JP2006507358A - 糖蛋白質合成 - Google Patents

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Abstract

糖蛋白質のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ製造方法を提供する。１方法は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と、１個以上の糖部分を非天然アミノ酸に結合する段階を含む。別の方法は糖部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階を含む。どちらの方法により製造される蛋白質も付加糖で更に修飾することができる。

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／４１９，２６５号(出願日２００２年１０月１６日)、米国仮特許出願第６０／４２０，９９０号(出願日２００２年１０月２３日)、及び米国仮特許出願第６０／４４１，４５０号(出願日２００３年１月１６日）の優先権を主張し、その明細書の開示内容全体を本明細書に組込む。
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国国立衛生研究所により交付された助成番号第ＧＭ４４１５４号、ＧＭ６２１５９号及びＧＭ６６４９４号と、エネルギー省（ＤＯＥ）により交付された助成番号第ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４５８１２号として政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
（発明の技術分野）
本発明は糖ペプチド、糖蛋白質、及び関連ミメティクスと、糖ペプチド、糖蛋白質、及び関連ミメティクスの合成方法の分野に関する。
グリコシル化による蛋白質の翻訳後修飾は蛋白質フォールディング及び安定性に影響を与え、蛋白質の固有活性を変化させ、他の生体分子とのその相互作用を変化させることができる。例えば非特許文献１参照。天然糖蛋白質は多数の異なる糖形態の集団として存在することが多いので、グリカン構造の分析や、蛋白質構造及び機能に対するグリコシル化効果の研究は困難である。従って、グリカン機能の系統的開明と改良糖蛋白質治療薬の開発には均質にグリコシル化された天然及び非天然蛋白質の合成方法が必要である。
所望グリコシル化パターンをもつ蛋白質を製造するための従来公知のアプローチの１つはグリコシダーゼを使用して不均質天然糖蛋白質を単純な均質コアに変換し、糖をグリコシルトランスフェラーゼで順次グラフトできるようにしている。例えば非特許文献２参照。このアプローチは、主要グリコシル化部位が蛋白質を発現させる細胞株により予め決定されるという欠点がある。あるいは、固相ペプチド合成により所望グリカン構造を含む糖ペプチドを合成することもできる。この糖ペプチドを天然化学的ライゲーション（例えば非特許文献３参照）、発現蛋白質ライゲーション（例えば非特許文献４参照）、又は遺伝子組換えプロテアーゼにより他のペプチド又は組換え蛋白質フラグメントとカップリングすると、より大きな糖蛋白質にすることができる。例えば非特許文献５参照。天然化学的ライゲーションと発現蛋白質ライゲーションはどちらも小蛋白質で最も有効であり、糖ペプチドのＮ末端にシステイン残基を必要とする。ペプチドを相互にライゲーションするためにプロテアーゼを使用する場合には、良好なカップリング収率のためにはライゲーション部位をグリコシル化部位から離して配置する必要がある。例えば非特許文献５参照。第３のアプローチは化学的方法を使用して蛋白質を糖で直接修飾する方法である。ハロアセトアミド糖誘導体をシステインのチオール基にカップリングさせると、良好な選択性が得られる（例えば非特許文献６；及び非特許文献７）が、この方法は２個以上のシステイン残基をもつ蛋白質では問題となることがある。
従って、所望グリコシル化パターンをもつ糖蛋白質を製造するための改良方法が必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、前記及び他の必要を満たすものである。
Ｖａｒｋｉ，Ａ．（１９９３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：９７−１３０ Ｗｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８ Ｓｈｉｎ，Ｙ．ら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１１６８４−１１６８９ Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５４２１−５４２８ Ｗｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９７９−１９８９ Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｊ．ａｎｄ，Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２：６７９３−６７９６ Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｄ．；ら，（２００２）Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ ４：１４６７−１４７０
本発明は糖蛋白質の合成方法を提供する。これらの方法は所定態様では、第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；第２の反応性基を含む糖部分と前記蛋白質を接触させ、第１の反応性基を第２の反応性基と反応させて糖部分を非天然アミノ酸に結合する段階を含む。これらの方法により生産された糖蛋白質も本発明に含まれる。第１の反応性基は所定態様では求電子性部分（例えばケト部分、アルデヒド部分、及び／又は同等物）であり、第２の反応性基は求核性部分である。所定態様では、第１の反応性基は求核性部分であり、第２の反応性基は求電子性部分（例えばケト部分、アルデヒド部分、及び／又は同等物）である。例えば、求電子性部分は糖部分に結合しており、求核性部分は非天然アミノ酸に結合している。糖部分は単一糖質部分を含むこともできるし、糖部分は２個以上の糖質部分を含むこともできる。
所定態様では、方法は更に糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階を含む。この反応の生成物を所望により少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び適当な糖供与体部分と接触させることができる。
所定態様では、方法は更に糖部分をβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，４フコシルトランスフェラーゼ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、及び／又は同等物の１種以上と接触させ、二側鎖又は三側鎖オリゴ糖構造を形成する段階を含む。
１態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。１態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。場合により、方法は更にＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応の生成物をβ１−４マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を含む。場合により、方法は更にＭａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−３マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する
段階を含む。場合により、方法は更にＭａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−６マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を含む。場合により、方法は更にＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を含む。場合により、方法は更にＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃｐｌ−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を含む。
第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階は、所定態様では直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ＲＳは配列番号１、２、又は３のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む。場合により、Ｏ−ｔＲＮＡはｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含む。所定態様では、非天然アミノ酸をポリペプチドにｉｎ ｖｉｖｏで組込む。
本発明は更に糖部分とポリペプチドを含む糖蛋白質を提供する。所定態様では、本発明の糖蛋白質において糖部分はポリペプチドに存在する非天然アミノ酸に結合した第１の反応性基と糖部分に結合した第２の反応性基の求核性反応の反応生成物によりポリペプチドと結合している。所定態様では、第１の反応性基は求電子性部分（例えばケト部分、アルデヒド部分、及び／又は同等物）であり、第２の反応性基は求核性部分である。
所定態様では、本発明の求核性部分は限定されないが、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、カルボヒドラジド、スルホニルヒドラジド等を含む。例えば、求核性部分は限定されないが、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）等を含み、前記式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである。
本発明の所定態様では、本発明の反応生成物は例えばオキシム、アミド、ヒドラゾン、還元ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン等を含む。
本発明の他の側面としては、糖部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことによる糖蛋白質の合成方法が挙げられる。前記方法により生産された糖蛋白質も本発明の特徴である。所定態様では、組込み段階は直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して糖部分（例えば、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、及び／又は同等物）を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシ
ル化する。１態様では、組込み段階はｉｎ ｖｉｖｏで実施される。例えば、Ｏ−ＲＳは配列番号４、５、又は６のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号８、９、又は１０のいずれか１種のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。場合により、Ｏ−ｔＲＮＡはｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含む。これらの方法は更に糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階を含むことができる。
所定態様では、方法は更にグリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を含む。１態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。別の態様では、糖部分は末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分はＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。付加糖を加えることができる。
所定態様では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼは限定されないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ等を含む。
本発明は更に糖蛋白質の合成に有用な宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、始原菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）も提供する。これらの宿主細胞は、ａ）糖部分を含む非天然アミノ酸と；ｂ）セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；ｃ）非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；ｄ）グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと；ｅ）ポリペプチドをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む。
翻訳系を含む組成物も本発明により提供される。翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳは糖部分（例えば、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、及び／又は同等物）を含む非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは少なくとも１個のセレクターコドンを認識する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号４、５、又は６のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号８、９、又は１０のいずれか１種のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。場合により、Ｏ−ｔＲＮＡはｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含む。
人工（例えば人為的に作製した非天然）ポリペプチド及びポリヌクレオチドも本発明の特徴である。例えば、本発明の人工ポリペプチドは例えば（ａ）配列番号４〜６のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号８〜１０のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異を含むアミノ酸配列を含む。本発明の人工ポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も本発明により提供される。本発明の人工ポリヌクレオチドは例えば（ａ）配列番号８〜１０のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオ
チド配列に相補的であるか又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号１〜６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｄ）人工ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｅ）核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；及び（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の保存変異体を含むポリヌクレオチドを含む。
〔定義〕
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又は生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の表面の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は他の翻訳系に内在する対応する分子により低効率で使用される分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。直交とは、該当翻訳系で直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共に機能できないか又は低効率でしか機能できず、あるいは、直交ＲＳが内在ｔＲＮＡがと共に機能できないか又は低効率でしか機能できず、例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率でしか機能できないことを意味する。例えば、該当翻訳系における直交ｔＲＮＡが該当翻訳系の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当翻訳系における任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ＲＳが内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率に比較して低いか又はゼロである。
優先的にアミノアシル化する：「優先的にアミノアシル化する」なる用語はＯ−ＲＳが非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率が天然ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡを作製するために使用する出発材料に比較して例えば約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％以上であることを意味する。その場合、非天然アミノ酸は成長中のポリペプチド鎖に高い忠実度で組込まれ、例えば、所与セレクターコドンで効率約７５％以上、所与セレクターコドンで効率約８０％以上、所与セレクターコドンで効率約９０％以上、所与セレクターコドンで効率約９５％以上、又は所与セレクターコドンで効率９９％以上である。
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識されるが、一般に内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチド内のこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。所与系で、内在系が該当天然３塩基コドンを使用しない場合にセレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、例えば天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠失する系や、天然３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）の読取りを改変するｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン、レアコドン、及び／又は同等物を読み飛ばすことができる。
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）に天然アミノ酸を組込むために必要な成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明の成分はｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも翻訳系に加えることができる。翻訳系は細胞とすることができ、原核細胞（例えば大腸菌細胞、始原菌細胞等）でも真核細胞（例えば酵母、哺乳動物、植物、昆虫等）でもよい。
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の天然アミノ酸の１種又はセレノシステイン又はピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。
糖部分：本明細書で使用する「糖部分」なる用語は天然及び非天然糖部分を意味する（即ち、非天然糖部分、例えばヒドロキシル又はアミノ位を修飾（例えば脱ヒドロキシル化、脱アミノ化、エステル化等）された糖部分、例えば２−デオキシＧａｌは非天然糖部分の１例である）。「糖質」なる用語は一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎをもち、限定されないが、例えば単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類が挙げられる。オリゴ糖は糖単位（糖とも言う）から構成される鎖である。糖単位は任意規則で配置することができ、２個の糖単位間の結合は約１０種の異なる方法の任意のものとすることができる。
本明細書では以下の略称を使用する：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；及び
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（一般にＮ−アセチルノイラミニル）。
オリゴ糖は還元末端の糖が実際に還元糖であるか否かに拘わらず、還元末端と非還元末端をもつとみなされる。容認されている命名法に従い、本明細書ではオリゴ糖は左側を非還元末端とし、右側を還元末端とする。本明細書に記載する全オリゴ糖は非還元糖の名称又は略称（例えばＧａｌ）に続いてグリコシド結合（α又はβ）、環結合の立体配置、結合に関与する還元糖の環位置を記載し、その後に還元糖の名称又は略称（例えばＧｌｃＮＡｃ）を記載する。２個の糖間の結合は例えば２，３、２→３，２−３、又は（２，３）のように表すことができる。２個の糖間の天然又は非天然結合（例えば１−２、１−３、１−４、１−６、２−３、２−４、２−６等）も本発明に含まれる。各糖はピラノースである。
「シアル酸」（略称「Ｓｉａ」）なる用語は９炭素カルボキシル化糖ファミリーの任意メンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーはＮ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸）（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡと略称することが多い）である。このファミリーの第２のメンバーはＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基をヒドロキシル化したＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（
ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９）である。９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ（例えば９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ）、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ等の９置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーについては、例えばＶａｒｋｉ（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：２５−４０；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）参照。シアル酸化合物の合成とシアリル化法における使用は例えば国際出願ＷＯ９２／１６６４０（公開日１９９２年１０月１日）に記載されている。
グリコシルトランスフェラーゼの供与体基質は活性化ヌクレオチド糖である。このような活性化糖は一般にヌクレオシド二リン酸又は一リン酸を脱離基とする糖の誘導体であるウリジン及びグアノシン二リン酸とシチジン一リン酸から構成される。細菌、植物、及び真菌系は場合により他の活性ヌクレオチド糖も使用できる。
本欄及び本明細書の他の欄で定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味である。
〔図面の簡単な説明〕
図１は非天然アミノ酸を含むポリペプチドに糖部分を結合するための２種類のスキーム（順次経路と収束経路）の例を模式的に示す。
図２は（図１の）アミノオキシ糖１とｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む（図１の）突然変異体Ｚドメイン蛋白質Ｉの７時間及び２６時間カップリング反応のＨＰＬＣ分析を示す。
図３は（図１の）突然変異体Ｚドメイン蛋白質Ｉ、（図１の）糖蛋白質ミメティクスＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの高分解能ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳスペクトルを示す。各スペクトルの２＋同位体クラスターを示す。
図４はＧｌｙ４→Ａ突然変異体ミオグロビン（〜１８．５ｋＤ）の発現を示す。蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ゲルを銀染色した。
図５はＧｌｙ４→Ａ突然変異体ミオグロビンの分子量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
図６はＡ、Ｂ及びＣはグリコシル化アミノ酸を含む精製突然変異体ミオグロビンの特性決定を示す。ＡはＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンＢａｎｄｅｒｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ＩＩ（ＢＳＩＩ）と野生型ミオグロビン及び糖ミオグロビンの結合を示す。ＢはＵＤＰ−［Ｈ３］ガラクトースによる糖ミオグロビンのオンブロットガラクトシルトランスフェラーゼ標識を示す。Ｃは溶液中で実施したガラクトシルトランスフェラーゼ反応の定量分析を示し、１．０が１００％転移に対応するように放射性標識ガラクトースを標準化した。
蛋白質の翻訳後修飾は代謝、シグナル伝達、及び遺伝子発現をはじめとする多数の生体プロセスを調節する。しかし、選択的に修飾された蛋白質の均質集団の作製に関連する合
成の問題により、蛋白質構造及び機能に対するこれらの修飾の効果に関する詳細な研究は妨げられている。例えば、グリコシル化は真核生物で最も一般的な蛋白質の翻訳後修飾の１種であり、フォールディングや分泌から生体分子認識及び血清半減期に至る広範な蛋白質機能に影響を与える。例えばＲ．Ａ．Ｄｗｅｋ，（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：６８３参照。グリコシル化の効果の解明はかなり進んだが、オリゴ糖鎖の具体的な役割とその構造と機能の関係についてはまだ解明され始めたばかりである。例えば、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，＆ Ｌ．Ｌ．Ｋｉｅｓｓ１ｉｎｇ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３５７参照。主な問題は糖蛋白質が一般に糖形態の混合物として生産されるため、天然源から固有糖形態を単離しにくい点である。規定構造の糖形態を合成するために種々の方法が開発されているが、生産される糖蛋白質のサイズ、量、及び／又は品質に重大な欠点がある。例えばＰ．Ｓｅａｒｓ，＆ Ｃ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｍ．Ｗａｃｋｅｒら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；及びＨ．Ｃ．Ｈａｎｇ，＆ Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，（２００１）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７参照。本発明はこの問題と他の問題を解決し、糖蛋白質及び糖蛋白質ミメティクス、並びに所望グリコシル化パターンをもつ糖蛋白質の合成方法を提供する。本発明の糖蛋白質及び糖蛋白質ミメティクスは均質な糖形態の治療用糖蛋白質の生産及び／又はグリコシル化蛋白質の構造と機能に関する研究の促進に有用である。
〔グリコシル化〕
本発明は糖蛋白質の合成方法を提供する。所定態様では、これらの方法は、第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；糖部分に結合した第２の反応性基と第１の反応性基を接触させ、共有結合を形成し、糖部分を前記蛋白質に結合する段階を含む。
