한 이해에 있어서 상당한 진전이 있었지만, 올리고당 쇄의 구체적인 역할 및 그들의 구조와 기능 사이의 관계는 이제 이해되기 시작하고 있다. 예를 들어, C. R. Bertozzi, & L. L. Kiessling, (2001) Science 291: 2357를 참고한다. 주요 난제는 당단백질이 일반적으로 당형태의 혼합물로 생산되어 천연 공급원으로부터 특정 당형태의 분리를 어렵게 하는 것이다. 구조적으로 한정된 당형태를 합성하기 위해 다양한 방법이 개발되었으나, 모두 생산되는 당단백질의 크기, 양 및/또는 질에 대해 심각한 제한을 가한다. 예를 들어, P. Sears, & C. H. Wong, (2001) Science 291: 2344 ; M. Wacker etal., (2002) Science 298: 1790 ; B. G. Davis, (2002) Chem. Rev. 102: 579; and, H. C. Hang, & C. R. Bertozzi, (2001) Acc. Chem. Res. 34: 727을 참고한다. 이 실시예에서, 이.콜리에서 독특한 당형태를 생산하기 위해 이용된 전략과 성분이 개시되며, 이것은 셀렉터 코돈, 예, 앰버 코돈, TAG에 대한 반응으로 당화된 아미노산을 유전적으로 코딩하는 오르소고날 신세타제-tRNA 쌍을 개발하는 것을 포함한다. 이것 및 다른 당-변형된 아미노산을 단백질 내로 직접 유전적으로 도입하는 것은 당단백질 구조와 기능을 분석하고 조작하는 능력을 크게 개선시킬 수 있다.

신규한 화학적 및 물리적 특성을 갖는 아미노산을 이.콜리(예, L. Wang, et al., (2001) Science 292: 498 ; L. Wang, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 1836; Z. Zhang, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41: 2840; J. W. Chin etal., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 9026; J. W. Chin etal., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99: 11020; S. W. Santoro, et al., (2002) Nat. Biotechnol. 20: 1044; L. Wang, et al., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100: 56; 및, Z. Zhang etal., (2003) Biochemistry 42: 6735 참고) 및 효모 (예, J. W. Chin etal., Science, (2003 출판) 참고) 의 유전적 코드에 체계적으로 첨가하는 것을 처음으로 허용한 방법이 이전에 개발되었다. 이 접근법에서는, 내인성 tRNA 및 신세타제와 교차반응하지 않는 앰버 억제자 엠.잔나쉬 TyrRS-mu tRNA_CUA ^Tyr 쌍이 개발되어 원하는 비천연 아미노산을 독특하게 충전시킨다. 이 방법은 또한 당화된, 인산화된, 또는 메틸화된 아미노산을 단백질 내로 직접 도입시킬 수 있도록 하여(예, T. Arslan, et al., (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 10877 참고) 단백질의 선택적인 효소적 또는 화학적 번역후 변형의 필요를 없앤다. B-O-GlcNAc-L-세린(화합물 A, GlcNAc: N-아세틸글루코스아민)을 이.콜리에서 단백질 내로 부위 특이적으로 도입하기 위해 시도하였다. O-GlcNAc 변형은 거의 모든 진핵 생물에서 일어나며, 세포 시그날링, 단백질 트래피킹 및 세포 성장의 조절에 관여하며, 또한 더욱 복잡한 탄수화물이 생성되는 기질이다. 예를 들어, L. Wells, et al., (2001) Science 291: 2376; 및, N.Lamarre-Vincent, & L. Hsieh-Wilson, (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 6612를 참고한다. 불행히도, 유리 하이드록실기를 가진 당 유도체는 진핵 세포의 막을 가로질러 잘 전달되지 않아, 기질 화합물 A는 세포-투과성이기 힘들 것임을 제안한다. 예를 들어, A. K. Sarkar, et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92: 3323을 참고한다. 하지만, 자당의 히드록실기의 아세틸화가 세포 막을 가로지르는 수송을 촉진하며 히드록실 아세틸기가 일단 세포내에서는 비특이적인 세포질 에스테라제에 의해 탈아세틸화될 수 있음이 나타났다. 예를 들어, N. Lamarre-Vincent, & L. Hsieh-Wilson, (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 6612를 참고한다. 따라서, 시판 전구체가 N-Fmoc-트리-아세틸-β-GlcNAc-세린인 아세틸화된 유도체 트리-아세틸-β-GlcNAc-세린 화합물 B를 이 실험에서 이용하였다. 화합물:

