CN109439606B - 一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase的基因工程菌，显著地提高了间苯三酚生产菌株合成间苯三酚的产量，通过摇瓶发酵，改造的菌株合成间苯三酚的产量是对照菌株的1.85倍。本发明可用于间苯三酚的工业化生产。

Description

一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯，是一种重要的精细化工产品。间苯三酚本身就是一种药物，可以用作低毒平滑肌松弛剂；其衍生物三甲氧基苯是一种有效的镇静剂，已被用作化妆品添加剂。间苯三酚的硝基化合物三硝基间苯三酚是一种重要的炸药也是几种其他爆炸物的合成中间体。20世纪初就建立了间苯三酚的化学合成途径，并经过许多研究人员的逐渐改进，但化学合成法仍存在多种弊端，如副产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。间苯三酚化合物是一大类次级代谢产物，已经从不同的天然来源中分离出700多种天然存在的间苯三酚衍生物，包括植物，海洋生物和微生物。
以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。但目前微生物发酵法合成间苯三酚产量较低，无法用于工业化生产。仍需通过对产间苯三酚工程菌进行基因改造，以提高间苯三酚产量。
发明内容
为解决生物法合成间苯三酚产量过低的问题，本发明提供了一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌，所述基因工程菌过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase，出发菌株为大肠杆菌。
进一步地限定，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA来源于大肠杆菌K-12，GenebankID：948409；或者为来源于其他生物体，与基因tpiA同源性超过70％的基因。
进一步地限定，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA与大肠杆菌K-12中基因tpiA同源性低于70％，但其编码的蛋白与蛋白TpiA功能相同或相似。
更进一步地限定，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述聚酮合成酶基因phlD的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；所述多重抗性激活因子marA的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase亚基accA的Genebank ID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083。
本发明还提供了所述提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)制备含有磷酸丙糖异构酶基因tpiA的重组质粒；
2)将步骤1)所得重组质粒与产间苯三酚的重组质粒一起导入到宿主菌中，获得重组菌株；所述产间苯三酚的重组质粒含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase；该质粒记载在Zhang R,Cao Y,Liu W,et al.Improvingphloroglucinol tolerance and production in Escherichia coli by GroESLoverexpression.Microbial Cell Factories,2017,16(1):227；所述宿主菌为大肠杆菌。
进一步地限定，步骤1)是将磷酸丙糖异构酶基因tpiA连接到载体pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-tpiA。
更进一步地限定，步骤1)所述的重组质粒的制备，是以大肠杆菌K-12基因组DNA为模版，经PCR扩增获得磷酸丙糖异构酶基因tpiA，将磷酸丙糖异构酶基因tpiA与pETDuet-1载体分别经NdeI和BglII限制性内切酶双酶切后，将酶切后的磷酸丙糖异构酶基因tpiA与pETDuet-1载体大片段5413bp连接，制备获得重组质粒；所述PCR扩增的正向引物tpiA-F，序列如SEQ ID NO：4所示；反向引物tpiA-R，序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供了上述基因工程菌的应用：将构建获得的基因工程菌，用于发酵生产间苯三酚。
进一步地限定，所述的应用是指将本发明所构建的基因工程菌接种至发酵培养基中生产间苯三酚。所述发酵培养基成分为：K2HPO4·3H2O 9.8g/L，C6H8O7·H2O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，1000×微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O 3.7g/L，ZnSO4·7H2O 2.9g/L，H3BO3 24.7g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，MnCl2·4H2O 15.8g/L)，所述各成分浓度均为在发酵培养基中的终浓度；接种时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，氯霉素终浓度34μg/mL。
更进一步地限定，当所述基因工程菌培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导后获得间苯三酚。
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称：
间苯三酚(Phloroglucinol)：PG
异丙基硫代半乳糖苷：IPTG
磷酸丙糖异构酶基因：tpiA
聚酮合成酶基因：phlD
