CN108728471A - 产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了产3‑羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用。本发明公开的重组菌的构建方法，包括：敲除受体菌的fadR基因、fabF基因、fabH基因和向受体菌中导入acc基因或基因簇、alkL基因、mcr基因以及增强受体菌中fadL基因、fadD基因、sthA基因和atoSC基因簇的表达；受体菌为含有fadR基因、fabF基因和fabH基因的细菌或真菌。实验证明，利用本发明的重组菌以脂肪酸为原料生产3‑羟基丙酸的转化率为28.37％，表明，可以利用本发明的重组菌制备3‑羟基丙酸。

Description

产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用。
背景技术
以化石资源利用为基础的化学品制造面临着资源枯竭和环境污染等日趋严重的问题。以生物合成路线实现传统化学品的低成本制造成为具有前景的替代手段。通过对工业微生物菌株进行遗传改造，可以改进微生物细胞对原料的利用、提高产品转化率，从而降低生产成本。
3-羟基丙酸是一种重要的化学中间体和具有广阔市场前景的平台化合物，也是美国能源部2004年列出的当前世界12种最具潜力开发的生物基化工产品之一。3-羟基丙酸不仅本身可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂，通过氧化、脱水、还原、酯化、聚合等反应可以合成多种重要的化学品，包括丙烯酸、丙二酸、1，3丙二醇、丙烯酰胺、聚3-羟基丙酸等。
目前生产3-羟基丙酸的方法主要包括化学合成方法和生物合成方法。制备3-羟基丙酸的化学方法包括3-羟基腈水解法、水合丙烯酸法、3-羟基丙醛氧化法、丙烯醇氧化法等。3-羟基丙酸的生物法合成方法主要是利用微生物发酵将原料转化为3-羟基丙酸，或将相关酶提取后在无细胞体系中生产3-羟基丙酸。微生物合成3-羟基丙酸的研究主要包括三个方面：(1)筛选、诱变天然合成3-羟基丙酸的微生物菌株；(2)构建重组微生物工程菌株利用葡萄糖产3-羟基丙酸；(3)构建微生物工程菌株利用甘油生产3-羟基丙酸。
筛选、诱变天然合成3-羟基丙酸的微生物主要集中在假丝酵母，但由于假丝酵母合成3-羟基丙酸通常需要以丙酸为碳源，经济可行性较差。
以葡萄糖为底物合成3-羟基丙酸的重组微生物工程菌株构建主要包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等。工程菌株合成3-羟基丙酸主要利用了两类合成途径：(1)经3-羟基丙酰辅酶A的合成途径；(2)经丙二酸单酰辅酶A的合成途径。美国Cargill公司以经3-羟基丙酰辅酶A途径为基础，利用大肠杆菌等工程菌株中将葡萄糖转化为乳酸，然后经过丙酰辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰水解酶的催化等三步反应生成3-羟基丙酸。美国OPX生物公司利用经丙二酸单酰辅酶A的途径，通过乙酰辅酶A羧化酶和丙二酸单酰辅酶A还原酶的催化将底物转化为3-羟基丙酸。
以甘油为底物合成3-羟基丙酸的重组微生物工程菌株构建主要通过在克雷伯氏肺炎杆菌或者大肠杆菌中引入醛氧化酶将3-羟基丙醛氧化成3-羟基丙酸。
目前生物法合成3-羟基丙酸的主要技术限制是原料价格相对较高，所采用途径的理论转化率低，亟待开发新的低成本原料路线。脂肪酸是一类具有高度还原状态的物质，用于微生物发酵、生物转化的脂肪酸原料可以从油料粗加工产物、地沟油等来源以低廉的价格获取。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何生产3-羟基丙酸。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法。
本发明所提供的重组菌的构建方法，包括对受体菌进行甲或乙的改造，得到所述重组菌；所述甲为A6；所述乙为A6以及A1、A2、A3、A4、A5、A7和A8这七种中的全部或部分；
A1、敲除所述受体菌的脂肪酸降解转录因子fadR基因或抑制除所述fadR基因的表达或抑制所述fadR基因编码的蛋白质的活性；
A2、敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因或抑制除所述fabF基因的表达或抑制所述fabF基因编码的蛋白质的活性；
A3、敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH基因或抑制除所述fabH基因的表达或抑制所述fabH基因编码的蛋白质的活性；
A4、增加所述受体菌中乙酰辅酶A羧化酶acc基因或基因簇编码蛋白质的含量或增强所述acc基因或基因簇编码蛋白质的活性；
A5、增加所述受体菌中外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因编码蛋白质的含量或增强所述alkL基因编码蛋白质的活性；
A6、增加所述受体菌中丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr基因编码蛋白质的含量或增强所述mcr基因编码蛋白质的活性；
所述受体菌为含有所述fadR基因、所述fabF基因和所述fabH基因的细菌或真菌。
上述方法中，所述受体菌可为1)或2)：
1)大肠杆菌；
2)大肠杆菌BW25113。
上述方法中，所述acc基因或基因簇可来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或/和混浊红球菌(Rhodococcus opacus)。
所述alkL基因可来源于除烃海杆菌(Marinobacfer hydrocarbonoclasticus)或/和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
所述mcr基因可来源于嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)。
上述方法中，所述fadR基因可编码下述a1)或a2)的蛋白质：
a1)序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质；
a2)将序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述fabF基因可编码下述a3)或a4)的蛋白质：
a3)序列表中SEQ ID No.14所示的蛋白质；
a4)将序列表中SEQ ID No.14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.14的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述fabH基因可编码下述a5)或a6)的蛋白质：
a5)序列表中SEQ ID No.16所示的蛋白质；
a6)将序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.16的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述acc基因或基因簇可编码a7)和a8)的蛋白质：
a7)下述a71)或a72)：
a71)序列表中SEQ ID No.26所示的蛋白质；
a72)将序列表中SEQ ID No.26的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.26的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
a8)下述a81)或a82)：
a81)序列表中SEQ ID No.27所示的蛋白质；
a82)将序列表中SEQ ID No.27的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.27的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述alkL基因可编码下述a9)或a10)的蛋白质：
a9)序列表中SEQ ID No.29所示的蛋白质；
a10)将序列表中SEQ ID No.29的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.29的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述mcr基因编码可下述a11)或a12)的蛋白质：
a11)序列表中SEQ ID No.37所示的蛋白质；
a12)将序列表中SEQ ID No.37的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.37的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，A4可通过向所述受体菌中导入所述acc基因或基因簇实现。
A5可通过向所述受体菌中导入所述alkL基因实现。