양성 및 음성 선별 시리즈를 이용하여 활성 부위 돌연변이의 라이브러리로부터, 이.콜리에서 β-GlcNAc-세린으로 오르소고날 mu tRNA_CUA ^Tyr를 특이적으로 충전하는 TyrRS를 분리하였다. 상동성 바실러스 스테아로서모필러스 TyrRS의 X-선 구조에 기초하여, 임의화된 활성 부위 잔기를 갖는 두 라이브러리를 구성하였다: 플라스미드 pBK-lib-m에 의해 코딩되는 하나는 임의화된 잔기 Tyr³², Ala⁶⁷, His⁷⁰, Gln¹⁵⁵, Asp^{158 및} Ala ¹⁶⁷ 을 가졌으며, 플라스미드 pBK-lib에 의해 코딩화되는 두 번째는 임의화된 잔기 Tyr³², Glu¹⁰⁷, Asp¹⁵⁸, Ile^{159 및} Leu¹⁶²를 가졌다. 이들 잔기는 모두 페닐 고리의 6.9 Å이내이며 기질 결합 포켓을 형성하는 주요 잔기이다. 합쳐진 라이브러리는 약 2.6 x 10⁹의 독립적인 클론을 갖는다. 이어서 이 라이브러리를 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자의 Asp112에 도입된 앰버 코돈의 억제에 기초하여 양성 선별하여, 당화된 아미노산을 도입할 수 있는 TyrRS 돌연변이를 선별하였다. 고농도의 클로람페니콜에서 생존하는 세포는 Asp112TAG 앰버 코돈에 대한 반응으로 β-GlcNAc-세린 또는 내인성 아미노산을 삽입시키는 능력을 가진 돌연변이 TyrRS를 발현해야 한다. 독성 바나제 유전자에서 세 개의 앰버 코돈의 억제에 기초한 음성 선별을 이어서 이용하여 상기의 선별된 클론들로부터, 내인성 아미노산을 도입하는 돌연변이 TyrRS를 제거하였다. 다섯 번의 양성 선별과 네 번의 음성 선별 후, 고농도의 클로람페니콜에서 생존하는 세 개의 클론이 나타났다. 이들 클론과 그들의 돌연변이는 다음과 같다:

모든 이들 클론은 β-GlcNAc-세린에 대해 매우 선택적인 것으로 나타나며, 이는 화합물 B를 1 mM의 세린, α-트리-아세틸-GalNAc-트레오닌, α/β-트리-아세틸- GalNAc-세린 또는 β-테트라-아세틸-Glu-아스파라긴으로 치환시킬 경우 30 ㎍/ml을 초과하는 클로람페니콜에서 세포 성장을 허용하지 않기 때문이다. 이들 생체내 유전적 결과는 새로 선택된 돌연변이 TyrRS가 β-GlcNAc-L-세린에 대해 우수한 특이성을 가짐을 제안한다.

화합물 B의 도입의 효율과 확실성을 시험하기 위하여, 4번째 위치에서의 앰버 코돈 및 C 말단 His6 태그를 함유한 돌연변이 미오글로빈 유전자(Gly4TAG)를 생성시켰다. 예를 들어, S. W. Santoro et al., (2002) Nat. Biotechnol. 20: 1044를 참고한다. 돌연변이 신세타제, S1-90이 최소 배지에서 화합물 B의 존재하에 및 Gly4TAG 미오글로빈 유전자와 동시발현되었을 때, 1 mg/l의 전길이 돌연변이 미오글로빈이 생성되었다(도 4 참고). 비교를 위하여, 5.5 mg/l의 야생형 미오글로빈이 유사한 조건 하에 생산되어, S1-90의 우수한 억제 수준을 나타낸다. S1-90,, 또는 화합물 B의 부재하에서는, 은염색된 SDS-PAGE에 의해 전길이 미오글로빈의 발현이 관찰되지 않았다(도 4 참고).