多種多様な適切な反応性基が当業者に公知である。このような適切な反応性基としては、例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボン酸、カルボニル、アルケニル、アルキニル、アルデヒド、エステル、エーテル（例えばチオ−エーテル）、アミド、アミン、ニトリル、ビニル、スルフィド、スルホニル、ホスホリル、又は同様の化学反応基が挙げられる。その他の適切な反応性基としては限定されないが、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトリロトリ酢酸、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル（例えばブロモアセチル、ヨードアセチル）、活性化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、塩化スルホニル、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、Ｎ−アシル−イミダゾール、イミダゾールカルバミン酸、ビニルスルホン、スクシンイミジル炭酸、アリールアジド、無水物、ジアゾ酢酸、ベンゾフェノン、イソチオシアン酸、イソシアン酸、イミドエステル、フルオロベンゼン、ビオチン及びアビジンが挙げられる。
所定態様では、反応性基の一方は求電子性部分であり、第２の反応性基は求核性部分である。求核性部分又は求電子性部分は非天然アミノ酸の側鎖に結合することができ、その場合には、対応する基を糖部分に結合する。求核性部分と反応して共有結合を形成する適切な求電子部分は当業者に公知である。このような求電子性部分としては限定されないが、例えばカルボニル基、スルホニル基、アルデヒド基、ケトン基、ヒンダードエステル基、チオエステル基、安定イミン基、エポキシド基、アジリジン基等が挙げられる。求電子性部分と反応することができる適切な求核性部分は当業者に公知である。このような求核性部分としては例えば脂肪族又は芳香族アミン（例えばエチレンジアミン）が挙げられる。他の態様では、反応性基は−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−Ｎ
Ｒ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）及び／又は同等物であり、前記式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキル、好ましくはＨである。本発明の１側面では、反応性基はヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、カルボヒドラジド、スルホニルヒドラジド等である。
求核性部分と求電子性部分の反応生成物は一般に求核性部分に元々存在する原子を組込んでいる。アルデヒド又はケトンと求核性部分を反応させることにより得られる典型的な結合としては使用される求核性部分及び求核性部分と反応させる求電子性部分（例えばアルデヒド、ケトン、及び／又は同等物）に応じてオキシム、アミド、ヒドラゾン、還元ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、又は類似官能基等の反応生成物が挙げられる。カルボン酸との結合は一般にカルボヒドラジド又はヒドロキサム酸と呼ばれる。スルホン酸との結合は一般にスルホニルヒドラジド又はＮ−スルホニルヒドロキシルアミンと呼ばれる。その後、得られた結合を化学的還元により安定化させることができる。
所定態様では、糖蛋白質は糖部分に結合した非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことにより合成される。例えば、セレクターコドンに応答して糖部分をもつ非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込む直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳを使用することができる。例えば本明細書の「非天然アミノ酸をもつ蛋白質の製造」のセクション参照。
〔グリコシルトランスフェラーゼ〕
本発明はアミノ酸と結合した糖部分又は糖部分を含む非天然アミノ酸を更にグリコシル化する方法を提供する。グリコシル化段階は例えばグリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、又は当業者に公知の他の酵素を使用して酵素により実施することが好ましい。所定態様では、２種以上の異なるグリコシルトランスフェラーゼを含む単一反応混合物で複数の酵素段階を実施する。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの両者を反応混合物に加えることによりガラクトシル化段階とシアリル化段階を同時に実施することができる。
グリコシルトランスフェラーゼ反応を含む酵素糖合成では、本発明の組換え細胞は場合によりグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１個の異種遺伝子を含む。多数のグリコシルトランスフェラーゼとそのポリヌクレオチド配列が公知である。例えば“Ｔｈｅ ＷＷＷ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ”参照（世界ウェブｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ参照）。グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列とアミノ酸配列を推定することが可能なグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列もＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ等の種々の公共データベースから入手できる。
本発明の細胞で使用することができるグリコシルトランスフェラーゼとして限定されないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ等が挙げられる。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては真核生物と原核生物から得られるものが挙げられる。
グリコシルトランスフェラーゼの受容体は本発明の方法により修飾する糖蛋白質に存在する。適切な受容体としては例えばＧａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，３Ｇａ
ｌＮＡｃ−、ラクト−Ｎ−テトラオース−、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ−、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ−、及びＧａｌβ１，４Ｇｌｃ−（ラクトース）等のガラクトシル受容体が挙げられる。他の受容体も当業者に公知である（例えばＰａｕｌｓｏｎら（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４参照）。一般に、受容体は糖蛋白質と結合した糖部分鎖の一部を構成する。
酵素量又は濃度は初期触媒速度の尺度である活性単位で表される。１活性単位は所与温度（一般に３７℃）及びｐＨ値（一般に７．５）で毎分１μｍｏｌの生成物の形成を触媒する。従って、酵素１０単位は温度３７℃とｐＨ値７．５で１分間に基質１０μｍｏｌが生成物１０μｍｏｌに変換される場合の酵素の触媒量である。酵素は溶液に遊離させて使用してもよいし、ポリマー等の支持体に固定してもよい。従って、多少の沈殿が反応中に形成される場合もあるが、反応混合物は当初は実質的に均質である。
グリコシル化反応は適切なグリコシルトランスフェラーゼと受容体に加え、グリコシルトランスフェラーゼの糖供与体として機能する活性化ヌクレオチド糖を含む。反応は更にグリコシルトランスフェラーゼ活性を助長する他の成分も含むことができる。これらの成分としては２価カチオン（例えばＭｇ＋２又はＭｎ＋２）、ＡＴＰ再生に必要な材料、リン酸イオン、及び有機溶媒が挙げられる。プロセスで使用される種々の反応体の濃度又は量は温度及びｐＨ値等の反応条件や、グリコシル化すべき受容体糖の選択と量などの多数の因子により異なる。反応媒体は更に必要に応じて溶解補助界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ又はＳＤＳ）と、メタノール又はエタノール等の有機溶媒を加えてもよい。
本発明の方法を使用して生産されたオリゴ糖は当業者に公知の方法により分析することができる。例えば、糖質単位を例えばアルカリβ脱離により糖質部分から遊離させ、ゲル濾過によりポリペプチドから分離することができる。得られたオリゴ糖を次にゲル濾過、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィー等の１種以上の標準技術又はその組み合わせを使用して相互に分離し、完全に分析することができる。精製オリゴ糖単位の完全な構造分析には単糖単位、その環形態、立体配置（Ｄ又はＬ）、アノマー結合（α又はβ）、糖間の結合の位置とその配列の決定が必要である。更に、置換基が存在する場合にはその位置を確認する。単糖間のグリコシド結合の位置を決定するためにはメチル化分析を使用することができる。糖残基のアノマー立体配置は例えば１Ｈ ＮＭＲスペクトロスコピーを使用して割り当てることができる。完全構造糖質分析を実施するために使用する条件と方法はＢｅｅｌｅｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｂｕｒｄｏｎ ａｎｄ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５），Ｈｏｕｎｓｅｌｌ，“Ｇｌｙｃｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．７６，１９９８，及びＥｌ Ｒａｓｓｉ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ，Ｖｏｌ．５８（１９９４）に概説されている。
オリゴ糖の糖を完全に特性決定するためのその他の技術としてはＦＡＢ−ＭＳ（高速原子ボンバードメント−質量分析）、ＨＰＡＥ（高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー）及びＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトロスコピー、特に１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ）が挙げられる。これらの技術は補完的である。オリゴ糖の構造を完全に特性決定するためにこれらの技術を使用する方法の例はＳｐｅｌｌｍａｎら，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４１００，及びＳｔａｎｌｅｙら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１１３７４に記載されている。他の方法としては正イオン高速原子ボンバードメント質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）及びガスクロマトグラフィー−電子衝撃質量分析（Ｇ
Ｃ／ＥＩ−ＭＳ）によるメチル化分析（ＥＰＯ出願第８９３０５１５３．２号参照）が挙げられる。
〔糖蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ合成〕
糖蛋白質をｉｎ ｖｉｖｏ合成するためには、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入すればよい。ポリヌクレオチドは更に糖部分の結合が所望される位置に１個以上のセレクターコドンを含む。非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸）と；セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む宿主細胞に発現ベクターを導入する。Ｏ−ＲＳは非天然アミノ酸を直交ｔＲＮＡに結合した後に、非天然アミノ酸を未完成蛋白質に導入する。
所定態様では、宿主細胞は更にグリコシルトランスフェラーゼをコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。このような宿主細胞は非天然アミノ酸と結合した糖部分への１個以上の糖の付加を触媒することができる。
ターゲット核酸を宿主細胞に導入する方法としては数種の周知方法が利用可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃及びウイルスベクターによる感染等が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅するためには細菌細胞を使用することができる。対数期まで細菌細胞を増殖させると、細菌内のプラスミドを当分野で公知の各種方法により単離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，後出参照）。更に、細菌からプラスミドを精製するために多数のキットが市販されている（例えばＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；及びＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）参照）。単離精製したプラスミドを更に操作して他のプラスミドを作製し、細胞をトランスフェクトするために使用するか又は生物に感染させるために関連ベクターに組込む。
組換え宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞を場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。
例えば細胞単離及び培養（例えば後続核酸単離）に関する他の有用な文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
〔非天然アミノ酸をもつ蛋白質の製造〕
非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を含む糖蛋白質の製造も本発明の特徴である。所定態様では、本発明は第２の反応性基と反応させると共有結合を形成することができる適切な反応性基を結合した１種以上の非天然アミノ酸を含む糖蛋白質の製造に関する。所定態様では、非天然アミノ酸は求電子性部分を含み（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）、アルデヒド又はケト部分を求核性部分と反応させ、糖部分をポリペプチド又は蛋白質と結合する。非天然アミノ酸を含む蛋白質は直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用して遺伝的にコードされる付加アミノ酸を受容するように蛋白質生合成機構を改変した細胞により合成される。特に、細胞はセレクターコドン（例えば終止コドン、４塩基コドン等）を認識する直交ｔＲＮＡと、アルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸を直交ｔＲＮＡと結合することが可能な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。
所定態様では、本発明は糖部分を含む１種以上の非天然アミノ酸を含む糖蛋白質の製造に関する。非天然アミノ酸を含む蛋白質は直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用して遺伝的にコードされる付加アミノ酸を受容するように蛋白質生合成機構を改変した細胞により合成される。特に、細胞はセレクターコドン（例えば終止コドン、４塩基コドン等）を認識する直交ｔＲＮＡと、糖部分をもつ非天然アミノ酸を直交ｔＲＮＡと結合することが可能な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。
この技術により非天然アミノ酸を蛋白質に直接部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができる。重要な点は、非天然アミノ酸を２０種の標準アミノ酸の１種に置換するのでなく遺伝子レパートリーに加えるという点である。蛋白質は蛋白質の特定位置に１又は複数の（同一又は異なる）非天然アミノ酸をもつことができる。蛋白質を誘導体化するための初期方法とは異なり、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用により、蛋白質中で特定アミノ酸が存在する各位置でこの特定アミノ酸を誘導体化するのではなく、蛋白質中で特定アミノ酸が存在する位置のただ１つに非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産することができる。
糖蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベク
ターに配置してもよいし、２成分を同一ベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出，及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔに記載されている。
例えば、糖蛋白質の生産方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。公開ＷＯ２００２／０８５９２３号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」はこの方法を記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができる非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）のｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ系に導入してもよい。参考資料として本明細書に組込む２００３年１０月１５日付け対応出願、発明の名称「ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（Ｓｉｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｅｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」（代理人整理番号５４−０００１７０ＰＣＴ）も参照されたい。
本発明の細胞は大量の有用な量の糖蛋白質を合成することができる。１側面では、組成物は場合により、例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量の糖蛋白質を含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本
明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を組込んだ蛋白質の細胞における大量（例えば他の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）の生産も本発明の特徴である。
非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、蛋白質部分への標的接近等を改変するように例えば蛋白質構造及び／又は機能を調整するために実施することができる。非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を含む蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を組込んだ蛋白質を含む組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００） Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１１個以上の非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）及び／又は別の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含む。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１種を非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）で置換した蛋白質を含む。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２種以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１種の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合する部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を組込んだほぼ任意蛋白質（又はその部分）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではな
く、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを組込むように利用可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致し、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上の非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合する部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を組込むために修飾することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例は限定されないが、ＷＯ２００２／０８５９２３，前出に記載されている。糖部分を結合するアミノ酸を含む１種以上の非天然アミノ酸及び／又は糖部分を含む非天然アミノ酸を組込むために修飾することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例は限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」、１種以上の非天然アミノ酸の組込みによる改変の好適ターゲット）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト増殖ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
本明細書に記載する非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）をｉｎ ｖｉｖｏ組込むための組成物
と方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーターとその一部が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌類、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。自明の通り、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル導入カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
本発明の蛋白質（例えば糖部分を結合するアミノ酸を含む１種以上の非天然アミノ酸及び／又は糖部分を含む非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）と、シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）と、転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合する部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
本発明により修飾することができる多数の蛋白質が市販されており（例えばＳｉｇｍａ
ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ２００２カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体は周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って糖部分を結合するアミノ酸を含む１種以上の非天然アミノ酸、又は糖部分を含む非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを修飾することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃を通して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断関連特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性、特異性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能、特異性等が挙げられる。
他の各種蛋白質も本発明の１種以上の非天然アミノ酸を含むように修飾することができる。例えば、本発明は糖部分を結合するアミノ酸を含む１種以上の非天然アミノ酸で１種以上のワクチン蛋白質の１種以上の天然アミノ酸を置換するか、又は糖部分を含む非天然アミノ酸を例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細
菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質に組込むことができる。
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も本発明の非天然アミノ酸組込み及び／又は糖付加による修飾に適切なターゲットである。
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
〔免疫反応性によるポリペプチドの特性決定〕
本発明の糖ポリペプチドは（例えば本明細書に記載する翻訳系で合成される蛋白質の場合には糖部分を結合することができるアミノ酸を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸を含み、又は例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、糖ポリペプチドは例えば免疫アッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製とこのような抗血清と結合したポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
例えば、本発明は本明細書に記載する各種配列の１種以上から選択されるシンテターゼアミノ酸配列を含む免疫原に対して作製した抗体又は抗血清に特異的に結合するか又は特異的に免疫反応性であるシンテターゼ蛋白質を含む。他の相同体との交差反応性をなくすために、野生型Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉチロシルシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）等の入手可能なシンテターゼ又はＷＯ ２００２／０８５９２３に記載されているもの等の公知人工シンテターゼを用いて抗体又は抗血清をサブトラクションする。野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉ）チロシルシンテターゼ（
ＴｙｒＲＳ）又は従来配列が核酸に対応する場合には、場合により核酸によりコードされるポリペプチドを作製し、抗体／抗血清サブトラクション目的に使用する。
典型的なフォーマットの１例では、イムノアッセイは本明細書に記載するシンテターゼ配列の１種以上又はその実質的サブ配列（即ち記載する全長配列の少なくとも約３０％）を含む１種以上のポリペプチドに対して作製したポリクローナル抗血清を使用する。これらの配列に由来する潜在的ポリペプチド免疫原群を以下の文中では「免疫原性ポリペプチド」と総称する。得られた抗血清を場合により対照シンテターゼ相同体（野生型ＴｙｒＲｓ、及び／又はＷＯ２００２／０８５９２３に記載のシンテターゼ）に対する交差反応性が低くなるように選択し、ポリクローナル抗血清をイムノアッセイで使用する前に例えば対照シンテターゼ相同体の１種以上の免疫吸着によりこのような交差反応性を除去する。
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を標準マウス免疫プロトコールに従って免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。抗体のその他の点については本明細書にも記載しており、この場合の免疫反応性によるポリペプチドの特性決定に適用することができる）。あるいは、本明細書に開示する配列に由来する１種以上の合成又は組換えポリペプチドをキャリヤー蛋白質にコンジュゲートし、免疫原として使用する。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＷＯ２００２／０８５９２３，前出に記載されている。
ポリクローナル血清を採取し、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化した免疫原性蛋白質の１種以上を使用する固相イムノアッセイ）で免疫原性ポリペプチドに対する力価を測定する。１０６以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、プールし、対照シンテターゼポリペプチドでサブトラクションし、高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを作製する。