多重抗性激活因子：marA
乙酰CoA羧化酶基因：ACCase
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli
“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
有益效果
本发明在大肠杆菌中过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA，所得基因工程菌间苯三酚合成能力有较大提高，采用摇瓶发酵结束时间苯三酚产量可达到1.5g/L，是未过表达基因tpiA菌株的1.85倍，该方法为间苯三酚生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
附图说明
图1摇瓶发酵间苯三酚产量曲线图，横坐标为IPTG诱导后的培养时间(h)，纵坐标为间苯三酚产量(g/L)。
具体实施方式
下面通过实例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明，均为常规技术。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自Thermo Scientific公司，pETDuet-1载体购买自Novagen，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国Omega公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，接种时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，加入氯霉素至终浓度34μg/mL。
2)发酵培养基
K2HPO4·3H2O 9.8g/L，C6H8O7·H2O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，1000×微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O 3.7g/L，ZnSO4·7H2O 2.9g/L，H3BO3 24.7g/L，CuSO4·5H2O 2.5g/L，MnCl2·4H2O 15.8g/L)，接种时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，氯霉素终浓度34μg/mL。
其中：K2HPO4·3H2O 9.8g/L，C6H8O7·H2O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO43.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为625g/L，115℃，30min单独灭菌；MgSO4·7H2O储液为200g/L，121℃，20min单独灭菌；1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液前，分别补加上述单独除菌的葡萄糖、MgSO4·7H2O、1000×微量元素储液及抗生素。
实施例1.提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法。
本实施例提供的基因工程菌过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase，出发菌株为大肠杆菌。
具体构建方法如下：
1).制备含有磷酸丙糖异构酶基因tpiA的重组质粒具体过程如下：
以寡核苷酸5’-ATCGCATATGCGACATCCTTTAGTGATG-3’为正向引物，记为tpiA-F，5’-GAAGATCTTTAAGCCTGTTTAGCCGCTTC-3’为反向引物，记为tpiA-R，以大肠杆菌K-12[Escherichia coli K-12]基因组DNA为模版，用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出基因tpiA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在基因tpiA的5’端和3’端分别引入NdeI和BglII酶切位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到pETDuet-1载体上，即，将基因tpiA与pETDuet-1载体分别经NdeI和BglII限制性内切酶进行双酶切，回收基因tpiA的双酶切产物与pETDuet-1载体的双酶切产物(5413bp)，经T4DNA酶连接后，得到重组质粒，记为pETDuet-tpiA。
2).将步骤1)所得重组质粒与产间苯三酚的重组质粒一起导入到宿主菌中，获得重组菌株；所述产间苯三酚的重组质粒为pACYC-phlD/marA/accADBC，含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因ACCase，所述聚酮合成酶基因phlD的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述多重抗性激活因子marA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase亚基accA的Genebank ID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083。该质粒的构建方法参照已发表论文(Zhang R,Cao Y,Liu W,et al.Improvingphloroglucinol tolerance and production in Escherichia coli by GroESLoverexpression.Microbial Cell Factories,2017,16(1):227)方法的菌株和质粒内容。
按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞，将两种重组质粒pETDuet-tpiA和pACYC-phlD/marA/accADBC通过热激法共同转化至上述制备的感受态细胞，获得重组菌株。