도 4는 Gly4→화합물 A 돌연변이 미오글로빈(~18.5 kD)의 발현을 예시한다. 단백질을 Ni²⁺-친화성 크로마토그래피에 의해 정제하여 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 젤을 은 염색하였다. 레인 1은 미오글로빈이 오르소고날 tRNA, 신세타제 S1-90 및 화합물 B의 존재하에 발현되었음을 보여준다. ~ 18 kDa의 밴드는 전길이 미오글로빈에 해당한다. 레인 2는 오르소고날 tRNA와 신세타제 S1-90의 존재 및 기질 화합물 B의 부재하에서의 발현 후 용출된 단백질을 보여준다. 레인 3은 오르소고날 tRNA와 기질 화합물 B의 존재 및 신세타제 S1-90의 부재하에서의 발현 후 용출된 단백질을 보여준다. 레인 4는 신세타제 S1-90 및 기질 화합물 B의 존재 및 오르소고날 tRNA의 부재하에서의 발현 후 용출된 단백질을 보여준다. 레인 5는 비교를 위한 정제된 야생형 미오글로빈을 함유한다.

고 해상도 MALDI-TOF 분석에 의해 18430.1 Da의 His6 태그-정제된 돌연변이 미오글로빈의 모노이소토픽 질량을 얻었으며, 이는 메티오닌없이 Glc(OH)₃Nac-세린을 함유한 미오글로빈의 이론적 질량(M_theoretical = 18429.5 Da)과 32 ppm내에서 일치한다. 도 5를 참고한다. N 말단 메티오닌의 손실은 이.콜리에서 일반적이다. 또한, O-아세틸화된 글리코미오글로빈 또는 야생형 미오글로빈에 해당하는 시그널이 관찰되지 않았다. 질량 스펙트럼 데이터는 GlcNAc-세린의 미오글로빈내로의 도입에 대한 높은 특이성을 확인한다(96% 이상).

몇 가지 추가적인 실험을 실시하여 돌연변이 미오글로빈의 특성을 추가로 규명하였다. 먼저, ELISA-유사 분석을 이용하여 GlcNAc-특이적 렉틴, 반데이래 심플리시포리아 II(BSII)(예, S.Ebisu, et al.,(1978), Carbohydr.Res.61 ;129 참고)의 야생형 미오글로빈 및 글리코-미오글로빈에 대한 결합을 분석하였다. 도 6, 패널 A를 참고한다. 도 6, 패널 A는 GlcNAc-특이적 렉틴, 반데이래 심플리시포리아 II(BSII)가 야생형 미오글로빈과 글리코미오글로빈에 결합함을 보여준다. A₄₀₅ 값이 야생형 미오글로빈, 글리코미오글로빈 및 음성 대조군(렉틴 첨가 없음)에 대해 나타난다. Gly4→화합물 A 돌연변이 미오글로빈(200 ng)과 야생형 미오글로빈(200 ng)을 미세적정 플레이트 웰에 고정시키고, 이어서 비오틴화된 BSII 및 스트렙타비딘-알카라인 포스파타제 접합체와 항온처리하였다. 웰을 p-니트로페닐 포스페이트와 항온처리하고 405nm에서의 흡광도를 측정하여 모니터하였다. 상기 두 가지 형태의 미오글로빈을 미세적정 플레이트 웰에 고정시키고, 이어서 비오틴화된 BSII, 스트렙타비딘-알카라인 포스파타제 접합체 및 p-니트로페닐 포스페이트로 각각 항온처리하였다. 야생형 미오글로빈을 함유한 웰은 음성 대조군 웰에 해당하는 시그널을 나타냈다. 대조적으로, 글리코미오글로빈을 함유한 웰은 야생형 미오글로빈보다 적어도 200배 더 높은 시그널을 생산하여, GlcNAc-특이적 렉틴에 의한 선택적인 인식을 입증하였다. 또한, 이 결과는 이 렉틴이 GlcNAc에 대해 매우 선택적이어서 탄수화물이 GalNAc 및 ManNAc과 같은 다른 이성체 형태로 변형되지 않았음을 나타낸다(예, S.Ebisu et al., (1978), Carbohydr.Res.61:129 참고)