高力価ポリクローナル抗血清サブトラクションプールを比較イムノアッセイで対照相同体に対する交差反応性について試験する。この比較アッセイでは、サブトラクション高力価ポリクローナル坑血清に差別的な結合条件を設定し、高力価ポリクローナル坑血清と免疫原性シンテターゼの結合のシグナル対ノイズ比を対照シンテターゼ相同体との結合に比較して少なくとも約５〜１０倍にする。即ち、アルブミン又は脱脂粉乳等の非特異的競合剤を加えるか及び／又は塩条件、温度、及び／又は同等物を調節することにより結合反応のストリンジェンシーを調整する。これらの結合条件は、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチド及び／又は対照ポリペプチドに比較するポリペプチド）がサブトラクションポリクローナル坑血清プールに特異的に結合するか否かを調べる後期アッセイで使用される。特に、差別的結合条件下で対照シンテターゼ相同体の少なくとも２〜５倍のシグナル対ノイズ比と、免疫原性ポリペプチドの少なくとも約１／２のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは公知シンテターゼに比較して免疫原ポリペプチドと実質的な構造類似性をもつので、本発明のポリペプチドである。
別の例では、試験ポリペプチドの検出に競合的結合フォーマットのイムノアッセイを使用する。例えば、上述のように、対照ポリペプチドの免疫吸着により坑血清混合物プールから交差反応性抗体を除去する。次に、免疫原性ポリペプチドを固体支持体に固定化し、支持体をサブトラクション坑血清プールに暴露する。試験蛋白質をアッセイに加え、サブ
トラクション坑血清プールとの結合を競合させる。試験蛋白質が固定化蛋白質に対してサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力と、アッセイに加えた免疫原性ポリペプチドが結合を競合する能力を比較する（免疫原性ポリペプチドは坑血清プールとの結合を固定化免疫原性ポリペプチドと有効に競合する）。標準計算を使用して試験蛋白質の交差反応性百分率を計算する。
平行アッセイでは、場合により対照蛋白質がサブトラクション坑血清プールとの結合を競合する能力を免疫原性ポリペプチドが坑血清との結合を競合する能力と比較測定する。この場合も、標準計算を使用して対照ポリペプチドの交差反応性百分率を計算する。試験ポリペプチドの交差反応性百分率が対照ポリペプチドの少なくとも５〜１０倍である場合又は試験ポリペプチドの結合が免疫原性ポリペプチドの結合とほぼ同一範囲である場合に、試験ポリペプチドはサブトラクション坑血清プールに特異的に結合すると言う。
一般に、本明細書に記載する競合的結合イムノアッセイでは任意試験ポリペプチドを免疫原性及び／又は対照ポリペプチドに比較するために免疫吸着坑血清プールを使用することができる。この比較を行うためには、免疫原性、試験及び対照ポリペプチドを各々広い濃度範囲でアッセイし、サブトラクション坑血清と例えば固定化した対照、試験又は免疫原性蛋白質との結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量を標準技術により決定する。競合アッセイで結合に必要な試験ポリペプチドの量が免疫原性ポリペプチドの必要量の２倍未満であり、対照ポリペプチドの少なくとも約５〜１０倍である場合に、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質に対して作製した抗体に特異的に結合すると言う。
特異性の付加試験として、得られる免疫原性ポリペプチドサブトラクション坑血清プールと免疫吸着に使用する免疫原性ポリペプチドの結合が殆ど又は全く検出できなくなるまで場合により坑血清プールを（対照ポリペプチドではなく）免疫原性ポリペプチドに完全に免疫吸着させる。この完全に免疫吸着した坑血清を次に試験ポリペプチドとの反応性について試験する。反応性が殆ど又は全く観察されない場合（即ち完全に免疫吸着した坑血清と免疫原性ポリペプチドの結合に観察されるシグナル対ノイズ比の２倍以下）には、試験ポリペプチドは免疫原性蛋白質により誘導される坑血清に特異的に結合する。
〔直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対〕
１種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産に適した翻訳系は国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」及びＷＯ２００２／０８５９２３号，前出に記載されている。これらの出願は各々その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を含む細胞を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。細胞は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにこれらの成分を使用する。
直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳから構成される。Ｏ−ｔＲＮＡは上述のように内在シンテターゼによりアシル化されず、セレクターコドンをデコードすることができる。Ｏ−ＲＳは例えば拡張アンチコドンループでＯ−ｔＲＮＡを認識し、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）で優先的にアミノアシル化する。多重直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対の開発により、各種コドン
を使用して多重非天然アミノ酸を同時に組込むことが可能になる。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ配列については実施例５参照。
Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、起源と宿主名で記載されている各種生物に由来する天然ｔＲＮＡ及び／又はＲＳを突然変異させることにより誘導してもよい。各種態様において、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは少なくとも１種の生物に由来する。別の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたｔＲＮＡから誘導し、Ｏ−ＲＳは第２の生物に由来する天然に存在するか又は天然に存在するものを突然変異させたＲＳから誘導する。
具体的には、これらの方法は（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導されるｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの不在下で第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーをネガティブ選択することによりｔＲＮＡのプールを提供する段階と、（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーをｔＲＮＡのプールから選択することにより少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む。組換えＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。方法は更に、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される突然変異体ＲＳのライブラリーを作製する段階と、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸の存在下で組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーをＲＳのライブラリーから選択することにより活性ＲＳのプールを提供する段階と、（ｆ）非天然アミノ酸の不在下で少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳのプールをネガティブ選択することにより特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供する段階を含み、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）に特異的な少なくとも１種の組換えＯ−ＲＳと組換えＯ−ｔＲＮＡを含む。
直交対を作製するストラテジーの１つは突然変異体ライブラリーを作製してこのライブラリーからＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択する方法である。
直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を作製する第２のストラテジーは異種ｔＲＮＡ／シンテターゼ対（例えば別の生物起源の対）を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の性質としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の性質としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡから誘導される異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに直交性である。
〔直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）〕
本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）で優先的にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳは配列番号１〜６に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は配列番号１〜６を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号８、９、もしくは１０のいずれか１種を含むポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるＯ−ＲＳ又はその一部が挙げられる。例えば代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については本明
細書の表２と実施例５参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
Ｏ−ＲＳの作製方法は野生型シンテターゼの骨格から突然変異体シンテターゼのプールを作製した後、例えばアルデヒドもしくはケト部分又は糖部分をもつ非天然アミノ酸に対する特異性を２０種の標準アミノ酸と比較検討することにより突然変異ＲＳを選択することを基本とする。このようなシンテターゼを単離するために、本発明の選択方法は（ｉ）１回目の選択からの所望シンテターゼの活性を低くすることができ、集団が小さいので高感度であり、（ｉｉ）各回の選択で選択ストリンジェンシーを変えることが望ましいので「調節可能」であり、（ｉｉｉ）汎用性であるため、種々の非天然アミノ酸に使用できる。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼを例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、各種シンテターゼドメインを組み合わせることにより各種部位等で突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用ストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、非天然アミノ酸の不在下でネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング、他の再帰的突然変異誘発法、及び／又は同等物により更に突然変異誘発することができる。
突然変異体ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、キメラ構築等により作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。
ポジティブ選択は選択マーカー遺伝子にセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）を含むポジティブ選択マーカーにおけるセレクターコドンの抑圧に基づいて行うことができる。抗生物質又は他の選択物質をポジティブ選択圧として適用することができる。更に、非天然アミノ酸の存在下と不在下で本明細書に記載するようなポジティブマーカーとネガティブマーカーのいずれにも選択マーカーを使用することができる。場合により、セレクターコドンを含む選択マーカー遺伝子をポジティブ選択に使用し、少なくとも１個以上のセレクターコドンを含むネガティブ選択マーカー（例えばバルナーゼ遺伝子等の毒性マーカー）をネガティブ選択に使用する。
ポジティブ選択は細胞をアンピシリン耐性にするβ−ラクタマーゼ遺伝子の非必須位置のセレクターコドンの抑圧に基づいて行うこともでき、ネガティブマーカーとしてリボヌクレアーゼバルナーゼを使用するネガティブ選択を使用する。ペリプラズムに分泌されるβ−ラクタマーゼに対して、細胞質に局在するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を使用することもでき、更にアンピシリンは殺菌性であるが、クロラムフェニコールは静菌性である。
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発させることができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突
然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。場合により、選択物質の濃度を変動させる。
本発明の方法では、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するために付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加回のポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物で１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
Ｏ−ＲＳの作製、シンテターゼの基質特異性の改変、Ｏ−ＲＳの他の例に関するその他の詳細についてはＷＯ２００２／０８６０７５，前出参照。
〔直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡＳ）〕
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸）の組込みを媒介する。
本発明のＯ−ｔＲＮＡの１例は配列番号７である。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表２と実施例５参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。ｔＲＮＡ分子では、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）に置換される。塩基に付加修飾を加えてもよい。本発明はＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、配列番号７のＯ−ｔＲＮＡと同様に機能し、ｔＲＮＡ Ｌ−形構造を維持するが、同一配列ではない（と共に野生型ｔＲＮＡ分子でもない）分子が挙げられる。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号，前出に記載されている。
例えば、所望ＲＳに対するその親和性を維持しながらｔＲＮＡの直交性を改善するために、本方法は夫々コグネイトシンテターゼの不在下と存在下の突然変異体サプレッサーｔＲＮＡライブラリーによるネガティブ選択とポジティブ選択を組合せる。ネガティブ選択では、セレクターコドンをマーカー遺伝子（例えばバルナーゼ遺伝子等の毒性遺伝子）の非必須位置に導入する。例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する突然変異ｔＲＮＡライブラリーのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化される（即ち宿主、例えば大腸菌シンテターゼに非直交性である）場合には、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）は抑圧され、産生された毒性遺伝子産物は細胞死に至る。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡをもつ細胞は生存する。その後、生存細胞をポジティブ選択し、セレクターコドン（例えばアンバーコドン）をポジティブマーカー遺伝子（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）に配置する
。これらの細胞はコグネイトＲＳをもつ発現ベクターも含む。これらの細胞を選択物質（例えばアンピシリン）の存在下に増殖させる。その後、同時発現したコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化することができ、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより認識することができないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく、（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ、（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡは両者選択後に生存している。
突然変異ｔＲＮＡのライブラリーを構築する。ｔＲＮＡの所望ループ（例えばアンチコドンループ（Ｄアーム、Ｖループ、ＴΨＣアーム）又はループ組合せ又は全ループ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに突然変異を導入することができる。ｔＲＮＡのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は始原細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングしてもよい。
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、アクセプターステム、Ｄアーム又はループ、可変ループ、ＴΨＣアーム又はループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするような突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループの突然変異が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡの３’末端への付加配列（ＣＣＡ）の付加を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
例えば、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ）をコードするポリヌクレオチドの非必須位置（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する位置）等にセレクターコドンを導入する。スクリーニング／選択は場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下に細胞集団を増殖させることにより実施される。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ ｖｉｖｏ抑圧（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス又はフレームシフト突然変異）に基づく選択システムを使用する。例えば、ポリヌクレオチド変異体（例えば所定位置にセレクターコドンを含むｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが直交性でない場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼを系で同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観察される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等程度の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主、例えば大腸菌シンテターゼに直交でないとき）には、セレクターコドンは抑圧され、産生される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死に至る。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。場合により、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子に２個以上のアンバーコドンを付加してもよい。生存細胞は例えば比較比細胞密度アッセイを使用することにより選択することができる。
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールをポジティブ選択し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下に細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡをもつ細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡは両者選択後に生存している。
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質（例えばアンピシリン）の濃度を変動させる。本発明の１側面では、初期回に所望活性を低くできるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期回には低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期回の選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者を複数回反復する。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者のマーカーを使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一とすることができる。
本発明では例えば非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を利用する例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を作製するために他の型の選択も使用できる。例えば、ポジティブ選択段階、ネガティブ選択段階又はポジティブ選択段階とネガティブ選択段階の両者はレポーターを使用することができ、レポーターは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により検出される。例えば、ポジティブ選択マーカー（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子）を使用し、ＣＡＴ遺伝子にセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）を付加してまずポジティブ選択を行った後にネガティブ選択スクリーニングを行い、別の遺伝子（例えばＧＦＰ）の転写を行うネガティブマーカー（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子）内の位置でセレクターコドン（例えば２個以上）を抑圧できないものを選択することができる。１態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカー
を同一ベクター（例えばプラスミド）に配置することができる。ネガティブマーカーの発現はレポーター（例えば緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ））の発現を誘導する。選択とスクリーニングのストリンジェンシーは変動させることができ、例えばレポーターを蛍光発光させるために必要な光強度を変動させることができる。別の態様では、ＦＡＣによりスクリーニングされるレポーターをポジティブ選択マーカーとして使用してポジティブ選択を行った後にネガティブ選択スクリーニングを行い、ネガティブマーカー（例えばバルナーゼ遺伝子）内の位置でセレクターコドン（例えば２個以上）を抑圧できないものを選択することができる。例えば本明細書の実施例４も参照。
場合により、レポーターを細胞表面、ファージディスプレイ等に提示する。細胞表面ディスプレイ（例えばＯｍｐＡ細胞表面ディスプレイシステム）は大腸菌細胞表面における特定エピトープ（例えば外膜ポリンＯｍｐＡに融合したポリオウイルスＣペプチド）の発現に依存する。エピトープは翻訳中に蛋白質メッセージ中のセレクターコドンが抑圧されるときにしか細胞表面に提示されない。従って、提示されるペプチドはライブラリー内の突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの１種により認識されるアミノ酸を含み、特定非天然アミノ酸を含むペプチドに対する抗体と共に対応するシンテターゼ遺伝子を含む細胞を分離することができる。ＯｍｐＡ細胞表面ディスプレイシステムはファージディスプレイの代法としてＧｅｏｒｇｉｏｕらにより開発され、改良された。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒ．，Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．＆ Ｇｅｏｒｇｏｉｕ，Ｇ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ
ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ．９０：１０４４４−８（１９９３）参照。
選択段階はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することもできる。その後、選択した成分（例えばシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込み用細胞に導入することができる。
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号，前出に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ
ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ＰＮＡＳ １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
〔資源及び宿主生物〕
本発明の糖蛋白質を生産するための翻訳成分は一般に非真核生物に由来する。例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏ
ｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の始原菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の始原菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物（例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ資源として使用することができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。直交ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は種々の宿主生物（例えば第２の生物）で使用することができる。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
〔セレクターコドン〕
本発明のセレクターコドンは非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を組込むように蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン、（例えばアンバーコドン又はオパールコドン等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。
６４種の遺伝コドンは２０種のアミノ酸と３種の終止コドンをコードする。翻訳終結には１個の終止コドンしか必要ないので、他の２個は主に非蛋白産生アミノ酸をコードするために使用することができる。アンバー終止コドンＵＡＧはｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成系とアフリカツメガエル卵母細胞で使用して非天然アミノ酸の組込みに成功している。３種の終止コドンのうちでＵＡＧは大腸菌での使用頻度が最も低い終止コドンである。大腸菌株にはＵＡＧを認識して天然アミノ酸を挿入する天然サプレッサーｔＲＮＡを含むものもある。更に、これらのアンバーサプレッサーｔＲＮＡは慣用蛋白質突然変異誘発でも使用されている。本発明の所定態様では、他の終止コドンを本発明で使用する。
