MXPA06008496A - Polipeptidos de interferon humano modificados y sus usos. - Google Patents

Polipeptidos de interferon humano modificados y sus usos.

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MXPA06008496A
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Anna-Maria Hays
Troy Wilson
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Abstract

Se proporcionan polipeptidos de interferon humano modificados y sus usos.

Description

POLIPEPTIDOS DE INTERFERON HUMANO MODIFICADOS Y SUS USOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U. Serie No. 60/581,314, presentada en Junio 18, 2004, la solicitud de patente provisional de E.U. Serie No.60/581, 175, presentada en Junio 18, 2004, la solicitud de patente provisional de E.U. Serie No. 60/580,885 presentada en Junio 18, 2004 y la solicitud de patente provisional de E.U. titulada 60/638,616 presentada en Diciembre 22, 2004, las especificaciones de las cuales se incorporan en la presente en su totalidad. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a polipéptidos de interferón modificados con al menos un aminoácido codificado de manera no natural . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia del supergen de la hormona del crecimiento (GH) (Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1991); Mott, H.R. y Campbell, I.D. Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. e Ihle, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS) representa un conjunto de proteínas con características estructurales similares. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un haz helicoidal cuádruple, la estructura general del cual se muestra en la Figura 1. Mientras aún existen más miembros de la familia aún a identificarse, algunos miembros de la familia incluyen lo siguiente: hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placental, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , interleucina-2 (IL-2) , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidad p35) , IL-13, IL-15, oncostatina M, factor neurotrópico ciliar, factor inhibidor de leucemia, interferón alfa, interferón beta, interferón gama, interferón omega, interferón tau, interferón epsilon, factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) , factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) , factor de estimulación de colonia de macrófago (M- CSF) y cardiotrofin-1 (CT-1) ("la familia del supergen GH") .
Los miembros de la familia del supergen GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, a pesar del hecho de que generalmente tienen identidad de secuencia de aminoácido o ADN limitada. Las características estructurales compartidas permiten nuevos miembros de la familia del gen para identificarse fácilmente. Las estructuras generales de los miembros de la familia hGH, EPO, INNa-2 y G-CSF se muestran en las Figuras 2 , 3 , 4 y 5 respectivamente . Los interferones son relativamente glicoproteínas pequeñas de una sola cadena liberadas por las células invadidas por los virus o expuestas a ciertas otras sustancias. Los interferones se agrupan actualmente en tres clases principales, designadas: 1) interferón de leucocito (interferón-alfa, a~interferón, IFN-a) , 2) interferón de fibroblasto (interferón-beta, ß-interferón, IFN-ß) y 3) interferón inmune (interferón gamma, ?-interferón, IFN-?) . En respuesta a la infección viral, los linfocitos sintetizan -interferón primario (con interferón omega, IFN-?) mientras que la infección de los fibroblastos usualmente induce la producción de ß-interferón, IFN-a e IFN-ß comparten aproximadamente 20-30 por ciento de homología de secuencia de aminoácido. El gen para los intriones que carecen IFN-ß humano y codifican una proteína que procesa el 29% de identidad de secuencia de aminoácido con IF?- humano, sugiriendo que los genes IF?-a e IF?-ß se han desarrollado a partir de un antepasado común (Taniguchi et al., Nature 285 547-549 (1980)). Mediante contraste, el IF?-? sintetizado por los linfocitos en respuesta a los mitógenos. IF?-a, IF?-ß e IF?-? se conocen por inducir la expresión del antígeno MHC Clase I y se refieren como interferones tipo I, mientras que IF?-? induce la expresión del antígeno MHC Clase II y se refiere como interferón tipo II. Se han identificado un gran número de genes distintos que codifican diferentes especies de IF?a. Los interferones alfa caen en dos clases principales I y II, conteniendo cada una, una pluralidad de proteínas discretas (Barón et al., Critical Reviews in Biotechnology 10, 179-190 (1990); Nagata et al., Nature 287, 401-408 (1980); Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980); Streuli et al., Science 209, 1343-1347 (1980); Goeddel et al., Nature 290, 20-26 (1981); Lawn et al., Science 212, 1159-1162 (1981); Ullrich et al., J. Mol. Biol. 156, 467-486 (1982); Weissmann et al., Phil . Trans. R. Soc. Lond. B299m 7-28 (1982); Lund et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 81, 2435-2439 (1984); Capón et al., Mol. Cell. Biol. 5, 768 (1985)). Las diversas especies de IFN-a incluyen IF?-aA (IF?- 2) , IF?- B, IF?-aC, IF?-aCl, IF?~aD (IF?-al) , IF?-aE, IF?- F, IF?- G, IF?-aH, IF?-al, IFN-alI , IF?-aI2, IF?- K, IF?- L, IF?- 4B, IF?-a5, IF?-a6, IF?- 74, IF?-cc76, IF?- 4a) , IF?-a88 y alelos del mismo. Los interferones se derivaron originalmente a partir de fuentes que ocurren de forma natural, tales como leucocitos cubiertos de capa leucocítica y células de fibroblastos, utilizando opcionalmente agentes de inducción para incrementar la producción de interferón. Los interferones también se han producido mediante tecnología de AD? recombinante . La clonación y la expresión del IF?-otA recombinante (IF?-aA) también conocido como IF?a2) se describió por Goeddel et al-, ?ature 287, 411 (1980). Las secuencias de aminoácido de IF?aA, B, C, D, F, G, H, K y L junto con las secuencias de nucleótido de codificación se describen por Pestka en Archiv. Biochem. Biophys. 221, 1 (1983). La - clonación y la expresión de IFNß maduro se describe por Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980). La clonación y la expresión del IFN? maduro se describen por Gray et al., Nature 295, 503 (1982). IFN? se han descrito por Capón et al., Mol. Cell. Biol. 5, 768 (1985). IFNt se ha identificado y descrito por Whaley et al., J. Biol. Chem. 269, 10864-8 (1994) . Los interferones tienen una variedad de actividads biológicas, incluyendo propiedades inmunoreguladores anti-virales y anti-proliferativas y se han utilizado como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer y varias enfermedades virales . Como una clase de interferón-a se han mostrado para inhibir varios tipos de proliferación celular y son útiles especialmente para el tratamiento de una variedad de trastornos de proliferación celular frecuentemente asociados con el cáncer, particularmente malignidades hematológicas tales como leucemias. Estas proteínas han mostrado actividad anti-proliferativa contra mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma de bajo grado, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crónica, carcinoma de célula renal, tumores de vejiga urinaria y cánceres de ovario (Bonnem, E. M. et al., (1984) J. Biol. Response Modifiers 3:580; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20:71). Ejemplos específicos de productos de IFN comercialmente disponibles incluyen IFN?-lb (Actimmune®) , IFNß-la (Avonex® y Rebif®) , IFNß-lb (Betaseron®) , IFN alfacon-1 (Infergen®) , IFNa-2 (Intron A®) , IFNa-2a (Royeron-A®) , Peginterferon alfa-2a (Pegasys®) y Peginterferon alfa-2b (PEG-Intron®) . Algunos de os problemas asociados con la producción de versiones PEGiladas de las proteinas IFN se describen en Wang et al., (2002) Adv. Drug. Deliv. Rev. 54:547-570; y Pedder, S.C. Semen Liver Dis. 2003;23 Suppl 1:19-22. Wang et al., isómeros posicionales caracterizados de PEG-Intron® y Pedder at al Pegasys® comparados con PEG-Intron® describiendo la inestabilidad de las químicas de PEGilación utilizadas y los efectos de formulación. A pesar del número de productos IFN actualmente disponibles en el mercado, existe una necesidad no conocida para los terapéuticos de interferón. Un miembro de la superfamilia del supergen GH es la hormona del crecimiento humano (hGH) . La hormona del crecimiento humano participa en mucho de la regulación del crecimiento y desarrollo humano normal . Esta hormona pituitaria de una sola cadena que ocurre de manera natural consiste de 191 residuos de aminoácido y tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kDa. hGH exhibe una multitud de efectos biológicos, incluyendo el crecimiento lineal (somatogénesis) , lactación, activación de macrófagos y efectos similares a la insulina y diabetogénicos, entre otros (Charla, R., et al., Ann . Rev. Med. 34:519-547 (1983); Isaksson, O., et al., Ann. Rev. Physiol . , 47:483-499 (1985); Hughes, J. y Friesen, H., Ann. Rev. Physiol . , 47:469-482 (1985)) . La estructura de hGH es bien conocida (Goeddel, D., et al., Nature 281:544-548 (1979)) y la estructura tridimensional de hGH se ha resuelto por cristalografía de rayos X (de Vos, A., et al., Science 255:306-312 (1992)). La proteína tiene una estructura globular compacta, comprendiendo haces helicoidales alfa antipáticos de cuatro, llamados A-D iniciando desde la N-terminal que se une a los ciclos. hGH también contiene cuatro residuos de cisterna que participan en dos uniones de disulfuro intramoleculares: C53 se empareja con C165 y C182 se empareja con C189. La hormona no se glicosila y se ha expresado en una forma secretada en E. coli (Chang, C. et al., Gene 55:189-196 (1987)). Se ha identificado un número de mutantes que ocurren de forma natural de hGH. Estos incluyen hGH-V (Seeberg, DNA 1:239 (1982); Patentes de E.U. Nos. 4,446,235, 4,670,393 y 4,665,180 que se incorporan en la presente mediante la referencia) y un hGH 20-kDa que contiene una supresión de los residuos 32-46 de hGH (Kostyo et al., Biochem. Biophys . Acta 925:314 (1987); Lewis, U. , et al., J". Biol . Chem. , 253:2679-2687 (1978)). Además, numerosas variantes de hGH, se logran a partir del procesamiento post- - - transcripcional, post-translacional, secretor, metabólico y otros procesos fisiológicos, que se han reportado (Baumann, G., Endocrine Reviews 12:424 (1991)). Los efectos biológicos del hGH se derivan a partir de su interacción con los receptores celulares específicos. La hormona es un miembro de una familia de proteínas homologas que incluyen lactógenos y prolactinas de placenta. hGH es inusual entre los miembros de la familia, sin embargo, en eso exhibe amplia especificidad de especies y une ya sea el receptor somatogénico clonado (Leung, D. et al., Nature 330:537-543 (1987)) o de prolactina (Boutin, J. et al., Cell 53:69-77 (1988)). En base a estudios estructurales y bioquímicos, se han propuesto mapas funcionales para los dominios de unión lactogénico y somatogénico (Cunningham, B. y Wells, J. , Proc. Nati. Acad. Sci. 88:3407 (1991)). El receptor hGH es un miembro de la familia del receptor hematopoyético/citosina/factor de crecimiento, que incluye varios otros receptores del factor de crecimiento, tales como los receptores de interleucina (IL)-3, -4 y -6, el receptor del factor de estimulación de colonia de macrófago de granulocito (GM-CSF) , el receptor de eritropoyetina (EPO) , así como el receptor G-CSF. Ver, Bazan, Proc. Nati . Acad, Sci EUA 87: 6934-6938 (1990) . Los miembros de la familia del receptor de citosina contienen cuatro residuos de cisterna conservados y un residuo de triptofan-serina-X-triptofan- - serina colocado justo fuera de la región de transmembrana. Las secuencias conservadas se cree que se involucran en las interacciones de proteína-proteína. Ver, e.g., Chiba et al., Biochim. Biophys . Res . Comm. 184: 485-490 (1992). La interacción entre hGH y el dominio extracelular de su receptor (hGHbp) se encuentra entre las interacciones de hormona-receptor más bien conocidas . Los datos cristalográficos de rayos X de alta resolución (Cunningham, B., et al., Science, 254:821-825 (1991)) han mostrado que hGH tiene dos sitios de unión a receptor y une dos moléculas de receptor secuencialmente utilizando distintos sitios en la molécula. Los dos sitios de unión a receptor se refieren como un Sitio I y un Sitio II. El Sitio I incluye el extremo de la terminal carboxi de la hélice D y parte de la hélice A y el ciclo A-B, en vista de que el Sitio II abarca la región de terminal amino de hélice A y una porción de hélice C. La unión de GH a su receptor ocurre secuencialmente con el primer Sitio I de unión. El Sitio II entonces embraga un segundo receptor GH , resultando en la dimerización y activación del receptor de las trayectorias de señalización intracelulares que conducen a las respuestas celulares a la hormona. Una luteína hGH en la cual se ha introducido una sustitución G120R en el sitio II es capaz de unir un solo receptor hGH, pero no es capaz de dimerizar dos receptores. La muteína actúa como un antagonista hGH in vitro, presumiblemente al ocupar sitios del receptor sin activar las trayectorias de señalización intracelulares (Fuh, G., et al., Science 256:1677-1680 (1992)). El hGH recombinante se utiliza como un terapéutico y se ha aprobado para el tratamiento de un número de indicaciones. La deficiencia del hGH conduce por ejemplo al enanismo que se ha tratado exitosamente por más de una década mediante administración exógena de la hormona. Además, para la deficiencia del hGH, el hGH se ha probado para el tratamiento de falla renal (en niños) , Síndrome de Turner y caquexia en pacientes con SIDA. Recientemente, la Administración de Comida y Droga (FDA) a probado hGH para el tratamiento de estatura corta no dependiente del GH. hGH también se encuentra actualmente bajo investigación para el tratamiento de envejecimiento, debilidad en edad avanzada, síndrome de intestino corto y falla del corazón congestiva. El hGH recombinante se vende actualmente como un producto inyectable diariamente, con cinco productos principales actualmente en el mercado: Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropoin™ (Pfizer) y Sainen/Serostim™ (Serono) . Sin embargo, un cambio significativo para utilizar la hormona del crecimiento como un terapéutico, es que la proteína tiene una vida media corta in vivo y por lo tanto, debe administrarse mediante inyección subcutánea diariamente para máxima efectividad (MacGillivray, et al., J". Clin . Endocrinol . Metab . 81: 1806-1809 (1996)). Se han enfocado considerables esfuerzos en medios para mejorar la administración de los agonistas y antagonistas de hGH, al bajar el costo de producción, haciendo la administración más fácil para el paciente, mejorando la eficacia y el perfil de seguridad y creando otras propiedades que pueden proporcionar una ventaj a competitiva. Por ejemplo, Genentech y Alkermer mercadean formalmente Nutropin Depot ™, una formulación de almacén de hGH para la deficiencia de la hormona del crecimiento pediátrica. Mientras que el almacén permite menos administración frecuente (una vez cada 2-3 semanas en lugar de una vez al día) también se asocia con efectos laterales no deseables, tales como bio-disponibilidad disminuida y dolor en el sitio de la inyección y se sacó del mercado en 2004. Otro producto, Pegvisomant™ (Pfizer) también se ha aprobado recientemente por la FDA. Pegvisomant™ es un análogo hecho genéticamente del hGH que funciona como un antagonista del receptor de la hormona de crecimiento altamente selectivo indicado para el tratamiento de acromegalia (van der Lely, et al., The Lancet 358: 1754-1759 (2001) . Aunque varios de los residuos de cadena lateral de aminoácido en Pegvisomant™ se derivatizan con polímeros de glicol de polietileno (PEG) , el producto aún se administra una vez al día, indicando que las propiedades farmacéuticas - - no son óptimas. Además de la PEGilación y las formulaciones de almacén, otras rutas de administración incluyendo formas de dosis de hGH inhaladas u orales, se encuentran bajo desarrollo de la etapa temprana pre-clínico y clínico y ninguno ha recibido aún la aprobación del FDA. De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad para un polipéptido que exhiba la actividad de la hormona del crecimiento pero que también proporcione una vida media del suero más larga y por lo tanto, niveles terapéuticos más óptimos del hGH y una vida media terapéutica incrementada. La unión covalente del poli (etilen glicol) del polímero hidrofílico abreviado PEG, es un método de incrementar la biocapacidad de solubilidad del agua, incrementando la vida media del suero, incrementando la vida media terapéutica , modulando la inmunogenicidad, modulando la actividad biológica o extendiendo en tiempo de circulación de muchas moléculas biológicamente activas, incluyendo proteínas, péptidos y particularmente moléculas hidrofóbicas. PEG se ha utilizado extensamente en farmacéuticos, sobre implantes artificiales y en otras aplicaciones son de importancia en donde la biocompatibilidad, carece de toxicidad y carece de inmunogenicidad. A fin de maximizar las propiedades deseadas de PEG, el peso molecular total y el estado de hidratación del polímero PEG o polímeros unidos a la molécula biológicamente activa debe ser suficientemente - - alta para impartir las características ventajosas típicamente asociadas con la unión del polímero PEG, tal como solubilidad del agua y vida media de circulación incrementada, mientras no se impacta de manera adversa la bioactividad de la molécula principal . Los derivados de PEG se enlazan frecuentemente a moléculas biológicamente activas a través de funcionalidades químicas reactivas, tales como residuos de lisina, cisterna e histidina, los residuos de N-terminal y carbohidrato. Las proteínas y otras moléculas con frecuencia tienen un número limitado de sitios reactivos disponibles para la unión del polímero. Con frecuencia, los sitios más adecuados para la modificación a través de la unión del polímero juegan un papel significativo en la unión al receptor y son necesarios para la retención de la actividad biológica de la molécula. Como un resultado, la unión indiscriminada de las cadenas de polímero a tales sitios reactivos sobre una molécula biológicamente activa con frecuencia conduce a una reducción significativa o aún la pérdida total de la actividad biológica de la molécula modificada por el polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para formar conjugados que tienen suficiente peso molecular del polímero para impartir las ventajas deseadas a una molécula objetivo, la técnica anterior enfoca que tiene típicamente la unión aleatoria involucrada de numerosas ramificaciones de polímero hacia la molécula, incrementando por lo tanto el riesgo de una reducción o aún la pérdida total en la bioactividad de la molécula principal. Los sitios reactivos que forman los sitios para la unión de los derivados de PEG a las proteínas se dictan mediante la estructura de la proteína. Las proteínas, incluyendo las enzimas, se componen de varias secuencias de aminoácidos alfa, que tienen la estructura general H2N—CHR— COOH. El residuo amino alfa (H2N--) de un aminoácido une el residuo carboxilo (--COOH) de una aminoácido adyacente para formar enlaces de amida que pueden representarse como - (NH— CHR— C0) a~ - , en donde el subíndice "n" puede igualar cientos o miles. El fragmento representado por R pueden contener sitios reactivos para la actividad biológica de la proteína y para la unión de los derivados PEG. Por ejemplo, en el caso de lisina aminoácido, existe un residuo —NH2 en la posición epsilon así como en la posición alfa. El epsilon --NH2 se encuentra libre para la reacción bajo las condiciones de pH básico. Mucho de la técnica en el campo de la derivatización de la proteína con PEG se ha dirigido a desarrollar derivados de PEG para unir al residuo --NH2 de epsilon de los residuos de lisina presentes en las proteínas . "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" ("Polietilen Glicol y Derivados de PEGilación Avanzada"), Néctar Molecular - Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Estos derivados PEG todos tienen la limitación común, sin embargo, no pueden instalarse selectivamente entre los frecuentes numerosos residuos de lisina presentes en las superficies de las proteínas. Esto puede ser una limitación significativa en instancias en donde un residuo de lisina es importante para la actividad de la proteína, existente en por ejemplo un sitio activo de la enzima o en casos en donde un residuo de lisina juega un papel al mediar la interacción de la proteína con otras moléculas biológicas, como en el caso de sitios de unión al receptor. Una segunda complicación e igualmente importante de métodos existentes para la PEGilación de la proteína es que los derivados de PEG pueden sufrir reacciones laterales no deseadas con residuos diferentes a aquellos deseados . La histidina contiene un residuo imino reactivo, representado estructuralmente como --N(H)--, pero muchas especies químicamente reactivas que reaccionan con epsilon --NH2 también pueden reaccionar con --N(H)--. Similarmente, la cadena lateral de la cisterna aminoácido porta un grupo de sulfidrilo libre representado estructuralmente como -SH. En algunas instancias, los derivados PEG dirigidos al grupo de epsiolon --NH2 de lisina, también reaccionan con cisterna, histidina u otros residuos . Esto puede crear mezclas heterogéneas complejas de moléculas bioactivas derivatizadas - de PEG y riesgos que destruyen la actividad de la molécula bioactiva a objetivarse. Debe ser deseable desarrollar derivados de PEG que permiten un grupo funcional químico a introducirse de uno o más polímeros PEG hacia la molécula bioactiva en los sitios específicos sobre la superficie de la proteína que es tanto bien definida como predecible . Además, a los residuos de lisina, considerables esfuerzos en la técnica se han dirigido hacia el desarrollo de los reactivos de PEG activados diferentes a las cadenas laterales de aminoácido, incluyendo cisteína, histidina y la N-terminal. Ver, e.g., la Pat. de E.U. No. 6,610,281 que se incorpora mediante la referencia en la presente y "polietilen Glicol y Derivados para PEGilación Avanzados" Néctar Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Un residuo de cisterna puede introducirse selectivamente al sitio en la estructura de proteínas utilizando mutagénesis dirigida al sitio y otras técnicas conocidas en la materia y resultando en el residuo de sulfidrilo resultante puede reaccionarse con derivados PEG que porta grupos funcionales reactivos al tiol. Este enfoque es complicado, sin embargo, en que la introducción de un grupo de sulfidrilo libre puede complicar la expresión, duplicando y estabilidad de la proteína resultante. Así, puede ser deseable tener un medio para introducir un grupo funcional químico en moléculas bioactivas que facilita el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la - - proteína mientras que simultáneamente son compatibles con (i.e., no embragar con reacciones laterales no deseadas) sulfidrilos y otros grupos funcionales químicos típicamente encontrados en las proteínas . Como puede observarse a partir de una muestra de la técnica, muchos de estos derivados que se han desarrollado para la unión a las cadenas laterales de proteínas, en particular, el residuo --NH2 sobre la cadena lateral de aminoácido de lisina y el residuo -SH sobre la cadena lateral de cisterna han probado ser problemáticos en su síntesis y uso. Algunas formas de enlaces no estables con la proteína que se someten a la hidrólisis a la hidrólisis y por lo tanto descomponen, degradan o son de otro modo inestables en ambientes acuosos, tales como en la corriente sanguínea. Ver Pedder, S.C. Semen Liver Dis. 2003;23 Suppl 1:19-22 para una discusión de la estabilidad de los enlaces en PEG-Intron®. Algunos forman enlaces más estables, pero se someten a la hidrólisis antes de que se forme el enlace, lo que significa que el grupo reactivo en el derivado PEG puede inactivarse antes de que pueda unirse la proteína. Algunos son algo tóxicos y por lo tanto menos adecuados para utilizarse in vivo. Algunos son muy lentos para reaccionar para ser prácticamente útiles. Algunos resultan en una pérdida de la actividad de la proteína al unir los sitios responsables de la actividad de la proteína. Algunos no son específicos en - los sitios al cual se unirán, que también puede resultar en una pérdida de la actividad deseable y en una carencia de reproductibilidad de los resultados. A fin de superar los cambios asociados con las proteínas de modificación con residuos de poli (etilen glicol), los derivados PEG que se han desarrollado son más estables (e.g., Patente de E.U. 6,602,498 que se incorpora en la presente mediante la referencia) o que reaccionan selectivamente con residuos tiol sobre las moléculas y superficies (e.g., Patente de E.U. 6,610,281 que se incorpora en la presente mediante la referencia) . Existe una clara necesidad en la técnica para los derivados PEG que son químicamente inertes en ambientes fisiológicos hasta que se llaman a reaccionar selectivamente para formar uniones químicas estables . Recientemente, se ha reportado una total tecnología nueva en las ciencias de la proteína, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con las modificaciones específicas del sitio de las proteínas. Específicamente, se han agregado nuevos componentes a la maquinaria biosintética de la proteína de Escherichia coli (E. coli) de procariote (e.g., L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y el Sacchro yces cerevisiae (S. cerevisiae) de eucariote (e.g., J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que ha facilitado la incorporación de aminoácidos no codificados genéticamente a las proteínas in vivo. Un número de nuevos aminoácidos con nuevas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluyendo etiquetas de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos ceto y aminoácidos glicosilados se han incorporado eficientemente y con alta fidelidad en las proteínas E. coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Ver, e.g., J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y L. Wang & P.G. Schultz, (2002), Chem. Comm. , 1-10. Estos estudios han demostrado que es possible introdcir selective y rutinariamente grupos químicos funcionales, tales como grupos cetona, grupos alquino y residuos azida que no se encuentran en las proteínas, que son químicamente inertes a todo de los grupos funcionales encontrados en 20 aminoácidos comunes generalmente codificados y que pueden utilizarse para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables . La capacidad de incorporar aminoácidos no genéticamente codificados en las proteínas permite la introducción de grupos funcionales químicos que pueden proporcionar alternativas valuables para los grupos funcionales que ocurren de forma natural, tales como epsilon -NH2 de lisina, el sulfidrilo -SH de cisterna, el grupo imino de histidina, etc. Ciertos grupos funcionales químicos se conocen que son inertes a los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados pero reaccionan limpia y eficientemente para formar enlaces estables. Los grupos azida y acetileno, por ejemplo, se conocen en la técnica por sufrir una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] en condiciones acuosas en la presencia de una canidad catalítica de cobre. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) Org . Chem. 67:3057-3064; y Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Al introducir un residuo azida en por ejemplo una estructura de proteína, es capaz de incorporar un grupo funcional que es químicamente inerte a las aminas, sulfidrilos, ácidos carboxílicos, grupos hidroxilo encontrados en las proteínas, pero también reaccionan suave y eficientemente con un residuo de acetileno para formar un producto de cicloadición. De forma importante, en la ausencia del residuo de acetileno, la azida permanece químicamente inerte y no reactiva en la presencia de otras cadenas laterales de proteína y bajo condiciones fisiológicas. La presente invención se dirige, entre otras cosas, a problemas asociados con la actividad y producción de polipéptidos de interferón y también se dirige a la producción de un polipéptido de interferón con propiedades biológicas o farmacológicas mejoradas, tales como vida media - terapéutica mejorada. BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona miembros de la familia de supergen GH, incluyendo polipéptidos hlFN, comprendiendo uno o más aminoácidos codificados no de manera natural . En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una o más modificaciones post-translacionales . En algunas modalidades, el polipéptido hlFN se enlaza a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN se enlaza a un polímero bifuncional, enlazador bifuncional o al menos un polipéptido hlF? adicional. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural se enlaza a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol) . En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) es un polímero bifuncional. En algunas modalidades, el polímero bifuncional se enlaza a un segundo polipéptido. En algunas modalidades, el segundo polipéptido es un polipéptido hlF?. En algunas modalidades, el polipéptido hlF? comprende al menos dos aminoácidos enlazados a un polímero soluble en agua que comprende un residuo de poli (etilen glicol) . En algunas modalidades, al menos un aminoácido es un aminoácido codificado no de manera natural.
- - En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural e incorporan en cualquier posición en uno o más de las siguientes regiones correspondientes a estructuras secundarias en IFN como sigue .-1-9 (N-terminal) , 10-21 (hélice A) , 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) , 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y la hélice E) , 137-155 (hélice E) , 156-165 (C-terminal) (SEQ ID NO:24 o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificados no de manera natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en IFN: antes de la posición 1 (i.e. en la N terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97 , 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden - uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las posiciones siguientes: 100, 106, 107, 108, 111, 113, 114 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las posiciones siguientes: 41, 45, 46, 48, 49 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las posiciones siguientes: 61, 64, 65, 101, 103, 110, 117, 120, 121, 149 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 6, 9, 12, 13, 16, 96, 156, 159, 160, 161, 162 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, el aminoácido que no ocurre naturalmente en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua, incluyendo pero sin limitarse a las posiciones; antes de la posición 1 (i.e., en la N terminal) ), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97 , 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo) (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID N0:23 o 25). En algunas modalidades, los aminoácidos que no ocurren naturalmente se enlazan a un polímero soluble en agua en una o más de las siguientes posiciones: 6, 9, 12, 13, 16, 41, 45, 46, 48, 49, 61, 64, 65, 96, 100, 101, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 117, 120, 121, 149, 156, 159, 160, 161 y 162 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones proporcionando un antagonista: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69 , 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 o cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 24 o - los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25); un polipéptido hlFN que comprende una de estas sustituciones puede actuar potencialmente como un antagonista débil o agonista débil dependiendo del sitio seleccionado y la actividad deseada. El antagonista IFN humano incluye pero no se limita a aquellos con sustituciones en 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 o cualquier combinación de los mismos (hlFN; SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que modula la afinidad del polipéptido hlFN para un receptor de polipéptido hlFN. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que incrementa la estabilidad del polipéptido hlFN. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que modula la inmunogenicidad del polipéptido hlFN. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que modula la vida media del suero o tiempo de circulación del polipéptido hlFN. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que incrementa la solubilidad acuosa del polipéptido hlFN. En algunas - modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que incrementa la solubilidad del polipéptido hlFN producido en una célula huésped. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución, adición o supresión que incrementa la expresión del polipéptido hlFN en una célula huésped o sinteiza in Vitro. En algunas modalidades, el polipéptido hlF? comprende una sustitución, adición o supresión que incrementa la resistencia a la proteasa del polipéptido hlF?. En algunas modalidades las sustituciones de aminoácido en el polipéptido hlF? pueden ser con aminoácidos que se presentan de manera natural o que no ocurren naturalmente, siempre que al menos una sustitución sea con un aminoácido codificado no de manera natural . En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carboxilo, un grupo aminoxi, un grupo hidrazina, un grupo hidracida, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación amino terminal y R es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de carboxi terminal . En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo aminooxi . En algunas modalidades el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo hidracida. En algunas modalidades el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo hidrazina. En algunas modalidades el residuo de aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo semicarbazida . En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo azida. En algunas modalidades el aminoácido codificado no de manera natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación amino terminal y R3 es - H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de carboxi terminal . En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo alquino . En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; X es 0, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación amino terminal y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de carboxi terminal . En algunas modalidades, el polipéptido es un agonista de polipéptido hlFN, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso. En algunas modalidades, el agonista de polipéptido hlFN, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el agonista del polipéptido hlFN, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso comprende un aminoácido codificado no de manera natural y uno o más modificación post-translacional, enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural a un polímero soluble en agua se encuentra presente dentro de la región del Sitio II (la región de la proteína que abarca la cara del haz helicoidal AC, la región amino terminal de hélice A y una porción de la hélice C) del polipéptido hlFN. En algunas modalidades el polipéptido hlFN comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que evita la dimerización del receptor del polipéptido hlFN al evitar que el antagonista del polipéptido hlFN se una a una segunda molécula del receptor de polipéptido hlF?. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones astringentes a la SEQ ID ?O: 26 o 27 en donde el polinucleótido comprende al menos un codón selector. En algunas modalidades, el codón selector se selecciona del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro y un codón de cuatro bases . La presente invención también proporciona métodos - de elaborar un polipéptido hlFN enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto un polipéptido hlFN aislado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural con un polímero soluble en agua que comprende un residuo que reacciona con el aminoácido no naturalmente codficado. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlF? es reactivo hacia un polímero soluble en agua que es de otro modo no reactivo hacia cualquiera de los 20 aminoácidos comunes. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlF? es reactivo hacia un polímero enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que es de otro modo no reactivo hacia cualquiera de los 20 aminoácidos comunes . En algunas modalidades, el polipéptido hlF? enlazado al polímero soluble en agua se hace al reaccionar un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido que contiene carbonilo con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo aminooxi, hidrazina o semicarbazida para la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace de amida. En algunas modalidades, el polipéptido hlF? enlazado al polímero soluble en agua se hace al reaccionar una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo - carbonilo con un polipéptido que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidracida o semicarbazida. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN enlazado al polímero soluble en agua se hace al reaccionar un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido que contiene alquino con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un residuo de azida. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se enlaza a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace de amida. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN enlazado al polímero soluble en agua se hace al reaccionar un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido que contiene azida con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un residuo de alquino. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se enlaza a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace de amida. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular entre 0.1 kDa y 50 kDa. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) es un polímero ramificado. En algunas modalidades, cada ramificación del polímero de poli (etilen glicol) ramificado tiene un peso molecular entre 1 kDa y 100 kDa o entre 1 kDa y 50 kDa. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua enlazado al polipéptido hlFN comprende un residuo de polialquilen glicol. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlFN comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidracida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlFN comprende un residuo de carbonilo y el polímero soluble en agua comprende un residuo de aminooxi, hidracidao semicarbazida. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlFN comprende un residuo de alquino y el polímero soluble en agua comprende un residuo de azida. . En algunas modalidades, el residuo de aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlFN comprende un residuo azida y el poli'mero soluble en agua comprende un residuo de alquino. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural se - enlaza a un polímero soluble en agua. La presente invención también proporciona células que comprenden un polinucleótido que codifica el polipéptido hlFN que comprende un codón selector. En algunas modalidades, las células comprenden una sintetasa de ARN ortogonal y/o R?Nt ortogonal para sustituir un aminoácido codificado no de manera natural en el polipéptido hlF?. La presente invención también proporciona métodos para elaborar un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido codificado no de manera natural. En algunas modalidades, los métodos comprenden cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido hlF?, una sintetasa SRN ortogonal y/o AR?t ortogonal bajo condiciones para permitir la expresión del polipéptido hlF?; y purificar el polipéptido hlF? a partir de las células y/o medio de cultivo. La presente invención también proporciona métodos para incrementar la vida media terapéutica, la vida media del suero o el tiempo de circulación de los polipéptidos hlF?. La presente invención también proporciona métodos para modular la inmunogenicidad de los polipéptidos hlF?. En algunas modalidades, los métodos comprenden sustituir un aminoácido codificado no de manera natural para cualquiera de uno o más aminoácidos en polipéptidos hlF? que se presentan de manera natural y/o enlazar el polipéptido hlF? a un - - enlazador, un polímero, un polímero soluble en agua o una molécula biológicamente activa. La presente invención también proporciona métodos para tratar un paciente en la necesidad de tal tratamiento con una cantidad efectiva de una molécula hlFN de la presente invención. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido codificado no de manera natural y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural se enlaza a un polímero soluble en agua. La presente invención también proporciona polipéptidos hlF? que comprenden una secuencia mostrada en la SEQ ID ?O: 23, 24, 25 o cualquier otra diferente a la secuencia de polipéptido hlF?, excepto que al menos un aminoácido se sustituya mendiante un aminoácido codificado no de manera natural. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural se enlaza a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidracida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino.
- - La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido hlFN que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO : 23, 24, 25 o cualquiera diferente a la secuencia del polipéptido IF?, en donde al menos un aminoácido se sustituye por un aminoácido codificado no de manera natural. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural comprende un residuo de sacárido. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua se enlaza al polipéptido a través de un residuo de sacárido. En algunas modalidades, un enlzador, polímero o molécula biológicamente activa se enlaza al polipéptido hlF? a través de un residuo de sacárido. La presente invención también proporciona un polipéptido hlF? que comprende un polímero soluble en agua enlazado a través de una unión covalente hacia el polipéptido hlF? en un solo aminoácido. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol) . En algunas modalidades, el aminoácido covalentemente enlazado al polímero soluble en agua es un aminoácido codificado no de manera natural presente en el polipéptido. La presente invención proporciona un polipéptido hlF? que comprende al menos un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa, en donde dicho enlazador, polímero o - molécula biológicamente activa se encuentra unido al polipéptido a través de un grupo funcional de un aminoácido codificado no de manera natural, ribosomalmente incorporado en el polipéptido. En algunas modalidades el polipéptido es mono PEGilado. La presente invención también proporciona un polipéptido hlFN que comprende un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que se une a uno o más aminoácidos codificados no de manera natural en donde dicho aminoácido codificado no de manera natural se incorpora ribosomalmente en el polipéptido en los sitios preseleccionados . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un diagrama de la estructura general para las proteínas de haz helicoidal de cuatro. La Figura 2 muestra un diagrama de la estructura general para la Hormona de Crecimiento (GH) de la proteína de haz helicoidal de cuatro. La Figura 3 muestra un diagrama de la estructura general para la Eritropoyetina (EPO) de la proteína de haz helicoidal de cuatro. La Figura 4 muestra un diagrama de la estructura general para Inferieron alfa-2 (IFNa-2) de la proteína de haz helicoidal de cuatro. La Figura 5 muestra un diagrama de la estructura general para el Factor de Estimulación de Colonia de Granulocito (G-CSF) de la proteína de haz helicoidal de cuatro . La Figura 6 muestra un SDS-PAGE teñido de azul Coomassie demostrando la expresión de hGH que comprende p-acetil fenilalanina del aminoácido codificado no de manera natural en cada una de las siguientes posiciones: Y35, F92, Ylll, G131, R134, K140, Y143 o K145. La Figura 7, paneles A y B muestran un diagrama de la actividad biológica del hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural (Panel B) y hGH tipo silvestre (Panel A) en células IM9. La Figura 8 muestra un SDS-PAGE teñido de azul Coomassie demostrando que la producción de hGH comprende un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado mediante unión covalente de PEG (5, 20 y 30 kDa) hacia el aminoácido codificado no de manera natural . La Figura 9 muestra un diagrama que demuestra la actividad biológica de varias formas PEGiladas del hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural en las células IM9. La Figura 10, Panel A, esta figura representa la estructura primaria de hGH con los sitios de división indicados de tripsina y la sustitución del aminoácido no natural, F92pAF especificado con una flecha (la Figura modificada por Becker et al., Biotechnol Appl Biochem (1988) 10 (4) :326-337) . La Figura 10, Panel B, muestra sobrepuestos mapas trípticos de péptidos generados a partir de un polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado (etiquetado A) , péptidos generados a partir de un polipéptido hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural (etiquetado B) y péptidos generados a partir de WHO rhGH (etiquetado C) . La Figura 10, Panel C, muestra una modificación del pico 9 desde el Panel B. La Figura 11, Panel A y B muestran el análisis SDS- PAGE teñido de azul Coomassie de polipéptidos PEG-hGH purificado. La Figura 12, muestra un diagrama de la actividad biológica de una molécula de dímero hGH sobre las células IM9. La Figura 13 , Panel A, muestra un diagrama de los datos del ensayo IM-9 midiendo la fosforilación de pSTAT5 mediante el antagonista hGH con la sustitución G120R. La Figura 13, Panle B, muestra un diagrama délos datos del ensayo IM-9 midiendo la fosforilación de pSTAT5 mediante un polipéptido hGH con un aminoácido no natural incorporado en la misma posición (G120) . La Figura 14, muestra un diagrama indicando que el dímero del antagonista hGH mostrado en la Figura 13, Panel B también carece de actividad biológica en el ensayo IM-9.
- - La Figura 15, muestra un diagrama que compara la vida media del suero en ratas del polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado con el polipéptido hGH que no está PEGilado. La Figura 16, muestra un diagrama que compara la vida media del suero en ratas de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado. La Figura 17, muestra un diagrama que compara la vida media del suero en ratas de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado. Las ratas se dosificaron una vez con 2.1 mg/kg. La Figura 18, Panel A, muestra un diagrama del efecto del peso del cuerpo de la rata ganado después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado (posición 35, 92) . La Figura 18, Panel B, muestra un diagrama del efecto de los niveles de circulación del plasma IGF-1 después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado (posición 35, 92) . La Figura 18,' Panel C, muestra un diagrama del efecto del peso del cuerpo de la rata ganado después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que - es PEGilado (posición 92, 134, 145, 131, 143) . La Figura 18, Panel D, muestra un diagrama del efecto de los niveles de circulación del plasma IGF-1 después de la administración de una sola dosis de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado (posición 92, 134, 145, 131, 143) . La Figura 18, Panel E, muestra un diagrama que compara la vida media del suero en ratas de los polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural que es PEGilado (posición 92 , 134, 145, 131, 143) . DEFINICIONES Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, construcciones y reactivos particulares descritos en la presente y como tal puede variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir solo modalidades particulares y no se intenta limitar el alcance de la presente invención, que solo se limitará por las reivindicaciones anexas . Como se utiliza en la presente y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Así, por ejemplo, la referencia a "hlFN" es una referencia de uno o más de tales proteínas e incluye equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia y así sucesivamente. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por el experto ordinario en la materia al cual pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse cualquiera de los métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes por aquellos descritos en la presente en la práctica o probando la invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente mediante la referencia para el propósito de describir y desglosar por ejemplo las construcciones y metodologías que se describen en las publicaciones, que pueden utilizarse junto con la invención presentemente descrita. Las publicaciones tratadas en la presente se proporcionan solo por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe construirse como una admisión de que los inventores no son titulares a la ante-fecha de tal descripción por virtud de la invención o cualquiera otra razón. El término "sustancialmente purificado" se refiere a un polipéptido hlFN que puede estar sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan - - 0 interactúan con las proteínas como se encuentran en su ambiente que ocurre naturalmente, i.e., célula natural o célula huésped en el caso de polipéptidos hlFN producidos recombinantemente. El polipéptido hlFN que puede estar sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de la proteína que tiene menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% (por peso seco) de la proteína contaminante. Cuando el polipéptido hlFN o variante del mismo se produce recombinantemente mediante las células huésped, la proteína puede estar presente a aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2% o aproximadamente 1% o menos del peso seco de las células. Cuando el polipéptido hlFN o variante del mismo se produce recombinantemente mediante las células huésped, la proteína puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/1, aproximadamente 4 g/1, aproximadamente 3 g/1, aproximadamente 2 g/1, aproximadamente 1 g/1, aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, - aproximadamente 50 mg/l, aproximadamente 10 mg/l o aproximadamente 1 mg/l o menos del peso seco de las células. Así, el polipéptido "sstancialmente purificado" como se produce por los métodos de la presente invención puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, específicamente un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85% y más específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99% o mayor como se determinó por métodos apropiados tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforésis capilar. Una "célula huésped recombinante" o "célula huésped" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, sin considerar el método utilizado para la inserción, por ejemplo absorción, transducción, emparej amiento-f u otros métodos conocidos en la técnica para crear células huésped recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado por ejemplo un plásmido o alternativamente puede integrarse en el genoma huésped.
- - Como se utiliza en la presente, el término "medio" o "medios" incluye cualquier soporte medio, solución, sólido, semi-sólido o rígido de cultivo que puede soportar o contener cualquier célula huésped, incluyendo células huésped bacteriales, células huésped de levadura, células huésped de insecto, células huésped de planta, células huésped eucarióticas, células huésped de mamífero, células CHO o E. coli y contenidos de célula. Así, el término puede abarcar el medio en el cual la célula huésped ha crecido, e.g., el medio en el cual el polipéptido hlFN se ha secretado, incluyendo el medio ya sea antes o después de la etapa de proliferación. El término también puede abarcar amortiguadores o reactivos que contienen lisados de célula huésped, tal como en el caso en donde se produce el polipéptido hlFN intracelularmente y las células huésped se lisan o rompen para liberar el polipéptido hlFN. "Agente de reducción" como se utiliza en la presente con respecto a re-hacer la proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene grupos sulfidrilo en el estado reducido y reduce las uniones e disulfuro intra o intermoleculares . Los agentes de reducción adecuados incluyen pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT) , 2-mercaptoetanol , ditioeritritol, cisterna, cisteamina (2-aminoetanotiol) y glutationa reducida. Es fácilmente aparente para aquellos de experiencia ordinaria en la materia que son adecuados una amplia variedad de los agentes de reducción para utilizarse en los métodos y composiciones de la presente invención. "Agente oxidizante" como se utiliza en la presente con respecto al re-hacer la proteína, se define como cualquier compuesto o material que es capaz de retirar un electrón a partir de un compuesto que se oxidiza. Los agentes oxidizantes adecuados incluyen pero no se limitan a glutationa oxidizada, cisteína, cista ina, ditiotrenitol oxidizado, eritreitol oxidizado y oxígeno. Es fácilmente aparente para aquellos de experiencia ordinaria en la materia que son adecuados una amplia variedad de agentes oxidizantes para utilizarse en los métodos de la presente invención. "Agente de desnaturalización" o "desnatural" como se utiliza en la presente, se define como cualquier compuesto o material que provocará el no hacer reversible una proteína. La resistencia de un agente de desnaturalización o desnatural se determinará tanto por las propiedades como la concentración del agente desnaturalizante natural o desnatural. Los agentes desnaturalizantes o desnaturales adecuados pueden ser caotropes, detergentes, solventes orgánicos, solventes miscibles en agua, fosfolípidos o una combinación de dos o más de tales agentes. Los caotropes adecuados incluyen pero no se limitan a urea, guanidina y tiocianato de sodio. Los detergentes útiles pueden incluir - pero no se limitan a detergentes fuertes tales como dodecil sulfato de sodio o éteres de polioxietileno (e.g., detergentes Tween o Tritón) , detergentes medios no iónicos Sarkosyl (e.g., digitonin) , detergentes medios catiónicos tales como N?2 , 3- (Dioleyoxi) -propil-N,N,N-trimetílamonío, detergentes medios iónicos (e.g., colato de sodio o deoxicolato de sodio) o detergentes zwiteriónicos incluyendo pero sin limitarse a, sulfobetaminas (Zwittergent) , sulfato de 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-1-propano (CHAPS) y sulfonato de 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-l-propano (CHAPSO) . Los solventes orgánicos miscibles en agua tales como acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente alcanoles C2~C4 tales como etanol o isopropanol) o alcandioles inferiores (especialmente alcandioles C2-C4 tales como etilen-glicol) pueden utilizarse como desnaturantes. Los fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos que se presentan de manera natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol o derivados de fosfolípido sintético o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina . "Re-hecho" como de utiliza en la presente describe cualquier proceso, reacción o método que transforma la unión de disulfuro que contiene polipéptidos a partir de un estado hecho o no hecho indebidamente hacia una conformación hecha adecuadamente con respecto a las uniones de disulfuro. "Co-hacer" como se utiliza en la presente, se refiere específicamente a procesos, reacciones o métodos de re-hacer que emplean al menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y resultan en la transformación de polipéptidos no hechos o indebidamente hechos a polipéptidos nativos, adecuadamente hechos. Como se utiliza en la presente "interferón" o "IFN" debe incluir aquellos polipéptidos y proteínas que tienen al menos una actividad biológica de un interferón humano, incluyendo pero sin limitarse a IFNa, IFNß, IFN?, IFN?, IFNe, o IFN t (tal como aquellos descritos en la Patente de E.U. 4,414,150; 4,456,748; 4,727,138 4,762,791, 4,929,554 5,096,705; 4,695,623; 4,614,651 4,678,751 4,925,793 5,460,811; 5,120,832; 4,780,530 4,908,432 4,970,161 4,973,479; 4,975,276; 5,098,703 5,278,286 5,661,009 6,372,206; 6,433,144; 6,472,512 6,572,853 6,703,225 6,200,780; 6,299,869; 6,300,475 6,323,006 6,350,589 5,705,363; 5,738,845; 5,789,551 6,117,423 6,174,996 5,540,923; 5,541,293; 5,541,312; 5,554,513; 5,593,667 que se incorporan en la presente mediante la referencia) , así como análogos IFN, isoformas IFN, miméticos IFN, fragmentos IFN, proteínas IFN híbridas, oligómeros y multímeros de proteínas de fusión, homólogos, variantes del patrón de glicosilación, y luteínas de los mismos sin considerar la actividad - - biológica del mismo y además sin considerar el método de síntesis o elaboración del mismo incluyendo pero sin limitarse a métodos activados recombinantes (ya sea producidos a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético u otra forma de ácido nucleico) , sintético, transgénico y de gen. Ejemplos específicos de IFN incluyen pero no se limitan a, IFN?-lb (Actimmune®) , IF?ß-la (Avonex® y Rebif®) , IF?ß-lb (Betaseron®) , IF? de concenso, IF? alfacon-1 (Infergen®) , IF?a-2 (Intron A®),IF?a-2a (Roferon-A®) , Peginterferon alía2a (Pegasys®) , Peginterferon alfa-2b (PEG-Intron®) , análogo de IF?, mutantes de IF?, IF? humano glicoslado alterado y análogos IF? conjugado de PEG. Ejemplos específicos de células modificadas para la expresión de IF? humano endógeno se describen en Devlin et al., J. Leukoc. Biol. 41:306 (1987); Patente de E.U. ?o. 6,716,606; 6,610,830; 6,482,613; 6,489,144; 6,159,712; 5,814,485; 5,710,027; 5,595,888; 4,966,843; 6,379,661; 6,004,548; 5,830,705; 5,582,823; 4,810,643 y 6,242,218; que se incorporan en la presente mediante la referencia. El término "IF? humano (hlF?) " o "polipéptido hlF?" se refiere al interferón o IF? como se describe arriba, así como a un polipéptido que retiene al menos una actividad biológica de un hlF? que ocurre naturalmente . Los polipéptidos IF? incluyen las sales y prodrogas farmacéuticamente aceptables y prodrogas de las sales, polimorfes, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente activos y estereoisómeros del IFN humano que ocurre naturalmente y fusiones de polipéptido de los mismos. Ejemplos de polipéptidos hlFN incluyen pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de E.U. Nos. 4,604,284; 5,582,824; 6,531,122 6,204,022; 6,120,762; 6,046,034; 6,036,956; 5,939,286 5,908,626; 5,780,027; 5,770,191; 5,723,125; 5,594,107 5,378,823; 4,898,931; 4,892,743 que se incorporan en la presente mediante la referencia. Las fusiones comprenden aminoácidos adicionales en la terminal amino, la terminal carboxi o ambas que se abarcan mediante el término "polipéptido hlFN" . Fusiones ejemplificativas incluyen pero no se limitan a, e.g., IFN de metionilo que es un metionilo que se enlaza a la N Terminal del hlFN resultante a partir de la expresión recombinante de la forma madura de hlFN que carece del péptido de señal de secreción o porción del mismo, fusiones para el propósito de purificación (incluyendo pero sin limitarse a, poli-histidina o epítopes de afinidad) , fusiones con péptidos de unión a albúmina de suero y fusiones con proteínas de suero tales como albúmina de suero. El ácido nucleico de hlFN que ocurre naturalmente y las secuencias de aminoácido para formas de longitud total y madura se conocen como las variantes tales como variantes de ácido amino sencillas o variantes de empalme.
- El interferón de consenso es un interferín recombinante tipo 1 que contiene 166 aminoácidos. El IFN de consenso se derivo al explorar las secuencias de varios interferones naturales alfa y asignar el aminoácido más frecuentemente observado en cada posición correspondiente . El IFN de consenso, cuando se compara sobre una base de masa igual con IFNa-2a y a-2b en ensayos in vi tro, típicamente despliega actividad biológica de 5-10 veces mayor (Blatt et al., J. Inferieron Cytokine Res. 1996; 16:489-99). Para la secuencia de aminoácido IFNa-2a de longitud total que ocurre naturalmente así como la secuencia de aminoácido IFNa-2a madura que ocurre naturalmente, ver en la presente la SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 respectivamente. En algunas modalidades los polipéptidos hlFN de la invención son sustancialmente idénticos a la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de interferón. Las moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes hlFN y polipéptidos hlFN mutantes son bien conocidos e incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en las Patentes de E.U. Nos. 6,331,525; 6,069,133; 5,955,307; 5,869,293; 5,831,062; 5,081,022; 5,004,689; 4,738,931; 4,686,191; que se incorporan en la presente mediante la referencia. Ejemplos de mutantes hlFN incluyen aquellos descritos en las Patentes de E.U. Nos. 6,514,729 y 5,582,824, que se incorporan en la presente mediante la referencia.