또한 미오글로빈내의 O-GlcNAc-세린 잔기가 갈락토실트랜스퍼라제에 의해 선택적으로 변형될 수 있는 지 여부를 조사하였다. 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 갈락토스(Gal)를 자당 뉴클레오티드 UDP-Gal로부터 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc)의 4 위치로 옮겨 Galβ1,4GlcNAc를 형성하는 것으로 알려져 있다. O-당화된 미오글로빈이 UDP-Gal로 변형될 수 있는 지를 결정하기 위하여, 야생형 및 O-당화된 미오글로빈 둘 다를 SDS-PAGE에 의해 분리하고 PVD 막으로 옮겼다. 이어서 막을 소의 우유 갈락토실트랜스퍼라제 및 방사성 UDP-[H³]-갈락토스와 함께 실온에서 24시간 동안 항온처리하였다. 예를 들어, K. Kamemura, et al., (2002), J. Biol. Chem. 277: 19229를 참고한다. [H³]-Gal의 도입은 막을 X-선 필름에 노출시켜 모니터하였다. 글리코미오글로빈만이 표지되었으며, 야생형 미오글로빈에 대해서는 검출가능한 시그널이 관찰되지 않았다. 도 6, 패널 B를 참고한다. 도 6, 패널 B는 온-블롯 갈락토실트랜스퍼라제가 글리코미오글로빈을 UDP-[H³]갈락토스로 표지함을 보여준다. 야생형 미오글로빈(1 ㎍)과 Gly4→화합물 A 돌연변이 미오글로빈(1 ㎍)을 12% SDS-PAGE에 의해 분리하고 PVD 막으로 옮겼다. 이어서 막을 소 우유 갈락토실트랜스퍼라제(1 U), UDP-[H³]갈락토스(0.5 μCi) 및 소 장 알카라인 포스파타제(1 U)로 실온에서 24시간 동안 처리하였다. 완전히 세척 한 후, 막을 증가된 오토라디오그래피를 이용하여 X-선 필름에 노출시켯다.

정량 분석을 위하여, 글리코실트랜스퍼라제 반응을 또한 용액에서 실시하였다. 예를 들어, K. Witte, et al., (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 2114를 참고한다. 실온에서 48시간 동안 항온처리한 후, 존재하는 방사성표지에 기초하여 이당류의 72% 수율이 얻어졌다. 도 6, 패널 C를 참고한다. 도 6, 패널 C는 용액에서 실시된 갈락토실트랜스퍼라제 반응의 정량 분석을 예시하며, 방사성표지된 갈락토스를 정상화하여 1.0이 100% 이동에 해당하도록 하였다. HPLC-정제된 야생형 미오글로빈(100 ㎍) 및 Gly4→화합물 A 돌연변이 미오글로빈(100 ㎍)을 함유한 용액에, 피루베이트 키나제(5 U), UDP-글루코스 피로포스포릴라제(1 U), 무기 피로포스포릴라제(10 U), 갈락토스-1-포스페이트-우리딜 트랜스퍼라제(1 U), 소 우유 갈락토실트랜스퍼라제(2 U), 글루코스-1-포스페이트(3 μmol), 우리딜 디포스페이트(3 μmol), 포스포에놀피루베이트(0.01 mmol) 및 DTT(2 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 pH 7.2로 조절한 후, [H³]갈락토스-1-포스페이트(0.01 mmol)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 48시간 동안 실시하였다. 단백질 생성물을 PD-10 세파덱스 25 컬럼으로 분리하였다. 도입된 방사성표지를 액체 신틸레이션 분석기에서 측정하였다.

이들 연구는 β-GlcNAc-L-세린이 우수한 특이성과 우수한 수율로 이.콜리내의 단백질 내로 번역과 동시에 도입될 수 있음을 증명한다. 도입된 β-GlcNAc-세린이 글리코실트랜스퍼라제에 의해 당이 순차적으로 첨가될 수 있는 주요 당화 부위로 작용할 수 있다. 예를 들어, K. Kamemura, et al., (2002), J. Biol. Chem. 277: 19229를 참고한다.