１態様では、本方法は非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドン（例えばＵＡＧ）を認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、Ｏ−ＲＳにより所望非天然アミノ酸でアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは天然アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して終止コドン（例えばＴＡＧ）を蛋白質遺伝子内の該当部位に導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ
．５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，７９１−８０２（１９８８）参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び突然変異体遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ融合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質が得られる。
非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主（例えば大腸菌）にさほど影響を与えずに行うことができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンに結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを上げるか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。
非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸）はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えば、Ｋｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
セレクターコドンは更に４塩基以上のコドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン）も含む。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。例えば、アンチコドンループ（例えば少なくとも８〜１０ｎｔアンチコドンループ）をもつ突然変異Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば特殊フレームシフトサプレッサーｔＲＮＡ）の存在下では、４塩基以上のコドンは単一アミノ酸として読取られる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基以上のコドンをデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で多重非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，２３７−２４４（２００２）；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ
Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９（２００１）参照。
本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンを使用する。４塩基以上のコドンは例えば１個又は多数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，７９３９（１９９３）；及びＨｏｈｓａｋａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：
３４（１９９９）参照。２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡで２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４（１９９９）参照。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列を遺伝子に挿入するが、蛋白質に翻訳しない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）をポリペプチドに組込むために他の上記方法の代用又は併用としてトランス翻訳系を使用することができる。この系は大腸菌に存在するｔｍＲＮＡと呼ばれる分子を利用する。このＲＮＡ分子はアラニルｔＲＮＡと構造的に近縁であり、アラニルシンテターゼによりアミノアシル化される。ｔｍＲＮＡとｔＲＮＡの相違はアンチコドンループが特殊な大きい配列で置換されていることである。この配列はｔｍＲＮＡ内でコードされるオープンリーディングフレームを鋳型として使用し、停止している配列上でリボソームに翻訳を再開させることができる。本発明では、直交シンテターゼで優先的にアミノアシル化して非天然アミノ酸を負荷する直交ｔｍＲＮＡを作製することができる。この系を使用する遺伝子を転写することにより、リボソームは特定部位で停止し、非天然アミノ酸はこの部位に導入され、その後、直交ｔｍＲＮＡ内にコードされた配列を使用して翻訳が再開する。
所与系で、内在系が該当天然３塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）場合にセレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができる。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠失する系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び未完成非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２（２００２）も参照。他の関連文献は以下に挙げる。
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告ではカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対
である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．．４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発しようとして、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定であり、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生物機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして機能するに止まっている。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法はその直交ｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
〔非天然アミノ酸〕
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：

により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。
本発明の非天然アミノ酸は場合により側鎖のみが天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。他方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
本発明の糖蛋白質の生産には、式ＩにおいてＲが非天然アミノ酸を含む蛋白質と糖部分
を結合するように糖部分と結合した反応性基と反応することができる部分を含む非天然アミノ酸が特に重要である。適切なＲ基としては、例えばケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、アミノオキシ、アルケニル、アルキニル、カルボニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、チオエステル、ヒンダードエステル、ヒドロキシルアミン、アミン等、又はその任意組み合わせが挙げられる。所定態様では、非天然アミノ酸は光架橋基をもつ。
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：

の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
例えば、多数の非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）ベースとする。チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多重置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、メタ置換、オルト置換、及び／又はパラ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド基、ケト基等を含む。
非天然アミノ酸の具体例としては限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−
Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、下記又は本明細書の他の箇所に記載するもの等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は例えばＷＯ２００２／０８５９２３の図１７、１８、１９、２６及び２９に示される。
本発明の方法で使用するのに適した非天然アミノ酸としては、糖部分がアミノ酸側鎖に結合したものも挙げられる。１態様では、糖部分をもつ非天然アミノ酸としてはＭａｎ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、Ｆｕｃ、又はＧａｌ部分をもつセリン又はスレオニンが挙げられる。糖部分を含む非天然アミノ酸の例としては限定されないが、例えばトリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−セリン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−セリン、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、Ｇｌｃ−Ｌ−セリン、テトラアセチル−Ｇｌｃ−Ｌ−セリン、ｆｕｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−ｆｕｃ−Ｌ−セリン、Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−スレオニン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、トリ−アセチル−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニン、Ｇｌｃ−Ｌ−スレオニン、テトラアセチル−Ｇｌｃ−Ｌ−スレオニン、ｆｕｃ−Ｌ−スレオニン、トリ−アセチル−ｆｕｃ−Ｌ−スレオニン、Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−スレオニン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｇａｌ−セリン等が挙げられる。本発明は上記非天然アミノ酸の未保護形態とアセチル化形態を含む。ＷＯ２００３／０３１４６４Ａ２、発明の名称「ペプチドのリモデリングと糖結合（Ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」；及び米国特許第６，３３１，４１８号、発明の名称「糖組成物、その合成方法及び装置（Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」も参照されたい。
〔非天然アミノ酸の化学的合成〕
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により下記実施例の記載や当業者に公知の標準方法を使用して合成する。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸のその他の合成についてはＷＯ２００２／０８５９２３参照。
例えば、メタ置換フェニルアラニンはＷＯ２００２／０８５９２３に要約するような手順で合成される（例えば公報の図１４参照）。一般に、ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）をメタ置換メチルベンゼン化合物に加えてメタ置換臭化ベンジルを得た後にマロン酸化合物と反応させてメタ置換フェニルアラニンを得る。メタ位に使用される典型的置換基としては限定されないが、ケトン、メトキシ基、アルキル、アセチル等が挙げられる。例えば、３−アセチルフェニルアラニンはＮＢＳを３−メチルアセトフェノンの溶液と反応させることにより製造される。詳細については下記実施例を参照されたい。同様の合成を
使用して３−メトキシフェニルアラニンを製造する。その場合の臭化ベンジルのメタ位のＲ基は−ＯＣＨ３である。例えば、Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，３８，４６００−４６６９参照。
所定態様では、シンテターゼ（例えば直交ｔＲＮＡをアミノアシル化するために使用する直交ｔＲＮＡシンテターゼ）の活性部位に関する公知情報により非天然アミノ酸の設計を変更する。例えば、アミドの窒素を置換した誘導体（１）、γ位のメチル基（２）、及びＮ−Ｃγ−環状誘導体（３）の３種のグルタミン類似体が提供される。例えば活性部位Ｐｈｅ２３３から疎水性小アミノ酸への突然変異はＧｌｎのＣγ位の立体嵩増加により補完できるので、主要結合部位残基が酵母ＧｌｎＲＳに相同である大腸菌ＧｌｎＲＳのＸ線結晶構造に基づき、グルタミン側鎖から１０Å以内の残基の一連の側鎖突然変異を補完するように類似体を設計した。
例えば、Ｎ−ナフタロイル−Ｌ−グルタミン酸１，５−無水物（ＷＯ２００２／０８５９２３の図２３の化合物番号４）を場合により使用してアミドの窒素に置換基をもつグルタミン類似体を合成する。例えばＫｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆ Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９（１９４９）；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２（１９５９）；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら，Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４−［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０（１９８８）；及びＡｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆ Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ
Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５（１９９１）参照。前記無水物は一般にグルタミン酸から製造され、まずアミンをフタルイミドとして保護した後に酢酸中で還流させる。次に無水物を多数のアミンで開環し、アミドに各種置換基を付ける。フタロイル基をヒドラジンで脱保護すると、ＷＯ２００２／０８５９２３の図２３に示すような遊離アミノ酸が得られる。
γ位の置換は一般にグルタミン酸のアルキル化により実施される。例えばＫｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６（１９８９）参照。例えばＷＯ２００２／０８５９２３の図２４の化合物番号５に示すような保護アミノ酸は場合によりまずアミノ部分を９−ブロモ−９−フェニルフルオレン（ＰｈｆｌＢｒ）でアルキル化（例えばＣｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，１８５９−１８６６（１９８６）参照）した後、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルイソ尿素を使用して酸部分をエステル化することにより製造される。ＫＮ（Ｓｉ（ＣＨ３）３）２を加えてメチルエステルのα位を部位選択的に脱プロトン化してエノラートを形成した後、場合により各種ヨウ化アルキルでアルキル化する
。ｔ−ブチルエステルとＰｈｆｌ基を加水分解すると、所望γ−メチルグルタミン類似体（ＷＯ２００２／０８５９２３の図２４の化合物番号２）が得られた。
ＷＯ２００２／０８５９２３の図２５に化合物番号３で示すようなＮ−Ｃγ−環状類似体は場合により従来記載されているようにＢｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔ−Ｂｕから４段階で製造される。例えばＢａｒｔｏｎら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｄｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３，４２９７−４３０８（１９８７）及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５ ４６０２−７（１９９２）参照。Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ピロリジノン、ピロリジノン、又はオキサゾリドンのアニオンの生成後に図２５に示すような化合物７を加えるとマイケル付加物が得られる。次にＴＦＡで脱保護すると遊離アミノ酸が得られる。
上記非天然アミノ酸以外に、チロシン類似体ライブラリーも設計した。活性部位がＭ．ｊａｎｎａｓｈｉｉシンテターゼと高度に相同のＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造に基づき、チロシンの芳香族側鎖から１０Å以内の残基を突然変異させた（Ｙ３２，Ｇ３４，Ｌ６５，Ｑ１５５，Ｄ１５８，Ａ１６７，Ｙ３２及びＤ１５８）。これらの活性部位アミノ酸の一連の置換を補完するようにＷＯ２００２／０８５９２３の図２６に示すようなチロシン類似体ライブラリーを設計した。これらは種々の疎水性及び水素結合性を付与する各種フェニル置換パターンを含む。チロシン類似体は場合によりＷＯ２００２／０８５９２３（例えば公報の図２７参照）により示す一般ストラテジーを使用して製造される。例えば、場合によりナトリウムエトキシドを使用してアセトアミドマロン酸ジエチルのエノラートを生成する。その後、適当な臭化ベンジルを加えた後に加水分解することにより所望チロシン類似体を製造することができる。
〔非天然アミノ酸の細胞取込み〕
非天然アミノ酸取込みは例えば蛋白質に組込むために非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に検討される問題の１つである。例えば、αアミノ酸は電荷密度が高いのでこれらの化合物は細胞浸透性になりにくいと思われる。天然アミノ酸は種々の程度のアミノ酸特異性を示す一連の蛋白質輸送系を介して細菌に取込まれる。従って、本発明は非天然アミノ酸が細胞に取込まれる場合にどの非天然アミノ酸が取込まれるかを調べる迅速なスクリーニングを提供する。
例えば、種々の非天然アミノ酸を場合により最少培地で細胞毒性についてスクリーニングする。毒性は一般に（１）倍加時間の有意変化がない無毒性、（２）倍加時間の増加が約１０％未満である低毒性、（３）倍加時間の増加が約１０％〜約５０％である中毒性、（４）倍加時間の増加が約５０％〜約１００％である高毒性、及び（５）倍加時間の増加が約１００％を上回る極毒性の５分類に分類される。例えばＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ，ＵＳＡ ９６，４７８０−４７８５（１９９９）参照。一般に高毒性又は極毒性に分類されるアミノ酸の毒性をその濃度の関数として測定し、ＩＣ５０値を得る。一般に、天然アミノ酸の近縁類似体であるか又は反応性官能基を示すアミノ酸が最高毒性を示す。この傾向はこれらの非天然アミノ酸の毒性メカニズムが天然アミノ酸をプロ
セシングする必須酵素の蛋白質組込み又は阻害である可能性を示唆している。
毒性アミノ酸の可能な取込み経路を同定するためには、場合により例えば過剰の構造的に類似する天然アミノ酸を加えた培地でＩＣ５０レベルの毒性アッセイを繰返す。毒性アミノ酸では過剰の天然アミノ酸の存在は一般に毒素存在下の細胞の増殖能を補うが、これは天然アミノ酸が細胞取込み又は必須酵素との結合に関して毒素との競合を有効に解消するためであると予想される。これらの場合には、場合により毒性アミノ酸を可能な取込み経路に割り当て、細胞生存にその相補が必要な「致死対立遺伝子」と呼ぶ。これらの致死対立遺伝子は細胞が非毒性非天然アミノ酸を取込む能力をアッセイするのに極めて有用である。毒性対立遺伝子の相補は細胞増殖の回復により判断され、恐らく致死対立遺伝子に割り当てられると同一の取込み経路により非毒性アミノ酸が細胞に取込まれることを示唆している。相補の欠如については結論が出ていない。例えば、試験と結論については下記実施例を参照されたい。
（例えば下記実施例に記載するような）得られた結果は、致死非天然アミノ酸対立遺伝子の相補がアミノ酸取込みを定量的に試験するために効率的な方法であることを立証している。この方法は一般に多数の化合物を放射性標識するよりも手間がかからないので該当非天然アミノ酸の分析方法としてより有利な方法である。この一般ストラテジーは場合により核酸塩基類似体、糖質類似体又はペプチド類似体等の広範な分子の細胞取込みを迅速に評価するために使用される。例えば、このストラテジーは場合により本明細書に記載する非天然アミノ酸の細胞取込みを評価するために使用される。
本発明は非天然アミノ酸を送達するための一般方法として全アミノ酸取込み経路に独立した方法も提供する。この一般方法は細胞膜を通してジペプチドとトリペプチドを輸送するペプチドパーミアーゼによる取込みに依存する。ペプチドパーミアーゼはサホド側鎖特異的ではなく、その基質に対するＫＤ値はアミノ酸パーミアーゼのＫＤアミノ酸と同等であり、例えば約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭである。例えばＮｉｃｋｉｔｅｎｋｏら，Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤｐｐＡ，ａ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｄｅｐｅｐｔｉｄｅ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ／ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１６５８５−１６５９５（１９９５）及びＤｕｎｔｅｎ，Ｐ．，Ｍｏｗｂｒａｙ，Ｓ．Ｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，２３２７−３４（１９９５）参照。その後、非天然アミノ酸はリジン等の天然アミノ酸のコンジュゲートとして取込まれ、内在大腸菌ペプチダーゼの１種によるジペプチドの加水分解後に細胞質に放出される。このアプローチを試験するために、数種のＵｎｎ−Ｌｙｓ及びＬｙｓ−Ｕｎｎジペプチドを固相合成により合成し、これらのジペプチドの存在下と不在下にリジン最少培地でリジン生合成欠損大腸菌株の増殖を試験した。これらの細胞に利用可能な唯一のリジン源は非天然アミノ酸を含むジペプチドである。ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ペンタフルオロフェニルアラニン及びケージドセリンの取込みをこのように分析した。４例のいずれでも１０ｍＭ以上のジペプチド濃度で増殖が観察された。取込みは本明細書に記載する方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する別法は、アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産する生合成経路の提供である。
〔非天然アミノ酸の生合成〕
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、場合により新規酵素を付加するか又は既存大腸菌経路を改変することにより非天然アミノ酸の生合成経路を大腸菌で形成する。付
加新規酵素は場合により天然酵素でも人工的に作製した酵素でもよい。例えば（ＷＯ２００２／０８５９２３に記載するような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物からの公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこの遺伝子を含むプラスミドで細胞（例えば大腸菌細胞）を形質転換することにより細胞に導入することができる。遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。付加酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。場合により人工的に作製した酵素も同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
生合成経路で使用する新規酵素の生産方法又は既存経路を進化させる方法は種々のものが入手可能である。例えば場合により例えばＭａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（世界ウェブｗｗｗ．ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍ参照）により開発されたような再帰的組換えを使用して新規酵素及び経路を開発する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ １９９４，“Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３７０ Ｎｏ．４：Ｐｇ．３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，“ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９１：Ｐｇ．１０７４７−１０７５１参照。同様に、場合によりＧｅｎｅｎｃｏｒ（世界ウェブｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍ参照）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（登録商標）を代謝経路組換えに使用し、例えば大腸菌で非天然アミノ酸を生産するように経路を組換える。この技術は例えば機能ゲノミクスと分子進化及び設計により同定した新規遺伝子の組合せを使用して宿主生物で既存経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（世界ウェブｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍ参照）も例えば新規経路を創製するために遺伝子ライブラリーと遺伝子経路を迅速にスクリーニングするための技術を提供している。
一般に、本発明の生合成方法（例えばコリスミン酸からｐ−アミノフェニルアラニン（ｐＡＦ）を生産するための経路）は細胞で生産される他のアミノ酸濃度に影響を与えない。例えば、コリスミン酸からｐＡＦを生産するために使用される経路は細胞内でｐＡＦを生産するが、コリスミン細胞から一般に生産される他の芳香族アミノ酸の濃度は実質的に変わらない。一般に本発明の組換え生合成経路で生産される非天然アミノ酸は効率的蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他のアミノ酸の濃度を変化させたり細胞資源を枯渇させる程にはならない。こうしてｉｎ ｖｉｖｏ生産される典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するために使用される遺伝子を含むプラスミドで細菌を形質転換し、２１番目のアミノ酸（例えばｐＡＦ、ｄｏｐａ、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン等）を作製したら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両者に合うように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
〔核酸及びポリペプチド配列変異体〕
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物と方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する（表２、例えば配列番号１〜１０参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書（例えば実施例）に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする）多数の非関連配列も提供する。
本発明はポリペプチド（例えばＯ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ）