Los interferones tienen una variedad de actividades biológicas, incluyendo propiedades inmunoreguladoras y antiproliferativas anti-virales y se han utilizado como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer y varias enfermedades virales. Los interferones-a han mostrado que inhiben varios tipos de proliferación celular y son especialmente útiles para el tratamiento de una variedad de trastornos de proliferación celular frecuentemente asociados con el cáncer, particularmente malignidades hematológicas tales como leuceminas. Estas proteínas han mostrado actividad anti-proliferativa contra mielona múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma de bajo grado, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crónica, carcinoma de la célula renal, tumores de vejiga urinaria y cánceres de ovario (Bonnem, E.M. et al. (1984) J. Biol. Response Modifiers 3:580; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20 :71) . Los IFNa son útiles contra varios tipos de infecciones virales (Finter, ?.B. et al. (1991) Drugs 42(5):749). Los interferones-a han mostrado actividad contra la infección del virus de papiloma humano, infecciones de Hepatitis B y Hepatitis C (Finter, ?.B. et al., 1991, supra; Kashima, H. et al., (1988) Laryngoscope 98:334; Dusheiko, G. M. et al. (1986) J. Hematology 3 (Suple. 2):S199; Davis, G. L et al. (1989) ?. England J. Med. 321:1501) . Se ha - investigado el papel del los interferones y los receptores de interferón en la patogénesis de ciertas enfermedades autoinmunes e inflamatorias (Benoit, P. et al. (1993) J. Immunol . 150(3) -. 101) . Además, el interferón-a se ha probado para utilizarse para el tratamiento de enfermedades tales como leucemia de célula capilar, carcinoma de célula renal, carcinoma de célula basal, melanoma maligno, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, mieloma múltiple, leucemia mielógena crónica, linfoma no de Hodgkin, papilomatosis laríngea, micosis fungoidea, condiloma acuminata, hepatitis B crónica, hepatitis C, hepatitis D crónica y hepatitis crónica no A, no B/C. Los interferones se han implicado en la patogénesis de varias enfermedades autoinmnes, tales como eritematosis de lupus sistémico, enfermedad de Behcet y diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM también referida como diabetes tipo I) . Se ha demostrado en un modelo de ratón transgénico que la expresión de la célula ß de IFN-a pueda provocar la insulitas y la IDDM (WO 93/04699, publicada en Marzo 18 de 1993) . La producción de IFN-? e IFN-a impares se ha observado en pacientes con esclerosis múltiple (MS) . El IFN-a se ha detectado en el suero de muchos pacientes con SIDA y se ha reportado que la producción de IFN-? se ha suprimido grandemente en suspensiones de células mononucleares estimuladas con mitógeno derivadas de pacientes - con SIDA. Para un revisión ver por ejemplo, Capítulo 16 "The Presence and Posible Pathogenic Role of Interferons in Disease", En: Interferones y Otras Citocinas Reguladoras, Edgard de Maeyer (1988, John Wiley and Sons publishers) . Los interferones alfa y beta se han utilizado en el tratamiento de la enfermedad viral aguda de herpes zoster (t.C. Meritan et al, N. Engl. J. Med. 298, 981-987 (1978); E. Heidemann et al., Onkologie 7, 210-212 (1984)), infecciones virales crónicas, e.g., infecciones de hepatitis C y hepatitis B (R. L. Knobler et al., Neurology 34, 1273078 (1984); M. A. Faerkkilae et al., Act. Neurol. Sci. 69, 184-185 (1985)), rIFNa-2a (Roferon®, Roche) es una formulación en inyección indicada en utilizarse para el tratamiento de leucemia celular capilar y sarcoma de Kaposi relacionada con SIDA. El IFNa-2b Recombinante (Intron A™, Schering) se ha probado para el tratamiento de leucemia celular capilar, casos seleccionados de verruga acuminada, sarcoma de Kaposi relacionada con SIDA, infecciones de hepatitis C y hepatitis B crónica en ciertos pacientes . Las composiciones de múltiples subtipos de IF?a también se utilizan para tratar una variedad de enfermedades (Multiferon®, Viragen, Inc.). IF??lb (Actimmune®, Intermune Pharmaceuticals, Inc.) se encuentra comercialmente disponible para el tratamiento de la enfermedad granulomatosa crónica y osteoporosis maligna. Las actividades biológicas del tipo IF?s se han - descrito y se conocen en la materia y pueden encontrarse por ejemplo en Pfeffer, Semen. Oncol. 24 (suppl 9), S9-63-S9-69 (1997) y las Patentes de E.U. Nos. 6,436,391; 6,372,218 6,270,756 6,207,145 6,086,869 6,036,949 6,013,253 6,007,805 5,980,884 5,958,402 5,863,530 5,849,282 5,846,526 5,830,456 5,824,300 5,817,307 5,780,021 5,624,895 5,480,640 5,268,169 5,208,019 5,196,191 5,190,751 5,104,653; 5,019,382; 5,959,210; que se incorporan en la presente mediante la referencia. Los IFNa son miembros de diversas superfamilias de haz helicoidal de genes de citosina (Sprang, S.R. et al. (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:815-827). Los interferones humanos a se codifican por una familia de más de 20 genes no alélicos serialmente duplicados que comparten 85-98% de identidad de secuencia en el nivel aminoácido (Heneo, K. et al. (1985) J. Mol. Biol. 185:227-260). El IFNß humano es un polipéptido regulador con un peso molecular de aproximadamente 22 kDa que consiste de 166 residuos de aminoácido. Este puede producirse por la mayoría de las células en el cuerpo, en particular fibroblastos, en respuesta a la infección viral o exposición de otros agentes. Este une a un receptor de superficie de célula multimérica y la unión del receptor productivo resultando en una cascada de eventos intracelulares que conducen a la expresión de genes inducibles por IFNß que a su vez producen efectos que pueden - clasificarse como anti-virales, anti-proliferativos e inmunomoduladores . Se conoce la secuencia aminoácido de IFNß humana y se reportó "por ejemplo por Taniguchi, Gene 10:11-15, 1980 y en la EP 83069, EP 41313 y la Pat. de E.U. No . 4,686,191 que se incorporan en la presente mediante la referencia. Las estructuras de cristal de han reportado para el IF?ß humano y murino respectivamente (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:11813-11818, 1997; J. Mol. Biol. 253:187-207; Patente de E.U. No. 5,602,232; 5,460,956; 5,441,734; 4,672,108; que se incorporan en la presente mediante la referencia) . Se han revisado en Cell Mol. Life Sci. 54:1203-1206, 1998. Se han reportado las variantes de IFNß (WO 95/25170, WO 98/48018, Pat. de E.U. No. 5,545,723; Pat. de E.U. No. 4,914,033, EP 260350, Pat. de E.U. No. 4,588,585, Pat. de E.U. No. 4,769,233, Stewart et al, ADN Vol.6 no.2 1987 pp. 119-128, Runkel et al, 1998, J. Biol. Chem. 273, No. 14, pp. 8003-8008, que se incorporan en la presente mediante la referencia) . Se ha reportado la expresión de IFNß en células CHO (Pat. de E.U. No. 4,966,843, Pat. de E.U. No. 5,376,567 y Pat. de E.U. No. 5,795,779, que se incorporan en la presente mediante la referencia) . Se han reportado moléculos IFNß con un patrón y métodos de glicosilación particulares para su preparación (EP 287075 y EP 529300) . Las preparaciones comerciales de IFNß se venden - bajo los nombres de Betaseron® (también llamado interferón ßlb, que no es glicosilado, producido utilizando células bacteriales recombinantes, , que tienen una supresión del residuo de metionina de Terminal N y la mutación C17S) y Avonex® y Rebif® (también llamado interferón ßla, que es glicosilado, producido utilizando células de mamífero recombinantes) para el tratamiento de pacientes con esclerosis múltiple que han mostrado ser efectivos en reducir la tasa de exacerbación y más pacientes permanecen libres de exacerbación por periodos prolongados de tiempo como se comparó con pacientes tratados con placebo. Además, se reduce la tasa de acumulación de discapacidad (Neurol. 51:682-689, 1998) . La comparación de IFNßla con respecto a la estructura y función se han presentado en Pharmaceut . Res. 15:641-649. IFNßlb ha mostrado que retarda la progresión de la esclerosis múltiple, un recurrente entonces progresa la enfermedad degenerativa inflamatoria del sistema nervioso central . IFNß puede tener efectos inhibidores en la proliferación de leucocitos y presentación del antígeno. IFNß puede modular el perfil de la producción de citosina hacia un fenotipo anti-inflamatorio. IFNß puede reducir la migración de la célula T al inhibir la actividad de metaloproteasas de matriz de la célula T. Estas actividades se enlazan para actuar en concierto para contar con el - mecanismo de IFNß en MS (Neurol. 51:682-689, 1998). IFNß puede utilizarse para el tratamiento de osteosarcoma, carcinoma de célula basal, displasia cervical, glioma, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de seno, melanoma e infecciones virales tales como virus de papiloma, hepatitis viral, herpes genitales, herpes zoster, queratitis herpética, herpes simples, encefalitis viral, neumonía de citomegalovirus y rinovirus. Varios efectos laterales se encuentran asociados con el uso de preparaciones actuales de IFNß, incluyendo reacciones en el sitio de la inyección, fiebre, escalofríos, mialgias, artralgias y otros síntomas similares al resfriado (Clin. Therapeutics, 19:883-893, 1997). Dada la multitud de efectos laterales con los productos de IFNß recurrentes, su asociación con la inyección frecuente, el riesgo de desarrollo de anticuerpos neutralizantes que impiden el efecto terapéutico deseado de IF?ß y el potencial para obtener más niveles de IF?ß terapéuticos óptimos con efecto terapéutico mejorado concomitante, existe una clara necesidad para moléculas similares a IF?ß mejorados. Como se utiliza en la presente, "hormona de crecimiento" o "GH" debe incluir aquellos polipéptidos y proteínas que tienen al menos una actividad biológica de una hormona de crecimiento humana, así como análogos de GH, - - isoformas GH, miméticos GH, fragmentos GH, proteínas híbridas GH, oligómeros de proteínas de fusión y multímeros, homólogos, variantes del patrón de glicosilación y luteínas de los mismos, a pesar del método de síntesis o elaboración del mismo incluyendo pero sin limitarse a métodos recombinates (ya sea producidos a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético y otra forma de ácido nucleico) , sintéticos, transgénicos y activados por gen. El término "polipéptido hGH" abarca los polipéptidos hGH que comprenden una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido. Sustituciones ejemplificativas incluyen, e.g., la sustitución de lisina en una posición 41 o la fenilalanina en la posición 176 del hGH nativo. En algunos casos, la sustitución puede ser un residuo de isoleucina o arginina si la sustitución se encuentra en la posición 41 o es un residuo de tirosina si la posición es 176. La posición FIO puede sustituirse con e.g., A, H o I. La posición M4 puede sustituirse con e.g., W, Q o G. Otras sustituciones ejemplificativas incluyen cualquier sustitución o combinación de las mismas, incluyendo pero sin limitarse a: R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; R167E, D171S, E174S, F176Y; F10A, M14W, H18D, H21N; F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; - F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, E174S, F176Y, I179T; FIOH, M14G, H18N, H21N; FlOA, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, T175T, I179T; o F10I, M14Q, H18E, R167N, D171S, I179T; Ver e . g. la Patente de E.U. No. 6,143,523, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Se han descrito sustituciones ejemplificativas en una amplia variedad de posiciones de aminoácido en hGH que se presentan de manera natural, incluyendo sustituciones que incrementan la actividad agonista, incrementando la resistencia a la proteasa, convirtiendo el polipéptido en un antagonista, etc. Y se abarcan por el término "polipéptido hGH" . Las secuencias agonistas hGH incluyen e.g., la secuencia hGh que ocurre naturalmente comprendiendo las siguientes modificaciones H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, I179T. Ver, e .g. , la Patente de E.U. No. 5,849,535, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Las secuencias hGH agonistas adicionales incluyen H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; o H18D, Q22A,^ F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A. Ver, e . g. , la Patente de E.U. No. 6,022,711 que se incorpora en la presente mediante la referencia. Los polipéptidos hGH comprenden sustituciones en H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, - E65A, K168A, E174A mejorando la afinidadpara el receptor hGH en el sitio I. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,854,026, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Las secuencias hGH con resistencia incrementada para las proteasas incluye pero no se limita a polipéptidos hGH que comprenden una o más sustituciones de aminoácido dentro del ciclo C-D. En algunas modalidades, las sustituciones incluyen pero no se limitan a, R134D, T135P, K140A y cualquier combinación de los mismos. Ver, e .g. , Alam et al. (1998) J. Biotechnol 65:183-190. Los antagonistas de la Hormona del Crecimiento Humana incluyen e.g., aquellas con sustituciones en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F o G120E) y algunas veces incluyen además las siguientes sustituciones: H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A. Ver, e . g. , la Patente de E.U. No. 6,004,931, que se incorpora en la presente mediante la referencia. En algunas modalidades los antagonistas hGH comprenden al menos una sustitución en las regiones 106-108 o 127-129 que provocan GH para actuar como un antagonista. Ver, e . g. , la Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora en la presente mediante la referencia. En algunas modalidades el antagonista hGH comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en la región de unión del Sitio II de la molécula hGH. En algunas - modalidades, el polipéptido hGH comprende además las siguientes sustituciones: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T con una sustitución en G120 ( Ver, e. g. , la Patente de E.U. 5,849,535). Para la secuencia de aminoácido GH de longitud total que ocurre naturalmente así como la secuencia de aminoácido GH madura que ocurre naturalmente y el mutante que ocurre naturalmente, ver la SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO : 3 respectivamente en la presente. En algunas modalidades, los polipéptidos hGH son sustancialmente idénticos a la SEQ ID NO : l o SEQ ID ?O : 2 o SEQ ID ?O : 3 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de la hormona del crecimiento. Se ha identificado un número de mutantes que se presentan de manera natural de hGH. Estos incluyen hGH-V (Seeberg, DNA 1:239 (1982); Patentes de E.U. Nos .4, 446, 235, 4,670,393 y 4,665,180 que se incorporan en la presente mediante la referencia) y un hGH de 20-kDa que contiene una supresión de los residuos 32-46 de hGH (SEQ ID N0:3) (Kostyo et al., Biochem. Biophys . Acta 925:314 (1987); Lewis, U. , et al., J. Biol . Chem. , 253:2679-2687 (1978)). La hormona del crecimiento placental se describe en Igout, A. et al., Nucleic Acids Res . 17(10) :3998 (1989)). Además, numerosas variantes de hGH, se alcanzan desde el procesamiento post-transcripcional, , post-translacional, secretor, matabólico y otros procedimientos fisiológicos que se han reportado - incluyen variantes de la cadena o proteolíticamente divididas (Baumann, G. , Endocrine Reviews 12: 424 (1991)) . Los dímeros hGH enlazados directamente a través de enlaces de disulfuro Cys-Cys se describen en Lewis, U. J. , et al., ". Biol . Chem. 252:3697-3702 (1977); Brostedt, P. y Roos, P., Prep. Biochem. 19:217-229 (1989)). Las moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes hGH y mutan polipéptidos hGH son bien conocidas e incluyen pero no se limitan a aquellas descritas en las Patentes de E.U. Nos. 5,534,617; 5,580,723; 5,688,666 5,750,373 5,834,250; 5,834,598; 5,849,535; 5,854,026 5,962,411 5,955,346; 6,013,478; 6,022,711; 6,136,563 6,143,523 6,428,954; 6,451,561; 6,780,613 y la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0153003; que se incorporan en la presente mediante la referencia. Las preparaciones comerciales de hGH se venden bajo los nombres: Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-?ordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Sainen/Serostim™ (Serono) . El término "polipéptido hGH" también incluye las sales y prodrogas farmacéuticamente aceptables de las sales, polimorfes, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente activas y estereoisómeros de hGH que ocurre naturalmente así como variantes agonistas, miméticos y antagonistas del hGH que ocurre naturalmente y fusiones de polipéptido de los mismos. Las fusiones comprenden aminoácidos adicionales en la Terminal amino, Terminal carboxilo o ambas, que se abarcan por el término "polipéptido hGH". Fusiones ejemplificativas incluyen, pero no se limitan a, e.g., hormona de crecimiento de metionilo en la cual una metionina se enlaza a la Terminal N del hGH resultante a partir de la expresión recombinante, fusiones para el propósito de purificación (incluyendo pero sin limitarse a epítopes de poli-histidina o de afinidad) , fusiones con péptidos de unión de albúmina de suero y fusiones con proteínas de suero tales como albúmina de suero. Varias referencias describen la modificación de polipéptidos mediante la conjugación o glicosilación del polímero. El término "polipéptido hlF?" incluye los polipéptidos conjugados a un polímero tal como PEG y pueden comprenderse de uno o más derivatizaciones adicionales de cisterna, lisina u otros residuos. Además, el polipéptido hlF? puede comprender un enlazador o polímero, en donde el aminoácido al cual se conjuga el enlazador o polímero puede ser un aminoácido no natural de acuerdo con la presente invención o puede conjugarse a un aminoácido codificado naturalmente utilizando técnicas conocidas en la materia como el acoplamiento a lisina o cisterna. Se ha reportado la conjugación del polímero de los polipéptidos hGH. Ver, e.g., Pats . de E.U. Nos. 5,849,535, 6,136,563 y 6,608,183 que se incorporan en la presente - mediante la referencia. Se ha reportado la modificación del polímero de IFNß nativo o una variante C17S del mismo (EP 229108, Pat. de E.U. No. 5,382,657; EP 593868; Pat. de E.U. No. 4,917,888 y WO 99/55377, que se incorporan en la presente mediante la referencia). La Pat. de E.U. No. 4,904,584 describe los polipéptidos de lisina PEGilados reducidos, en donde al menos un residuo de lisina se ha reducido o reemplazado con cualquier otro residuo de aminoácido. La WO 99/67291 describe un proceso para conjugar una proteína con PEG, en donde al menos se reduce un residuo de aminoácido en la proteína y la proteína se contacta con PEG bajo condiciones suficientes para lograr la conjugación con la proteína. La WO 99/03887 describe variantes PEGiladas de polipéptidos que pertenecen a la superfamilia de la hormona del crecimiento, en donde un residuo de cisterna se ha sustituido con un residuo de aminoácido no esencial ubicado en una región específica del polipéptido. Ejemplos de moléculos IFN PEGiladas incluyen aquellas descritas en la Patente de E.U. No.: 6,524,570; 6,250,469; 6,180,096; 6,177,074; 6,042,822; 5,981,709; 5,951,974; 5,908,621; 5,738,846; 5,711,944; 5,382,657, que se incorporan en la presente mediante la referencia. IFNß se mencionó como un ejemplo de un polipéptido que pertenece a la superfamilia de la hormona del crecimiento. La WO 00/23114 describe IFNß glicosilado y pegilado. La WO 00/23472 describe las proteínas de fusión de IFNß. La WO 00/26354 describe un método de producir una variante de polipéptido glicosilado con alergenicidad reducida, que como se comparó con un polipéptido principal correspondiente comprende al menos un sitio de glicosilación adicional . IFNß se describe como un ejemplo entre muchos polipéptidos que pueden modificarse de acuerdo con la tecnología descrita en la Pat. de E.U. No. 5,218,092. El término "polipéptido hlFN" también incluye formas glicosiladas N enlazadas u O enlazadas del polipéptido. Estas formas incluyen pero no se limitan a, un polipéptido con un sitio de glicosilación O enlazado en la posición 129 de la SEQ ID NO: 23 o la posición equivalente de la SEQ ID NO: 24 o 25 o cualquier otro polipéptido IFN (Adolf et al., Biochem. J. 276:511 (1991). Las variantes que contienen cambios de un solo nucleótido también se consideran como variantes biológicamente activas del polipéptido hlFN. Además, también se incluyen las variantes empalmadas . El término "polipéptido hlFN" también incluye heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros u homomultímeros del polipéptido hlFN de cualquiera o uno o más polipéptidos hlFN o cualquier otro polipéptido, proteína, carbohidrato, polímero, molécula pequeña, ligando u otra molécula activa de cualquier tipo, enlazado por medios químicos o expresados como un proteína de fusión, así como análogos de polipéptido que contienen por ejemplo, supresiones específicas u otras modificaciones que aún mantienen actividad biológica. Todas las referencias en las posiciones aminoácidos en hGH que se describen en la presente se basan en la posición en la SEQ ID NO: 2, a menos que se especifique de otro modo (i.e., cuando se encuentra en estado que la comparación se basa en la SEQ ID N0:1, 3 u otra secuencia de hGH) . Todas las referencias para las posiciones de aminoácido en hlFN que se describen en la presente se basan en la posición en la SEQ ID NO: 24, a menos que se especifique de otro modo (i.e., cuando se encuentra en estado que la comparación se basa en la SEQ ID NO: 23, 25 u otra secuencia hlFN) . El experto en la materia apreciará que las posiciones aminoácidos correspondientes a las posiciones en la SEQ ID NO: 23, 24, 25 o cualquier otra secuencia de IFN pueden identificarse fácilmente en cualquier otra molécula hlFN tal como fusiones, variantes, fragmentos, etc, de hlFN . Por ejemplo, los programas de alineamiento de secuencia tales como BLAST pueden utilizarse para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde con una posición en la SEQ ID NO: 23, 24, 25 u otra secuencia IFN. Las sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos descritos en la presente con referencia a la SEQ ID NO: 23, 24, 25 u otra secuencia IFN se intentan también para referirse a las sustituciones, supresiones o adiciones en las posiciones correspondientes en las fusiones, variantes, fragmentos, etc. de hlFN descritos en la presente o conocidos en la materia y se abarcan expresamente por la presente invención. Identificaciones y análisis similares se aplican a la SEQ ID ?0:1, 2, 3 o cualquier otra secuencia GH. El término "polipéptido hlF?" abarca los polipéptidos hlF? que comprenden una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido. Los polipéptidos hlFN de la presente invención pueden comprenderse de modificaciones con uno o más aminoácidos naturales junto con una o más modificaciones de aminoácidos no naturales. Se han descrito sustituciones ejemplificativas en una amplia variedad de posiciones de aminoácido en polipéptidos hlFN que se presentan de manera natural, incluyendo pero sin limitarse a sustituciones que modulan uno o más de las actividades biológicas del polipéptido hlF?, tal como pero sin limitarse a, incrementar la actividad agonista, incrementar la solubilidad del polipéptido, convertir el polipéptido en un antagonista, etc. y se abarcan por el término "polipéptido hlF?" . Los antagonistas GH humanos incluyen, pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición en la posición 1 (i.e., en la Terminal N) o cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 2 o el aminoácido correspondiente en SEQ ID N0:1, 3 o cualquier otra secuencia GH) . En algunas modalidades, los antagonistas hGH comprenden al menos una sustitución en las regiones 1-5 (terminal N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el ciclo A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el ciclo B-C) ; 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el ciclo C-D), 154-183 (hélice D) , 184-191 (Terminal C) que provoca que GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios ejemplificativos de incorporación de un aminoácido codificado no de manera natural incluye residuos dentro de la región amino terminal de la hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, la sustitución de G120 con un aminoácido codificado no de manera natural tal como p-azido-L-fenilalanina u O-propargil-L-tirosina. En otras modalidades, las sustituciones antes listadas se combinan con sustituciones adicionales que provocan que el polipéptido GH sea un antagonista hGH. Por ejemplo, un aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una de las posiciones identificadas en la presente y se introduce una sustitución simultánea en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F o G120E) . En algunas modalidades, el antagonista hGH comprende un aminoácido codificado no de - manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en una región de unión al receptor de la molécula hGH. Los antagonistas GH humano incluyen, pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 o cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 24 o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 23, 25 o cualquier otra secuencia IFN) ; un polipéptido hlFN que comprende una de estas sustituciones puede actuar potencialmente como un antagonista débil o agonista débil dependiendo del sitio seleccionado y la actividad deseada. Los antagonistas IFN humanos incluyen pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 o cualquier combinación de los mismos )hIFN; SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . En algunas modalidades, los antagonistas hlFN comprenden al menos una sustitución en las regiones 1-9 (terminal N) , 10-21 (hélice A) , 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) ; 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y E) , 137-155 (hélice E) , 156-165 (terminal C) que provoca que IFN actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios ejemplificativos de incorporación de un aminoácido codificado no de manera natural incluye residuos dentro de la región amino terminal de la hélice A y una porción de la hélice C. En otras modalidades, las sustituciones arriba listadas se combinan con sustituciones adicionales que provocan que el polipéptido hlFN sea un antagonista hlF?. En algunas modalidades, el antagonista hlF? comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en una región de unión a receptor de la molécula hlF?. En algunas modalidades, los polipéptidos hlF? compreden además una adición, sustitución o supresión que modula la actividad biológica del polipéptido hlF?. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o supresiones pueden modular la afinidad para el receptor del polipéptido hlF?, modular (incluyendo pero sin limitarse a incrementos o decrementos) la dimerización del receptor, estabilizar los dímeros del receptor, modular la vida media circulante, modular la vida media terapéutica, modular la estabilidad del polipéptido, modular la dosis, modular la liberación o biodisponibilidad, facilitar la purificación o mejorar o alterar una ruta particular de administración. Similarmente, los polipéptidos hlFN pueden comprender secuencias de división de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión a anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a FLAG o poli-His) u otra afinidad en base a las secuencias (incluyendo pero sin limitarse a FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero sin limitarse a, biotina) que mejoran la detección (incluyendo pero sin limitarse a, GFP) , la purificación u otras características del polipéptido. El término "polipéptido hlFN" también abarca homodímeros, heterodímeros, homomultímeros y heteromultímeros que se enlazan, incluyendo pero sin limitarse a aquellos directamente enlazados a través de cadenas laterales de aminoácido no codificadas naturalmente, ya sea las mismas o diferentes cadenas laterales de aminoácido no codificadas naturalmente, para las cadenas laterales de aminoácido codificadas naturalmente o indirectamente a través de un enlazador. Los enlazadores ejemplificativos incluyen pero no se limitan a polímeros solubles en agua tales como poli (etilen glicol) o polidextrano o un polipéptido. Un "aminoácido codificado no de manera natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos o pirolisina o selenocisteína comunes. Otros términos que pueden utilizarse de forma igual con el término "aminoácido no cidificado naturalmente" son "aminoácido no natural" , "aminoácido desnatural", "aminoácido que no ocurre naturalmente" y de forma variable versiones separadas y no separadas de las mismas . El término "aminoácido codificado no de manera natural" también incluye pero no se limita a, aminoácidos que ocurren mediante modificación (e.g. modificaciones post-translacionales) o un aminoácido codificado naturalmente (incluyendo pero sin limitarse a los 20 aminoácidos o pirolisina y selenocisteína comunes) pero que no se incorporan naturalmente por sí mismos en una cadena de polipéptido de crecimiento mediante el complejo de traslación. Ejemplos de tales aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen, pero no se limitan a N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina. Un "grupo de modificación amino Terminal" se refiere a cualquier molécula que puede unirse a la terminal amino de un polipéptido. Similarmente, un "grupo de modificación de terminal carboxi" se refiere a cualquier molécula que puede unirse a la Terminal carboxi de un polipéptido . Los grupos de modificación de Terminal incluyen, pero no se limitan a, varios polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas tales como albúmina de suero u otros residuos que incrementan la vida media del suero de los péptidos . Los términos "grupo funcional" , "residuo activo" , "grupo de activación" , "grupo de partida" , "sitio reactivo" , - "grupo químicamente reactivo" y "residuo químicamente reactivo" se utilizan en la materia y en la presente para referirse a distintas porciones o unidades definibles de una molécula. Los términos son algo sinónimos en las técnicas químicas y se utilizan en la presente para indicar las proporciones de las moléculas que llevan a cabo alguna función o actividad y son reactivos con otras moléculas . El término "enlace" o "enlazador" se utiliza en la presente para referirse a los grupos o uniones que normalmente se forman como resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes . Los enlaces hidrolíticamente estables se refiere a aquellos enlaces que son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua en los valores pH útiles, incluyendo pero sin limitarse a por debajo de condiciones fisiológicas por un periodo extendido de tiempo, tal vez aún indefinidamente. Los enlaces hidrolíticamente no estables o degradables se refiere a aquellos enlaces que son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo por ejemplo, sangre. Los enlaces enzimáticamente no estables o degradables se refiere a aquellos enlaces que pueden degradarse mediante una o más enzimas. Como se entiende en la materia, PEG y los polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en el elemento principal del polímero y uno o más de los grupos funcionales de terminal de la molécula del polímero. Por - ejemplo, los enlaces de éster formados mediante la reacción de los ácidos carboxílicos de PEG o ácidos carboxílicos de PEG activados con grupos alcoholes sobre un agente biológicamente activo que se hidroliza generalmente bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen pero no se limitan a, enlaces de carbonato; enlaces de imina que resultan de la reacción de una amina y un aldehido; los enlaces de éster de fosfato formados al reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; los enlaces de hidrazona que son el producto de reacción de una hidrazida y un aldehido; los enlaces de acétalo que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que son el producto de reacción de un formato y un alcohol; enlaces de péptido formados mediante un grupo amina incluyendo pero sin limitarse a, en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótido formados mediante un grupo de fosforamidita, incluyendo pero sin limitarse a, en el extremo de un polímero y un grupo 5 'hidroxilo de un oligonucleótido. El término "molécula biológicamente activa" , "residuo biológicamente activo" o "agente biológicamente activo" cuando se utiliza en la presente se refiere a cualquier sustancia que puede afectar cualquiera de las propiedades físicas o bioquímicas de un organismo biológico, - incluyendo pero sin limitarse a, virus, bacterias, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se utiliza en la presente, las moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia intentada para el diagnóstico, cura, migración, tratamiento o prevención de la enfermedad en humanos u otros animales o para de otro modo mejorar el buen estado físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, drogas de molécula pequeña, colorantes, lípidos, nucleósidos, oligonucleóidos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para utilizarse con la invención, incluyen pero no se limitan a, antibióticos, fungicidas, agentes anti-virales, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-tumor, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedad, hormonas, factores del crecimiento, agentes esferoidales y lo similar. Un "polímero bifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales separados que son capaces de reaccionar específicamente con otros residuos (incluyendo pero sin limitarse a, grupos laterales de aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes.
Un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en un segundo componente biológico, puede utilizarse para formar un conjugado que incluye el primer componente biológicamente activo, el enlazador bifuncional y el segundo componente biológicamente activo. Se conocen muchos procedimientos y moléculas de enlazador para la unión de varios compuestos a los péptidos . Ver, e. g. , Solicitud de Patente Europea No. 188,256; Patentes de E.U. Nos . 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; y 4,589,071 que se incorporan en la presente mediante la referencia. Un "polímero multi-funcional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales separados que son capaces de reaccionar específicamente con otros residuos (incluyendo pero sin limitarse a, grupos laterales de aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes . En donde los grupos sustituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escrito de izquierda a derecha, igualmente abarcan los sutituyentes químicos idénticos que pueden resultar a partir de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo la estructura -CH20- es equivalente a la estructura -OCH2- . El término "sustituyentes" incluyen pero no se limitan a "sustituyentes de no interferencia" . Los "sustituyentes de no interferencia" son aquellos grupos que produces compuestos estables . Los sustituyentes de no interferencia o radicales adecuados incluyen, pero no se - limitan a, halo, alquilo C?-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, alcoxi C1-C10, aralquilo C1-C12, alcarilo C?-C12, cicloalquilo C3~C?2, cicloalquenilo C3-Ca2/ fenilo, fenilo sustituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C12, alcoxiarilo C2-C?2, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C?2, alquilsulfinilo d-Cg, alquilsulfonilo C?-C10, --(CH2)m -O— (alquilo C1-C10) en donde m es desde 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, --N02, --CN, - -NRC (0)- (alquilo Cx-Cio) , --C(O)- (alquilo C?-C?0) , alquil tioalquilo C2-C?0, --C (O) 0-- (alquilo C1-C10) , --OH, --S02, =S, --COOH, --NR2, carbonilo, --C(O)-- (alquilo C1-C10)-CF3, --C(0)-CF3, --C(0)NR2, --(arilo C1-C10) - S-- (arilo C6-C?o) , —C (O) -- (arilo Ca-C10) , -- (CH2)m—O— (-- (CH2)m—O- - (alquilo CX- LO) en donde cada m es desde 1 a 8, --C(0)NR2, --C(S)NR2, --S02NR2, --NRC(0)NR2, --NRC(S)NR2, sales de los mismos y lo similar. Cada R como se utiliza en la presente es H. alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, aralquilo o alcarilo. El término "halógeno" incluye floro, cloro, yodo y bormo . El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere, a menos que se especifique de otro modo, a una cadena recta o ramificada o radical de hidrocarburo cíclico o una combinación de los mismos, que - puede ser completamente saturado, mono o poliinsaturado y puede incluir radicales di y multivalentes, que tienen designado el número de átomos de carbono (i.e., C?-C10 se refiere a uno o diez átomos de carbono) . Ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciciohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y lo similar. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alaquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2 -propenilo, crotilo, 2-isopentilo, 2- (butadienilo) , 2,4-pentadienilo, 3- (1, 4-pentadienilo) , etinilo, propinilo 1 y 3, 3 -butinilo y homólogos e isómeros mayores . El término "alquilo" , a menos que se especifique de otro modo también se refiere a que incluye aquellos derivados de alquilo definidos en más detalle abajo, tal como "heteroalquilo" . Los grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarburos se llaman "homoalquilo" . El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical divalente derivado a partir de un alcano como se ejemplificó, pero no se limita, mediante las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2- e incluye además aquellos grupos descritos abajo como "heteroalquileno". Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá desde 1 a 24 átomos de carbono con aquellos grupos que tienen 10 o algunos átomos de carbono siendo preferidos en la presente invenció. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho o algunos átomos de carbono. Los términos "alcoxi" , "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) como se utilizan en su sentido convencional y se refieren a aquellos grupos unidos a un remanente de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre respectivamente. El término "heteroalquilo" por sí mismo o en combinación con otro término se refiere a menos que se establezca de otro modo, a una cadena estable recta o ramificada o radical de hidrocarburo cíclico o combinaciones de los mismos, consistiendo de el número establecido de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de 0, N, Si y S y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidizarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente. El (los) heteroátomo (s) O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición a la cual el grupo alquilo se une al remanente de la molécula. Ejemplos incluyen pero no se limitan a, -CH2CH2-0- - CH3, -CH2CH2-NH-CH3, -CH2CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2CH2-s(0)-CH3, -CH2CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -SÍ(CH3)3-, -CH2-CH=N-OCH3 y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como por ejemplo -CH2NH-OCH3 y -CH2-0-Si(CH3)3. Similarmente, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical divalente derivado a partir de heteroalquilo como se ejemplificó, pero sin limitarse por -CH2CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para los grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos pueden también ocupar cualquiera o ambas terminales de cadena (incluyendo pero sin limitarse a, alquilenoxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno y lo similar) . Aún además, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, la no orientación de los grupos de enlace se implica por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'-representa tanto -C (O) 2R' como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocilcoalquilo" por sí mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se establezca de otro modo, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo" respectivamente. Así, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluye enlaces en anillo saturado o insaturado. Adicionalmente, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo - puede ocupar la posición en la cual se une el heterociclo al remanente de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, ciclopentilo y lo similar. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1- (1, 2,5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3 -piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-il, tetrahidrofuran-3-il, tetrahidrotien-2-il, tetrahidrotien-3-il, 1-piperacinilo, 2-piperacinilo y lo similar. Adicionalmente, el término abarca estructuras en anillo bicíclicas y tricíclicas. Similarmente, el término "heterocicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical divalente derivado a partir de heterocicloalquilo y el término "cicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical divalente derivado a partir de cicloalquilo. Como se utiliza en la presente, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en solventes acuosos. El enlace de los polímeros solubles en agua a los polipéptidos hlFN puede resultar en cambios incluyendo pero sin limitarse a, vida media del suero incrementada o modulada o vida media terapéutica incrementada o modulada con relación a la forma no modificada, inmunogenicidad modulada, características de asociación físicas moduladas tales como agregación o formación de multímero, unión al receptor alterado y dimerización o multimerización del receptor alterado. El polímero soluble en agua puede o no puede tener su propia actividad biológica. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol, propionaldehído de polietilen glicol, mono alcoxi C1-C10 o derivados ariloxi de los mismos (descrito en la Patente de E.U. No. 5,252,714 que se incorpora en la presente mediante la referencia) , monometoxi-polietilen glicol, polivinil pirrolidona, polivinil alcohol, ácidos de poliamino, anhídrido maléico de diviniléter, N- (2-Hidroxipropil) -metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluyendo sulfato de dextrano, polipropilen glicol, copolímero de óxido de polipropilen óxido/etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo pero sin limitarse a metilcelulosa y carboximetil celulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilen glicol y derivados de los mismos, copolímeros de polialquilen glicoles y derivados de los mismos, polivinil etil éters y alfa-beta-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartamida y lo similar o mezclas de los mismos. Ejemplos de tales polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol y albúmina de suero . Como se utiliza en la presente, el término "polialquilen alcohol" o "poli (alqueno glicol)" se refiere a polietilen glicol (poli (etilen glicol)), polipropilen glicol, polibutilen glicol y derivados de los mismos. El término "polialquilen glicol" abarca tanto polímeros lineales como ramificados y pesos moleculares promedio de entre 0.1 kDa y 100 kDa. Otras modalidades ejemplificativas se listan por ejemplo, en catálogos de suministro comercial, tal como el catálogo de Shearwater Corporation "Polietilen Glicol y Derivados de Aplicaciones Biomédicas" (2001) . El término "arilo" se refiere, a menos que se establezca de otro modo, al sustituyente de hidrocarburo aromático poliinsaturado que puede ser de un solo anillo o múltiples anillos (preferentemente desde 1 a 3 anillos) que se fusionan juntos o enlazan covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen desde uno a cuatro heteroátomos seleccionados a partir de N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre se oxidizan opcionalmente y el (los) átomo (s) de nitrógeno se cuaternizan opcionalmente. Un grupo heteroarilo puede unirse al remanente de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo o heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, piracinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5- - izaxolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 2-isoquinolilo, 2 -quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas en anillo de arilo y heteroarilo arriba anotados se seleccionan a partir del grupo de sustituyentes aceptables descritos abajo. Por brevedad, el término "arilo" cuando se utiliza en combinación con otros términos (incluyendo pero sin limitarse a, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluyen tanto anillo de arilo como de heteroarilo como se define arriba. Así, el término "arilalquilo" se refiere a que incluye aquellos radicales en los cuales se une un grupo arilo hacia un grupo alquilo (incluyendo pero sin limitarse a, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y lo similar) incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (incluyendo pero sin limitarse a, grupos metileno) se ha reemplazado mediante por ejemplo, un átomo de oxígeno (incluyendo pero sin limitarse a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (l-naftiloxi) propilo y lo similar) . Cada uno de los términos anteriores (incluyendo pero sin limitarse a, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroailo" ) se refieren a que incluyen tanto formas sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Se - proporcionan abajo sustituyentes ejemplificativos para cada tipo de radical . Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos con frecuencia referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de los grupos seleccionados a partir de, pero sin limitarse a: -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (O) NR"R" ' , -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"' , -S(0)R', -S(0)2R', S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en un número que varía desde cero a (2m'+l), en donde m' es el número total de átomos de carbono en tal un radical. R' , R" , R" ' y R"" cada una independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo pero sin limitarse a arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada uno de los grupos R' , R" , R" ' y R"" cuando se encuentra presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo - de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" se refiere a que incluye, pero no se limita a, l-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusión anterior de sustituyentes, un experto en la materia entenderá que el término "alquilo" se refiere a que incluye los grupos que incluyen uniones de átomos de carbono a grupos diferentes a los grupos de hidrógeno, tal como haloalquilo (incluyendo pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero sin limitarse a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y lo similar) . Similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustitiyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan a partir de, pero sin limitarse a: halógeno, -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R' , -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (O) NR"R" ' , NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"' )=NR"", -NR-C (NR'R" ) =NR" ' , -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, -ch(Ph)2, flúor alcoxi (C?-C4) y flúor alquilo (C?-C4) en un número que varía desde cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en donde R' , R" , R" ' y R"" se seleccionan independientemente a partir de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona - independientemente como son cada uno de los grupos R' , R" , R" ' y R"" cuando se encuentra presente más de uno de estos grupos . Como se utiliza en la presente, el término "vida media del suero modulada" se refiere a el cambio positivo o negativo en la vida media circulante de una molécula modificada biológicamente activa con relación a su forma no modificada. La vida media del suero se mide al tomar muestras sanguíneas en varios puntos de tiempo después de la administración de la molécula biológicamente activa y determinar la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración del suero con el tiempo permite el cálculo de la vida media del suero. La vida media incrementada del suero deseablemente tiene al menos aproximadamente el doble, pero puede ser útil un incremento más pequeño, por ejemplo en donde se facilita un régimen de dosificación satisfactorio o ayuda aun efecto tóxico. En algunas modalidades, el incremento es de al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos aproximadamente diez veces. El término "vida media terapéuticamente modulada" como se utiliza en la presente se refiere al cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula biológicamente modificada, con relación a su forma no modificada. La vida media terapéutica - - se mide al medir las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en varios puntos de tiempo después de la administración. La vida media terapéutica incrementada deseablemente facilita un régimen de dosificación benéfico particular, una dosis total benéfica particular o ayuda a un efecto no deseado. En algunas modalidades, la vida media terapéutica incrementada resulta a partir de la potencia incrementada, unión incrementada o disminuida de la molécula modificada a su objetivo o él incremento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada. El término "aislado" cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o proteína se encuentra sustancialmente libre de otros componentes particulares con los cuales se asocia en el estado natural. Puede estar en un estado homogéneo. Las sustancias aisladas pueden estar ya sea en un estado seco o semi-seco o en solución, incluyendo pero sin limitarse a, una solución acuosa. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de química analíticas tales como electroforésis de gel de poliacilamida o cromoatografía líquida llevada a cabo en alto. Una proteína que se encuentra presente en especies predominantes en una precipitación que es sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de las estructuras de - lectura abiertas que flanquean el gen y codifican una proteína diferente a la del gen de interés . El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da alcance a sustancialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, se refiere al ácido nucleico o proteína que es al menos 85% puro, al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 99% puro o más puro. El término "ácido nucleico" se refiere a deoxiribonucleótidos, deoxiribonucleósidos, ribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sea en forma de un solo o doble enlace. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedaes de unión similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan en una forma similar a los nucleótidos que se presentan de manera natural. A menos que se limiten específicamente de otro modo, el término también se refiere a análogos de oligonucleótido incluyendo APN (ácido peptidonucléico) , análogos de ADN utilizados en tecnología de anitsentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y lo similar) . A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de los mismos (incluyendo pero sin limitarsea, degenerar las sustituciones de codón) y secuencias complementarias así - - como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codón degeneradas pueden alcanzarse al generar secuencias en las cuales la tercer posición de uno o más (o todos) codones seleccionados se sustituyen con residuos de base mezclados o de deoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J". Biol . Chem. 260:2605-2608 (1985); y Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)). Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" como se utiliza intercambiablemente en la presente se refiere a un polímero de residuos de aminoácido. Es decir, una descripción dirigida a un polipéptido que se aplica igualmente a una descripción de un péptido y una descripción de una proteína y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido que se presentan de manera natural así como polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido se encuentra en un aminoácido codificado no de manera natural. Como se utiliza en la presente, los términos abarcan cadenas de aminoácido de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (i.e., antígenos), en donde los residuos de aminoácido se enlazan mediante uniones covalentes de polipéptido. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan de manera natural o que no ocurren naturalmente, así como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan en una forma similar a la de los aminoácidos que se presentan de manera natural . Los aminoácidos naturalmente codificados son los 20 aminoácidos comunes (alanita, arginina, aspargina, ácido aspártico, cisterna, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina. Lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina) y pirolisina y selenocisteína. Los análogos de aminoácido se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica como la de un aminoácido que ocurre naturalmente, i.e., un carbono a que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (tales como, norleucina) o elementos principales de péptido modificado pero retienen la misma estructura química básica como la de un aminoácido que ocurre naturalmente . Los aminoácidos pueden referirse en la presente por ya sea sus tres símbolos de letra comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una sola letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclatura Comisión. De igual modo, los nucleótidos pueden referirse mediante sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados . Las "variantes conservadoramente modificadas" se aplican tanto al aminoácido como a las secuencias de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de aminoácido particulares, las "variantes conservadoramente modificadas" se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas . Debido a la degeneración de código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican la alanita de aminoácido. Así, en cada posición en donde se especifica una alanita mediante un codón, el codón puede alterarse con cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son una especie de variantes conservadoramente modificadas. Cada secuencia de aminoácido en la presente que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para la metionina y TGG que es ordinariamente el único codón para el triptofano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido se encuentra implícito en cada secuencia descrita. - 3 Como las secuencias de aminoácido, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales para una secuencia de ácido nucleico, péptido o proteína que altera, agrega o suprime un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservadoramente modificada" en donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativas proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar que son bien conocidos en la materia. Tales variantes conservadoramente modficadas se encuentran en la adición y no excluyen variantes polimórficas, interespecies, homólogos y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos cada uno contiene aminoácidos qu son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2 ) Acido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3 ) Aspargina (N) , Glutamina (Q) ; 4 ) Arginina (R) , Lisina (k) ; 5 ) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6 ) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7 ) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8 ) Cisterna (C) , Metionina (M) (ver, e.g. , Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2a edición (Diciembre 1993) - Los terminus "indéntico" o "identidad" de porcentaje en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos (i.e., aproximadamente 60% de identidad, opcionalmente aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% de identidad sobre una región especificada) , cuando se comparan o alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región diseñada como se midió utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante alineamiento manual e inspección visual. Esta definición se refiere también al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir sobre una región que es de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud o sobre una región que es 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud o, en donde no se especifican a través de toda la secuencia o un polinucleótido o polipéptido. Para la comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un - algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia entran en una computadora, se diseñan los coordinados de subsecuencia, si es necesario y se diseñan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Pueden utilizarse los parámetros del programa por omisión o pueden diseñarse parámetros alternos . El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula las identidades de secuencia de porcentaje para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia en base a los parámetros del programa . Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de desde 20 a 600, usualmente aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 hasta aproximadamente 150 en la cual una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. Puede conducirse el alineamiento opcional de secuencias para comparación, incluyendo pero sin limitarse a, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1970J Adv. Appl . Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman and Wunsch (1970) J".
- Mol . Biol . 48:443, mediante la búsqueda para el método similar de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat 'l . Acad. Sci . USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) o mediante alineamiento manual e inspección visual (ver, e.g., Ausubel et al., Curreirzt Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y secuencias similares son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 que e describen en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids . Res . 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J". Mol . Biol . 215:403-410 respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del Nacional Center for Biotechnology Information. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST? (para secuencias de nucleótido) utiliza como por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectación € o 10, M=5, N=4 y una comparación de ambos filamentos. Para las secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como por omisión una longitud de palabra de 3 y expectación (E) de 10 y la matriz de registro BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89:10915) los - alineamientos (B) de 50, la expectación (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambos filamentos . El algoritmos BLAST se lleva a cabo típicamente con el filtro de "baja complejidad" apagado . El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, e.g., Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5887). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más baja (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual una comparación entre las dos secuencias de nucleótido y aminoácido puede ocurrir mediante una oportunidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más baja en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.2, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01 y más preferentemente menor de aproximadamente 0.001. La frase "hibridiza selectivamente (o específicamente)" se refiere a la unión, duplexión o hibridación de una molécula solo con una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones de hibridación astringentes cuando esa secuencia se encuentra presente en una mezcla compleja (incluyendo pero sin limitarse a, ADN o ARN celular total o de biblioteca) .
La frase "condiciones de hibridación astringentes" se refiere a las condiciones de baja resistencia iónica y alta temperatura como se conoce en la materia. Típicamente, bajo condiciones astringentes una prueba se hibridizar con su subsecuencia objetivo en una mezcla compleja de ácido nucleco (incluyendo pero sin limitarse al, ADN o ARN celular total o de biblioteca) pero no se hibridíza hacia otras secuencias en la mezcla compleja. Las condiciones astringentes son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más grandes se hibridizan específicamente a temperaturas mayores. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization wi th Nucleic Probes, "Overview of principies of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) . Generalmente, las condiciones estringentes se seleccionan para ser de aproximadamente 5-10° menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en un pH de resistencia iónica definida. El Tm es la temperatura (pH bajo resistencia iónica definida y concentración nucleica) a la cual el 50% de las pruebas complementarias para hibridizar el objetivo hacia la secuencia objetivo en equilibrio (a medida que las secuencias objetivo se encuentran presentes en exceso, a una Tm de 50% de las pruebas a ocuparse en el equilibrio) . Las condiciones astringentes pueden ser aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente 1.0 m de ion de sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion de sodio (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para pruebas cortas (incluyendo pero sin limitarse a 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para pruebas largas (incluyendo pero sin limitarse a más de 50 nucleótidos) . Las condiciones astringentes puede también lograrse con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos dos veces de hibridación bajo tierra, opcionalmente 10 veces bajo tierra. Las condiciones de hibridación astringentes ejemplificativas pueden ser como sigue: 50% de formamida, 5X SSC y 1% de SDS, incubando a 42° o 5X sSC, 1% de SDS, incubando a 65 °C, con lavado en 0.2X SSC y 0.1% de SDS a 65°C. Tales lavados pueden llevarse a cabo por 5, 15, 30, 60, 120 0 más minutos. Como se utiliza en la presente, el término "eucariote" se refiere a organismos que pertenecen a los Eucarya de dominio filogenéticos tales como animales (incluyendo pero sin limitarse a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.) ciliados, plantas (incluyendo pero sin limitarse a, monocotas, dicotas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidia, protistas, etc. Como se utiliza en la presente, el término "no eucariote" se refiere a organismos no eucarióticos. Por ejemplo un organismo no eucariótico puede pertenecer a la Eubacteria (incluyendo pero sin limitarse a, Escherichia coli , Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.) de dominio filogenético o el Archaea (incluyendo pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicu , Halobacteriut tal como Halof erax volcanii y Halobacterium de especies NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii , Aeuropyrum pernix, etc.) de dominio filogenético. El término "sujeto" como se utiliza en la presente, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un humano, que es el objetivo del tratamiento, observación o experimento. El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente se refiere a aquella cantidad del polipéptido de aminoácido no natural (modificado) administrado que remedia la extensión de algo o más de los síntomas de la enfermedad, condición o trastorno a tratarse. Las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural (modificado) descrito en la presente pueden administrarse para tratamientos profilácticos, de mejoramiento y/o terapéuticos . Los términos "mejora" o "mejoramiento" se refiere a incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración un efecto deseado. Así, con respecto a mejorar el efecto de los agentes terapéuticos, el término "mejoramiento" se refiere a la capacidad de incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad de mejoramiento efectivo", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se utilizan en un paciente, las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y el curso de la enfermedad, trastorno o condición, previa a la terapia, el estado de salud del paciente y la respuesta a las drogas y lo que juzgue el médico que lo trata. ?l término "modificado" como se utiliza en la presente se refiere a la presencia de una modificación post-translacional en un polipéptido. El término de la forma " (modificada) " se refiere a que los polipéptidos se tratan opcionalmente modificados, es decir, los polipéptidos bajo discusión pueden modificarse o no modificarse. El término "post-translacionalmente moificado" y "modificado" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que ocurre para tal aminoácido después de que se ha incorporado en una cadena de - polipéptido. El término abarca, a manera de ejemplo solo modificaciones co-translacionales in vivo, modificaciones post-translacionales in vivo y modificaciones post-translacionales in vi tro. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural (modificado) se administran a un paciente susceptible o de otro modo un riesgo de una enfermedad, trastorno o condición particular. Tal una cantidad se define que es una "cantidad profilácticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas también dependen del estado de salud del paciente, peso y lo similar. Debe considerarse bien dentro de la experiencia en la materia para determinar tales cantidades profilácticamente efectivas mediante experimentación de rutina (e.g., una prueba clínica de escalación de dosis) . El término "protegido" se refiere a la presencia de un "grupo de protección" o residuo que evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo de protección variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo a protegerse. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo de protección puede seleccionarse a partir del grupo de tert-butiloxicarbonil (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) . Si el grupo - químicamente reactivo es un tiol, el grupo de protección puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanóico o propiónico o un grupo hidroxilo, el grupo de protección puede ser un grupo bencilo o alquilo tal como metilo, etilo o Pert-butilo. Pueden también utilizarse otros grupos de protección conocidos en la materia o con los métodos y composiciones descritos en la presente. Solo a manera de ejemplo, los grupos de bloqueo/protección pueden seleccionarse a partir de: alilo Bn Cte altoc &fe Et t- butilo TBDMS Otros grupos de protección se describen en Greene y Wuts, Protective Groups en Organic Síntesis, 3a Ed.. John Wiley & Sons, New Cork, NY, 1999, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural (modificado) se administran a un paciente que sufre aún de una enfermedad, condición o trastorno, en una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente detener los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición. Tal una cantidad se define que es una "cantidad terapéuticamente efectiva" y dependerá de la severidad y curso de la enfermedad, trastorno o condición previa a la terapia, el estado de salud del paciente y la respuesta a las drogas y el juicio del médico que lo trata. Debe considerarse bien dentro de la experiencia en la materia para determinar tales cantidades terapéuticamente efectivas mediante experimentación de rutina (e.g., una prueba clínica de escalación de dosis) . El término "tratar" se utiliza para referirse a ya se los tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. A menos que se indique de otro modo, se emplean los métodos convencionales de espectroscopia de masa, NMR, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología dentro de la experiencia en la materia. DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Introducción Las moléculas de interferón comprenden al menos un aminoácido no natural que se proporciona en la invención. En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido hlFN con al menos un aminoácido no natural incluye al menos una modificación post-translacional . En una modalidad, la al menos una modificación post-translacional comprende la unión de una molécula incluyendo pero sin limitarse a una etiqueta, una tintura, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotoreticulador, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido de antisentido, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de giro, un fluoroforo, un residuo que contiene metal, un residuo radioactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas, un residuo fotocargado, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un átomo químicamente divisible, un grupo fotodivisible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado con carbono, un agente redox activo, un amino tioácido, un residuo tóxico, un residuo isotópicamente - etiquetado, una prueba biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimiolumiscente, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo de intercalación, un cromoforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña o cualquier combinación de lo anterior o cualquier otro compuesto o sustancia deseable, que comprende un segundo grupo reactivo hacia al menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo utilizando metodología química que se conoce por el experto en la materia para ser adecuado para los grupos reactivos particulares. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es un residuo de alquinilo (incluyendo pero sin limitarse a, en el aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina, en donde el grupo propargil también algunas veces se refiere como un residuo de acetileno) y el segundo grupo reactivo es un residuo azido y se utilizan metodologías [3+2] de cicloadición química. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo azido (incluyendo pero sin limitarse a, en el grupo aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el residuo e alquinilo. En ciertas modalidades del polipéptido hlFN modificado de la presente invención, al menos un aminoácido no natural (incluyendo pero sin limitarse al, aminoácido no natural que contiene un grupo ceto funcional) que comprende al menos una modificación post-translacional, se utiliza en - donde la al menos una modificación post-translacional comprende un residuo de sacárido. En ciertas modalidades, la modificación post-translacional se hace in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica. En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-translacional que se hace in vivo por una célula huésped , en donde la modificación post-translacional no se hace normalmente por otro tipo de cpelula huésped. En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-translacional que se hace in vivo mediante una célula eucariótica, en donde la modificación transnacional no se hace normalmente mediante una célula no eucariótica. Ejemplos de modificaciones post-translacionales incluyen pero no se limitan a, acetilación, acilación, modificación de lípido, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido y lo similar. En una modalidad, la modificación post-translacional comprende la unión de un oligosacárido a una aspargina mediante un enlace de GlcNAc-aspargina (incluyendo pero sin limitarse a, en donde el oligosacárdo comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc y lo similar) . En otra modalidad, la modificación post-translacional comprende la unión de un oligosacárido (incluyendo pero sin limitarse a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNac, etc.) a una serina o treonina mediante un enlacede GalNAc-serina, un GalNAc-treonina, un GlcNAc-serina o un GlcNAc-treonina. En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de secreción o localización, una marca de epítope, una marca FLAG, una marca de polihistidina, una fusión GST y/o lo similar. La proteína o polipéptido de interés puede contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez o más aminoácidos no naturales . Los aminoácidos no naturales pueden ser los mismos o diferentes, por ejemplo, pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5,, 6, 7, 8, 9, 10 o más diferentes aminoácidos no naturales. En ciertas modalidades, al menos uno, pero algunos en lugar de todos, de un aminoácido particular presente en una versión de la proteína que ocurre naturalmente se sustituye con un aminoácido no natural . La presente invención proporciona métodos y composiciones en base a los miembros de la familia del supergen GH, en particular hlFN que comprende al menos un aminoácido codificado no de manera natural. La introducción de al menos un aminoácido codificado no de manera natural en un miembro de la familia del supergen GH puede permitir la aplicación de químicos conjugados que involucran reacciones químicas específicas, pero no se limitan a, con uno o más - aminoácidos codificados no de manera natural mientras no reaccionan con los 20 aminoácidos que ocurren comúnmente. En algunas modalidades, el miembro de la familia del supergen GH compende el aminoácido no cidificado naturalmente que se enlaza a un polímero soluble en agua, tal como polietilen glicol (PEG) a través de la cadena lateral del aminoácido codificado no de manera natural . Esta invención proporciona un método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas con derivados PEG, que involucra la incorporación selectiva de aminoácidos codificados no de manera natural, incluyendo pero sin limitarse a, aquellos aminoácidos que contienen grupos o sustituyentes funcionales no encontrados en los 20 aminoácidos naturalmente incorporados, incluyendo pero sin limitarse a una cetona, una azida o residuo de acetileno, en las proteínas en respuesta a un codón selector y la modificación subsecuente de aquellos aminoácidos con un derivado PEG adecuablemente reactivo. Una vez incorporadas, las cadenas laterales de aminoácido pueden entonces modificase al utilizar metodologías químicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la materia por ser adecuados para los grupos funcionales o sustituyentes particulares presentes en el aminoácido naturalmente codificado. Se conoces metodologías químicas de una amplia variedad que son adecuadas para el uso en la presente invención para incorporar un polímero soluble en agua en una proteína Tales metodologías incluyen pero no se limitan a reacción de cicloadíción [3+2] de Huisgen (ver, e.g., Padwa, A. en Comprehensive Oranic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M. , Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; y Huisguen, R. en 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) con, incluyendo pero sin limitarse a, derivados de acetileno o azida respectivamente. Debido a que el método de cicloadición [3+2] de Huisguen involucra una cicloadición en lugar de una reacción de sustitución nucleofílica, las proteínas pueden modificarse con selectividad extremadamente alta. La reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en codiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4>1,5) mediante la adición de cantidades catalíticas de sales Cu (I) hacia la mezcla de reacción. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) Org . Chem. 67:3057-3064; y Rostovtsev et al., (2002) Angew. Chem. Int . Ed. 41:2596-2599; y WO 03/101972. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención a través de una cicloadición [3+2] que incluye virtualmente cualquier molécula con un grupo funcional o sustituyente adecuado incluyendo pero sin limitarse a un derivado azido o acetileno. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo acetileno, incluyendo pero sin limitarse a, un grupo p-propargiloxifenilalanina o azido, incluyendo pero sin limitarse a p-azido-fenilalanina, respectivamente . El anillo de cinco miembros que resulta a partir de la cicloadición [3+2] de Huisguen no son generalmente reversibles en reducir los ambientes y es estable contra la hidrólisis por periodos extendidos y ambientes acuosos. Consecuentemente, pueden modificarse las características físicas y químicas de una amplia variedad de sustancias bajo condiciones acuosas demandantes con los derivados PEG activos de la presente invención. Aún más importante, debido a que los residuos de azida y acetileno son específicos entre sí (y no por ejemplo, reaccionan con cualquiera de los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados) , las proteínas pueden modificarse en uno o más sitios específicos con selectividad extremadamente alta. La invención también proporciona derivados solubles en agua o hidrolíticamente estables de los derivados PEG y polímeros hidrofílicos relacionados que tienen uno o más residuos de acetileno o azida. Los derivados del polímero PEG que contienen residuos de acetileno son altamente selectivos para el acoplamiento con residuos azida que se han introducido selectivamente en las proteínas en respuesta a un codón selector. Similarmente, los derivados del polímero PEG que contienen residuos azida son altamente selectivos para acoplarse con residuos de acetileno que se han introducido selectivamente en las proteínas en respuesta a un codón - selector. Más específicamente, los residuos azida comprenden, pero no se limitan a, alquilo, azidas, azidas de arilo y derivados de estas azidas . Los derivados del alquilo y azidas de arilo pueden incluir otros sustituyentes siempre que se mantenga la reactividad específica de acetileno. Los residuos de acetileno comprenden alquilo y aril acetilenos y derivados de cada uno. Los derivados de alquilo y aril acetilenos pueden incluir otros sustituyentes siempre que se mantenga la reactividad específica de azida. La presente invención proporciona conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos, sustituyentes o residuos funcionales, con otras sustancias que incluyen pero no se limitan a una etiqueta; una tintura; un polímero; un polímero soluble en agua, ; un derivado de polietilen glicol; un fotoreticulador; un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido de antisentido, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de giro, un fluoroforo, un residuo que contiene metal, un residuo radioactivo, un nuevo - grupo funcional, un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas, un residuo fotocargado, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un átomo químicamente divisible, un grupo fotodivisible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado con carbono, un agente redox activo, un amino tioácido, un residuo tóxico, un residuo isotópicamente etiquetado, una prueba biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimiolumiscente, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo de intercalación, un cromoforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña o cualquier combinación de lo anterior o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) . La presente invención también incluye conjugados de sustancias que tienen residuos azida o acertileno con derivados de polímero PEG que tienen los residuos de acetileno o azida correspondientes. Por ejemplo, un polímero PEG que contiene un residuo azida puede acoplarse a una molécula biológicamente activa en una posición en la proteína que contiene un aminoácido codificado no de manera natural portando una funcionalidad de acetileno. El enlace mediante el cual el PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan incluye pero no se limita al producto de cicloadición [3+2] de Huisguen.