A6可通过向所述受体菌中导入所述mcr基因实现。
上述方法中，所述向所述受体菌中导入所述acc基因或基因簇具体可为将包含所述acc基因或基因簇的表达载体(即acc基因或基因簇表达载体)导入所述受体菌。
所述向所述受体菌中导入所述alkL基因具体可为将包含所述alkL基因的表达载体(即alkL基因表达载体)导入所述受体菌。
所述向所述受体菌中导入所述mcr基因具体可为将包含所述mcr基因的表达载体(即mcr基因表达载体)导入所述受体菌。
所述表达载体均可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pSB1s或pXB1k，所述pSB1s的序列为序列表中SEQ ID No.30，所述pXB1k的序列为序列表中SEQ IDNo.35。
在向所述受体菌中导入所述acc基因或基因簇、所述alkL基因和/或所述mcr基因时，可通过导入单独表达载体来实现，也可通过导入共表达载体实现，所述单独表达载体只含有所述acc基因或基因簇、所述alkL基因和所述mcr基因中的一个，所述共表达载体含有所述acc基因或基因簇、所述alkL基因和所述mcr基因中的至少两个。
在本发明的一个实施例中，向所述受体菌中导入所述acc基因或基因簇和所述alkL基因时是通过将含有这两个基因或基因簇的共表达载体(即acc-alkL共表达载体)导入所述受体菌实现的，向所述受体菌中导入所述mcr基因时通过将含有这个基因的单独表达载体(即mcr表达载体)导入所述受体菌实现的。所述acc-alkL共表达载体具体可为将所述acc基因或基因簇和所述alkL基因导入所述pSB1s中得到的重组载体pSB1s-acc-alkL。所述pSB1s-acc-alkL能表SEQ ID No.26所示的accBC蛋白质、SEQ ID No.27所示的accDA蛋白质以及SEQ ID No.29所示的alkL蛋白质。所述mcr表达载体具体可为将所述mcr基因导入所述pXB1k中得到的重组载体pXB1k-mcr。所述pXB1k-mcr能表达SEQ ID No.37所示的mcr蛋白质。
上述方法中，所述fadR基因可为下述b1)或b2)：
b1)序列表中SEQ ID No.1所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述fabF基因可为下述b3)或b4)：
b3)序列表中SEQ ID No.13所示的cDNA分子或DNA分子；
b4)与b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述fabH基因可为下述b5)或b6)：
b5)序列表中SEQ ID No.15所示的cDNA分子或DNA分子；
b6)与b5)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述acc基因或基因簇可为下述b7)或b8)：
b7)序列表中SEQ ID No.25的第15-3259位所示的cDNA分子或DNA分子；
b8)与b7)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述alkL基因可为下述b9)或b10)：
b9)序列表中SEQ ID No.28所示的cDNA分子或DNA分子；
b10)与b9)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述mcr基因可为下述b11)或b12)：
b11)序列表中SEQ ID No.36所示的cDNA分子或DNA分子；
b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
上述方法中，A1所述敲除所述受体菌的脂肪酸降解转录因子fadR基因可利用同源重组进行，具体可利用具有所述fadR基因敲除性状的大肠杆菌菌株JW1176来实现。
A2所述敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因可利用同源重组进行，具体可利用具有所述fabF基因敲除性状的大肠杆菌菌株JW1081来实现。
A3所述敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH基因可利用同源重组进行，具体可利用具有所述fabH基因敲除性状的大肠杆菌菌株JW1077来实现。
上述方法还可包括下述B1-B4中的四种、任三种、任两种或任一种：
B1、增加所述受体菌中fadL基因编码蛋白质的含量或增强所述fadL基因编码蛋白质的活性；
B2、增加所述受体菌中脂肪酸β氧化途径中基因编码蛋白质的含量或增强所述脂肪酸β氧化途径中基因编码蛋白质的活性；
所述脂肪酸β氧化途径中基因是选自如下一种或多种基因：编码脂酰辅酶A合酶的fadD基因、编码脂酰辅酶A脱氢酶的fadE基因、编码3-羟酰辅酶A脱氢酶的fadB基因、编码3-酮脂酰辅酶A硫解酶的fadA基因、编码3-酮脂酰辅酶A硫解酶的fadl基因、编码3-羟酰辅酶A脱氢酶的fadJ基因和编码短链脂酰辅酶A合酶的fadK基因；
B3、增加所述受体菌中sthA基因编码蛋白质的含量或增强所述sthA基因编码蛋白质的活性；
B4、增加所述受体菌中短链脂肪酸降解途径中基因编码蛋白质的含量或增强所述短链脂肪酸降解途径中基因编码蛋白质的活性；
所述短链脂肪酸降解途径中基因为B4a或B4b：
B4a、短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC基因簇中基因；
B4b、短链脂肪酸降解基因簇atoDAEB基因簇中基因。
上述方法中，所述受体菌还可含有所述fadL基因、所述脂肪酸β氧化途径中基因、所述sthA基因和/或所述短链脂肪酸降解途径中基因。
上述方法中，所述短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC基因簇中基因可为编码atoC转录激活因子的基因atoC基因和/或编码atoS感应组氨酸激酶的基因atoS基因。
所述短链脂肪酸降解基因簇atoDAEB基因簇中基因可为编码乙酰乙酰辅酶A转移酶α亚基的基因atoA基因、编码乙酰乙酰辅酶A转移酶β亚基的基因atoD基因、编码乙酰乙酸转运蛋白的基因atoE基因和/或编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的基因atoB基因。
上述方法中，所述fadL基因可编码下述a17)或a18)的蛋白质：
a17)序列表中SEQ ID No.6所示的蛋白质；
a18)将序列表中SEQ ID No.6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.6的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述fadD基因可编码下述a19)或a20)的蛋白质：
a19)序列表中SEQ ID No.9所示的蛋白质；
a20)将序列表中SEQ ID No.9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.9的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述sthA基因可编码下述a21)或a22)的蛋白质：
a21)序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质；
a22)将序列表中SEQ ID No.12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.12的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述atoSC基因簇可编码下述a23)和a24)的蛋白质：
a23)下述a231)或a232)的蛋白质：
a231)序列表中SEQ ID No.19所示的蛋白质；
a232)将序列表中SEQ ID No.19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.19的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
a24)下述a241)或a242)的蛋白质：
a241)序列表中SEQ ID No.21所示的蛋白质；
a242)将序列表中SEQ ID No.21的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.21的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，B1可通过将所述fadL基因的启动子替换为启动子PCPA1实现。
B2可通过将所述脂肪酸β氧化途径中基因的启动子替换为所述启动子PCPA1实现。
B3可通过将所述sthA基因的启动子替换为所述启动子PCPA1实现。
B4可通过将所述短链脂肪酸降解途径中基因的启动子替换为所述启动子PCPA1实现。
上述方法中，所述短链脂肪酸降解途径中基因的启动子可为所述短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC基因簇的启动子或所述短链脂肪酸降解基因簇atoDAEB基因簇的启动子。