、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の非天然アミノ酸を組込んだポリペプチド又は蛋白質が挙げられる。本発明のポリペプチドは更に人工ポリペプチドを含み、例えば（ａ）配列番号４〜６のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号８〜１０のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異を含むアミノ酸配列が挙げられる。本発明の人工ポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供される。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含む。
本発明のポリヌクレオチドとしては１個以上のセレクターコドンを含む本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは配列番号８、８、もしくは１０のいずれか１種、又はその保存変異体を含むポリヌクレオチドも含む。本発明のポリヌクレオチドは配列番号１〜６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。人工ポリヌクレオチドとは天然に存在しない人造ポリヌクレオチドである。
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを導入する。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結したプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列にハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
〔保存変異〕
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することは自明である。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸１個を欠失するか、アミノ酸１個が付加されるか、又はアミノ酸１個が化学的に類似するアミノ酸１個で置換される場合には、これらの改変は「保存改変変異」である。従って、本発明のポリペプチド配列の「保存変異」としては、糖部分を結合するアミノ酸を含む保存的非天然アミノ酸及び／又は同一保存置換基の糖部分を含む非天然アミノ酸でポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％
未満、より一般には２％又は１％未満を置換する場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知である。相互に「保存置換」を含む天然アミノ酸を含むグループの例を以下に示す。

〔核酸ハイブリダイゼーション〕
比較ハイブリダイゼーションを使用して本発明の核酸の保存変異を含む本発明の核酸（例えば配列番号７、８、９、又は１０）を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好適な方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号７、８、９、又は１０に示す核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブにハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言う。
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １）及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
サザン又はノーザンブロットでフィルター上で１００を越える相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションである。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には
高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄でバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで非関連プローブに観測されるよりも５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験に関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、種々の環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、総合選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。例えばマッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択する。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の趣旨では、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す条件である。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を漸増させることにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
〔ユニークサブ配列〕
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択さ
れる核酸にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は公知ポリペプチド配列の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを得るために例えば突然変異させた親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
〔配列比較、一致度及び相同度〕
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在することが好ましく、少なくとも約１００残基長の配列の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、入手可能な任意突然変異誘発法により任意天然核酸を改変し、１個以上のセレクターコドンを加えることができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。もっと高いレベルの配列類似度、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＩＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
配列比較及び相同性決定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比
較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ＆ ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）。
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
〔突然変異誘発及び他の分子生物学技術〕
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出；及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えば直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む本発明の糖蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、例えば非天然アミノ酸（例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸又は糖部分を含む非天然アミノ酸）をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の利用可能な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を実施することができる。
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び例えば糖部分を結合することができる部分を含む非天然アミノ酸（例えばアルデヒド又はケト誘導体化アミノ酸）又は糖部分を含む非天然アミノ酸で誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７）、及び／又は同等物の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基
本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ参照）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ参照）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
組換え宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞を場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸分離のための）例えば細胞分離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
〔キット〕
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも糖部分を含む糖蛋白質の製造用キットが提供され、キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを含む。１態様では、キットは更に糖部分をもつ非天然アミノ酸、又は糖部分を結合するための部分をもつ非天然アミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に糖蛋白質を製造するための説明書を含む。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
〔ケト官能基を蛋白質に組込むためのシステム〕
本実施例はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造し、この非天然アミノ酸を蛋白質に組込むためのシステムについて記載する。
殆どの公知生物の遺伝コードは蛋白質生合成の構成単位として同一の２０種の標準アミノ酸をコードする。稀なケースではセレノシステイン（例えばＢｏｃｋ，Ａ．ら，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：５１５−５２０参照）又はピロリジン（例えばＳｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｇ．ら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４５９−１４６２；Ｈａｏ，Ｂ．ら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４６２−１４６６参照
）が加わる。標準アミノ酸の側鎖は驚くほど少数の官能基−−窒素塩基、カルボン酸及びアミド、アルコール及びチオール基と、残余の単純なアルカン又は疎水性基からなる。遺伝的にコードされるアミノ酸に新規アミノ酸（例えば金属キレート性、蛍光、レドックス活性、光活性又はスピン標識側鎖をもつアミノ酸）を付加することができるならば、蛋白質の構造と機能及び恐らく生体自体の操作可能性が著しく増すと考えられる。最近、本発明者らは大腸菌の翻訳機構に新規成分を付加することにより、多数の非天然アミノ酸を高い忠実度で蛋白質に部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができたと報告した（例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１８３６−１８３７；及びＺｈａｎｇ，Ｚ．ら（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４１：２８４０−２８４２参照）。本実施例はケト含有アミノ酸を生物（例えば大腸菌）の遺伝コードに付加するためにこのアプローチを拡張できることと、ケト基のユニークな反応性を使用して多様な物質で蛋白質を選択的にｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾できることを立証する。
ケト基は有機化学で遍在性であり、付加反応からアルドール縮合に至る多数の反応に関与している。更に、ケト基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下にヒドラジド及びヒドロキシルアミン誘導体で選択的に修飾することができる。例えばＣｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；及びＭａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８参照。この重要な官能基は補因子（例えばＢｅｇｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．ら（１９９７）ｉｎ Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．．ｅｄｓ．Ｌｅｅｐｅｒ，Ｆ．Ｊ．＆ Ｖｅｄｅｒａｓ，Ｊ．Ｃ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｖｏｌ．１９５，ｐｐ．９３−１４２参照）や代謝産物（例えばＤｉａｚ，Ｅ．ら（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６５：５２３−５６９参照）に存在し、更に蛋白質の翻訳後修飾基として（例えばＯｋｅｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｄｏｎｋ，Ｗ．Ａ．（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：Ｒ１５９−Ｒ１７１参照）存在するが、標準アミノ酸の側鎖には存在しない。この官能基を大腸菌でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンとして遺伝的にコードするために、アンバーナンセンスコドン（のみ）に応答してこのアミノ酸を大腸菌で蛋白質に部位特異的に挿入することが可能なｔＲＮＡ−シンテターゼを開発した。重要な点として、このｔＲＮＡ−シンテターゼ対は２０種の標準アミノ酸のその対応部分に直交性であり、即ち、直交シンテターゼ（のみ）が直交ｔＲＮＡ（のみ）を非天然アミノ酸でのみアミノアシル化し、得られるアシル化ｔＲＮＡはアンバーコドンのみに応答して非天然アミノ酸を挿入する。
〔材料と方法〕
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造：Ｆｍｏｃ−４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から購入した。この化合物（１．０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）にピペリジン４ｍＬ（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％）を加えて２時間室温で撹拌した。溶媒を蒸発させると、白色粉末が得られた。次に固形分を冷水（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１０ｍＬに再懸濁し、上清を濾取した。分取逆相ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ Ｃ１８，Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して所望生成物を反応混合物から分離した（０．１％ＴＦＡ添加Ｈ２Ｏ中５→３０％ＣＨ３ＣＮを使用して３０分間）。溶出液（ｔＲ＝１２分）を凍結乾燥すると、白色固体が得られた（０．４５ｇ，８８％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，５．４Ｈｚ），３．２（ｍ，２Ｈ），２．７（ｓ，３Ｈ）．ＭＳエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）：Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ３計算値［Ｍ＋１］＋２０８．０９，実測値（ＥＳＩ）：２０８．４７。
ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンの合成（例えばＣｌｅｌａｎｄ，Ｇ．Ｈ．（１９６９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３４：７４４−７４７参照）：Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（１８．５ｇ，１０５ｍｍｏｌ）を４−メチルアセトフェノン（１３．４ｇ，１００ｍｍｏｌ）の四塩化炭素（４００ｍＬ）溶液に撹拌下に加えた後、２’，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（０．４３ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加えた。次に反応混合物を４時間加熱還流した。反応（ＴＬＣ：８：１／ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）の完了後、溶液を水（１×１００ｍＬ）、１ＭＨＣｌ水溶液（３×１００ｍＬ）、０．５％ＮａＨＣＯ３水溶液（３×１００ｍＬ）及びブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせて無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させると、黄色固体が得られ、ヘキサンで再結晶させると、所望１−（４−ブロモエチル−フェニル）エタノンが固体として得られた（１６．８ｇ，７８％）。ペンタンで洗浄したナトリウム片（２．３ｇ，０．１ｍｏｌ）に無水エタノール（５０ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で１５分間滴下し、溶液を更に１５分間撹拌した。次に固体アセトアミドマロン酸ジエチル（２．７ｇ，１０ｍｍｏｌ）を撹拌下に３０分間加えた後に、無水エタノール中１−（４−ブロモエチル−フェニル）エタノン（２．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）を９０分間滴下した。混合物を一晩加熱還流し、冷却した後、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）と水（１００ｍＬ）を溶液に加えた。有機層を分離し、０．５％ＮａＨＣＯ３（３×１００ｍＬ）とブライン（１×１００ｍＬ）で順次洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒を減圧除去すると、茶色ガム状固体が得られた。ヘキサン−ジクロロメタン（４：１）を残渣に加え、不溶性材料を濾別し、１０：１ジクロロメタン−ベンゼンで十分に洗浄すると、２−アセチルアミノ−２−（４−アセチル−ベンジル）マロン酸ジエチルエステルが黄色固体として得られた（３．３ｇ，９５％粗収率）。この化合物にジオキサン中４Ｍ ＨＣｌを加えて一晩撹拌した。次に混合物を蒸発乾涸し、水で再結晶させると、ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン（１３．２ｇ，６４％総収率）が白色固体として得られた。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，５．４ＨＺ），３．３０（ｍ，２Ｈ），２．６８（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ１９５．８，１７４．３，１４５．９，１３３．１，１２８．９，１２７．８，６０．２，３８．３，２６．５。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ３計算値［Ｍ＋１］＋２０８．０９，実測値２０８．０７。
突然変異体シンテターゼ進化：ポジティブ選択では、プラスミドｐＹＣ−Ｊ１７を使用し、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子と、Ａｓｐ１１２にＴＡＧ終止コドンをもつクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を発現させた。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照。ｐＹＣ−Ｊ１７を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞にチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）ライブラリーをコードするスーパーコイルＤＮＡを形質転換した。１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含有する最少培地（ＧＭＭＬ）プレートに１７μｇ／ｍＬテトラサイクリン、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、６０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び１ｍＭ ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを添加し、細胞をプレーティングした。３７℃で４０時間インキュベーション後にコロニーをプールし、プラスミドを単離した。ゲル電気泳動を使用して突然変異体シンテターゼをコードするプラスミド（ｐＢＫプラスミド）をｐＹＣ−Ｊ１７から分離し、ネガティブ選択用ｐＬＷＪ１７Ｂ３を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に形質転換した。プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３はｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを発現し、アラビノースプロモーターの制御下にＧｌｎ２、Ａｓｐ４４、及びＧｌｙ６５に３個のアンバーコドンをもつバルナーゼ遺伝子を発現する。０．２％アラビノース、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、及び３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートで形質転換細胞を増殖させた。８時間後に細胞をプレートから取出し、ｐＢＫプラスミドを更に数回の選択で精製した。２回目と３回目のポジティブ
選択では、クロラムフェニコールの濃度を夫々８０及び１００μｇ／ｍＬに増加した。３回のポジティブ選択と２回のネガティブ選択を交互に行った後に、ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＴアッセイでｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの不在下に９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールと、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下に１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールのＩＣ５０値を示す１１個の突然変異体ＴｙｒＲＳが同定された。例えばＷａｎｇ，Ｌ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０参照。各突然変異体ＴｙｒＲＳのコドン使用は異なるが、これらの突然変異体ＴｙｒＲＳの蛋白質配列は３個の独立クローンＬＷ１、ＬＷ５及びＬＷ６で収束した。
蛋白質発現及び精製：プラスミドｐＬＥＩＺを使用してバクテリオファージＴ５プロモーターとｔ０ターミネーターの制御下に７位にアンバーコドンとＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ６タグをもつＺドメイン遺伝子を発現させ、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子を発現させた。クローンＬＷ１から単離された突然変異体シンテターゼ遺伝子（ＬＷ１ＲＳ）は構成的大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下にプラスミドｐＢＫＬＷ１ＲＳでコードされた。１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含有する最少培地（ＧＭＭＬ培地）に２５μｇ／ｍＬカナマイシン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び１．０ｍＭ ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンを添加し、ｐＬＥＩＺとｐＢＫ−ＬＷ１ＲＳで共形質転換した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を増殖させた。細胞がＯＤ６００＝０．５に達したら、イソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を添加して蛋白質発現を誘導した。５時間後に細胞をペレット化し、製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って変性条件下に蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次に蛋白質をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で脱塩し、水中溶出させた。蛋白質収率をブラッドフォードアッセイ（ＢＣＡ ｋｉｔ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により測定した。蛋白質アリコートをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と質量分析に使用した。
フルオレセインヒドラジドとビオチンヒドラジドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質修飾：精製野生型（ｗｔ）及び突然変異体Ｚドメイン蛋白質をリン酸緩衝食塩水（１００ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ６．５，０．５Ｍ塩化ナトリウム）で透析により交換した。フルオレセインヒドラジド１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）又はビオチンヒドラジド２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をＤＭＦに溶かし、シランコーティングエッペンドルフチューブに入れた各蛋白質０．０７μｍｏｌに終濃度１ｍＭまで添加した。最終容量０．５ｍｌまでＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加えた。反応混合物を２５℃に１８時間維持した。ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して未反応色素又はビオチンを蛋白質から除去し、蛋白質をＰＢＳ緩衝液で溶出させた。標識効率を測定するために、溶出した蛋白質試料を次に逆相ＨＰＬＣにより分析した（ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ−Ｃ１８，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，流速１．０ｍＬ／分，水性５０ｍＭ酢酸トリエチルアミン緩衝液，ｐＨ７．０中１０→４０％ＣＨ３ＣＮを使用して７０分間，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。無標識突然変異体Ｚドメインの保持時間（ｔＲ）は３９．３分であり、フルオレセインヒドラジド標識突然変異体ＺドメインのｔＲは４０．７分であり、ビオチンヒドラジド標識突然変異体ＺドメインのｔＲは４０．９分であった。
蛍光スペクトル測定：全蛍光発光スペクトルは励起４９０ｎｍ；夫々励起及び発光帯域４ｎｍ及び４ｎｍ；光電子増倍管電圧９５０Ｖ；及び走査速度１ｎｍ／秒でＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２スペクトロフルオロメーター（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）を使用して記録した。各標識蛋白質１０ｎｇを使用した。報告するスペクトルは３回の走査の平均を表す。
〔結果と考察〕