- Está bien establecido en la técnica que PEG puede utilizarse para modificar las superficies de los biomateriales (ver, e.g., Patente de E.U. 6,610,281; Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136 (2000) que se incorpora en la presente mediante la referencia) . La invención también incluye biomateriales que comprenden una superficie que tiene uno o más sitios azida o acetileno reactivos y uno o más de los polímeros que contienen azida o acetileno de la invención acoplados a la superficie a través del enlace de cicloadición [3+2] de Huisguen. Los biomateriales y otras sustancias también pueden acoplarse a los derivados del polímero de azida o acetileno activado a través de un enlace diferente al del enlace de azida o acetileno, tal como a través de un enlace que comprende un residuo de ácido carboxílico, amina, alcohol o tiol, para dejar los residuos de azida y acetileno disponibles para reacciones subsecuentes . La invención incluye un método de sintetizar los polímeros que contienen azida y acetileno de la invención. En el caso del derivado de PEG que contiene azida, la azida puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. Alternativamente, el derivado de P?G que contiene azida puede prepararse al unir un agente de enlace que tiene el residuo azida a una terminal de un polímero convencional activado por lo que el polímero resultante tiene el residuo azida en su terminal . En el caso del derivado de PEG que contiene - - acetileno, el acetileno puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. Alternativamente, el derivado de PEG que contiene acetileno puede prepararse al unir un agente de enlace que tiene el residuo de acetileno en una terminal hacia un polímero convencional activado de manera que el polímero resultante tiene el residuo de acetileno en su terminal . Más específicamente, en el caso del derivado de PEG que contiene azida, un polímero soluble en agua tiene al menos un residuo de hidroxilo activo que sufre una reacción para producir un polímero sustituido que tiene un residuo más reactivo, tal como un grupo de salida de mesilato, tresilato, tosilato o halógeno en el mismo. La preparación y uso de los derivados de PEG contiene haluros de ácdio de sulfonilo, átomos de halógeno y otros grupos de salida que son bien conocidos por el experto. El polímero sustituido resultante entonces sufre una reacción para sustituir el residuo más reactivo de un residuo azida en la terminal del polímero. Alternativamente, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo nucleofílico o electrofílico activo sufre una reacción con un agente de enlace que tiene una azida en una terminal por lo que la unión covalente se forma entre el polímero PEG y el agente de enlace y el residuo azida se coloca en la terminal del polímero. Los residuos nucleofílicos y electrofílieos, incluyendo aminas, tioles, - hidrazidas, hidrazinas, alcoholes, carboxilatos, aldehidos, cetonas, tioésteres y lo similar, son bien conocidos por el experto . Más específicamente, en el caso del derivado de PEG que contiene acetileno, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo de hidroxilo activo sufre una reacción para desplazar un halógeno u otro grupo de salida activado a partir de un precursor que contiene un residuo de acetileno. Alternativamente, un polímero soluble en agua que contiene al menos un residuo nucleofílico o electrofílico activo sufre una reacción con un agente de enlace que tiene un acetileno en una terminal por lo que se forma una unión covalente entre el polímero PEG y el agente de enlace y el residuo de acetileno se coloca en la terminal del polímero. El uso de residuos de halógeno, el grupo de salida activado, los residuos nucleofílicos y electrofílicos en el contexto de la síntesis orgánica y la preparación y uso de derivados PEG se establece bien por los practicantes en la materia. La invención también proporciona un método para la modificación selectiva de proteínas para agregar otras sustancias a la proteína modificada, incluyendo pero sin limitarse a polímeros solubles en agua tales como PEG y derivados PEG que contienen un residuo azida o acetileno. Los derivados PEG que contienen azida o acertileno pueden utilizarse para modificar las propiedades de las superficies - y moléculas en donde son importantes la biocompatibilidad, estabilidad, solubilidad y carencia de inmunogenicidad, mientras que al mismo tiempo proporcionan un medio más selectivo de unir los derivados PEG a las proteínas que el conocido previamente conocido en la materia. II. Familia de Supergen de la Hormona del Crecimiento Las siguientes proteínas incluyen aquellas codificadas por genes de la familia del supergen de la hormona del crecimiento (GH) (Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1991); Bazan, J.F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H.R. y Campbell, I. D., Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silennoinen, 0. e Ihle, J. N. , SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996) ) : hormona del crecimiento, prolactina, lactógeno placental, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , interleucina-2 (IL-2) , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12 (subunidad p35) , IL-13, IL-15, oncostatina M, factor neurotrópico ciliar (CNTF) , factor inhibidor de leucemia (LIF) , interferón alfa, interferón beta, interferón epsilon, interferon gama, interferón omega, interferón tau, factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) , factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) , factor de estimulación de colonia de macrófago (M-CSF) y cardiotropina-1 (CT-1) ("la familia del supergen GH" ) . Se anticipa que los miembros adicionales de esta familia de gen - se identificarán en el futuro a través de la clonación y secuenciación de gen. Los miembros de la familia de supergen GH tienen estructuras secundarias y terciarias, a pesas del hecho de que generalmente tienen limitada la identidad de secuencia del aminoácido o ADN. Las características estructurales compartidas permiten nuevos miembros de la familia del gen para identificarse fácilmente y los métodos y composiciones del aminoácido no natural descritos en la presente se aplican de forma similar. Dando la extensión de la homología estructural entre los miembros de la familia de supergen GH, los aminoácidos codificados no de manera natural pueden incorporarse en cualquiera de los miembros de la familia de supergen GH utilizando la presente invención. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un haz helicoidal del cuatro, la estructura general de la cual se muestra en la Figura 1. Las estructuras generales de los miembros de la familia hGH, EPO, IFNa-2 y G-CSF se muestran en las Figuras 2 , 3, 4 y 5 respectivamente. Las estructuras de un número de citocinas, incluyendo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemetry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K. , et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J". Mol . Biol . 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J.F. Science 257:410-411 (1992); McKay, D.B. Science 257: 412 (1992)), IL- 4 (Redfield et al., Biochemestry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256 : 1613 - 1611 (1992)) e IL-5 (Milburn et al., Nature 363:172-176 (1993)) se han determinado por difracción de rayos X y estudios NMR y muestran la conservación de la dirección con la estructura GH, a pesar de una carencia de significativa homología de secuencia primaria. IFN se considera ser un miembro de esta familia en base al modelaje y otros estudios (Lee et al., J. Growth hormona Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4:1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274:661 (1997)). EPO se considera que es un miembro de esta familia eb base a estudios de modelaje y mutagénesis (Boissel et al., J. Biol . Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wen et al., J. Biol. Chem. 269:22839-22846 (1994)). Todas estas citocinas y factores del crecimiento anteriores ahora se considera que comprenden una gran familia de gen. Además de compartir estructuras secuendaria y terciaria similares, los miembros de esta familia comparten la propiedad de que ellos deben oligomerizar los receptores de superficie para activar las trayectorias de señalización intracelulares. Algunos miembros de la familia GH, incluyen pero no se limitan a; GH y EPO, une un solo tipo de receptor yse provoca para formar homodímeros. Otra familia de miembros incluye pero no se limita a, IL-2, IL-4 e IL-6, une más de un tipo de receptor y provoca que los receptores formen heterodímeros o agregados en orden mayor (Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995)). Estudios de mutagénesis han mostrado que, el GH de estas citocinas y los factores de crecimiento contienen múltiples sitios de unión a receptor, típicamente dos y unen sus receptores de cognado secuencialmente (Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5 : 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 93: 9471-9476). Como GH, los sitios de unión a receptor primarios para estos otros miembros de la familia ocurren principalmente en las cuatro hélices alfa y el ciclo A-B. Los aminoácidos específicos en los haces helicoidales que participan en la unión al receptor difieren entre los membros de la familia. La mayoría de los receptores de superficie celular que interactúan con los miembros de la familia del supergen GH se relacionan estructuralmente y comprenden una segunda gran familia de multi-gen. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora en la presente mediante la referencia. Una conclusión general alcanzada a partir de estudios mutacionales de varios miembros de la familia del supergen GH es que los cíelos unen las hélices alfa que generalmente tienden a no involucrarse en la unión al receptor. En particular, el ciclo corto B-C aparece que no es esencial para la unión al receptor en la mayoría sino es ue en todos los miembros de la familia. Por esta razón, el ciclo B-C puede sustituirse con aminoácidos codificados no de manera natural como se describe en la presente con los miembros de la familia de supergen GH. El ciclo A-B, el ciclo C-D (y el ciclo D-E de interferon/miembros similares a IL-10 de la superfamilia GH) pueden también sustituirse con un aminoácid que no ocurre naturalmente . Los aminoácidos próximos a la hélice A y distales a la hélice final también tienden a no involucrarse en la unión al receptor y también pueden ser sitios para introducir aminoácidos que no ocurren naturalmente. En algunas modalidades, un aminoácido no cidificado naturalmente se sustituye en cualquier posición dentro de una estructura de ciclo, incluyendo pero sin limitarse a, el primer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más aminoácidos del ciclo A-B, B-C, C-D o D-E. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificados no de manera natural se sustituyen dentro del útlimo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más aminoácidos del ciclo A-B, B-C, C-D o D-E. Ciertos miembros de la familia GH, incluyen pero no se limitan a, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 e interferón beta que contiene azúcares N-enlazados y/u 0-anlzados. Los sitios de glicosilación en las proteínas ocurren casi exclusivamente en - las regiones de ciclo y no en los haces helicoidales alfa. Debido a que las regiones de ciclo generalmente no se involucran en la unión a receptor y debido a que son sitios para la unión covalente de los grupos de azúcares, pueden ser sitios útiles para introducir en las proteínas sustituciones de aminoácido que no ocurren naturalmente . Los aminoácidos que comprenden sitios de glicosilación N y O enlazados en las proteínas pueden ser sitios para las ustituciones aminoácidos que no ocurren naturalmente debido a que estos aminoácidos se exponen a la superficie. Por lo tanto, la proteína natural puede tolerar grupos de azúcar bultosos unidos a las proteínas en esos sitios y sitios de glicosilación que tienden a ubicarse lejos de los sitios de unión a receptor. Miembros adicionales de la familia de supergen GH son similares a los descubiertos en el futuro. Pueden identificarse nuevos miembros de la familia de supergen GH a través de análisis de estructura secundaria y terciaria ayudados por computadora de las secuencias de proteína predichas. Los miembros de la familia de supergen GH típicamente poseen cuatro o cinco hélices anfifáticos unidos mediante aminoácidos no helicoidales (las regiones de ciclo) . Las proteínas pueden contener una secuencia de señal hidrofobica en su N terminal para promover la secreción a partir de la célula. Tales miembros descubiertos después de la familia de supergen GH también se incluyen dentro de la - invención. Así, se proporciona la descripción de la familia de supergen de la hormona del crecimiento para propósitos ilustrativos y solo a manera de ejemplo y no como limitar el alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritas en la presente. Además, con referencia a los polipéptidos GH e IFN en esta solicitud se intenta utilizar el término genérico como un ejemplo de cualquier miembro de la familia de supergen GH. Así, debeentenderse que las modificaciones y químicos descritos en la presente con referencia a los polipéptidos o proteínas hGH o hlFN pueden aplicarse igualmente a cualquier miembro de la familia de supergen GH, incluyendo aquellos específicamente listados en la presente. III. Métodos de Ácido Nucleico Recombinante Para Utilizarse Con La Invención En numerosas modalidades de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido hlFN de interés se aislará, colnará y con frecuencia alterará utilizando métodos recombinantes. Tales modalidades se utilizan, incluyendo pero sin limitarse a, para la expresión de la proteína o durante la generación de las variantes, derivados, casetes de expresión u otras secuencias derivadas a partir del polipéptido hlF?. En algunas modalidades, las secuencias que codifican los polipéptidos de la invención se - enlazan operablemente a un promotor heterólogo. El aislamiento de hGH y la producción de GH en células huésped se describe en, e.g., las Patentes de E.U. Nos. 4,601,980, 4,604,359, 4,634,677, 4,658,021, 4,898,830, 5,424,199, 5,795,745, 5,854,026, 5,849,535; 6,004,931; 6,022,711; 6,143,523 y 6,608,183 que se incorporan en la presente mediante la referencia. El aislamiento de hlFN y la producción de IFN en células huésped se describe en e.g., las Patentes de E.U. Nos. 6,489,144; 6,410,697; 6,159,712; 5,955,307; 5,814,485; 5,710,027; 5,595,888; 5,391,713; 5,244,655; 5,196,323; 5,066,786; 4,966,843; 4,894,330; 4,364,863, que se incorporan en la presente mediante la referencia. Una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido hlFN comprende un aminiácido no codificado naturalmente tal vez sintetizado sobre la base de la secuencia de aminoácido del polipéptido principal, incluyendo pero sin limitarse a, que tiene la secuencia de aminiácido mostrada en la SEQ ID NO: 24 (hlFN) y entonces cambiar la secuencia de nucleótido a fin de efectuar la introducción (i.e., incorporación o sustitución) o retiro (i.e., supresión o sustitución) del (los) residuo (s) de aminoácido relevanteds) . La secuencia de nucleótido puede modificarse convenientemente mediante la mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con los métodos convencionales. Alternativamente, la secuencia de nucleótido puede prepararse mediante síntesis química, incluyendo pero sin limitarse a, al utilizar un sintetizador de oligonucleótido, en donde los oligonucleótidos se diseñan en base a la secuencia de aminoácido del polipéptido deseado y preferentemente seleccionar aquellos codones que se favorecen en la célula huésped en la cual el polipéptido recombinante se producirá. Por ejemplo, varias codificación de oliginucleótidos pequeñas para las porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y ensamblarse mediante ligación de PCR o reacción en cadena de ligación. Ver, e.g., Barany, et al., Proc . Nati . Acad. Sci . 88: 189-193 81991); Patente de E.U. 6,521,427 que se incorpora en la presente mediante la referencia. Esta invención utiliza técnicas de rutina en el campo de genéticos recombinantes . Los textos básicos describen los métodos generales de uso en esta invención incluyendo Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); Kriegle, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). Los textos generales que describen técnicas biológicas moleculares incluyen a Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al . , Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2 a Ed.), Vol. 1-3 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uhna aventuira conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. Y John Wiley & Sons, Inc. (suplementado a través de 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, incluyendo pero sin limitarse a, la generación de genes que incluyen codones selectores para la producción de proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, ARNts ortogonales, sintetasas ortogonales y pares de los mismos . Se utilizan varios tipos de mutagénesis en la invención para una variedad de propósitos, incluyendo pero sin limitarse a, producir bibliotecas de ARNts , para producir bibliotecas de sintetasas, para producir codones selectores, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos no naturales en una proteína o plipéptido de interés. Incluyen pero no se limitan al recombinar el AD? de recombinación homologa de mutagénesis de punto aleatorio dirigida al sitio u otros métodos de mutagénesis recusrivos, construcción quimérica, mutagénesis utilizando templados que contienen uracilo, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, mutagénesis de AD? modificada por fosforotioato, mutagénesis - - utilizando ADN dúplex abierta o lo similar o cualquier combinación de los mismos . Métodos adicionales adecuados incluyen la mutagénesis de reparación de punto desigual utilizando mutagénesis de cepas huésped de reparación deficiente, de selección por restricción y de purificación por restricción, de omisión, mutagénesis mediante síntesis de gen total, de reparación de rompimiento de doble filamento y lo similar. La mutagénesis, incluyendo pero sin limitarse a, involucrar construcciones quiméricas, también se incluyen en lapresente invención. En una modalidad, la mutagénesis puede guiarse mediante información conocida de la molécula que ocurre naturalmente o molécula alterada o mutada que ocurre naturalmente, incluyendo pero sin limitarse a, la secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura de cristal o lo similar. Los textos y ejemplos encontrados en la presente describen estos procedimientos . La información adicional se encuentra en las siguientes publicaciones y referencias citadas dentro de : Ling et al . , Approaches to DNA mutagenesis : an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol .
Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann.
Rev. Genet . 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vi tro mutagenesis, Science 229:1193- 1201 (1985) ,- Cárter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, et al., Rapid and efficient site-specif ic mutagenesis wi thout phenotypic selection, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient si te-specif ic mutagenesis wi thout phenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specifici ties, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); Methods in Enzymol 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 -derived vectors : an efficient an general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, ?ucleic Acids Res . 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis : a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate, Methods in Enzymol . 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate -modif ied DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucí . Acids Res . 13:8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frecuency using phosphorothioate-modified DNA, Nucí . Acids Res . 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclese Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí . Acids Res . 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí . Acids Res . 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate -containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucí . Acids Res . 16: 803-814; Kramer et al., The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucí . Acis Res. 12:9441-9456 (1984) ; Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction orf mutations via gapped dúplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucí . Acids Res . 16:7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotid -directed construction of mutations : a gapped dúplex AND procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucí . Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kraner et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucí . Acids Res . 13: 4431-4443 (1985); Cárter, Improved - oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol . 154:382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to genérate large deletions, Nucí . Acids Res . 14: 5115 (1986); Wells et a., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transi tion state of subtilisin, Phil . Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); ?ambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide -binding protein (transducin) , ?ucl . Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grudstróm et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ^shot-gun ' gene synthesis, Nucí . Acids Res . 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double- strand break repair in plasmids of Escherichia coli : a method for siti -specific mutagenesis, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:7177-7188 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual enviroments , Current Opinión in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W.P.C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); e I.A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic . Acids . Res 23, 3067-8 (1995). Detalles adicionales sobre muchos de los - - métodos anteriores pueden encontrarse en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para problemas de dificultad de ajuste con varios métodos de mutagénesis. La invención también se refiere a células huésped aucarióticas, células huésped no eucarióticas y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural a través de pares ARNt/RS ortogonales. Las células huésped se hacen genéticamente (incluyendo pero sin limitarse a, transformadas, transducidas o transfectadas) con los polinucleótidos de la invención o construcciones que incluyen un polinculeótido de la invención, incluyendo pero sin limitarse a, un vector de la invención, que puede ser por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar por ejemplo en la forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se inctroducen en las células y/o microorganismos por métodos estándar incluyendo electroporación (From et al . , Proc. Nati . Acad. Sci. USA 82,5824 (1985), la infección mediante vectores virales, penetración balística a alta velocidad por partículas pequeñas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz o perlas pequeñas o partículas o en la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)). Las células huésped hechas pueden cultivarse en - - medios nutrientes convencionales modificados como es apropiado para tales actividades como por ejemplo, etapas de clasificación, promotores de activación o transformantes de selección. Estas células pueden cultivarse opcionalmente en organismos transgénicos. Otras referencias útiles, incluyen pero no se limitan al aislamiento y cultivo de la célula (e.g., para el aislamiento de ácido nucleico subsecuente) incluye a Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en la presente; Payne et al (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Ohils (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) y Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Varios métodos bien conocidos de introducir ácidos nucleicos objetivo en las células se encuentran disponibles, cualquiera de los cuales puede utilizarse en la invención. Estos incluyen: fusión de células de recipiente con protoplastos bacteriales que contienen ADN, electroporación, bombardeo por proyectil e infección con vectores virales (tratado después abajo), etc. Las células bacteriales pueden utilizarse para amplificar el número de plásmidos que contienen construcciones de ADN de esta invención. Las bacterias crecen para la fase grande y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse mediante una variedad de métodos conocidos en la materia (ver, por ejemplo Sambrook) . Además, una plétora de equipos se encuentra comercialmente disponible para la purificación de plásmidos a partir de bacterias (ver, e.g., EasyPrep™, FlexiPrep™ ambos de Pharmacia Biotehc,- Strata Clean™ de Stratagene; y QIAprep™ de Qiagen) . Los plásmidos aislados y purificados se manejan además para producir otros plásmidos utilizados para transfectar células o incorporados en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traslación, secuencias de iniciación de transcripción y traslación y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico objetivo particular. Los vectores opcionalmente comprenden casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia de terminación independiente, secuencias que permiten la duplicación del cásete en eucariotes o procariotes o ambos (incluyendo pero sin limitarse a, vectores de enlace) y marcadores de selección para tanto sistemas procarióticos como eucarióticos. Los vectores son adecuados para la duplicación e integración en procariotes, eucariotes o preferentemente ambos. Ver, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); - Ausubel, Sambrook, Berger (all supra) . Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para la clonación, e.g., por el ATCC, e.g., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al., (eds.) publicado por el ATCC. Procedimientos básicos adicionales para la secuenciación, clonación y otros aspectos de la biología molecular y consideraciones teóricas precedentes también se encuentran en Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y virtualmente cualquier ácido nucleico etiquetado ya sea estándar o no estándar) puede ser el acostumbrado o estándar ordenado por cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como el Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponible en el World Wide Web en mcrc.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en el World Wide Web en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros. COPONES SELECTORES Los codones selectores de la invención expanden la estructura del codón genético de la maquinaria biosintética de la proteína. Por ejemplo, un codón selector incluye pero no se limita a un único codón de tres bases, un codón sin sentido, tal como un codón de detención, incluyendo pero sin limitarse a, un codón ámbar (UAG) o un codón opal (UGA) , un codón no natural o un codón de cuatro o más bases, un codón - raro o lo similar. Es fácilmente aparente para aquellos expertos en la materia que existe un amplio rango en el número de codones selectores que pueden introducirse en un gen deseado, incluyendo pero sin limitarse a uno o más, dos o más, más de tres, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica al menos una porción del polipéptido hlFN. En una modalidad, los métodos involucran el uso de un codón selector que es un codón de detención para la incorporación de aminoácidos no naturales in vivo en una célula eucariótica. Por ejemplo, un O-ARNt se produce que reconoce el codón selector, incluyendo pero sin limitarse a, UAG y se aminoacila por un 0-RS con un aminoácido no natural deseado. Este O-ARNt no se reconoce por las sintetasas de ARNt de aminoacilo huéspedes que se presentan de manera natural. La mutagénesis dirigida al sitio convencional puede utilizarse para introducir el codón de detención, incluyendo pero sin limitarse a, TAG en el sitio de interés de un polipéptido de interés. Ver, e.g., Sayers, J.R., et al., (1988), 5 ' , 3 ' Exonuclease in phosphorothioate -based oligonucleotide-directed mutagenesis. ?ucleic Acids Res . 791-802. Cuando el 0-RS, O-ARNt y el ácido nucleico que codifica elpolipéptido de interés se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido no natural - en la posición especificada. La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede darse sin perturbación significativa de la célula huésped eucariótica. Por ejemplo, debido a la eficiencia de supresión para el codón UAG que depende de la competencia entre O-ARNt, incluyendo pero sin limitarse a, el ARNt supresor ámbar y un factor de liberación eucariótico (incluyendo pero sin limitarse a, eRF) (que se une a un codón de detención e inicia la liberación del péptido de crecimiento a partir del ribosoma) , la eficiencia de supresión puede modularse al incluir pero sin limitarse a, incrementar el nivel de expresión de O-AR?t y/o el ARNt supresor. Los codones selectores también comprenden codones extendidos, incluyendo pero sin limitarse a, cuatro o más codones base, tales como cuatro, cinco, seis o más codones base. Se incluyen ejemplos de cuatro codones base, incluyendo pero sin limitarse a, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGUA, CUACU, UAGGC y lo similar. Una característica de la invención incluye utilizar codones extendidos en base a la supresión de cambio de estructura. Cuatro o más codones base pueden insertarse, incluyendo pero sin limitarse a, uno o múltiples aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, en la presencia de O-ARNts mutados, incluyendo pero sin limitarse a, un AR?Ts supresor de cambio de estructura especial, con ciclos de anticodón por ejemplo, con al menos 8-10 ciclos de anticodón nt, los cuatro o más codones base se lee como un solo aminoácido. En otras modalidades, los ciclos de anticodón pueden decoificar, incluyendo pero sin limitarse a, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases o al menos un codón de seis bases o más . Ya que existen 256 posibles codones de cuatro bases, pueden codificarse múltiples aminoácidos no naturales en la misma célula utilizando un codón base de cuatro o más. Ver, Anderson et al., (2002) Exploring the Limi ts of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code : Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli , J. Mol. Biol. 307: 755-769. Por ejemplo, los codones de cuatro bases se han utilizado para incorporar aminoácidos no naturales en las proteínas utilizando métodos biosintéticos in vitro. Ver, e.g., Ma et al., (1993) Biochemestry, 32:7939; y Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc . , 121:34. CGGG y AGGU se utilizan para incorporar simultánemente2-naftilalanina y un derivado de NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos ARNts de supresores de cambio de estructura químixcamente acilados. Ver, e.g., Hohsaka et al., (1999) . A . Chem. Sóc. 121:12194. En un estudio in vivo, Moore et al.
Examinarona la capacidad de los derivados Leu ARNt con anticodones NCUA para suprimir los codones UAGN (N puede ser U, A, G o C) y encontrar que UAGA cuádruple puede decodificarse mediante un Leu ARNt con un anticodón UCUA con una eficiencia de 13 a 26% con un poco decodificación en la estructura 0 o 1. Ver, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol. , 298:195. En una modalidad, los codones extendidos en base a codones raros o codones sin sentido pueden utilizarse en la presente invención, los cuales pueden reducir la lectura completa del de sentido alterado y la supresión del cambio de estructura en otro sitios no deseados . Para un sistema dado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en donde el sistema endógeno no utiliza (o raramemte utiliza) el codón base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un ARNt que reconoce al codón de tres bases natural y/o un sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro. Los codones selectores opcionalmente incluyen pares base no naturales. Estos pares base no naturales expanden además el alfabeto genético existente. Un par extra base incrementa el número de codones triples a partir de 64 a 125. Las propiedades en pares de tres bases incluyen pares base estables y selectivos, incorporación enzimática eficiente en AD? con alta fidelidad mediante una polimerasa y la extención - - principal eficiente continuada después de la síntesis del par base natural naciente. Las descripciones de pares base no naturales que pueden adaptarse para los métodos y composiciones incluyen, e.g., Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20: 177-182. Otras publicaciones relevantes se listan abajo. Para el uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable a la membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no se destruye mediante enzimas celulares . Esfuerzos previos por Benner y otros toman ventaj a de los patrones de unión a hidrógeno que son diferentes a partir de aquellos en pares de Watson-Crick canónicos, el ejemplo más notorio del cual es el par iso-C:iso-G. Ver, e.g., Switzer et al., (1989) J . Am. Chem. Soc. , 111:8322; y Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general hacen pares erróneos por algunos grados con bases naturales y no pueden duplicarse enzimáticamente. Kool y co-trabaj adores demostraron que las interacciones de empaque hidrofóbico entre bases pueden reemplazar la unión a hidrógeno para dirigir la formación del par base. Ver, Kool (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; y Guckian y Kool (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. En un esfuerzo - para desarrollar un par base no natural que satisfaga todos los requerimientos anteriores, Schultz, Romesberg y co-trabaj adores sintetizaron sistemáticamente y estudiaron una serie de bases hidrofóbicas no naturales. Un auto-par PICS: PICS se encontró que es más estable que los pares base naturales y puede incorporarse eficientemente en ADN por el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN de Escherichia coli (KF) . Ver, e.g., McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11586; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc . , 122:3274. Un auto-par 3MN:3MN puede sintetizarse por KF con suficiente eficiencia y selectividad para la funcipon biológica. Ver, e.g., Ogawa et al., (2000) . Am. Chem. Soc . , 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para duplicación adicional . Una polimerasa de ADN mutante se ha desarrollado recientemente, que puede utilizarse para duplicar el auto par PICS. Además, un auto par 7AI puede duplicarse. Ver, e.g., Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc . , 123:7439. Un nuevo par de metalobase, Dipic:Py, también se ha desarrollado, el cual forma un par estable en la unión Cu (II) . Ver, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc . , 122:10714. Debido a que los codones extendidos y los codones no naturales son intrínsicamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de la invención pueden tomar ventaja de esta propiedad para generar ARNSts ortogonales para ellos.
Un sistema de derivación translacional también puede utilizarse para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de derivación translacional, se incorpora una gran secuencia en un gen pero no se traslada a la proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como una indicación para inducir el ribosoma para saltar sobre la secuencia y recuperar la traslación corriente debajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína o polipéptido de interés (o porción del mismo) en los métodos y/o composiciones de la invención se codifican mediante un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores . Los genes que codifican para las proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos bien conocidos para un experto en la materia y descritos en la presente que incluyen por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones selectores, siempre que se incorpore uno o más aminoácidos no naturales. La invención incluye cualquier de tal variante, incluyendo pero sin limitarse a mutante, versiones de cualquier proteína por ejemplo, incluyendo al menos un aminoácido no natural. Similarmente, la invención también incluye ácidos nucleicos correspondientes, i.e., cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican uno o más aminoácidos no naturales . Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés tal como un polipéptido hlFN pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína se utiliza ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua,proteínas o una amplia variedad de otras moléculas, sobre una proteína de interés. Los métodos adecuados para la incorporación de la cisteína en una posición deseada del polipéptido hlFN son bien conocidos en la materia, tales como aquellos descritos en la Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora en la presente mediante la referencia y técnicas de mutagénesis estándar. IV. Aminoácidos Codificado no de manera natural Una muy amplia variedad de aminoácidos codificado no de manera natural se encuentra adecuada para utilizarse en la presente invención. Cualquier número de aminoácidos codificado no de manera natural puede introducirse en un - polipéptido hlFN. En general, los aminoácidos codificado no de manera natural introducidos con sustancialmente químicamente inertes hacia los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados (i.e., alanina, arginina, aspargina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, trptofano, tirosina y valina) . En algunas modalidades, los aminoácidos codificados no de manera natural incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficiente y selectivamente con grupos fincionales que no se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero sin limitarse a, azido, cetona, aldehido y grupos aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, un polipéptido hlFN que incluye un aminoácido codificado no de manera natural contiene un grupo funcional azido que puede reaccionarse con un polímero (incluyendo pero sin limitarse a poli (etilen glicol) o alternativamente un segundo polipéptido que contiene un residuo alquino para formar un conjugado estable resultando en la reacción selectiva de los grupos funcionales azida y alquino para formar un producto de cicloadición [3+2] de Huisgen. La estructura genérica del aminoácido alfa se ilustra como sigue (Fórmula I) : - Un aminoácido codificado no de manera natural es típicamente cualquier estructura que tiene la fórmula antes listada en donde el grupo R es cualquier sustituyente diferente al utilizado en los veinte aminoácidos naturales y puede ser adecuado para utilizarse en la presente invención. Debido a que los aminoácidos codificados no de manera natural de la invención típicamente difieren de los aminoácidos naturales solo en la estrucura de la cadena lateral, los aminoácidos codificados no de manera natural forman uniones de amida con otros aminoácidos, incluyendo pero sin limiatrse a los codificados natural o no naturalmente, en la misma forma en la cual se forman en polipéptidos que se presentan de manera natural. Sin embargo, los aminoácidos codificados no de manera natural tienen grupos de cadena lateral que los distinguen a partir de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R opcionalmente comprende un grupo alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, amino o lo similar o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos de interés que no ocurren naturalmente que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos que comprenden un reticulador fotoactivable, aminoácidos etiquetados en giro, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de unión a metal, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos reactivos, aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos que interactúan covalente y no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotocargados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que contienen biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina sustituida de azúcar, otros aminoácidos modificados con carbohidrato, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilen glicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomo pesado, aminoácidos químicamente divisibles y/o fotodivisibles, aminoácidos con unas cadenas laterales alargadas como se comparón con los aminoácidos naturales, incluyendo pero sin limitarse a, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo pero sin limitarse a, mayores de aproximadamente 5 o mayores de aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos que contienen azúcar enlazados con carbono, aminiácidos redox activos, amino tioácido que contiene aminoácidos y aminoácidos que comprenden uno o más residuos tóxicos . Los aminoácidos - codificados no de manera natural ejemplificativos que pueden ser adecuados para utilizarse en - - la presente invención y que son útiles para las reacciones con polímeros solubles en agua incluyen pero no se limitan a, aquellos con grupos reactivos de carbonilo, aminooxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquina. En algunas modalidades, los aminoácidos codificados no de manera natural comprenden un residuo de sacárido. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L- serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil -L-treonina, N-acetil -L-glucosaminil-L-aspargina y 0-mannosaminil-L-serina. Ejemplos de tales aminoácidos también incluyen ejemplos en donde el enlace N- u O- que ocurre naturalmente entre el aminoácido y el sacárido se reemplaza por un enlace covalente no comúnmente encontrado en la naturaleza - incluyendo pero sin limitarse a, un alqueno, una oxamina, un tioéter, una amida y lo similar. Ejemplos de tales aminoácidos también incluyen sacáridos que no se encuentran comúnmente en las proteínas que se presentan de manera natural tales como 2-deoxi-glucosa, 2-deoxigalactosa y lo similar. Muchos de los aminoácidos codificados no de manera natural proporcionados en la presente se encuentran comercialmente disponibles, e.g., de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) , ?ovabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) o Peptech (Burlington, MA USA) . Aquellos que no se encuentran comercialmente - disponibles se sintetizan opcionalmente en la presente o utilizan métodos estándar conocidos por los eexpertos en la materia. Para las técnicas de síntesis estándar, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon (1982, Segunda Edición, Willard Grant Press, Boston mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) ,- y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Ver también, las Solicitudes de Publicación de Patente de E.U. 2003/0082575 y 2003/0108885, que se incorporan en la presente mediante la referencia. Además de los aminoácidos no naturales que contienen nuevos aminoácidos no naturales de cadenas laterales que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención, también comprenden opcionalmente estructuras de elemento principal modificado, incluyendo pero sin limitarse a, como se ilustró por las estructuras de la Fórmula II y III: en donde Z típicamente comprende OH, NH2, SH, NH-R' o S-R' ; X y Y que pueden ser el mismo o diferente, típicamente comprende S u 0 y R y R' que son opcionalmente el mismo o diferente, se seleccionan típicamente a partir de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito arriba para los aminoácidos no naturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales de la invención comprenden opcionalmente sustituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra por las Fórmulas II y III . Los aminoácidos no naturales de este tipo incluyen pero no se limitan a, ácidos a-hidroxi, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, que incluyen pero no se limitan a, con cadenas laterales correspondientes los veinte aminoácidos comunes o cadenas laterales no naturales. Además, las sustituciones en el carbón a opcionalmente incluyen pero no se limitan a, L, D o aminoácidos a-a disustituídos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido a inobutírico y lo similar. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como análogos de prolina de anillo de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 nmiembros, aminoácidos ß y ? tales como ácido butírico de ß-alanina y ?-amino. Muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y lo similar y son adecuados para utilizarse en la presente invención. Los análogos de tirosina incluyen - pero no se limitan a, tirosinas para-sistituídas, tirosinas orto-sustituidas y tirosinas meta sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende, incluyendo pero sin limitarse a, un grupo ceto (incluyendo pero sin limitarse a, un grupo acetilo) , un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, una cadena recta C6-C20 o hidrocarburo ramificado, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o lo similar. Además, los anillos de arilo multiplicados sustituidos también se contemplan. Los análogos de glutamina que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, derivados a-hidroxi, derivados ?-sustituídos, derivados cíclicos y derivados de glutamina de amina sustitupidos . Ejemplos de análogos de fenilalanina que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen pero no se limitan a, fenilalaninas para-sustituidas, fenilalaninas orto-sustituidas y fenilalaninas meta-sustituídas, en donde el sustituyente comprende incluyendo pero sin limitarse a, un grupo hidroxi, un gurpo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehido, un azido, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo pero sin limitarse a, un grupo acetilo) , un benzoilo, un grupo alquinilo o lo similar. Ejemplos específicos de aminoácidos - no naturales que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen pero no se limitan a, un p-acetil-L-fenilalanina, un O-metil-L-tirosina, un L3- (2-naftil) alanina, un 3-metil-fenilalanina, un O-4-alil-L-tirosina, un 4-propil-L-tirosina, un tri-O-acetil-GLcNAcß-serina, un L-Dopa, una fenilalanina fluorinada, un isopropil-L-fenilalanina, un p-azido-L-fenilalanina, un p-acil-L-fenilalanina, un p-benzoil-L-fenilalanina, un L-fosfoserina, una fosfoserina, una fosfonotirosina, un p-yodo-fenilalanina, un p-bromofenilalanina, un p-amino-L-fenilalanina, un isopropil-L-fenilalanina y un p-propargiloxi-fenilalanina y lo similar. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención se proporcionan en por ejemplo, la WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids". Ver también Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, P?AS 99:19-24, para análogos de metionina adicionales. En una modalidad, se proporcionan composiciones de un polipéptido hlF? que incluyen un aminoácido no natural (tal como p- (propargiloxi) -fenilalanina) . También se proporcionan varias composiciones comprenden p- (propargiloxi) -fenilalanina e incluyen pero no se limitan a, proteínas y/o células. En un aspecto, una composición que - incluye el aminoácido no natural de p- (propargiloxi) -fenilalanina incluye además un ARNt ortogonal . El aminoácido no natural puede unirse (incluyendo pero sin limitarse a, covalentemente) al AR?t ortogonal, incluyendo pero sin limitarse a, unirse covalentemente al ARNt ortogonal a través de una unión de amino-acilo, covalentemente unido a un 3 'OH o un 2 'OH de una terminal de azúcar ribosa del AR?t ortogonal, etc . Los residuos químicos a través de aminoácidos no naturales que pueden incorporarse en las proteínas ofrecen una variedad de ventajas y manejos de la proteína. Por ejemplo, la única reactividad de un grupo ceto funcional permite la modificación selectiva de proteínas con cualquiera de un número de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vitro e in vivo . A aminoácido no natural de átomo pesado por ejemplo, puede ser útil para el ajuste de fase de los datos de estructura de rayos X. La introducción específica de sitio de átomos pesados que utiliza aminoácidos no naturales también proporciona selectividad y flexibilidad en las posiciones seleccionadas para los átomos pesados. Los aminoácidos no naturales fotoreactivos (incluyendo pero sin limitarse a, cadenas laterales de aminoácidos con benzofenona y arilazidas (incluyendo pero sin limitarse a fenilazida) ) por ejemplo, se permiten para la fotoreticulación eficiente in vivo e in vitro de la proetína. Ejemplos de aminoácidos - no naturales fotoreactivos incluyen pero no se limitan a, p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. La proteína con los aminoácidos no narurales fotoreactivos puede entonces reticularse como se hará mediante la excitación de control temporal que proporciona el grupo fotoreactivo. En un ejemplo, el grupo metilo de un aminoácido no natural puede sustituirse con uno etiquetado isotópicamente, incluyendo pero sin limitarse al, grupo metilo como una prueba de la estructura local y dinámicos, incluyendo pero sin limitarse a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia vibracional . Los grupos funcionales alquinilo o azido por ejemplo, permiten la modificación selectiva de proteínas con moléculas a través de una reacción de cicloadición [3+2] . Un aminoácido no natural incorporado en un polipéptido en la terminal amino puede componerse de un grupo R que es cualquier sustituyente diferente al utilizado en los veinte aminoácidos naturales y un 2°. Grupo reactivo diferente a partir del grupo NH2 normalmente presente en a-aminoácidos (ver Fórmula I) . Un aminoácido no natural similar puede incorporarse en la terminal carboxilo con un 2 ° grupo reactivo diferente a partir del grupo COOH normalmente presente en un a-aminoácido (ver Fírmula I) . SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchos de los aminoácidos no naturales adecuados para utilizarse en la presente invención se encuentran comercialmente disponibles, e.g., de Sigma (USA) o Aldrich (Milwaukee, Wl, USA) . Aquellos que no se encuentran comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se proporciona en la presente o como se proporciona en varias publicaciones o utilizando métodos estándar conocidos por los expertos en la materia. Para técnicas de síntesis orgánica, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, Segunda Edición, Willard Grant Press, Boston, Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey and Sundberg (Tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Publicaciones adicionales que describen la síntesis de aminoácidos no naturales incluyen, e.g., WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids ;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem. , 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of ?-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates . J. Chem. Soc. , 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, Rr (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents . J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro- 4 [ [4- (diethylamino) -1-methylbutil] amino] quinoline (Chloroquine) . J. Org . Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M. , Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials . , Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues . J. Org . Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Puré Pipecolates from L-Aspargine. Application to the Total Synthesis of (+) -Apovicamine through Amino Acid Decacronylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org . Chem. 1989: 1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives . Tetrahedron Lett . 43:4297-4308; y Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocuclic 2-aminopropanoic axid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Ver también, las solicitudes de patente tituladas "Protein Arrays" presentada en Diciembre 22 de 2003, serie número 10/744,899 y la serie número 60/435,821 presentada en Diciembre 22 de 2002. A. Grupos Carbonil reactivos Los aminoácidos con un grupo carbonil activo se permiten para una variedad de reacciones para enlazar moléculas (incluyendo pero sin limitarse a, PEG u otras moléculas solubles en agua) a través de reacciones de adición nucleofílica o condensación de aldol entre otras. Los aminoácidos ejemplificativos que contienen carbonilo pueden representarse como sigue : en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; R2 es H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de amino terminal y R es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal carboxi . En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (i.e., metilo, etilo o propilo) y el residuo de cetona se coloca en la posición para con relación a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (i.e., metilo, etilo o propilo) y el residuo de cetona se coloca em la posición meta con relación a la cadena lateral alquilo. La síntesis de p-acetil- (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describe en Zhang, Z., et al., Biochemestry 42: 6735-6746 (2003), que se incorpora en la presente mediante la referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo pueden prepararse similarmente por un experto en la materia. En algunas modalidades, un polipéptido comprende un aminoácido codificado no de manera natural que se modifica químicamente para generar un grupo funcional carbonil reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehido útil para las reacciones de conjugación puede generarse a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. En donde la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo, una serina o treonina N-terminal (que puede estar normalmente presente o puede exponerse a través de digestión química o enzimática) puede utilizarse para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de media división oxidativa utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J. , Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., <J. Biol . Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en la materia se restringen al aminoácido en la terminal N del péptido o proteína. En la presente invención, un aminoácido codificado no de manera natural porta grupos hidroxilo y amino adyacentes que pueden incorporarse en el polipéptido como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina porta un grupo hidroxilo adyacente a la amina epsilon. Las condiciones de reacción para generar el aldehido típicamente involucran la adición de exceso molar de - metaperiodato de sodio bajo medias condiciones para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es típicamente de aproximadamente 7.0. Una reacción típica involucra la adición de aproximadamente 1.5 de exceso molar de meta periodato de sodio para una solución amortiguada del polipéptido, seguido por la incubación por aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Ver, e.g., la Patente de E.U. No. 6,423,685 que se incorpora en la presente mediante la referencia. La funcionalidad carbonilo puede reaccionarse selectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina o semicarbazida bajo medias condiciones en solución acuosa para formar los enlaces de hidrazona, oxima o semicarbazona correspondientes, respectivamente, que son estables bajo condiciones fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W.P., J". Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J y Tam, J. P. J". Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Además, la única reactividad del grupo carbonilo se permite para la modificación selectiva en la presencia de otras cadenas laterales de aminoácido. Ver, e.g., Cornish, V. W. , et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G. , Bioconjung. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal , L. K. , et al., Science 276:1125-1128 (1997) . B. Grupos reactivos de hidrazina,, hidrazida o semicarbazida - Los aminoácidos codificados no de manera natural contienen un grupo nucleofílico, tal como una hidrazina, hidrazida o semicarbazida, que se permiten para la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero sin limitarse a, con PEG y otros polímeros solubles en agua9. Los aminoácidos ejemplificativos que contienen hidrazina, hidrazida o semicarbazida pueden representarse como sigue : en donde n ea 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no está presente; X es O, N o S o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal amino y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal carboxi . En algunas modalidades, n es 4 , Rx no está presente y X es ?. En algunas modalidades n es 2, Rx no está presente y X no está presente. En algunas modalidades n es 1, Rx es fenilo, X es O y el átomo de oxígeno se coloca en para hacia el grupo alifático en el anillo de arilo. Se encuentran disponibles los aminoácidos que - contienen hidrazida, hidrazina y semicarbazida a partir de fuentes comerciales. Por ejemplo, L-glutamato-?-hidrazida está disponible por Sigma Chemical (St- Louis, MO) . Otros aminoácidos que no se encuentran comercialmente disponibles pueden prepararse por un experto en la materia. Ver, e.g., la Pat. de E.U. No. 6,281,211 que se incorpora en la presemte mediante la referencia. Los polipéptidos que contienen aminoácidos codificados no de manera natural que portan funcionalidades de hidrazida, hidrazina o semicarbazida pueden reaccionarse eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver, e.g., Shao, J. y Tam, J. , J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). La única reactividad de grupos funcionales de hidrazida, hidrazina y semicarbazida los hacen significativamente más reactivos hacia los grupos de aldehidos, cetonas y otros electrofílicos como se comparó con los grupos nucleofílicos presentes en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero sin limitarse a, el grupo hidroxilo de serina o treonina u otros grupos amino de lisina y la N terminal) . C. Aminoácidos que contienen aminooxi Los aminoácidos codificados no de manera natural contienen un grupo aminooxi (también lamado un hidroxilamina) que se permite para la reacción con una variedad de grupos - electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero sin limitarse a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Como las hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi permite que reaccione eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver, e.g., Shao, J. y Tam, J., J". Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res . 34: 727-736 (2001). En vista de que el resultado de la reacción con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxamina resulta generalmente a partir de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo tal como una cetona. Aminoácidos ejemplificativos que contienen grupos aminooxi pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; Y = C(0) o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación amino terminal y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación carboxi terminal. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 1 y Y está presente. En algunas modalidades, n es 2 , Rx y X no están presentes, m es 0 y Y no está presente. Los aminoácidos ue contienen aminooxi pueden prepararse a partir de precursores de aminoácido fácilmente disponibles (homoserina, serina y treonina). Ver, e.g., M. Carrasco y R. Brown, J". Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Ciertos aminoácidos que contienen aminooxi, tales como L-2-amino-4- (aminooxi) ácido butírico), se han aislado a partir de fuentes naturales (Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997) . Otros amianoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse por un experto en la materia. D. Grupos Reactivos de Azida y alquino La única reactividad de los grupos funcionales azida y alquino los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas. Las azidas orgánicas, particularmente azidas y alquinos alifáticas son generalmente estables hacia condiciones químicas reactivas comunes. En particular, tanto los grupos funcionales de azida como alquino son inertes hacia las cadenas laterales (i.e., grupos R) de los 20 aminoácidos comunes encontrados en polipéptidos que se presentan de manera natural . Cuando se traen en proximidad cercana, sin embargo, se revela la naturaleza "elástica" de los grupos azida y alquino y reaccionan selectiva y eficientemente a través de la reacción de cicloadición '[3+2] - de Huisgen para generar la triazola correspondiente. Ver, e.g., Chin J. , et al . , Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J". Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W. , et al., J. Am . Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Debido a que la reacción de cicloadición [3+2] de Huisgen involucra una reacción de cicloadición selectiva (ver, e.g., Padwa, A., en COMPREHENSIVE ORGANIC SY?THESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M. , 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITIO? CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p.1-176) en lugar de una sustitución nucleofílica, la incorporación de los aminoácidos no cidificados naturalmente portan cadenas laterales que contienen azida y alquino que permiten que los polipéptidos resultantes se modifiquen selectivamente en la posición del aminoácido codificado no de manera natural . La reacción de cicloadición que involucra el polipéptido hlF? que contiene azida o alquino puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones acuosas mediante la adición de Cu (II) (inlcuyendo pero sin limitarse a, en la forma de una cantidad catalítica de CuS0) en la presencia de un agente de reducción para reducir Cu (II) a Cu (I), in situ, en cantidad catalítica. Ver, e.g., Wang, Q. et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovsev, et al., Angew. Chem . Int . Ed. 41: 2596-2599 (2002). Agentes de reducción ejemplificativos incluyen pero no se limitan a, - ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+, Co2+ y un potencial eléctrico aplicado. En algunos casos, en donde se desea una reacción de cicloadición [3+2] de Huisgen entre una azida y un alquino, el polipéptido hlFN comprende un aminoácido codificado no de manera natural que comprende un . residuo de alquino y el polímero soluble en agua para unirse al aminoácido que comprende un residuo de azida. Alternativamente, también puede llevarse a vcabo la reacción inversa (i.e., con el residuo de azida en el aminoácido y el residuo de alquino en el polímero soluble en agua) . El grupo funcional azida también puede reaccionarse selectivamente con un polímero soluble en agua que contiene un éster de arilo y apropiadamente funcionalizado con un residuo de fosfina para generar un enlace de amida. El grupo de fosfina de arilo reduce la azida in si tu y la amina resultante entonces reacciona eficientemente con un enlace de éster próximo a generar la amida correspondiente. Ver, e.g., E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287 , 2007-2010 (2000) . El aminoácido que contiene azida puede ser ya sea un alquil azida (incluyendo pero sin limitarse a, 2-amino-6-azido-l-ácido hexanóico) o un aril azida (p-azido-fenilalanina) . Polímeros solubles en agua ejemplificativos que contienen un residuo de aril éster y uno de fosfina pueden - - representarse como sigue : en donde X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo, W es plímero soluble en agua y R puede ser los grupos H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido. Los grupos R ejemplificativos incluyen pero no se limitan a, -CH2, -C(CH3)3, -OR', -?R'R", -SR' , -halógeno, -C(0)R', -C=?R'R", -S(0)2R', -S(0)2?R'R", -C? y -?02. R' , R" , R" ' y R"" cada uno independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo pero sin limitarse a arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos arialquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada grupo R' , R" , R" ' y R"" cuando se encuentra presente más de uno de estos grupos . Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6- o 7- miembros. Por ejemplo, -?R'R" se refiere a que incluye pero no se limita a, l-pirrolidinil y 4-morfolinil . A partir de la discusión anterior de sustituyentes, un experto en la materia comprenderá que el término "alquilo" se refiere a que incluye los grupos incluyendo átomos de carbono unidos a los grupos diferentes a los grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero sin limitarse a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y lo similar). El grupo funcional azida también puede reaccionarse selectivamente con un polímero soluble en agua que contiene tioéster y apropiadamente funcionalizado con un residuo de aril fosfina para generar un enlace de amida. El grupo de aril fosfina reduce la azida in situ y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con el enlace de tioéster para generar la amida correspondiente. Los polímeros solubles en agua ejemplificativos que contienen un tioéster y un residuo de fosfina pueden representarse como sigue : en donde n es 1-10; X puede ser 0, N, S o no está presente, Ph es fenilo y W es un polímero soluble en agua. Los aminoácidos que contienen alquino ejemplificativos pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente,- m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación amino terminal y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación carboxi terminal. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X no está presente, m es 0 y el residuo de acetileno se coloca en la posición para con relación a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es 0, m es 1 y el grupo propargiloxi se coloca en la posición para con relación a la cadena lateral alquilo (i.e., O-propargil-tirosina) . En algunas modalidades, n es 1, Rx y X no están presentes y m es o (i.e., proparilglicina) . Los aminoácidos que contienen alquino se encuentran comercialmente disponibles. Por ejemplo, propargilglicina se encuentra comercialmente disponible por Peptech (Burlington, MA) . Alternativamente, los aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo con métodos estándar. Por ejemplo, p-propargilfenilalanina puede sintetizarse, por ejemplo como se describe en Deiters, A., et al., J". Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003) y 4-alquinil-L-fenilalanina pueden sintetizarse como se describe en Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Otros aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse por un experto en la materia. Los aminoácidos que contienen azida ejemplificativos pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación amino terminal y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación carboxi terminal. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X no está presente, m es 0 y el residuo de azida se coloca en para con la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 0-4 y Rx y X no está presente y m=0. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 2 y el residuo ß-azidoetoxi se coloca en la posición para con relación a la cadena lateral de alquilo. Los aminoácidos que contienen azida se encuentran disponibles en fuentes comerciales. Por ejemplo, 4-azidofenilalanina puede obtenerse de Chem-Impex International Inc. (Wood Dale, IL) . Para aquellos aminoácidos que contieen azida que no se encuentran comercialmente disponibles, el grupo azida puede prepararse relativamente fácil utilizando métodos estándar conocidos por los expertos en la materia, incluyendo pero sin limitarse a, a través del desplazamiento de un grupo de salida adecuado (incluyendo pero sin limitarse a haluro, mesilato, tosilato) o a través de la abertura de una lactona adecuadamente protegida. Ver, e.g., Advanced Organic Chemistry por March (Tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) . E. Grupos reactivos de aminotiol La única reactividad de los grupos funcionales de aminotiol beta-sustituidos los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehido a través de la formación de tiazolidina. Ver, e.g., J. Shao y J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. En algunas modalidades, los aminoácidos de aminotiol beta-sustituidos pueden incorporarse en los polipéptidos hlFN y después reaccionarse con polímeros solubles en agua que comprenden una funcionalidad aldehido. En algunas modalidades, un polímero soluble en agua, conjugado de droga y otra carga útil puede acoplarse a un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido de aminotiol beta-sustituido a través de la formación de tiazolidina.