将质粒pACYC-phlD/marA/accADBC和空质粒pETDuet-1通过热激法转入上述制备的感受态细胞，形成对照菌株。
实施例2.利用实施例制备获得的基因工程菌发酵生产间苯三酚，通过在该基因工程菌中表达基因tpiA增强大肠杆菌合成ATP和丙酮酸的代谢通路，进而提高大肠杆菌合成间苯三酚产量。其步骤如下：
1、摇瓶发酵实验
1)一级种子液的培养：在LB种子液培养基中接种固体LB平板上的实施例1制备得到的重组大肠杆菌单菌落，并加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素，37℃生长10-12h，获得本发明所述的基因工程菌的一级种子液。
对照组：在LB种子液培养基中接种固体LB平板上的实施例1制备得到对照菌株单菌落，并加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素，37℃生长10-12h，获得对照菌株的一级种子液。
2)将上步得到的一级种子液分别按1％(wt)接种量转接至含100mL发酵培养基的500mL发酵摇瓶中，转接种子液时各补加葡萄糖储液、MgSO4.7H2O储液、1000×微量元素储液、终浓度100μg/mL氨苄青霉素、终浓度34μg/mL氯霉素，每种菌株设定3个重复，37℃、200rpm培养。
3)当菌液OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度50μmol/L的IPTG诱导。
4)IPTG诱导后，置于30℃、200rpm继续培养，诱导20h后收集菌液，离心取上清，测定间苯三酚含量。
2、间苯三酚的含量检测
间苯三酚(PG)浓度测定：肉桂醛显色法测定发酵液中间苯三酚的含量，其原理是根据间苯三酚与肉桂醛的显色反应，具体步骤如下：
1)配制10mg/L的肉桂醛显色液(肉桂醛直接溶解于体积比1:3的浓盐酸/乙醇溶液中)。
2)向1.5mL离心管中加入1mL肉桂醛显色液，再加入5μL发酵液上清，颠倒混匀，室温放置15min。
3)取200μL加入96孔板，用酶标仪读取OD446值；
4)绘制间苯三酚标准曲线，根据标准曲线计算间苯三酚含量。
根据本实施例操作步骤，摇瓶水平，含有质粒pACYC-phlD/marA/accADBC和空质粒pETDuet-1的对照菌株PG产量为0.81g/L，含有两种重组质粒pETDuet-tpiA和pACYC-phlD/marA/accADBC的菌株产量为1.5g/L，如图1所示。在摇瓶发酵的相同发酵条件下，含有两种重组质粒pETDuet-tpiA和pACYC-phlD/marA/accADBC的基因工程菌菌株比单质粒pACYC-phlD/marA/accADBC的对照菌株间苯三酚浓度提高了约85％。
本实施例所列数据为多次重复试验的平均数值。
本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
虽然本发明已经公开了示例性示范方案，但是本领域人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
核苷酸序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 768
<212> DNA
<213> tpiA基因
<400> 1
atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac 60
gagctggttt ctaacctgcg taaagagctg gcaggtgttg ctggctgtgc ggttgcaatc 120
gcaccaccgg aaatgtatat cgatatggcg aagcgcgaag ctgaaggcag ccacatcatg 180
ctgggtgcgc aaaacgtgga cctgaacctg tccggcgcat tcaccggtga aacctctgct 240
gctatgctga aagacatcgg cgcacagtac atcatcatcg gtcactctga acgtcgtact 300
taccacaaag aatctgacga actgatcgcg aaaaaattcg cggtgctgaa agagcagggc 360
ctgactccgg ttctgtgcat cggtgaaacc gaagctgaaa atgaagcggg caaaactgaa 420
gaagtttgcg cacgtcagat cgacgcggta ctgaaaactc agggtgctgc ggcattcgaa 480
ggtgcggtta tcgcttacga acctgtatgg gcaatcggta ctggcaaatc tgcaactccg 540
gctcaggcac aggctgttca caaattcatc cgtgaccaca tcgctaaagt tgacgctaac 600
atcgctgaac aagtgatcat tcagtacggc ggctctgtaa acgcgtctaa cgctgcagaa 660
ctgtttgctc agccggatat cgacggcgcg ctggttggtg gtgcttctct gaaagctgac 720
gccttcgcag taatcgttaa agctgcagaa gcggctaaac aggcttaa 768
<210> 2
<211> 1053
<212> DNA
<213> phlD基因
<400> 2
atggcttcta cactttgcct tccacacgtc atgtttccgc aacacaagat cacccagcaa 60
cagatggtcg atcacctgga aaacctgcac gccgaccatc cacgcatggc cctggccaag 120
cgcatgatcg ccaacaccga agtcaacgag cgccacctgg tgttgccgat cgacgaactg 180
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gaacagaact gtgcgcacaa cgacttcttc atcttccaca ccggtggtcg caagatcctc 840
