CN102787135A - 一种提高工程大肠杆菌间苯三酚合成能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高重组细胞间苯三酚合成能力的方法，具体说涉及一种通过代谢工程手段改造重组细胞，提高生物法合成间苯三酚产量的方法。

Description

一种提高工程大肠杆菌间苯三酚合成能力的方法

技术领域

本发明涉及一种高产间苯三酚的工程大肠杆菌。本发明还涉及用上述工程大肠杆菌制备间苯三酚的方法。

背景技术

间苯三酚又名1，3，5-三羟基苯、均苯三酚，是重要的精细化工产品，可以用作药物合成的中间体、燃料耦合剂、轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料，在纺织品及皮革染色工艺、生产塑料胶囊、替代碘化银用于人工降雨等方面有广泛应用。除此之外，间苯三酚本身还是一种优良的医药产品，性能优越的抗养护剂，早已广泛用于抗菌、防腐等。

早在20世纪50年代，间苯三酚的化学合成工艺就已经建立起来并应用到工业生产中，包括2，4，6-三硝基甲苯(TNT)途径、1，3，5-三异丙基苯途径等。但传统的化学合成工艺后处理较难、污染环境且原料存在安全隐患，同时副产物的存在使得间苯三酚的分离精制比较困难。

生物催化是以酶为催化剂来完成的化学反应，反应条件温和，对环境友好；以可再生资源为底物的生物催化合成，是解决全球能源危机的有效途径，近年来研究非常活跃。间苯三酚及其衍生物的生物催化合成途径主要是在对荧光假单胞菌phlACBDE基因簇的功能分析的基础形成的。通过反向遗传学的手段，研究者发现了间苯三酚合成的关键基因phlD，PhlD蛋白可催化小分子底物丙二酸单酰辅酶A聚酮缩合及环化等一系列反应，最终生成间苯三酚，这一研究使生物法合成间苯三酚成为可能。中国发明专利200810225401进一步证实了在工程大肠杆菌中异源表达phlD基因可以导致间苯三酚在培养基中的积累。

然而，间苯三酚作为一种酚类物质，本身就是一种优良的杀菌剂，对大肠杆菌的正常生长具有严重的抑制作用。另一方面，间苯三酚不是大肠杆菌的正常代谢产物，野生型大肠杆菌的代谢流并不适用于间苯三酚的高效合成。因此，上述间苯三酚合成工程菌的产量还比较低，离实际应用的要求尚有一定差距。

发明内容

为了进一步提高大肠杆菌工程菌的间苯三酚合成能力，我们采用代谢工程的手段对该工程菌株进行了改造。为了提高大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，我们在大肠杆菌中过量表达了多重抗性激活因子marA基因。MarA是的一个正向调控转录因子，能参与调控大肠杆菌60多个基因的转录，所激活转录的基因中包括acrAB、TolC等，是大肠杆菌最主要的主动外排系统，可使大肠杆菌对抗生素、有毒物质和有机溶剂的耐受性显著增加。另外，我们对大肠杆菌的代谢网络进行改造，使代谢流重定向到间苯三酚合成的分支。

本发明的目的在于提供一种提高工程大肠杆菌间苯三酚合成能力的方法。为了增强大肠杆菌流向间苯三酚的代谢流，我们在大肠杆菌中过量表达了自身的乙酰辅酶A羧化酶基因(ACCase)。ACCase属于生物素包含酶的类型，在绝大多数细胞中均有分布。ACCase催化脂肪酸从头合成的第一步，是生物体内脂肪酸合成的限速酶，在脂肪酸代谢过程中起着重要的作用。大肠杆菌ACCase，属于异质型ACCase，由四个亚基组成：生物素羧基载体蛋白亚基，生物素羧化酶亚基和转羧酶的两个亚基。ACCase能够催化乙酰辅酶A与二氧化碳羧化生成丙二酸单酰辅酶A，而丙二酸单酰辅酶A则是合成间苯三酚的直接前体。因此，过量表达ACCase对于提高间苯三酚产量具有重要作用。