/ABSORCIÓN CELULAR DE AMINO CIDOS NATURALES La absorción del aminoácido nonatural por una célula eucariótica es una emisión que se considera típicamente cuando se diseñan y seleccionan los aminoácidos no naturales, incluyendo pero sin limitarse a, para la incorporación en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de a-aminoácidos sugiere que estos compuestos no son deseables para ser permeables a la célula. Los aminoácidos naturales se toman en la célula eucariótica a través de una colección de sistemas de transporte basados en la proteína. Puede hacerse una clasificación rápida cuyos valores con aminoácidos no naturales, si los hay, se toman por las células. Ver, e.g., los ensayos de toxicidad en, e.g., las solicitudes tituladas "Protein Arrays" presentada en Diciembre 22 de 2003, número de serie 10/744,899 y número de serie 60/435,821 presentada en Diciembre 22 de 2002; y Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism wi th an expanded genetic code . PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la absorción se analiza fácilmente con varios ensayos, una alternativa para diseñar aminoácidos no naturales que es sujeta a examen para las trayectoria de absorción celular es para proporcionar trayectorias biosintéticas para crear aminoácidos in vivo . BIOSÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Todavía existen muchas trayectorias biosintéticas en células para la producción de aminoácidos y otros compuestos . Mientras que no puede xistir en la naturaleza un método biosintético para un aminoácido no natural particular, incluyendo pero sin limitarse a, en una célula eucariótica, la invención proporciona tales métodos. Por ejemplo, las trayectorias biosintéticas para aminoácidos no naturales se generan opcionalmente en la célula huésped al agregar nuevas enzimas o modificar trayectorias de célula huésped existentes. Nuevas enzimas adicionales son opcionlamente enzimas que ocurren natural o enzimas envueltas artificialmente. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalaniña (como se presentó en el ejmplo en la WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids") depende d ela adición de una combinación de enzimas conocidas a partir de otros organismos. Estos genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariótica al transformar la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la cálula, proporcionan una trayectoria enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente se proporcionan en los ejemplos de abajo. Las secuencias de enzimas adicionales se encuentran por ejemplo em Genbank. Las enzimas envueltas artificialmente también se agregan opcionalmente en una célula en la misma forma. En esta forma, la maquinaria celular y los recursos de una célula se manejan para producir aminoácidos no naturales . Se encuentra disponible una variedad de métodos para producir nuevas enzimas para utilizarse en las trayectorias biosintéticas o para la evolución de trayectorias existentes. Por ejemplo, la recombinación recursiva, incluyendo pero sin limitarse a, como se desarrolló por Maxygen, Inc. (disponible en el World Wide Web en maxygen.com) se utiliza opcionalmente para desarrollar nuevas enzimas y trayectorias. Ver, e.g., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA su ff ling, Nature 370(4): 389-391; y Stemmer, (1994; , DNA recombinar by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc . ati. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. Similarmente, DesignPath™ desarrollado por Genencor (disponible en la World Wide Web en genencor.com) se utiliza opcionalmente para elaborar la trayectoria metabólica, incluyendo pero sin limitarse a elaborar una trayectoria para crear 0-metil-L-tirosina en una célula. Esta tecnología recosntruye trayectorias existentes en organismos huésped utilizando una combinación de nuevos genes, incluyendo pero sin limitarse a, los identificados a través de genómicos funcionales y la evolución molecular y el diseño. Diversa Corporation (disponible en la World Wide Web en diversa.com) también proporciona la tecnología para bibliotecas de - clasificación rápida de genes y trayectorias de gen, incluyendo pero sin limitarse a, crear nuevas trayectorias. Típicamente, el aminoácido no natural producido con una trayectoria biosíntetica elaborada de la invención se produce en una concentración suficiente para la biosíntesis eficiente de la proteína, incluyendo pero sin limitarse a, una cantidad celular natural, pero no a tal grado como para afectar la concentración de los otros aminoácidos o agotar los recursos celulares . Las concentraciones típicas producidas in vivo en esta forma son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM. Una vez que se transforma una célula con un plásmido que comprende los genes utilizados para producir enzimas deseadas para una trayectoria específica y se genera un aminoácido no natural, las selecciones in vivo se utilizan opcionalmente para optimizar además la producción del aminoácido no natural para tanto la síntesis de la proteína ribosomal como el crecimiento celular. POLIPÉPTIDOS CON AMINOÁCIDOS NO NATURALES La incorporación de un aminoácido no natural puede darse para una variedad de propósitos, incluyendo pero sin limitarse a, cambios a la medida en la estructura de la proteína y/o función, cambio de tamaño, acidez, nucleofilicidad, unión a hidrógeno, hidrofobicidad, accesibilidad de sitios objetivo de proteasa, objetivación de un residuo (incluyendo pero sin limitarse a, para un arreglo de proteína), etc. Las proteínas que incluyen un aminoácido no natural pueden tener propiedades catalíticas o biofísicas mejoradas o apun totalmente nuevas. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente mediante inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribució, propuiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, capacidad catalítica, vida media (incluyendo pero sin limitarse a vida media del suero) , capacidad para reaccionar con otras olécuñas, incluyendo pero sin limitarse a, covalente o no covalentemente y lo similar. Las composiciones incluyen proteínas que incluyen al menos un aminoácido no natural que son útiles para, incluyendo pero sin limitarse a, nuevas proteínas terapéuticas, de diagnóstico, de enzimas catalíticas, de enzimas industriales, de unión (incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos) y incluyendo pero sin limitarse a, el estudio de la estructura y función de la proteína. Ver, e.g., Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. En un aspecto de la invención, una composición incluye al menos una proteína con al menos una que incluye pero no se limita, a al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez o más aminoácidos no naturales . Los aminoácidos no naturales pueden ser el mismo o diferente, incluyendo pero sin limitarse a, que pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 o 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprende 1, 2, 3,, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 0 más diferentes aminoácidos no naturales. En otro aspecto, una composición incluye una proteína con al menos uno, pero solo algunos que todos de un aminoácido particular presente en la proteína se sustituye con el aminoácido no natural. Para una proteína dada con más de uno de los aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo pero sin limitarse a, la proteína que puede incluir dos o más diferentes tipos de aminoácidos no naturales o puede incluir dos o más del mismo aminoácido no natural) . Para una proteína dada con más de dos aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser el mismo o diferente o una combinación de un aminoácido no natural múltiple de la misma clase con al menos un aminoácido no natural diferente. Las proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural son una característica de la invención. La invenciín también incluye polipéptidos o proteínas con al menos un aminoácido no natural producido utilizando las composiciones y métodos de la invención. Un excipiente (incluyendo pero sin limitarse a, un excipiente farmacéuticamente aceptable) también puede estar presente con la proteína. Al producir proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural en células eucarióticas, las proteínas o polipéptidos típicamente incluirán modificaciones eucarióticas post-translaciones . En ciertas modalidades, una proteína incluye al menos un aminoácido no natural y al menos una modificación post-translacional que se hace in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación post-translacional no se hace por una célula procariótica. Por ejemplo, la modificación de posttraslación incluye, incluyendo pero sin limitarse a, la acetilación, acilación, modificación de lípido, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido, glicosilación y lo similar. En un aspecto, la modificación post-translacional incluye la unión de un oligosacárido (incluyendo pero sin limitarse a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) para una aspargina mediante unenlace de GlcNAc-aspargina. Ver la Tabla 1 que lista algunos ejemplos de oligosacáridos N enlazados de proteínas eucarióticas (residuos adicionales también están presentes, los cuales no se muestran) . En otro aspecto, la modificación post-traducción incluye la unión de un oligosacárido (incluyendo pero sin limitarse a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina mediante un enlace de GalNAc-serina o GalNAc-treonina o un enlace de GlcNAc-serina o un GclNAc-treonina. TABLA 1: EJEMPLOS DE OLIGOSACÁRIDOS A TRAVÉS DEL ENLACE GlcNAc En aún otro aspecto, la modificación de posttraslación incluye procesamiento proteolítico de precursores (incluyendo pero sin limitarse a, precursor de calcitonina, precursor de péptido relacionado con el gen de calcitonina, hormona de preproparatiroideo, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, pro-opiomelanocortina y lo similar) , ensamblaje en una proteína de nultisubunidad o ensamblaje macromolecular, traslación hacia otro sitio en la 77 célula (incluyendo pero sin limitarse a, organelos, tales como el retículo endoplásmico, el aparato Golgi, los núcleos, lisosomas, peroxisomas, mitocondria, cloroplastos, vaculoas, etc o a través de trayectoria secretora) . En ciertas modalidades, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, un marcador de epítope, un marcador FLAG, un marcvador de polihistidina, una fusión GST o lo similar. Las Patentes de E.U. Nos. 4,963,495 y 6,436,674, que se incorporan en la presente mediante la referencia, construyen detalles diseñados para mejorar la secreciób de los polipéptidos hGH. Una ventaja de un aminoácido no natural es que presenta residuos químicos adicionales que pueden utilizarse para agregar moléculas adicionales. Estas modificaciones pueden hacerse in vivo en una célula eucariótica o no eucariótica o in vitro. Así, en ciertas modalidades, la modificación post-traducción se hace a través del aminoácido no natural. Por ejemplo, la modificación post-traducción puede ser a través de una reacción nucleofílica. La mayoría de las reacciones actualmente utilizadas para la modificación selectiva de proteína involucra la formación de unión covalente entre parejas de reacción nucleofílicos y electrofílicas, incluyendo pero sin limitarse a la reacción de a-halocetonas con cadenas laterales de histidina o cisteína. Selectivamente en estos casos se determina mediante el número y accesibilidad de las residuos nucleofílicos en la proteína. En las proteínas de la invención, pueden utilizarse otras reacciones más selectivas tales como la reacción de un aminoácido ceto no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vitro e in vivo. Ver, e.g., Cornish et al., (1996) Am. Chem. Soc, 118:8150-8151; Mahal et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. , 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. , 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; y Chin, et al., (2003) Science, in press . Esto permite la etiquetación selectiva de virtualmente cualquier proteína con un huésped o reactivos que incluyen fluoroforos, agentes de reticulación, derivados de sacárido y moléculas citotóxicas. Ver tambié, la Solicitud de Patente Serie No. 10/686,944 titulada "Glycoprotein synthesis" presentada en Enero 16 de 2003 que se incorpora en la presente mediante la referencia. Las modificaciones post-traducción, incluyen pero no se limitan a, a través de un aminoácido azido, tambuién pueden hacerse a través de ligacipon Staudinger (incluyendo pero sin limitarse a, con reactivos de triarilfosfina). Ver, e.g., Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24. La invención proporciona otro método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas, que involucra la incorporación genética de aminoácidos no naturales, incluyendo pero sin limitarse a, los que contienen un residuo azida o alquinilo en las proteínas en respuesta a un codón selector. Estas cadenas laterales de aminoácido pueden modificarse entonces al incluir pero sin limitarse a, la reacción de cicloadici+on [3+2] de Huisgen (ver, e.g., Padwa, A. en Comprehensive Organic Synthesis, Vol.4, (1991) Ed. Trost, B. M. , Pergamon, Oxford, p.1069-1109; y Huisgen, R. en 1,3 -Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) con, incluyendo pero sin limitarse a, derivados de alquinilo o azida respectivamente. Debido a que este método involucra una cicloadición en lugar de una sustitución nucleofílica, las proteínas pueden modificarse con selectividad extremadamente alta. Esta reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) mediante la adición de cantidades catalíticas de sales Cu(I) para la mezcla de reacción. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; y Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Otro método que puede utilizarse es el intercambio de ligando en un compuesto bisarsénico con un residuo de tetracisteína, ver, e.g., Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención a través de una cicloadición [3+2] incluye virtualmente cualquier molécula con un derivado de azida o alquinilo. Las moléculas incluyen pero no se limitan a tintes, fluoroforos, agentes de reticulación, derivados de sacárido, polímeros (incluyendo pero sin limitarse a, derivados de polietilen glicol) , fotoreticuladores, compuestos citotóxicos, etiquetas de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipép'tido (o más), polinucleótido (s) (incluyendo pero sin limitarse a, ADN, ARN, etc.), quelantes de metal, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos y lo similar. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo alquinilo, incluyendo pero sin limitarse al, grupo p-propargiloxifenilalanina o azido, incluyendo pero sin limitarse a, p-azido-fenilalanina respectivamente. V. Generación in vivo de polipéptidos hlFN que comprenden aminoácidos no codificados genéticamente Los polipéptidos hlFN de la invención pueden generarse in vivo utilizando sintetasas de ARNt y ARNt modificadas para agregar a o sustituir aminoácidos que no se codifican en sistemas que se presentan de manera natural . Los métodos para generar sintetasas ARNts y ARNt que utilizan aminoácidos que no se codifican en sistemas que se presentan de manera natural se describen en e.g., las Publicaciones de Solicitud de patente de ?.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) y 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorporan en la presente mediante la referencia. Estos métodos involucran generar una maquinaria traslacional que funciona independientemente de las sintetasas y ARNts endógenos al sistema de traslación (y por lo tanto algunas veces se refieren como "ortogonal"). Típicamente, el sistema de traslación comprende un ARNt ortogonal (0-AR?t) y una sintetasa AR?t de aminoacilo ortogonal (O-RS) . Típicamente, el 0-RS preferentemente aminoacila el 0-AR?t con al menos un aminoácido que no ocurre naturalmente en el sistema de traslación y el 0-AR?t reconoce al menos un codón selector que no se reconoce por el otro ARNts en el sistema. El sistema de traslación inserta así el aminoácido codificado no de manera natural en una proteína producida en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, "sustituyendo" por lo tanto un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado. Se ha descrito en la materia una amplia variedad de sintetasas ARNts ortogonales y AR?t de aminoacilo para insertar aminoácidos sintéticos particulares en los polipéptidos y que son generalmente adecuados para utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, las sintetasas O-ARNt/ARNt de aminoacilo ceto-específicas se describen en Wang, L. et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 100:56-61 (2003) y Zhang, Z et al., Biochem. 42 (22) :6735-6746 (2003). Los O-RS o porciones de las mismas ejemplificativas se codifican por secuencias de polinucleótido e incluyen secuencias de aminoácido descritas en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 y 2003/0108885, incorporada cada una en la presente mediantela referencia. Las moléculas O-ARNt correspondientes para utilizarse con O-RSs también se describen en ñas Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) y 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorporan en la presente mediante la referencia. Un ejemplo de un sistema O-ARNt de azida específico/aminoacilo-ARNt se describe en Chin, J. W. , et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Secuencias ejemplificativas de O-RS para p-azido-L-Phe incluyen, pero no se limitan a secuencias de nucleótido SEQ ID Nos: 14-16 y 29-32 y secuencias de aminoácido SEQ ID Nos: 46-48 y 61-64 como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0108885 (Serie No. 10/126,931) que se incorpora en la presente mediante la referencia. Las secuencias O-ARNt ejemplificativas adecuadas para utilizarse en la presente invención incluyen pero no se limitan a, secuencias de nucleótido SEQ ID Nos: 1-3 como se describe en la Publicación de Solicitud de patente de E.U. 2003/0108885 (Serie No- 10/126,931) que se incorpora en la presente mediante la referencia. Otros ejemplos de pares de sintetasa O-ARNt/aminoacilo-ARNt específicos para aminoácidos particulares no cidificados naturalmente se describe en la Publicación de Solicitud de Patente 2003/0082575 (Serie No. 10/126,927) que se incorpora en la presente mediante la referencia. O-RS y O-ARNt que incorporan ambos aminoácidos que contienen ceto y azida en S. cerevisiae se describen en Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003). El uso de sintetasas 0-7?RNt/aminoacilo-ARNt involucra la selección de un codón específico el cual codifica el aminoácido codificado no de manera natural. Mientras que puede utilizarse cualquier codón, es generalmente deseable seleccionar un codón que se utilice raramente o nunca en la célula en la cual se expresa la sintetasa O-ARNt/aminoacilo-ARNt . Por ejemplo, los codones ejemplificativos incluyen un codón sin sentido tal como los codones de terminación (ámbar, ocre y opal) , cuatro o más codones base y otros tres codones base naturales que se encuentran raramente o sin utilizar. El (los) codon (es) selector (es) específico (s) pueden introducirse en posiciones apropiadas en la secuencia de codificación del polinucleótido hlFN utilizandos métodos de mutagénesis conocidos en la materia (incluyendo pero sin limitarse a, mutagénesis específica del sitio, mutagénesis de cásete, mutagénesis de selección de restricción, etc.). Los métodos para generar los componentes de la maquinaria biosintética de la proteína, tales como O-RSs, 0-ARNts y pares 0-ARNt/O-RS ortogonales que pueden utilizarse para incorporar un aminoácido codificado no de manera natural se describen en Wang, L. et al., Science 292:498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc . 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemestry 42:6735-6746 (2003). Los métodos y composiciones para la incorporación in vivo de aminoácidos codificados no de manera natural se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie ?o. 10/126,927) que se incorpora en la presente mediante la referencia. Los métodos para seleccionar un par de sintetasa ARNt-AR?t ortogonal para utilizarse en el sistema de traslación in vivo de un organismo también se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (Serie ?o. 10/126,927) y 2003/010885 (Serie ?o. 10/126,931) que se incorporan en la presente mediante la referencia. Los métodos para producir al menos una sintetasa aminiacil-7?RNt ortogonal recombinante (0-RS) comprende: (a) generar un abiblioteca de (opcionalmente mutante) Rss derivados a partir de al menos una sintetasa de aminoacil-AR?t (RS) a partir de un primer organismo, incluyendo pero sin limitarse a, un organismo procariótico, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A. fulgidus, P. furiodud, P. horikoshii , A. pernix, T. thermophilus o lo similar o un organismo eucariótico; (b) seleccionar (y/o clasificar) la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutante) para miembros aminoacilan ARNt ortogonal (O-ARNt) en la presencia de un aminoácido codificado no de manera natural y un aminoácido natural, pro lo tanto proporcionan un grupo de RSs activo (incluyendo pero sin limitarse a, RSs mutante) que preferencialmente aminoacilan el O-ARNt en la ausencia del aminoácido codificado no de manera natural, proporcionando por lo tanto el al menos un O-RS recombinante; en donde el al menos un O-RS recombinante preferencialmente aminoacila el 0-AR?t con al aminoácido codificado no de manera natural . En una modalidad, el RS es un RS activo. El RS inactivo puede generarse' al mutar un RS activo. Por ejemplo, el RS inactivo puede generarse al mutar al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2 , al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6 o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos a diferentes aminoácidos, incluyendo pero sin limitarse a, alanina. Las bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo pero sin limitarse al diseño rotacional en base a la proteína de estructura tri dimensionla o mutagénesis de nucleótidos RS en una técnica de diseño aleatorio o rotacional. Por ejemplo, los RSs mutantes pueden generarse mediante mutaciones específicos de sitio, mutaciones aleatorias, mutaciones de recombinación de generación de diversidad, construcciones qui, ericas, diseño racional y por otros métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica. En una modalidad, la selección (y/o clasificación) de la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para los miembros que son activos, incluyen pero no se limitan a, que aminoacila un ARNt ortogonal (O-ARNt) en la presencia de un aminoácido codificado no de manera natural y un aminoácido natural, incluye: introducir una selección positiva del marcador de clasificación, incluyendo pero sin limitarse a, un gen de resistencia a antibiótico o lo similar y la biblioteca de RRs (opcionalmente mutante) en una pluralidad de células en la presencia de un agente deselección; identificando células que sobreviven (o muestran una respuesta específica) en la presencia del agente de seleccióny/o clasificación al suprimir el al menos un codón selector en el marcador de selección o clasificación, proporcionando por lo tanto un subconjunto de células positivamente seleccionadas que contienen el grupo de RSs activas (opcionalmente mutantes) . Opcionalmente, puede variar la concentración del agente de selección y/o clasificación. En un aspecto, el marcador de selección positiva es un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón selector es un codón de detección ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positiva es un gen ß-lactamasa y el codón selector es un codón de detección ámbar en el gen ß-lactamasa. En otro aspecto el marcador de clasificación positiva comprende un marcador de clasificación fluorescente o luminiscente o un marcador de clasificación en base a la afinidad (incluyendo pero sin limitarse a, un marcador de superficie celular) . En una modalidad, la selección o clasificación negativa del grupo para RRs activos (opcionalmente mutantes) que preferencialmente aminoacilan el O-ARNt en la ausencia del aminoácido no cidificado naturalmente incluye: introducir un marcador de selección o clasificación negativa con el RRs del grupo activo (opcionalmente mutante) a partir de la selección o clasificación negativa en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de selección o clasificación negativa comprende al menos un codón selector (incluyendo pero sin limitarse a, un gen de resistencia antibiótica, incluyendo pero sin limitarse a, un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; e - - identificación de células que sobreviven o muestran una respuesta de clasificación específica en un primer medio suplementado con el aminoácido codificado no de manera natural y un angente de clasificación o selección, pero falla para sobrevivir o para mostrar la respuesta específica en un segundo medio no suplementado con el aminoácido codificado no de manera natural y el agente de selección o clasificación, proporcionando por lo tanto células sobrevivientes o células clasificadas con el al un menos 0-RS recombinante. Por ejemplo, un protocolo de identificación CAT opcionalmente actúa como una selección positiva y/o clasificación negativa en la determinación de recombinantes O-RS apropiados . Por ejemplo, un grupo de clones opcionalmente se duplica sobre placas de crecimiento que contienen CAT (que comprende al menos un codón selector) ya sea con o sin uno o más aminoácidos no cidificados naturalmente. El crecimiento de las colonias exclusivamente sobre las placas que contienen aminoácidos codificados no de manera natural se contemplan así a medida que contienen O-RS recombinante. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o clasificación) es variada. En algunos aspectos el primero y segundo organismos son diferentes. Así, el primero y/o segundo organismo opcionalmente comprende: un procariote, un eucariote, un mamífero, un Escherichia coli , un hongo, una levadura, una araquebacteria, una eurobacteria, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras modalidades el marcador de clasificación comprende el marcador de clasificación fluorescente o luminiscente o un marcador de clasificacipón en base a la afinidad. En otra modalidad, la clasificación o selección (incluyendo pero sin limitarse a, seleccionar negativamente) del grupo para RSs activos (opcionalmente mutantes) incluye: aislar el grupo del RRs mutante activo a partir de la etaá de selección positiva (b) ; introducir un marcador de selección o clasificación negativa en donde el marcador de selección o clasificación negativa comprende al menos un codón selector (incluyendo pero sin limitarse a, un gen marcador tóxico, incluyendo pero sin limitarse a, un gen de barnasa de ribonucleasa, que comprende al menos un codón selector) y el grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células de un segundo organismo; e identificación de células que sobreviven o muestran una respuesta de clasificación específica en un primer medio no suplementado con el aminiácido no codificado naturalmente, pero falla para sobrevivir o mostrar una respuesta de clasificación específica en un segundo medio suplementado con al aminoácido codificado no de manera natural, proporcionando por lo tanto células sobrevivientes o clasificadas con el al menos un O-RS recombinante, en donde el al menos un O-RS recombinante es específico para el aminoácido codificado no - de manera natural. En un aspecto, el al menos un codón selector comprende aproximadamente dos o más codones selectores. Tales modalidades opcionalmente pueden incluirse en donde el al menos un codón selector comprende dos o más codones selectores y en donde el primero y segundo organismo son diferentes (incluyendo pero sin limitarse a, cada organismo opcionalmente incluye pero no se limita a, un procariote, un eucariote, un mamífero, un Escherichia coli , un hongo, una levadura, una araquebacteria, una eurobacteria, una planta, un insecto, un protista, etc.) También, algunos aspectos se incluyen en donde el marcador de selección negativa comprende un gen de barnasa de ribonucleasa (que comprende al menos un codón selector) . Otros aspectos se incluyen en donde el marcador de clasificación opcionalmente comprende un marcador de clasificación fluorescente o luminiscente o un marcador de clasificación por afinidad. En las modalidades de la presente, las clasificaciones y/o selecciones opcionalmente incluyen la variación de la estringencia de clasificación y/o selección. En una modalidad, los métodos para producir al menos una sintetasa de aminoacidol-ARNt ortogonal recombinante (O-RS) pueden comprender además: (d) aislar el al menos un O-RS recombinante; (e) generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutado) derivado a partir de al menos un O-RS recombinante; y (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que el O-RS mutado que sea obtenido comprenda una capacidad para aminoacilar preferencialmente el O-ARNt . Opcionalmente, las etapas (d) - (f) se repiten, incluyendo pero sin limitarse a, al menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el segundo conjunto de O-RS mutados se deriva a partir de al menos un O-RS recombinante que puede generarse mediante mutagénesis, incluyendo pero sin limitarse a, mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, recombinación o una combinación de las mismas. La estringencia de las etapas de selección/ clasificación incluyendo pero sin limitarse a, la etapa de selección/clasificación positiva (b) , la etapa de selección/ clasificación negativa (c) o ambas, las etapas de selección/ clasificación positiva y negativa (b) y (c) , en los métodos antes decritos, opcionalmente incluyen variar la estringencia de selección/clasificación. En otra modalidad, la etapa de selección/clasificación positiva (b) , la etapa de selección/ clasificación negativa (c) o ambas las etapas de selección/ clasificación positiva y negativa (b) y (c) comprenden utilizar un reportador en donde el reportador se detecta mediante la distribución de la célula activada por fluorescencia (FACS) o en donde el reportador se detecta mediante luminiscencia. Opcionalmente, el reportador se despliega sobre una superficie celular, sobre un despliegue de fago o lo similar y se selecciona en base e la actividad de afinidad o catalítica involucrando el aminoácido codificado no de manera natural o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se despliega sobre una superficie celular, sobre un despliegue de fago o lo similar. Los métodos para producir un ARNt ortogonal recombinante (O-ARNt) incluyen: (a) generar un abiblioteca de ARNts mutantes derivadas a partir de al menos un ARNt , incluyendo pero sin limitarse a, un ARNt supresor, a partir de un primer organismo; (b) seleccionar (incluyendo pero sin limitarse a, seleccionar negativamente) o clasificar la biblioteca para ARNs (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan mediante una sintetasa de aminoacilo-ARNt (RS) a partir de un segundo organismo en la ausencia de un RS del primer organismo, proporcionando por lo tanto un grupo de ARNts (opcionalmente mutantes) ; y (c) seleccionar o clasificar el grupo de AR?ts (opcionalmente mutantes) para los miembros que se aminoacilan mediante un RS ortogonal introducido (O-RS) , proporcionando por lo tanto al menos un O-ARNt recombinante; en donde el al menos un O-ARNt recombinante reconoce un codón selector y no reconoce la eficiencia mediante el RS a partir del segundo organismo y se aminoacila preferencialmente mediante le O-RS . En algunas modalidades el al menos un ARNt se un ARNt supresor y/o comprende un codón único de tres bases de bases naturales y no naturales o es un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural , un codón que comprende al menos 4 bases , un codón ámbar, un codón ocre o un codón de detención opal. En una modalidad, el O-ARNt recombinante posee una mejora de ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, 0-ARNt se importa opcionalmente en un primer organismo a partir de un segundo organismo sin necesidad de modificación. En varias modalidades, el primero y segundo organismos son ya sea el mismo o diferente y se seleccionan ocpionalmente a partir de, incluyendo pero sin limiatrse de, procariotes (incluyendo pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii, Metahobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli , Halobacterium, etc.), eucariotes, mamíferos, hongos, levaduras, araquebacteria, eubacteria, plantas, insectos, protistas, etc. Adicionalmente, el ARNt recombinante se aminoacila opcionalmente por un aminoácido codificado no de manera natural, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se biosintetiza in vivo ya sea naturalmente o a través de manipulación genética. El aminoácido codificado no de manera natural se agrega opcionalmente a un medio de crecimiento para al menos el primero o segundo organismo. En un aspecto, la selección (incluyendo pero sin limitarse a, seleccionar negativamente) o clasificación de biblioteca oara ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan mediante una etapa de sintetasa de aminoacilo_ARNt (etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en d9nde el gen marcador tóxico comprende al menos un codón selector (o un gen que conduce a la producción de un agente tóxico o estático o un gen esencial para el organismo en donde tal gen marcador comprende al menos un codón selector) y la biblioteca de ARNts (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células a partir del segundo organismo; y seleccionar células sobrevivientes, en donde las células sobrevivientes contienen el grupo de ARNts (opcionalmente mutantes) que comprende al menos un ARNt ortogonal o ARNt funcional. Por ejemplo, las células sobrevivientes pueden seleccionarse al utilizar un ensayo de densidad celular de proporción de comparación. En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones selectores. En otra modalidad de los métodos, el gen marcador tóxico es un gen de barnasa de ribonucleasa, en donde el gen de barnasa de ribonucleasa comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen de barnasa de ribonucleasa puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, seleccionar o clasificar el grupo de ARNts (opcionalmente mutantes) para los miembros que se aminoacilan por un RS ortogonal introducido (O-RS) puede incluir: introducir un gen marcador de selección o clasificación positiva, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a la droga (incluyendo pero sin limitarse a, gen de ß-lactamasa, que comprende al menos uno de los codones selectores, tal como al menos un codón selector ámbar) o un gen esencial para el organismo, o un gen que conduce a la deisntoxificación de un agente tóxico, junto con O-RS y el grupo de ARNts (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células a partir del segundo organismo; e identificar el crecimiento de las células sobrevivientes o clasificadas en la presencia de un agente de selección o clasificiacón, incluyendo pero sin limitarse a, un antibiótico, proporcionando por lo tanto un grupo de células que poseen el al menos un ARNt recombinante, en donde el al menos un ARNt recombinante se aminoacila mediante O-RS e inserta el aminoácido en un producto de traslación codificado por el gen marcador positivo, en respuesta de al menos un codón selector. En otra modalidad, la concentración del agente de selección y/o clasificiación es variada. Se proporcionan los métodos para generar pares O-ARNt/O-RS específicos. Los métodos incluyen: (a) generar una biblioteca de ARNts mutantes derivadas a partir de al menos un AR?t a partir de un primer organismo; (b) seleccionar o clasificar negativamente la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan mediante una sintetasa de aminoacilo-ARNt (RS) a partir de un segundo organismo en la ausencia de un RS a partir del primer organismo, proporcionando por lo tanto un grupo se ARNts - (opcionalmente mutantes) ; (c) seleccionar o clasificar el grupo de ARNts (opcionalmente mutantes) para los miembros que se aminoacilan mediante un RS ortogonal introducido (O-RS) , proporcionando por lo tanto al menos un O-ARNt recombinante. El al menos un ARNt recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce la eficiencia por el RS a partir del segundo organismo y se aminoacila preferencialmente por el O-RS . El método también incluye (d) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas a partir de al menos una sintetasa de aminoacilo-ARNt (RS) a prtir de un tercer organismo; (e) seleccionar o clasificar la biblioteca de RSs mutantes para los miembros que aminoacilan preferencialmente el al menos un O-ARNt recombinante en la presencia de un aminoácido codificado no de manera natural y un aminoácido natural, proporcionando por lo tanto un grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes) ; y (f) seleccionar o clasificar negativamente el grupo para RSs activos (opcionalmente mutantes) que aminoacilan preferencialmente el al menos un O- ARNt recombinante en la ausencia de un aminoácido no codificaco naturalmente, proporcionando por lo tanto un par O-ARNt/O-RS específico, en donde el al menos el par O-ARNt/O-RS específico comprende al menos un O-RS recombinante que es específico para el aminoácido codificado no de manera natural y el al menos un O-ARNt recombinante . Se incluyen los pares O-ARNt/0-RS específicos producidos por los métodos. Por - ejemplo, el par O-ARNt/O-RS puede incluir, incluyendo pero sin limitarse a, un par mutRNATyr-mutTyrRS , tal como un par mutRNATyr-SS12TyrRS, un par mutRNALeu-mutLeuRS , un par mutRNAThr-mutThrRS, un par mutRNAGlu-mutGluRS o lo similar. Adicionalmente, tales métodos se incluyen en donde el primer y tercer organismo son el mismo (incluyendo pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii) . Los métodos para seleccionar un par de sintetasa ARNt-ARNt ortogonal para utilizarse en un sistema de traslación in vivo para un segundo organismo se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen. Introducir un gen marcador, un ARNt y una sintetasa de aminoacilo-ARNt (RS) aislada o derivada a partir de un primer organismo en un primer conjunto de células a partir de un segundo organismo; introduciendo el gen marcador y el ARNt en un conjunto celular duplicado a partir de un segundo organismo; y seleccionar para las células sobrevivientes en el primer conjunto que falla para sobrevivir en el conjunto celular duplicado o la clasificación para las células que muestran una respuesta de clasificación específica que falla para dar tal respuesta en el conjunto celular duplicado, en donde el primer conjunto y el conjunto celular duplicado crecen en la presencia de un agente de selección o clasificación, en donde las células sobrevivientes o clasificadas comprenden el par de sintetasa ARNt-ARNt ortogonal para utilizarse en el - - sistema de traslación in vivo del segundo organismo. En una modalidad, la ocmparación y selección o clasificación incluye un ensayo de complementación in vivo. La concentración del agente de selección o clasificación puede variar. Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, el primero y segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden ser el mismo o diferente. En una modalidad, los organismos son opcionalmente un organismo procariótico, incluyendo pero sin limitarse a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus o lo similar. Alternativamente, los organismos opcionalmente comprenden un organismo eucariótico, incluyendo pero sin limitarse a, plantas (incluyendo pero sin limitarse a, plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas) , algas, protistas, hongos (incluyendo pero sin limitarse a, levaduras, etc.), animales (incluyendo pero sin limitarse a, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.) o lo similar. En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico incluyendo pero sin limitarse a Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A . pernix, T. thermophilus o lo similar.
Alternativamente, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, incluyendo pero sin limitarse a, una levadura, una célula de animal, una célula de planta, un hongo, una célula de mamífero o lo similar. En varias modalidades el primero y segundo organismos son diferentes. VT. Ubicación de aminoácidos que no ocurren naturalmente en polipéptidos hlFN La presente invención contempla la incorporación de uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en los polipéptidos hlFN. Uno o más aminoácidos que se presentan de manera natural pueden incorporarse en una posición particular que no rompe la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse al hacer sustituciones "conservativas" , incluyendo pero sin limitarse a, la sustitución de aminoácidos hidrofóbicos con aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos voluminosos para aminoácidos voluminosos, aminoácidos hidrofílicos para aminoácidos hidrofílicos) y/o insertart al aminoácido que no ocurre naturalmente en una ubicación que no se requiere para la actividad. Las regiones de hGH pueden ilustrarse como sigue, en donde las posiciones de amainoácido en hGH se indican a la mitad de la fila (SEQ ID NO: 2) : Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D [1-5] - [6-33] - [34-74] - [75-96] - [97-105] - [106-129] - [130-153] - [154-183] - [184-191] Term ? ciclo A-B ciclo B-C ciclo C-D term C Las regiones de hlFN pueden ilustrarse como sigue, en donde las posiciones de aminoácido en hlFN son de acuerdo con la SEQ ID NO: 24: 1-9 (N-terminal) , 10-21 (hélice A) . 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) , 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y E) , 137-155 (hélice E) , 156-165 (terminal C) . Una variedad de enfoques bioquímicos y estructurales puede emplearse para seleccionar los sitios deseados para la sustitución con un aminoácido codificado no de manera natural dentro del polipéptido hlFN. Es fácilmente aparente para los expertos en la materia que cualquier posición de la cadena de polipéptido es adecuada para la selección para incorporar un aminoácido codificado no de manera natural y la selección puede ser en base al diseño racional o mediante selección aleatoria para cualquier o ningún propósito particular. La selección de sitios deseados puede ser para producir una molécula de hlFN que tiene cualquier propiedad o actividad deseada, incluyendo pero sin limitarse a, agonistas, super-agonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de unión a receptor, moduladores de actividad a receptor, formación de dímero o multímero, sin cambio para la actividad o comparación adecuada de la molécula nativa o manipulación de cualquier propiedad física o química del polipéptido tal como solubilidad, agregación o estabilidad. Por ejemplo las ubicaciones en el polipéptido requeridas para actividad biológica de los polipéptidos hlFN pueden identificarse utilizando métodos de exploración de alanina o de exploración homologa conocidos en la materia.
Ver, e.g., Cunningham, B. y Wells, J. , Science, 244:1081-1085 (1989) (identificando 14 residuos que son críticos para la actividad hGH) y Cunningham, B. et al., Science 243:1330-1336 (1989) (identificando los epítopes de anticuerpo y receptor utilizando mutagénesis de exploración homologa). Ver, e.g., Di Marco et al., Biochem Biophys Res Com 202:1445 (1994); Walter et al., Cáncer Biotherapy & Radiopharm. 13:143 (1998); Runkel et al. J.B.C. 273:8003 (1998) para IFN. Los residuos diferentes a aquellos identificados como críticos para la actividad biológica mediante mutagénesis de exploración de alanina u homologa pueden ser buenos candidatos para la sustitución con un aminoácido codificado no de manera natural dependiendo de la actividad deseada observada para el polipéptido. Alternativamente, los sitios identificados como críticos para la actividad biológica pueden también ser buenos candidatos para la sustitución con un aminoácido codificado no de manera natural, dependiendo de nuevo de la actividad deseada observada para el polipéptido. Otra alternativa puede ser hacer simplemente varias sustituciones en cada posición en la cadena de polipéptido con un - aminoácido codificado no de manera natural y observar el efecto en las actividades del polipéptido. Es fácilmente aparente para los expertos en la materia que es adecuado cualquier medio, técnica o método para seleccionar una posición para la sustitución con un aminoácido no natural en cualquier polipéptido para utilizarse en la presente invención. La estructura y actividad de mutantes que se presentan de manera natural de polipéptidos hlFN que contienen supresiones también puede examinarse para determinar las regiones de la proteína que son deseables para ser tolerantes a la sustitución con un aminoácido codificado no de manera natural. Ver, e.g., Kostyo et al., Biochem. Biophys . Acta . 925:314 (1987); Lewis, U. , et al., J". Biol . Chem. , 253:2679-2687 (1978) para hGH. En una forma similar, la digestión de la proteasa y anticuerpos monoclonales puede utilizarse para identificar regiones de hlFN que responden para la unipon del receptor hlFN. Ver, e.g., Cunningham, B. et al., Science 243:1330-1336 (1989); Mills, J. et al., Endocrinology, 107:391-399 (1980); Li, C, Mol . Cell . Biochem. , 46:31-41 (1982) (indicando que los aminoácidos entre los residuos 134-149 pueden suprimirse sin una pérdidad de actividad) . Una vez que se han eliminado los residuos que son deseables para ser tolerantes a la sustitución con aminoácidos codificados no de manera natural, puede - examinarse el impacto de las sustituciones propuestas en cada una de las posiciones remanentes a partir de la estructura de cristal tri-dimensional del hlFN y sus proteínas de unión. Ver de Vos, A. et al., Science, 255:306-312 (1992) para hGH; todas las estructuras de cristal de hGH se encuentran disponibles en la Protein Data bank (incluyendo 3HHR, 1AXI y 1HWG) (PDB disponible de la World Wide Web en rcsb.org) , una base de datos centralizada que contiene datos de estructura tri-dimensional de moléculas grandes de las proteínas y ácidos nucleicos. Las estructuras cristalográfica de rayos X y ?MR de hlF? también se encuentran disponibles en la Protein Data Bank (1RH2 y 11TF) , asi como las Patentes de E.U. Nos. 5,602,232; 5,460,956; 5,441,734; 4,672,108 que se incorporan en la presente mediante la referencia. Así, los de experiencia en la materia pueden identificar fácilmente las posiciones de aminoácido que pueden sustituirse con aminoácidos codificados no de manera natural . En algunas modalidades, los polipéptidos hlFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente colocados en una región de la proteína que no rompe las hélices o la estructura secundaria de hoja beta del polipéptido. Los residuos ejemplificativos de la incorporación de un aminoácido codificado no de manera natural pueden ser aquellos que se excluyen a partir de las regiones de unión al - receptor potenciales (incluyendo pero sin limitarse al, Sitio I y Sitio II) , pueden ser completa o parcialmente expuestos al solvente, tienen o nó tienen interacciones mínimas o de unión a hidrógeno, con residuos próximos, pueden estar mínimamente expuestos a residuos reactivos próximos y pueden estar en regiones que son altamente flexibles (incluyendo pero sin limitarse al ciclo C-D) o estructuralmente rígidos (incluyendo pero sin limitarse a la hélice B) como se predijo por la estructura de cristal tri-dimensional del polipéptido hlFN con su receptor. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificados no de manera natural se incorporan encualquier posición en una o más de las siguientes regiones correspondientes a las estructuras secundarias en hGH como sigue: 1-5 (terminal N) , 6-33 (hélice A), 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el ciclo A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-195 (región entre la hélice B y la hélice C, el ciclo B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el ciclo C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminal C) de la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, los polipéptidos hGH comprenden al menos un aminoácido que no ocurre naturalmente sustituido por al menos un aminoácido ubicado en al menos una región del hGH seleccionado a partir del grupo que consiste de la terminal N (1-5) , el extremo de la terminal N del ciclo A-B (32-46) ; el ciclo B-C (97-105) , el ciclo C-D (132-149) y la terminal C (184-191) . En algunas modalidades, uno o más de los aminoácidos codificados no de manera natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones de hGH: antes de la posición 1 (i.e., en la terminal N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminal carboxilo de la protaína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID ?O:l o 3) . Los sitios ejemplificativos de la inrosporación de uno o más aminoácidos codificados no de manera natural incluyen 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO:2 o los aminoácidos correspondientes de las SEQ ID ?O: 1 o 3. Un subconjunto de sitios ejemplificativos para la incorporación de uno o más aminoácidos codificados no de manera natural incluyen 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99 , 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de las SEQ ID NO: 1 o 3. Un examen de la estructura de cristal de hGH y sus interacciones con el receptor hGH indica que las cadenas laterales de estos residuos de aminácido son completa o parcialmente accesibles al solvente y la cadena lateral de un aminoácido codificado no de manera natural puede apuntar lejos de la superficie de proteína y fuera del solvente . Posiciones ejemplificativas para la incorporación de uno o más aminoácidos codificados no de manera natural que incluyen 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155 o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID ?O:2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID ?O: 1 o 3. Un examen de la estructura de cristal de hGH y sus interacciones con el receptor hGH indica que las cadenas laterales de estos residuos de aminácido son completamente expuestos al solvente y la cadena lateral del residuo nativo apunta hacia el solvente . Un subconjunto de sitios ejemplificativos para la incorporación de uno o más aminoácidos codificados no de manera natural incluye 30, 74, 103 o cualquier combinación de los mismos, de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID N0:1 o 3. Otro subconjunto de sitios ejemplificativos para la incorpoaración de uno o más aminoácidos codificados no de manera natural incluye 35, 92, 143, 145 o cualquier combinación de los mismos, de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3. En algunas modalidades, el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en la posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 1-5, 82-90, 117-134 y 169-176 de la SEQ ID NO: 3 (hGH) . En algunas modalidades, el aminoácido que no ocurre naturalmente en uno o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua, incluyendo pero sin limitarse a las posiciones: antes de la posición 1 (i.e., la terminal N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66 , 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminal carboxilo de la protaína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO:l o 3). En algunas modalidades, los aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de estas posiciones se enlazan a un polímero soluble en agua 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, los aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de estas posiciones se enlazan a un polímero soluble en agua: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . Los antagonistas GH humanos incluyen pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en; 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o la adición en la posiicón 1 (i.e., en la teminla N) o culaquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID ?O: 1, 3 o cualquiera de la otra secuencia GH) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificados no de manera natural se incorporan o sustituyen en una o más de las siguientes regiones a estructuras secundarias en IF? en donde las posiciones de aminoácido en hlF? son de acuerdo con la SEQ ID NO: 24: 1-9 (terminal ?) , 10-21 (hélice A) , 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) , 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y E) 137-155 (hélice E) , 156-165 (terminal C) . En algunas modalidades, uno o más de los aminoácidos codificados no de manera natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones IFN: antes de la posición 1 (i.e., en la terminal N), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo de la proteína) (como en la SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en los otros IFN's). En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 100, 106, 107, 108, 111, 113, 114 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en otros IFN's). En algunas modalidades los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 41, 45, 46, 48, 49 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en los otros IFN's). En algunas modalidades los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 61, 64, 65, 101, 103, 110, 117, 120, 121, 149 (SEQ ID NO:24 o los aminoácidos correspondientes en los otros IFN's). En algunas modalidades los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 6, 9, 12, 13, 16, 96, 156, 159, 160, 161, 162 (SEQ ID ?O: 24 o los aminoácidos correspondientes en los otros IF?'s) . En algunas modalidades los polipéptidos IF? de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 (SEQ ID ?O:24 o los aminoácidos correspondientes en los otros IF?'s). En algunas modalidades los aminoácidos que no ocurren naturalmente en estas u otras posiciones se enlazan a un polímero soluble en agua, incluyendo pero sin limitarse a las posiciones: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo) (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en los otros IFN' s) . En algunas modalidades, el polímero soluble en agua se acopla a una o más posiciones de aminoácido: 6, 9, 12, 13, 16, 41, 45, 46, 48, 49, 61, 64, 65, 96, 100, 101, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 117, 120, 121, 149, 156, 159, 160, 161 y 162 (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23, 25 o cualquiera de los otros polipéptidos IF?) . En algunas modalidades, los polipéptidos IF? de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente en una o más de las siguientes posiciones proporcionando un antagonista: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 o cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en otros IF?'s); un polipéptido hlF? que comprende una de estas sustituciones puede actuar potencialmene como un antagonista débil o agonista débil dependiendo del sitio seleccionado en la actividad deseada. Los antagonistas IF? humanos incluyen pero no se limitan a, aquellos con sustituciones en 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 o cualquier combinación de los mismos (hlF?; SEQ ID ?O:24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID ?O: 23 o 25) .
Una amplia variedad de aminoácidos codificados no de manera natural puede sustituirse para p incorporarase en una posición dada en un polipéptido hlFN. En general, un aminoácido codificado no de manera natural se selecciona para la incorporación basada en un examen de la estructura de cristal tri-dimensional de un polipéptido hlFN con su receptor, un preferencia para las sustituciones conservativas (i.e., aminoácidos codificado no de manera natural en base a arilo, tales como p-acetilfenilamina u O-propargiltirosina sustituyendo por Phe, Tyr y Trp) , y la química de conjugación específica que se desea introducir en el polipéptido hlFN (e.g., la introducción de 4-azidofenilalanina si se desea efectuar una cicloadición Huisgen [3+2] con un polímero soluble en agua que contiene un residuo alquino o una formación de enlace amida con un polímero soluble en agua que contienen un aril éster, que a su vez, incorpora un residuo fosfina) . En una modalidad, el método incluye además la incorporación en la proteína de un aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto la proteína con una molécula (incluyendo pero sin limitarse a una marca, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotorreticulador, un compuesto citotóxico, una droga, una marca de afinidad, una marca de - fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido de anti sentido, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una marca de giro, un fluoróforo, un residuo que contiene metal, un residuo radiactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas, un residuo fotoencerrado, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente divisible, un grupo fotodivisible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente activo reductor, un tioácido amino, un residuo tóxico, un residuo marcado isotópicamente, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo de electrón denso, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una marca detectable, una molécula pequeña, o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) que comprende un segundo grupo reactivo. El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo para unir la molécula al aminoácido no natural a través de una - cicloadición [3+2] . En una modalidad, el primer grupo reactivo es un residuo alquinilo o azido y el segundo grupo reactivo es un residuo azido o alquinilo. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo alquinilo (incluyendo pero sin limitarse a, en aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el residuo azido. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo azido (incluyendo pero sin limitarse a, en el aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo el es residuo alquinilo. En algunos casos, la(s) sustitución (es) de aminoácido codificada (s) se combinará (n) con otras adiciones, sustituciones o supresiones dentro del polipéptido hlFN para afectar otros rasgos biológicos del polipéptido hlFN. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la estabilidad (incluyendo pero sin limitarse a, resistencia a degradación proteolítica) del polipéptido hlFN o incrementar la afinidad del polipéptido hlFN para su receptor. En algunas modalidades, el polipéptido hlFN comprende una sustitución aminoácido seleccionada del grupo que consiste de F10A, F10H, F10I; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y; I179T o cualquier combinación de los mismos en la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la solubilidad (incluyendo pero sin limitarse a, cuando se expresan en E. coli u otras células huésped) del polipéptido hlFN. En algunas modalidades, las adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la solubilidad del polipéptido seguida de la expresión en células huésped recombinantes de E. coli. En algunas modalidades, el polipéptido hGH comprende una sustitución G120A de aminoácido. El polipéptido hGH que comprende esta sustitución retiene la actividad agonista y retiene o mejora los niveles de expresión en una célula huésped. En algunas modalidades, los sitios se seleccionan para sustitución con un aminoácido naturalmente codificado o no natural en adición a otro sitio para incorporación de un aminoácido no natural que da como resultado el incremento de la solubilidad del polipéptido seguida por la expresión en células huésped recombinantes de E. coli. En algunas modalidades, los polipéptidos hlFN comprenden otra adición, sustitución o supresión que modula la afinidad del receptor del polipéptido hlFN, modula (incluyendo pero sin limitarse a, incrementa o disminuye) la dimerización del receptor, estabiliza los dímeros de receptor, modula la vida media en circulación, modula la liberación o bio-disponibilidad, facilita la purificación, o mejora o altera la vía de administración particular. Por ejemplo, además de introducir uno o más aminoácidos codificado no de manera natural, como se determina en la - presente, se introducen una o más de las siguientes sustituciones: F10A, F10H, o F10I; M14W, M14Q, o M14G; H18D; H21N; R167N; D171S; E174S; F176Y; y I179T para incrementar la afinidad de la variante hGH para este receptor. De manera similar, los polipéptidos hlF? pueden comprender secuencias de división proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a, FLAG o poli-His) u otras secuencias en base a afinidad (incluyendo, pero sin limitarse a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero sin limitarse a, biotina) que mejoran la detección (incluyendo pero sin limitarse a, GFP) , purificación u otros rasgos del polipéptido. En algunas modalidades, la sustitución de un aminoácido codificado no de manera natural genera un antagonista hGH. Un sub-conjunto de sitios ejemplares para incorporación de uno o más aminoácidos codificado no de manera natural incluye: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127, o una adición antes de la posición 1 (SEQ ID ?O: 2, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID ?O: 1, 3 o cualquier otra secuencia GH) . En algunas modalidades, los antagonistas hGH comprenden al menos una sustitución en las regiones 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B) , el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito - B-C), 106-109 (hélice C) , 130.153 (región entre la hélice C y la hélice D, el circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) que ocasiona que el GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido codificado no de manera natural incluyen residuos dentro de la región de terminación amino de la hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, la sustitución de G120 con un aminoácido codificado no de manera natural tal como p-azido-L-fenilalanina u O-propargil-L-tirosina. En otras modalidades, las sustituciones antes listadas se combinan con sustituciones adicionales que ocasionan que el polipéptido hGH sea un antagonista hGH. Por ejemplo, un aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una de las posiciones identificadas en la presente y se introduce una sustitución simultánea en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120Y, G120F, o G120E) . En algunas modalidades, se sustituye un aminoácido diferente a glicina por G120 en la SEQ ID NO: 2 (hGH) . En algunas modalidades, se sustituye arginina por G120 en la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades el antagonista hGH comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en una región de enlace de receptor de la molécula hGH. En algunas modalidades, la sustitución de un - aminoácido codificado no de manera natural genera un antagonista hlFN. Un sub-conjunto de sitios de incorporación ejemplares de uno o más aminoácidos codificado no de manera natural incluyen: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 (como en la SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en otros IF?s) . Otro subconjunto de sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido codificado no de manera natural incluyen: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, (hlFN; SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID ?O: 23 o 25) . En algunas modalidades, los antagonistas hlF? comprenden al menos una sustitución en las regiones 1-9 (terminación ?) , 10-21 (hélice A) , 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) , 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y la hélice E) , 137-155 (hélice E) , 156-165 (terminación C) que ocasiona que el IF? actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido codificado no de manera natural incluyen residuos dentro de la región de terminación amino de la hélice A y una porción de la hélice - C. En otras modalidades, las sustituciones antes listadas se combinan con sustituciones adicionales que ocasionen que el polipéptido hlFN sea un antagonista hlFN. En algunas modalidades, el antagonista hlFN comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en una región de enlace de receptor de la molécula de hlFN . En algunos casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado no de manera natural. En algunos casos, el polipéptido hlFN incluye además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de uno o más aminoácidos codificado no de manera natural para los aminoácidos de origen natural . Por ejemplo, en algunas modalidades, al menos dos residuos en las siguientes regiones de hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado no de manera natural: 1-5 (terminación N) ; 32-46 (extremo de terminación N del circuito A-B) ; 97-105 (circuito B-C) ; y 132-149 (circuito C-D) ; y 184-191 (terminación C) . En algunas modalidades, al menos dos residuos en las siguientes regiones de hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado no de manera natural: 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, circuito B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y - la hélice D, el circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) . En algunas modalidades, al menos dos residuos en las siguientes regiones de hlFN se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado no de manera natural: 1-9 (terminación N) , 10-21 (hélice A) , 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) , 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y la hélice E) , 137-155 (hélice E) , 156-165 (terminación C) . en algunos casos dos o más residuos codificado no de manera natural se enlazan a uno o más PEGs lineales o ramificados de menor peso molecular (aproximadamente -50-20 kDa en masa o manes) , aumentando así la afinidad de enlace y comparable vida media en suero relativa a las especies unidas a un solo PEG de más alto peso molecular. En algunas modalidades, hasta dos de los siguientes residuos de hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en la posición: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186, y 187. En algunos casos, se realiza cualquiera de los siguientes pares de sustituciones: K38X* y K140X*; K41X* y K145X*; Y35X* y E88X*; Y35X* y F92X*; Y35X* y Y143X*; F92X* u Y143X* en donde X* representa un aminoácido codificado no de manera natural . Los sitios de incorporación preferidos de dos o más aminoácidos codificado no de manera natural incluyen combinaciones de los siguientes residuos: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186, y 187. Los sitios de incorporación particularmente preferidos de dos o más aminoácidos codificado no de manera natural incluyen combinaciones de los siguientes residuos: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 y 155. Los sitios de incorporación preferidos en hGH de dos o más aminoácidos codificado no de manera natural incluyen coombinaciones de los siguientes residuos : antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) o cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 2. Los sitios de incorporación preferidos del hlFN de dos o más aminoácidos codificado no de manera natural incluyen combinaciones de los siguientes residuos -. antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminación carboxilo de la proteína) o cualquier combinación de los mismos . Expresión de no eucariotos y eucariotos Para obtener un alto nivel de expresión de un polinucleótido hlFN clonado, típicamente ser subclonan los polinucleótidos que codifican un polipéptido hlFN de la invención en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor para dirigir la transcripción, un terminados de transcripción/translación, y si es para un ácido nucleico que codifica para una proteína, un sitio de enlace de ribosoma para una iniciación translacional. Los promotores - - bacteriales adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen, e.g., en Sambrook et al., y Ausubel et al. Los sistemas de expresión bacterial para expresar polipéptidos hlFN de la invención, se encuentran disponibles, incluyendo pero sin limitarse a E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., ?ature 302:543-545 (1983)). Los equipos para tales sistemas de expresión se encuentran comercialmente disponibles. Los sistemas de expresión eucariótica para células de mamífero, levadura, y células de insecto son muy conocidos en la técnica y también se encuentran comercialmente disponibles. En los casos en los que se utilizan tARNs ortogonales y aminoacil tARN sintetasas (antes descritas) para expresar los polipéptidos hlFN de la invención, las células huésped para expresión se seleccionan en base a su capacidad para utilizar los componentes ortogonales. Las células huésped ejemplares incluyen bacterias Gram positivas (incluyendo pero sin limitarse a B. brevis, B. subtilis o Streptomyces) y bacterias Gram negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida) , así como levadura y otras células eucarióticas. Las células que comprenden pares O-tARN/O-RS pueden utilizarse como se describe en la presente. Una célula huésped eucariótica o célula huésped no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad - de sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición incluye opcionalmente, incluyendo pero sin limitarse a, al menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos, 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos un gramo o más de la proteína que comprende un aminoácido no natural, o una cantidad que puede lograrse con métodos de producción de proteína in vivo (se proporcionan en la presente detalles en la producción y purificación de proteína recombinante) . En otro aspecto, la proteína se encuentra presente opcionalmente en la composición a una concentración de, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos 10 microgramos de proteína por litro, al menos 50 microgramos de proteína por litro, al menos 75 microgramos de proteína por litro, al menos 100 microgramos de proteína por litro, al menos 200 microgramos de proteína por litro, al menos 250 microgramos de proteína por litro, al menos 500 microgramos de proteína por litro, al menos 1 miligramo de proteína por litro, o al menos 10 miligramos de proteína por litro o más, en, incluyendo pero sin limitarse a, un lisado celular, un amortiguador, un amortiguador farmacéutico, u otra suspensión líquida (incluyendo, pero sin limitarse a, en un volumen de, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera desde aproximadamente 1 ni a aproximadamente 100 1) . Es una característica de la invención la producción de grandes cantidades (incluyendo, pero sin limitarse a, más de las típicamente posibles con otros métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, translación in vitro) de una proteína en una célula eucariótica incluyendo al menos un aminoácido no natural . Una célula huésped eucariótica o una célula no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad para biosintetizar las proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, las proteínas que comprenden un aminoácido no natural pueden producirse en una concentración de, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos 10 µg/litro, al menos 50 µg/litro, al menos 75 µg/litro, al menos 100 µg/litro, al menos 200 µg/litro, al menos 250 µg/litro, al menos 500 µg/litro, al menos 1 mg/litro, al menos 2 mg/litro, al menos 3 mg/litro, al menos 4 mg/litro, al menos 5 mg/litro, al menos 6 mg/litro, al menos 7 mg/litro, al menos 8 mg/litro, al menos 9 mg/litro, al menos 10 mg/litro, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro, o más de proteína en un extracto celular, lisado celular, medio de cultivo, un amortiguador, y/o lo similar.
- I . Sistemas de Expresión, Cultivo y Aislamiento Los polipéptidos hlFN pueden expresarse en cualquier número de sistemas de expresión adecuado incluyendo, por ejemplo, levadura, células de insecto, células de mamífero, y bacterias. Se proporciona abajo una descripción de sistemas de expresión ejemplares. Levadura . Como se utiliza en la presente, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras capaz de expresar un gen que codifica para un polipéptido hlFN. Tales levaduras incluyen, pero no se limitan a, levaduras ascosporógenas (Endomycetales) , levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen al grupo Fungi imperfecti (Blastomycetes) . Las levaduras ascosporógenas se dividen en dos familias, Spermophtoraceae y Saccharomycetaceae . La última se comprende de cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (e.g., género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae, Lipomycoideae y Saccharomycoideae (e.g., género Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces) . Las levaduras basidiosporógenas incluyen el género Leucosporidium, Rhodoosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium y Filobasisiella. Las levaduras que pertenecen al grupo Fungi Imperfecti (Blasomycetes) se dividen en dos familias, Sporobolomycetaceae (e.g., género Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (e.g., género Candida). De particular interés para su uso con la presente invención, son las especies dentro del género Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, y Candida, incluyendo, pero sin limitarse a P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. Lactis, K. Fragilis, C. albicans, C. maltosa, y H. polymorpha. La selección de la levadura adecuada para la expresión de polipéptidos hlFN se encuentra dentro de la habilidad de el de experiencia ordinaria en la técnica. al seleccionar huéspedes de levadura para expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, por ejemplo, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica, buena capacidad de secreción, buena producción de proteína soluble y robustez general. Las levaduras se encuentran disponibles generalmente de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, el Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) y la American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . El término "huésped de levadura" incluye levadura que puede ser o se ha utilizado como recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de levadura original que ha recibido los vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. Se entiende que la progenie de una sola célula de origen no necesariamente puede ser completamente idéntica en morfología o en el complemento de ADN genómico o total para la original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen suficientemente similar a la original que va a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido hlF?, se incluye en la progenie pretendida por esta definición. Los vectores de expresión y transformación, incluyendo replicones extracromosomales o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en muchos huéspedes de levadura. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para S. cerevisiae (Sikorski et al., Genetics (1998) 112-19; Ito et al., J. Bacteriol. (1983), 153:163; Hinnen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1978) 75_1929) ; C. albicans (Kurtz et al., Mol. Cell Biol., (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. Basic Microbiol., (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., (1986) 202:302); K. Gragilis (Das et al., J. Bacteriol., (1984) 158:1165); K. Lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol., (1983) 154:737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8:135); P. guilleromondii (Kunze et al., J. Basic. Microbiol., (1985) 25:141); P. pastoris - (Patentes de E.U. Nos. 5,324,639; 4,929,555; y 4,837,148; Cregg et al., Mol. Cell Biol., (1985) 5:3376); Schizosacharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature (1981) 300:706); y Y. Lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet., (1985) 10:49); A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284-89; Tiburn et al., Gene (1983) 26:205-221; y Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1984) 81:1470-74); A niger (Kelly y Hynes,. EMBO J. (1985) 4:475479); T. Reesia (EP 0 244 234); y hongos filamentosos tales como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357) , cada una incorporada por la referencia en la presente . Las secuencias de control para vectores de levadura son muy conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, regiones promotoras de genes tales como alcohol dehidrogenasa (7?DH) (EP 0 284 044) ,- enolasa; glucocinasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; gliceraldehído-3-fosfato-dehidrogenasa (GAP o GAPDH) , hexocinasa; fosfofructocinasa; 3-fosfogliceato mutasa; y piruvato cinasa (PyK) (EP 0 329 203) . El gen PH05 de levadura, que codifica ácido fosfatasa, también pueden proporcionar secuencias promotoras útiles (Myanohara et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1983) 80:1). Otras secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:2073); y otras enzimas glicolíticas, tales como piruvato decarboxilasa, triosefosfato isomerasa, y fosfoglucosa isomerasa (Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900; Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:149). Los promotores de levadura inducibles que tienen una ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, pueden incluir regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 1; isocitocromo C; ácido fosfatasa; metalotioneína; gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa; enzimas de degradación asociadas con el metabolismo de nitrógeno; y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en la EP 0 073 657. Los mejoradores de levadura también pueden utilizarse con promotores de levadura. Además, los promotores sintéticos también pueden funcionar como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias de activación en corriente ascendente (UAS) de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora ADH enlazada a la región de activación de transcripción GAP. Ver, Patentes de - E.U. Nos. 4,880,734 y 4,867,197, que se incorporan por la referencia en la presente. Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten de las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GALIO, o PH05, combinadas con la región de activación de transcripción de un gen de enzima glicolítica tal como GAP o PyK. Ver, EP 0 164 556. Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no levadura que tienen la capacidad de enlazar ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. A otros elementos de control que pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura incluyen terminadores, por ejemplo de GAPDH o los genes enolasa (Holland et al., J. Biol. Chem., (1981) 256:1385). Adicionalmente, el origen de repetición de origen plásmido 2µ es adecuado para la levadura. Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura. Ver, Tschemper et al., Gene (1980) 10:157; Kingsman et al., Gene (1979) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una especie mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofán. De manera similar, las especies de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por los plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. Los métodos para introducir ADN exógeno en - - huéspedes de levadura son muy conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica e incluyen típicamente, pero no se limitan a, ya sea los esferoplastos de transformación o de células huésped de levadura tratadas con cationes álcali. Por ejemplo la transformación de levadura puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en Hsiao et al., Proc. Nati. Acad, Sci. EUA (1979) 76:3829 y Van Solingen et al., J. Bact . (1977) 130:946. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como inyección nuclear, electroporación, o fusión de protoplasto, como se describe en general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lab. Manual (2001). Las células huésped de levadura pueden cultivarse entonces utilizando técnicas estándar conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Otros métodos para expresar proteínas heterólogas en células huésped de levadura son muy conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. ver, generalmente, la Publicación de Patente de E.U. No.20020055169, Patentes de E.U. Nos. 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; y 5,089,398 Patentes de E.U. Reexaminadas Nos. RE37,343 y RE35,749 Solicitudes de Patente PCT Publicadas WO 99/078621; WO 98/37208; y WO 98/26080; Solicitudes de Patente Europea EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; EP 0 460 071; EP 0 340 - - 986; EP O 329 203; EP O 324 274; y EP O 164 556. Ver también Gellissen et al., Antonie Van Leeuwenhoek (1992) 62(1-2) : 79-93; Romanos et al., Yeast (1992) 8 (6) :423-488 ; Goeddel, Methods in Enzymology (1990) 185:3-7, cada una incorporada en la presente por la referencia. Las especies de huésped de levadura pueden cultivarse durante la etapa de amplificación utilizando métodos de fermentación estándar en lotes de alimentos muy conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. los métodos de fermentación pueden adaptarse para contar con las diferencias en la ruta de utilización de carbono de huéspedes de levadura particulares o el modo de control de expresión. Por ejemplo, la fermentación de un huésped de levadura Saccharomyces puede requerir una sola alimentación de glucosa, fuente de nitrógeno complejo (e.g., hidrolisados de caseína), y múltiple suplementación de vitaminas. En contraste, la levadura metilotrópica P. pastoris puede requerir glicerol, metanol y alimentaciones de mineral de rastro, pero solo simples sales de amonio (nitrógeno) para un óptimo crecimiento y expresión. Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,324,639; Elliot et al., J. Protein Chem. (1990) 9:95; y Fieschko et al., Biotech. Bioeng. (1987) 29:1113, incorporada en la presente por la referencia. Sin embargo, tales métodos de fermentación pueden tener ciertas características comunes independientes de la - - especie de huésped de levadura empleado. Por ejemplo, puede agregarse un nutriente limitante del crecimiento, típicamente carbono, al fermentador durante la fase de amplificación para permitir el máximo crecimiento. Además, los métodos de fermentación emplean generalmente un medio de fermentación diseñado para contener cantidades adecuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósforo, y otros nutrientes menores (vitaminas, minerales de rastro y sales, etc.). Los ejemplos adecuados de medio de fermentación para uso con Pichia se describen en las Patentes de E.U. Nos. 5,324,639 y 5,231,178 que se incorporan en la presente por la referencia. Células de Insecto Infectadas con baculovirus . El término "huésped insecto" o "célula huésped de insecto" se refiere a un insecto que puede ser o ha sido utilizado como recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de insecto original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula de origen puede no ser necesariamente idéntica en morfología o en el complemento ADN genómico o toral a la original debido a una mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen que es suficientemente similar a la original que va a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido hlFN, se incluye en la progenie pretendida por - - esta definición. La selección de células de insecto adecuadas para la expresión de polipéptidos hlFN es muy conocida por los de experiencia ordinaria en la técnica. Diversas especies de insecto se encuentran muy bien descritas en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles incluyendo Aedes aegypti, Bombix mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni. Al seleccionar huéspedes de insecto para la expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, inter alia, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez general . Los insectos se encuentran generalmente disponibles de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, el Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; y el American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . Generalmente, los componentes de un sistema de expresión de insecto infectado por baculovirus incluyen un vector de transferencia, comúnmente un plásmido bacterial, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus, como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen heterólogo que va a expresarse; un baculovirus de tipo silvestre con secuencias homologas al fragmento específico del baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo en el genoma de baculovirus) ; y células huésped de insecto y medio de crecimiento apropiado. Los materiales, métodos y técnicas utilizados para construir vectores, células de transfección, placas de selección, células de crecimiento en cultivo, y lo similar, se conocen en la técnica y los manuales que describen estas técnicas se encuentran disponibles . Después de insertar el gen heterólogo en el vector de transferencia, el vector y el genoma de tipo silvestre se transfieren en una célula huésped de insecto en donde el vector y el genoma viral se recombinan. El virus recombinante empacado se expresa y las placas recombinantes se identifican y se purifican. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto se encuentran comercialmente disponibles en forma de equipo de, por ejemplo, Invitrogen Corp., (Carisbad, CA) . Estas técnicas generalmente son conocidas por los expertos en la técnica y se encuentran completamente descritas en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) , incorporada en la presente por la referencia. Ver también, Richardson, 39 Methods in Molecular Biology; Baculovirus Expression Protocols (1995) ; Ausubel et al, . Current Protocols in Molecular Biology 16.9-16.11 (1994); King y Posee, The Baculovirus System: A Laboratory Guide - 37 - (1992); y O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992) . En realidad, la producción de diversas proteínas heterólogas utilizando sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto se conoce bien en la técnica. Ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 6,368,825; 6,342,216 6,338,846 6,261,805; 6,245,528 6,225,060 6,183,987 6,168,932 6,126,944; 6,096,304 6,013,433 5,965,393 5,939,285 5,891,676; 5,871,986 5,861,279 5,858,368 5,843,733 5,762,939; 5,753,220 5,605,827; 5,583,023 5,571,709 5,516,657; 5,290,686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/03628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082 que se incorporan por la referencia en la presente. Los vectores útiles en sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, vectores de insecto de expresión y transferencia del virus de polihedrosis nuclear baculovirus Autographacalifornica (AcNPV) , que es un vector de expresión viral independiente del auxiliar. Los vectores de expresión viral derivados de este sistema utilizan comúnmente el fuerte - promotor de gen de polihedrina viral para conducir la expresión de genes heterólogos. Ver, generalmente Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992) . Previo a la inserción del gen externo en el genoma de baculovirus, los componentes antes descritos, que comprenden un promotor, guía (si se desea) , secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de transcripción, se ensamblan típicamente en una construcción de transcolocación intermedia (vector de transferencia) . Las construcciones de .transcolocación intermedia se mantienen frecuentemente en un replicón, tal como un elemento extra cromosomal (e.g., plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicón, permitiendo así que se mantenga en un huésped adecuado para clonación y amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177) y un gen procariótico de resistencia a la ampicilina (amp) y el origen de replicación para selección y propagación en E. coli. Un vector de transferencia comúnmente utilizado para introducir genes externos en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores, conocidos por los de experiencia en la técnica, incluyendo, por ejemplo, pVL985, que altera el codón de inicio de polihedrina de ATG a ATT, y que introduce pares base del sitio de clonación 32 de un BamHl del ATT. Ver, Luckow y Summers, 17 Virology 31 (1989) . Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, PblueBac4.5/V5-HÍS; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp. Carisbad, CA) . Después de la inserción del gen heterólogo, el vector de transferencia y el genoma baculoviral de tipo silvestre se co-transfectan en un huésped de célula de insecto. Los métodos para introducir un ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus de baculovirus son conocidos en la técnica. ver, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987); Smith et al., Mol. Cell Biol., (1983) 3:2156; Luckow y Summers, Virology (1989) 17:31. Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina, mediante doble recombinación cruzada homologa; la inserción también puede ser en un sitio de enzima de restricción fabricado en el gen de baculovirus deseado. Ver, Miller et al., Bioessays (1989) 4:91. La transfección puede lograrse por electroporación.