上述方法中，所述启动子PCPA1可为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.3的第1443-1622位的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，将所述fadL基因的启动子替换为启动子PCPA1可通过序列表中SEQ IDNo.4所示的DNA片段来实现。
将所述脂肪酸β氧化途径中基因的启动子替换为所述启动子PCPA1可通过序列表中SEQ ID No.7所示的DNA片段来实现。
将所述sthA基因的启动子替换为所述启动子PCPA1可通过序列表中SEQ ID No.10所示的DNA片段来实现。
将所述短链脂肪酸降解途径中基因的启动子替换为所述启动子PCPA1可通过序列表中SEQ ID No.17所示的DNA片段来实现。
上述方法中，所述75％或75％以上同一性均可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了3-羟基丙酸的制备方法。
本发明所提供的3-羟基丙酸的制备方法，包括：以脂肪酸为底物，采用所述重组菌的制备方法制备的所述重组菌进行生物转化，制备3-羟基丙酸。
上述3-羟基丙酸的制备方法中，所述脂肪酸可为棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸、辛酸和/或己酸。
上述3-羟基丙酸的制备方法还可包括在所述生物转化前利用阿拉伯糖对所述重组菌进行诱导。
上述3-羟基丙酸的制备方法具体可为利用所述重组菌对所述脂肪酸进行全细胞催化制备3-羟基丙酸。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Z1-Z4中任一产品：
Z1、由所述重组菌的制备方法制备的重组菌；
Z2、蛋白质或成套蛋白质，为下述M1或M2：
M1、M1a和M1b，M1a为所述mcr基因编码的蛋白质，M1b为所述acc基因或基因簇编码的蛋白质和所述alkL基因编码的蛋白质中的全部或部分；
M2、上述M1和M2a，M2a为所述fadL基因编码的蛋白质、所述fadD基因编码的蛋白质、所述sthA基因编码的蛋白质和所述atoSC基因簇编码的蛋白质中的全部或部分；
Z3、基因或成套基因，为下述N1或N2：
N1、N1a和N1b，N1a为所述mcr基因，N1b为所述acc基因或基因簇和所述alkL基因中的全部或部分；
N2、上述N1和N2a，N2a为所述fadL基因、所述fadD基因、所述sthA基因和所述atoSC基因簇中的全部或部分；
Z4、成套试剂，由所述启动子PCPA1和所述基因或成套基因组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述产品的下述任一应用：
X1、生产3-羟基丙酸；
X2、制备生产3-羟基丙酸产品；
X3、降解脂肪酸；
X4、制备降解脂肪酸产品。
本发明以脂肪酸为原料合成3-羟基丙酸，理论转化率达到217.86％，显著高于葡萄糖(理论转化率为100％)。本发明还制备了以脂肪酸为原料生产3-羟基丙酸的重组菌，该重组菌可以利用从油料粗加工产物、地沟油等来源以低廉的价格获取的脂肪酸原料用于微生物发酵和生物转化生产3-羟基丙酸。因此利用脂肪酸原料合成3-羟基丙酸具有潜在的成本优势。利用本发明的重组菌以脂肪酸为原料生产3-羟基丙酸的转化率为28.37％，表明，可以利用本发明的重组菌制备3-羟基丙酸。
附图说明
图1为利用FM08生产β-丙氨酸。
图2为利用FI08生产3-羟基丙酸。
图3为利用FA11生产β-丙氨酸。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的野生型P1噬菌体(Thomason LC，Costantino N.2007.E.coligenome manipulation by P1 transduction.Current Protocols in MolecularBiology：1.17.1-8)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Datsenko KA，Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000；97(12)：6640-6645.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、重组大肠杆菌工程菌株FM07的构建
本实施例制备了可以用于制备生产β-丙氨酸和3-羟基丙酸的菌株的一株基础菌FM07，该菌株的制备方法如下，所用引物见表1。
(1)脂肪酸降解转录因子fadR的敲除。
从大肠杆菌BW25113出发，敲除了大肠杆菌BW25113的fadR基因，得到大肠杆菌BW25113的突变体FM01，具体步骤如下：
(1-a)制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，该大肠杆菌基因片段具有fadR敲除性状。
含有fadR敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株JW1176，该菌株为含有fadR敲除性状的W3110系列菌株，JW1176为日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品，其中的编码脂肪酸降解转录因子的基因fadR替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1300bp)从而将fadR基因敲除(Baba T，Ara T，et al.Construction of Escherichia coliK-12 in-frame，single-gene knockout mutants：the Keiocollection.Mol.Syst.Biol.2006；2：2006.0008.)。P1噬菌体制备过程如下：将JW1176菌株37℃过夜培养后转接于含5mmol/L CaCl2和0.1％葡萄糖的LB培养基中，培37℃养1h，然后加入野生型P1噬菌体继续培养1-3h。加几滴氯仿再培养几分钟，离心取上清，即得到含有fadR敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir fadR。
(1-b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株FM01-Kan：
过夜培养的大肠杆菌BW25113(受体菌)，取1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mM CaCl2和5mM MgSO4)重悬BW25113菌体细胞，将100μL噬菌体P1vir fadR与100μL BW25113细胞悬浮液混和，37℃孵育30min，然后加入1mL的LB培养基和200μL的1mol/L柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μL的LB培养基重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，37℃培养过夜后，挑选克隆，用fadR-IF/fadR-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FM01-Kan。
(1-c)抗性的消除：
将pCP20质粒(Clontech公司)通过氯化钙转化法转化至FM01-Kan，在含有氨苄青霉素的LB平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pCP20的重组大肠杆菌FM01-Kan/pCP20。在含有氨苄青霉素抗性的LB培养基30℃培养后，涂布于无抗性LB平板上43℃培养过夜，挑选克隆，用fadR-IF/fadR-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FM01。
其中，FM01是将大肠杆菌BW25113的脂肪酸降解转录因子fadR基因敲除的菌株。大肠杆菌BW25113中，fadR基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质，fadR基因的编码序列如SEQID No.1所示。fadR-IF/fadR-IR从FM01的基因组DNA中扩增得到一个约400bp的片段，从大肠杆菌BW25113的基因组DNA中扩增得到一个约1100bp的片段。其中fadR-IF和fadR-IR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的fadR基因的上游区域和下游区域。测序分析结果表明FM01的基因组上没有fadR基因，FM01是将大肠杆菌BW25113的fadR基因敲除，得到的大肠杆菌BW25113的突变体。
(2)通过启动子替换增强fadL基因的表达。