为实现该目标，本发明提供的工程大肠杆菌制备间苯三酚的步骤为：

构建酶系统或重组细胞，所述酶系统包括聚烯酮酐合成酶(PhlD)(GenBank登录号：6060688)、多重抗性因子(MarA)(GenBank登录号：6060688)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)(GenBank登录号：6062185、6058890、6058863或6059083)；所述重组细胞整合了编码聚烯酮酐合成酶的基因phlD、编码多重抗性因子的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶的ACCase基因。

使用上述重组细胞来生产间苯三酚的方法包括以下步骤：

将重组细胞按体积比1-5％的接种量接种到添加50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度30-37℃、搅拌速度400-800rpm、pH 6.0-8.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为8-12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1mmol·L^-1，继续补料40-80重量％的葡萄糖发酵12-24小时；

将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1-3次；

合并萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末即为间苯三酚。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种提高细胞合成间苯三酚的能力的方法，所述方法包括在所述细胞中表达多重抗性因子(MarA)。

2.根据以上1所述的方法，所述方法还包括在所述细胞中表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)。

3.根据以上1或2所述的方法，其中所述细胞能够表达聚烯酮酐合成酶(PhlD)。

4.根据以上3所述的方法，其中所述细胞是荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)或导入了能够表达聚烯酮酐合成酶(PhlD)的表达载体的重组大肠杆菌细胞(Escherichia coli)。

5.根据以上4所述的方法，其中在所述重组大肠杆菌细胞中共表达编码聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD、编码多重抗性因子(MarA)的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因，优选所述共表达是通过一个、两个或更多个用于共表达这些基因的表达质粒来实现的。

6.根据以上5所述的方法，其中所述phlD基因是来源于细菌，优选来源于荧光假单胞菌，或是和phlD基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和phlD基因没有明显的同源性，但和phlD具有相同或相似功能的核酸序列；

所述marA基因是来源于细菌，优选大肠杆菌，或是和marA同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和marA基因没有明显的同源性，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；和

所述ACCase基因是来源于细菌，优选大肠杆菌，或是和ACCase基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ACCase基因没有明显的同源性，但和ACCase具有相同或相似功能的核酸序列。

7.一种用于合成间苯三酚的重组细胞，其中该细胞共表达：编码聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD；以及编码多重抗性因子(MarA)的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因中的至少一个、优选两个，更优选所述细胞是大肠杆菌细胞，还更优选所述共表达是通过一个、两个或更多个用于共表达这些基因的表达质粒来实现的。

8.一种利用以上7所述的重组细胞生产间苯三酚的方法，所述细胞是大肠杆菌细胞，其中所述方法包括：

(1)将以上7所述的大肠杆菌重组细胞按体积比1-5％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵，在培养温度30-37℃、搅拌速度400-800rpm、pH6.0-8.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为8-12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1mmol·L^-1，继续补料发酵12-24小时；

(2)将培养液进行离心，分离大肠杆菌菌体和上清，上清采用等体积的萃取剂萃取1-3次；

(3)合并(2)中所述萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末即为间苯三酚。

9.根据以上8所述的方法，其中所述方法适用于摇瓶培养或发酵罐培养。

10.根据以上8所述的方法，其中：

1)所述培养基为M9发酵培养基，并向其中添加了50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素；

2)所述方法采用分批补料发酵，补料底物为40-80重量％的葡萄糖；和/或

3)所述萃取剂为乙酸乙酯。

本发明具有以下优点：

本发明中的酶系统或重组细胞其间苯三酚合成能力大大提高，每升发酵液间苯三酚产量可达到3.5-5克，而仅表达PhlD蛋白的重组细胞每升发酵液间苯三酚产量为2-2.3克，经改造后的菌株间苯三酚产量提高了1.5-2.5倍，该方法为间苯三酚生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。