재료 및 방법

돌연변이 TyrRS 효소의 지시된 개발: 양성 및 음성 선별의 일반적인 과정은 이전에 보고되었다. 예를 들어, Z. Zhang et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735를 참고한다. 요약하면, 플라스미드 pBK-lib-m(예, Z. Zhang etal., (2003) Biochemistry 42: 6735 참고) 및 pBK-lib (예, L. Wang, et al., (2001) Science 292: 498 참고)의 조합을 플라스미드 pRep (2)/YC (예, S. W. Santoro, et al., (2002) Nat. Biotechnol. 20: 1044 참고)를 함유한 컴피턴트 이.콜라이 DH10B내로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 40 ㎍/ml 테트라사이클린, 50 ㎍/ml 카나마이신, 68 ㎍/ml 클로람페니콜 및 1 mM 화합물 B를 함유한 GMML 배지(1% 글리세롤, 0.3 mM 루이신, 1 mM MgCl₂, 0.1 mM CaCl₂ 및 0.5% NaCl을 가진 1 x M9 최소 배지) 500 ml에서 37℃에서 60시간 동안 성장시켰다. 플라스미드(pBK)를 생존 세포로부터 정제하고 pLWJ17B3(예, L. Wang, et al., (2001) Science 292: 498)을 보유한 이.콜라이 DH10B내로 형질전환시켜 음성 선별을 시작하였다. 이어서 세포를 40 ㎍/ml 클로람페니콜, 50 ㎍/ml 카나마이신 및 0.02% L-아라비노스를 함유한 LB 플레이트에 도말하고 37℃에서 8시간 동안 항온처리하였다. 플라스미드 pBK를 생존 세포로부터 정제하고 후속 양성 및 음성 선별을 위해 이용하였다. 5회의 양성 선별 및 4회의 음성 선별 후, 기질-의존성 클로람페니콜 내성을 부여한 오르소고날 tRNA-신세타제의 후보 세 쌍을 분리하고 서열 결정하였다.

돌연변이 미오글로빈의 발현 및 특성 규명: pBAD/JYAMB-4TAG (예를 들어, S. W. Santoro, et al., (2002) Nat. Biotechnol.20: 1044 참고)와 pS1-90을 함유한 DH10B 세포를 카나마이신, 테트라사이클린, 0.02% L-아라비노스, 5 μM FeCl_{3 및} 0 또는 1 mM의 화합물 B를 함유한 500 ml GMML 배양물에서 성장시켰다. 세포를 침전시키고, 용해시키고, 단백질을 천연 조건 하에 Ni²-NTA 비드를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질을 12% SDS-PAGE에 의해 분석하고 은염색하였다. 정제된 단백질 분액을 고 해상도 질량 분광 분석에 적용하였다. 타임-오브-플라이트(TOF) 질량 분광기를 갖춘 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화(MALDI)(Voyager DE-STR, Applied Biosystems, Foster City, CA) 를 이용하여 단백질의 분자량을 측정하였다. 단백질 샘플은 337 nm 질소 레이저로부터의 조사시 탈착되고 이온화되었다. 시나핀산을 MALDI 매트릭스로 이용하였다. 렉틴 결합과 글리코실트랜스퍼라제 반응을 확립된 프로토콜을 따라 실시하였다(예, K. Kamemura, et al., (2002), J. Biol. Chem. 277: 19229; and, K. Witte, et al., (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 2114 참고).

실시예 5: 예시적인 O-RS의 서열

본 발명에 이용될 수 있는 예시적인 O-RS는 서열 번호 1∼6(표 2 참고)를 포함하며, 본 발명에 이용될 수 있는 예시적인 O-tRNA는 서열 번호 7을 포함한다. O-RS를 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 8∼10을 포함한다.

여기서 개시된 실시예 및 구체예는 단지 예시의 목적이며 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며 이들은 본 출원 및 첨부된 청구범위의 정신과 개요내에 포함된다.

전술한 발명이 명확성과 이해의 목적으로 다소 상세히 개시되었지만, 본 명세서를 읽은 당업자에게는 그 형태 및 상세 사항의 다양한 변화가 본 발명의 범위를 벗어남없이 만들어질 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 모든 전술한 기법 및 장치가 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 여기서 인용된 모든 문헌, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌은 참고로 그 전체가 각 개별 문헌, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌이 개별적으로 여기에 도입되는 것으로 나타내진 것과 마찬가지로 여기에 도입된다.