从重组菌FM01出发，将该菌株中fadL基因的启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1，得到重组大肠杆菌FM02，具体步骤如下：
(2-a)含有pKD46质粒宿主菌的制备：
将pKD46质粒(Clontech公司)通过氯化钙转化法转化至上一步获得的FM01菌株中，在含有氨苄青霉素的LB平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌FM01/pKD46。重组大肠杆菌FM01/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。然后通过10％甘油洗涤制备成FM01/pKD46感受态细胞。
(2-b)用于扩增替换启动子打靶基因片段的质粒的制备：
CPA1-Lox66-Kan-Lox71片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3。CPA1-Lox66-Kan-Lox71含有：A.组成型启动子PCPA1序列，其核苷酸序列是SEQ ID No.3的第1443-1622位，B.带LOXP侧翼的卡那霉素抗性基因(LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQ ID No.3的第21-1433位。CPA1-Lox66-Kan-Lox71序列通过全基因合成(南京金士瑞生物科技有限公司)，连接在pUC57载体上，获得重组载体pUC57-9K。
(2-c)打靶片段fadLup-kan-PCPA1-fadLdown的制备：
以pUC57-9K为模板，采用引物fadL-PF/fadL-PR扩增出fadLup-kan-PCPA1-fadLdown片段，fadLup-kan-PCPA1-fadLdown片段的序列为序列表中SEQ ID No.4，该片段含有(a)fadL基因的启动子上游同源臂fadLup，其核苷酸序列是SEQ ID No.4的第1-51位；(b)带LOXP侧翼的卡那霉素抗性基因(LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQ ID No.4的第52-1492位；(c)大肠杆菌组成型启动子PCPA1，其核苷酸序列是SEQ ID No.4的第1493-1670位；(d)fadL基因的启动子下游同源臂fadLdown，其核苷酸序列是SEQ ID No.4的第1671-1722位。
(2-d)同源重组：
将上述fadLup-kan-PCPA1-fadLdown片段电转入(2-a)所制备的FM01/pKD46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)的LB平板37℃过夜，挑选克隆，用fadL-PIF/fadL-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约2000bp目的带为阳性，扩增出约400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM02-kan。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的fadL基因启动子的上游和下游区域。测序分析结果表明FM02-kan的基因组上含有步骤(2-c)的fadLup-kan-PCPA1-fadLdown片段。
(2-e)抗性的消除：
将pCP20质粒(Clontech公司)通过氯化钙转化法转化至FM02-Kan，在含有氨苄青霉素的LB平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pCP20的重组大肠杆菌FM02-Kan/pCP20。在含有氨苄青霉素抗性的LB培养基30℃培养后，涂布于无抗性LB平板上43℃培养过夜，挑选克隆，fadL-PIF/fadL-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约600bp目的带为阳性，扩增出约2000bp或400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM02。
其中，FM02是将FM01的fadL基因的启动子替换为组成型启动子PCPA1的菌株。FM01中，fadL基因编码SEQ ID No.6所示的蛋白质，fadL基因的编码序列如SEQ ID No.5所示。测序分析结果表明FM02的基因组上fadL基因启动子替换为了组成型启动子PCPA1，fadL基因的表达由PCPA1启动。
(3)通过启动子替换增强fadD基因的表达。
从重组菌FM02出发，将该菌株中脂酰辅酶A合酶fadD基因的启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1，得到重组大肠杆菌FM03，具体步骤如下：
(3-a)含有pKD46质粒宿主菌的制备：
按照步骤(2)的方法，将pKD46质粒转化至上一步获得的FM02菌株中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌FM02/pKD46，然后制备成FM02/pKD46感受态细胞。
(3-b)打靶片段fadDup-kan-PCPA1-fadDdown的制备：
以步骤(2)的pUC57-9K为模板，采用引物fadD-PF/fadD-PR扩增出fadDup-kan-PCPA1-fadDdown片段，fadDup-kan-PCPA1-fadDdown片段的序列为序列表中SEQ ID No.7，该片段含有(a)fadD基因的启动子上游同源臂fadDup，其核苷酸序列是SEQ ID No.7的第1-51位；(b)带LOXP侧翼的卡那霉素抗性基因(LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQ ID No.7的第52-1492位；(c)大肠杆菌组成型启动子PCPA1，其核苷酸序列是SEQ ID No.7的第1493-1670位；(d)fadD基因的启动子下游同源臂fadDdown，其核苷酸序列是SEQ ID No.7的第1671-1722位。
(3-C)同源重组：
将上述fadDup-kan-PCPA1-fadDdown片段电转入(3-a)所制备的FM02/pKD46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)的LB平板37℃过夜，挑选克隆，用fadD-PIF/fadD-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出2000bp目的带为阳性，扩增出约400bp长度目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM03-kan。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的fadD基因的启动子的上游和下游区域。测序分析结果表明FM03-kan的基因组上含有步骤(3-b)的fadDup-kan-PCPA1-fadDdown片段。
(3-d)抗性的消除：
按照步骤(2)的方法利用pCP20质粒消除FM03-kan的卡那霉素抗性，利用fadD-PIF/fadD-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约600bp目的带为阳性，扩增出约2000bp或400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM03。
其中，FM03是将FM02的fadD基因启动子替换为组成型启动子PCPA1的菌株。FM02中，fadD基因编码SEQ ID No.9所示的蛋白质，fadD基因的编码序列如SEQ ID No.8所示。测序分析结果表明FM03的基因组上fadD基因启动子替换为了组成型启动子PCPA1，fadD基因的表达由PCPA1启动。
(4)通过启动子替换增强sthA基因的表达。
从重组菌FM03出发，将该菌株中脂酰辅酶A合酶sthA基因的启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1，得到重组大肠杆菌FM04，具体步骤如下：
(4-a)含有pKD46质粒宿主菌的制备：
按照步骤(2)的方法，将pKD46质粒转化至上一步获得的FM03菌株中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌FM03/pKD46，然后制备成FM03/pKD46感受态细胞。
(4-b)打靶片段sthAup-kan-PCPA1-sthAdown的制备：