Ver, Trotter y Wood, 39 Methods in Molecular Biology (1995) ; Mann y King, J. Gen Virol. (1989) 70:3501. Alternativamente, los liposomas pueden utilizarse para transfectar las células de insecto con el vector de expresión recombinante y el baculovirus. Ver, e.g., Liebman et al., Biotechniques (1999) - 26(1) :36; Graves et al., Biochemistry (1998) 37:6050; Nomura et al., J. Biol. Chem., (1998) 273 (22) : 13570 ; Schmidt et al., Protein Expression and Purification (198) 12:323; Siffert et al., Nature Genetics (1998) 18:45; Tilkins et al., Cell Biology: A Laboratory Handbook 145-154 (1998); Cai et al., Protein Expression and Purification (1997) 10:263; Dolphin et al., Nature Genetics (1997) 17:491; Kost et al., Gene (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. Biol. Chem. (1996) 271 (37) :22376; Reversey et al., J. Biol. Chem., (1996) 271 (39) :23607-10 ; Stanley et al., J. Biol. Chem (1995) 270:4121; Sisk et al., J. Virol. (1994) 68(2) :766; y Peng et al., BioTecniques (1993) 14.2:274. Los liposomas comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, Cellfectin® y Lipofectin® (Invitrogen Corp., Carisbad CA) . Adicionalmente puede utilizarse transfección de fosfato de calcio. Ver, Trotter y Wood, 39 Methods in Molecular Biology (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; y Mann y King, J. Gen Virol. (1989) 70:3501. Los vectores de expresión de baculovirus contienen comúnmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazar un baculovirus ARN polimerasa e iniciar la transcripción en corriente descendente (3') de una secuencia de codificación (e.g., gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que comúnmente se coloca - - próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción incluye típicamente un sitio de enlace de ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de baculovirus también puede tener un segundo dominio llamado un mejorador, que, si se encuentra presente, comúnmente se encuentra distal al gen estructural. Además, la expresión puede ser ya sea regulada o constitutiva. Los genes estructurales, abundantemente transcritos en losa últimos momentos en el ciclo de infección, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles . Los ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína polihedral viral (Friesen et al., The Regulation of Baculovirus Gene Expression en The Molecular Biology of Baculoviruses (1986) ; EP 0 127 839 y 0 155 476) y el gen que codifica la proteína plO (Vlak et al., J. Gen Virol. (1988) 69:765) . El vector de expresión de baculovirus recién formado se empaca en un baculovirus recombinante infeccioso y subsecuentemente pueden purificarse las placa de crecimiento mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Ver, Miller et al., Bioessays (1989) 4:91; Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) . Se han desarrollado vectores de expresión de - baculovirus recombinante para infección en diversas células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, inter alia, Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125), Bombyx mori (ATCC No. CRL-8910) , Drosophila Malanogaster (ATCC No. 1963) , Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni. Ver, WO 89/046,699; Wright, Nature (1986) 321:718; Carbonell et al., J. Virol. (1985) 56:153; Smith et al., Mol. Cell Biol., (1983) 3:2156. Ver generalmente, Fraser et al., In Vitro Cell Dev. Biol. (1989) 25:225. Más específicamente, las líneas celulares utilizadas para sistemas de vector de expresión de baculovirus incluyen comúnmente pero sin limitarse a, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL-1711) , Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp. Cat No. 11497-013 (Carisbad, CA) ) , Tri-368 (Trichopulsia ni) , y High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni) . Las células y medios de cultivo se encuentran comercialmente disponibles para la expresión tanto directa como de fusión de polipéptidos heterólogos en la expresión de baculovirus, y generalmente la tecnología de cultivo celular se conoce por los expertos en la técnica. E. coli y otros Procariotos . Las técnicas de expresión bacterial son muy conocidas en la técnica. Una amplia variedad de vectores se encuentran disponibles para uso en huéspedes bacteriales. Los vectores pueden ser - vectores de copia única o de baja o alta multicopia. Los vectores pueden servir para clonación y/o expresión. En vista de la amplia literatura referente a vectores, la disponibilidad comercial de muchos vectores, e incluso los manuales que describen vectores y sus mapas de restricción y características, no se requiere en la presente una extensa descripción. Como es bien sabido, los vectores implican normalmente marcadores que permiten la selección, cuyos marcadores pueden proporcionar resistencia, prototrofia o inmunidad al agente citotóxico. Frecuentemente, se encuentra presente una pluralidad de marcadores que proporcionan diferentes características. Un promotor bacterial es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazar la ARN polimerasa bacterial e iniciar la transcripción en corriente descendente (3') de una secuencia de codificación (e.g., gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que se encuentra comúnmente colocada próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción incluye típicamente un sitio de enlace de ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacterial también puede tener un segundo dominio llamado un operador, que puede sobreponerse a un sitio de enlace de ARN polimerasa adyacente en el cual inicia la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción negativa regulada (inducible) , dado que una - proteína represora del gen puede enlazar al operador y en consecuencia inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede presentarse en ausencia de elementos negativos reguladores, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede lograrse mediante una secuencia de enlace de proteína del gen activador, que, si se encuentra presente, se encuentra comúnmente próxima (5') a la secuencia de enlace de ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora del gen es la proteína activadora de catabolito (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., Annu. Rev. Genet. (1984) 18-173]. La expresión regulada puede por tanto ser positiva o negativa, mejorando o reduciendo la transcripción. Las secuencias que codifican enzimas de trayectoria metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolízadoras de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., Nature (1977) 198:1056] y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofán (trp) [Goeddel et al., Nucí. Acids. Res. (1980) 8:4057; Yelverton et al., ?ucl . Acids Res. (1981) ) :731; Pat. de E.U. ?o . 4,738,921; GHPub . Nos. 036 776 y 121 775, que se incorporan por la referencia en la presente] . El sistema promotor de b-galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The Cloning of interferon and other mistakes" . En Interferon 3 (?d. I, Gresser) ] , los sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake et al., Nature (1981) 292:128] y T5 [Pat. de E.U. No. 4,689,406, que se incorporan por la referencia en la presente] proporcionan también secuencias promotoras útiles . Los métodos preferidos de la presente invención utilizan fuertes promotores, tales como el promotor T7 para inducir polipéptidos hlFN en altos niveles. Ejemplos de tales vectores son muy conocidos en la técnica e incluyen la serie pET29 de Novagen, y los vectores pPOP descritos en la WO 99/05297 que se incorpora por la referencia en la presente . Tales sistemas de expresión producen altos niveles de polipéptidos hlFN en el huésped sin comprometer la viabilidad de la célula huésped o los parámetros de crecimiento. Adicionalmente, los promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza funcionan también como promotores bacteriales. Por ejemplo, las secuencias de activación de transcripción de un promotor bacterial o bacteriófago pueden unirse con las secuencias operón de otro promotor bacterial o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [Pat. de E.U. No. 4,551,433 que se incorpora por la referencia en la presente] . Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido de trp-lac comprendido del promotor trp y las secuencias lac operón que se regula por el represor lac [Amann et al., Gene (1983) 25:167; de Boer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (1983) 80:21]. Además, un promotor bacterial puede incluir promotores de origen natural de origen no bacterial que tienen la capacidad de enlazar ARN polimerasa bacterial e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacterial también puede acoplarse con una .ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotos . El sistema de ARN polimerasa de bacteriófago T7/promotor es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al., J. Mol. Biol. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (1985) 82:1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprender un promotor bacteriófago y una región operadora de E. coli (EP Pub. No. 267 851) . Además de la secuencia promotora funcional, también es útil un sitio eficiente de enlace de ribosoma para la expresión de genes externos en procariotos. En E. coli, el sitio de enlace de ribosoma se denomina la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos en la corriente ascendente del codón de inicio [Shine et al., Nature (1975) 254:34]. Se cree que la secuencia SD promueve el enlace de ARNm al ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo - 3' del ARNr de E. coli 16S [Steitz et al., "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA" , en Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) ] para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con un débil sitio de enlace de ribosoma [Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989] . El término "huésped bacterial" o "célula huésped bacterial" se refiere a un bacterial que puede ser o ha sido utilizado como recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped bacterial de origen que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula de origen puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento ADN genómico o total a la original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen que es suficientemente similar a la original para caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica para un polipéptido hlFN, se incluye en la progenie pretendida por esta definición. La selección de bacterias huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos hlFN es muy conocida por los de experiencia ordinaria en la técnica. Al seleccionar huéspedes bacteriales para la expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, inter alia, buena capacidad de formación de cuerpo de inclusión, baja actividad proteolítica y robustez general. Los huéspedes bacteriales se encuentran generalmente disponibles de una variedad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, el Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; y el American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . La fermentación industrial/farmacéutica utiliza generalmente un bacterial derivado de especies K (e.g., W3110) o de bacterias derivadas de especies B (e.g., BL21) . Estas especies son particularmente útiles debido a que sus parámetros de crecimiento son extremadamente bien conocidos y robustos. Además, estas especies son no patogénicas, lo cual es comercialmente importante por razones de seguridad y ambientales. En una modalidad de los métodos de la presente invención, el huésped E. coli es una especie de BL21. En otra modalidad de los métodos de la presente invención, el huésped E. coli es una especie proteasa menos incluyendo, pero sin limitarse a OMP- y LON- . En otra modalidad de los métodos de la presente invención, la especie de célula huésped es una especie de Pseudomonas, incluyendo, pero sin limitarse a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, y Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada la especie MB101, se encuentra disponible para - procesos terapéuticos de producción de proteína por The Dow Chemical Company como una especie huésped (Midland, MI disponible en la World Wide Web en dow.com) . Las Patentes de E.U. Nos. 4,755,465 y 4,859,600 que se incorporan en la presente, describen el uso de especies Pseudomonas como célula huésped para la producción de hGH. Una vez establecida la especie de célula huésped recombinante (i.e., que la estructura de expresión se ha introducido en la célula huésped y las células huésped con la estructura de expresión apropiada se aislan) , la especie de célula huésped recombinante se cultiva bajo condiciones apropiadas para la producción de polipéptidos hlFN. Como será aparente para el experto en la técnica, el método de cultivo de la especie de célula huésped recombinante será dependiente de la naturaleza de la estructura de expresión utilizada en la identidad de la célula huésped. Las especies huésped recombinantes se cultivan normalmente utilizando métodos muy conocidos en la técnica. las células huésped recombinantes se cultivan típicamente en un medio líquido conteniendo fuentes asimilables de carbono, nitrógeno, y sales inorgánicas, y opcionalmente, conteniendo vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento, y otros suplementos de cultivo proteináceos muy conocidos en la técnica. El medio líquido para el cultivo de células huésped pueden contener opcionalmente antibióticos o anti hongos para evitar el - crecimiento de microorganismos y/o compuestos indeseables incluyendo, pero sin limitarse a, antibióticos para seleccionar células huésped conteniendo el vector de expresión. Las células huésped recombinantes pueden cultivarse en formatos por lotes o continuos, ya sea con cosecha celular (en los casos en donde el polipéptido hlFN se acumula intracelularmente) o cosecha del cultivo sobrenadante ya sea en formatos por lotes o continuos . Para la producción en células huésped procarióticas, se prefiere el cultivo por lotes y la cosecha celular. Los polipéptidos hlFN de la presente invención se purifican normalmente después de la expresión en sistemas recombinantes. El polipéptido hlFN puede purificarse a partir de las células huésped mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Normalmente, los polipéptidos hlFN producidos en células huésped bacteriales son pobremente solubles o insolubles (en forma de cuerpos de inclusión) . En una modalidad de la presente invención, pueden realizarse fácilmente sustituciones de aminoácido en el polipéptido hlFN seleccionadas para el propósito de incrementar la solubilidad de la proteína producida de manera recombinante utilizando los métodos descritos en la presente así como los conocidos en la técnica. En el caso de proteína insoluble, la proteína puede colectarse de lisados de célula huésped mediante centrifugación y puede seguirse además por homogeneización de las células. En el caso de proteína pobremente soluble, pueden agregarse compuestos incluyendo, pero sin limitarse a, polietileno imina (PEÍ) para inducir la precipitación de proteína parcialmente soluble. La proteína precipitada puede colectarse entonces convenientemente por centrifugación. Las células huésped recombinantes pueden romperse u homogeneizares para liberar los cuerpos de inclusión de dentro de las células utilizando una variedad de métodos muy conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. El rompimiento u homogeneización de la célula huésped puede efectuarse utilizando técnicas muy conocidas incluyendo, pero sin limitarse a, rompimiento celular enzimático, homogeneización dounce, o rompimiento de liberación a alta presión. En una modalidad del método de la presente invención, se utiliza la técnica de liberación a alta presión para romper las células huésped de E . coli para liberar los cuerpos de inclusión de los polipéptidos hlFN. Se ha encontrado que los rendimientos de polipéptido hlFN insoluble en forma de cuerpos de inclusión puede aumentarse utilizando solo un paso de las células huésped de E. coli a través de homogeneizador. Al manejar los cuerpos de inclusión del polipéptido hlFN, es ventajoso minimizar el tiempo de homogeneización en repeticiones a fin de maximizar el rendimiento de los cuerpos de inclusión sin pérdida debida - a factores tales como solubilización, tensión mecánica o proteolisis . El polipéptido hlFN insoluble o precipitado puede entonces solubilizarse utilizando cualquiera de un número de agentes de solubilización adecuados conocidos en la técnica. Preferentemente, el polipéptido hlFN se solubiliza con urea o hidrocloruro de guanidina. El volumen del polipéptido BP hlFN solubilizado puede minimizarse de manera que pueden producirse grandes lotes utilizando tamaños de lote convenientemente manejables. Este factor puede ser significativo en el establecimiento comercial a gran escala en donde el huésped recombinante puede cultivarse en lotes de miles de litros en volumen. Además, cuando se fabrica el polipéptido hlFN en un establecimiento comercial a gran escala, en particular para usos farmacéutico humano, deben evitarse en lo posible los químicos dañinos que puedan dañar la maquinaria y el contenedor, o el producto mismo de proteína. Se ha demostrado en el método de la presente invención que puede utilizarse la urea agente de desnaturalización más suave para solubilizar los cuerpos de inclusión del polipéptido hlFN en lugar del agente de desnaturalización de hidrocloruro de guanidina más fuerte. El uso de urea reduce significativamente el riesgo de daño al equipo de acero inoxidable utilizado en los procesos de fabricación y purificación del polipéptido hlFN mientras que solubiliza eficientemente los cuerpos de inclusión del polipéptido hlFN. Cuando el polipéptido hlFN se produce como una proteína de fusión, se retira preferentemente la secuencia de fusión. El retiro de una secuencia de fusión puede lograrse mediante división enzimática o química, preferentemente mediante división enzimática. El retiro enzimático de las secuencias de fusión puede lograrse utilizando métodos muy conocidos por los técnicos . La selección de enzimas para el retiro de la secuencia de fusión se determinará por la identidad de la fusión, y las condiciones de reacción se especificarán por la selección de la enzima como será aparente para el experto en la técnica. El polipéptido hlFN dividido se purifica preferentemente a partir de la secuencia de fusión dividida mediante métodos muy conocidos . Tales métodos se determinarán por la identidad y propiedades de la secuencia de fusión y el polipéptido hlFN, como será aparente para el experto en la técnica. Los métodos para purificación pueden incluir, pero no se limitan a, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía o diálisis o cualquier combinación de las mismas . El polipéptido hlFN también se purifica preferentemente para retirar el ADN de la solución de proteína. El ADN puede retirarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como precipitación o cromatografía de intercambio de ion, pero preferentemente se retira por precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico, tal como, pero sin limitarse a, protamina sulfato. El polipéptido hlFN puede separarse del ADN precipitado utilizando métodos estándar muy conocidos incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugación o filtración. El retiro de moléculas huésped de ácido nucleico es un factor importante en una implementación en donde el polipéptido hlFN se va a utilizar para tratar humanos y los métodos de la presente invención reducen el ADN de célula huésped a niveles farmacéuticamente aceptables . También pueden utilizarse métodos para fermentación a pequeña escala o a gran escala en la expresión de proteína, incluyendo, pero sin limitarse a fermentadores, matraces de agitación, biorreactores de lecho fluido, biorreactores de fibra hueca, sistemas de cultivo en botella giratoria, y sistemas de biorreactor de tanque agitado. Cada uno de estos métodos puede efectuarse en proceso en modo por lotes, lote de alimentación o continuo. Los polipéptidos hlFN humanos de la invención pueden recuperarse generalmente utilizando métodos estándar en la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo o lisado celular puede centrifugarse o filtrarse para retirar el desecho celular. El sobrenadante puede concentrarse o diluirse a un volumen deseado o diafiltrarse en un amortiguador adecuado para condicionar la preparación para purificación adicional . La purificación adicional del polipéptido hlFN de la presente invención incluye la separación de formas deamidadas y sujetadas de la variante del polipéptido hlFN de la forma intacta. Cualquiera de los siguientes procedimientos ejemplares puede emplearse para purificación de los polipéptidos hlFN de la invención: cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de anión o catión (utilizando, incluyendo, pero sin limitarse a, SEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC en fase inversa; filtración en gel (utilizando, incluyendo, pero sin limitarse a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografí de quelado de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo, pero sin limitarse a, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo, pero sin limitarse a precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción. Las proteínas de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, anticuerpos para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, socios de enlace para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, etc., pueden purificarse ya sea parcialmente o sustancialmente a homogeneidad de acuerdo con procedimientos estándar conocidos y utilizados por los expertos en la técnica. por consiguiente, los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse por cualquier otro número de métodos muy conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción acida o de base, cromatografía de columna, cromatografía de columna de afinidad, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis de gel y lo similar. Pueden utilizarse etapas de repliegue de proteína, según se desee, para elaborar proteínas maduras correctamente plegadas .
Puede emplearse cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos adecuados en etapas de purificación finales en donde se desea una alta pureza. En una modalidad, se utilizan anticuerpos elaborados contra aminoácidos no naturales (o proteínas que comprenden aminoácidos no naturales) como reactivos de purificación, incluyendo pero sin limitarse a, purificación en base a afinidad de proteínas que comprenden uno o más aminoácidos no naturales. Una vez purificados, parcialmente o a - homogeneidad, según se desee, los polipéptidos se utilizan opcionalmente para una amplia variedad de utilidades, incluyendo, pero sin limitarse a, como componentes de análisis, reactivos terapéuticos, de profilaxis, diagnósticos de investigación y/o como inmunógenos para la producción de anticuerpos . Además de otras referencias anotadas en la presente, son muy conocidos en la técnica una variedad de métodos de purificación/plegado de proteínas, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos descritos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag N.Y. , (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al., (1996) Protein methods, 2a edición, Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal, (1990) , Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a edición Springer-Verlag, NY; Janson y Ryden, (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, segunda edición, Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) , Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, ?J; y las referencias citadas en las presentes . Una ventaja de producir una proteína o polipéptido de interés con un aminoácido no natural en una célula huésped eucariótica o en una célula huésped no eucariótica es que típicamente las proteínas o polipéptidos se plegarán en sus conformaciones naturales. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, los expertos en la técnica reconocerán que después de la síntesis, expresión y/o purificación, las proteínas pueden poseer una conformación diferente a las conformaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de la invención, la proteína expresada se desnaturaliza opcionalmente y después se renaturaliza. Esto se logra utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, agregando una chaperonina a la proteína o polipéptido de interés, solubilizando las proteínas en un agente caotrópico tal como HCl guanidina, utilizando disulfuro isomerasa, etc. En general, es ocasionalmente deseable desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y después ocasionar que los polipéptidos se replieguen en la conformación preferida. Por ejemplo, puede agregarse guanidina, urea, DTT, DTE, y/o chaperonina a un producto de translación de interés. Los métodos de reducción, desnaturalización y renaturalización son muy conocidos por los expertos en la técnica (ver, las referencias anteriores y - - Debinski, et al., (1993) J. Biol. Chem., 268:14065-14070; Kreitman y Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4:581-585; y Buchner et al., (1992) Anal. Biochem. 205:263-270). Debinski et al., por ejemplo, describe la desnaturalización y reducción de proteínas de cuerpo de inclusión en guanidina-DTE. Las proteínas pueden replegarse en un amortiguador de reducción conteniendo, incluyendo pero sin limitarse a, glutationa oxidada y L-arginina. Los reactivos de replegado pueden fluir o de otra manera moverse con el uno o más polipéptidos u otro producto de expresión, o viceversa. En el caso de la producción procariótica de polipéptido hlFN, el polipéptido hlFN así producido puede plegarse mal y entonces carece de o tiene una actividad biológica reducida. La bioactividad de la proteína puede restaurarse mediante el "repliegue". En general, el polipéptido hlFN mal plegado se repliega solubilizando (cuando el polipéptido hlFN es también insoluble) , desdoblando y reduciendo la cadena de polipéptido utilizando, por ejemplo, uno o más agentes caotrópicos (e.g. urea y/o guanidina) y un agente de reducción capaz de reducir enlaces disulfuro (e.g., ditiotreitol, DTT o 2-mercaptoetanoi, 2-ME) . A una concentración moderada de caotropo, se agrega entonces un agente oxidante (e.g., oxígeno, cistina o cistamina) , que permite la reformación de los enlaces disulfuro. El polipéptido hlFN puede replegarse utilizando métodos estándar - conocidos en la técnica, tales como los descritos en las Pat. de E.U. Nos. 4,511,502, 4,511,503 y 4,512,922 que se incorporan en la presente por la referencia. Después de replegar o co-plegar, el polipéptido hlFN se purifica adicionalmente preferentemente . Métodos Generales de Purificación. Cualquiera de una variedad de etapas de aislamiento puede llevarse a cabo en el lisado celular que comprende el polipéptido hlFN o en cualquier mezcla de polipéptido hlFN resultante de cualquier etapa de aislamiento incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración de gel, cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC"), HPLC en fase inversa, ("RP-HPLC"), absorción de lecho expandido, o cualquier combinación y/o repetición de las mismas y en cualquier orden apropiado. El equipo y otros materiales necesarios utilizados para realizar las técnicas descritas en la presente se encuentran comercialmente disponibles. Las bombas, colectores de fracción, monitores, registradores, y sistemas completos se encuentran disponibles, por ejemplo de Applied Biosystems (Foster City, CA) , Bio Rad Laboratories, Inc.
(Hercules, CA) , y Amersham Biosciences, Inc., (Piscataway, NJ) . También se encuentran disponibles de tales compañías materiales cromatográficos incluyendo, pero sin limitarse a, - materiales de matriz de intercambio, medios y amortiguadores. El equilibrio y otras etapas en los procesos de cromatografía de columna descritos en la presente tales como lavado y elución pueden lograrse más rápidamente utilizando equipo especializado tal como una bomba. Las bombas comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, bomba HILOAD® P-50, bomba Peristálica P-l, bomba P-901, y bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Ejemplos de colectores de fracción incluyen el colector de fracción RediFrac, colectores de fracción FRAC- 100 y FRAC-200, y el colector de fracción SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . También se encuentran disponibles mezcladores para formar gradientes de pH y concentración lineal. Los mezcladores comercialmente disponibles incluyen Gradient Mixer GM-1, y In-Line Mixers (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . El proceso cromatográfico puede monitorearse utilizando cualquier monitor comercialmente disponible. Tales monitores pueden utilizarse para conjuntar información tal como UV, pH, y conductividad. Ejemplos de detectores incluyen Monitor UV-1, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900, y Conductivity Monitor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . En realidad se encuentran disponibles comercialmente sistemas completos incluyendo los diversos sistemas AKTA® de American - - Biosciences (Piscataway, NJ) . En una modalidad de la presente invención, por ejemplo, el polipéptido hlFN puede reducirse y desnaturalizarse primero desnaturalizando el polipéptido hlF? purificado resultante en urea, seguido por dilución en amortiguador TRIS conteniendo un agente de reducción (tal como DTT) a un pH adecuado. En otra modalidad, el polipéptido hlF? se desnaturaliza en urea en un rango de concentración de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 9 M, seguido por dilución en amortiguador TRIS a un pH en el rango de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. La mezcla de replegado de esta modalidad puede entonces incubarse. En una modalidad, la mezcla de replegado se incuba a temperatura ambiente durante cuatro a veinticuatro horas. La mezcla reducida y desnaturalizada de polipéptido hlF? puede entonces aislarse o purificarse adicionalmente. Como se definió en la presente, el pH de la primera mezcla de polipéptido hlFN puede ajustarse previo a efectuar cualquier etapa de aislamiento subsecuente. Además, la primera mezcla de polipéptido hlFN o cualquier mezcla subsecuente del mismo puede concentrarse utilizando técnicas conocidas en la técnica. Además, el amortiguador de elución que comprende la primera mezcla de polipéptido hlFN o cualquier mezcla subsecuente de los mismos puede intercambiarse por un amortiguador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento utilizando técnicas muy conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Cromatografía de Intercambio de Ion. En una modalidad, y como una etapa adicional opcional, la cromatografía de intercambio de ion puede efectuarse en la primera mezcla de polipéptido hlFN. Ver, generalmente, Ion Exchange Chromatography: Principies and Methods (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) ) . Las columnas de intercambio de ion comercialmente disponibles incluyen columnas HITRAP®, HIPREP® y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Tales columnas utilizan fuertes intercambiadores de anión tales como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance, y Q S?PHAROSE® XL; fuertes intercambiadores de catión tales como SP SEPHAROSE® High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow, y SP SEPHAROSE® XL; débiles intercambiadores de anión tales como DEAE SEPHAROSE® Fast Flow, y débiles intercambiadores de catión tales como CM SEPHAROSE® Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La cromatografía de columna de intercambio de catión puede llevarse a cabo en el polipéptido hlFN en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar polipéptido hlFN sustancialmente aislado. La etapa de cromatografía de intercambio de catión puede llevarse a cabo utilizando cualquier matriz de intercambio de catión adecuada. Las matrices útiles de intercambio de catión, - - incluyen, pero no se limitan a materiales de matriz de intercambio de catión fibrosos, porosos, no porosos, microangulares, en perlas o reticulados. Tales materiales de matriz de intercambio de catión incluyen, pero no se limitan a, celulosa, agarosa, dextran, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice, poliéter o compuestos de cualquiera de los anteriores. Después de la absorción del polipéptido hlFN a la matriz de intercambio de catión, el polipéptido hlFN sustancialmente purificado puede eluirse poniendo en contacto la matriz con un amortiguador que tiene una resistencia pH o iónica suficientemente alta para desplazar el polipéptido hlFN de la matriz. Los amortiguadores adecuados para uso en alta elución del pH del polipéptido hlFN sustancialmente purificado incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES, y MES variando en concentración de al menos aproximadamente 5 mM a al menos aproximadamente 100 mM. Cromatografía en Fase Inversa. La RP-HPLC puede llevarse a cabo para purificar proteínas siguiendo protocolos adecuados conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica. Ver, e.g., Pearson et al., Anal. Biochem. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. Chirom. , (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. Chrom. , (1986) 359:391-402. La RP-HPLC puede llevarse a cabo en el polipéptido hlF? para aislar el polipéptido hlF? sustancialmente purificado. A este respecto, pueden utilizarse resinas derivatizadas de sílice con funcionalidades alquilo con una amplia variedad de longitudes, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C30, al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C20, o al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente CX8 resinas . Alternativamente, puede utilizarse una resina polimérica. Por ejemplo, puede utilizarse resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd, que es una resina de polímero de estireno. También pueden utilizarse resinas ciano o poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena alquilo. Además, la columna de RP-HPLC puede lavarse con un solvente tal como etanol. Puede utilizarse un amortiguador de elución adecuado conteniendo un agente de emparejamiento de ion y un modificador orgánico tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo o etanol, para eluir el polipéptido hlFN de la columna de RP-HPLC. Los agentes de emparejamiento de ion más comúnmente utilizados incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, tetrametilamonio, tetrabutilamonio, trietilamonio acetato. La elución puede llevarse a cabo utilizando uno o más gradientes o condiciones isocráticas, con las condiciones de gradiente preferidas para reducir el tiempo de separación y para disminuir la amplitud de pico. Otro método implica el uso de dos gradientes con diferentes rangos de concentración de solvente. Ejemplos de amortiguadores de elución adecuados para su uso en la presente pueden incluir, pero no se limitan a soluciones de acetato de amonio y acetonitrilo. Técnicas de Purificación de Cromatografía de Interacción Hidrófoba. La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) puede llevarse a cabo en el polipéptido hlFN. Ver generalmente, Hydrophobic Interaction Chromatography Handbook: Principies and Methods (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) que se incorpora en la presente por la referencia. Las matrices HIC adecuadas incluyen, pero no se limitan a, matrices alquilo o arilo sustituidas, tales como matrices butil, hexil, octil o fenil sustituidas incluyendo matrices de agarosa, agarosa reticulada, sefarosa, celulosa, sílice, dextran, poliestireno, poli (metacriltato) , y resinas de modo mezclado, incluyendo pero sin limitarse a, una resina de polietilenoamina o una matriz de poli (metacrilato) butil o fenil sustituida. Las fuentes comercialmente disponibles para cromatografía de columna de interacción incluyen pero no se limitan a columnas HITRAP®, HIPREP® y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Brevemente, previo a la carga, la columna HIC puede equilibrarse utilizando amortiguadores estándar conocidos por los de experiencia ordinaria en la técnica, tales como una solución de ácido acético/cloruro de sodio o HEPES conteniendo sulfato de amonio. Después de cargar el polipéptido hlFN, la columna puede entonces lavarse utilizando amortiguadores y condiciones estándar para retirar materiales no deseadas pero reteniendo el polipéptido hlFN en la columna HIC. El polipéptido hlFN puede eluirse con aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 volúmenes de columna de un amortiguador estándar, tal como un amortiguador HEPES conteniendo EDTA y una menor concentración de sulfato de amonio que el amortiguador de equilibrio, o un amortiguador de ácido acético/cloruro de sodio, entre otros. También puede utilizarse un gradiente se sal lineal de disminución, utilizando, por ejemplo un gradiente de fosfato de potasio para eluir las moléculas de hlFN . El eluyente puede entonces concentrarse, por ejemplo, mediante filtración tal como diafiltración o ultrafiltración. La diafiltración puede utilizarse para retirar la sal utilizada para eluir el polipéptido hlFN. Otras Técnicas de Purificación. Puede llevarse a cabo aún otra etapa de aislamiento utilizando, por ejemplo, filtración de gel (Gel Filtration: Principies and Methods (Cat. NO. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, ?J) que se incorpora por la referencia en la presente, HPLC, absorción de lecho expandido, ultrafiltración, diafiltración, liofilización y lo similar, en la primera mezcla de polipéptido hlFN o cualquier mezcla subsecuente del mismo, para retirar cualquier exceso de sales y para reemplazar el amortiguador con un amortiguador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento o incluso para la formulación del producto de droga final. El rendimiento del polipéptido hlFN, incluyendo polipéptido hlFN sustancialmente purificado, puede monitorearse en cada etapa descrita en la presente utilizando técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. tales técnicas también pueden utilizarse para lograr el rendimiento del polipéptido hlFN sustancialmente purificado después de la última etapa de aislamiento. Por ejemplo, el rendimiento del polipéptido hlFN puede monitorearse utilizando cualquiera de diversas columnas de cromatografía líquida en fase inversa a alta presión, que tienen una diversidad de longitudes de cadena alquilo tales como ciano RP-HPLC, CX8RP-HPLC, así como HPLC de intercambio de catión y HPLC de filtración de gel . La pureza puede determinarse utilizando técnicas estándar, tales como SDS-PAGE, o midiendo el polipéptido hlFN utilizando inmuno análisis Webster y ELISA. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos policlonales contra proteínas aisladas de fermentación negativa de levadura de control y de la recuperación de intercambio de catión. Los anticuerpos también pueden utilizarse para probar la presencia de proteínas contaminantes de célula huésped.
El material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste de grupos dietilaminoetilo (DEAE) que se encuentran enlazados de manera covalente a la superficie de perlas de Sepharose. El enlace del polipéptido hlFN a los grupos DEAE se encuentra mediado por interacciones iónicas . El acetonitrilo y el ácido trifluoroacético pasan a través de la columna sin ser retenidos. Después de que estas sustancias se han lavado, se retiran los rastros de impurezas lavando la columna con amortiguador de acetato a un pH bajo. Después la columna se lava con amortiguador de fosfato neutro y el polipéptido hlFN se eluye con un amortiguador con resistencia iónica aumentada. La columna se empaca con flujo rápido de DEAE Sepharose. El volumen de la columna se ajusta para asegurar la carga de polipéptido hlFN en el rango de 3-10 mg de polipéptido hlFN/ml de gel. La columna se lava con agua y amortiguador de equilibrio (sodio/fosfato de potasio) . Las fracciones depositadas del eluido de HPLC se cargan y la columna se lava con amortiguador de equilibrio. Después la columna se lava con amortiguador de lavado (amortiguador de acetato de sodio) seguido por lavado con amortiguador de equilibrio. Subsecuentemente, el polipéptido hlFN se eluye de la columna con amortiguador de elución (cloruro de sodio, sodio/fosfato de potasio) y se colecta en una sola fracción de acuerdo con el perfil de elución maestro. El eluido se la columna de DEAE Sepharose se ajusta a la conductividad especificada. La sustancia de droga resultante se filtra estéril en botellas Teflon y se almacena a -70 °C. Puede utilizarse una amplia variedad de métodos y procedimientos para lograr el rendimiento y pureza de una proteína hlFN de uno o más aminoácidos codificado no de manera natural, incluyendo pero sin limitarse a, el análisis Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE coloreado con plata, SDS-PAGE coloreado con coomassie, espectrometría de masa (incluyendo pero sin limitarse a, MALDI-TOF) y otros métodos para caracterizar proteínas conocidos por el experto en la técnica. Expresión en Sistemas Alternos Se han empleado diversas estrategias para introducir aminoácidos no naturales en proteínas en células huésped no recombinantes, células huésped mutagenizadas, o sistemas de célula libre. Estos sistemas también son adecuados para uso en la elaboración de polipéptidos hlFN de la presente invención. Los aminoácidos de derivatización con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr, dieron como resultado la conversión de lisina a N2-acetil-lisina. La síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales . Con el reciente desarrollo de ligación enzimática y ligación química natural de fragmentos de péptido, es posible elaborar proteínas más - grandes. Ver, e.g., P. E. Dawson y S. B. H. Kent, 7?nnu. Rev. Biochem., 69:923 (2000). Un método biosintético general in vitro en el cual se ha utilizado un ARNt supresor químicamente acilado con el aminoácido no natural se agrega a un extracto in vitro capaz de soportar biosíntesis de proteína, para incorporar específicamente al sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una variedad de proteínas virtualmente de cualquier tamaño. Ver, e.g., V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C. J. ?oren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general methods for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); y J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc . , 111:8013-8014 (1989). Se ha introducido un amplio rango de grupos funcionales en proteínas para estudios de estabilidad de proteínas, plegado de proteínas, mecanismo de enzima y transducción de señal . Un método in vivo, llamado incorporación de presión selectiva, se desarrolló para explotar la promiscuidad de sintetasas de tipo silvestre. Ver, e.g., ?. Budisa, C. Minks, S. Alefeider, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J. , 13:41 (1999) . Una especie auxotrópica e la cual se cambia la trayectoria metabólica relevante que suministra a la célula con un aminoácido natural particular, se cultiva en un medio mínimo conteniendo concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras se reprime la transcripción del gen objetivo. Al establecimiento de una fase estacionaria de crecimiento, el aminoácido natural se agota y se reemplaza con el análogo de aminoácido no natural, la inducción de la expresión de la proteína recombinante da como resultado la acumulación de una proteína conteniendo el análogo no natural. Por ejemplo, al utilizar esta estrategia, se han incorporado o, m, y p-fluorofenilalaninas en las proteínas y exhiben dos curvas características en el espectro UV que pueden identificarse fácilmente, ver, e.g., C. Minks, R. Huber, L. Moroder, y N. Budisa, Anal. Biochem. 284:29 (2000); se ha utilizado trifluorometionina para reemplazar metionina en la lisozima T4 bacteriófaga para estudiar su interacción con ligandos quitooligosacárido mediante 19F NMR, ver, e.g., H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry, 36:34°04 (1997); y se ha incorporado trifluoroleucina en lugar de leucina, dando como resultado un aumento en la estabilidad térmica y química de una proteína zíper de leucina. Ver, e.g., Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew., Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Además, se incorpora selenometionina y tellurometionina en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos X. Ver, e.g., W. A.
Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J. , 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B.
Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat. Sruct . Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J.
Kellermann y R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); y N.
Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T.
Neuefiend, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol., 270:615 (1997) . Los análogos de metionina con funcionalidades alqueno o alquino también se han incorporado eficientemente, permitiendo la modificación adicional de proteínas mediante medios químicos. Ver, e.g., J. C. M. van Hest y D. A.
Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L.
Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc . , 122:1282 (2000); y K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente de E.U. No. 6,586,207; Publicación de Patente de E.U. 2002/0042097, que se incorporan en la presente por la referencia. El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos de aminoácido no naturales por aminoacil-ARNt sintetasas, que, en general, requiere de alta selectividad para asegurar la fidelidad de la translación de proteínas.
Una manera de expandir el alcance de este método es relajar la especificidad del substrato de aminoacil-ARNt sintetasas, que se ha logrado en un número limitado de casos. Por ejemplo, el reemplazo de Ala294 por Gly en fenilalanil-ARNt sintetasa (PheRS) de Escherichia coli incrementa el tamaño de la bolsa de enlace del substrato y da como resultado la acilación de AR?tPhe por medio de p-Cl-fenilalanina (-C1-Phe). Ver, M. Ibba, P. Kast y H. Hennecke, Biochemistry., 33:7107 (1994). Una especie de Escherichia coli que alberga este PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Ver, e.g., M. Ibba y H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); y ?. Sharma, R. Furter, P. Kast y D. A. Tirrell FEBS Lett., 467:37 (2000). De manera similar, un punto de mutación Phel30Ser cercano al sitio de enlace de aminoácido de tirosil-ARNt sintetasa de Escherichia coli mostró permitir que la azatirosina se incorpore más eficientemente que la tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Solí y S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000). Otra estrategia para incorporar aminoácidos no natural en proteínas in vivo es modificar sintetasas que tienen mecanismos de corrección. Estas sintetasas no pueden discriminar y en consecuencia activar aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales cognado. Este error se corrige en un sitio separado, que desacila el aminoácido mal cargado del AR?t para mantener la fidelidad de la translación de proteínas. Si la actividad de - corrección de la sintetasa se desactiva, los análogos estructurales que se desactivan pueden escapar la función de edición e incorporarse. Este procedimiento se ha demostrado recientemente con la valil-7ARNt sintetasa (ValRS) . Ver, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. Marliere, Science, 292:501 (2001) . ValRS puede desaminoacilar ARNtVal con Cys, Thr, o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no cognado se hidrolizan subsecuentemente mediante el dominio de edición. Después de la mutagénesis aleatoria del cromosoma de Escherichia coli, se seleccionó una especia mutante de Escherichia coli que tiene una mutación en el sitio de edición ValRS . Este ValRS defectuoso en edición carga incorrectamente ARNtVal con Cys. Debido a que Abu se asemeja estéricamente a Cys (grupo -SH de Cys se reemplaza con -CH3 en Abu) , el ValRs mutante también incorpora Abu en proteína cuando esta especie mutante de Eschericha coli se cultiva en presencia de Abu. El análisis espectrométrico de masa muestra que aproximadamente 24% de las valinas se reemplazan por Abu en cada posición valina en la proteína natural. Los métodos de síntesis de fase sólida y semisintéticos también han permitido la síntesis de un número de proteínas conteniendo nuevos aminoácidos. Por ejemplo, ver las siguientes publicaciones y referencias citadas que son como sigue: Crick, F. J. C, Barrett, L. Brenner, S.
- Watts-Tobin, R. , General nature of the genetic code for proteins., Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K. Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein potency of an S-peptide fragment., J. Am. Chem., 88 (24) : 5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc. Chem. Res., 47-54 (1989); ?akatsuka, T. Sasaki, T. Kaiser, E.T., Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J. Am. Chem. Soc . , 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. , Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: Backbone engineered HIV protease, Science, 256 (5054) :221-225 (1992); Chaiken, I. M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit. Rev. Biochem., 11 (3) :255-301 (1981); Offord, R. E., Protein engineering by chemical means?, Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); y Jackson, D. Y., Burnier, J. Quan, C. Stanley, M. , Tom, J. , Wells, J. A., A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183) :243 (1994). La modificación química se ha utilizado para introducir una diversidad de cadenas laterales no naturales, incluyendo cofactores, marcas de giro y oligonucleótidos en proteínas in vivo. Ver, e.g., Corey, D. R. Schultz, P. G. , Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded - deoxyribonuclease, Science 238 (4832) : 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T. Lawrence D. S. Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu. Rev. Biochem. , 54:565-595 (1985); Kaiser, E. T. Lawrence, D. S., Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226 (4674) .-505-511 (1984); Neet, K. E. Nanci A, Koshland, D. E., Properties of thiol-subtilisin, K. Biol. Chem., 243 (24) : 6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. , A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin J. Am. Chem. Soc., 3153-3154 (1966); y, Pollac, S. J. , Nakayama, G. Schultz, P. G. , Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242 (4881) : 1038-1040 (1988) . Alternativamente, se han utilizado métodos biosintéticos que emplean ARNts aminoacilo químicamente modificados para incorporar diversas sondas biofísicas en proteínas sintetizadas in vitro. Ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas: Brunner, J., New Photolabeling and crosslinking methods, .Annu. Rev. Biochem., 62:483-514 (1993); y Krieg, U. C. Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Nati . Acad. Sci., 83 (22) :8604-8608 (1986) . Previamente, se ha mostrado que los aminoácidos no naturales pueden incorporarse específicamente en el sitio en proteínas in vitro mediante la adición de ARNts de supresión químicamente aminoacilados para reacciones de síntesis de proteína programadas con un gen conteniendo una mutación ámbar de no sentido. Al utilizar estos procedimientos, puede sustituirse un número de los veinte aminoácidos comunes con cercanos homólogos estructurales, -e.g., fluorofenilalanina para fenilalanina, utilizando especies auxotrópicas para un aminoácido particular. Ver, e.g., Noren C. J. Anthony-Cahill, Griffith, M. C, Schultz, P. G. , A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids intro proteins, Science, 244:182-188 (1989); M. W. Nowak et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G. , Dix, T. A., Chamberlin, A. R. Diala, E. S. Biosynthetic site-specific incorporation of a non natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, F., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J. Schultz, P. G. , Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); y Mendel, D. , Cornish, V. W. & Scultz, P. G. , Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 435-62 (1995). Por ejemplo, se preparó un ARNt supresor que reconoció el codón de paro UAG y se aminoaciló químicamente con un aminoácido no natural . Se utilizó mutagénisis convencional dirigida al sitio para introducir el codón de paro TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver, e.g., Sayers, J. R. , Schmidt, W. Eckstein, F., 5', 4' Endonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res., 16 (3) : 791-802 (1988) . Cuando el ARNt supresor acilado y el gen mutante se combinaron en un sistema de transcripción/translación in vitro, el aminoácido no natural se incorporó en respuesta al codón UAG el cual dio una proteína conteniendo ese aminoácido en la posición especificada. Los experimentos utilizando [3H] -Phe y los experimentos con ácidos a-hidroxi demostraron que solo el aminoácido deseado se incorpora en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora en ningún otro sitio en la proteína. Ver, e.g., Noren et al., supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6) :425-432 ; y Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. , Site-specific incorporation of novel backbone estructures into proteins, Science 255 (5041) : 197-200 (1992) . También se han utilizado técnicas de microinyección para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas. Ver, e.g., M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, ?. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty y H.
- A. Lester, Science, 268:439 (1995); y D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Se inyectó un oocito Xenopus con dos especies de ARN elaboradas in vitro; un ARNm que codifica para la proteína objetivo con un codón de paro UAG en la posición del aminoácido de interés y un AR?t ámbar supresor aminoacilado con el aminoácido no natural deseado. La maquinaria translacional del oocito inserta entonces el aminoácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido estudios in vivo de función de estructura de proteínas de membrana integrales, que generalmente no son dóciles para sistemas de expresión in vitro. Los ejemplos incluyen la incorporación de un aminoácido fluorescente en el receptor taquiquinina neuroquina 2 para medir distancias mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, ver, e.g., G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel y A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar residuos expuestos a la superficie en canales de ion, ver, e.g., J. P. Gallivan, H. A. Lester y D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1977); el uso de análogos de tirosina cargados para monitorear cambios de conformación en un canal de ion en tiempo real, ver, e.g., J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); y, el uso de - aminoácidos alfa hidroxi para cambiar las estructuras de canal de ion para analizar sus mecanismos de entrada. Ver, e.g., P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Cell 96:89 (1999); y T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz y J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001) . La capacidad para incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo, ofrece las ventajas de altos rendimientos de proteínas mutantes, facilidad técnica, el potencial para estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos . La capacidad para incluir aminoácidos no naturales con diversos tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades y otras propiedades en proteínas, puede extender grandemente nuestra capacidad para manipular racional y sistemáticamente las estructuras de proteínas, tanto para probar la función de las proteínas como para crear nuevas proteínas u organismos con nuevas propiedades. Sin embargo, el proceso es difícil, debido a la compleja naturaleza de las interacciones de ARNt-sintetasa que se requieren para lograr un alto grado de fidelidad en la translación de proteínas . En un intento para incorporar específicamente en el sitio para-F-Phe, se utiliza un par de levadura de ARNtPheCUA - ámbar supresor/f enilalanil-ARNt sintetasa en una especie Phe auxotrópica de Escherichia coli resistente a p-F-Phe. Ver e.g., R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998). También puede ser posible obtener la expresión de un polinucleótido hlF? de la presente invención utilizando un sistema de translación libre de células (in vitro) . En estos sistemas, que pueden incluir ya sea AR?m como patrón (translación in vitro) o AD? como patrón (transcripción y translación combinadas in vitro) , la síntesis in vitro se dirige por los ribosomas . Se ha aplicado un esfuerzo considerable a la investigación de sistemas de expresión de proteínas libres de células. Ver, e.g., Kim, D. M. y J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001); Kim, D-M, y J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542 (2000) ; Kim, D-M, y J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390 (2000) ; Kim, D-M, y J. R. Swartz Biotechnology and Bioengineering, 66 , 180-188 (1999) ; y Patnaik, R. y J. R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868 (1998) ,-Patente de E.U. ?o. 6,337,191; Publicación de Patente de E.U. ?o. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que se incorporan por la referencia en la presente. Otro procedimiento que puede aplicarse a la expresión de polipéptidos hlF? que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural, incluye la técnica de fusión de ARNm-polipéptido. Ver, e.g., R. Roberts y J. Szostak, Proc. Nati. Acad. Sci., (EUA) 94:12297-12302 (1997); A. Framkel et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). En este procedimiento, un patrón de ARNm enlazado a puromicina se traduce en péptido en el ribosoma. Si una o más moléculas de ARNt se ha modificado, los aminoácidos no naturales pueden incorporarse también al péptido. Después de haber leído el último codón de ARNm, la puromicina captura la terminación C del péptido. Si se encuentra que el conjugado de ARNm-péptido resultante tiene propiedades interesantes en un análisis in vitro, su identidad puede revelarse fácilmente a partir de la secuencia de ARNm. De esta manera, pueden seleccionarse bibliotecas de polipéptidos hlFN que comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural para identificar polipéptidos que tienen propiedades deseadas. Más recientemente, se han reportado translaciones de ribosoma in vitro con componentes purificados que permiten la síntesis de péptidos sustituidos con aminoácidos codificado no de manera natural. Ver, e.g., A Forster et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 100:6353 (2003) . IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos hlFN Pueden efectuarse diversas modificaciones a los polipéptidos de aminoácidos no naturales descritos en la presente utilizando las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente. Estas modificaciones incluyen la incorporación de funcionalidad adicional sobre el componente de aminoácido no natural del polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a, una marca; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietileno glicol; un fotorreticulador; un compuesto citotóxico; una droga; una marca de afinidad; una marca de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido de anti sentido; un ácido ribonucleico inhibidor; un biomaterial; una nanopartícula; una marca de giro; un fluoróforo; un residuo que contiene metal; un residuo radiactivo; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas; un residuo fotoencerrado; un residuo fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; un residuo que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente divisible; un grupo fotodivisible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado a carbono; un agente activo de reducción; un amino tioácido; un residuo Tóxico; un residuo isotópicamente marcado; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo de electrón denso; un grupo magnético; un grupo de intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una marca detectable; una molécula pequeña; o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable. Como ejemplo ilustrativo, no limitante de las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente, la siguiente descripción se enfocará en agregar los polímeros macromoleculares al polipéptido de aminoácido no natural con el entendimiento de que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la misma también son aplicables (con las modificaciones apropiadas, si es necesario y las cuales puede realizar el experto en la técnica con la presente descripción) para agregar otras funcionalidades, incluyendo pero sin limitarse a aquellas listadas anteriormente. Una amplia variedad de polímeros macromoleculares y otras moléculas pueden enlazarse a los polipéptidos hlFN de la presente invención para modular las propiedades biológicas del polipéptido hlFN, y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas a la molécula de hlFN . Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al polipéptido hlFN a través de un aminoácido codificado naturalmente, a través de un aminoácido codificado no de manera natural o cualquier sustituyente funcional de un aminoácido natural o no natural, o cualquier sustituyente o grupo funcional agregado a un aminoácido natural o no natural . La presente invención proporciona preparaciones sustancialmente homogéneas de conjugados de polímero:proteína. "Sustancialmente homogéneas" como se utiliza en la presente significa que se observa que las moléculas del conjugado de polímero :proteína son más grandes que la mitad de la proteína total. El conjugado de polímero :proteína tiene actividad biológica y las presentes preparaciones "sustancialmente homogéneas" de polipéptido hlFN PEGilado proporcionadas en la presente son aquellas que son suficientemente homogéneas para mostrar las ventajas de una preparación homogénea, e.g., fácil para aplicación clínica y en la predicción de farmacocinética de lote a lote. También puede elegirse la preparación de una mezcla de moléculas del conjugado de polímero :proteína, y la ventaja provista en la presente, es que puede seleccionarse la proporción de conjugado de mono polímero :proteína que va a incluirse en la mezcla. Por consiguiente, si se desea, puede prepararse una mezcla de varias proteínas con varios números de residuos de polímero unidos (i.e., di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar dichos conjugados con el conjugado de mono polímero:proteína preparado utilizando losa métodos de la presente invención, y tener una mezcla con una proporción determinada de conjugados de mono polímero :proteína. El polímero seleccionado puede ser soluble en agua de manera que la proteína a la cual se une no se precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Preferentemente, para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. La proporción de moléculas de polietileno glicol a moléculas de proteína variará, como también las concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima (en términos de eficiencia de reacción en que existe un mínimo exceso de proteína o polímero sin reactivar) puede determinarse por el peso molecular del polietileno glicol seleccionado y por el número de grupos reactivos disponibles. En cuanto se refiere al peso molecular, típicamente entre mayor sea el peso molecular del polímero, es menor el número de moléculas de polímero que pueden unirse a la proteína. De manera similar, debe tomarse en cuenta la ramificación del polímero cuando se optimizan estos parámetros. Generalmente, entre mayor sea el peso molecular (o más las ramificaciones) es mayor la relación de polímero:proteína. Como se utiliza en la presente, y contemplando los conjugados de PEG:polipéptido hlFN, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que da un incremento en hematocrito que proporciona beneficios al paciente . La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de un número de factores, incluyendo la condición física general del paciente y el caso de anemia subyacente.
Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de polipéptido hlFN para un paciente que sufre de falla renal crónica es de 50 a 150 unidades/kg tres veces por semana. La cantidad de polipéptido hlFN utilizada para terapia da una relación aceptable de incremento de hematocrito y mantiene el hematocrito a un nivel benéfico (comúnmente al menos aproximadamente 30% y típicamente en un rango de 30% a 36%) . Una cantidad terapéuticamente efectiva de la presente composición puede lograrse fácilmente por el experto en la técnica utilizando materiales y procedimientos públicamente disponibles . El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural incluyendo, pero sin limitarse a lineal, en tridente o ramificada. Típicamente, el polímero soluble en agua es un poli (alquileno glicol), tal como poli (etileno glicol) (PEG) , pero también pueden emplearse otros polímeros solubles en agua. A manera de ejemplo, se utiliza PEG para describir ciertas modalidades de esta invención. PEG es un polímero soluble en agua muy conocido que se encuentra comercialmente disponible, o puede prepararse mediante polimerización de abertura de anillo de etileno glicol de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3 páginas 138-161) . El término "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietileno glicol, sin tener en cuenta el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y puede representarse enlazado al polipéptido hlFN mediante la fórmula: XO- (CH2CH20)n-CH2CH2-Y en donde n es 2 a 10,000 y X es H o una modificación de terminación, incluyendo pero sin limitarse a, alquilo Cx_4. En algunos casos, un PEG utilizado en la invención termina en un extremo con hidroxi o metoxi, i.e., X es H o CH3 ("PEG metoxi") . Alternativamente, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando así un polímero bifuncional.