ケトアミノ酸：ケト基はカルボニル基又は酸性Ｃα位への付加反応に関与することができるため、２０種の標準アミノ酸には存在しないユニークな化学反応性を提供する。この基は多様な化学試薬による蛋白質の選択的修飾で天然アミノ酸システインに代用できる。システインの反応性チオール基は種々の生体物理学的プローブを蛋白質に結合するために広く使用されている。例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３１：８３−１０６；Ａｌｔｅｎｂａｃｈ，Ｃ．ら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０８８−１０９２；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｇｉｕｌｉａｎｏ，Ｋ．Ａ．ら（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５−４３４；Ｍａｎｎｕｚｚｕ，Ｌ．Ｍ．ら，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：２１３−２１６；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ａ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２；Ｌｌｏｐｉｓ，Ｊ．ら，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７：５４６−５６４；及びＧａｉｅｔｔａ，Ｇ．ら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５０３−５０７参照。しかし、蛋白質には反応性基が２個以上存在することと、ジスルフィド結合を使用する場合に遊離チオールの存在下で生じる交換反応により、単一システイン残基の標識は困難なことが多い。そこで、直交反応性をもつ非蛋白質産生アミノ酸を利用できるならば、単一システインを選択的に標識できない場合や、２種の異なるラベルが必要な場合にも蛋白質の選択的修飾が可能になる。ケトは水溶液中で温和な条件下にヒドラジド、ヒドロキシルアミン、及びセミカルバジドと容易に反応し、夫々生理条件下で安定なヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン結合を形成する。例えばＪｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１：４７５−４８１；ａｎｄ，Ｓｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９参照。
カルボニル基をペプチド及び小蛋白質に選択的に組込むために数種の方法が開発されている。まず、Ｎ末端セリン又はスレオニンを過ヨウ素酸塩で酸化することによりペプチドのＮ末端にアルデヒドが導入された。アルデヒド基はビオチン及び蛍光レポーター（例えば、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６参照）又はヒドラゾン結合を介してＣＯＯＨ末端ヒドラジドを含む蛋白質フラグメントとカップリングされた（例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ，Ｈ．Ｆ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０参照）。しかし、この方法により導入されるカルボニル基はＮ末端に限られており、蛋白質は酸化に対して安定でなければならない。その後、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用してヒドラジド又はヒドロキシルアミンを含むペプチドセグメントを製造した後に分枝鎖アルデヒドコアマトリックスと反応させてペプチドデンドリマーを形成したり（例えばＳｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９；及びＲｏｓｅ，Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３０−３３参照）、ケト含有ペプチドセグメントと反応させて合成蛋白質を形成する方法が実施されている（例えばＣａｎｎｅ，Ｌ．Ｅ．ら，（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：２９９８−３００７参照）。ＳＰＰＳは蛋白質全体にケト基を導入することができるが、大型のペプチド又は蛋白質の合成に伴う固有の問題がある。このサイズの制約は場合によっては、合成ペプチドを組換え蛋白質のＣＯＯＨ末端に化学的にライゲーションする発現蛋白質ライゲーション（ＥＰＬ）により解決することができる。例えばＭｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ
Ａ ９５：６７０５−６７１０参照。ケトン基を含むペプチドがＳＰＰＳにより製造され、Ａｂｅｌｓｏｎ蛋白質チロシンキナーゼのＳｒｃホモロジー３ドメインとライゲーションされている。例えばＡｙｅｒｓ，Ｂ．ら，（１９９９）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ５１：３４３−３５４参照。
ケト基を蛋白質に組込むためにｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法も使用されている。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１参照。この方法では、ケト基を含む非天然アミノ酸をアンバーサプレッサーｔＲＮＡに化学的にアシル化する。蛋白質生合成を補助することが可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出液中でアシル化ｔＲＮＡと突然変異体遺伝子を融合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が選択的に組込まれる。この方法はサプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸で化学的にｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化する必要があり、アシル化ｔＲＮＡが翻訳中に化学量論的試薬として消費され、再生できないため、蛋白質収率が低い。ｐ−アセチル−Ｌフェニルアラニンに対して特異性をもつ直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を開発することにより、例えばＵＡＧコドンに応答して生きた大腸菌細胞でケトアミノ酸を蛋白質に直接組込むことができる。生物（例えば大腸菌）で発現させることができる限り、ターゲット蛋白質にサイズ制約はなく、多量の突然変異体蛋白質を発現させることができると考えられる。更に、標識試薬が細胞浸透性で非毒性である限り、ラベルを全細胞に選択的に導入できると考えられる。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対して特異性をもつ突然変異体シンテターゼの進化：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と突然変異体チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）を直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の作製用出発点として使用した。従来、この対は大腸菌で直交性であることが示されている。例えば、Ｗａｎｇ，Ｌ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０；及びＷａｎｇ，Ｌ．ら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５０１０−５０１１参照。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを負荷し、２０種の標準アミノ酸を負荷しないようにＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を変化させるために、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製し、スクリーニングした。相同Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造（例えば、Ｂｒｉｃｋ，Ｐ．ら（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：８３−９８参照）を使用して結合チロシンのアリール環のパラ位から６．５Å以内にある残基を同定した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の対応する残基（Ｔｙｒ３２，Ｇｌｕ１０７，Ａｓｐ１５８，Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕｌ６２）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりランダムに突然変異させ、１．６×１０９のサイズのライブラリーを作製した（例えば、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照。このＴｙｒＲＳ突然変異体ライブラリーをまず大腸菌に導入したプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（例えば、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照）上でコードされるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須位置（Ａｓｐ１１２）におけるアンバー終止コドンの抑圧に基づき、１ｍＭ ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下にポジティブ選択にかけた。クロラムフェニコール中で生存する細胞はｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを標準アミノ酸又はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンでアミノアシル化する突然変異体シンテターゼをコードするはずである。そこで、突然変異体シンテターゼをコードするＤＮＡを単離し、（プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３上でコードされる）許容部位に３個のアンバーコドンを含む毒性蛋白質バルナーゼ遺伝子を発現するネガティブ選択株に形質転換した。ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡに天然アミノ酸を負荷する突然変異体シンテターゼをコードする細胞はバルナーゼを産生し、死滅する。ネガティブ選択では増殖培地にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを添加しなかったので、生存細胞は非天然アミノ酸に対して特異性をもつシンテターゼをコードするはずである。クロラムフェニコール濃度を増加しながらポジティブ選択３回とネガティブ選択２回を交互に行った後に、クロラムフェニコール中での生存がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの添加に依存する多数のクローンが出現した。ＣＡＴ遺伝子内のＡｓｐ１１２ＴＡＧコドンの抑圧に基づくｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してこれらのＴｙｒＲＳを
特性決定した。例えばＷａｎｇ，Ｌ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０参照。１１個のＴｙｒＲＳ突然変異体が同定された。選択したシンテターゼとｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを発現する細胞は１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含有する最少培地プレート（ＧＭＭＬプレート）でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの不在下では９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで生存し、この非天然アミノ酸の存在下では、細胞はＧＭＭＬプレートで１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で生存した。この結果は選択した突然変異体シンテターゼが天然アミノ酸よりもｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対して高い活性をもつことを示唆している。これらの突然変異体のＤＮＡを配列決定した処、アミノ酸のコドン使用は異なるが、蛋白質レベルでは３個の独立した突然変異体（ＬＷ１，ＬＷ５，及びＬＷ６）で収束することが判明した。突然変異体シンテターゼの活性部位突然変異を表１に示す。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同ＴｙｒＲＳの結晶構造によると、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ Ｔｙｒ３２及びＡｓｐ１５８の保存側鎖は基質チロシンのヒドロキシル基と水素結合を形成すると思われる。突然変異体シンテターゼではＴｙｒ３２はＬｅｕ又はＡｌａに突然変異し、Ａｓｐ１５８はＧｌｙ１５８に突然変異している。これらの突然変異はチロシンの結合に不利であると同時にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのメチル基を受用する余地ができると思われる。突然変異体のＸ線結晶構造を決定することにより、これらの突然変異体の厳密な役割が解明されると思われる。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだ突然変異体蛋白質の特性決定：進化型シンテターゼとｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡがｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを蛋白質に選択的に組込む能力を試験するために、ＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ６タグを付けたブドウ球菌プロテインＡ（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：１０７−１１３参照）のＺドメインの遺伝子の許容部位（Ｌｙｓ７）をアンバー終止コドンに置換した。Ｚドメインは分子量約７．９ｋＤであるので、その質量はイオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析を使用して非常に高確度で測定することができる。ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ、ＬＷ１ＲＳ及びＺドメイン遺伝子（Ｌｙｓ７ＴＡＧ）で形質転換した細胞を１ｍＭ ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンの存在下に増殖させた。非天然アミノ酸の添加は細胞の増殖速度に影響しなかった。突然変異体蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製すると、総単離収量は最少培地中３．６ｍｇ／Ｌであった。比較のために、突然変異体ＴｙｒＲＳの代わりに野生型（ｗｔ）ＴｙｒＲＳを使用した処、Ｚドメインの収量は最少培地中９．２ｍｇ／Ｌであった。ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ又はＬＷ１ＲＳの不在下ではＺドメインは得られず、この部位への非天然アミノ酸組込みの忠実度が非常に高いことが判明した。他の蛋白質（例えばＣｄｃ４２）へのｐ−アセチル−Ｌフェニルアラニンの組込みにも成功した。
ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＷＴ ＴｙｒＲＳにより発現されたｗｔ Ｚドメイン蛋白質と、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＬＷ１ＲＳにより発現された突然変異体Ｚドメイン蛋白質の両者をエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）により分析した。ｗｔ Ｚドメイン蛋白質では、無傷の蛋白質と、最初のメチオニンをもたない蛋白質と、最初のメチオニンをもたない蛋白質のアセチル化形態に対応する質量の３個のピークが観察された（Ｎ末端トリプシン消化ペプチドフ
ラグメントのタンデム質量分析により確認）。突然変異体Ｚドメイン蛋白質では、無傷の蛋白質の実験モノアイソトピック質量は７９４９．８９３Ｄａであり、理論質量７９４９．８７４Ｄａから２．２ｐｐｍ以内であった。他の２個のピークは夫々最初のメチオニンをもたない蛋白質（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８１８．８３８Ｄａ，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８１８．８３３Ｄａ）とそのアセチル化形態（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８６０．８４３Ｄａ，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８６０．８４４Ｄａ）に対応する。アンバーコドン位置に他のアミノ酸をもつ突然変異体蛋白質に対応するピークはスペクトルに観察されなかった。無傷の蛋白質質量スペクトルに観察された１５００を上回るシグナル対ノイズ比はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの組込みの忠実度が９９．８％を上回ることを意味する。トリプシン消化物の液体クロマトマグラフィータンデム質量分析を実施し、ＮＨ２末端ペプチドの配列を確認した。ＮＨ２末端トリプシン消化ペプチドＭＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮＫの二重負荷分子イオンに対応する６０６．２３Ｄａの前駆体イオンを単離し、イオントラップ質量分析計（ＩＴＭＳ）で断片化した。フラグメントイオン質量は明確に割当られ、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的組込みが確認された。これらの結果が明白に示すように、進化型シンテターゼはｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡと協同して天然アミノ酸ではなくｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを他の位置ではなくアンバーコドンによりコードされる位置に組込む。
フルオレセインヒドラジドによる部位特異的蛋白質修飾：次に、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのケト基がｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的蛋白質修飾の化学的ハンドルとして機能できるか否かを調べた。精製突然変異体ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンＺドメイン蛋白質（突然変異体Ｚドメイン）とｗｔ Ｚドメイン蛋白質をリン酸緩衝液中１ｍＭフルオレセインヒドラジド（スキーム１で２５℃にて１８時間処理した。反応後に蛋白質をサイズ排除クロマトグラフィーにより過剰のフルオレセインヒドラジドから分離し、ドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。まずゲルを蛍光イメージングシステムでイメージングした後、銀染色した。突然変異体Ｚドメインのバンドは蛍光シグナルを示すが、ｗｔ Ｚドメインから蛍光を検出することはできない。これらの２種の蛋白質のアリコートを使用して４９０ｎｍ励起で蛍光スペクトルを測定した。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含むＺドメイン蛋白質のみがフルオレセインに類似する蛍光スペクトルを示す。ｗｔ Ｚドメインに蛍光シグナルは検出されないことから、ヒドラジドとケトンの間のみに標識反応が生じ、ｗｔ蛋白質に官能基は存在しないことが分かった。標識産物を四重極型飛行時間質量分析（ＱＴＯＦ ＭＳ）で分析した。８４２５．１６０Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８４２４．９５８Ｄａ）の実験モノアイソトピック質量が得られ、フルオレセインヒドラジドは突然変異体Ｚドメイン蛋白質とモル比１：１で反応したことが確認された。標識の程度を調べるために、反応混合物を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離した。標識Ｚドメインのピーク面積と未標識Ｚドメインのピーク面積の比は９０±５％であった。
ビオチンヒドラジドによる部位特異的蛋白質修飾：このアプローチの汎用性を立証するために、Ｚドメインを更にビオチンヒドラジド誘導体（構造Ｃ）で標識した。精製突然変異体及びｗｔ Ｚドメインをリン酸緩衝液中１ｍＭビオチンヒドラジドで２５℃にて１８
時間処理した。リン酸緩衝液で透析して過剰のビオチンヒドラジドを除去した後、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。分離した蛋白質をニトロセルロース膜に転写し、ビオチン特異的アビジン−ＨＲＰコンジュゲートでプローブした。予想通り、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのみが検出され、ビオチンヒドラジドで標識されたことが判明した。ｗｔ Ｚドメインにシグナルは観察されなかった。フルオレセイン標識実験で記載したようにＨＰＬＣ分析により標識効率を測定した処、８０±１０％であった。標識蛋白質はＱＴＯＦ ＭＳ（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝８４１６．２３６，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８４１６．１４６Ｄａ）によりビオチンヒドラジド１分子と突然変異体Ｚドメイン１分子から形成された産物であることが確認された。これらの実験はｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質修飾に対するケトンハンドルの優れた特異性を立証するものである。
要するに、新規化学官能基であるケト基を蛋白質に部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込んだ。この官能基はケト基とヒドラジド誘導体の特異的化学反応により例えばフルオレセインとビオチンで選択的且つ効率的にｉｎ ｖｉｔｒｏ標識することができる。このアプローチを使用すると、蛋白質構造及び機能のプローブとして利用するため、触媒もしくは治療特性を強化した蛋白質を作製するため、又は蛋白質を使用するバイオアッセイを実施するために、多様な他のヒドラジド又はヒドロキシルアミン誘導体（糖類、スピンラベル、金属キレート剤、架橋剤、ポリエーテル、脂肪酸及び毒素など）で蛋白質を選択的に標識することができる。ユニークな化学的ハンドルを生きた細胞で蛋白質に直接部位特異的に組込むことができるならば、分子分解時の蛋白質局在、蛋白質移動及び蛋白質のコンホメーション変化のｉｎ ｖｉｖｏイメージングのために小分子フルオロフォアで蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ修飾が可能になる。この技術により大腸菌中でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む蛋白質をフルオロフォアでｉｎ ｖｉｖｏ標識することもできる。
参考資料として本明細書に組込む２００３年１０月１５日付け対応出願、発明の名称「ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（ＳＩＴＥ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＫＥＴＯＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＩＮＴＯ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」（代理人整理番号５４Ａ−０００１７０ＰＣＴ）も参照されたい。
〔メタ−チロシン類似体のｉｎ ｖｉｖｏ組込み〕
ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ（ＷＯ２００２／０８５９２３の実施例１に記載）をメタ−チロシン類似体でアミノアシル化するために直交ＴｙｒＲＳを作製した。
突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリープラスミドの作製：ＷＯ２００２／０８５９２３の実施例１に記載されている方法にほぼ従い、メタ置換チロシン誘導体に特異的な突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｒｙＲＳをコードするプラスミドライブラリーを構築した。要約すると、上記実施例１に記載したようにＮＮＫコドンスキームを使用してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造中の結合チロシンのアリール環のメタ位から６．９Å以内にあるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の６個の残基（Ｔｙｒ３２、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、Ａｌａ１６７）をＤＮＡレベルで全２０種のアミノ酸に突然変異させた。構築したプラスミドライブラリーｐＢＫ−ｌｉｂは約１×１０９個の独立クローンを含んでいた。
ｍ−アセチルフェニルアラニンの組込み用直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の進化：ポジティブ選択３回とネガティブ選択２回を行った後に、クロラムフェニコール中での生存が非天然アミノ酸の添加に依存する５個の候補クローン（ＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号１７〜２１及びＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号４９〜５３）が出現した。ｍ−アセチルフェニルアラニンの不在下では、３種の突然変異体ＴｙｒＲＳプラスミドのうちの１種を導入した細胞のクロラムフェニコール耐性のＩＣ５０は２０μｇ／ｍｌである。ｍ−アセチルフェニルアラニンの存在下では、同一細胞のクロラムフェニコール耐性のＩＣ５０は１００μｇ／ｍｌである。これらの２つの数値に大差があるのは選択したシンテターゼが細胞内で天然アミノ酸よりもｍ−アセチルフェニルアラニンを特異的に組込むことができるためである。ｍ−メトキシフェニルアラニンのデータも同様であり、５個のクローンを単離した（ＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号２２〜２６とＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号５４〜５８）。
非天然アミノ酸を組込んだＤＨＦＲの蛋白質発現：上記で選択したｍ−メトキシフェニルアラニン及びｍ−アセチルフェニルアラニンシンテターゼを使用してＷＯ２００２／０８５９２３の実施例１に記載したようにアンバーコドンに応答してＤＨＦＲに該当非天然アミノ酸を組込ませた。陰性対照として、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対とＤＨＦＲをコードするアンバー突然変異体ベクターの両者を導入した細胞を非天然アミノ酸の不在下に増殖させた。蛋白質発現の結果をＷＯ２００２／０８５９２３の図１０に示す。これらの結果から、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対は非天然ｍ−メトキシフェニルアラニン及びｍ−アセチルフェニルアラニンを特異的に組込むことが明白に立証された。ＤＨＦＲ蛋白質の発現収率はどちらの場合も約０．５ｍｇ／Ｌ培養液であった。
１態様では、化合物（例えばヒドラジド誘導体）を使用して蛋白質を少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばメタ−チロシン類似体）でｉｎ ｖｉｖｏ標識することができる。
〔糖蛋白質ミメティクスの合成〕
ユニークな反応性をもつ非蛋白産生官能基を利用できるならば、蛋白質の選択的化学修飾は非常に容易になる。ケト基はこのような化学的ハンドルであり、天然アミノ酸の側鎖には存在せず、標準アミノ酸の存在下に温和な条件下でヒドラジド及びヒドロキシルアミン誘導体と容易且つ選択的に反応する。例えばＣｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗら，（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１とその引用文献参照。ケト基は固相ペプチド合成によりペプチドに挿入されており、求核性糖誘導体とカップリングしてネオ糖ペプチドが構築されている。例えばＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅ．Ｃ．ら，（１９９８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：７１３４−７１３５参照。本発明者らは非天然アミノ酸を生きた細胞で蛋白質に直接部位特異的に組込むことが可能な一般方法を最近開発した（例えば参考資料として本明細書に組込むＷＯ２００２／０８５９２３と２００３年１０月１５日付け対応出願、発明の名称「ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（ＳＩＴＥ
ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＫＥＴＯ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＩＮＴＯ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」、代理人整理番号５４−０００１７０ＰＣＴ参照）。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００も参照。アンバーナンセンスコドンに応答して９９．８％を上回る翻訳忠実度でケト含有アミノ酸ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの組込みに成功した。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：５６−６１参照。本実施例は遺伝的にコードされるケト官能基とアミノオキシ糖誘導体を使用する均質糖蛋白質ミメティクスの製造について記載する。
糖蛋白質ミメティクスを作製するために２種類の経路を検討した（図１参照）。第１のアプローチでは、まずアミノオキシ基で誘導体化した糖をケト基とカップリングし、付加糖をグリコシルトランスフェラーゼで酵素結合する。より収束的な第２の経路では、規定構造をもつグリカンをアミノオキシ誘導体として製造し、１段階で蛋白質に直接カップリングする。ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインは比較的小寸法（分子量７．９ｋＤ）であるため、非常に高確度で質量分析特性決定し易いのでこれをモデル蛋白質として使用した（例えばＮｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．ら，（１９８７）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：１０７−１１３参照）。
対応する遺伝子の７番目のコドンをアンバー終止コドンＴＡＧに突然変異させ、Ｈｉｓ６タグをＣ末端に付けて蛋白質精製し易くした。従来報告されているプロトコールによりｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをアンバー位置に組込み、突然変異体Ｚドメイン蛋白質を得た。例えばＷａｎｇ，Ｌ．ら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：５６−６１参照。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー後に蛋白質約３．６ｍｇ／Ｌが得られた。次に、公開方法に従って図１のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）１のβ結合アミノオキシ類似体を合成した。例えばＣａｏ，Ｓ．ら，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１：６６７９−６６８６参照。突然変異体Ｚドメイン蛋白質（１０ｍｇ／ｍＬ）とアミノオキシ糖１（２１ｍＭ）を水性１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で混合し、３７℃で７〜２６時間インキュベートした。２８０ｎｍの吸光度をモニターすることにより反応混合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した（図２参照）。主ピークは２個しか観察されず、対応する溶出液をマトリックス支援レーザー脱離／イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳ）により特性決定した（図３参照）。得られたモノアイソトピック質量から、一方のピーク（ｔＲ＝４４．８分）は未反応突然変異体Ｚドメイン（Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８１８．８３３Ｄａ，Ｍｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８１８．８３６Ｄａ）に対応し、他方のピーク（ｔＲ＝４３．２分）はアミノオキシ糖１で誘導体化された突然変異体Ｚドメイン（Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８０３６．９２４Ｄａ，Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８０３６．９１４Ｄａ）に対応することが判明した。大腸菌で発現させると、Ｚドメイン蛋白質は無傷の蛋白質と、最初のメチオニンをもたない蛋白質と、最初のメチオニンをもたない蛋白質のアセチル化形態の３形態をもつ。無傷の蛋白質は逆相ＨＰＬＣを使用して他の２形態から分離することができる。質量分析を簡単にするために、本実施例では最初のメチオニンをもたないＺドメインを含む精製フラクションとそのアセチル化形態を使用した。図２でＩＩＩ及びＩＶのスペクトルに示すように、全質量スペクトルでこれらの２形態に対応する２個のピークを観察することができる。構造については図１参照。対照として、チロシンをＺドメインの７位に組込んだ場合には、糖誘導体化蛋白質は観察されない。この事実と、糖修飾Ｚドメインに観察される高確度質量（誤差＜１．２ｐｐｍ）から、アミノオキシ糖１はケト基に選択的に結合していることが確認された。カップリング効率は時間と共に増加し（出発材料と生成物に対応するＨＰＬＣピークの面積から判断）、出発材料から生成物への変換率は７時間後に４２％であり、２６時間後には９５％を上回った（図２参照）。
次に、第１の糖に第２の糖を酵素カップリングできるか否かを調べた。精製付加物ＩＩ（５ｍｇ／ｍＬ）（構造については図１参照）を１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．４）中でＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）（１６ｍＭ）とβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．４単位／ｍＬ）の存在下に４８時間周囲温度でインキュベートした。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは糖ヌクレオチドからガラクトースをＧｌｃＮＡｃ部分の４位に転移させ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを形成することが知られている。例えばＳｃｈａｎｂａｃｈｅｒ，Ｆ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｂｎｅｒ，Ｋ．Ｅ．（１９７０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：５０５７−５０６１参照。ＨＰＬＣによる分離後
に新規ピーク（ｔＲ＝４２．５分）が同定された。ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳにより測定した溶出液のモノアイソトピック質量（Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８１９８．９７７，Ｍｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝８１９８．９６９）から、ガラクトースはＧｌｃＮＡｃとカップリングし、付加物ＩＩＩとなることが確認された（図３参照）。構造については図１参照。ＨＰＬＣ分析により測定したカップリング効率は約６０％であり、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼについて従来報告されている値に近似した。例えばＷｉｔｔｅ，Ｋ．ら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８参照。この結果は第１の糖と蛋白質の非天然結合がグリコシルトランスフェラーゼ反応にさほど影響を与えないことを示している。この二糖標識蛋白質を更にＣＭＰ−シアル酸及びα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（例えばＫｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１参照）と反応させると、シアル酸がガラクトースに付加され、ＩＶとなる（ｔＲ＝４１．７分）ことがＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳにより確認された（Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８４９０．０７２，Ｍｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝８４９０．０１４）（図３参照）。ＩＩＩからＩＶへの変換のカップリング効率はＨＰＬＣ分析によると６５％であった。構造については図１参照。
収束経路を使用して蛋白質ミメティクスＩＩＩ及びＩＶも作製した。図１参照。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．７５単位／ｍＬ）とグリコシル供与体ＵＤＰ−ガラクトースを使用して１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中総収率７０％でアミノオキシＧｌｃＮＡｃ（０．０５Ｍ）は２に変換された。アミノプロピルシリカゲルＨＰＬＣによる精製後、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（０．２２単位／ｍＬ）とＣＭＰ−シアル酸（０．０３Ｍ）を使用してシアル酸を２（０．０３Ｍ）に加えると、収率約８０％で上記と同一緩衝液中に３が得られた。１００ｍＭ水性酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含むＺドメイン蛋白質（５ｍｇ／ｍＬ）に精製アミノオキシ類似体２及び３（夫々１３及び７．２ｍＭ）を周囲温度でカップリングすると、夫々糖蛋白質ミメティクスＩＩＩ及びＩＶが得られた。図１参照。得られたＩＩＩ及びＩＶは第１の順次経路により作製した対応する付加物と一致することがＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳ分析により確認された。同一反応条件下で２６時間の２とＩ及び３とＩのカップリング効率は夫々約７６％及び６０％であった。収率は１とＩのカップリング（９５％）よりも低かったが、これはグリカンが複雑になるにつれて立体効果が増すためであると考えられる。
要するに、規定糖置換基を含む均質糖蛋白質ミメティクスを合成するための一般方法を実証した。
〔実験材料及び方法〕
概説：ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、β−１、４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−１，４−ＧａｌＴ）及びα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（α−２，３−ＳｉａｌＴ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。特に指定しない限り、全薬品はＡｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ又はＳｉｇｍａから入手し、それ以上精製せずに使用した。ニンヒドリン又はモリブデン酸セリウム発色剤を展開試薬として使用して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により反応をモニターした。全非水性反応はオーブン乾燥ガラス容器でＡｒ雰囲気下に実施した。全非水性溶媒は使用前に蒸留させた。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−４００、ＡＭＸ−５００又はＡＭＸ−６００ＭＨｚスペクトロメーターで記録し、残留溶媒ピーク（ＣＤＣｌ３：１Ｈδ７．２４，１３Ｃδ７７．０；ＣＤ３ＯＤ：１Ｈδ３．３０，１３Ｃδ４９．０；Ｄ２Ｏ：１Ｈδ４．７６）と照合した。
図１の化合物２：新たに調製したＭｎＣｌ２溶液（２ｍｍｏｌ）を添加したＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）３５０μＬに図１の化合物１（５ｍｇ，０．０２１ｍ
ｍｏｌ）とＵＤＰ−Ｇａｌ（２１ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）を溶かした。β−１，４−ＧａｌＴ（０．３Ｕ，０．１ＵμＬ−１）とアルカリホスファターゼ（０．５Ｕ，１ＵμＬ−１）を加え、反応混合物を周囲温度で２日間温和に振盪した。反応混合物を遠心し、流速１ｍＬ ｍｉｎ−１で９０分間１００：０ Ａ：Ｂ→５０：５０ Ａ：Ｂ（Ａ＝ＭｅＣＮ及びＢ＝Ｈ２Ｏ）のグラジエント溶離を利用してアミノプロピルシリカゲルＨＰＬＣにより上清を精製した。所望生成物の滞留時間は５３分であった。カラムフラクションを凍結乾燥すると、図１の純粋な化合物２（６ｍｇ，７０％）が白色粉末として得られた；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）δ４．５８（ｄ，Ｊ＝６．１２，１Ｈ），４．４２（ｄ，Ｊ＝７．４４，１Ｈ），３．９６（ｄ，Ｊ＝１１．８８ １Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝４．８３，１２．３，１Ｈ），３．７２−３．６９（ｍ，６Ｈ），３．６２（ｄｄ，Ｊ＝３．０６，１０．０８，１Ｈ），３．５６（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１５０ＭＨｚ）δ１７５．１８，１０３．９８，１０３．３１，７８．６３，７５．７８，７５．１３，７２．９２，７２．８２，７１．３９，６８．９９，６１．４６，６０．４３，５３．８０，２２．５５。ＨＲ−ＦＴＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ１４Ｈ２６Ｎ２Ｏ１１の計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４２１．１４２９，実測値４２１．１４４８。
図１の化合物３：新たに調製したＭｎＣｌ２溶液（５ｍｍｏｌ）を添加したＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）４５０μＬに図１の化合物２（５．３ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）とＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（１０ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）を溶かした。α−２，３−ＳｉａｌＴ（２２ｍＵ，３．７ｍＵμＬ−１）とアルカリホスファターゼ（５０ｍＵ，５０ｍＵμＬ−１）を加え、反応混合物を周囲温度で２日間温和に振盪した。反応混合物を遠心し、流速１ｍＬ ｍｉｎ−１で３０分間１００：０ Ａ：Ｂ→０：１００ Ａ：Ｂ（Ａ＝ＭｅＣＮ及びＢ＝Ｈ２Ｏ）のグラジエント溶離を利用してアミノプロピルシリカゲルＨＰＬＣにより上清を精製した。対応フラクション（２７分）を集め、凍結乾燥すると、白色粉末が得られた（７ｍｇ，７６％）。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）δ４．５５（ｄ，Ｊ＝８．３４，１Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝７．８６，１Ｈ），４．０４（ｄｄ，Ｊ＝３．０６，９．６０，１Ｈ），３．５８−３．９６（ｍ，１７Ｈ），３．５１（ｍ，１Ｈ），２．６７（ｄｄ，Ｊ＝４．８０，１２．７２，１Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），１．７５（ｔ，Ｊ＝１２．３０，１Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ（ｎｅｇ）Ｃ２５Ｈ４３Ｎ３Ｏ１９の計算値［Ｍ−Ｈ］−＝６８８，実測値６８８。
アミノオキシ糖誘導体を突然変異体Ｚドメイン蛋白質にカップリングするための一般手順：典型的反応では、アミノオキシ糖誘導体（５００μｇ）と突然変異体Ｚドメイン蛋白質〜１ｍｇを１００ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かした。水を総容量１００μＬまで加え、反応混合物を３７℃で２６時間振盪した。次に、混合物を遠心し、流速１ｍＬ ｍｉｎ−１で７０分間９０：１０ Ａ：Ｂ→６０：４０ Ａ：Ｂ（Ａ＝Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ）のグラジエント溶離を利用してＡｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ−Ｃ１８ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍカラムで逆相ＨＰＬＣにより上清を精製した。カラムフラクションをＴｒｉｓＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で中和し、サイズ排除カラムで脱塩した。水で溶出後、溶出液を凍結乾燥すると、図１の純粋なＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶが白色粉末として夫々収率９６％、７６％及び６０％で得られた。
順次経路を使用した（図１の）糖蛋白質ミメティクスＩＩＩ及びＩＶの製造：図１のＩＩＩを製造するために、新たに調製したＭｎＣｌ２溶液（０．５ｍｍｏｌ）を添加した１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０μＬに図１のＩＩ（〜０．５ｍｇ）とＵＤＰ−Ｇａｌ（１ｍｇ）を溶かした。β−１，４−ＧａｌＴ（４０ｍＵ，４０ｍＵμＬ−１）とアルカリホスファターゼ（５０ｍＵ，５０ｍＵμＬ−１）を加え、反応混合物を周囲温度で２日間温和に振盪した。反応混合物を遠心し、上清を逆相ＨＰＬＣにより精製し
た。図１のＩＶを製造するために、新たに調製したＭｎＣｌ２溶液（０．５ｍｍｏｌ）を添加した１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０μＬに図１のＩＩＩ（〜０．５ｍｇ）とＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（０．５ｍｇ）を溶かした。α−２，３−ＳｉａｌＴ（１０ｍＵ，３．７ｍＵμＬ−１）とアルカリホスファターゼ（５０ｍＵ，５０ｍＵμＬ−１）を加え、反応混合物を周囲温度で２日間温和に振盪した。反応混合物を遠心し、上清を逆相ＨＰＬＣにより精製した。
ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳ：ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳ実験にはＡＰＥＸ ＩＩコンソールと９．４Ｔマグネットを備えるＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製ホームビルド機器を使用した。ＴＦＡを含有する通常のＭＡＬＤＩ試料調製物を使用した場合に糖部分は崩壊する傾向がある。本発明者らは低感受性で低温のマトリックスを使用した。マトリックスは３−ヒドロキシピコリン酸（２０ｍｇ ｍＬ−１）とクエン酸二アンモニウム（１ｍｇ ｍｏｌ−１）の混合物である。イオン源に衝突冷却を提供することにより準安定分解を減らすＦＴＩＣＲの特殊中圧ＭＡＬＤＩ源により糖蛋白質の分解を更に最小限にした。
〔糖蛋白質合成の別のストラテジー〕
本発明の１態様では、グリコシル化アミノ酸の翻訳時組込みにより生物（例えば大腸菌）で均質糖蛋白質を合成するための別のストラテジーが開発された。例えば、規定位置にβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンを含むミオグロビンを大腸菌で良好な収率と高い忠実度で発現させることができる。β−ＧｌｃＮＡｃ部分は糖質結合蛋白質により認識することができ、又はガラクトシルトランスフェラーゼで後期修飾することもできる。このアプローチは他の翻訳後修飾（例えば蛋白質リン酸化、アセチル化、メチル化等）にも適用可能であると思われる。
グリコシル化は真核生物で最も一般的な蛋白質の翻訳後修飾の１種であり、フォールディングや分泌から生体分子認識及び血清半減期に至る広範な蛋白質機能に影響を与える。例えばＲ．Ａ．Ｄｗｅｋ，（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：６８３参照。グリコシル化の効果の解明はかなり進んだが、オリゴ糖鎖の具体的な役割とその構造と機能の関係についてはまだ解明され始めたばかりである。例えば、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，＆ Ｌ．Ｌ．Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３５７参照。主な問題は糖蛋白質が一般に糖形態の混合物として生産されるため、天然源から固有糖形態を単離しにくい点である。規定構造の糖形態を合成するために種々の方法が開発されているが、生産される糖蛋白質のサイズ、量、及び／又は品質に重大な欠点がある。例えばＰ．Ｓｅａｒｓ，＆ Ｃ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｍ．Ｗａｃｋｅｒら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；及びＨ．Ｃ．Ｈａｎｇ，＆ Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，（２００１）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７参照。本実施例では、セレクターコドン（例えばアンバーコドン、ＴＡＧ）に応答してグリコシル化アミノ酸を遺伝的にコードする直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対の開発を含め、ユニークな糖形態を大腸菌で生産するために使用されるストラテジーと成分を記載する。上記及び他の糖修飾アミノ酸の直接遺伝的蛋白質組込みにより、糖蛋白質構造及び機能の分析及び操作能を著しく拡大することができる。
新規化学的及び物理的性質をもつアミノ酸を大腸菌（例えばＬ．Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８；Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１８３６；Ｚ．Ｚｈａｎｇら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４１：２８４０；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ ９９：１１０２０；Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４；Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ １００：５６；及びＺ．Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５参照）と酵母（例えばＪ．Ｗ．Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００３年印刷中）参照）の遺伝コードに体系的に付加することを初めて可能にした数種の方法が従来開発されている。このアプローチでは、内在ｔＲＮＡ及びシンテターゼと交差反応しないアンバーサプレッサーＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ−ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ対を開発し、所望非天然アミノ酸のみを負荷するように進化させている。この方法はグリコシル化、リン酸化、又はメチル化アミノ酸を蛋白質に直接組込むこともでき（例えばＴ．Ａｒｓｌａｎら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１０８７７参照）、蛋白質の選択的酵素又は化学的翻訳後修飾の必要がなくなる。β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン（化合物Ａ，ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン）を大腸菌で蛋白質に部位特異的に組込む試みがなされた。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ修飾はほぼ全真核細胞で遍在性であり、細胞シグナリング、蛋白質トラフィキング及び細胞増殖の調節に関与しており、より複雑な糖質を生産するための基質でもある。例えばＬ．Ｗｅｌｌｓら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３７６；及びＮ．Ｌａｍａｒｒｅ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，＆ Ｌ．Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎ，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６６１２参照。しかし、遊離ヒドロキシル基をもつ糖誘導体は真核細胞の膜を通過しにくいので、基質化合物Ａは細胞浸透性でないと思われる。例えばＡ．Ｋ．Ｓａｒｋａｒら，（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ ９２：３３２３参照。他方、糖のヒドロキシル基のアセチル化が細胞膜通過を助長し、ヒドロキシルアセチル基を一旦細胞内に導入してから非特異的サイトゾルエステラーゼにより脱アセチル化できることが示されている。例えばＮ．Ｌａｍａｒｒｅ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，＆ Ｌ．Ｈｓｉｅｈ−Ｗｉｌｓｏｎ，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６６１２参照。従って、これらの実験では前駆体Ｎ−Ｆｍｏｃ−トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリンが市販されているアセチル化誘導体トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン（化合物Ｂ）を使用した。化合物は下式で示される。
一連のポジフィブ及びネガティブ選択を使用して活性部位突然変異体のライブラリーから大腸菌で直交ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡにβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンを特異的に負荷するＴｙｒＲＳを単離した。相同Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳのＸ線構造に基づき、活性部位残基をランダムに配置した２個のライブラリー、即ちプラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ−ｍによりコードされ、残基Ｔｙｒ３２、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、及びＡｌａ１６７をランダムに配置した第１のライブラリーと、プラスミドｐＢＫ−ｌｉｂによりコードされ、残基Ｔｙｒ３２、Ｇｌｕ１０７、Ａｓｐ１５８、Ｉｌｅ１５９、及びＬｅｕ１６２をランダムに配置した第２のライブラリーを構築した。これらの残基はいずれもフェニル環から６．９Å以内にあり、基質結合ポケットを形成する主残基である。ライブラリー合計で独立クローン約２．６×１０９とした。このライブラリーを次にポジティブ選択にかけ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のＡｓｐ１１２に導入したアンバーコドンの抑圧に基づき、グリコシル化アミノ酸を組込むことが可能なＴｙｒＲＳ突然変異体を選択した。高濃度のクロラムフェニコールの存在下で生存する細胞はＡｓｐ１１２ＴＡＧアンバーコドンに応答してβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリン又は内在アミノ酸を挿入する能力をもつ突然変異体ＴｙｒＲＳを発現すると考えられる。次に、毒性バルナーゼ遺伝子の３個