附图说明

图1是聚烯酮酐合成酶(phlD)、多重抗性因子(marA)共表达载体pET-phlDmarA的示意图；

图2是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)表达载体pA-accADBC的示意图。

图3是间苯三酚的核磁共振氢谱。

图4是间苯三酚的核磁共振碳谱。

具体实施方式

实施例1：

构建聚烯酮酐合成酶(phlD)和多重抗性因子(marA)共表达的载体，具体过程如下：

以寡核苷酸5’-CAT GCC ATG GTA GAT AAA CGC GAA TC-3’和5’-ACG CGT CGA CTC AGAAGG CAG ACG TAT CC-3’为引物，以荧光假单胞菌Pf-5[Psendomonas fluorescens Pf-5(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC BAA-477)]基因组DNA为模板，用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出聚烯酮酐合成酶(phlD)基因，并在5’端和3’端分别引入NdeI和BamHI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用NdeI和BamHI酶切的pET30a(Novagen)载体上，得到重组质粒pET-phlD；以寡核苷酸5’-CAT GCC ATG GGC ATG TCC AGA CGC AAT ACT GAC GC-3’和5’-GGA GGA TCC TAG CTG TTG TAA TGA TTT AAT GGA TG-3’为引物，以大肠杆菌BL21[Escherichia coli BL21(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC 41842)]基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出多重抗性基因(marA)基因，并在5’端和3’端分别引入NcoI和BamHI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用NcoI和BamHI酶切的pACYCduet-1(Novagen)载体上，得到重组质粒pA-marA；以寡核苷酸5’-CCG GAATTC TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG G-3’和5’-ACG CGT CGA CCTAGC TGT TGT AAT GAT TTA ATG GAT G-3’为引物，以重组质粒pA-marA为模板，用PCR方法扩增出T7marA片段，并在5’端和3’端分别引入EcoRI和SalI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用EcoRI和SalI酶切的pET-phlD载体上，得到重组质粒pET-phlDmarA(参见图1)。

构建乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的表达载体，具体过程如下：

以寡核苷酸5’-CGC GGA TCC GAT GAG TCT GAA TTT CCT TGATTT TG-3’和5’-ATG CGA GCT CTT ACG CGT AAC CGT AGC TCA TC-3’为引物，以大肠杆菌BL21基因组为模板，用PCR方法扩增出乙酰辅酶A羧化酶亚基A基因，并在5’端和3’端分别引入BamHI和SacI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用BamHI和SacI酶切的pACYCduet-1载体上，得到重组质粒pA-accA；以寡核苷酸5’-CGC GGATCC GAT GAG CTG GAT TGA ACG AAT TAA AAG-3’和5’-ATG CGAGCT CTC AGG CCT CAG GTT CCT GAT C-3’为引物，以大肠杆菌BL21基因组为模板，用PCR方法扩增出乙酰辅酶A羧化酶亚基D基因，并在5’端和3’端分别引入BamHI和SacI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用BamHI和SacI酶切的pACYCduet-1载体上，得到重组质粒pA-accD；以寡核苷酸5’-ATG CGA GCT CTT AAT ACG ACT CAC TATAGG GG-3’和5’-ACG CGT CGA CTC AGG CCT CAG GTT CCT GAT C-3’为引物，以重组质粒pA-accD为模板，用PCR方法扩增出T7accD片段，并在5’端和3’端分别引入SacI和SalI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用SacI和SalI酶切的pA-accA载体上，得到重组质粒pA-accAD；以寡核苷酸5’-GGA ATT CCA TAT GGA TAT TCG TAA GATTAA AAA AC-3’和5’-CCG CTC GAG TTA TTT TTC CTG AAG ACCGAG-3’为引物，以大肠杆菌BL21基因组为模板，用PCR方法扩增出乙酰辅酶A羧化酶亚基BC基因，并在5’端和3’端分别引入NdeI和XhoI位点，然后用上述酶切位点将此基因克隆到同样用NdeI和XhoI酶切的pA-accAD载体上，得到重组质粒pA-accADBC(参见图2)。

实施例2：

将实施例1中构建得到的重组质粒pET-phlDmarA和pA-accADBC采用热击转化法共转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后涂布于带有卡那霉素和氯霉素两种抗性的LB固体培养基平板上筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌BL21/phlDACCasemarA。