[표 2]

서열의 예

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2002년 10월 16일에 출원된 미국 가출원 제60/419,265호, 2002년 10월 23일에 출원된 미국 가출원 60/420,990호 및 2003년 1월 16일에 출원된 미국 가출원 60/441,450호의 우선권 및 그 이익을 주장하며, 이들은 참고로 전체가 본원에 통합된다.

연방 정부 지원 연구 및 개발 하에 이루어진 발명의 권리에 대한 언급

본 발명은 국립 보건소에 의해 주어진 그랜트 GM44154, GM62159 및 GM66494 및 에너지국(DOE)에 의해 주어진 그랜트 DE-FG03-OOER45812하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 일정 권리를 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> The Scripps Research Institute Schultz, Peter Wang, Lei Zhang, Zhiwen <120> GLYCOPROTEIN SYNTHESIS <130> 54A-000610PC <140> PCT/US03/32870 <141> 2003-10-15 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 1 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 2 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 2 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 3 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 3 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Tyr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Cys Tyr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Gly Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Cys Met His 145 150 155 160 Tyr His Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 6 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> X can be either C or S <400> 6 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Tyr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Xaa Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn His Asp His 145 150 155 160 Tyr Met Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 7 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> mutant tyrosine amber suppressor tRNA <400> 7 ccggcgguag uucagcaggg cagaacggcg gacucuaaau ccgcauggcg cugguucaaa 60 uccggcccgc cggacca 77 <210> 8 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 8 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gcttacatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtcc attccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa ttgctatcat 480 tataggggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 9 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase <400> 9 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctggaatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtgg attccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa ttgtatgcat 480 tatcacggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 10 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii tyrosyl-t RNA synthetase; S1-5 with S at position 107 <400> 10 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gcttacatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagttc attccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tcatgatcat 480 tatatgggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921

Claims

a) 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 단계; 및

b) 제2 반응성 기를 포함하는 당 부분과 상기 단백질을 접촉시키는 단계로서, 이 때 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여 당 부분을 비천연 아미노산에 부착시키는 것인 단계