のアンバーコドンの抑圧に基づくネガティブ選択を使用し、選択したクローンから内在アミノ酸を組込む突然変異体ＴｙｒＲＳを排除した。５回のポジティブ選択と４回のネガティブ選択後に高濃度のクロラムフェニコールの存在下で生存する３個のクローンが出現した。これらのクローンとその突然変異は以下の通りである。Ｓ１−９０（Ｇｌｕ１０７→Ｐｒｏ１０７，Ａｓｐ１５８→Ｃｙｓ１５８，Ｉｌｅ１５９→Ｔｙｒ１５９，Ｌｅｕ１６２→Ａｒｇ１６２）、Ｓ４−５（Ｔｙｒ３２→Ｇｌｙ３２，Ｇｌｕ１０７−Ｇｌｙ１０７，Ａｓｐ１５８→Ｃｙｓ１５８，Ｌｅｕ１６２→Ｈｉｓ１６２）、Ｓ１−５（Ｇｌｕ１０７→Ｃｙｓ１０７，Ａｓｐ１５８→Ｈｉｓ１５８，Ｉｌｅ１５９→Ａｓｐ１５９，Ｌｅｕ１６２→Ｍｅｔ１６２）。化合物Ｂの代わりに１ｍＭセリン、α−トリ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、α／β−トリ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−セリン又はβ−テトラ−アセチル−Ｇｌｕ−アスパラギンを使用しても３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを上回る細胞増殖は得られないので、これらの全クローンはβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンに高度に選択的であると思われる。これらのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝結果から、新規に選択された突然変異体ＴｙｒＲＳはβ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリンに対して優れた特異性をもつと考えられる。
化合物Ｂの組込み効率及び忠実度を試験するために、４位にアンバーコドンとＣ末端Ｈｉｓ６タグを含む突然変異体ミオグロビン遺伝子（Ｇｌｙ４ＴＡＧ）を作製した。例えばＳ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４参照。突然変異体シンテターゼＳ１−９０を最少培地で化合物Ｂの存在下にｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ及びＧｌｙ４ＴＡＧミオグロビン遺伝子と同時発現させると、全長突然変異体ミオグロビン１ｍｇ／Ｌが生産された（図４参照）。比較のために、同様の条件下で野生型ミオグロビン５．５ｍｇ／Ｌが生産され、Ｓ１−９０の抑圧レベルが良好であることが判明した。Ｓ−９０、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ、又は化合物Ｂの不在下では銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより全長ミオグロビンの発現は観察されなかった（図４参照）。
図４はＧｌｙ４→化合物Ａ突然変異体ミオグロビン（〜１８．５ｋＤ）の発現を示す。蛋白質をＮｉ２＋−アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ゲルを銀染色した。レーン１は直交ｔＲＮＡ、シンテターゼＳ１−９０、及び化合物Ｂの存在下でミオグロビンが発現されたことを示す。〜１８ｋＤａバンドは全長ミオグロビンに対応する。レーン２は直交ｔＲＮＡとシンテターゼＳ１−９０の存在下で且つ基質化合物Ｂの不在下に発現後に溶出した蛋白質を示す。レーン３は直交ｔＲＮＡと基質化合物Ｂの存在下で且つシンテターゼＳ１−９０の不在下に発現後に溶出した蛋白質を示す。レーン４はシンテターゼＳ１−９０と基質化合物Ｂの存在下で且つ直交ｔＲＮＡの不在下に発現後に溶出した蛋白質を示す。レーン５は比較用に精製野生型ミオグロビンを含む。
高分解能ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によると、Ｈｉｓ６タグ精製突然変異体ミオグロビンのモノアイソトピック質量は１８４３０．１Ｄａであり、Ｇｌｃ（ＯＨ）３Ｎａｃ−セリンを含み、メチオニンを欠失するミオグロビンの理論質量（Ｍｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝１．８４２９．５Ｄａ）と３２ｐｐｍ以内で一致する。図５参照。Ｎ末端Ｍｅｔの欠失は大腸菌で一般的であることに留意されたい。更に、Ｏ−アセチル化糖ミオグロビン又は野生型ミオグロビンに対応するシグナルは観察されなかった。質量スペクトルデータにより、ＧｌｃＮＡｃ−セリンのミオグロビン組込みの高度特異性が確認された（＞９６％）。
突然変異体ミオグロビンを更に特性決定するために数種の付加実験を実施した。まず、ＥＬＩＳＡ様アッセイを使用し、ＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンＢａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ＩＩ（ＢＳＩＩ）（例えばＳ．Ｅｂｉｓｕら，（１９７８），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．６１：１２９参照）と野生型ミオグロビン及び糖ミオグロビンの結合を分析した。図６Ａ参照。図６ＡはＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンＢａｎｄｅ
ｒｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ＩＩ（ＢＳＩＩ）と野生型ミオグロビン及び糖ミオグロビンの結合を示す。野生型ミオグロビン、糖ミオグロビン、及び陰性対照（レクチン非添加）のＡ４０５値を示す。Ｇｌｙ４→化合物Ａ突然変異体ミオグロビン（２００ｎｇ）と野生型ミオグロビン（２００ｎｇ）をマイクロタイタープレートウェルに固定化した後、ビオチン化ＢＳＩＩとストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートの存在下にインキュベートした。ウェルをリン酸ｐ−ニトロフェニルの存在下にインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。２種の形態のミオグロビンをマイクロタイタープレートウェルに固定化した後、夫々ビオチン化ＢＳＩＩ、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート、及びリン酸ｐ−ニトロフェニルの存在下にインキュベートした。野生型ミオグロビンを含むウェルは陰性対照ウェルと等価のシグナルを発生した。他方、糖ミオグロビンを含むウェルは野生型ミオグロビンの少なくとも２００倍のシグナルを発生し、ＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンによる選択的認識が立証された。更に、このレクチンはＧｌｃＮＡｃに高度に選択的であるので、この結果から糖質はＧａｌＮＡｃやＭａｎＮＡｃ等の他の異性形に修飾されていないことも判明した（例えばＳ．Ｅｂｉｓｕら，（１９７８），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．６１：１２９参照）。
ミオグロビンのＯ−ＧｌｃＮＡｃ−セリン残基をガラクトシルトランスフェラーゼで選択的に修飾できるか否かについても検討した。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは糖ヌクレオチドＵＤＰ−Ｇａｌからガラクトース（Ｇａｌ）をＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の４位に転移させ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを形成することが知られている。Ｏ−グリコシル化ミオグロビンをＵＤＰ−Ｇａｌで修飾できるか否かを調べるために、野生型及びＯ−グリコシル化ミオグロビンの両者をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ＰＶＤ膜に転写させた。次に膜を牛乳ガラクトシルトランスフェラーゼ及び放射性ＵＤＰ−［Ｈ３］−ガラクトースの存在下に室温で２４時間インキュベートした。例えばＫ．Ｋａｍｅｍｕｒａら，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２２９参照。膜をＸ線フィルムに露光することにより［Ｈ３］−Ｇａｌの取込みをモニターした。糖ミオグロビンのみが標識され、野生型ミオグロビンでは検出可能なシグナルは観察されなかった。図６Ｂ参照。図６ＢはＵＤＰ−［Ｈ３］ガラクトースによる糖ミオグロビンのオンブロットガラクトシルトランスフェラーゼ標識を示す。野生型ミオグロビン（１μｇ）とＧｌｙ４→化合物Ａ突然変異体ミオグロビン（１μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ＰＶＤ膜に転写させた。次に膜を牛乳ガラクトシルトランスフェラーゼ（１Ｕ）、ＵＤＰ−［Ｈ３］−ガラクトース（０．５μＣｉ）及びウシ腸アルカリホスファターゼ（１Ｕ）で２４時間室温にて処理した。十分に洗浄後、エンハンストオートラジオグラフィーを使用して膜をＸ線フィルムに露光した。
定量分析のために、更に糖転移反応を溶液中で実施した。例えばＫ．Ｗｉｔｔｅら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４参照。４８時間室温でインキュベーション後に存在する放射性ラベルを基準に７２％の二糖収率が得られた。図６Ｃ参照。図６Ｃは溶液中で実施したガラクトシルトランスフェラーゼ反応の定量分析を示し、１．０が１００％転移に対応するように放射性標識ガラクトースを標準化した。ＨＰＬＣ精製野生型ミオグロビン（１００μｇ）とＧｌｙ４→化合物Ａ突然変異体ミオグロビン（１００μｇ）を含有する溶液にピルビン酸キナーゼ（５Ｕ）、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（１Ｕ）、無機ピロホスホリラーゼ（１０Ｕ）、ガラクトース−１−リン酸−ウリジルトランスフェラーゼ（１Ｕ）、牛乳ガラクトシルトランスフェラーゼ（２Ｕ）、グルコース−１−リン酸（３μｍｏｌ）、ウリジル二リン酸（３μｍｏｌ）、ホスホエノールピルビン酸（０．０１ｍｍｏｌ）、及びＤＴＴ（２μｍｏｌ）を加えた。反応溶液をｐＨ７．２に調整した後、［Ｈ３］−ガラクトース−１−リン酸（０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。４８時間室温で反応させた。蛋白質産物をＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５カラムで分離した。放射性ラベル取込みを液体シンチレーションアナライザーで測定し
た。
これらの試験の結果、β−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリンは優れた特異性と良好な収率で大腸菌で蛋白質に翻訳時組込みが可能であることが立証された。組込まれたβ−ＧｌｃＮＡｃ−セリンは糖をグリコシルトランスフェラーゼで順次付加することができる主グリコシル化部位として機能することができる。例えばＫ．Ｋａｍｅｍｕｒａら，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２２９。
〔材料と方法〕
突然変異体ＴｙｒＲＳ酵素の指向進化。ポジティブ及びネガティブ選択の一般手順は従来報告されている。例えばＺ．Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５参照。要約すると、プラスミドｐＲｅｐ（２）／ＹＣ（例えば、Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４参照）を導入したコンピテント大腸菌ＤＨ１０ＢにプラスミドｐＢＫ−ｌｉｂ−ｍ（例えば、Ｚ．Ｚｈａｎｇら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：６７３５参照）及びｐＢＫ−ｌｉｂ（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８参照）の組み合わせを形質転換した。４０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、６８μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、及び１ｍＭ化合物Ｂを添加したＧＭＭＬ培地（１％グリセロール，０．３ｍＭロイシン，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ
ＣａＣｌ２及び０．５％ ＮａＣｌを含有する１×Ｍ９最少培地）５００ｍｌ中で形質転換細胞を６０時間３７℃で増殖させた。プラスミド（ｐＢＫ）を生存細胞から精製し、ｐＬＷＪ１７Ｂ３（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８参照）を導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂに形質転換し、ネガティブ選択を開始した。次に、４０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、及び０．０２％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートに細胞をプレーティングし、３７℃で８時間インキュベートした。プラスミドｐＢＫを生存細胞から精製し、後続ポジティブ及びネガティブ選択に使用した。ポジティブ選択５回とネガティブ選択４回の後に、基質依存的クロラムフェニコール耐性を付与する３個の候補直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を単離し、配列決定した。
突然変異体ミオグロビンの発現と特性決定。カナマイシン、テトラサイクリン、０．０２％Ｌ−アラビノース、５μＭ ＦｅＣｌ３、及び０又は１ｍＭ化合物Ｂを加えたＧＭＭＬ培地５００ｍｌ中でｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ（例えばＳ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４参照）とｐＳ１−９０を導入したＤＨ１０Ｂ細胞を増殖させた。細胞をペレット化させ、溶解させ、天然条件下にＮｉ２＋−ＮＴＡビーズを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより蛋白質を精製した。蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、銀染色した。精製蛋白質のアリコートを高分解能質量分析した。飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を使用して蛋白質の分子量を測定した。蛋白質試料を３３７ｎｍ窒素レーザーから照射後に脱離イオン化した。シナピン酸をＭＡＬＤＩマトリックスとして使用した。確立プロトコール（例えば、Ｋ．Ｋａｍｅｍｕｒａら，（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２２９；及びＫ．Ｗｉｔｔｅら，（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４参照）に従ってレクチン結合及びグリコシルトランスフェラーゼ反応を実施した。
〔代表的Ｏ−ＲＳの配列〕
本発明で使用することができる代表的Ｏ−ＲＳとしては、配列番号１〜６（表２参照）が挙げられ、本発明で使用することができる代表的Ｏ−ｔＲＮＡとしては配列番号７が挙
げられる。Ｏ−ＲＳをコードする代表的ポリヌクレオチドとしては配列番号８〜１０が挙げられる。
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
非天然アミノ酸を含むポリペプチドに糖部分を結合するための２種類のスキーム（順次経路と収束経路）の例を模式的に示す。 （図１の）アミノオキシ糖１とｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む（図１の）突然変異体Ｚドメイン蛋白質Ｉの７時間及び２６時間カップリング反応のＨＰＬＣ分析を示す。 （図１の）突然変異体Ｚドメイン蛋白質Ｉ、（図１の）糖蛋白質ミメティクスＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの高分解能ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ ＭＳスペクトルを示す。各スペクトルの２＋同位体クラスターを示す。 Ｇｌｙ４→Ａ突然変異体ミオグロビン（〜１８．５ｋＤ）の発現を示す。蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ゲルを銀染色した。 Ｇｌｙ４→Ａ突然変異体ミオグロビンの分子量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。 グリコシル化アミノ酸を含む精製突然変異体ミオグロビンの特性決定を示す。ＡはＧｌｃＮＡｃ特異的レクチンＢａｎｄｅｒｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ＩＩ（ＢＳＩＩ）と野生型ミオグロビン及び糖ミオグロビンの結合を示す。ＢはＵＤＰ−［Ｈ３］ガラクトースによる糖ミオグロビンのオンブロットガラクトシルトランスフェラーゼ標識を示す。 グリコシル化アミノ酸を含む精製突然変異体ミオグロビンの特性決定を示す。Ｃは溶液中で実施したガラクトシルトランスフェラーゼ反応の定量分析を示し、１．０が１００％転移に対応するように放射性標識ガラクトースを標準化した。

Claims (57)

  1. ａ）第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；
    ｂ）第２の反応性基を含む糖部分と前記蛋白質を接触させ、第１の反応性基を第２の反応性基と反応させて糖部分を非天然アミノ酸に結合する段階を含む糖蛋白質の合成方法。
  2. 第１の反応性基が求電子性部分であり、第２の反応性基が求核性部分である請求項１に記載の方法。
  3. 求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項２に記載の方法。
  4. 求核性部分が−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）（式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである）から構成される群から選択される請求項２に記載の方法。
  5. 求核性部分かヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドから構成される群から選択される請求項４に記載の方法。
  6. 反応生成物がオキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、又はチオセミカルバゾンを含む請求項２に記載の方法。
  7. 反応生成物が還元ヒドラゾンを含む請求項６に記載の方法。
  8. 第１の反応性基が求核性部分であり、第２の反応性基が求電子性部分である請求項１に記載の方法。
  9. 求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項８に記載の方法。
  10. 糖部分が２個以上の糖質部分を含む請求項１に記載の方法。
  11. 糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階ｃ）を更に含む請求項１に記載の方法。
  12. グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項１１に記載の方法。
  13. 段階（ｃ）の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を更に含む請求項１１に記載の方法。
  14. 糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分ＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
  15. 糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
  16. Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応の生成物をβ１−４マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
  17. Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−３マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
  18. Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−６マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１７に記載の方法。
  19. Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１８に記載の方法。
  20. Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃｐｌ−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１９に記載の方法。
  21. 糖部分をβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，４フコシルトランスフェラーゼ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼの１種以上と接触させ、二側鎖又は三側鎖オリゴ糖構造を形成する段階を更に含む請求項１１に記載の方法。
  22. 組込み段階をｉｎ ｖｉｖｏで実施する請求項１に記載の方法。
  23. 組込み段階が直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の方法。
  24. Ｏ−ＲＳが配列番号１、２、又は３のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の方法。
  25. Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含む請求項２３に記載の方法。
  26. 請求項１に記載の方法により生産された糖蛋白質。
  27. 請求項２２に記載の方法により生産された糖蛋白質。
  28. 糖部分とポリペプチドを含む糖蛋白質であって、糖部分がポリペプチドに存在する非天然アミノ酸に結合した第１の反応性基と糖部分に結合した第２の反応性基の求核性反応の反応生成物によりポリペプチドと結合している前記糖蛋白質。
  29. 第１の反応性基が求電子性部分であり、第２の反応性基が求核性部分である請求項２８に記載の糖蛋白質。
  30. 求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項２９に記載の糖蛋白質。
  31. 求核性部分が−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）（式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである）から構成される群から選択される請求項２９に記載の糖蛋白質。
  32. 求核性部分かヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドから構成される群から選択される請求項３１に記載の糖蛋白質。
  33. 反応生成物がオキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、又はチオセミカルバゾンを含む請求項２８に記載の糖蛋白質。
  34. 反応生成物が還元ヒドラゾンを含む請求項３３に記載の糖蛋白質。
  35. 糖部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階を含む糖蛋白質の合成方法。
  36. 糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階を更に含む請求項３５に記載の方法。
  37. グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項３６に記載の方法。
  38. グリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を更に含む請求項３６に記載の方法。
  39. 糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリ
    コシルトランスフェラーゼがβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求項３６に記載の方法。
  40. 糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである請求項３６に記載の方法。
  41. 組込み段階が直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項３５に記載の方法。
  42. Ｏ−ＲＳが配列番号４、５、又は６のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項４１に記載の方法。
  43. Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含む請求項４１に記載の方法。
  44. 組込み段階をｉｎ ｖｉｖｏで実施する請求項３５に記載の方法。
  45. 非天然アミノ酸がβ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニンを含む請求項３５に記載の方法。
  46. 請求項３５に記載の方法により生産された糖蛋白質。
  47. ａ）糖部分を含む非天然アミノ酸と；
    ｂ）セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；
    ｃ）非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
    ｄ）グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと；
    ｅ）ポリペプチドをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む糖蛋白質合成用宿主細胞。
  48. グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項４７に記載の宿主細胞。
  49. 宿主細胞が哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、始原菌細胞、又は昆虫細胞である請求項４７に記載の宿主細胞。
  50. 翻訳系を含む組成物であって、翻訳系が直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳが糖部分を含む非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡが少なくとも１個のセレクターコドンを認識する前記組成物。
  51. Ｏ−ＲＳが配列番号４、５、もしくは６のいずれか１種又はその保存変異体を含むアミノ酸配列を含む請求項５０に記載の組成物。
  52. Ｏ−ＲＳが配列番号８、９、もしくは１０のいずれか１種又はその保存変異体を含むポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる請求項５０に記載の組成物。
  53. Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを含む請求項５０に記載の組成物。
  54. 非天然アミノ酸がβ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニンを含む請求項５０に記載の組成物。
  55. （ａ）配列番号４〜６のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｂ）配列番号８〜１０のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；及び
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異を含むアミノ酸配列から構成される群から選択される人工ポリペプチド。
  56. 請求項５５に記載のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清。
  57. （ａ）配列番号８〜１０のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
    （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれをコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号１〜６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）請求項５５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｅ）核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
    （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；及び
    （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の保存変異を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択される人工ポリペプチド。
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