gacgagctgg tgatgcacct ggacctggca tccaaccggg tctcgcaatc gcgcagcagc 900
ctgtcggaag ccggcaacat tgccagcgtg gtggtgttcg acgtactcaa gcggcagttc 960
gattccaacc tcaatcgcgg cgacatcggc ctgctggcag ccttcggccc ggggttcacc 1020
gcggaaatgg cggtgggcga gtggaccgcc tga 1053
<210> 3
<211> 384
<212> DNA
<213> marA 基因
<400> 3
atgtccagac gcaatactga cgctattacc attcatagca ttttggactg gatcgaggac 60
aacctggaat cgccactgtc actggagaaa gtgtcagagc gttcgggtta ctccaaatgg 120
cacctgcaac ggatgtttaa aaaagaaacc ggtcattcat taggccaata catccgcagc 180
cgtaagatga cggaaatcgc gcaaaagctg aaggaaagta acgagccgat actctatctg 240
gcagaacgat atggcttcga gtcgcaacaa actctgaccc gaaccttcaa aaattacttt 300
gatgttccgc cgcataaata ccggatgacc aatatgcagg gcgaatcgcg ctttttacat 360
ccattaaatc attacaacag ctag 384
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> tpiA-F
<400> 4
atcgcatatg cgacatcctt tagtgatg 28
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> tpiA-R
<400> 5
gaagatcttt aagcctgttt agccgcttc 29

Claims (9)

1.一种提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase，出发菌株为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA来源于大肠杆菌K-12，Genebank ID：948409。
3.根据权利要求1所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述聚酮合成酶基因phlD的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；所述多重抗性激活因子marA的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase亚基accA的Genebank ID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083。
4.权利要求1-3任意一项所述提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备含有磷酸丙糖异构酶基因tpiA的重组质粒；
2）将步骤1）所得重组质粒与产间苯三酚的重组质粒一起导入到宿主菌中，获得重组菌株；所述产间苯三酚的重组质粒含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase；所述宿主菌为大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1）是将磷酸丙糖异构酶基因tpiA连接到载体pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-tpiA。
6.根据权利要求5所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1）所述的重组质粒的制备，是以大肠杆菌K-12基因组DNA为模版，经PCR扩增获得磷酸丙糖异构酶基因tpiA，将磷酸丙糖异构酶基因tpiA与pETDuet-1载体分别经NdeI和BglII限制性内切酶双酶切后，将酶切后的磷酸丙糖异构酶基因tpiA与pETDuet-1载体大片段5413 bp连接，制备获得重组质粒；所述PCR扩增的正向引物tpiA-F，序列如 SEQ ID NO：4所示；反向引物tpiA-R，序列如 SEQ ID NO :5所示。
7.权利要求1-3任意一项所述提高间苯三酚产量的基因工程菌在发酵生产间苯三酚中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，经培养生产间苯三酚，所述发酵培养基成分为：K2HPO4•3H2O 9.8 g/L，C6H8O7·H2O 2.1g/L，柠檬酸铁铵 0.3 g/L，(NH4)2SO4 3.0 g/L，葡萄糖 20g/L，MgSO4•7H2O 0.4 g/L，1000×微量元素，所述微量元素为：(NH4)6Mo7O24•4H2O 3.7 g/L，ZnSO4•7H2O 2.9 g/L，H3BO3 24.7g/L，CuSO4•5H2O 2.5 g/L，MnCl2•4H2O 15.8 g/L；所述各成分浓度均为在发酵培养基中的终浓度；接种时加入氨苄青霉素至终浓度100 μg/mL，氯霉素终浓度34 μg/mL。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，当所述基因工程菌培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导后获得间苯三酚。
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