以步骤(2)的pUC57-9K为模板，采用引物sthA-PF/sthA-PR扩增出sthAup-kan-PCPA1-sthAdown片段，sthAup-kan-PCPA1-sthAdown片段的序列为序列表中SEQ ID No.10，该片段含有(a)sthA基因的启动子上游同源臂fadDup，其核苷酸序列是SEQ ID No.10的第1-51位；(b)带LOXP侧翼的卡那霉素抗性基因(LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQ IDNo.10的第52-1492位；(c)大肠杆菌组成型启动子PCPA1，其核苷酸序列是SEQ ID No.10的第1493-1670位；(d)sthA基因的启动子下游同源臂fadDdown，其核苷酸序列是SEQ ID No.10的第1671-1722位。
(4-c)同源重组：
将上述sthAup-kan-PCPA1-sthAdown片段电转入(4-a)所制备的FM03/pKD46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)的LB平板37℃过夜，挑选克隆，用sthA-PIF/sthA-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约2000bp目的带为阳性，扩增出约400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM04-kan。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的sthA基因的启动子的上游和下游区域。测序分析结果表明FM04-kan的基因组上含有步骤(4-b)的sthAup-kan-PCPA1-sthAdown片段。
(4-d)抗性的消除：
按照步骤(2)的方法利用pCP20质粒消除FM04-kan的卡那霉素抗性，利用sthA-PIF/sthA-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约600bp目的带为阳性，扩增出约2000bp或400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM04。
其中，FM04是将FM03的sthA基因启动子替换为组成型启动子PCPA1的菌株。FM03中，sthA基因编码SEQ ID No.12所示的蛋白质，sthA基因的编码序列如SEQ ID No.11所示。测序分析结果表明FM04的基因组上sthA基因启动子替换为了组成型启动子PCPA1，sthA基因的表达由PCPA1启动。
(5)β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF的敲除。
从重组菌出FM04出发，敲除了FM04的fabF基因，得到FM05，具体步骤如下：
(5-a)制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，该大肠杆菌基因片段具有fabF敲除性状。
含有fabF敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株JW1081，JW1081为日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品。按照步骤(1)的P1噬菌体制备方法，将JW1176菌株替换为菌株JW1081，得到含有fabF敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir fabF。
(5-b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株FM05-Kan：
按照步骤(1)的方法，将大肠杆菌BW25113替换为步骤(4)的FM04，并用fabF-IF/fabF-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出约1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FM05-Kan。
(5-c)抗性的消除：
按照步骤(1)的方法，将FM01-Kan替换为FM05-Kan，消除菌株的卡那抗性，用fabF-IF/fabF-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FM05。
其中，FM05是将FM04的fabF基因敲除的菌株。FM04中，fabF基因编码SEQ ID No.14所示的蛋白质，fabF基因的编码序列如SEQ ID No.13所示。fabF-IF/fabF-IR从FM05的基因组DNA中扩增得到一个约400bp的片段，从FM04的基因组DNA中扩增得到一个约1600bp的片段。其中fabF-IF和fabF-IR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的fabF基因的上游区域和下游区域。测序分析结果表明FM05的基因组上没有fabF基因，FM05是将FM04的fabF基因敲除得到的菌株。
(6)β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH的敲除。
从重组菌出FM05出发，敲除了FM05的fabH基因，得到FM06，具体步骤如下：
(6-a)制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，该大肠杆菌基因片段具有fabH敲除性状。
含有fabH敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株JW1077，JW1077为日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品。按照步骤(1)的P1噬菌体制备方法，将JW1176菌株替换为菌株JW1077，得到含有fabH敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir fabH。
(6-b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株FM06-Kan：
按照步骤(1)的方法，将大肠杆菌BW25113替换为步骤(4)的FM05，并用fabH-IF/fabH-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FM06-Kan。
(6-c)抗性的消除：
按照步骤(1)的方法，将FM01-Kan替换为FM06-Kan，消除菌株的卡那抗性，用fabH-IF/fabH-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FM06。
其中，FM06是将FM05的fabH基因敲除的菌株。FM05中，fabH基因编码SEQ ID No.16所示的蛋白质，fabH基因的编码序列如SEQ ID No.15所示。fabH-IF/fabH-IR从FM06的基因组DNA中扩增得到一个约400bp的片段，从FM05的基因组DNA中扩增得到一个约1400bp的片段。其中fabH-IF和fabH-IR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的fabH基因的上游区域和下游区域。测序分析结果表明FM06的基因组上没有fabH基因，FM06是将FM05的fabH基因敲除得到的菌株。
(7)通过启动子替换增强atoS基因和atoC基因的表达。
从重组菌FM06出发，将该菌株中短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC(该基因簇含有atoS基因和atoC基因)的启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1，得到重组大肠杆菌FM07，具体步骤如下：
(7-a)含有pKD46质粒宿主菌的制备：
按照步骤(2)的方法，将pKD46质粒转化至上一步获得的FM06菌株中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌FM06/pKD46，然后制备成FM06/pKD46感受态细胞。
(7-b)打靶片段atoSCup-kan-PCPA1-atoSCdown的制备：
以步骤(2)的pUC57-9K为模板，采用引物atoSC-PF/atoSC-PR扩增出atoSCup-kan-PCPA1-atoSCdown片段，atoSCup-kan-PCPA1-atoSCdown片段的序列为序列表中SEQ ID No.17，该片段含有(a)atoSC基因簇的启动子上游同源臂atoSCup，其核苷酸序列是SEQ ID No.17的第1-51位；(b)带LOXP侧翼的卡那霉素抗性基因(LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQID No.17的第52-1492位；(c)大肠杆菌组成型启动子PCPA1，其核苷酸序列是SEQ ID No.17的第1493-1670位；(d)atoSC基因簇的启动子下游同源臂atoSCdown，其核苷酸序列是SEQID No.17的第1671-1722位。
(7-c)同源重组：