를 포함하는, 당단백질의 합성 방법.
제1항에 있어서, 제1 반응성 기는 친전자성 부분이고, 제2 반응성 기는 친핵성 부분인 방법.
제2항에 있어서, 친전자성 부분은 케토 또는 알데히드 부분인 방법.
제2항에 있어서, 친핵성 부분은 -NR¹-NH₂(하이드라자이드), -NR¹(C=O)NR²NH₂(세미카바자이드), -NR¹(C=S)NR²NH₂(티오세미카바자이드), -(C=O)NR¹NH₂(카보닐하이드라자이드), -(C=S)NR¹NH₂(티오카보닐하이드라자이드), -(SO₂)NR¹NH₂(설포닐하이드라자이드), -NR¹NR²(C=O)NR³NH₂(카바자이드), -NR¹NR²(C=S)NR³NH₂(티오카바자이드) 및 -O-NH₂(하이드록실아민)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 이 때 각 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 H, 또는 탄소수 1∼6의 알킬인 방법.
제4항에 있어서, 친핵성 부분은 하이드라자이드, 하이드록실아민, 세미카바자이드 및 카보하이드라자이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 반응 생성물은 옥심, 아미드, 하이드라존, 카보하이드라존, 티오카보하이드라존, 설포닐하이드라존, 세미카바존, 또는 티오세미카바존을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 반응 생성물은 환원된 하이드라존을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제1 반응성 기는 친핵성 부분이고, 제2 반응성 기는 친전자성 부분인 방법.
제8항에 있어서, 친전자성 부분은 케토 또는 알데히드 부분인 방법.
제1항에 있어서, 당 부분은 2 이상의 탄수화물 부분을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, c) 자당 공여 부분으로부터 자당을 당 부분에 전달하기에 적절한 조건 하에 충분한 시간 동안, 당 부분을 글리코실트랜스퍼라제, 자당 공여 부분 및 글리코실트랜스퍼라제 활성에 필요한 다른 반응물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 글리코실트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산 트랜스퍼라제, 갈락투론산 트랜스퍼라제 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)의 생성물을 적어도 제2의 글리코실트랜스퍼라제 및 제2의 자당 공여 부분과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하고, 자당 공여 부분은 UDP-Gal이며, 글리코실트랜스퍼라제는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제인 방법.
제11항에 있어서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하고, 자당 공여 부분은 UDP-GlcNAc이며, 글리코실트랜스퍼라제는 β1-4N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제인 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 반응의 생성물을 β1-4만노실트랜스퍼라제 및 GDP-만노스와 접촉시켜 Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 방법은 Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc- 부분을 α1-3만노실트랜스퍼라제 및 GDP-만노스와 접촉시켜 Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 방법은 Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc- 부분을 α1-6만노실트랜스퍼라제 및 GDP-만노스와 접촉시켜 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 방법은 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc- 부분을 β1-2N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 및 UDP-GlcNAc와 접촉시켜 Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 방법은 Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc- 부분을 β1-2N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 및 UDP-GlcNAc와 접촉시켜 GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-를 포함하는 당 부분을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 방법은 당 부분을 β1-4N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, α1,3-푸코실트랜스퍼라제, α1,2-푸코실트랜스퍼라제, α1,4-푸코실트랜스퍼라제, β1-4갈락토실트랜스퍼라제 및 시알릴트랜스퍼라제 중 하나 이상과 접촉시켜 바이안테너리(biantennary) 또는 트리안테너리(triantennary) 올리고당 구조를 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 도입 단계는 생체내에서 이루어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 도입 단계는 오르소고날(orthogonal) tRNA/오르소고날 아미노아실-tRNA 신세타제(O-tRNA/O-RS) 쌍을 이용하는 것을 포함하며, 이 때 O-tRNA는 셀럭터 코돈을 인식하고 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하며, 상기 O-RS는 비천연 아미노산에 의해 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 방법.
제23항에 있어서, O-RS는 서열 번호 1, 2 또는 3 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제23항에 있어서, O-tRNA는를 포함하는 것인 방법.
제1항의 방법에 의해 생산된 당단백질.
제22항의 방법에 의해 생산된 당단백질.
당 부분과 폴리펩티드를 포함하는 당단백질로서, 상기 당 부분은 상기 폴리펩티드 내에 존재하는 비천연 아미노산에 부착된 제1 반응성 기와 상기 당 부분에 부착된 제2 반응성 기 사이의 친핵성 반응의 반응 생성물에 의해 폴리펩티드에 부착되는 것인 당단백질.
제28항에 있어서, 제1 반응성 기는 친전자성 부분이고, 제2 반응성 기는 친핵성 부분인 당단백질.
제29항에 있어서, 친전자성 부분은 케토 또는 알데히드 부분인 당단백질.
제29항에 있어서, 친핵성 부분은 -NR¹-NH₂(하이드라자이드), -NR¹(C=O)NR²NH₂(세미카바자이드), -NR¹(C=S)NR²NH₂(티오세미카바자이드), -(C=O)NR¹NH₂(카보닐하이드라자이드), -(C=S)NR¹NH₂(티오카보닐하이드라자이드), -(SO₂)NR¹NH₂(설포닐하이드라자이드), -NR¹NR²(C=O)NR³NH₂(카바자이드), -NR¹NR²(C=S)NR³NH₂(티오카바자이드), 또는 -O-NH₂(하이드록실아민)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 이 때 R¹, R² 및 R³는 각각 독립적으로 H, 또는 탄소수 1∼6의 알킬인 당단백질.
제31항에 있어서, 친핵성 부분은 하이드라자이드, 하이드록실아민, 세미카바자이드 및 카보하이드라자이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 당단백질.
제28항에 있어서, 반응 생성물은 옥심, 아미드, 하이드라존, 카보하이드라존, 티오카보하이드라존, 설포닐하이드라존, 세미카바존, 또는 티오세미카바존을 포함하는 것인 당단백질.
제33항에 있어서, 반응 생성물은 환원된 하이드라존을 포함하는 것인 당단백질.
당 부분을 포함하는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 단계를 포함하는 당단백질의 합성 방법.
제35항에 있어서, 상기 방법은 자당 공여 부분으로부터 자당을 당 부분에 전달하기에 적절한 조건 하에 충분한 시간 동안, 당 부분을 글리코실트랜스퍼라제, 자당 공여 부분 및 글리코실트랜스퍼라제 활성에 필요한 다른 반응물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 글리코실트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산 트랜스퍼라제, 갈락투론산 트랜스퍼라제 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제36항에 있어서, 상기 방법은 글리코실트랜스퍼라제 반응의 생성물을 적어도 제2의 글리코실트랜스퍼라제 및 제2의 자당 공여 부분과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하고, 자당 공여 부분은 UDP-GlcNAc이며, 글리코실트랜스퍼라제는 β1-4N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제인 방법.
제36항에 있어서, 당 부분은 말단 GlcNAc를 포함하고, 자당 공여 부분은 UDP-Gal이며, 글리코실트랜스퍼라제는 β1-4-갈락토실트랜스퍼라제인 방법.
제35항에 있어서, 도입 단계는 오르소고날 tRNA/오르소고날 아미노아실-tRNA 신세타제(O-tRNA/O-RS) 쌍을 이용하는 것을 포함하며, 이 때 O-tRNA는 셀럭터 코돈을 인식하고 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하며, 상기 O-RS는 비천연 아미노산에 의해 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 방법.
제41항에 있어서, O-RS는 서열 번호 4, 5 또는 6 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제41항에 있어서, O-tRNA는를 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 도입 단계는 생체내에서 이루어지는 것인 방법.
제35항에 있어서, 비천연 아미노산은 β-O-GlcNAc-L-세린, 트리-아세틸-β-GlcNAc-세린, 트리-O-아세틸-GalNAc-α-트레오닌 또는 α-GalNAc-L-트레오닌을 포함하는 것인 방법.
제35항의 방법에 의해 생산된 당단백질.
a) 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산;