Los grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos " grupos reactivos que se utilizan comúnmente para reaccionar con los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo, pero sin limitarse a, grupos maleimido, carbonatos activados (incluyendo pero sin limitarse a, p-nitrofenil éster) , esteres activados (incluyendo, pero sin limitarse a N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenil éster) y aldehidos) , así como grupos funcionales inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con los grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos codificado no de manera natural (incluyendo pero sin limitarse a grupos azido, grupos alquino) . Se anota que el otro extremo del PEG, que se muestra en la fórmula anterior como Y, se unirá directamente o indirectamente a un polipéptido hlFN a través de un aminoácido de origen natural o codificado no de manera natural. Por ejemplo, Y puede ser un enlace amida, carbamato o urea para un grupo amina (incluyendo pero sin limitarse a, la amina epsilon de lisina o la terminación N) del polipéptido. Alternativamente, Y puede ser un enlace maleimida para un grupo tiol (incluyendo pero sin limitarse a, el grupo tiol de cisteína) . Alternativamente Y puede ser un enlace para un residuo no comúnmente accesible a través de los 20 aminoácidos comunes. Por ejemplo, un grupo azido en el PEG puede reactivarse con un grupo alquino del polipéptido hlFN para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2] . Alternativamente, un grupo alquilo en el PEG puede reactivarse con un grupo azido presente en un aminoácido codificado no de manera natural para formar un grupo similar. En algunas modalidades, puede reactivarse un fuerte nucleófilo (incluyendo pero sin limitarse a hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) con un grupo aldehido o cetona presente en un aminoácido codificado no de manera natural para formar una hidrazona, oxima o semicarbazona, según sea aplicable, que en algunos casos puede reducirse además mediante tratamiento con un agente de reducción apropiado. Alternativamente, el fuerte nucleófilo puede incorporarse en el polipéptido hlFN a través de un aminoácido codificado no de manera natural y utilizarse para reaccionar preferentemente con un grupo cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua.
Puede utilizarse cualquier masa molecular para un PEG según se desee prácticamente, incluyendo pero sin limitarse a, de aproximadamente 100 Daltons (Da) a 100,000 Da o más según se desee (incluyendo pero sin limitarse a, algunas veces 0.1-5 kDa o 10.40 kDa). También pueden utilizarse PEGs de cadena ramificada, incluyendo pero sin limitarse a, moléculas PEG teniendo cada una un MW fluctuando de 1-100 kDa (incluyendo pero sin limitarse a, 1-50 kDa o 5-20 kDa) . Se describe un amplio rango de moléculas en, incluyendo pero sin limitarse a, el catálogo Shearwater Polymers Inc., catálogo Nektar Therapeutics, incorporados en la presente por la referencia. Generalmente, se encuentra disponible al menos una terminación de la molécula PEG para la reacción con el aminoácido codificado no de manera natural. Por ejemplo, los derivados PEG que contienen residuos alquino y azido para la reacción con cadenas laterales de aminoácido pueden utilizarse para unir PEG a los aminoácidos codificado no de manera natural descritos en la presente. Si el aminoácido codificado no de manera natural comprende un azido, entonces el PEG contendrá típicamente ya sea un residuo alquino para efectuar la formación del producto [3+2] de cicloadición o una especie activada por PEG (i.e., éster, carbonato) que contiene un grupo fosfina para efectuar la formación del enlace amida. Alternativamente, si el aminoácido codificado no de manera natural comprende un alquino, entonces el PEG contendrá típicamente un residuo azida para efectuar la formación del producto de cicloadición [3+2] Huisgen. Si el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo, el PEG comprenderá típicamente un potente nucleófilo (incluyendo pero sin limitarse a, una funcionalidad hidrazida, hidrazina, hidroxilamina o semicarbazida) a fin de efectuar la formación de los enlaces hidrazona, oxima y semicarbazona correspondientes, respectivamente. En otras alternativas, puede utilizarse una reversa de la orientación de los grupos reactivos antes descritos, i.e., un residuo azida en el aminoácido codificado no de manera natural, puede reactivarse con un derivado PEG conteniendo un alquino. En algunas modalidades, la variante de polipéptido hlFN con un derivado PEG contiene una funcionalidad química reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido codificado no de manera natural. La invención proporciona en algunas modalidades, derivados de polímero conteniendo azida y acetileno que comprenden una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da. La estructura de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli (etileno glicol) . Sin embargo, debe entenderse que también son adecuados para uso - en la presente invención una amplia variedad de polímeros solubles en agua incluyendo pero sin limitarse a poli (etileno glicol) y otros polímeros relacionados, incluyendo poli (dextran) y poli (propileno glicol), y que el uso del término PEG o poli (etileno glicol) pretende abarcar e incluir todas esas moléculas. El término PEG incluye, pero no se limita a poli (etileno glicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG de brazos múltiples, PEG derivatizado, PEG en tridente, PEG ramificado, PEG pendiente (i.e., PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales pendientes de la estructura de polímero) o PEG con enlaces degradables en el mismo. El PEG es típicamente claro, incoloro, inodoro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora, y generalmente no tóxico. Se considera que el poli (etileno glicol) es biocompatible, es decir que el PEG es capaz de coexistir con tejidos u organismos vivos sin ocasionar daños. Más específicamente, PEG es sustancialmente no inmunogénico, es decir que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en e 1 cuerpo . Al unirse a una molécula que tiene una función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune de manera que el organismo puede tolerar la presencia del agente. Los - conjugados PEG tienden a no producir ninguna respuesta inmune sustancial u ocasionar recubrimiento u otros efectos indeseables. El PEG que tiene la fórmula - -CH2CH20— (CH2CH20) n—CH2CH-- , en donde n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4000, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, es adecuado para su uso en la presente invención. El PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da es en. algunas modalidades de la presente invención, particularmente útil como la estructura de polímero. La estructura de polímero puede ser lineal o ramificada. Se conocen generalmente en la técnica estructuras de polímero ramificadas. Típicamente, un polímero ramificado tiene un residuo núcleo de rama central y una pluralidad de cadenas de polímero lineales enlazadas al núcleo de rama central. El PEG se utiliza comúnmente en formas ramificadas que pueden prepararse mediante adición de óxido de etileno a varios polioles, tales como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. El residuo de rama central también puede derivarse de diversos aminoácidos Tales como lisina. El poli (etileno glicol) ramificado puede representarse en forma general como R(-PEG-OH)m en el cual R se deriva de un residuo núcleo, tal como glicerol, oligómeros de glicerol, o pentaeritritol, y m representa el número de brazos . Las moléculas PEG de brazos múltiples, tales como las descritas en las Patentes de E.U. Nos. 5,932,462, 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; Solicitud de Pat. de E.U. 2003/0143596; WO 96/21469; y WO 93/21259; cada una de las cuales se incorpora por la referencia en la presente en su totalidad, también pueden utilizarse como la estructura de polímero. El PEG ramificado también puede encontrarse en forma de un PEG en tridente representado por PEG (--YCHZ2) n, en donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo de terminación activado enlazado a CH por medio de una cadena de átomos de longitud definida . Aún en otra forma ramificada, el PEG pendiente tiene grupos reactivos tales como carboxil, conjuntamente con la estructura PEG en lugar de al final de las cadenas PEG. Además de estas formas de PEG, el polímero también puede prepararse con enlaces débiles o degradables en la estructura. Por ejemplo PEG puede prepararse con enlaces éster en la estructura del polímero, que se someten a hidrólisis. Como se mostró abajo, esta hidrólisis da como resultado la división del polímero en fragmentos de menor peso molecular: -PEG-C02-PEG-+H20 ? PEG-C02H+HO-PEG- Los expertos en la técnica entienden que el término poli (etileno glicol) o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la técnica incluyendo pero sin limitarse a aquellas descritas en la presente. Muchos otros polímeros son también adecuados para su uso en la presente invención. En algunas modalidades, las estructuras de polímero que son solubles en agua, con de 2 a aproximadamente 300 terminaciones, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquileno glicoles), tales como poli (propileno glicol) ("PPG"), sus copolímeros (incluyendo pero sin limitarse a copolímeros de etileno glicol y propileno glicol) , sus terpolímeros, sus mezclas y lo similar. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura de polímero puede variar, se encuentra típicamente en el rango de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, frecuentemente de aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la lista anterior para estructuras sustancialmente solubles en agua no es en modo alguno exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades antes descritas se contemplan como adecuadas para su uso en la presente invención. En algunas modalidades de la presente invención, los derivados de polímero son "multi-funcionales" , es decir que la estructura de polímero tiene al menos dos - - terminaciones, y posiblemente tantas como aproximadamente 300 terminaciones, funcionalizadas o activadas con un grupo funcional. Los derivados multifuncionales de polímero incluyen, pero no se limitan a, polímeros lineales que tienen dos terminaciones, siendo enlazada cada terminación a un grupo funcional que puede ser el mismo o diferente. En una modalidad, el derivado de polímero tiene la estructura : X-A-POLI-B-N=N=N en donde : N=N=N es un residuo azida; B es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente; POLY es un polímero soluble en agua no antigénico; A es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional . Ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquil múltiplemente funcionalizado que contiene hasta 18, y más preferentemente entre 1-10 átomos de carbono. Puede incluirse un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre con la cadena alquil.
La cadena alquil también puede ramificarse en un heteroátomo.
Otros ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo aril múltiplemente funcionalizado, conteniendo hasta 10 y más preferentemente 5-6 átomos de carbono. El grupo aril puede sustituirse con uno o más átomos de carbono, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace adecuados incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,932,462; 5,643,575; y Publicación de Solicitud de Pat. de E.U. 2003/0143596, cada una de las cuales se incorpora por la referencia en la presente . Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la lista anterior de residuos de enlace no es en modo alguno exhaustiva y es meramente ilustrativa. Y que todos los residuos de enlace que tienen las cualidades antes descritas se contemplan como adecuados para su uso en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales adecuados para su uso como X incluyen, pero no se limitan a hidroxil, hidroxil protegido, alcoxil, éster activo, tal como esteres N-hidroxisuccinimidil y esteres 1-benzotriazolil, carbonato activo, tal como carbonatos N-hidroxisuccinimidil y carbonatos 1-benzotriazolil, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, -hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimido, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxalos, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona y azida. Como lo entienden los expertos en la técnica, el residuo X seleccionado debe ser compatible con el grupo azida de manera que no ocurra la reacción con el grupo azida. Los derivados de polímero que contienen azida pueden ser homobifuncionales, es decir que el segundo grupo funcional (i.e., X) es también un residuo azida, o heterobifuncionales, es decir que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. El término "protegido" se refiere a la presencia de un grupo de protección o residuo que evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo de protección variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo de protección puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonil (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo de protección puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o propiónico, o un grupo hidroxil, el grupo de protección puede ser un grupo bencil o alquil tal como metil o ter-butil. También pueden utilizarse en la presente invención otros grupos de protección conocidos en la técnica.
Ejemplos específicos de grupos funcionales terminales en la literatura incluyen, pero no se limitan a, carbonato N-succinimidil (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,281,698, 5,468,478), amino (ver, e.g., Buckmann et al., Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky et al., Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Ver, e.g., 7Andresz et al., Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionato y succinimidil butanoato (ver, e.g., Olson et al., en Poly (ethilene glicol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS., Washington D.C., 1997; ver también Pat. de E.U. No. 5,672,662) succinimidil succinato (Ver, e.g., Abuchowski et al., Cáncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) y Joppich et al., Macrolol . Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (ver, e.g., Pat. de E.U. No. 4,670,417), carbonato de benzotriazolo (ver, e.g., Pat. de E.U. No. 5,650,234), glicidil éter (ver, e.g., Pitha et al., Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech, Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (ver, e.g., Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al-, J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), carbonato p-nitrofenil (ver, e.g., Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (ver, e.g., Harris et al., J. Polym. Sci. Chem. Ed., 22:341 (1984), Pat. de E.U. : ?o. 5,824,784, Pat. de E.U. ?o. 5,252,714), maleimido (ver, e.g., Goodson et al., Bio/Technology 8:343 (1990); Romani et al., en Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (ver, e.g., Woghiren, et al., Bioconj . Chem. 4:314 (1993)), acrilol (ver, e.g., Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver, e.g., Pat. de E.U. No. 5,900,461). Todas las referencias y patentes anteriores se incorporan en la presente por la referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2-N=N=N en donde : X es un grupo funcional como se describió anteriormente; y n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000. En otra modalidad, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura de polímero que tiene la estructura : X-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-0-)CH2)m-W-N=N=N en donde : W es un residuo enlazador alifático o aromático que comprende entre 1-10 átomos de carbono; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y X es un grupo funcional como se describió anteriormente. m es entre 1 y 10.
Los derivados PEG que contienen azida de la invención pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente . En un método, mostrado abajo, una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura de polímero que tiene una primera terminación enlazada a un primer grupo funcional y una segunda terminación enlazada a un grupo de partida adecuado, se reactivan con un anión azida (que puede emparejare con cualquiera de un número de contra iones adecuados, incluyendo sodio, potasio, ter-butilamonio etc.) . El grupo de partida experimenta un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por el residuo azida, produciendo el polímero PEG deseado que contiene azida. X-PEG-L + N3 ? X-PEG-Ns Como se muestra, una estructura de polímero adecuada para su uso en la presente invención tiene la fórmula X-PEG-L, en donde PEG es poli (etileno glicol) y X es un grupo funcional que no reacciona con los grupos azida y L es un grupo de partida adecuado. Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidroxil, hidroxil protegido, acetal, alquenil, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimido, ditiopiridina y vinilpiridina y cetona. Ejemplos de grupos de partida adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato y tosilato. En otro método de preparación de los derivados de polímero que contienen azida de la presente invención, se pone en contacto un agente de enlace que contiene una funcionalidad azida con una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, en donde el agente de enlace contiene una funcionalidad química que se reactivará selectivamente con una funcionalidad química en el polímero PEG, para formar un producto derivado de polímero que contiene azida en donde la azida se separa de la estructura de polímero mediante un grupo de enlace. Se muestra abajo un esquema de reacción ejemplar: X-PEG-M+N-enlazador-N=N=N ? PG-X-PEG-enlazador-N=N=N en donde : PEG es poli (etileno glicol) y X es un grupo tapado tal como alcoxi o un grupo funcional como se describió anteriormente ; y M es un grupo funcional que no es reactivo con la funcionalidad azida pero que reaccionará eficiente y selectivamente con el grupo N funcional . Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, M siendo un ácido carboxílico, carbonato o éster activo si N es una amina; M siendo una cetona si N es un residuo hidrazida o aminooxi; M siendo un grupo de partida si N es un nucleófilo. La purificación del producto crudo puede lograrse mediante métodos conocidos incluyendo, pero sin limitarse a precipitación del producto seguida por cromatografía, si es necesario. Se muestra abajo un ejemplo más específico en el caso de diamina PEG, en el cual una de las aminas se encuentra protegida por un residuo de grupo protector tal como ter-butil-Boc y la diamina PEG mono protegida resultante se reactiva con un residuo de enlace que contiene la funcionalidad azida: BocHN-PEG-NH2 + H02C- (CH2)3-N=N=N En este ejemplo, el grupo amina puede encontrarse acoplado al grupo de ácido carboxílico utilizando una variedad de agentes de activación tales como reactivos tionil cloruro o carbodiimida y N-hidroxisuccinimida o N-hidroxibenzotriazolo para crear un enlace amida entre el derivado PEG monoamina y el residuo de enlazador que contiene azida. Después de la formación exitosa del enlace amida, puede utilizarse directamente el derivado N-ter-butil-Boc-protegido que contiene azida para modificar las moléculas bioactivas o puede elaborarse adicionalmente para instalar otros grupos funcionales útiles. Por ejemplo, el grupo ?-t-Boc puede hidrolizarse mediante tratamiento con un fuerte ácido para generar una omega-amino-PEG-azida. La amina resultante puede utilizarse como un asa sintética para instalar otra funcionalidad útil tal como grupos maleimida, disulfuros activados, esteres activados etc., para la creación de valiosos reactivos heterobifuncionales. Los derivados heterobifuncionales son particularmente útiles cuando se desea unir diferentes moléculas a cada terminación del polímero. Por ejemplo, el PEG omega-N-amino-N-azido permitiría la unión de una molécula que tiene un grupo electrofílico activado, tal como un aldehido, cetona, éster activado, carbonato activado, etc., a una terminación del PEG y una molécula que tiene un grupo acetileno a la otra terminación del PEG. En otra modalidad de la invención, el derivado de polímero tiene la estructura: X-A-POLY-B-C=C-R en donde : R puede ser ya sea H o un grupo alquil, alqueno, alquiloxi, o aril o aril sustituido; B es un residuo de enlace, que puede encontrarse presente o ausente; POLY es un polímero no antigénico soluble en agua; A es un residuo de enlace que puede encontrarse presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional .
Ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquil múltiplemente funcionalizado conteniendo hasta 18, y más preferentemente entre 1-10 átomos de carbono. Puede incluirse un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre con la cadena alquil. La cadena alquil también puede ramificarse en un heteroátomo. Otros ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo aril múltiplemente funcionalizado, conteniendo hasta 10 y más preferentemente 5-6 átomos de carbono. El grupo arilo puede sustituirse con uno o más átomos de carbono, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace adecuados incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,932,462 y 5,643,575 y la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U. 2003/0143596, cada una de las cuales se incorpora por la referencia en la presente. Los de experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que la lista anterior para residuos de enlace no es en modo alguno exhaustiva y pretende ser meramente ilustrativa, y que se contemplan como útiles en la presente invención una amplia variedad de residuos de enlace que tienen las cualidades descritas anteriormente. Ejemplos de grupos funcionales adecuados para su uso como X incluyen hidroxil, hidroxil protegido, alcoxil, éster activo, tal como esteres N-hidroxisuccinimidil y - esteres 1-benzotriazolil, carbonato activo, tal como carbonatos N-hidroxisuccinimidil, y carbonatos 1-benzotriazolil, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxalos, dionas, mesilatos, tosilatos, y tresilato, alqueno, cetona, y acetileno. Como se entenderá, el residuo X seleccionado será compatible con el grupo acetileno de manera que la reacción con el grupo acetileno no ocurra. Los derivados de polímero que contienen acetileno pueden ser homobifuncionales, es decir que el segundo grupo funcional (i.e., X) es también un residuo acetileno, o heterobifuncionales, es decir que el segundo grupo funcional es un grupo diferente. En otra modalidad de la presente invención, los derivados de polímero comprenden una estructura de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20-(CH2CH20) n-CH2CH2-0- (CH2)m-C=CH en donde : X es un grupo funcional como se describió anteriormente; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y m es entre 1 y 10.
Se muestran abajo ejemplos específicos de cada uno de los polímeros PEG heterobifuncionales. Los derivados PEG que contienen acetileno de la invención pueden prepararse utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica y/o descritos en la presente . En un método, una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura de polímero que tiene una primera terminación enlazada a un primer grupo funcional y una segunda terminación enlazada a un grupo nucleofílico adecuado, se reactivan con un compuesto que contiene tanto una funcionalidad acetileno como un grupo de partida adecuado para la reacción con el grupo nucleofílico en el PEG. Cuando el polímero que contiene el residuo nucleofílico y la molécula que contiene el grupo de partida se combinan, el grupo de partida experimenta un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por el residuo nucleofílico, produciendo el polímero deseado que contiene acetileno. X-PEG-Nu + L-A-C ? X-PEG-Nu-A-C=CR' Como se muestra, una estructura de polímero preferida para su uso en la reacción tiene la fórmula X-PEG-Nu, en donde PEG es poli (etileno glicol) , Un es un residuo nucleofílico y X es un grupo funcional que no reacciona con Nu, L o la funcionalidad acetileno.
Ejemplos de Nu incluyen, pero no se limitan a grupos amina, alcoxi, ariloxi, sulfhidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, aminoxi, que reaccionarían principalmente a través de un mecanismo tipo SN2. Ejemplos adicionales de grupos Nu incluyen aquellos grupos funcionales que reaccionarían a través de una reacción de adición nucleofílica. Ejemplos de grupos L incluyen cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato, y tosilato y otros grupos que se espera que experimenten desplazamiento nucleofílico así como cetonas, aldehidos, tioésteres, olefinas, grupos carbonil alfa-beta insaturados, carbonatos y otros grupos electrofílicos que se espera que experimenten adición por nucleófilos. En otra modalidad de la presente invención, A es un enlazador alifático de entre 1-10 átomos de carbono o un anillo aril sustituido de entre 6-14 átomos de carbono. X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo de partida adecuado. En otro método para la preparación de derivados de polímero que contienen acetileno de la invención, un polímero PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, que contiene ya sea un grupo funcional protegido o un agente tapado en una terminación y un grupo de partida adecuado en la otra terminación se ponen en contacto por un anión acetileno.
Se muestra abajo un esquema de reacción ejemplar: X-PEG-L+-C=CR' ? X-PEG-C=CR' en donde : PEG es poli (etileno glicol) y X es un grupo tapado tal como alcoxi o un grupo funcional como se describió anteriormente; Y R' es ya sea H, un grupo alquil, alcoxi, aril o ariloxi o un grupo alquil sustituido, alcoxil, aril o ariloxi. En el ejemplo anterior, el grupo de partida L debe ser suficientemente reactivo para experimentar desplazamiento tipo SN2 cuando se pone en contacto con una concentración suficiente del anión acetileno. Se conocen en la técnica las condiciones de reacción requeridas para lograr el desplazamiento SN2 de los grupos de partida mediante aniones acetileno. La purificación del producto crudo puede lograrse comúnmente mediante métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación del producto seguido por cromatografía, si es necesario. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse a los polipéptidos hlFN de la invención. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse a través de un aminoácido codificado no de manera natural incorporado en el polipéptido hlFN o cualquier grupo funcional o sustituyente de un aminoácido codificado no de manera natural o naturalmente codificado, o cualquier grupo funcional o sustituyente agregado a un aminoácido codificado no de manera natural o naturalmente codificado. Alternativamente, los polímeros solubles en agua se encuentran enlazados a un polipéptido hlFN que incorpora un aminoácido codificado no de manera natural a través de un aminoácido de origen natural (incluyendo pero sin limitarse a, el grupo cisteína, lisina o amina del residuo de terminación N) . en algunos casos, los polipéptidos hlFN de la invención comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos no naturales, en donde uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se encuentran enlazados a polímeros solubles en agua (incluyendo pero sin limitarse a, PEG y/o oligosacáridos) . En algunos casos, los polipéptidos hlFN de la invención comprenden además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos naturalmente codificados enlazados a polímeros solubles en agua. En algunos casos, los polipéptidos hlFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural enlazados a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos de origen natural enlazados a polímeros solubles en agua. En algunas modalidades, los polímeros solubles en agua utilizados en la presente invención aumentan la vida media en suero del polipéptido hlFN en relación a la forma conjugada . El número de polímeros solubles en agua enlazados a un polipéptido hlFN (i.e., la cantidad de PEGilación o glicosilación) de la presente invención puede ajustarse para proporcionar una característica alterada (incluyendo pero sin limitarse a, incrementada o disminuida) farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica tal como la vida media in vivo. En algunas modalidades, la vida media del hlFN aumenta al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces sobre un polipéptido no modificado. Derivados de PEG conteniendo un fuere grupo nucleofílico (i.e., hidrazina, hidroxilamina, o semicarbazida). En una modalidad de la presente invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que contiene carbonilo, se modifica con un derivado PEG que contiene un residuo de terminación hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida que se encuentra directamente enlazado a la estructura PEG. En algunas modalidades, el derivado PEG de terminación hidroxilamina tendrá la estructura: RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio se encuentra entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, el derivado PEG conteniendo hidrazina o hidrazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-X-NH-NH2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonil (C=0) que puede encontrarse presente o ausente. En algunas modalidades, el derivado PEG conteniendo semicarbazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido conteniendo carbonilo se modifica con un derivado PEG que contiene un residuo de terminación hidroxilamina, hidrazida, hidrazina o semicarbazida que se encuentra enlazado a la estructura PEG por medio de un enlace amida. En algunas modalidades, los derivados PEG de terminación hidroxilamina tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-?H-C(0) (CH2)m-0-?H2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio se encuentra entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, los derivados PEG conteniendo hidrazina o hidrazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-?H-C(0) (CH2) m-X-?H-?H2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonil (C=0) que puede encontrarse presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados PEG conteniendo semicarbazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0) (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido conteniendo carbonil se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene un residuo de terminación hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida, teniendo cada cadena del PEG ramificado un MW fluctuando de 10-40 kDa y, más preferentemente, de 5-20 kDa. En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural se modifica con un derivado PEG que tiene una estructura ramificada. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG de terminación hidrazina o hidrazida tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonil (C=0) que puede encontrarse presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados PEG conteniendo un grupo semicarbazida tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) -C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-NH-C (O) -?H-NH2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), X es opcionalmente ?H, 0, S, C (P) o no presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. En algunas modalidades, los derivados PEG conteniendo un grupo hidroxilamina tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2) 2-C (O) -?H-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2)m-0-?H2 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), X es opcionalmente ?H, O, S, C(O) o no presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. El grado y sitios en los cuales el (los) polímero (s) soluble (s) en agua se encuentra (n) enlazado (s) al polipéptido hlF? pueden modular el enlace del polipéptido al receptor del polipéptido hlFN en el Sitio 1. En algunas modalidades, los enlaces se encuentran dispuestos de tal manera que el polipéptido hlF? se enlaza al receptor del polipéptido hlF? en el Sitio 1 con un Kd de aproximadamente 400 nM o menor, con un Kd de 150 nM o menor, y en algunos casos con un Kd de 100 nM o menor, medido por un análisis de enlace de equilibrio, tal como se describe en Spencer et al., J. Biol. Chem, 263:7862-7867 para hGH. Los métodos y química para la activación de polímeros así como para conjugación de péptidos se describen en la literatura y se conocen en la técnica. Los métodos comúnmente utilizados para la activación de polímeros incluyen, pero no se limitan a, activación de grupos funcionales con bromuro cianógeno, periodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, sulfonil haluros, triclorotriazina, etc. (Ver, R. F. Taylor, (1991) , Protein Immobilisation, Fundamental and Applications, Marcel Dekker, N.Y. ; S.S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y. ; Dunn, R. L. et al., Eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991) . Se encuentran disponibles diversas revisiones y monografías de la funcionalización y conjugación de PEG.
Ver, por ejemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys., C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol., 14:866-874 (1992); Delgado et al . , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995) . Los métodos para la activación de polímeros también pueden encontrarse en la WO 94/17039, Pat. de E.U. No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. de E.U. No. 5,219,564, Pat. de E.U. No, 5,122,614, WO 90/13540, Pat. de - E.U. No. 5,281,698 y WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y enzimas incluyendo pero sin limitarse a Factor de Coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027), molécula portadora de oxígeno (Pat. de E.U. No. 4,412,989), ribonucleasa y superóxido dismutasa (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11:141-45 (1985)). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente. La PEGilación (i.e., adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos hlFN conteniendo un aminoácido codificado no de manera natural, tal como p-azido-L-fenilalanina, se lleva a cabo mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, el polipéptido hlFN se PEGila con un derivado mPEG terminado en alquino. Brevemente, se agrega un exceso de mPEG (5000) -0-CH2-C=CH sólido con agitación, a una solución de polipéptido hlFN conteniendo p-azido-L-Phe a temperatura ambiente. Típicamente, la solución acuosa se amortigua con un amortiguador que tiene un pKa cercano al pH al cual va a llevarse a cabo la reacción (generalmente aproximadamente pH 4-10) . Ejemplos de amortiguadores adecuados para PEGilación a un pH 7.5, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS y TES. El pH se monitorea y se ajusta continuamente si es necesario. La reacción típicamente se deja continuar durante entre aproximadamente 1-48 horas.
Los productos de reacción se someten subsecuentemente a cromatografía de interacción hidrófoba para separar las variantes del polipéptido hlFN PEGilado a partir de mPEG(5000) -0-CH2-C=CH libre y cualquier complejo de alto peso molecular del polipéptido hlFN pegilado que pueda formarse cuando se activa el PEG no bloqueado en ambos extremos de la molécula, reticulando así las moléculas variantes del polipéptido hlFN. Las condiciones durante la cromatografía de interacción hidrófoba son tales que el mPEG(5000) -0-CH2-C=CH libre fluye a través de la columna, mientras que cualquier complejo variante del polipéptido hlFN PEGilado reticulado se eluye en las formas deseadas, que contienen una molécula variante del polipéptido hlFN conjugada a uno o más grupos PEG. Las condiciones adecuadas varían dependiendo de los tamaños relativos de los complejos reticulados contra los conjugados deseados y se determinan fácilmente por los expertos en la técnica. El eluyente que contiene los conjugados deseados se concentra mediante ultrafiltración y se desala mediante diafiltración. Si es necesario, el polipéptido hlF? PEGilado obtenido de la cromatografía hidrófoba puede purificarse adicionalmente mediante uno o más procedimientos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de anión o catión (utilizando, incluyendo pero sin limitarse a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC en fase inversa; filtración en gel (utilizando, incluyendo pero sin limitarse a SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de quelado de metal ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo, pero sin limitarse a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero sin limitarse a precipitación de sulfato de amonio) o extracción. El peso molecular aparente puede estimarse mediante GPC por comparación con estándares de proteína globular (Protein Purification Methods, A Practical Approach (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). La pureza del conjugado hGH-EG puede lograrse mediante degradación proteolítica (incluyendo pero sin limitarse a, división de tripsina) seguida por análisis de espectrometría de masa. Pepinsky B., et al., Pharmacol. & Exp. Ther., 297(3) :1059-66 (2001). Un polímero soluble en agua enlazado a un aminoácido de un polipéptido hlFN de la invención, puede derivatizarse o sustituirse adicionalmente sin limitación. Derivados PEG conteniendo azida En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlFN se modifica con un derivado PEG que contiene un residuo azida que reaccionará con un residuo alquino presente en la cadena lateral del aminoácido codificado no de manera natural. En general, los derivados PEG tendrán un peso molecular promedio fluctuando de 1-100 kDa y en algunas modalidades de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado PEG de terminación azida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-N3 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio se encuentra entre 5-40 kDa) . En otra modalidad, el derivado PEG de terminación azida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) m-NH-C (O) - (CH2) p-N3 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio se encuentra entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido conteniendo alquino se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene un residuo de terminación azida teniendo cada cadena del PEG ramificado un MW fluctuando de 10-40 kDa y, más preferentemente de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG de terminación azida tendrá la estructura siguiente : [RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2) m-X- (CH2) PN3 en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo O, N, S, o carbonil (C=0) en cada caso que puede encontrarse presente o ausente . Derivados PEG que contienen alquino En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlFN se modifica con un derivado PEG que contiene un residuo alquino que reaccionará con un residuo azida presente en la cadena lateral del aminoácido codificado no de manera natural . En algunas modalidades, el derivado PEG de terminación alquino tendrá la estructura siguiente : RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) m-C=CH en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., el peso molecular promedio se encuentra entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural conteniendo alquino se modifica con un derivado PEG que contiene un residuo de terminación azida o terminación alquino que se encuentra enlazado a la estructura PEG por medio de un enlace amida. En algunas modalidades, el derivado PEG de terminación alquino tendrá la estructura siguiente : RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) m-NH-C (O) -CH (CH2) p-C=CH en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido conteniendo azida se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene un residuo de terminación alquino teniendo cada cadena del PEG ramificado un MW fluctuando de 10-40 kDa y, más preferentemente de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG de terminación alquino tendrá la estructura siguiente : [RO- (CH2CH20) n-O- (CH2) 2-?H-C (O) ] 2CH (CH2)m-X- (CH2) pC=CH en donde R es un alquil simple (metil, etil, propil, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo O, ?, S, o carbonil (C=0) o no presente. Derivados PEG que contienen fosfina En otra modalidad de la invención, un polipéptido hlF? se modifica con un derivado PEG que contiene un grupo funcional activado (incluyendo pero sin limitarse a, éster, carbonato) que comprende además un grupo aril fosfina que reaccionará con un residuo azida presente en la cadena lateral del aminoácido codificado no de manera natural . En general, los derivados PEG tendrán un peso molecular promedio fluctuando de 1-100 kDa y en algunas modalidades de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado PEG tendrá la estructura : en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no presente, Ph es fenil, y W es un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el derivado PEG tendrá la estructura : en donde X puede ser O, N, S o no presente, Ph es fenil, W es un polímero soluble en agua y R puede ser H, alquil, aril, alquil sustituido y grupos aril sustiuidos. Los grupos R ejemplares incluyen, pero no se limitan a -CH2, -C(CH3)3, OR' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -C(0)R', -CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2-NR'R" , -CN y -N02. R' , R" , R' " y R' " ' se refieren cada uno independientemente a hidrógeno, heteroalquil sustituido o no sustituido, aril sustituido o no sustituido, incluyendo pero sin limitarse a, aril sustituido con 1-3 halógenos, alquil sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquil . Cuando un compuesto de la - invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como cada uno de los grupos R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cuando más de uno de estos grupos se encuentra presente. Cuando R' , y R' ' se encuentran unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R'' pretende incluir, pero sin limitarse a, l-pirrolidinil y 4-morfolinil . A partir de los sustituyentes tratados anteriormente, el experto en la técnica entenderá que el término "alquil" pretende incluir grupos incluyendo átomos de carbono enlazados a grupos diferentes a los grupos hidrógeno, tales como haloalquil (incluyendo pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acil (incluyendo pero sin limitarse a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 y lo similar). Otros derivados PEG y técnicas Generales de PEGilación Otras moléculas PEG ejemplares que pueden enlazarse a polipéptidos hlFN, así como métodos de PEGilación incluyen los descritos e.g., en la Publicación de Patente de E.U. No. 2004/0001838 2002/0052009 2003/0162949 2004/0013637 2003/0228274 2003/0220447 2003/0158333 2003/0143596 2003/0114647 2003/0105275 2003/0105224 2003/0023023 2002/0156047 2002/0099133 2002/0086939 2002/0082345 2002/0072573 2002/0052430 2002/0040076 2002/0037949 2002/0002250 2001/0056171 2001/0044526 2001/0027217 2001/0021763; Patente de E.U. No. 6,646,110; 5,824,778 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6.461,603; 6.436,386 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461; 5.739,208; 5,672,662 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460; 5324,844; 5,252,714 6.420,339; 6.201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213 5,612,460; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439508, WO 97/03106, WO 96/214469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510,356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316, que se incorporan por la referencia en la presente. Cualquiera de las moléculas PEG descritas en la presente puede utilizarse de cualquier modo, incluyendo pero sin limitarse a, monocatenaria, de cadena ramificada, de cadena multibrazos, unifuncional, bifuncional, multifuncional o cualquier combinación de los mismos . Aumento de afinidad para albúmina de suero Diversas moléculas pueden fusionarse también a polipéptidos hlF? de la invención para modular la vida media de los polipéptidos hlFN en suero. En algunas modalidades, las moléculas se encuentran enlazadas o fusionadas a polipéptidos hlFN de la invención para aumentar la afinidad para la albúmina de suero endógena en un animal . Por ejemplo, en algunos casos, se realiza una fusión recombinante de un polipéptido hlFN y una secuencia de enlace de albúmina. Las secuencias de enlace de albúmina ejemplares incluyen, pero no se limitan a, el dominio de enlace de albúmina de proteína G de estreptococo (ver, e.g., Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:534-542 (1996) y Sjolander et al., J. Immunol . Methods 201:115-123 (1997)), o péptidos de enlace de albúmina tales como los descritos en e.g., Dennis et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002). En otras modalidades, los polipéptidos hlFN de la presente invención se acilan con ácidos grasos . En algunos casos, los ácidos grasos promueven el enlace a la albúmina de suero. Ver, e.g., Kurtzhals et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995) . En otras modalidades, los polipéptidos hlFN de la invención se fusionan directamente con albúmina de suero (incluyendo, pero sin limitarse a, albúmina de suero humana) .
Los expertos en la técnica reconocerán que también pueden enlazarse una variedad de otras moléculas al hlF? en la presente invención para modular el enlace a la albúmina de suero u otros componentes de suero.
X. Glicosilación de Polipéptidos hlFN La invención incluye polipéptidos hlFN que incorporan uno o más aminoácidos codificado no de manera natural que contienen residuos sacárido. Los residuos sacáridos pueden ser ya sea naturales (incluyendo pero sin limitarse a, N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo pero sin limitarse a 3-fluorogalactosa) . Los sacáridos pueden enlazarse a los aminoácidos codificado no de manera natural ya sea mediante un enlace glicosídico O-enlazado (incluyendo pero sin limitarse a N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (incluyendo pero sin limitarse a una oxima o la glicosida C o S-enlazada correspondiente. Los residuos sacárido (incluyendo pero sin limitarse a glicosil) pueden agregarse a los polipéptidos hlFN ya sea in vivo o in vitro. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que contiene carbonil se modifica con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente enlazado a través de un enlace oxima. Una vez unido al aminoácido codificado no de manera natural, el sacárido puede elaborarse adicionalmente mediante tratamiento con glicosiltransferasas y otras enzimas para generar un enlace oligosacárido enlazado al polipéptido hlFN. Ver, e.g., H. Liu et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1702-1703 (2003).
- En algunas modalidades de la invención, un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural conteniendo carbonil se modifica directamente con un glicano con estructura definida preparado como un derivado aminooxi . El experto en la técnica reconocerá que pueden utilizarse otras funcionalidades, incluyendo azida, alquino, hidrazida, hidrazina y semicarbazida para enlazar el sacárido al aminoácido codificado no de manera natural. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido hlFN que comprende una azida o un aminoácido codificado no de manera natural que contiene alquinil puede modificarse mediante, incluyendo, pero sin limitarse a, una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] con, incluyendo pero sin limitarse a, derivados alquinil o azida, respectivamente. Este método permite que las proteínas se modifiquen con extremada alta selectividad. XI . Dímeros y Multímeros Miembros de la Familia Supergene GH La presente invención proporciona también combinaciones de miembros de la familia del supergen GH (incluyendo pero sin limitarse a hlFN) homodímeros, heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros (i.e., trímeros, tetrámeros, etc.) en donde un polipéptido miembro de la familia del supergen GH tal como hlFN que contiene uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se enlaza a otro miembro de la familia del supergen GH o variante del mismo o a cualquier otro polipéptido que es un miembro de la familia del supergen no GH o variante del mismo, ya sea directamente a la estructura de polipéptido o a través de un enlazador. Debido a su aumentado peso molecular en comparación con monómeros, los conjugados de dímero o multímero del miembro de la familia del supergen GH, tal como hlFN, pueden exhibir nuevas o deseables propiedades, incluyendo pero sin limitarse a diferentes farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinámicas, vida media terapéutica modulada, o vida media modulada en plasma en relación al miembro monomérico de la familia del supergen GH. En algunas modalidades, los dímeros del miembro de la familia del supergen GH, tal como hlFN, de la invención modularán la dimerización del receptor del miembro de la familia del supergen GH. En otras modalidades, los dímeros o multímeros del miembro de la familia del supergen GH de la presente invención actuarán como un receptor antagonista, agonista o modulador del miembro de la familia del supergen GH. En algunas modalidades, uno o más moléculas hlFN presentes en un dímero o multímero que contiene hlFN comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente dentro de la región de enlace del Sitio II. De tal manera, cada una de las moléculas de hlFN del dímero o multímero es accesible para el enlace al receptor de polipéptido hlFN a través de la interfaz del Sitio I pero se encuentran no disponibles para enlazarse a un segundo receptor de polipéptido hlFN a través de la interfaz del Sitio II. De esta manera, el dímero o multímero de polipéptido hlFN puede engranar los sitios de enlace del Sitio I de cada uno de los dos receptores de polipéptido hlF? pero, dado que las moléculas de hlFN tienen un polímero soluble en agua unido a un aminoácido no genéticamente codificado presente en la región del Sitio II, los receptores de polipéptido hlFN no pueden engranarse a la región del Sitio II del ligando del polipéptido hlFN y el dímero o multímero actúa como un antagonista del polipéptido hlFN. En algunas modalidades, una o más de las moléculas hlF? presentes en un dímero o multímero conteniendo polipéptido hlF? comprenden un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente dentro de la región de enlace del Sitio 01, permitiendo el enlace a la región del Sitio II . Alternativamente, en algunas modalidades una o más de las moléculas de hlFN presentes en el dímero o multímero conteniendo polipéptido hlFN comprende un aminoácido codificado no de manera natural enlazado a un polímero soluble en agua que se encuentra presente en un sitio que no se encuentra dentro de la región de enlace del Sitio I o Sitio II, de manera que ambos se encuentran disponibles para el enlace. En algunas modalidades se utiliza una combinación de moléculas hlFN que tienen el Sitio I, Sitio II o ambos, disponibles para el enlace . Una combinación de moléculas hlFN en donde al menos una tiene el Sitio I disponible para el enlace, y al menos una tiene el Sitio II disponible para el enlace, puede proporcionar moléculas que tienen una actividad o propiedad deseada. Adicionalmente, una combinación de moléculas hlFN que tienen tanto el Sitio I como el Sitio II disponibles para el enlace, puede producir una molécula hlFN super agonista. En algunas modalidades, los polipéptídos miembros de la familia del supergen GH se enlazan directamente, incluyendo, pero sin limitarse a, a través de un enlace Asn-Lys amida o enlace Cys-Cys disulfuro. En algunas modalidades, los polipéptidos miembros de la familia del supergen GH enlazados, y/o miembros de la familia del supergen no GH enlazado, comprenderán diferentes aminoácidos codificado no de manera natural para facilitar la dimerización, incluyendo pero sin limitarse a, un alquino en un aminoácido codificado no de manera natural de un primer polipéptido hlFN y una azida en un segundo aminoácido codificado no de manera natural de un segundo polipéptido miembro de la familia del supergen GH se conjugarán a través de una cicloadición Huisgen [3+2] . Alternativamente, un primer polipéptido miembro de la familia del supergen GH, y/o el miembro de la familia del supergen no GH enlazado, que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que contiene cetona, puede conjugarse a un segundo polipéptido miembros de la familia del supergen GH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que contiene hidroxilamina y los polipéptidos se reactivan a través de formación de la oxima correspondiente . Alternativamente, los dos polipéptidos miembros de la familia del supergen GH, y/o el miembro de la familia del supergen no GH enlazado se enlazan a través de un enlazador. Cualquier enlazador hetero, homo o bifuncional puede utilizarse para enlazar los dos polipéptidos miembros de la familia del supergen GH, y/o el miembro de la familia del supergen no GH, que pueden tener la misma o diferente secuencia primaria. En algunos casos, el enlazador utilizado para trabar entre sí los polipéptidos miembros de la familia del supergen GH, y/o el miembro de la familia del supergen no GH enlazado, puede ser un reactivo PEG bifuncional. En algunas modalidades, la invención proporciona enlazadores bifuncionales solubles en agua que tienen una estructura de palanca que incluye: un residuo a) azida, alquino, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, o que contiene carbonil en al menos un primer extremo de una estructura de polímero; y b) al menos un segundo grupo funcional de un segundo extremo de la estructura de polímero. El segundo grupo funcional puede ser el mismo o diferente al primer grupo funcional. El segundo grupo funcional, en algunas modalidades, es no reactivo con el primer grupo funcional. La invención proporciona, en algunas modalidades, compuestos solubles en agua que comprenden al menos un brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrítica. En algunas modalidades, la invención proporciona multímeros que comprenden uno o más miembros de la familia del supergen GH, tal como hlFN, formados por reacciones con polímeros activados solubles en agua que tienen la estructura : R- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-X en donde n es de aproximadamente 5 a 3,000, m es de 2-10, X puede ser un grupo azida, alquino, hidrazina, hidrazida, aminooxi, un residuo hidroxilamina, acetilo, o que contiene carbonil, y R es un grupo tapado, un grupo funcional, o un grupo de partida que puede ser el mismo o diferente a X. R puede ser, por ejemplo, un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de hidroxil, hidroxil protegido, alcoxil, éster N-hidroxisuccinimidil, y éster 1-benzotriazolil, carbonato N-hidroxisuccinimidil, carbonato 1-benzotriazolil, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol - protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimido, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxalos, dionas, mesilatos, tosilatos, y tresilato, alqueno y cetona. XII . Medición de la actividad del polipéptido hlFN y de la afinidad del polipéptido hlFN para el receptor del polipéptido hlFN El receptor hGH puede prepararse como se describe en MacFarland et al., Science, 245:494-499 (1989) y Leung D., et al., Nature, 330:537-543 (1987). La actividad del polipéptido hGH puede determinarse utilizando análisis estándar in vitro o in vivo. Por ejemplo, las líneas celulares que proliferan en presencia de hGH (e.g., una línea celular que expresa el receptor hGH o un receptor lactogénico) pueden utilizarse para monitorear el enlace del receptor hGH. Ver, e.g., Clark R. , et al., J. Biol. Chem., 271(36) :21969 (1996); Wada et al., Mol. Endocrinol., 12:146-156 (1998); Gout P.W. et al., Cáncer Res., 40, 2433-2436 (1980); WO 99/03887. Para un polipéptido hGH no P?Gilado que comprende un aminoácido no natural, la afinidad de la hormona para este receptor puede medirse utilizando un biosensor BIAcore™ (Pharmacia). Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,849,535; Spencer S. A. et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) . Los modelos animales in vivo para analizar la actividad hGH incluyen aquellos descritos en e.g., Clark et al., J. Biol. Chem. 271 (36)_21969-21977 (1996). Los análisis para la capacidad de dimerización de polipéptidos hGH que comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural pueden construirse como se describe en Cunningham, B., et al., Science, 254:821-825 (1991) y Fuh, G. , et al., Science, 256:1677-1680 (1992) . Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente. El receptor hlFN puede prepararse como se describe en la Patente de E.U. No. 6,566,132; 5,889,151; 5,861,258; 5,731,169; 5,578,707, que se incorporan por la referencia en la presente. La actividad del polipéptido hlFN puede determinarse utilizando análisis in vitro o in vivo estándar o conocidos. Por ejemplo, las células o líneas celulares que modulan el crecimiento o la producción del antígeno MHC Clase I o II en respuesta al hlFN o enlazan hlFN (incluyendo pero sin limitarse a, células que contienen receptores IFN activos tales como células Daudi linfoblastoide humanas o células que producen el receptor IFN recombinante) pueden utilizarse para monitorear el enlace del receptor hlFN. Para un polipéptido hlFN no PEGilado o PEGilado que comprende un aminoácido no natural, la afinidad de la hormona para este receptor puede medirse utilizando técnicas conocidas en la técnica tales como el biosensor BIAcore™ (Pharmacia) . Los modelos animales in vivo así como pruebas clínicas en humanos para probar la actividad hlFN incluyen aquellos descritos en e.g., Kontsek et al., Acta Virol., 43:63 (1999); Youngster et al., Current Pharma Design 8:2139 (2002); Kozlowski et al., BioDrugs 15:419 (2001); Patente de E.U. No. 6,180,096; 6,177,074; 6,042,822; 5,981,709; 5,951,974; 5,908,621; 5,711,944; 5,738,846; que se incorporan por la referencia en la presente . Sin importar cuáles métodos se utilizan para crear los análogos hlFN presentes, los análogos se someten a análisis para actividad biológica. Pueden conducirse análisis de timidina tritiada para lograr el grado de división celular. Sin embargo, pueden utilizarse otros análisis biológicos para lograr la actividad deseada. Los análisis biológicos tales como el análisis para la capacidad de inhibir la replicación viral, también proporcionan indicación de actividad IFN. Ver, Bailón et al., Bioconj . Chem. 12:195 (2001); Forti et al., Meth. Enzymol., 119:533 (1986); Walter et al., Cáncer Biother. & Radiopharm. 13:143 (1998); DiMarco et al., BioChem. Biophys. Res. Com. 202:1445 (1994); y Patente de E.U. No. 4,675,282; 4,241,174; 4,514,507; 4,622,292; 5,766,864 que se incorporan por la referencia en la presente . Otros análisis in vitro pueden utilizarse para lograr la actividad biológica. En general, la prueba de actividad biológica debe proporcionar análisis para el resultado deseado, tal como incremento o disminución en la actividad biológica (en comparación con IFN no alterado) , diferente actividad biológica (en comparación con IFN no alterado) , análisis de afinidad del receptor, o análisis de vida media en suero. Se reportó previamente que las células Daudi enlazarán IFN murino 125 I-marcado y que este enlace puede competir por la adición de IFN no marcado (Ver, e.g., Patente de E.U. No. 5,516,514; 5,632,988). Se analiza la capacidad del IFN natural y del hlFN para competir por el enlace de 125I-IFN a células leucémicas humanas y murinas. El IFN natural altamente purificado (>85% puro; 1 mg) se yodina [Tejedor et al., Anal. Biochem. 127, 143 (1982)], y se separa de los reactivos mediante cromatografía de filtración de gel y de intercambio de ion. La actividad específica del 125I-IFN natural puede ser de aproximadamente 100 µCi/µg proteína. La compilación de referencias anterior para metodologías de análisis no es exhaustiva, y los expertos en la técnica reconocerán otros análisis útiles para el resultado final deseado. XIII. Medición de potencia, vida media funcional in vivo, y parámetros de farmacocinética Un importante aspecto de la invención es la vida media biológica prolongada obtenida mediante la construcción del polipéptido hlFN con o sin conjugación del polipéptido a un residuo de polímero soluble en agua. La rápida disminución de las concentraciones en suero del polipéptido hlFN ha hecho importante evaluar las respuestas biológicas al tratamiento con polipéptido hlFN conjugado y no conjugado y sus variantes. Preferentemente, el polipéptido hlF? conjugado y no conjugado y sus variantes de la presente invención, tiene prolongadas vidas medias en suero también después de administración intravenosa, haciendo posible medir mediante, e.g., método ELISA o mediante un análisis de visualización primaria. Pueden utilizarse equipos ELISA o RÍA ya sea de BioSource International (Camarillo, CA) o de Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) . Otro ejemplo de un análisis para la medición de la vida media in vivo de IFN o sus variantes, se describe en Kozlowski et al., BioDrugs 15:419 (2001); Bailón et al., Bioconj . Chem. 12:195 (2001); Youngster et al., Current Pharm. Design 8:2139 (2002); Pat. de E.U. No. 6,524,570; 6,250,469; 6,180,096; 6,177,074; 6,042,822; 5,981,709; 5,591,974; 5,908,621; 5,738,846, que se incorporan por la referencia en la presente. La medición de la vida media biológica in vivo se lleva a cabo como se describe en la presente . La potencia y vida media funcional in vivo de un polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural, pueden determinarse de acuerdo con el protocolo descrito en Clark R. , et al., J. Biol. Chem. 271, - - 36, 21969-21977 (1996) . La potencia y la vida media funcional in vivo de un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural puede determinarse de acuerdo con el protocolo descrito en la Patente de E.U. No. 5,711,944; 5,382,657, que se incorporan por la referencia en la presente. Los parámetros farmacocinéticos para un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido codificado no de manera natural pueden evaluarse en ratas macho Sprague-Drawley normales (?=5 animales por grupo de tratamiento) . Los animales recibirán ya sea una dosis única de 25 µg/rata intravenosa o 50 µg/rata subcutánea, y se tomarán aproximadamente 5-7 muestras de sangre de acuerdo con un curso de tiempo predefinido, generalmente cubriendo aproximadamente 6 horas para un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido codificado no de manera natural no conjugado a un polímero soluble en agua y aproximadamente 4 días para un polipéptido hlF? que comprende un aminoácido codificado no de manera natural y conjugado a un polímero soluble en agua. Los datos farmacocinéticos para polipéptidos hlF? han sido estudiados en diversas especies y pueden compararse directamente con los datos obtenidos para polipéptidos hlF? que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural. Ver, Mordenti J. , et al., Pharm. Res. 8 (11) :1351-59 (1991) para estudios relacionados a hGH.
La actividad específica de los polipéptidos hlFN de acuerdo con esta invención puede determinarse mediante diversos análisis conocidos en la técnica. La actividad biológica de las muteínas de polipéptido hlFN o sus fragmentos, obtenidos y purificados de acuerdo con esta invención pueden probarse mediante métodos descritos o referidos en la presente o conocidos por los expertos en la técnica. XIV. Administración y Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo pero sin limitarse a, hlFN, sintetasas, proteínas que comprenden uno o más aminoácidos no naturales, etc.) se emplean opcionalmente para usos terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones, por ejemplo, comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable . Tal vehículo o excipiente incluye pero no se limita a, salina, salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y/o combinaciones de los mismos. La formulación se elabora para adecuarse al modo de administración. En general, los métodos para administrar proteínas son muy conocidos en la técnica y pueden aplicarse a la administración de los polipéptidos de la invención. Las composiciones terapéuticas que comprenden uno o - más polipéptidos de la invención se prueban opcionalmente en uno o más modelos animales de enfermedad apropiados in vitro y/o in vivo, para confirmar la eficacia, metabolismo de tejido, y para estimar las dosis de acuerdo con métodos muy conocidos en la técnica. En particular, las dosis pueden determinarse inicialmente por la actividad, estabilidad u otras medidas adecuadas de homólogos de aminoácido no naturales en la presente con naturales (incluyendo pero sin limitarse a, la comparación de un polipéptido hlFN modificado para incluir uno o más aminoácidos no naturales con un polipéptido hlFN de aminoácido natural), i.e., en un análisis relevantes . La administración mediante cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir una molécula en contacto último con células sanguíneas o de tejido. Los polipéptidos de aminoácido no natural de la invención se administran de cualquier manera adecuada, opcionalmente con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables . Los métodos adecuados de administración de tales polipéptidos en el contexto de la presente invención a un paciente, se encuentran disponibles, y aunque puede utilizarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede proporcionar frecuentemente una acción o reacción más inmediata y más efectiva que otra vía. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Las composiciones de polipéptido pueden administrarse mediante un número de vías incluyendo, pero sin limitarse a medios orales, intravenosos, intraperitoneales, intramusculares, transdérmicos, subcutáneos, tópicos, sublinguales o rectales. Las composiciones que comprenden polipéptidos de aminoácido no natural, modificados o no modificados, también pueden administrarse a través de liposomas. Tales vías de administración y formulaciones apropiadas son generalmente conocidas por los expertos en la técnica. El polipéptido hlFN que comprende un aminoácido no natural, solo o en combinación con otros componentes adecuados, también puede elaborarse en formulaciones aerosol (i.e., pueden "nebulizarse") para administrarse a través de inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y lo similar. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tales como, por ejemplo, mediante vías intraauriculares (en las articulaciones) , intravenosas, intramusculares, intradérmicas, intraperitoneales, y subcutáneas, incluyen, soluciones para inyección isotónicas estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterióstatos, y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores, y preservativos. Las formulaciones de ácido nucleico empacado pueden presentarse en envases sellados de dosis unitaria o de dosis múltiple, tales como ampolletas y viales. La administración parenteral y la administración intravenosa son métodos de administración preferidos. En particular, las vías de administración ya en uso para terapéuticos de homólogos de aminoácido natural (incluyendo pero sin limitarse a aquellos típicamente utilizados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticuerpos, y/o cualquier otra proteína suministrada farmacéuticamente) , conjuntamente con las formulaciones actualmente en uso, proporcionan vías de administración y formulación para los polipéptidos de la invención. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo, o, incluyendo, pero sin limitarse a, inhibir la infección por patógenos u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector particular, o formulación, y la actividad, estabilidad o vida media en suero del polipéptido de aminoácido no natural empleado y la condición del paciente, así como del peso corporal o área de superficie del paciente que va a tratarse . El tamaño de la dosis se determina también por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que acompañe la administración de un vector, particular, formulación o lo similar en un paciente particular. Para determinar la cantidad efectiva del vector o formulación que va a administrarse en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad (incluyendo pero sin limitarse a, cánceres, enfermedades hereditarias, diabetes, SIDA, o lo similar) , el médico evalúa los niveles en plasma circulantes, las toxicidades de formulación, el progreso de la enfermedad, y/o si es relevante, la producción de anticuerpos anti-polipéptido de aminoácido no natural . La dosis administrada, por ejemplo, a un paciente de 70 kilogramos, se encuentra típicamente en el rango equivalente a dosis de proteínas terapéuticas actualmente utilizadas, ajustadas para la actividad alterada de la vida media en suero de la composición relevante. Los vectores de esta invención pueden suplementar condiciones de tratamiento mediante cualquier terapia convencional conocida, incluyendo administración de anticuerpos, administración de vacunas, administración de agentes citotóxicos, polipéptidos de aminoácido natural, ácidos nucleicos, análogos de nucleótido, modificadores de respuesta biológica y lo similar. Para administración, las formulaciones de la presente invención se administran a una relación determinada por el LD-50 o ED-50 de la formulación relevante, y/o la observación de cualquier efecto secundario de los aminoácidos no naturales a varias concentraciones, incluyendo pero sin limitarse a, aplicados a la masa y salud general del paciente . La administración puede completarse a través de dosis únicas o divididas. Si un paciente que experimenta la infusión de una formulación desarrolla fiebres, escalofríos, o dolores musculares, recibe la dosis apropiada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofén, u otra droga para el control del dolor/fiebre . Los pacientes que experimentan reacciones a la infusión tales como fiebre, dolores musculares y escalofríos, se premedican 30 minutos previo a futuras infusiones ya sea con aspirina, acetaminofén o incluyendo, pero sin limitarse a difenhidramina. La meperidina se utiliza para escalofríos y dolores musculares más severos que no responden rápidamente a antipiréticos y antihistaminas. La infusión celular se retarda o se discontinúa dependiendo de la severidad de la reacción.