将上述atoSCup-kan-PCPA1-atoSCdown片段电转入(7-a)所制备的FM06/pKD46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)的LB平板37℃过夜，挑选克隆，用atoSC-PIF/atoSC-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出2000bp目的带为阳性，扩增出400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM07-kan。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的atoSC基因簇的启动子的上游和下游区域。测序分析结果表明FM07-kan的基因组上含有步骤(7-b)的atoSCup-kan-PCPA1-atoSCdown片段。
(7-d)抗性的消除：
按照步骤(2)的方法利用pCP20质粒消除FM07-kan的卡那霉素抗性，利用atoSC-PIF/atoSC-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约600bp目的带为阳性，扩增出约2000bp或400bpbp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FM07。
其中，FM07是将FM06的atoSC基因簇的启动子替换为组成型启动子PCPA1的菌株。FM06中，atoSC基因簇中atoS基因编码SEQ ID No.19所示的蛋白质，atoS基因的编码序列如SEQ ID No.18所示，atoC基因编码SEQ ID No.21所示的蛋白质，atoC基因的编码序列如SEQID No.20所示。测序分析结果表明FM07的基因组上atoSC基因簇的启动子替换为了组成型启动子PCPA1，atoSC基因簇中atoS基因和atoC基因的表达由PCPA1启动。
表1.实施例1所用引物序列列表
实施例2、用于生产β-丙氨酸的菌株FM08的制备及β-丙氨酸的生产
一、用于生产β-丙氨酸(β-alanine)的菌株FM08的制备
FM08的制备方法如下，所用引物见表2。
(1)表达嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶截短体基因mcrC的质粒的构建。
(1-a)mcrC基因的PCR扩增。
经过改造的嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶截短体基因mcrC的核苷酸序列如SEQ ID No.22，编码序列表中SEQ ID No.23所示的蛋白质。全基因合成SEQ ID No.22所示的mcrC基因，然后用Gibson组装方法(Gibson DG，YoungL，et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat.methods.2009；6(5)：343-345)将SEQ ID No.22所示的mcrC基因连接在pUC57载体上，获得载体pUC57-mcrC。以mcrC-F和mcrC-R为引物，载体pUC57-mcrC为模板，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为AP221)进行PCR扩增，得到序列正确的mcrC基因片段。
(1-b)构建含有mcrC基因的重组表达载体。
用Ncol和Xhol酶切载体pLB1a(载体pLB1a核苷酸序列如SEQ ID No.24)，回收载体大片段LB1a-NX。用Gibson组装方法将上述(1-a)得到的序列正确的mcrC基因片段与LB1a-NX片段进行连接反应。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201)。涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F105-F/mcrC-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pLB1a-mcrC。
(2)表达谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium_glutamicum)乙酰辅酶A羧化酶acc基因簇的质粒的构建。
全基因合成谷氨酸棒状杆菌乙酰辅酶A羧化酶acc基因簇，并用Gibson组装方法连接至pUC57载体上，获得载体pUC57-acc。acc基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.25。其中位于accBC基因前的RBS1位点，序列是SEQ ID No.25的第2-7位；accBC的核苷酸序列是SEQ IDNo.25第15-1790位，氨基酸序列为SEQ ID No.26，accDA的核苷酸序列是SEQ ID No.25的第1805-3259位，氨基酸序列为SEQ ID No.27，accBC和accDA序列之间含有RBS2位点，序列是SEQ ID No.25的第1792-1797位。以acc-F和acc-R为引物，载体pUC57-acc为模板，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶PCR扩增出序列正确的acc基因片段。
用Xhol和EcoRI酶切步骤(1)的质粒pLB1a-mcrC，获得大片段LB1a-mcrC-XE。用Gibson组装方法将上述acc基因片段与LB1a-mcrC-XE片段进行连接反应。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物acc-F/T58-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pLB1a-mcrC-acc。
(3)表达除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoc/asticus)外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因的质粒的构建。
采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，产品目录为DP302)提取除烃海杆菌基因组DNA。以提取的除烃海杆菌基因组总DNA作为模板，以引物alkL-F/alkL-R通过PCR扩增alkL基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。用EcoRI和Pstl酶切步骤(2)获得的载体pLB1a-mcrC-acc获得大片段LB1a-mcrC-acc-EP。用Gibson组装方法将上述alkL基因片段与LB1a-mcrC-acc-EP片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，用引物alkL-F/T58-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pLB1a-mcrC-acc-alkL。
pLB1a-mcrC-acc-alkL含有SEQ ID No.22所示的mcrC基因、SEQ ID No.25所示的acc基因簇和SEQ ID No.28所示的DNA片段，其中SEQ ID No.28的第2-7位为RBS的序列，SEQID No.28的第15-686位为alkL的核苷酸序列。pLB1a-mcrC-acc-alkL能表达SEQ ID No.23所示的mcrC蛋白质、SEQ ID No.26所示的accBC蛋白质、SEQ ID No.27所示的accDA蛋白质以及SEQ ID No.29所示的alkL蛋白质。
(4)表达大肠杆菌(Escherichia coli)β-丙氨酸氨基转移酶基因baat基因(puuE基因)的质粒的构建。
从大肠杆菌中提取基因组DNA，用引物puuE-F/puuE-R扩增puuE基因片段。用Ncol和Xhol酶切载体pSB1s(载体pSB1s核苷酸序列如SEQ ID No.30)，回收载体大片段SB1s-NX。用Gibson组装方法将puuE基因片段与SB1s-NX片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，用引物F105-F/puuE-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pSB1s-puuE。
(5)表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)谷氨酸脱氢酶基因gdh基因(rocG基因)的质粒的构建。
从大肠杆菌中提取基因组DNA，用引物rocG-F/rocG-R扩增rocG基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。用Xhol和Pstl酶切载体步骤(4)的pSB1s-puuE获得大片段SB1s-puuE-XP。将rocG基因片段与SB1s-puuE-XP片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，用引物rocG-F/T-58鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pSB1s-puuE-rocG。