b) 셀렉터 코돈을 인식하는 오르소고날 tRNA;

c) 오르소고날 tRNA에 대한 비천연 아미노산의 부착을 촉진하는 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS);

d) 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

e) 폴리펩티드를 코딩하며, 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열

을 포함하는, 당단백질 합성을 위한 숙주 세포.
제47항에 있어서, 글리코실 트랜스퍼라제는 갈락토실트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 글루쿠론산 트랜스퍼라제, 갈락투론산 트랜스퍼라제 및 올리고사카릴트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
제47항에 있어서, 숙주 세포는 포유류 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포, 고세균 세포 또는 곤충 세포인 숙주 세포.
오르소고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르소고날 아미노아실 tRNA 신세타제(O-RS)를 포함하는 번역 시스템을 포함하는 조성물로서, 상기 O-RS는 당 부분을 포함하는 비천연 아미노산에 의해 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하며, 상기 O-tRNA는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 인식하는 것인 조성물.
제50항에 있어서, O-RS는 서열 번호 4, 5 또는 6 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열, 또는 그 보존적 변이체를 포함하는 것인 조성물.
제50항에 있어서, O-RS는 서열 번호 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 보존적 변이체에 의해 코딩되는 것인 조성물.
제50항에 있어서, O-tRNA는를 포함하는 것인 조성물.
제50항에 있어서, 비천연 아미노산은 β-O-GlcNAc-L-세린, 트리-아세틸-β-GlcNAc-세린, 트리-O-아세틸-GalNAc-α-트레오닌 또는 α-GalNAc-L-트레오닌을 포함하는 것인 조성물.
(a) 서열 번호 4∼6 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열 번호 8∼10 중 어느 하나에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(c) (a) 또는 (b)의 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체와 특이적 면역반응성을 나타내는 폴리펩티드; 및

(d) (a), (b) 또는 (c)의 보존적 변이를 포함하는 아미노산 서열

로 구성된 군으로부터 선택되는 인공 폴리펩티드.
제55항의 폴리펩티드와 특이적 면역반응성을 나타내는 항체 또는 항혈청.
(a) 서열 번호 8∼10 중 어느 하나에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(b) (a)의 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하거나 이 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열 번호 1∼6 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 보존적 변이체;

(d) 제55항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(e) 매우 엄격한 조건 하에 핵산의 실질적으로 전체 길이에 대하여 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 핵산;

(f) (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리뉴클레오티드에 적어도 98% 동일한 폴리뉴클레오티드; 및

(h) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)의 보존적 변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드

로 구성된 군으로부터 선택되는 인공 폴리뉴클레오티드.