Los polipéptidos hlFN humanos de la invención pueden administrarse directamente a un sujeto mamífero. La administración se realiza mediante cualquiera de las vías normalmente utilizadas para introducir el polipéptido hlFN a un sujeto. Las composiciones de polipéptido hlFN de acuerdo con las modalidades de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, por inhalación (incluyendo pero sin limitarse a mediante un aerosol) , bucal (incluyendo pero sin limitarse a sub-lingual) , vaginal, parenteral (incluyendo pero sin limitarse a subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial o intravenosa), tópica (i.e., en las superficies tanto de piel como mucosa, incluyendo superficies aéreas) y transdérmica, aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata. La administración puede ser ya sea local o sistémica. Las • formulaciones de los compuestos pueden presentarse en envases de dosis única o de dosis múltiple, tales como ampolletas y viales. Los polipéptidos hlFN de la invención pueden prepararse en una mezcla en una forma de dosis unitaria inyectable (incluyendo, pero sin limitarse a, solución, suspensión o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos hlF? de la invención también pueden administrarse mediante infusión continua (utilizando, incluyendo pero sin limitarse a, minibombas, tales como bombas osmóticas) , formulaciones de inyección rápida única o de depósito de liberación lenta. Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterióstatos, y solutos que hacen la formulación isotónica, y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores, y preservativos . Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable . Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra asi como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas (incluyendo vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables) de la presente invención (ver, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. 1985)). Los vehículos adecuados incluyen amortiguadores que contienen fosfato, borato, HEPES, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; iones de metal divalentes tales como zinc, cobalto, o cobre; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween™, Pluronics™ o PEG. Los polipéptidos hlFN de la invención, incluyendo aquellos enlazados a polímeros solubles en agua tales como PEG también pueden administrarse por o como parte de sistemas de liberación sostenida. Las composiciones de liberación sostenida incluyen, incluyendo pero sin limitarse a, matrices de polímero semi permeables en forma de artículos configurados, incluyendo pero sin limitarse a películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen las de materiales biocompatibles tales como poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982), etileno vinil acetato (Langer et al . , supra) o ácido poli-D-(-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988), poliláctidos (ácido poliláctico) (Patente de E.U. : No. 3,773,919; EP 58,481), poliglicolida (polímero de ácido glicólico) , poliláctido co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) , polianhídridos, copolímeros de ácido L-glutamico y gama-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitima, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, ácidos poliamino, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Las composiciones de liberación sostenida incluyen también un compuesto liposomalmente atrapado. Los liposomas que contienen el compuesto se preparan mediante métodos conocidos per se : DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Solicitud de Pat. Japonesa 83-118008; Pat. de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente . Los polipéptidos hlF? liposomalmente atrapados pueden prepararse mediante métodos descritos e.g., en DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
E.U.A., 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Solicitud de Pat. Japonesa 83-118008; Pat. de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. La composición y tamaño de los liposomas son muy conocidos o pueden determinarse fácilmente de manera empírica por el experto en la técnica. Algunos ejemplos de liposomas como se describe en e.g., Park JW et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92:1327-1331 (1995); Lasic D y Papahadjopoulos D (eds): Medical Applications of Liposomes (1998) ; Dru mond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, en Teicher B (ed) : Cáncer Drug Discovery and Development (2002) ; Park JW et al., Clin. Cáncer Res. 82:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3) : 109-118 (2002); Ma ot C. et al., Cáncer Res., 63:3154-3161 (2003). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan por la referencia en la presente. La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para ocasionar una respuesta benéfica en el sujeto al paso del tiempo. Generalmente, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido hlFN de la presente invención administrada parenteralmente por dosis, se encuentra en el rango de aproximadamente 0.01 µg/kg/día hasta aproximadamente 100 g/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg del peso corporal del paciente, aunque esto se sujeta a la discreción terapéutica. La frecuencia de dosis también se sujeta a discreción terapéutica y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos de polipéptido hlFN comercialmente disponibles aprobados para uso en humanos. Generalmente, el polipéptido hlFN PEGilado de la invención puede administrarse por cualquiera de las vías de administración descritas anteriormente. XV. Usos terapéuticos de los polipéptidos hlF? de la invención Los polipéptidos hlF? de la invención son útiles para tratar un amplio rango de trastornos. Los polipéptidos de agonista hGH de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar deficiencia del crecimiento, trastornos inmunes y para estimular la función cardiaca. Los individuos con deficiencias del crecimiento incluyen, e.g., individuos con síndrome de Turner, individuos deficientes en GH (incluyendo niños) , niños que experimentan un retraso o retardo en su curva normal de crecimiento aproximadamente 2-3 años antes de que sus placa de crecimiento se cierra (conocidos algunas veces como "niños cortos normales") , e individuos en los cuales la respuesta al factor I similar a insulina (IGF-1) al GH se ha bloqueado químicamente (i.e., mediante tratamiento glucocorticoide) o mediante condición natural tal como en pacientes adultos en donde se reduce naturalmente la respuesta de IGF-I al GH.
Una variante del hGH agonista puede actuar para estimular el sistema inmune de un mamífero incrementando su función inmune, ya sea que el incremento se deba a la mediación del anticuerpo o a la mediación celular, y ya sea que el sistema inmune sea endógeno al huésped tratado con el polipéptido hGH o se transplante de un donante al receptor huésped al que se da el polipéptido hGH (como en transplantes de médula ósea) . Los "trastornos inmunes" incluyen cualquier condición en la cual el sistema inmune de un individuo tiene una reducida respuesta al anticuerpo o celular a antígenos a la normal, incluyendo aquellos individuos con bazos pequeños con inmunidad reducida debido a tratamientos de droga (e.g., quimioterapéuticos) . Ejemplos de individuos con trastornos inmunes incluyen, e.g., pacientes ancianos, individuos que experimentan quimioterapia o terapia de radiación, individuos que se recuperan de una enfermedad importante, o que van a experimentar cirugía, individuos con SIDA, pacientes con deficiencias de célula B congénitas o adquiridas tales como hipogamaglobulinemia, agamaglobulinemia variada común, y deficiencias de inmunoglobulina selectivas (e.g., deficiencia de IgA, pacientes infectados con un virus tal como rabia con un tiempo de incubación más corto que la respuesta inmune del paciente; e individuos con trastornos hereditarios tales como el síndrome diGeorge . Los polipéptidos de antagonista hGH de la invención, pueden ser útiles para el tratamiento de gigantismo y acromegalia, diabetes y complicaciones (retinopatía diabética, neuropatía diabética) que surgen de diabetes, enfermedades oculares vasculares (e.g., que implican neovascularización proliferativa) , nefropatía, y males que responden a GH. Las enfermedades oculares vasculares incluyen, e.g., retinopatía (ocasionada por e.g., premadurez o anemia de célula de hoz) y degeneración macular. Los males que responden a GH incluyen, e.g., tumor de Wilm, sarcomas (e.g., sarcoma osteogénico), cáncer de seno, colon, próstata y tiroides, y cánceres de tejidos que expresan ARNm de receptor GH (i.e., de placenta, timo, cerebro, glándula salival, próstata, médula ósea, músculo esquelético, tráquea, médula espinal, retina, nodo linfático, y de linfoma de Burkitt, carcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar, leucemia linfoblástica, y melanoma) . Las cantidades promedio del hGH pueden variar y en particular se basan en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta de hGH es un tema preferente sujeto a factores tales como el tipo exacto o condición que se trata, la condición del paciente que se trata así como los otros ingredientes en la composición. La administración de los productos hlFN de la presente invención da como resultado cualquiera de las actividades demostradas por preparaciones de IFN comercialmente disponibles en humanos. Las composiciones farmacéuticas que contienen los productos de glicoproteína hlFN pueden formularse a una resistencia efectiva para la administración por varios medios a un paciente humano que experimenta trastornos que pueden afectarse mediante agonistas o antagonistas IFN, tales como, pero sin limitarse a, anti-proliferativos, anti-inflamatorios, o antivirales, que se utilizan ya sea solos o como parte de una condición o enfermedad. Las cantidades promedio del producto de glicoproteína hlFN pueden variar y en particular deben basarse en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta de hlFN es un tema preferente sujeto a factores tales como el tipo exacto o condición que se trata, la condición del paciente que se trata así como los otros ingredientes en la composición. El hlFN de la presente invención puede por tanto utilizarse para interrumpir o modular un ciclo de repetición viral, modular la inflamación, o como agentes anti-proliferativos. Entre las condiciones tratables por la presente invención, se incluyen HCV, HBV y otras infecciones virales, crecimiento o viabilidad de célula de tumor, y esclerosis múltiple. La invención también proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo tal como un agente quimioterapéutico anti-cáncer. La cantidad que va a darse puede determinarse fácilmente por el experto en la técnica en base a la terapia con hlFN. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada. Ejemplo 1 Este ejemplo describe uno de los muchos conjuntos de criterios potenciales para la selección de los sitios de incorporación preferidos de aminoácidos codificado no de manera natural en hGH. Este ejemplo demuestra cómo se seleccionaron los sitios preferidos dentro del polipéptido hGH para la introducción de un aminoácido codificado no de manera natural. Se utilizó la estructura cristalina 3HHR, compuesta de hGH complejado con dos moléculas del dominio extracelular del receptor (hGHbp) para determinar las posiciones preferidas en las cuales podrían introducirse uno o más aminoácidos codificado no de manera natural. Otras estructuras (e.g., 1AXI) se utilizaron para examinar la variación potencial de elementos estructurales primarios y secundarios entre los conjuntos de datos de la estructura cristalina. Las coordenadas para estas estructuras se encuentran disponibles del Protein Data Bank (PDB) (Berstein et al., J. Mol. Biol., 1997, 112 p 535) o a través de The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics ODB disponible en la red en rcsb.org. El modelo estructural 3HHR contiene toda la secuencia 22 kDA madura de hGH con la excepción de los residuos 148-153 y el residuo F191 de terminación C que se omiten debido al trastorno en el cristal. Dos puentes disulfuro se encuentran presentes, formados por C53 y C165 y C182 y C185. La numeración de secuencia utilizada en este ejemplo es de acuerdo con la secuencia de hGH maduro (variante de 22 kDa) mostrada en la SEQ ID NO : 2. Se utilizaron los siguientes criterios para evaluar cada posición de hGH para la introducción de un aminoácido codificado no de manera natural : el residuo (a) no debe interferir con el enlace de cualquier hGHbp en base al análisis estructural de 3HHR, 1AXI, y 1HWG (estructuras cristalográficas de hGH conjugado con monómero o dímero hGHbp) , b) no debe afectarse por alanina o mutagénesis de exploración de homólogo (Cunningham et al., Science (1989) 244:1081-1085 y Cunningham et al., Science (1989) 243:1330-1336) , (c) debe encontrarse expuesto a la superficie y exhibir mínimas interacciones de enlace van der Waals o de hidrógeno con los residuos circundantes, (d) debe ser ya sea suprimido o variable en variantes hGH (e.g., Tyr35, Lys38, Phe92, Lysl40) , (e) dará como resultado cambios conservadores a la sustitución con un aminoácido codificado no de manera natural y (f) puede encontrarse ya sea en regiones altamente flexibles (incluyendo pero sin limitarse a circuito CD) o regiones estructuralmente rígidas (incluyendo pero sin limitarse a Hélice B) . Adicionalmente, se llevaron a cabo cálculos adicionales en la molécula hGH, utilizando el Programa Cx (Pintar et al., Bioinformatics, 18 pp 980) para evaluar la cantidad de profusión para cada átomo de proteína. Como resultado, en algunas modalidades, se incorpora uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en, incluyendo pero sin limitarse a, una o más de las siguientes posiciones de hGH: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxil de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se sustituye en una o más de las siguientes posiciones: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO:l o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se sustituye en una o más de las siguientes posiciones: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 y 187 (SEQ ID NO:2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID N0:1 o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se sustituye en una o más de las siguientes posiciones: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO:l o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se sustituye en una o más de las siguientes posiciones: 30, 74, 103, (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO:l o 3) . En algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se sustituye en una o más de las siguientes posiciones: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID ?O:l o 3) .
- - En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua, incluyendo pero sin limitarse a, las posiciones: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (i.e., en la terminación carboxil de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID N0:2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 o 3) . En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de la SEQ ID N0:1 o 3) . Algunos sitios para la generación de un antagonista hGH incluyen: Im 2 , 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127 o una adición antes de la posición 1, o cualquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: 2 o el aminoácido correspondiente de la SEQ ID NO:l o 3 o cualquier otra secuencia GH) . Estos sitios se seleccionaron utilizando el criterio (c) - (e) del diseño agonista. El diseño antagonista también puede incluir modificaciones dirigidas al sitio de los residuos del sitio I para incrementar la afinidad de enlace a hGHbp. Ejemplo 2 Este ejemplo detalla la clonación y expresión de un polipéptido hGH incluyendo un aminoácido codificado no de manera natural en E. coli. Este ejemplo describe también un método para establecer la actividad biológica de polipéptidos hGH modificados. Los métodos para clonación de hGH y sus fragmentos se detallan en las Patentes de E.U. Nos. 4,601,980; 4,604,359; 4,634,677; 4,634,677; 4,658,021; 4,898,830; 5,424,199; y 5,795,745, que se incorporan por la referencia en la presente. El 7ADNC que codifica para el hGH de longitud total o la forma madura de hGH que carece de la secuencia de señal de terminación N, se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. Se utiliza un sistema de translación introducida que comprende un 7ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) para expresar hGH conteniendo un - aminoácido codificado no de manera natural . La O-RS preferentemente aminoacila el O-ARNt con un aminoácido codificado no de manera natural . A su vez el sistema de translación inserta el aminoácido codificado no de manera natural en el hGH en respuesta a un codón selector codificado. Tabla 2: secuencias O-RS y O-ARNt.
La transformación de E . coli con plásmidos que contienen el gen hGH modificado y el par ortogonal de aminoacil ARNt sintetasa/ARNt (específico para el aminoácido codificado no de manera natural deseado) permite la incorporación específica en el sitio del aminoácido codificado no de manera natural en el polipéptido hGH. El E. coli transformado, cultivado a 37°C en un medio conteniendo entre 0.01-100 mM del aminoácido particular codificado no de manera natural, expresa el hGH modificado con alta fidelidad y eficiencia. El hGH marcado His que contiene un aminoácido no natural codificado se produce mediante las células huésped - de E. coli como cuerpos de inclusión o agregados. Los agregados se solubilizan y se purifican por afinidad bajo condiciones de desnaturalización en HCl de 6M guanidina. El repliegue se lleva a cabo mediante diálisis a 4°C durante la noche en 50 mM de TRIS-HCl, pH 8.0, 40 µM CuS04 y Sarkosyl al 2% (peso/v) . el material de dializa entonces contra 20 mM de TRIS-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 2 mM de CaCl2, seguido por el retiro de la marca Hs . Ver Boissel et al., (1993) 268:15983-93. Los métodos para purificación de hGH son muy conocidos en la técnica y se confirman mediante SDS-PAGE, inmunoanálisis Western, o espectrometría de masa de atrapamiento de ion de electrorrociado-ionización y lo similar. La Figura 6 es un SDS-PAGE de polipéptidos hGH purificados. Las proteínas hGH mutantes marcadas His se purificaron utilizando la ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen, Carisbad, CA) a través de procedimientos estándar de purificación de proteínas marcadas His proporcionados por el fabricante, seguido por una columna de intercambio de anión previo a cargar en el gel. El campo 1 muestra el marcador de peso molecular y el campo 2 representa N-His hGH sin la incorporación de un aminoácido no natural. Los campos 3-10 contienen mutantes ?-His hGH que comprenden la p-acetil-fenilalanina de aminoácido no natural en cada una de las posiciones Y35, F92, Ylll, G131, R134, K140, Y143 y - K145, respectivamente. Para establecer adicionalmente la actividad biológica de polipéptidos hGH modificados, se utilizó un análisis de medición de un marcador en corriente descendente de la interacción del hGH con su receptor. La interacción del hGH con su receptor producido de manera endógena conduce a la fosforilación de tirosina de un transductor y activador de señal del miembro de la familia de transcripción, STAT5, en la línea celular humana de linfocito IM-9. Se identificaron dos formas de STAT5, STAT5A y STAT5B a partir de una biblioteca IM-9 de ADNc. Ver, e.g., Silva et al., Mol. Endocrinol. (1996) 10 (5) :508-518. El receptor humano de hormona de crecimiento en células IM-9 es selectiva para la hormona de crecimiento humana dado que ni la hormona de crecimiento de rata ni la prolactina humana dieron como resultado fosforilación STAT5 detectable. De manera importante, el dominio extra celular GHR de rata (L43R) y el G120R conteniendo hGH compiten efectivamente contra la fosforilación pSTAT5 estimulada por hGH. Las células IM-9 se estimularon con polipéptidos hGH de la presente invención. Los linfocitos IM-9 humanos se adquirieron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en RPMl 1640 suplementado con piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina (Invitrogen, Carisbad, San Diego) y suero fetal de bovino al 10% desactivado con calor (Hyclone, Logan UT) . Las células IM-9 se extenuaron durante la noche en medio de análisis (RPMl libre de fenol-rojo, 10 mM Hepes, FBS tratado con carbón/dextran al 1% desactivado con calor, piruvato de sodio, penicilina y estreptomicina) antes de la estimulación con un rango de dosis de 12 puntos de polipéptidos hGH durante 10 minutos a 37 °C. Las células estimuladas se fijaron con formaldehído al 1% antes de la permeabilización con metanol helado al 90% durante 1 hora en hielo. El nivel de fosforilación STAT5 se detectó mediante coloración intra celular con un anticuerpo fosfo-STAT5 primario (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) a temperatura ambiente durante 30 minutos seguido por un anticuerpo secundario PE-conjugado. La adquisición de muestra se realizó en la disposición FACS con datos adquiridos analizados en el equipo Flowjo (Tree Star Inc., Ashland, OR) . Los valores EC50 se derivaron de curvas de respuesta a la dosis ilustradas con intensidad media fluorescente (MFI) contra la concentración de proteína utilizando SigmaPlot. La Tabla 3 abajo resume los datos IM-9 generados con polipéptidos hGH mutantes. Diversos polipéptidos hGH con una sustitución de aminoácido no natural en diferentes posiciones se probaron con células IM-9 humanas como se describió. Específicamente, la Figura 7, Panel A muestra los datos IM-9 para un polipéptido hGH marcado His, y la Figura - 7, Panel B muestra los datos IM-9 para hGH marcado His que comprende la sustitución p-acetil-fenilalanina de aminoácido no natural para Y143. El mismo análisis se utilizó para establecer la actividad biológica de polipéptidos hGH comprendiendo un aminoácido no natural PEGilado.
Ej emplo 3 Este ejemplo detalla la introducción de un aminoácido que contiene carbonil y la subsecuente reacción con un PEG que contiene aminooxi . Este ejemplo demuestra un método para la generación de un polipéptido hlFN que incorpora un aminoácido codificado no de manera natural que contiene cetona que se reactiva subsecuentemente con un PEG que contiene aminooxi de aproximadamente 5,000 MW. Cada uno de los residuos 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 120, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155 identificado de acuerdo con el criterio del Ejemplo 1 (hGH) o los residuos identificados de acuerdo con el criterio del Ejemplo 32, incluyendo pero sin limitarse a 100, 106, 107, 108, 111, 113, 114 (hlFN) se sustituye por separado con un aminoácido codificado no de manera natural que tiene la siguiente estructura: Las secuencias utilizadas para la incorporación específica en el sitio de p-acetil-fenilalanina en hGH son la SEQ ID NO: 2 (hGH) y la SEQ ID NO: 4 (muttARN, M. jannaschii ARNtmTyrcuA) , y 16, 17 o 18 (TyrRS LW1, 5 o 6) descritas en el Ejemplo 2 anterior. Las secuencias utilizadas para la incorporación específica en el sitio de p-acetil-fenilalanina en hlFN son la SEQ ID NO: 24 (hlFN) , y la SEQ ID NO: 4 (muttARN), y 16, 17 o 18 (TyrRS LW1, 5 o 6) descritas en el Ej emplo 2 anterior .
Una vez modificada, la variante del polipéptido hlFN que comprende el aminoácido conteniendo carbonil se reactiva con un derivado PEG conteniendo aminooxi de la formula : R-PEG (N) -O- (CH2) n-0-NH2 en donde R es metil, n es 3 y ? es aproximadamente 5,000 MW. El hlFN purificado conteniendo p-acetilfenilalanina disuelto a 10 mg/ml en 25 mM MES (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 6.0, 25 M Hepes (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 7.0, o en 10 mM de acetato de sodio (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se reactiva con un exceso de 10 a 100 veces de PEG conteniendo aminooxi, y después se agita durante 10-16 horas a temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc., 1959 81, pp 475) . El PEG-hIFN se diluye entonces en un amortiguador apropiado para su inmediata purificación y análisis . Ej emplo 4 Conjugación con un PEG que consiste de un grupo hidroxilamina enlazado al PEG a través de un enlace amida. Un reactivo PEG que tiene la siguiente estructura se acopla a un aminoácido codificado no de manera natural conteniendo cetona utilizando el procedimiento descrito en el Ej emplo 3 : R-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) n-0-NH2 en donde R = metil, n=4 y N es aproximadamente 20,000 MW. La reacción, purificación y condiciones de análisis son como se describe en el Ejemplo 3. Ejemplo 5 Este ejemplo detalla la introducción de dos distintos aminoácidos codificado no de manera natural en polipéptidos hlFN. Este ejemplo demuestra un método para la generación de un polipéptido hGH que incorpora aminoácido codificado no de manera natural que comprende una funcionalidad cetona en dos posiciones entre los siguientes residuos: E30, E74, Y103, K38, K41, K140 y K145. El polipéptido hGH se prepara como se describió en los ejemplos 1 y 2 excepto que el codón de supresión se introduce en dos sitios distintos dentro del ácido nucleico. Ejemplo 6 Este ejemplo detalla la conjugación del polipéptido hlFN a un PEG conteniendo hidrazida y la subsecuente reducción in situ. Un polipéptido hlF? que incorpora un aminoácido conteniendo carbonil se prepara de acuerdo al procedimiento descrito en los Ejemplos 33 y 3. Una vez modificado, el PEG conteniendo hidrazida que tiene la siguiente estructura se conjuga al polipéptido hlFN: R-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) n-X-NH-NH2 en donde R = metil, n=2 y N=10,000 MW y X es un grupo carbonil (C=0) . El hlFN purificado que contiene p-acetilfenilalanina se disuelve a entre 0.1-10 mg/ml en 25 mM Mes (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 7.0, o en 10 mM de acetato de sodio (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se reactiva con un exceso de 1 a 100 veces de PEG conteniendo hidrazida, y la hidrazona correspondiente se reduce in situ mediante la adición de 1 M de ?aC?BH3 de reserva (Sigma Chemical, St . Louis, MO) , disuelto en H20, hasta una concentración final de 10.50 mM. Las reacciones se llevan a cabo en la oscuridad a 4°C a temperatura ambiente durante 18-24 horas. Las reacciones se detienen mediante adición de 1 M Tris (Sigma Chemical, St . Louis, MO) a aproximadamente pH 7.6 hasta una concentración final de Tris de 50 mM o diluidas en el amortiguador apropiado para purificación intermedia. Ej emplo 7 Este ejemplo detalla la introducción de un aminoácido que contiene alquino en un polipéptido hlF? y la derivatización con mPEG-azida. Los siguientes residuos, 35, 88, 92, 92, 94, 95, 99, 101, 131, 133, 134, 135, 136, 140, 143, 145 y 155 se sustituyen cada uno con el siguiente aminoácido codificado no de manera natural (hGH; SEQ ID ?O:2) : Las secuencias utilizadas para la incorporación específica en el sitio de p-propargil-tirosina en hGH son la SEQ ID NO: 2 (hGH) y la SEQ ID NO: 4 (muttARN, M. jannaschii ARNtmTyrCUA) y 9 , 10 o 11 descritas en el Ejemplo 2 anterior. Cualquiera de los residuos de hlFN identificados de acuerdo con el Ejemplo 32, incluyendo pero sin limitarse a 100, 106, 107, 108, 111, 113, 114 se sustituyen con este aminoácido codificado no de manera natural. Las secuencias utilizadas para la incorporación específica en el sitio de p-propargil-tirosina en hlFN son la SEQ ID NO: 24 (hlFN) , y la SEQ ID NO: 4 (muttARN, M. jannaschii ARNtmTyrcuA) / y 9, 10 o 11 descritas en el Ejemplo 2 anterior. El polipéptido hlF? que contiene la propargil tirosina se expresa en E . coli y se purifica utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 3. El hlF? purificado conteniendo propargil tirosina disuelto a entre 0.1-10 mg/ml en amortiguador PB (100 mM fosfato de sodio, 0.15 M de ?aCl, pH = 8) y un exceso de 10 a 1000 veces de un PEG conteniendo azida se agrega a la mezcla de reacción. Una cantidad catalítica de CuS0 y alambre de Cu se agrega entonces a la mezcla de reacción. Después de incubar la mezcla (incluyendo pero sin limitarse a, aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente o 37 °C, o durante la noche a 4°C) , se agrega H0 y la mezcla se filtra a través de una membrana de diálisis. La muestra puede analizarse entonces para la adición, incluyendo pero sin limitarse a, mediante procedimientos similares descritos en el Ejemplo 3. En este ejemplo, el PEG tendrá la siguiente estructura : R-PEG (N) -0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2)n-N3 en donde R es metil, n es 4 y N es 10,000 MW. Ej emplo 8 Este ejemplo detalla la sustitución de un aminoácido hidrófobo grande en un polipéptido hlFN con propargil tirosina. Un residuo Phe, Trp o Tyr presente dentro de una de las siguientes regiones de hGH: 1-5 (terminación N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el circuito A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, el circuito B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y la hélice D, el circuito C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (terminación C) (SEQ ID NO: 2) , se sustituye con el siguiente aminoácido codificado no de manera natural como se describe en el Ejemplo 7. De manera similar, un residuo Phe, Trp o Tyr presente dentro de una de las siguientes regiones de hlFN : 1-9 (terminación N) , 10-21 (hélice A) , 22-39 (región entre la hélice A y la hélice B) , 40-75 (hélice B) , 76-77 (región entre la hélice B y la hélice C) , 78-100 (hélice C) , 101-110 (región entre la hélice C y la hélice D) , 111-132 (hélice D) , 133-136 (región entre la hélice D y E) , 137-155 (hélice E) , 156-165 (terminación C) (como en la SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes de otros polipéptidos IF?) , se sustituye con el siguiente aminoácido codificado no de manera natural como se describe en el Ej emplo 7.
Una vez modificado, un PEG se une a la variante de polipéptido hlFN que comprende el aminoácido conteniendo alquino. El PEG tendrá la siguiente estructura: Me-PEG(N)-0- (CH2)2-N3 y los procedimientos de acoplamiento seguirán los del Ejemplo 7. Esto generará una variante de polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que es aproximadamente isoestérico con uno de los aminoácidos hidrófobos grandes de origen natural y que se modifica con un derivado PEG en un sitio distinto dentro del polipéptido. Ej emplo 9 Este ejemplo detalla la generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromultímero de polipéptido hlFN separado por uno o más enlazadores PEG. La variante de polipéptido hlF? que contiene alquino producida en el Ej emplo 7 se reactiva con un derivado PEG bifuncional de la forma: N3- (CH2) n-C (O) -NH- (CH2) a-O-PEG (N) -O- (CH2) 2NH-C (O) - (CH2) n-N3 en donde n es 4 y el PEG tiene un MW promedio de aproximadamente 5,000 para generar el homodímero de polipéptido hlF? correspondiente en donde las dos moléculas de hlFN se encuentran físicamente separadas por PEG. De una manera análoga un polipéptido hlF? puede acoplarse a uno o más polipéptidos diferentes para formar heterodímeros, homomultímeros, o heteromultímeros. El acoplamiento, purificación y análisis se llevará a cabo como en los E emplos 7 y 3. Ejemplo 10 Este ejemplo detalla el acoplamiento de un residuo sacárido para un polipéptido hlF?. Uno de los siguientes residuos se sustituye con el aminoácido no natural codificado siguiente: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 y 187 (hGH, SQ ID NO:2) - 75 - como se describe en el Ejemplo 3. De manera similar, un residuo de los siguientes se sustituye con el aminoácido no natural codificado siguiente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 (como en la SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes de otros polipéptidos IFN) .
Una vez modificada, la variante de polipéptido hlF? que comprende el aminoácidos conteniendo carbonil se reactiva con un análogo aminooxi b-enlazado de N-acetilglucosamina (GlcNAc) . La variante de polipéptido hlFN (10 mg/ml) y el sacárido aminooxi (21 mM) se mezclan en 100 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH 5.5) y se incuban a 37 °C durante 7 a 26 horas. Un segundo sacárido se acopla al primero enzimáticamente incubando el polipéptido hlFN conjugado a sacárido (5 mg/ml) con UDP-galactosa (16 M) y b- 1,4-galactosiltransferasa (0.4 unidades/ml) en 150 mM de amortiguador HEPES (pH 7.4) durante 48 horas a temperatura ambiente (Schanbacher et al., J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061) . Ejemplo 11 Este ejemplo detalla la generación de un antagonista de polipéptido hlFN PEGilado. Uno de los siguientes residuos, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 o 127 (hGH, SEQ ID NO : 2 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID N0:1 o 3) , se sustituye con el siguiente aminoácido codificado no de manera natural como se describe en el Ejemplo 3. Uno de los siguientes residuos, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 (hlFN, SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO:23 o 25), se sustituye con el siguiente aminoácido codificado no de manera natural como se describe en el Ejemplo 3; un polipéptido hlFN que comprende una de estas sustituciones puede actuar potencialmente como un antagonista débil o un agonista débil dependiendo del sitio seleccionado y la actividad deseada. Uno de los siguientes residuos, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, (hlFN; SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) se sustituye con el siguiente aminoácido codificado no de manera natural como se describe en el Ejemplo 3.
Una vez modificada, la variante del polipéptido hlFN que comprende el aminoácido conteniendo carbonil se reactivará con un derivado PEG conteniendo aminooxi de la forma : R-PEG (N) -0- (CH2)n-0-NH2 en donde R es metil, n es 4 y ? es 20,000 MW para generar un antagonista de polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que se modifica con un derivado PEG en un solo sitio dentro del polipéptido. El acoplamiento, purificación y análisis se llevan a cabo como en el Ejemplo 3. Ejemplo 12 Generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromultímero de polipéptido hlFN en el cual las moléculas hlFN se enlazan directamente Una variante de polipéptido hlFN que comprende el aminoácido que contiene alquino puede acoplarse directamente a otra variante de polipéptido hlF? que comprende el aminoácido que contiene azido, cada una de las cuales comprende sustituciones de aminoácido codificado no de manera natural en los sitios descritos en, pero sin limitarse a, Ejemplo 10. Esto generará el homodímero de polipéptido hlF? correspondiente en donde las variantes de polipéptido hlF? se encuentran físicamente unidas en la interfaz de enlace del sitio II. De manera análoga un polipéptido hlF? puede acoplarse a uno o más polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros. El acoplamiento, purificación y análisis se llevan a cabo como en los Ejemplos 3, 6, y 7. Ej emplo 13 PEG-OH+Br- (CH2)n-C=CR' ? PEG-O- (CH2)n-C=CR' A B El polialquileno glicol (P-OH) se reactiva con el alquil haluro (A) para formar el éter (B) . En estos compuestos, n es un entero de uno a nueve y R' puede ser un grupo alquilo o heteroalquilo Cl a C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado. R' también puede ser un alquil cíclico o heteroalquil cíclico de C3 a C7 saturado o insaturado, un grupo aril o heteroaril sustituido o no sustituido, o un grupo alcaril sustituido o no sustituido (el alquil es un alquil de Cl a C20 saturado o insaturado) o heteroalcaril . Típicamente, PEG-OH es polietileno glicol (PEG) o monometoxi polietileno glicol (mPEG) que tiene un peso molecular de 800 a 40,000 Daltons (Da) . Ejemplo 14 mPEG-OH+Br-CH2-C=CH ? mPEG-0-CH2-C=CH mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trató con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 ml) . Una solución de bromuro de propargil, disuelta como una solución al 80% por peso en xileno (0.56 ml, 5 mmol, 50 equiv. , ldrich) , y una cantidad catalítica de Kl se agregó entonces a la solución y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 2 horas. Se agregó entonces agua (1 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml) y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 anhidroso, y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . Esta solución de CH2C12 se agregó a dietil éter (150 ml) por goteo. El precipitado resultante se colectó, se lavó con varias porciones de dietil éter frío, y se secó para producir propargil-O-PEG. Ejemplo 15 mPEG-OH+Br- (CH2)3-C=CH ? mPEG-O- (CH2) 3-C=CH El mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trató con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 ml) . Se agregaron después a la - - mezcla cincuenta equivalentes de 5 -bromo- 1 -pent ina (0 . 53 ml , 5 mmol , Aldrich) y una cantidad catalítica de Kl . La mezcla resultante se calentó a refluj o durante 16 horas . Se agregó entonces agua (1 ml) y el solvente se retiró baj o vacío . Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml ) y la capa orgánica se separó , se secó sobre Na2S0 anhidroso, y el volumen se reduj o a aproximadamente 2 ml . Esta solución de CH2C12 se agregó a dietil éter (150 ml) por goteo . El precipitado resultante se colectó, se lavó con varias porciones de dietil éter frío, y se secó para producir el alquino correspondiente . Puede utilizarse 5-cloro-l-pentina en una reacción similar . Ej emplo 16 (1 ) m-HOCH2CsH4OH + NaOH + Br-CH2 -C=CH ? m-HOCH2C6H40-CH2-C=CH (2 ) m-HOCH2C6H40-CH2-C=CH + MsCl + N (Et) 3 ? m-MsOCH2C6H40-CH2-C=CH (3 ) m-MsOCH2CsH40-CH2-C=CH + LiBr ? m-BrCH2C6H40-CH2-C=CH (4 ) mPEG-OH + m-Br-CH2CeH40-CH2-C=CH ? mPEG-0-CH2CsH40-CH2-C=CH A una solución de 3-hidroxibenzilalcohol (2.4 g, 20 mmol) en THF (50 ml) y agua (2.5 ml) se agregó primero hidróxido de sodio en polvo (1.5 g, 37.5 mmol) y después una solución de bromuro de propargil, se disolvió como una solución al 80% por peso en xileno (3.36 ml, 30 mmol) . La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 6 horas. A la mezcla se agregó ácido cítrico al 10% (2.5 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. El residuo se extrajo con etil acetato (3 x 15 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaCl (10 ml) , se secaron sobre MgS0 y se concentraron para dar el alcohol 3-propargiloxibencílico . Se agregó cloruro de metanosulfonil (2.5 g, 15.7 mmol) y trietilamina (2.8 ml, 20 mmol) a una solución de un compuesto 3 (2.0 g, 11.0 mmol) en CH2C12 a 0°C y la reacción se colocó en el refrigerador durante 16 horas. Un procedimiento usual produjo el mesilato como un aceite amarillo claro. Este aceite (2.4 g, 9.2 mmol) se disolvió en THF (20 ml) y se agregó LiBr (2.0 g, 23.0 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 hora y después se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla se agregó agua (2.5 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. El residuo se extrajo con etil acetato (3 x 15 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaCl (10 ml) , se secaron sobre NaS04 anhidroso y se concentraron para dar el bromuro deseado. 20 kDa de mPEG-OH (1.0 g, 0.05 mmol, Sunbio) se disolvieron en THF (20 ml) y la solución se enfrió en un baño helado. Se agregó NaH (6 mg, 0.25 mmol) con agitación vigorosa durante un período de varios minutos seguido por la adición del bromuro obtenido anteriormente (2.55 g, 11.4 mmol) y una cantidad catalítica de Kl . El baño de enfriamiento se retiró y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 12 horas. Se agregó agua (1.0 ml) a la mezcla y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (25 ml) y la capa orgánica se separó, se secó bajo Na2S04 anhidroso y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . La adición por goteo a una solución de éter (150 ml) dio como resultado un precipitado blanco, que se colectó para producir el derivado PEG. Ejemplo 17 mPEG-NH2 + X-C (0) - (CH2) n-C=CR' ? mPEG-NH-C (0) - (CH2) n-C=CR' Los polímeros de poli (etileno glicol) conteniendo terminación alquino también pueden obtenerse acoplando un polímero de poli (etileno glicol) conteniendo un grupo funcional terminal, a una molécula reactiva conteniendo la funcionalidad alquino como se mostró anteriormente. n es entre 1 y 10. R' puede ser H o un pequeño grupo alquil de Cl a C4. Ejemplo 18 (1) H02C- (CH2)2-C=CH + NHS + DCC ? NHSO-C (O) - (CH2) 2-C=CH (2) mPEG-NH2 + NHSO-C (O) - (CH2) 2-C=CH ? mPEG-NH-C (O) - (CH2) 2-C=CH Se disolvió ácido 4-pentinoico (2.943 g, 3.0 mmol) en CH2C12 (25 ml) . Se agregó N-hidroxisuccinimida (3.80 g, 3.3 mmol) y DCC (4.66 g, 3.0 mmol) y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente . El éster 7 NHS crudo resultante se utilizó en la siguiente reacción sin - - purificación adicional . Se disolvió mPEG-NH2 con un peso molecular de 5,000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) en THF (50 ml) y la mezcla se enfrió a 4°C. se agregó éster 7 NHS (400 mg, 0.4 mmol) en porciones con agitación vigorosa. La mezcla se dejó agitar durante 3 horas mientras se calentó a temperatura ambiente . Se agregó entonces agua (2 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. Al residuo se agregó CH2C12 (50 ml) y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S04 anhidroso, y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . Esta solución de CH2C12 se agregó a éter (150 ml) por goteo. El precipitado resultante se colectó y se secó in vacuo. Ejemplo 19 Este ejemplo representa la preparación del metano sulfonil éster de poli (etileno glicol), que también puede referirse como metanosulfonato o mesilato de poli (etileno glicol) . El tosilato y los haluros correspondientes pueden prepararse mediante procedimientos similares. MPEG-OH + CH2S02C1 + ?(Et)3 ? mPEG-0-S02CH3 ? mPEG-?3 El mPEG-OH (MW = 3,400, 25 g, 10 mmol) en 150 ml de tolueno se destiló azeotrópicamente durante 2 horas bajo nitrógeno y la solución se enfrió a temperatura ambiente. Se agregaron a la solución 40 ml de CH2C12 seco y 2.1 ml de trietilamina seca (15 mmol) . La solución se enfrió en un baño helado y se agregaron por goteo 1.2 ml de cloruro de metanosulfonil destilado (15 mmol) . La solución se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante la noche y la reacción se sació agregando 2 ml de etanol absoluto. La mezcla se evaporó bajo vacío para retirar solventes, principalmente los diferentes a tolueno, se filtró, se concentró de nuevo bajo vacío y después se precipitó en 100 ml de dietil éter. El filtrado se lavó con varias porciones de dietil éter frío y se secó in vacuo para producir el mesilato. El mesilato (20 g, 8 mmol) se disolvió en 75 ml de THF y la solución se enfrió a 4°C. A la solución fría se agregó azida de sodio (1.56 g, 24 mmol). la reacción se calentó a reflujo bajo nitrógeno durante 2 horas. Los solventes se evaporaron entonces y el residuo se diluyó con CH2C1 (50 ml) . La fracción orgánica se lavó con solución de NaCl y se secó sobre MgS04 anhidroso. El volumen se redujo a 20 ml y el producto se precipitó mediante adición de 150 ml de éter frío seco. E emplo 20 (1) ?3-CeH4-C02H ? N3-C6H4CH2OH (2) ?3-C3H4-CH20H ? Br-CH2-C6H4N3 (3) mPEG-OH + Br-CH2-C6H4-N3 ? mPEG-0-CH2-C6H4N3 Un alcohol 4-azidobencílico puede producirse utilizando el método descrito en la Patente de E.U. 5,998,595, que se incorpora por la referencia en la presente.
Se agregó cloruro de metanosulfonilo (2.5 g, 15.7 mmol) y trietilamina (2.8 ml, 20 mmol) a una solución de alcohol 4-azidobencílico (1.75 g, 11.0 mmol) en CH2C12 a 0°C y la reacción se colocó en el refrigerador durante 16 horas. Un procedimiento usual produjo el mesilato como un aceite amarillo claro. Este aceite (9.2) mmol se disolvió en THF (20 ml) y se agregó LiBr (2.0 g, 23.0 mmol). la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 1 hora y después se enfrió a temperatura ambiente . A la mezcla se agregó agua (2.5 ml) y el solvente se retiró bajo vacío. El residuo se extrajo con etil acetato (3 x 15 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaCl (10 ml) , se secaron sobre Na2S04 anhidroso y se concentraron para dar el bromuro deseado. 20 kDa de mPEG-OH (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trataron con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 ml) y se agregó bromuro (3.32 g, 15 mmol) a la mezcla conjuntamente con una cantidad catalítica de Kl . La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 12 horas. Se agregó agua (1.0 ml) a la mezcla y la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2S0 anhidroso y el volumen se redujo a aproximadamente 2 ml . La adición por goteo a una solución de éter (150 ml) dio como resultado un precipitado, que se colectó para producir mPEG-0-CH2-C6H4-N3. Ejemplo 21 NH2-PEG-0-CH2CH2C02H + N3-CH2CH2C02-NHS ? N3-CH2CH2-C (O) NH-PEG-O-CH2CH2C02H NH2-PEG-0-CH2CH2C02H (MW 3,400 Da, 2.0 g) se disolvió en una solución saturada acuosa de ?aHC03 (10 ml) y la solución se enfrió a 0°C. Se agregó 3-azido-l-N-hidroxisuccinimido propionato (5 equiv.) con agitación vigorosa. Después de 3 horas, se agregaron 20 ml de H20 y la mezcla se agitó durante 45 minutos adicionales a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 3 con 0.5 ? de H2S04 y se agregó NaCl a una concentración de aproximadamente 15 % por peso. La mezcla de reacción se extrajo con CH2C12 (100 ml x 3) , se secó sobre ?a2S04 y se concentró. Después de la precipitación con dietil éter frío, el producto se colectó mediante filtración y se secó bajo vacío para producir el derivado PEG de omega-carboxi-azida. Ejemplo 22 mPEG-OMs +HC=CLi ? mPEG-0-CH2-CH2-C=C-H A una solución de litio acetilida (4 equiv.) preparada como se conoce en la técnica y enfriada a -78 °C en THF, se agregó por goteo una solución de mPEG-OMs disuelta en THF con agitación vigorosa. Después de 3 horas, se permitió que la reacción se calentara a temperatura ambiente y se sació con la adición de 1 ml de butanol. 20 ml de H0 se agregaron entonces y la mezcla se agitó durante 45 minutos adicionales a temperatura ambiente. El pH se ajustó a 3 con 0.5 N de H2S04 y se agregó NaCl a una concentración de aproximadamente 15 % por peso. La mezcla de reacción se extrajo con CH2C12 (100 ml x 3), se secó sobre Na2S0 y se concentró. Después de la precipitación con dietil éter frío, el producto se colectó mediante filtración y se secó bajo vacío para producir el 1- (but-3-iniloxi) -metoxipolietileno glicol (mPEG) . Ejemplo 23 Los aminoácidos conteniendo azida y acetileno se incorporaron selectivamente en el sitio en proteínas utilizando los métodos descritos en L. Wang et al., (2001), Science 292:498-500, J. W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin & P. G. Schultz (2002), Chem. BioChem. 11:1135-1137; J. W. Chin et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y L.
Wang & P. G. Schultz (2002), Chem. Comm., 1-10. Una vez incorporados los aminoácidos, la reacción de cicloadición se llevó a cabo con 0.01 mM de proteína en amortiguador de fosfato (PB) , pH 8, en presencia de 2 mM de derivado PEG, 1 mM de CuS04 y -1 mg de alambre de Cu durante 4 horas a 37 °C. Ejemplo 24 Este ejemplo describe la síntesis de p-acetil-D,L-fenilalanina (pAF) y derivados de m-PEG-hidroxilamina. El pAF racémico se sintetizó utilizando el procedimiento previamente descrito en Zhang, Z. Smith, B.A.C., Wang L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P.G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746. Para sintetizar el derivado de m-PEG-hidroxilamina, se completaron los siguientes procedimientos . A una solución de ácido (N-T-Boc-aminooxi) acético (0.382 g, 2.0 mmol) y 1,3-diisopropilcarbodiimida (0.16 ml, 1.0 mmol) en diclorometano (DCM, 70 ml) , que se agitó a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora, se agregó metoxi-polietileno glicol amina (m-PEG-NH2, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt . 30 K, de BioVectra) y diisopropiletilamina (0.1 ml, 0.5 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y después se concentró a aproximadamente 100 ml . La mezcla se agregó por goteo a éter frío (800 ml) . El producto t-Boc-protegido se precipitó y se colectó mediante filtración, lavado con éter 3 x 100 ml . Se purificó adicionalmente re-disolviendo en DCM (100 ml) y se precipitó en éter (800 ml) dos veces. El producto se secó en vacío produciendo 7.2 g (96%), confirmado mediante ?MR y prueba ?ihydrin. El deBoc del producto protegido (7.0 g) obtenido anteriormente, se llevó a cano en TFA al 50%/DCM (40 ml) a 0°C durante 1 hora y después a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de retirar la mayor parte del TFA al vacío, la sal de TFA del derivado de hidroxilamina se convirtió en la sal de HCl agregando 4N de HCl en dioxano (1 ml) al residuo. El precipitado se disolvió en DCM (50 ml) y se re-precipitó en éter (800 ml) . El producto final (6.8 g, 97%) se colectó mediante filtración, se lavó con éter 3 x 100 ml, se secó al vacío, y se almacenó bajo nitrógeno. Se sintetizaron otros derivados PEG (5 K, 20 K) de hidroxilamina utilizando el mismo procedimiento. Ejemplo 25 Este ejemplo describe los métodos de expresión y purificación utilizados para polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural. Las células huésped se han transformado con ARNt ortogonal, aminoacil ARNt sintetasa ortogonal y estructuras hGH. Una pequeña cantidad de una reserva de glicerol congelado de las células DH10B(fis3) transformadas se cultivó primero en 2 ml de medio definido (medio mínimo de glucosa suplementado con leucina, isoleucina, metales de rastro, y vitaminas) con 100 µg/ml de ampicilina a 37 °C. cuando el ODsoo alcanzó 2-5, 60 µl se transfirieron a 60 ml de medio definido fresco con 100 µg/ml de ampicilina y de nuevo se cultivó a 37 °C hasta un OD6oo de 2-5. 50 ml del cultivo se transfirieron a 2 litros de medio definido con 100 µg/ml de ampicilina en un fermentador de 5 litros (Sartorius BBl) . El pH del fermentador se controló a un pH 6.9 con carbonato de potasio, la temperatura a 37°C, la relación de flujo de aire a 5 lpm, y la espuma con el desespumante de polialquileno KFO - F119 (Lubrizol) . Las velocidades del agitador se ajustaron automáticamente para mantener niveles de oxígeno disuelto =30% y se utilizó oxígeno puro para suplementar el rocío de aire si las velocidades del agitador alcanzaran su valor máximo. Después de 8 horas a 37 °C, el cultivo se alimentó con concentrado 50X del medio definido a una relación exponencialmente aumentada para mantener una relación de crecimiento específica de 0.15 horas"1. Cuando el OD6oo alcanzó aproximadamente 100, se agregó una mezcla racémica de para-acetil-fenilalanina hasta una concentración final de 3.3 mM, y la temperatura disminuyó a 28°C. después de 0.75 horas, se agregó isopropil-b-D-tiogalactopiranosida hasta una concentración final de 0.25 mM. Las células se cultivaron 8 horas adicionales a 28 °C, se granularon y se congelaron a -80 °C hasta procesamiento posterior. Las proteínas hGH mutantes marcadas His se purificaron utilizando la ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen, Carisbad, CA) a través de los procedimientos estándar de purificación de proteína marcada His proporcionados por el manual de instrucciones de Invitrogen, seguido por una columna de intercambio de anión. El hGH purificado se concentró a 8 mg/ml y se intercambió el amortiguador al amortiguador de reacción (20 mM acetato de sodio, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 4.0). se agregó polvo de MPEG-oxiamina a la solución de hGH a una relación molar de 20:1 de PEG:hGH. La reacción se llevó a cabo a 28 °C durante 2 días con agitación suave. El PEG-hGH se purificó a partir de PEG no reactivado y hGH a través de una columna de intercambio de anión. La calidad de cada hGH mutante PEGilado se evaluó mediante tres análisis antes de entrar a experimentos animales. La pureza del PEG-hGH se examinó introduciendo un gel de acrilamida NuPAGE Bis-Tris al 4-12% con amortiguador introducido MES SDS bajo condiciones no reductoras (Invitrogen). Los geles se colorearon con azul de Coomassie. La banda PEG-hGH fue mayor que 95% pura en base a exploración de densitometría. El nivel de endotoxina en cada PEG-hGH se analizó mediante un análisis LAL utilizando el equipo KTA2 de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) , y fue menor que 5 EU por dosis . La actividad biológica del PEG-hGH se estableció con el bioanálisis IM-9 pSTAT5 (mencionado en el Ejemplo 2) , y el valor EC50 fue menor que 15 nM. Ejemplo 26 Este ejemplo describe métodos para evaluar la purificación y homogeneidad de polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural . La Figura 8 es un SDS-PAGE de polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural en la posición 92. Los campos 3, 4, y 5 del gel muestran hGH comprendiendo una p-acetil-fenilalanina en la posición 92 covalentemente unida ya - sea a una molécula PEG de 5 kDA, 20 kDA o 30 kDA. En la Figura 11 se muestran polipéptidos hGH adicionales que comprenden un aminoácido no natural PEGilado. Cinco µg de cada proteína PEG-hGH se cargaron sobre SDS-PAGE. Figura 11, Panel A; Campo 1, marcador de peso molecular; campo 2, estándar de referencia WHO rhGH (2 µg) ; campos 3 y 7, 30 KPEG-F92pAF; campo 4, 30 KPEG-Y35pAF; campo 5, 30 KPEG-R134pAF; campo 6, 20 KPEG-R134pAF; campo 8, estándar de referencia WHO rhGH (20 µg) . Figura 11, Panel B; Campo 9, marcador de peso molecular; campo 10, estándar de referencia WHO rhGH (2 µg) ; campo 11, 30 KPEG-F92pAF; campo 12, 30 KPEG-K145pAF; campo 13, 30 KPEG-Y143pAF; campo 14, 30 KPEG-G131pAF; campo 15, 30 KPEG-F92pAF/G120R, campo 16 estándar de referencia WHO rhGH (20 µg) . la Figura 9 muestra la actividad biológica de polipéptidos hGH PEGilados ( PEG de 5 kDa, 20 kDa o 30 kDa) en células IM-9; los métodos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 2. La pureza del conjugado hGH-PEG puede establecerse mediante degradación proteolítica (incluyendo pero sin limitarse a división de tripsina) seguido por un análisis de espectrometría de masa. Pepinsky B., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther., 297 (3) :1059-66 (2001). Los métodos para efectuar digestiones trípticas también se describen en la European Pharmacopeia (2002) 4a Edición, pp. 1938) . Se efectuaron modificaciones a los métodos descritos. Las muestras se - dializaron durante la noche en 50 mM de TRIS-HCl, pH 7.5. Los polipéptidos rhGH se incubaron con tripsina (tripsina tratada con TPCK, Worthington) a una relación de masa de 66:1 durante 4 horas en un baño de agua a 37 °C. las muestras se incubaron en hielo durante varios minutos para detener la reacción de digestión y subsecuentemente se mantuvieron a 4°C durante el análisis HPLC. Las muestras digeridas (-200 µg) se cargaron sobre una columna de 25 x 0.46 cm Vydac C-8 (tamaño de perla 5 µm, tamaño de poro 100 Á) en ácido trifluoroacético al 0.1% y se eluyeron con un gradiente de 0 a 80% de acetonitrilo durante 70 minutos a una relación de flujo de 1 ml/min a 30 °C. La elución de péptidos trípticos se monitoreó mediante absorbencia a 214 nm. La Figura 10 Panel A ilustra la estructura primaria del hGH con los sitios de división tripsina indicados y la sustitución del aminoácido no natural, F92pAF, especificada con una flecha (Figura modificada de Becker et al . , Biotechnol. Appl. Biochem. (1988) 10 (4) : 326-337) . El Panel B muestra mapas trípticos superpuestos de péptidos generados a partir de un polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado no de manera natural PEGilado (PEG de 30 K His6-F92pAF rhGH, marcado A) , péptidos generados a partir de un polipéptido hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural (His6-F92pAF rhGH, marcado B) , y péptidos generados a partir de hGH de tipo silvestre (WHO rhGH, - marcado C) . La comparación de los mapas trípticos de WHO rhGH y His6-F92pAF rhGH revela solo dos deslizamientos de pico, pico de péptido 1 y pico de péptido 9, y los picos restantes son idénticos. Estas diferencias ocasionadas por la adición del His6 en la terminación N del his6-F92pAF rhGH, dando como resultado el deslizamiento del pico 1; mientras que el desplazamiento en el pico 9 es ocasionado por la sustitución de fenilalanina en el residuo 92 con p-acetil-fenilalanina. Panel C - Se muestra una magnificación del pico 9 desde el Panel B. La comparación de His6-F92pAF y los mapas trípticos de PEG de 30 K Hiss-F92pAF revela la desaparición del pico 9 a la pegilación de His6-F92pAF confirmando así que la modificación es específica al péptido 9. Ejemplo 27 Este ejemplo describe un homodímero formado de dos polipéptidos hGH comprendiendo cada uno un aminoácido no natural . La Figura 12 compara los resultados del análisis IM-9 a partir de un polipéptido hGH marcado His que comprende una sustitución p-acetil-fenilalanina en la posición 92 con un homodímero de ese polipéptido modificado unido con en enlazador bifuncional que tiene grupos bifuncionales y reactividad como se describe en el Ejemplo 25 para PEGilación de hGH.
- Ejemplo 28 Este ejemplo describe un polipéptido hGH monómero y dímero que actúa como un antagonista hGH. Una muteína hGH en la cual se ha introducido una sustitución G120R en el sitio II es capaz de enlazarse un solo receptor hGH, pero es incapaz de dimerizar dos receptores. La muteína actúa como un antagonista hGH in vitro, presumiblemente ocupando sitios receptores sin activar las trayectorias de señalización intracelular (Fuh, G., et al., Science 256:1677-1680 (1992)). La Figura 13, Panel A muestra datos del análisis IM-9 que miden la fosforilación de pSTAT5 mediante hGH con la sustitución G120R. Un polipéptido hGH con un aminoácido no natural incorporado en la misma posición (G120) dio como resultado una molécula que actúa también como un antagonista hGH, como se muestra en la Figura 13, Panel B. Un dímero del antagonista hGH mostrada en la Figura 13 , Panel B se construyó unido con un enlazador bifuncional que tiene grupos funcionales y reactividad como se describe en el Ejemplo 25 para PEGilación de hGH. La Figura 14 muestra que este dímero también carece de actividad biológica en el análisis IM-9. Se llevaron a cabo análisis adicionales comparando el polipéptido hGH que comprende la sustitución G120pAF con un dímero de polipéptidos hGH G120pAF modificados unidos por un enlazador PEG. La fosforilación inducida WHO hGH de STAT5 - compitió con un rango de respuesta a la dosis del monómero y el dímero unidos por un enlazador PEG. También se llevaron a cabo estudios competitivos de receptor de superficie mostrando que el monómero y el dímero compiten con GH por el enlace de receptor de superficie celular en IM-9 y GHR de rata (L43R) /células BAF3. El dímero actuó como un antagonista más potente que el monómero. La Tabla 4 muestra los datos de estos estudios .
Ejemplo 29 Este ejemplo detalla la medición de la actividad hGH y la afinidad de polipéptidos hGH para el receptor hGH. Clonación y purificación del receptor GH de rata. El dominio extracelular del receptor GH de rata (GHR ECD, - aminoácidos S29-T238) se clonó en el vector pET20b (Novagen) entre los sitios Nde I y Hind III en marco con la marca 6His de terminación C. Una mutación de L43 a R se introdujo para aproximar adicionalmente el sitio de enlace del receptor GH humano (Souza et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1995) 92 (4) : 959-63) . La proteína recombinante se produjo en células BL21(DE3) de E. coli (Novagen) mediante inducción con 0.4 mM IPTG a 30 °C durante 4-5 horas. Después de lisar las células, la pildora se lavó cuatro veces resuspendiendo en un dounce con 30 ml de 50 mM de Tris, pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM de EDTA, 1% Tritón X-100, y dos veces con el mismo amortiguador sin Tritón X-100. En este punto los cuerpos de inclusión consistieron de más del 95% de GHR ECD y se solubilizaron en 0.1 M de Tris, pH 11.5, 2M urea. El repliegue se logró pasando un alícuota de la solución del cuerpo de inclusión a través de una columna de filtración de gel SlOO (Sigma), equilibrada con 50 mM de Tris, pH 7.8, 1 M de L-arginina, 3.7 mM de cisteína, 6.5 mM de cisteamina. Las fracciones conteniendo proteína soluble se combinaron y dializaron contra 50 mM de Tris, pH 7.6, 200 mM de NaCl, 10% glicerol. La muestra se centrifugó brevemente para retirar cualquier precipitado y se incubó con un alícuota de resina Talón (Clontech) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. después de lavar la resina con 20 volúmenes de amortiguador de diálisis suplementado con 5 mM de imidazol, - la proteína se eluyó con 120 mM de imidazol en amortiguador de diálisis. Finalmente, la muestra se dializó durante la noche contra 50 mM ' de Tris, pH 7.6, 30 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10% glicerol, se centrifugó brevemente para retirar cualquier precipitado, se ajustó a una concentración final de 20% glicerol, se alicuotó y se almacenó a -80°C. La concentración de la proteína se midió mediante OD(280) utilizando un coeficiente de extinción calculado de e = 65,700 M"1*cm":L. Análisis de enlace Biocore™ de GH a GHR Aproximadamente 600-800 RUs de GHR ECD soluble se inmovilizaron en un chip Biacore™ CM5, utilizando un procedimiento estándar de acoplamiento amina, según la recomendación del fabricante. Aunque una significativa porción del receptor se desactivó mediante esta técnica, se encontró experimentalmente que este nivel de inmovilización fue suficiente para producir una máxima respuesta de enlace GH específica de aproximadamente 100-150 RUs, sin cambio notable en la cinética de enlace. Ver, e.g., Cunningham et al., J. Mol. Biol. (1993) 234 (3) :554-63 y Wells J.A. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1996) 93(1) :l-6). Se inyectaron diversas concentraciones de GH de tipo silvestre o mutante (0.1 - 300 nM) en amortiguador HBS-EP (Biacore™, Pharmacia) sobre la superficie GHR a una relación de flujo de 40 µl/min durante 4.5 minutos, y la - disociación se monitoreó durante 15 minutos post-inyección. La superficie se regeneró mediante un impulso de 15 segundos de 4.5 M de MgCl2. Se observó solo una mínima pérdida de afinidad de enlace (1-5%) después de al menos 1000 ciclos de regeneración. La célula de referencia sin receptor inmovilizado se utilizó para sustraer cualquier efecto de volumen de amortiguador y enlace no específico. Los datos de enlace cinético obtenidos de experimentos de titulación de GH se procesaron con software BiaEvaluation 4.1 (BIACORE™) . El modelo de asociación de "analito bivalente" proporcionó un ajuste satisfactorio (valores chi2 generalmente por debajo de 3) , de acuerdo con la dimerización secuencial 1:2 propuesta (GH:GHR) (Wells J.A.
Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1996) 93(l):l-6). Las constantes de disociación de equilibrio (Kd) se calcularon como relaciones de constantes de relación individuales (k0ff/kon) - La Tabla 5 indica los parámetros de enlace de Biacore™ utilizando GHR ECD de rata (L43R) inmovilizado en un chip CM5.
Líneas Celulares GHR Estables La línea celular de ratón dependiente de IL-3, BAF3 , se pasó rutinariamente en RPMl 1640, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina, suero fetal bovino al 10% desactivado con calor, 50 uM de 2-mercaptoetanoi y medio acondicionado de la línea celular WEHI-3 al 10% como fuente de IL-3. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5%. La línea celular BAF3 se utilizó para establecer el clon de célula estable del GHR de rata (L43R) , 2E2-2B12-F4. Brevemente, células BAF3 mid-confluentes 1X107 se electroporaron con 15 µg de plásmido linealizado pcDNA3.1 conteniendo el ADNc de GHR de rata de longitud total (L43R) . las células transfectadas se dejaron recuperar durante 48 horas antes de clonarse limitando la dilución en medio conteniendo 800 µg/ml de G418 y 5 nM de WHO hGH. Los transfectantes que expresan GHR se identificaron mediante coloración de superficie con anticuerpo contra GHR humano (R&D Systems, Minneapolis, M?) y se analizaron en una disposición FACS (BD Biosciences, San Diego, CA) . Los - - transfectantes que expresan un buen nivel de GHR se exploraron entonces por actividad proliferativa contra WHO hGH en un análisis de proliferación BrdU (como se describe abajo) . Los clones de célula GHR de rata (L43R) transfectados establemente se establecieron con dos rondas adicionales de sub clonación repetida de los transfectantes deseados en presencia de 1.2 mg/ml de G418 y 5 nM de hGH con perfilado constante por expresión del receptor de superficie y capacidad proliferativa. El clon celular, 2E2-2B12-F4, establecido de esta manera se mantiene rutinariamente en medio BAF3 más 1.2 mg/ml de G418 en ausencia de hGH. Proliferación mediante marcación BrdU El GHR (L43R) de rata extenuado de suero que expresa la línea celular BAF3 , 2E2-2B12-F4, se emplacó a una densidad de 5 x 104 células/pozo en una placa de 96 pozos. Las células se activaron con un rango de dosis de 12 puntos de proteínas hGH y se marcaron al mismo tiempo con 50 µM de BrdU (Sigma, St . Louis, MO) . Después de 48 horas en cultivo, las células se fijaron/permeabilizaron con 100 ul de solución BD cytofix/cytoperm (BD Biosciences) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para exponer los epítopes BrdU, se trataron células fijas/permeabilizadas con 30 µg/pozo de Dnasa (Sigma) durante 1 hora a 37 °C. La coloración inmunofluorescente con anticuerpo APC-con ugado anti-BrdU (BD Biosciences) permitió el análisis de muestra en la - - disposición FACS. La Tabla 6 muestra la bioactividad de mutantes PEG hGH perfilada en los análisis de proliferación pSTAT5 (IM-9) y BrdU. WHO hGH se expresa como unidad para la comparación entre análisis. TABLA 6 hGH PSTAT5 EC50 (nM) Proliferación EC50 (nM) WHO WT 1.0 1.0 Y35pAF 1.3 1.6 + 0.8 (n=3) Y35pAF-30KPEG 10 5.4 + 2.8 (n=4) Y35pAF-40KPEG 53.3 24.0 + 11 0 (n=3) F92pAF 2.2 ± 0.4 (n=9) 1.4 + 0.7 (n=4) F92pAF-5KPEG 5.1 + 0.4 (n=3) ND F92pAF-20KPEG 10.5 + 0.8 (n=3) ND F92pAF-30KPEG 8.8 ± 1.2 (n=8) 4.1 ± 0.9 (n=3) F92pAF/G120R >200,000 >200,000 F92pAF/G120R >200,000 >200,000 30KPEG G131pAF 2.3 ± 1.8 (n=2) 2.1 ± 1.1 (n=3) G131pAF-30KPEG 23.8 ± 1.7 (n=2) 4.6 ± 2.4 (n=3) R134pAF 1.1 ± 0.2 (n=2) 1.7 + 0.3 (n=3) R134pAF-30KPEG 5.3 ND R134pAF-30KPEG 11.3 ± 1.1 (n=2) 2.5 ± 0.7 (n=4) Y143pAF 1.6 ± 0.1 (n=2) 1.8 + 0.6 (n=2) Y143pAF-30KPEG 12.3 ± 0.9 (n=2) 6.6 + 2.7 (n=3) Ejemplo 30 Este ejemplo describe métodos para medir la actividad in vitro e in vivo de hGH PEGilado. Análisis de Enlace Celular Se incubaron células (3 x 106) en duplicado en PBS/BSA al 1% (100 µl) en ausencia o presencia de diversas concentraciones (volumen: 10 µl) de GH, hGH o GM-CSF no marcado y en presencia de 125I-GH (aproximadamente 100,000 cpm o 1 ng) a 0°C durante 90 minutos (volumen total: 120 µl) . Las células se resuspenden entonces y se colocan sobre 200 µl de PCS helado en un tubo de centrífuga plástico de 350 µl y se centrifugan (1000 g: 1 minuto) . La pildora se colecta cortando el extremo del tubo y la pildora y el sobrenadante se cuentan por separado en un contador gama (Packard) . El enlace específico (cpm) se determina como el enlace total en ausencia de un enlace menor (cpm) competidor (media de duplicados) en presencia de un exceso de 100 veces de GH no marcado (enlace no específico) . El enlace no específico se mide para cada uno de los tipos de célula utilizados. Los experimentos se realizan en días separados utilizando la misma preparación de 125I-GH y deben mostrar consistencia interna. 125I-GH demuestra el enlace a las células que producen el receptor GH. El enlace se inhibe de manera dependiente de dosis mediante GH o hGH natural no marcado, pero no mediante GM-CSF u otro control negativo. La capacidad del hGH para competir por el enlace de 125I-GH natural, similar al GH natural, sugiere que los receptores reconocen ambas formas igualmente bien. Estudios in vivo de hGH PEGilado Se administra una solución de PEG-hGH, hGH no modificado y amortiguador a ratones o ratas . Los resultados mostrarán actividad superior y vida media prolongada del hGH PEGilado de la presente invención en comparación con hGH no modificado que se indica por un aumento significativo del peso corporal . Medición de la vida media in vivo de hGH conjugado y no conjugado y sus variantes Toda la experimentación animal se condujo en una instalación acreditada AAALAC y bajo protocolos aprobados por el Institutional -Animal Care and Use Committee of St . Louis University. Las ratas se alojaron individualmente en jaulas en habitaciones con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionó a los animales acceso a alimento para roedores Purina 5001 certificado y agua ad libitum. Para ratas hipofisectomizadas, el agua potable contenía adicionalmente glucosa al 5%. Estudios farmacocinéticos La calidad de cada hGH mutante PEGilado se evaluó - mediante tres análisis antes de entrar a experimentos animales. La pureza del PEG-hGH se examinó introduciendo un gel de acrilamida NuPAGE Bis-Tris al 4-12% con amortiguador introducido MES SDS bajo condiciones no reductoras (Invitrogen, Carisbad, CA) ) . Los geles se colorearon con azul de Coomassie. La banda PEG-hGH fue mayor que 95% pura en base a exploración de densitometría. El nivel de endotoxina en cada PEG-hGH se analizó mediante un análisis de cinética LAL utilizando el equipo KTA2 de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) , y fue menor que 5 EU por dosis. La actividad biológica del PEG-hGH se estableció con el bioanálisis IM-9 pSTAT5 (descrito en el Ejemplo 2) , y el valor EC50 se confirmó menor que 15 nM. Las actividades farmacocinéticas de los compuestos de hormona de crecimiento modificados con PEG se compararon entre sí y con hormonas de crecimiento no PEGiladas en ratas macho Sprague-Dawley (261-425g) obtenidas de Charles River Laboratories . Los catéteres se instalaron quirúrgicamente en la arteria carótida para recolección de sangre. Después de la instalación exitosa del catéter, se asignaron grupos de tratamiento a los animales (tres a seis por grupo) previo a la dosificación. Se dosificó a los animales de manera subcutánea con 1 mg/kg del compuesto en un volumen de dosis de 0.41-0.55 ml/kg. Se colectaron muestras de sangre en varios puntos de tiempo a través de un catéter alojado y dentro de tubos de microfuga recubiertos con EDTA. Se colectó plasma después de la centrifugación y se almacenó a -80°C hasta el análisis. Las concentraciones de compuesto se midieron utilizando equipos ELISA sandwich de anticuerpo de hormona de crecimiento ya sea de BioSource International (Camarillo, CA) o Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) . Las concentraciones se calcularon utilizando estándares correspondientes al análogo que se dosificó. Los parámetros farmacocinéticos se estimaron utilizando el programa de modelado WinNonlin (Pharsight, versión 4.1). Se utilizó análisis no compartimental con integración trapezoidal lineal ascendente/tronco descendente y los datos de concentración se pesaron uniformemente . La Figura 15 muestra las concentraciones medias en plasma (+/- S.D.) después de una sola dosis en ratas. Se dio a las ratas (n=3-4 por grupo) una dosis única en volumen de 1 mg/kg de proteína hGH de tipo silvestre (WHO hGH) , polipéptido hGH marcado His (his-hGH) , o polipéptido hGH marcado His comprendiendo el aminoácido no natural p-acetil-fenilalanina en la posición 92 covalentemente enlazado a 30 kDA PEG (30 kPEG-pAF92 (his) hGH) . Las muestras en plasma se tomaron durante los intervalos de tiempo indicados y se analizaron por el compuesto inyectado como se describe. El 30KPEG-pAF92 (his) hGH tiene una circulación dramáticamente extensa en comparación con el hGH de control.
- - La Figura 16 muestra las concentraciones medias en plasma (+/. S.D.) después de una sola dosis subcutánea en ratas. Se dio a las ratas (n=3-6 por grupo) una dosis única en volumen de 1 mg/kg de proteína. Los polipéptidos hGH comprendiendo el aminoácido no natural p-acetil-fenilalanina covalentemente enlazados a 30 kDA PEG en cada una de las seis diferentes posiciones se compararon con WHO hGH y (hís) -hGH. Las muestras en plasma se tomaron durante los intervalos de tiempo indicados y se analizaron por el compuesto inyectado como se describe. La Tabla 7 muestra los valores de parámetro farmacocinético para administración de dosis única de los polipéptidos hGH mostrados en la Figura 16. Se evaluaron las curvas de concentración vs tiempo mediante análisis no compartimental (Pharsight, versión 4.1). los valores mostrados son promedios (+/- desviación estándar) . Cmax: concentración máxima; terminal tl/2: vida media terminal; AUC0>inf: área bajo la curva de concentración-tiempo extrapolada a infinidad; MRT: tiempo medio de residencia; Cl/f: limpieza aparente total de plasma; Vz/f: aparente volumen de distribución durante la fase terminal. Tabla 7 : Valores de parámetro farmacocinético para administración subcutánea en volumen de dosis única de 1 mg/kg en ratas macho Sprague-Dawley normales.
Estudios farmacodinámicos Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley hipofisectomizadas de Charles River Laboratories. Las pituitarias se retiraron quirúrgicamente a las 3-4 semanas de edad. Se dejó aclimatar a los animales durante un período de tres semanas, tiempo durante el cual se monitoreó el peso corporal . Los animales con un aumento en el peso corporal de 0-8 g durante un período de siete días antes de iniciar el estudio se incluyeron y se aleatorizaron para grupos de tratamiento. Se administró a las ratas ya sea una dosis en - volumen o una dosis diaria de manera subcutánea. A lo largo del estudio las ratas se pesaron diaria y secuencialmente, se anestesiaron, se sangraron y se dosificaron (cuando fue aplicable) . Se colectó sangre del seno orbital utilizando un tubo capilar heparinizado y se colocó en un tubo de microfuga recubierto con EDTA. Se aisló el plasma mediante centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. La Figura 17 muestra las concentraciones medias en plasma (+/- S.D.) después de una sola dosis subcutánea en ratas hipofisectomizadas . Se dio a las ratas (n=5-7 por grupo) una sola dosis en volumen de 2.1 mg/kg de proteína. Se muestran los resultados de polipéptidos hGH que comprenden el aminoácido no natural p-acetil-fenilalanina covalentemente enlazada a PEG de 20 kDA en cada una de las dos diferentes posiciones (posición 35, 92) . Las muestras de plasma se tomaron durante intervalos de tiempo indicados y se analizaron por el compuesto inyectado como se describió. El péptido IGF-1 es un miembro de la familia de somatomedinas o factores de crecimiento similares a insulina. El IGF-1 media muchos de los efectos promotores del crecimiento de la hormona de crecimiento. Las concentraciones de IGF-1 se midieron utilizando un equipo de inmunoanálisis competitivo de enlace de enzima contra los estándares proporcionados de IGF-1 de rata/ratón (Diagnostic Systems Laboratories) . Se determinó una significativa - diferencia mediante la prueba t utilizando distribución de dos flagelos, no emparejados, de variación igual. La Figura 18, Panel A muestra la evaluación de compuestos en ratas hipofisectomizadas . Se dio a las ratas (n= 5-7 por grupo) ya sea una sola dosis o una dosis diaria de manera subcutánea. Los animales se pesaron, anestesiaron, sangraron y dosificaron secuencialmente (cuando fue aplicable) diariamente . Los resultados del peso corporal se muestran para tratamientos con placebo, hGH de tipo silvestre (hGH) , hGH marcado His ((his) hGH), y polipéptidos hGH que comprenden p-acetil-fenilalanina covalentemente enlazada a PEG de 30 kDa en las posiciones 35 y 92. Figura 18, Panel B - Se muestra un diagrama del efecto en los niveles de IGF-1 en plasma circulantes después de la administración de una sola dosis de polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural PEGilado. Las barras representan la desviación estándar. En la Figura 18, Panel A, el aumento en el peso corporal en el día 9 para el compuesto 30 KPEG-pAF35 (his)hGH es estadísticamente diferente (p<0.0005) del compuesto 30 KPEG-pAF92 (his) hGH en el cual se observó el mayor aumento . La Figura 18, Panel C muestra la evaluación de compuestos en ratas hipofisectomizadas . Se dio a las ratas (n= 11 por grupo) ya sea una sola dosis o una dosis diaria de manera subcutánea. Los animales se pesaron, anestesiaron, - sangraron y dosificaron secuencialmente (cuando fue aplicable) diariamente. Los resultados del peso corporal se muestran para tratamientos con placebo, hGH de tipo silvestre (hGH), hGH marcado His ((his) hGH), y polipéptidos hGH que comprenden p-acetil-fenilalanina covalentemente enlazada a PEG de 30 kDa en las posiciones 92, 134, 145, 131 y 143. Figura 18, Panel D - Se muestra un diagrama del efecto en los niveles de IGF-1 en plasma circulantes después de la administración de una sola dosis de polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural PEGilado (posición 92, 134, 145, 131, 143) en comparación con tratamientos con placebo y hGH de tipo silvestre . La Figura 18, Panel E muestra las concentraciones medias en plasma (+/-S.D.) correspondientes a polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido codificado no de manera natural PEGilado (posición 92, 134, 145, 131, 143). Las muestras de plasma se tomaron durante los intervalos de tiempo indicados y se analizaron por el compuesto inyectado como se describió. Las barras representan la desviación estándar. Ejemplo 31 Prueba clínica humana para la seguridad y/o eficacia del hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural . Objetivo. Para comparar la seguridad y farmacocinética de hGH humano recombinante PEGilado que - contiene un aminoácido codificado no de manera natural administrado de manera subcutánea con uno o más de los productos de hGH comercialmente disponibles (incluyendo, pero sin limitarse a Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serostim™ (Serono) ) . Pacientes . Dieciocho voluntarios sanos fluctuando entre 20-40 años de edad y pesando entre 60-90 kg se enrolan en el estudio. Los sujetos no tendrán valores anormales clínicamente significativos para hematología o química del suero, y una visualización negativa de toxicología en orina, visualización HIV, y antígeno de superficie de hepatitis B. ?o deben tener ninguna evidencia de lo siguiente: hipertensión; una historia de alguna enfermedad hematológica primaria; historia de significativa enfermedad hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinaria, metabólica, neurológica; historia de anemia o trastorno de ataques; una sensibilidad conocida a productos bacteriales o derivados de mamífero, PEG, o albúmina de suero humano; consumidor habitual o fuerte de bebidas que contienen cafeína; participación en alguna otra prueba clínica o tener transfusiones sanguíneas o donador dentro de los 30 días del inicio del estudio; haber tenido exposición a hGH dentro de los tres meses del inicio del estudio; tener enfermedad dentro de los siete días al inicio del estudio; y tener anormalidades significativas en el examen físico previo al estudio o a las evaluaciones clínicas de laboratorio dentro de los 14 días al inicio del estudio. Todos los sujetos son evaluables por seguridad y todas las recolección de sangre para análisis farmacocinéticos se colectan como se programó. Todos los estudios se llevan a cabo con la aprobación del comité de ética institucional y el consentimiento del paciente . Diseño del estudio. Este será un estudio de Fase I, único-central, de marca abierta, aleatorizado, de dos períodos cruzados en voluntarios macho sanos . Dieciocho sujetos se asignan aleatoriamente a uno de los dos grupos de secuencia de tratamiento (nueve sujetos/grupo) . El GH se administra en dos períodos de dosis separados como una inyección en volumen subcutánea en el muslo superior utilizando dosis equivalentes del hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural y el producto comercialmente disponible seleccionado. La dosis y frecuencia de administración del producto comercialmente disponible es como se instruye en la etiqueta del empaque. Puede agregarse al estudio, dosificación adicional, frecuencia de dosis, u otro parámetro según se desee utilizando los productos comercialmente disponibles, incluyendo grupos de sujetos adicionales. Cada período de dosificación se separa por un período de limpieza de 14 días.
- Los sujetos se confinan al centro de estudio al menos 12 horas previo a y 12 horas después de la dosis por cada uno de los dos períodos de dosificación, pero no entre períodos de dosificación. Pueden agregarse grupos de sujetos adicionales si va a existir dosificación adicional, frecuencia u otro parámetro, para probarse también para el hGH PEGilado. Pueden utilizarse en este estudio múltiples formulaciones de GH aprobadas para uso humano. Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , ?orditropin™ (?ovo-?ordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serostim™ (Serono) ) son productos de GH comercialmente disponibles aprobados para uso humano. La formulación experimental de hGH es hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural . Muestras de sangre . Se extrae sangre serial mediante punción directa de la vena antes y después de la administración del hGH. Las muestras de sangre venosa (5 ml) para determinación de las concentraciones de GH en suero se obtienen a aproximadamente 30, 20 y 10 minutos previo a la dosis (3 muestras de línea base) y a aproximadamente los siguientes momentos después de la dosificación: 30 minutos y a las 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 y 72 horas. Cada muestra de suero se divide en dos alícuotas . Todas las muestras de suero se almacenan a -20°C. Las muestras de suero se embarcan en hielo seco. Se llevan a cabo pruebas clínicas de laboratorio de ayuno (hematología, química del suero y análisis de orina) inmediatamente antes de la dosis inicial en el día 1, la mañana del día 4, inmediatamente antes de la dosis del día 16 y la mañana del día 19. Métodos bioanalíticos. Se utiliza un procedimiento con equipo ELISA (Diagnostic Systems Laboratory [DSL] , Webster TX) para la determinación de concentraciones de GH en suero . Determinaciones de seguridad. Los signos vitales se registran inmediatamente antes de cada dosis (días 1 y 16) , y a 6, 24, 48 y 72 horas después de cada dosis. Las determinaciones de seguridad se basan en la incidencia y tipo de efectos adversos y en los cambios en las pruebas clínicas de laboratorio desde la línea base. Además, se evalúan los cambios del pre-estudio en las mediciones de signos vitales, incluyendo presión sanguínea, y resultados del examen físico. Análisis de datos. Los valores de concentración en suero post-dosis se corrigen por concentraciones de GH de línea base pre-dosis sustrayendo de cada uno de los valores post-dosis la concentración media de GH de línea base determinada promediando los niveles de GH de las tres muestras colectadas a 30, 20, y 10 minutos antes de la dosis. Las concentraciones de GH en suero pre-dosis no se incluyen en el cálculo del valor medio si se encuentran por debajo del nivel de calificación del análisis. Los parámetros farmacocinéticos se determinan a partir de los datos de - - concentración en suero corregidos por concentraciones de GH de línea base. Los parámetros farmacocinéticos se calculan mediante métodos independientes del modelo en un sistema de computadora Digital Equipment Corporation VAX 8600 utilizando la última versión del software BIOAVL. Se determinan los siguientes parámetros de farmacocinética; concentración pico en suero (cm?) ; tiempo para concentración pico en suero (tmax) ; área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC) de cero hasta el último tiempo de muestreo de sangre (AUC0-72) calculado con el uso de lá regla trapezoidal lineal; y la vida media de eliminación terminal (tx/2) computada de la constante de relación de eliminación. La constante de relación de eliminación se estima por la regresión lineal de puntos de datos consecutivos en la región lineal terminal del diagrama tronco-lineal concentración-tiempo. Para cada tratamiento se calcula la media de desviación estándar (SD) , y de coeficiente de variación (CV) de los parámetros farmacocinéticos. Se calcula la relación de las medias de parámetro (formulación preservada/formulación no preservada) . Resultados de seguridad. La incidencia de eventos adversos se distribuye igualmente a través de los grupos de tratamiento. No existen cambios clínicamente significativos de las pruebas clínicas de laboratorio pre-estudio o presiones sanguíneas, y ningún cambio notable del pre-estudio en los resultados del examen físico y mediciones de signos - vitales. Los perfiles de seguridad para los dos grupos de tratamiento deben aparecer similares . Resultados de farmacocinética. Los perfiles medios de concentración-tiempo de GH en suero (no corregidos por niveles de GH de línea base) en todos los 18 sujetos después de recibir una sola dosis de uno o más de los productos hGH comercialmente disponibles (incluyendo, pero sin limitarse a Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serostim™ (Serono) ) se comparan con el hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural en cada punto de tiempo medido. Todos los sujetos deben tener concentraciones de GH de línea base pre-dosis dentro del rango fisiológico normal. Los parámetros farmacocinéticos se determinan de los datos en suero corregidos por concentraciones de GH de línea base pre-dosis y se determinan la Cmax y tmax. La tmax media para el (los) comparador (es) clínico (s) seleccionado (s) (Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk), Genotropin™ (Pfizer) y Saizen/Serostim™ (Serono)) es significativamente más corta que la tmax para el hGH PEGilado que comprende el aminoácido codificado no de manera natural . Los valores terminales de vida media son significativamente más cortos para los productos hGH comercialmente disponibles en comparación con la vida media - terminal para el hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural . Aunque el presente estudio se conduce en sujetos macho sanos, se anticiparán características de absorción y perfiles de seguridad similares en otras poblaciones de pacientes; tales como pacientes macho o hembra con cáncer o falla renal crónica, pacientes con falla renal pediátrica, pacientes en programas de predepósito autólogos, o pacientes programados para cirugía electiva. En conclusión, las dosis únicas administradas de manera subcutánea de hGH PEGilado que comprende aminoácido codificado no de manera natural serán seguras y bien toleradas por sujetos macho sanos. En base a una incidencia comparativa de eventos adversos, los valores clínicos de laboratorios, signos vitales y resultados de examen físico, los perfiles de seguridad de las formas comercialmente disponibles de hGH y hGH PEGilado que comprenden aminoácido codificado no de manera natural serán equivalentes. El hGH PEGilado que comprende aminoácido codificado no de manera natural proporciona potencialmente gran utilidad clínica a pacientes y proveedores del cuidado de la salud. Ejemplo 32 Este ejemplo describe uno de los muchos conjuntos potenciales de criterios para la selección de sitios de incorporación preferidos de aminoácidos codificado no de - manera natural en hlFN. Este ejemplo demuestra cómo se seleccionaron los sitios preferidos dentro del polipéptido hlFN para la introducción de un aminoácido codificado no de manera natural. La estructura cristalina con PDB ID IRH2 y la estructura NMR 1ITF (veinticuatro estructuras NMR diferentes) se utilizaron para determinar las posiciones preferidas dentro de las cuales podrían introducirse los aminoácidos codificado no de manera natural . Las coordenadas para estas estructuras se encuentran disponibles del Protein Data Bank (PDB) o a través de The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB disponible en la red mundial en rcsb.org. Las secuencia de numeración utilizada en este ejemplo se encuentra de acuerdo con la secuencia de aminoácidos del hlFN maduro mostrado en la SEQ ID NO: 24. Se utilizaron los siguientes criterios para evaluar cada posición del hlFN para la introducción de un aminoácido codificado no de manera natural : el residuo (a) no debe interferir con el enlace ya sea de hlFN bp en base al análisis estructural de las estructuras cristalográficas de hlFN conjugado con hlF?bp, b) no debe afectarse por la mutagénesis de exploración de alanina, (c) no debe exponerse a la superficie y exhibir mínimas interacciones van der Waals o de enlace de hidrógeno con los residuos circundantes, (d) debe ser ya sea suprimido o variable en variantes hlFB, (e) dará como resultado cambios conservadores a la sustitución con un aminoácido codificado no de manera natural y (f) podría encontrarse ya sea en regiones altamente flexibles (incluyendo pero sin limitarse a circuito CD) o en regiones estructuralmente rígidas (incluyendo pero sin limitarse a hélice B) . las publicaciones incluidas en la evaluación del sitio incluyen: Bioconj . Chemistry 2001 (12) 1956-202 Current Pharmacuetical Design 2002 (8) 2139-2157 Neuroimmunology 2001 (12) 857-859; BBRC 1994 (202) 1445-1451 Cáncer Biotherapy + Radiopharmaceuticals 1998 (vol 13) 143-153; Structure 1996 (14) 1453-1463; JMB 1997 (274) 661-675. Además, se llevaron a cabo cálculos adicionales en la molécula hlFN utilizando el programa Cx (Pintar et al., Bioinformatics, 18, pp 980) para evaluar la cantidad de profusión para cada átomo de proteína. Como resultado, en algunas modalidades, uno o más aminoácidos codificado no de manera natural se sustituyen en, pero sin limitarse a, una o más de las siguientes posiciones de hlFN (como en la SEQ ID NO: 24) o los aminoácidos correspondientes en otros IFNs) : antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, o 166 (i.e., en la terminación carboxil) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en una o más de las siguientes posiciones: 100, 106, 107, 108, 111, 113, 114. En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en una o más de las siguientes posiciones: 41, 45, 46, 48, 49. En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en una o más de las siguientes posiciones: 61, 64, 65, 101, 103, 110, 117, 120, 121, 149. En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en una o más de las siguientes posiciones: 6, 9, 12, 13, 16, 96, 156, 159, 160, 161, 162. En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en una o más de las siguientes posiciones: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69 , 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165. En algunas modalidades, el aminoácido de origen no natural en estas u otras posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua, incluyendo pero sin - limitarse a las posiciones: antes de la posición 1 (i.e., en la terminación N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, o 166 (i.e., en la terminación carboxil) . En algunas modalidades, el polímero soluble en agua se encuentra acoplado al polipéptido IFN en una o más de las posiciones de aminoácido: 6, 9, 12, 13, 16, 41, 45, 46, 48, 49, 61, 64, 65, 96, 100, 101, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 117, 120, 121, 149, 156, 159, 160, 161 y 162 (SEQ ID NO: 24, o el aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 23, 25 o cualquier otro polipéptido IFN) . En algunas modalidades, los polipéptidos IFN de la invención comprenden uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en una o más de las siguientes posiciones proporcionando un antagonista: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165; un polipéptido hlFN comprendiendo una de estas sustituciones puede actuar potencialmente como un antagonista débil o agonista débil dependiendo del sitio pretendido seleccionado y la actividad - deseada. Los antagonistas IFN humanos incluyen, pero sin limitarse a, aquellos con sustituciones en 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 o cualquier combinación de las mismas (hlFN; SEQ ID NO: 24 o los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 23 o 25) . Ejemplo 33 Este ejemplo detalla la clonación y expresión de un polipéptido hlF? modificado en E. coli. Este ejemplo demuestra cómo puede expresarse un polipéptido hlF? que incluye un aminoácido codificado no de manera natural en E. coli. Ver, ?agata et al., ?ature, Vol. 284, 316-320 (1980) y Patente de E.U. ?o. 4,364,863. El AD?c que codifica para el hlFN de longitud total y la forma madura de hlFN que carece de la secuencia de señal de terminación N se muestran en la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO : 27, respectivamente. ?l hlFN de longitud total y maduro que codifica para ADNc se inserta en los vectores de expresión pBAD HISc, pET20b y pET19b seguido por la optimización de la secuencia para clonación y expresión sin alterar la secuencia de aminoácido . Se utiliza un sistema de translación introducida que comprende un ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) para expresar el hlFN que contiene - un aminoácido codificado no de manera natural como se describe en el Ejemplo 2 para la expresión de hGH. Ejemplo 34 Este ejemplo describe métodos para medir la actividad in vitro e in vivo del IFN PEGilado. Análisis de enlace celular Se incuban células (3 x 106) en duplicado en PBS/BSA al 1% (100 µl) en ausencia o presencia de diversas concentraciones (volumen.- 10 µl) de IFN, hlFN, o GM-CSF no marcado y en presencia de 125I-IFN (aproximadamente 100,000 cpm o 1 ng) a 0°C durante 90 minutos (volumen total: 120 µl) . Las células se resuspenden entonces y se colocan sobre 200 µl de FCS helado en un tubo de centrífuga plástico de 350 µl y se centrifugan (1000 g: 1 minuto) . La pildora se colecta cortando el extremo del tubo y la pildora y el sobrenadante se cuentan por separado en un contador gama (Packard) . El enlace específico (cpm) se determina como el enlace total en ausencia de un enlace menor (cpm) competidor (media de duplicados) en presencia de un exceso de 100 veces de IFN no marcado (enlace no específico) . El enlace no específico se mide para cada uno de los tipos de célula utilizados. Los experimentos se realizan en días separados utilizando la misma preparación de 125I-IF? y deben mostrar consistencia interna. 125I-IFN demuestra el enlace a las células Daudi. El enlace se inhibe de manera dependiente de - dosis mediante IFN o hlFN natural no marcado, pero no mediante GM-CSF u otro control negativo. La capacidad del hGH para competir por el enlace de 125I-IFN natural, similar al IFN natural, sugiere que los receptores reconocen ambas formas igualmente bien. Estudios in vivo de IFN PEGilado Se administra una solución de PEG-hIFN, hlFN no modificado y amortiguador a ratones o ratas . Los resultados mostrarán actividad superior y vida media prolongada del hlF? PEGilado de la presente invención en comparación con hlF? no modificado que se indica por un aumento significativo de la inhibición de la repetición viral utilizando la misma dosis por ratón. Medición de la vida media in vivo de hlF? conjugado y no conjugado y sus variantes Se utilizan ratas Sprague-Dawley macho (aproximadamente de 7 semanas de edad) . En el día de la administración, se mide el peso de cada animal. Se inyectan 100 µg por kg de peso corporal de las muestras de hlFN no conjugado y conjugado de manera intravenosa en la vena del rabo de tres ratas. A 1 minuto, 30 minutos, 1, 2, 4, 6 y 24 horas después de la inyección, se extraen 500 µl de sangre de cada rata mientras se encuentran bajo anestesia C02. Las muestras de sangre se almacenan a temperatura ambiente durante 1.5 horas seguido por aislamiento de suero mediante - centrifugación (4°C, 18000 x g durante 5 minutos) . Las muestras de suero se almacenan a -80 °C hasta el día del análisis. La cantidad de IFN activo en las muestras de suero se cuantifica por medio del análisis de actividad de IF? in viro después de congelar las muestras en hielo. Actividad antiviral Existen muchos análisis conocidos por los expertos en la técnica que miden el grado de resistencia de células a virus (McNeill TA, J. Immunol . Methods (1981) 46 (2) : 121-7) . Estos análisis pueden clasificarse generalmente en tres tipos: inhibición del efecto citopático; formación de placa de virus; y reducción de producción de virus. Los análisis de efecto citopático viral miden el grado de protección inducido en cultivos celulares pretratados con IF? y subsecuentemente infectados con virus . El virus de estomatitis vesicular, por ejemplo, es un virus apropiado para su uso en tal análisis. Este tipo de análisis es conveniente para visualizar diferentes IF?s, dado que puede llevarse a cabo en placas de 96 pozos. Los análisis de reducción de placa miden la resistencia de cultivos celulares tratados con IF? a un virus que forma placa (por ejemplo, virus de sarampión) . Un beneficio de este análisis es que permite la medición precisa de una reducción del 50% en una formación de placa. Finalmente, los análisis de producción de virus miden la cantidad de virus liberada de las células - por ejemplo, durante un solo ciclo de crecimiento. Tales análisis son útiles para probar la actividad antiviral de IFNs contra virus que no ocasionan efectos citopáticos, o que no recubren placas en cultivos celulares objetivo. La multiplicidad de infección (moi) es un factor importante a considerar al utilizar análisis ya sea de reducción de placa o de producción de virus . Otras características interferón clínicamente importantes se analizan también fácilmente en el laboratorio. Una característica tal es la capacidad de un polipéptido interferón para enlazarse a receptores de superficie celular específicos. Por ejemplo, algunos IFNo;-2bs exhiben diferentes propiedades de superficie celular en comparación con un IFNa-2b, el IFN más ampliamente utilizado en pruebas clínicas. Aunque el IFNa-2b es un efectivo agente antiviral, ocasiona adversos efectos secundarios significantes. Los interferones que exhiben propiedades de enlace distintas a IFNa-2b pueden no ocasionar los mismos efectos adversos. En consecuencia, los interferones que compiten pobremente con IFNa-2b por sitios de enlace en células son de interés clínico. Los análisis de enlace de interferón competitivos son muy conocidos en la técnica (Hu et al., J. Biol. Chem. (1993) Jun 15; 268 (17) : 12591-5 ; Di Marco et al., (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 202:1445-1451). En general, tales análisis implican la incubación de células de cultivo con una mezcla de IFNa-2b marcado con 125I y un interferón no marcado de interés. El interferón no enlazado se retira entonces, u se mide la cantidad de marca enlazada (y por extensión, el IFNo;-2b marcado con 125I) . al comparar la cantidad de marca que se enlaza a células en presencia o ausencia de interferones competentes pueden calcularse las afinidades de enlace relativas. Otro prominente efecto de IFNas es su capacidad para inhibir el crecimiento celular, que es de mayor importancia para determinar la acción anti-tumor. Los análisis de inhibición de crecimiento se encuentran bien establecidos y comúnmente dependen de conteos celulares o absorción de timidina tritiada (timidina [3H] ) u otra radiomarca. La línea celular Daudi humana de linfoblastoide ha probado ser extremadamente sensible a IF?as, y también se ha utilizado para medir la actividad antiproliferativa en muchos IFNas y polipéptidos híbridos derivados (Meister et al., J. Gen Virol. (1986) Aug; 67 (Pt 8):1644-43). El uso de esta línea celular se ha facilitado por su capacidad para crecer en cultivos de suspensión (Evinger y Pestka, (1981) Methods Enzymol. 79:362-368). Los IFNas también exhiben muchas actividades inmunomoduladoras (Zoon et al., (1986) en The Biology of the Inferieron System. Cantell y Schellenkens Eds., Martinus Nyhoff Publishers, Amsterdam). Aunque los IFNs se descubrieron primero por virologistas, su primer uso clínico (en 1979) fue como agentes terapéuticos para mieloma (Joshua et al., (1997) Blood Rev. 11 (4) : 191-200) . Los IFNas han mostrado desde entonces ser eficaces contra una multiplicidad de enfermedades de origen viral, maligno, angiogénico, alérgico, inflamatorio, y fibrótico (Tilg, (1997) Gastroenterology 112 (3) :1017-1021) . Ha probado se eficaz en el tratamiento de carcinoma renal mestastático y leucemia mieloide crónica (Williams y Linch (1997) Br. J. Hosp. Med. 57 (9) :436-439) . Los usos clínicos de IFNs se revisan en Gresser (1997) J. Leukoc. Biol. 61 (5) -567-574 y Pfeffer (1997) Semin. Oncol. 24(2 Suppl. 9): S9-S63S969. Ejemplo 35 Prueba clínica humana para la seguridad y/o eficacia del hlFN PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural . Objetivo. Para comparar la seguridad y farmacocinética de hlFN humano recombinante PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural administrado de manera subcutánea con los productos de hlF? comercialmente disponibles Roferon A® o I?TRO? A ® . Pacientes . Dieciocho voluntarios sanos fluctuando entre 20-40 años de edad y pesando entre 60-90 kg se enrolan en el estudio. Los sujetos no tendrán valores anormales clínicamente significativos para hematología o - química del suero, y una visualización negativa de toxicología en orina, visualización HIV, y antígeno de superficie de hepatitis B. No deben tener ninguna evidencia de lo siguiente: hipertensión; una historia de alguna enfermedad hematológica primaria; historia de significativa enfermedad hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinaria, metabólica, neurológica; historia de anemia o trastorno de ataques; una sensibilidad conocida a productos bacteriales o derivados de mamífero, PEG, o albúmina de suero humano; consumidor habitual o fuerte de bebidas que contienen cafeína; participación en alguna otra prueba clínica o tener transfusiones sanguíneas o donador dentro de los 30 días del inicio del estudio; haber tenido exposición a hGH dentro de los tres meses del inicio del estudio; tener enfermedad dentro de los siete días al inicio del estudio; y tener anormalidades significativas en el examen físico previo al estudio o a las evaluaciones clínicas de laboratorio dentro de los 14 días al inicio del estudio. Todos los sujetos son evaluables por seguridad y todas las recolección de sangre para análisis farmacocinéticos se colectan como se programó. Todos los estudios se llevan a cabo con la aprobación del comité de ética institucional y el consentimiento del paciente. Diseño del estudio. Este será un estudio de Fase I, único-central, de marca abierta, aleatorizado, de dos - períodos cruzados en voluntarios macho sanos . Dieciocho sujetos se asignan aleatoriamente a uno de los dos grupos de secuencia de tratamiento (nueve sujetos/grupo) . El IFN se administra en dos períodos de dosis separados como una inyección en volumen subcutánea en el muslo superior utilizando dosis equivalentes del hlFN PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural y el producto comercialmente disponible seleccionado. La dosis y frecuencia de administración del producto comercialmente disponible es como se instruye en la etiqueta del empaque. Puede agregarse al estudio, dosificación adicional, frecuencia de dosis, u otro parámetro según se desee utilizando los productos comercialmente disponibles, incluyendo grupos de sujetos adicionales. Cada período de dosificación se separa por un período de limpieza de 14 días. Los sujetos se confinan al centro de estudio al menos 12 horas previo a y 72 horas después de la dosis por cada uno de los dos períodos de dosificación, pero no entre períodos de dosificación. Pueden agregarse grupos de sujetos adicionales si va a existir dosificación adicional, frecuencia u otro parámetro, para probarse también para el hlFN PEGilado. Pueden utilizarse en este estudio múltiples formulaciones de IFN aprobadas para uso humano . Roferon A® y/o Intron A® son productos de IFN comercialmente disponibles aprobados para uso humano. La formulación experimental de hlFN es hlFN - PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural . Muestras de sangre . Se extrae sangre serial mediante punción directa de la vena antes y después de la administración del hlFN. Las muestras de sangre venosa (5 ml) para determinación de las concentraciones de IFN en suero se obtienen a aproximadamente 30, 20 y 10 minutos previo a la dosis (3 muestras de línea base) y a aproximadamente los siguientes momentos después de la dosificación: 30 minutos y a las 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 y 72 horas. Cada muestra de suero se divide en dos alícuotas. Todas las muestras de suero se almacenan a -20 °C. Las muestras de suero se embarcan en hielo seco. Se llevan a cabo pruebas clínicas de laboratorio de ayuno (hematología, química del suero y análisis de orina) inmediatamente antes de la dosis inicial en el día 1, la mañana del día 4, inmediatamente antes de la dosis del día 16 y la mañana del día 19. Métodos bioanalíticos. Se utiliza un procedimiento con equipo ELISA (BioSource International (Camarillo, CA) ) para la determinación de concentraciones de IF? en suero. Determinaciones de seguridad. Los signos vitales se registran inmediatamente antes de cada' dosis (días 1 y 16) , y a 6, 24, 48 y 72 horas después de cada dosis. Las determinaciones de seguridad se basan en la incidencia y tipo - de efectos adversos y en los cambios en las pruebas clínicas de laboratorio desde la línea base. Además, se evalúan los cambios del pre-estudio en las mediciones de signos vitales, incluyendo presión sanguínea, y resultados del examen físico. Análisis de datos. Los valores de concentración en suero post-dosis se corrigen por concentraciones de IFN de línea base pre-dosis sustrayendo de cada uno de los valores post-dosis la concentración media de IFN de línea base determinada promediando los niveles de IFN de las tres muestras colectadas a 30, 20, y 10 minutos antes de la dosis. Las concentraciones de IFN en suero pre-dosis no se incluyen en el cálculo del valor medio si se encuentran por debajo del nivel de cuantificación del análisis. Los parámetros farmacocinéticos se determinan a partir de los datos de concentración en suero corregidos por concentraciones de IFN de línea base. Los parámetros farmacocinéticos se calculan mediante métodos independientes del modelo en un sistema de computadora Digital Equipment Corporation VAX 8600 utilizando la última versión del software BIOAVL. Se determinan los siguientes parámetros de farmacocinética; concentración pico en suero (cmax) ; tiempo para concentración pico en suero (tma?) ; área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC) de cero hasta el último tiempo de muestreo de sangre (AUC0-72) calculado con el uso de la regla trapezoidal lineal; y la vida media de eliminación terminal (t?/2) computada de la - constante de relación de eliminación. La constante de relación de eliminación se estima por la regresión lineal de puntos de datos consecutivos en la región lineal terminal del diagrama tronco-lineal concentración-tiempo. Para cada tratamiento se calcula la media de desviación estándar (SD) , y de coeficiente de variación (CV) de los parámetros farmacocinéticos . Se calcula la relación de las medias de parámetro (formulación preservada/formulación no preservada) . Resultados de seguridad. La incidencia de eventos adversos se distribuye igualmente a través de los grupos de tratamiento. No existen cambios clínicamente significativos de las pruebas clínicas de laboratorio pre-estudio o presiones sanguíneas, y ningún cambio notable del pre-estudio en los resultados del examen físico y mediciones de signos vitales. Los perfiles de seguridad para los dos grupos de tratamiento deben aparecer similares . Resultados de farmacocinética. Los perfiles medios de concentración-tiempo de IFN en suero (no corregidos por niveles de IFN de línea base) en todos los 18 sujetos después de recibir una sola dosis de uno o más de los productos hlFN comercialmente disponibles (e.g., Roferon A® o Intron A®) se comparan con el hlFN PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural en cada punto de tiempo medido. Todos los sujetos deben tener concentraciones de IFN de línea base pre-dosis dentro del rango fisiológico normal . Los parámetros farmacocinéticos se determinan de los datos en suero corregidos por concentraciones de IFN de línea base pre-dosis y se determinan la Cmax y tmax. La tmax media para hlFN (e.g., Roferon®) es significativamente más corta que la tmax para el hlFN PEGilado que comprende el aminoácido codificado no de manera natural . Los valores terminales de vida media son significativamente más cortos para hlFN (e.g., Intron A®) en comparación con la vida media terminal para el hlFN PEGilado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural . Aunque el presente estudio se conduce en sujetos macho sanos, se anticiparán características de absorción y perfiles de seguridad similares en otras poblaciones de pacientes; tales como pacientes macho o hembra con cáncer o falla renal crónica, pacientes con falla renal pediátrica, pacientes en programas de predepósito autólogos, o pacientes programados para cirugía electiva. En conclusión, las dosis únicas administradas de manera subcutánea de hlF? PEGilado que comprende aminoácido codificado no de manera natural serán seguras y bien toleradas por sujetos macho sanos. En base a una incidencia comparativa de eventos adversos, los valores clínicos de laboratorios, signos vitales y resultados de examen físico, los perfiles de seguridad de hlF? (e.g., Roferon A®) y hlF? PEGilado que comprenden aminoácido codificado no de manera - natural serán equivalentes . El hlFN PEGilado que comprende aminoácido codificado no de manera natural proporciona potencialmente gran utilidad clínica a pacientes y proveedores del cuidado de la salud. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presento son solo para propósitos ilustrativos y que se sugerirán diversas modificaciones y cambios a la luz de la misma a las personas expertas en la técnica y se incluyen dentro de la esencia y provisión de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad para todo propósito.

Claims (1)

  1. - REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido hlFN que comprende uno o más aminoácidos codificados no de manera natural. 2. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlFN comprende una o más modificaciones post-traducción. 3. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido se enlaza a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. 4. El polipéptido hlFN de la reivindicación 3, en donde el polipéptido se enlaza a un polímero soluble en agua. 5. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido se enlaza a un polímero bifuncíonal, enlazador bifuncional o al menos un polipéptido hlFN adicional . 6. El polipéptido hlFN de la reivindicación 5, en donde el enlazador o polímero bifuncional se enlaza a un segundo polipéptido. 7. El polipéptido hlFN de la reivindicación 6, en donde el segundo polipéptido es un polipéptido hlFN. 8. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4 en donde el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol) . 9. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, en donde dicho polímero soluble en agua se enlaza a un - - aminoácido codificado no de manera natural presente en dicho polipéptido hlFN. 10. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 1-9, 10-21, 22-39, 40-75, 76-77, 78-100, 101-110, 111-132, 133-136, 137-155, 156-165 de la SEQ ID N0:24. 11. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos antes de la posición 1 (i.e., en la N terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90 , 93, 94, 96 , 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo de la proteína) y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 12. El polipéptido hlF? de la reivindicación 11, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 100, 106, 107, 108, 111, 113, 114 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 13. El polipéptido hlFN de la reivindicación 11, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 41, 45, 46, 48, 49 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 14. El polipéptido hlFN de la reivindicación 11, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 61, 64, 65, 101, 103, 110, 117, 120, 121, 149 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 15. El polipéptido hlFN de la reivindicación 11, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 6, 9, 12, 13, 16, 96, 156, 159, 160, 161, 162 y cualquier combinación de los mismos de la S?Q ID NO: 24. 16. El polipéptido hlFN de la reivindicación 11, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69, 70, 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 17. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se - sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos antes de la posición 1 (i.e., en la N terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo) y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 18. El polipéptido hlFN de la reivindicación 17, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 6, 9, 12, 13, 16, 41, 45, 46, 48, 49, 61, 64, 65, 96, 100, 101, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 117, 120, 121, 149, 156, 159, 160, 161 y 162 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 19. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlFN comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones del aminoácido que modulan la afinidad del polipéptido hlFN para un receptor hlFN. 20. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlFN comprende una o más sustituciones, - adiciones o supresiones del aminoácido que incrementan la estabilidad o solubilidad del polipéptido hlFN. 21. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlFN comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones del aminoácido que incrementan la expresión del polipéptido hlFN en una célula huésped recombinante o sintetizada in vitro. 22. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlFN comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones del aminoácido que incrementan la resistencia a la proteasa del polipéptido hlFN. 23. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el aminoácido codificado no de manera natural es reactivo hacia un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que es de otro modo no reactiva hacia cualquiera de los 20 aminoácidos comunes en el polipéptido. 24. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazina, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. 25. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo. 26. El polipéptido hlFN de la reivindicación 25, - - en donde el aminoácido codificado no de manera natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal amino y R es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal carboxi. 27. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo aminooxi . 28. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo hidrazida. 29. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo hidrazina. 30. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo semicarbazida. 31. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, - en donde el residuo de aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo azida. 32. El polipéptido hlFN de la reivindicación 31, en donde el aminoácido codificado no de manera natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal amino y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal carboxi . 33. El polipéptido hlFN de la reivindicación 24, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo alquino. 34. El polipéptido hlFN de la reivindicación 33, en donde el aminoácido codificado no de manera natural tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal amino y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de terminal carboxi . 35. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 36. El polipéptido hlFN de la reivindicación 35, en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa. 37. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, que se hace al reaccionar un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido que contiene carbonilo con un polímero soluble en agua que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. 38. El polipéptido hlFN de la reivindicación 37, en donde el grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida se enlaza al polímero soluble en agua a través de un enlace de amida. 39. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, que se hace al reaccionar un polímero soluble en agua que comprende un grupo carbonilo con un polipéptido que comprende un aminoácido codificado no de manera natural que comprende un grupo aminooxi, una hidrazina, una hidrazida o una semicarbazida . 40. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, que se hace al reaccionar un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido que contiene alquino con un polímero soluble en agua que comprende un residuo azida. 41. El polipéptido hlFN de la reivindicación 4, que se hace al reaccionar un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido que contiene azida con un polímero soluble en agua que comprende un residuo alquino. 42. El polipéptido hlF? de la reivindicación 24, en donde el grupo azida o alquino se enlaza a un polímero soluble en agua a través de un enlace de amida. 43. El polipéptido hlF? de la reivindicación 4, en donde el polímero soluble en agua es un polímero ramificado o multiarmado. 44. El polipéptido hlFN de la reivindicación 43, en donde cada ramificación del polímero ramificado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 45. El polipéptido hlF? de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es un antagonista hlFN. 46. El polipéptido hlFN de la reivindicación 45, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 2, 3, 4, 5, 7, 8, 16, 19, 20, 40, 42, 50, 51, 58, 68, 69 , 10 , 71, 73, 97, 105, 109, 112, 118, 148, 149, 152, 153, 158, 163, 164, 165 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 47. El polipéptido hlFN de la reivindicación 45, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de los residuos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 74, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 48. El polipéptido hlFN de la reivindicación 45, en donde el polipéptido comprende uno o más del enlazador, polímero o molécula biológicamente activa de modificación post-traducción. 49. El polipéptido hlFN de la reivindicación 48, en donde el polímero comprende un residuo seleccionado del grupo que consiste de polímero soluble en agua y poli (etilen glicol) . 50. El polipéptido hlF? de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se encuentra presente dentro de la región del Sitio II del polipéptido hlF?. 51. El polipéptido hlF? de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el polipéptido evita la dimerización del receptor hlFN. 52. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un residuo de sacárido. 53. El polipéptido hlFN de la reivindicación 3, en donde el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se enlaza al polipéptido a través de un residuo de sacárido. 54. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones rigurosas a la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 27, en donde el polinucleótido comprende al menos un codón selector. 55. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 54 , en donde el codón selector se selecciona del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro y un codón de cuatro bases. 56. Un método para elaborar el polipéptido hlF? de la reivindicación 3 , comprendiendo el método poner en contacto un polipéptido hlF? aislado que comprende un aminoácido codificado no de manera natural con un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que comprende un residuo que reacciona con el aminoácido codificado no de manera natural . 57. El método de la reivindicación 56, en donde el polímero comprende un residuo seleccionado del grupo que consiste de un polímero soluble en agua y un poli (etilen glicol) . - 58. El método de la reivindicación 56, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino . 59. El método de la reivindicación 56, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un residuo de carbonilo y el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que comprende un residuo de áminooxi, una hidrazina, una hidrazida o de semicarbazida. 60. El método de la reivindicación 59, en donde el residuo de aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida se enlaza al enlazador, polímero o molécula biológicamente activa a través de un enlace de amida. 61. El método de la reivindicación 56, en donde el aminoácido codificado no de manera natural que comprende un residuo de alquino y el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa comprende un residuo de azida. 62. El método de la reivindicación 56, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un residuo de azida y el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa comprende un residuo alquino. 63. El método de la reivindicación 58, en donde el residuo de azida o alquino se enlaza a un enlazador, polímero, o molécula biológicamente activa a través de un enlace de amida. 64. El método de la reivindicación 57, en donde el residuo de poli (etilén glicol) tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 65 El método de la reivindicación 57, en donde el residuo de poli (etilén glicol) es un polímero ramificado o multiarmado. 66. Una composición que comprende el polipéptido hlFN de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticaente aceptable . 67. La composición de la reivindicación 66, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se enlaza a un polímero soluble en agua. 68. Un método para tratar a un paciente que tiene un trastorno modulado por hlFN que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 66. 69. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 54. 70. La célula de la reivindicación 69, en donde la célula comprende un ARNt sintetasa ortogonal o un ARNt ortogonal . 71. Un método para elaborar un polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural, comprendiendo el método, cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que coifican para un polipéptido hlFN y que comprende un codón selector, una ARN sintetasa ortogonal y un AR?t ortogonal bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido hlFN que comprende un aminoácido codificado no de manera natural; y purificar el polipéptido hlFN. 72. Un método para incrementar la vida media en suero o el tiempo de circulación de un políeptido de hlFN , comprendiendo el método sustituir uno o más aminoácidos codificados no de manera natural para cualquiera o más aminoácidos que se presentan de manera natural en el polipéptido hlFN. 73. Un polipéptido hlF? codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID ?O: 26; o la SEQ ID ?O : 27, en donde dicho polinucleótido comprende un codón selector y en donde dicho polipéptido comprende al menos una aminoácido codificado no de manera natural . 74. El polipéptido hlF? de la reivindicación 73, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se enlaza a un enlazador, polímero, polímero soluble en agua o molécula biológicamente activa. 75. El polipéptido hlFN de la reivindicación 74, en donde el polímero soluble en agua compreden un residuo de - poli (etilen glicol) . 76. El polipéptido hlFN de la reivindicación 73, en donde el aminoácido codificado no de manera natural se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste de residuos anteriores a la posición 1 (i.e., en la terminal N) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 58, 61, 64, 65, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 96, 97, 100, 101, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 148, 149, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 (i.e., en la terminal carboxilo) y cualquier combinación de los mismos de la SEQ ID NO: 24. 77. El polipéptido hlFN de la reivindicación 73, en donde el aminoácido codificado no de manera natural comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino . 78. El polipéptido hlFN de la reivindicación 75, en donde el residuo de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 79. El polipéptido hlFN de la reivindicación 75, en donde el residuo de poli (etilen glicol) es un polímero ramificado o multiarmado. 80. El polipéptido hlFN de la reivindicación 79, en donde el residuo de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 81. Una composición que comprende el polipéptido hlFN de la reivindicación 73 y un vehículo farmacéuticamente aceptable . 82. Un polipéptido hlFN que comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido que incrementan la expresión del polipéptido hlF? en una célula huésped recombinante . 83. Un polipéptido hlF? que comprende un polímero soluble en agua enlazado mediante una unión covalente al polipéptido hlF? en un solo aminoácido. 84. El polipéptido hlF? de la reivindicación 83, en donde el polímero soluble en agua comprende un residuo de poli (etilen glicol) . 85. El polipéptido hlFN de la reivindicación 83, en donde el aminoácido unido covalentemente al polímero soluble en agua es un aminoácido codificado no de manera natural . 86. El polipéptido hlFN de la reivindicación 11, en donde dicho aminoiácido codificado no de manera natural se enlaza a una molécula de poli (etilen glicol) . - 87. Un polipéptido hlFN que comprende al menos un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa, en donde dicho enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se une al polipéptido a través de un grupo funcional de un aminoácido codificado no de manera natural ribosomalmente incorporado en el polipéptido. 88. El polipéptido hlFN de la reivindicación 87, en donde dicho polipéptido hlF? es monoPEGilado. 89. Un polipéptido hlFN que comprende un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que se une a uno o más aminoácidos codificado no de manera natural en donde dicho aminoácido codificado no de manera natural se incorpora ribosomalmente en el polipéptido en los sitios preseleccionados . 90. El polipéptido hlFN de la reivindicación 89, en donde el poloipéptido hlFN comprende uno de dicho enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. 91. El polipéptido hlFN de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido hlFN comprende uno o más del enlazador, polímero, molécula biológicamente activa, polímero soluble en agua, polímero bifuncional, enlazador bifuncional, polipéptido hlFN adicional, segundo polipéptido o residuo de poli (etilen glicol) de modificación post-traducción y en donde dicho polipéptido hlFN se selecciona del grupo que consiste del concenso IFN, IFN , IFNß, IFNe, IFN?, IFN?, IFNt, - IFNa-la, IF?a-lb, IF? -2a, IF?a-2b, IFNß-la, IFNß-lb e IF??- la. 92. El polipéptido hlF? de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido hlF? que comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido incrementa la afinidad del polipéptido hlFN para un receptor de hlF? , incrementa la estabilidad o solubilidad del polipéptido hlF?, incrementa la expresión del polipéptido hlF? en una célula huésped recombinante o se sintetizada in vitro, incrementa la resistencia a la proteasa del polipéptido hlF? y en donde dicho polipéptido hlF? se selecciona del grupo que consiste IFN, IF?a, IFNß, IFNe, IFN?, IFN?, IFNt, IFNa-la, IFN -lb, IF?a-2a, IF?a-2b, IF?ß-la, IF?ß-lb e IF??-la de concenso. 93. El polipéptido hlF? de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlF? comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido que modulan la inmunogenicidad del polipéptido hlF?. 94. El polipéptido hlF? de la reivindicación 1, en donde el polipéptido hlFN comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido que modulan la vida media del suero o tiempo de circulación del polipéptido hlFN. 95. Un método para modular la inmunogenicidad de un polipéptido hlFN, comprendiendo el método sustituir uno o más aminoácidos codificado no de manera natural para 6 cualquiea o más aminoácidos que se presentan de manera natural en el polipéptido hlFN.
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