pSB1s-puuE-rocG含有SEQ ID No.31所示的puuE基因和SEQ ID No.33所示的DNA片段，其中SEQ ID No.33的第2-7位为RBS的序列，SEQ ID No.33的第15-1289位为rocG基因的序列。pSB1s-puuE-rocG能表达SEQ ID No.32所示的puuE蛋白质和SEQ ID No.34所示的rocG蛋白质。
(6)重组大肠杆菌FM08的构建。
将实施例1的菌株FM07制备感受态细胞，将上述步骤制备得到的pLB1a-mcrC-acc-alkL及pSB1s-puuE-rocG导入FM07中。涂布于含链霉素和氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选含有pLB1a-mcrC-acc-alkL及pSB1s-puuE-rocG的阳性克隆，命名为FM08。
FM08为将大肠杆菌BW25113进行如下(a1)-(a12)的改造得到的菌株：
(a1)将脂肪酸降解转录因子fadR基因敲除；
(a2)将fadL基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(a3)将fadD基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(a4)将sthA基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(a5)将β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因敲除；
(a6)将β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH基因敲除；
(a7)将atoSC基因簇启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(a8)导入丙二酸单酰辅酶A还原酶截短体基因mcrC基因；
(a9)导入乙酰辅酶A羧化酶acc基因簇；
(a10)导入外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因；
(a11)导入β-丙氨酸氨基转移酶基因puuE基因；
(a12)导入谷氨酸脱氢酶基因rocG基因。
将菌株FM07制备感受态细胞，将质粒pSB1s及pLB1a用CaCl2法导入FM07。涂布于含链霉素和氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选含有质粒pSB1s及pLB1a的克隆，将其命名为FM00，作为对照。
表2.实施例2所用引物序列列表
二、β-丙氨酸的制备
1、培养基的制备
A培养基：A培养基是由溶质和溶剂组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：25mM NaHPO4，25mM KH2PO4，50mM NH4Cl，5mM Na2SO4，2mM MgSO4，体积百分比浓度为0.5％的甘油，质量百分比浓度为0.5％的酵母粉，50μM FeCl3，20μM CaCl2，10μM MnCl2，10μM ZnSO4，2μM CoCl2，2μM NiCl2，2μM Na2MO4，2μM Na2SeO3和2μM H3BO3。
B培养基：B培养基是向A培养基中添加棕榈酸、聚氧乙烯醚Brii58乳化剂、Biotin和维生素B6得到的无菌培养基，其中，棕榈酸的质量百分比浓度为0.5％，聚氧乙烯醚Brij58乳化剂的质量百分比浓度为0.2％，Biotin的浓度为40mg/L，维生素B6的浓度为10mg/L。
C培养基：C培养基是向A培养基中添加棕榈酸、聚氧乙烯醚Brij58乳化剂、Biotin、NaHCO3、维生素B6和谷氨酸得到的无菌培养基，其中，棕榈酸的质量百分比浓度为1％，聚氧乙烯醚Brij58乳化剂的质量百分比浓度为0.2％，Biotin的浓度为40mg/L，NaHCO3的浓度为20mM，维生素B6的浓度为10mg/L，谷氨酸的浓度为2mM。
2、β-丙氨酸的制备
实验重复三次，每次实验重复的具体步骤如下：
2.1、菌体的培养。
将过夜培养的步骤一得到的菌株FM08按照如下方法进行培养：将菌株按1％接种量接种于20ml含有链霉素和卡纳霉素的A培养基(链霉素和卡纳霉素的浓度均为50mg/L)中，37℃培养12h后收集菌体；将收集的菌体转接于20ml含有链霉素和卡纳霉素的B培养基(链霉素和卡纳霉素的浓度均为50mg/L)中，37℃培养6h后，得到培养液，该培养液的OD600为6，向培养液中添加阿拉伯糖诱导使阿拉伯糖诱导在培养液中的质量百分比浓度为0.2％，37℃培养12h，收集菌体，即得到FM08菌体。
按照上述方法，将FM00利用不含有链霉素和卡纳霉素的A培养基与B培养基进行培养，得到FM00菌体。
2.2、β-丙氨酸的全细胞催化生产。
将上述步骤2.1收集的30mg(即1×1011cfu)干重的FM08菌体重悬于含20ml C培养基的摇瓶中，37℃培养24h后，离心取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为FM08待测样品。
按照上述方法，将FM08替换为FM00菌体，其他步骤均不变，得到FM00待测样品。
以β-丙氨酸(Sigma，05159-100G)为标准品采用标准曲线法(外标法)利用HPLC定量分析各待测样品中β-丙氨酸的含量。
定量检测结果如图1，FM08待测样品中β-丙氨酸的平均含量为0.36g/L(即0.36g/5×1012cfu)，棕榈酸的质量百分比浓度为0.78％；FM00待测样品中β-丙氨酸的平均含量为0mg/L，棕榈酸的质量百分比浓度为0.89％。利用FM08以棕榈酸为底物制备β-丙氨酸的转化率为16.36％，利用FM00无法得到β-丙氨酸。表明，可以利用FM08制备β-丙氨酸。
实施例3、用于生产3-羟基丙酸的菌株FI08的制备及3-羟基丙酸的生产
一、用于生产3-羟基丙酸的菌株FI08的制备
FI08的制备方法如下，所用引物见表3。
(1)表达谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium_glutamicum)乙酰辅酶A羧化酶acc基因簇的质粒的构建。
(1-a)谷氨酸棒状杆菌基因组DNA的提取和acc基因簇的PCR扩增。
采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，产品目录为DP302)提取谷氨酸棒状杆菌基因组DNA。以提取谷氨酸棒状杆菌基因组总DNA作为模板，以accBC-F和accL-R为引物，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶PCR扩增出基因片段accBC，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。以谷氨酸棒状杆菌基因组总DNA作为模板，以accL-F和accDA-R为引物，用TransStart FastPfu DNA聚合酶PCR扩增出基因片段accDA，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。其中accDA-R引物中引入了Nhel位点以有利于后续基因片段插入；accBC片段的3’末端与accDA片段的5’末端通过引物引入了含有RBS的互补序列用于下一轮的拼接。以accBC、accDA两个片段的混合物为模板，以accBC-F和accDA-R为引物，进一步PCR扩增出具有全长基因序列的acc片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
(1-b)构建含有acc基因的重组表达载体。
用Ncol和Xhol酶切载体pSB1s(载体pSB1s核苷酸序列如SEQ ID No.30)，回收载体大片段SB1s-NX。用Gibson组装方法将上述acc片段与SB1s-NX片段进行连接反应。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将其均匀涂布于含链霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F-105/accL-R鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，获得阳性质粒命名为pSB1s-acc。pSB1s-acc含有SEQ ID No.25的第15-3259位所示的DNA片段。
(2)表达除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因的质粒的构建。