实施例3：

采用实施例2中构建得到的重组大肠杆菌BL21/phlDACCasemarA发酵生产间苯三酚，其步骤如下：

将重组细胞按体积比1％的接种量接种到添加50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度30℃、搅拌速度400rpm、pH 6.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L^-1，继续补料40重量％的葡萄糖发酵12小时；

将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1次；

合并萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末经核磁共振氢谱(参见附图3)和碳谱(参见附图4)鉴定为间苯三酚，每升培养基的产量达到3.5克。

实施例4：

采用实施例2中构建得到的重组大肠杆菌BL21/phlDACCasemarA发酵生产间苯三酚，其步骤如下：

将重组细胞按体积比3％的接种量接种到添加50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度33℃、搅拌速度600rpm、pH 7.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为10，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L^-1，继续补料60重量％的葡萄糖发酵18小时；

将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取2次；

合并萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末经质谱鉴定即为间苯三酚，每升培养基的产量达到4.3克。

实施例5：

采用实施例2中构建得到的重组大肠杆菌BL21/phlDACCasemarA发酵生产间苯三酚，其步骤如下：

将重组细胞按体积比5％的接种量接种到添加50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度37℃、搅拌速度800rpm、pH 8.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为12，加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol·L^-1，继续补料80重量％的葡萄糖发酵24小时；

将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取3次；

合并萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末经质谱鉴定即为间苯三酚，每升培养基的产量达到5克。

Claims (10)

1.一种提高细胞合成间苯三酚的能力的方法，所述方法包括在所述细胞中表达多重抗性因子(MarA)(GenBank登录号：6060688)。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述细胞中表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)(GenBank登录号：6062185、6058890、6058863或6059083)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞能够表达聚烯酮酐合成酶(PhlD)(GenBank登录号：EU554263)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞是荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)或导入了能够表达聚烯酮酐合成酶(PhlD)的表达载体的重组大肠杆菌细胞(Escherichia coli)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述重组大肠杆菌细胞中共表达编码聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD、编码多重抗性因子(MarA)的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因，优选所述共表达是通过一个、两个或更多个用于共表达这些基因的表达质粒来实现的。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述phlD基因是来源于细菌，优选来源于荧光假单胞菌，或是和phlD基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和phlD基因没有明显的同源性，但和phlD具有相同或相似功能的核酸序列；

所述marA基因是来源于细菌，优选大肠杆菌，或是和marA同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和marA基因没有明显的同源性，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；和

所述ACCase基因是来源于细菌，优选大肠杆菌，或是和ACCase基因同源性超过70％的核酸序列，或来源于其它生物体，和ACCase基因没有明显的同源性，但和ACCase具有相同或相似功能的核酸序列。

7.一种用于合成间苯三酚的重组细胞，其中该细胞共表达：编码聚烯酮酐合成酶(PhlD)的基因phlD；以及编码多重抗性因子(MarA)的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的ACCase基因中的至少一个、优选两个，更优选所述细胞是大肠杆菌细胞，还更优选所述共表达是通过一个、两个或更多个用于共表达这些基因的表达质粒来实现的。

8.一种利用权利要求7所述的重组细胞生产间苯三酚的方法，所述细胞是大肠杆菌细胞，其中所述方法包括：

(1)将权利要求7所述的大肠杆菌重组细胞按体积比1-5％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵，在培养温度30-37℃、搅拌速度400-800rpm、pH 6.0-8.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为8-12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1mmol·L^-1，继续补料发酵12-24小时；

(2)将培养液进行离心，分离大肠杆菌菌体和上清，上清采用等体积的萃取剂萃取1-3次；

(3)合并(2)中所述萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末即为间苯三酚。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法适用于摇瓶培养或发酵罐培养。

10.根据权利要求8所述的方法，其中：

1)所述培养基为M9发酵培养基，并向其中添加了50μg·mL^-1卡那霉素和30μg·mL^-1氯霉素；

2)所述方法采用分批补料发酵，补料底物为40-80重量％的葡萄糖；和/或

3)所述萃取剂为乙酸乙酯。

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