从除烃海杆菌中提取基因组DNA，用引物alkL-F/alkL-R′扩增alkL基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。用Nhel和Spel酶切载体pSB1s-acc获得大片段SB1s-acc-HS。用Gibson组装方法将alkL片段与SB1s-acc-HS片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，用引物alkL-F/T-58鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pSB1s-acc-alkL。
pSB1s-acc-alkL含有SEQ ID No.25的第15-3259位所示的DNA片段和SEQ IDNo.28所示的DNA片段，其中SEQ ID No.28的第2-7位为RBS的序列，SEQ ID No.28的第15-686位为alkL的核苷酸序列。pSB1s-acc-alkL能表SEQ ID No.26所示的accBC蛋白质、SEQID No.27所示的accDA蛋白质以及SEQ ID No.29所示的alkL蛋白质。
(3)表达嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr的质粒的构建。
(3-a)mcr基因的PCR扩增。
经过改造的嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr基因的核苷酸序列如SEQ ID No.36，其中mcr的N端结构域核苷酸序列是SEQ IDNo.36的第1-1689位，mcr的C端结构域核苷酸序列是SEQ ID No.36的第1704-3749位，N端结构域和C端结构域之间含有RBS位点，序列是SEQ ID No.36的第1691-1696位。mcr基因序列通过全基因合成，用Gibson组装方法连接在pUC57载体上，获得载体pUC57-mcr。以pUC57-mcr为模板用引物mcr-F/mcr-R扩增，得到序列正确的mcr基因片段。
(3-b)构建含有mcr基因的重组表达载体。
将上述(3-a)得到的序列正确的mcr基因片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；用Ncol和Xhol酶切载体pXB1k(载体pXB1k核苷酸序列如SEQ ID No.35)，回收载体大片段XB1k-NX。用Gibson组装方法将上述(3-a)得到的序列正确的mcr基因片段与XB1k-NX片段进行连接反应。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。涂布于含链霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F-105/mcr-R鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，获得阳性质粒命名为pXB1k-mcr。
pXB1k-mcr含有SEQ ID No.36所示的DNA片段，能表达SEQ ID No.37所示的mcr蛋白质。
(4)重组大肠杆菌FM08的构建。
将实施例1的菌株FM07制备感受态细胞，将质粒pSB1s-acc-alkL及pXB1k-mcr用CaCl2法转化FM07。涂布于含链霉素和卡纳霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选含有pSB1s-acc-alkL及pXB1k-mcr的阳性克隆，命名为FI08。
FI08为将大肠杆菌BW25113进行如下(b1)-(b10)的改造得到的菌株：
(b1)将脂肪酸降解转录因子fadR基因敲除；
(b2)将fadL基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(b3)将fadD基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(b4)将sthA基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(b5)将β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因敲除；
(b6)将β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH基因敲除；
(b7)将atoSC基因簇启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(b8)导入乙酰辅酶A羧化酶acc基因簇；
(b9)导入外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因；
(b10)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr基因。
将实施例1的菌株FM07制备感受态细胞，将质粒pSB1s及pXB1k用CaCl2法导入FM07。涂布于含链霉素和氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选含有质粒pSB1s及pXB1k的克隆，将其命名为FC00，作为对照。
表3.实施例3所用引物序列列表
二、3-羟基丙酸(3-HP)的制备
1、培养基的制备
D培养基：D培养基是向实施例2的A培养基中添加棕榈酸和聚氧乙烯醚Brij58乳化剂得到的无菌培养基，其中，棕榈酸的质量百分比浓度为0.5％，聚氧乙烯醚Brij58乳化剂的质量百分比浓度为0.2％。
E培养基：E培养基是向实施例2的A培养基中添加棕榈酸、聚氧乙烯醚Brij58乳化剂、Biotin和NaHCO3得到的无菌培养基，其中，棕榈酸的质量百分比浓度为1％，聚氧乙烯醚Brij58乳化剂的质量百分比浓度为0.2％，Biotin的浓度为40mg/L，NaHCO3的浓度为20mM。
2、3-羟基丙酸的制备
实验重复三次，每次实验重复的具体步骤如下：
2.1、菌体的培养。
将过夜培养的步骤一得到的菌株FI08按照如下方法进行培养：将菌株按1％接种量接种于含20ml实施例2的含有链霉素和卡纳霉素A培养基(链霉素和卡纳霉素的浓度均为50mg/L)中，37℃培养12h后收集菌体；将收集的菌体转接于20ml含有链霉素和卡纳霉素的D培养基(链霉素和卡纳霉素的浓度均为50mg/L)中，37℃培养6h后，得到培养液，该培养液的OD600为6，向培养液中添加阿拉伯糖诱导使阿拉伯糖诱导在培养液中的质量百分比浓度为0.2％，37℃培养12h，收集菌体，即FI08菌体。
按照上述方法，将FC00利用不含有链霉素和卡纳霉素的A培养基与D培养基进行培养，得到FC00菌体。
2.2、3-羟基丙酸的全细胞催化生产。
将上述步骤2.1收集的30mg(即1×1011cfu)干重的FI08菌体重悬于含20ml E培养基的摇瓶中，37℃培养24h后，离心取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为FI08待测样品。
按照上述方法，将FI08替换为FC00菌体，其他步骤均不变，得到FC00待测样品。
以3-羟基丙酸(TCl，H0297-10G)为标准品采用标准曲线法(外标法)利用HPLC定量分析各待测样品中3-羟基丙酸的含量。
定量检测结果如图2，FI08待测样品中3-羟基丙酸的平均含量为0.539g/L(即0.539g/5×1012cfu)，棕榈酸的质量百分比浓度为0.81％；FC00待测样品中3-羟基丙酸的平均含量为0g/L，棕榈酸的质量百分比浓度为0.91％。利用FI08以棕榈酸为底物制备3-羟基丙酸的转化率为28.37％，利用FC00无法得到3-羟基丙酸。表明，可以利用FI08制备3-羟基丙酸。
实施例4、用于生产β-丙氨酸的菌株FA11的制备及β-丙氨酸的生产
一、用于生产β-丙氨酸的菌株FA11的制备
FA11的制备方法如下，所用引物见表4。
(1)乙醛酸途径转录抑制因子基因iclR的敲除。
从实施例1的重组菌FM07出发，敲除了FM07的iclR基因，得到FA08，具体步骤如下：
(1-a)制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，该大肠杆菌基因片段具有iclR敲除性状。
含有iclR敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株JW3978，JW3978为日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品。按照实施例1步骤(1)的P1噬菌体制备方法，将JW1176菌株替换为菌株JW3978，得到含有iclR敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1viriclR。
(1-b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株FA08-Kan：
按照实施例1中步骤(1)的方法，将大肠杆菌BW25113替换为实施例1的重组菌FM07，并用iclR-IF/iclR-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FA08-Kan。
(1-c)抗性的消除：
按照实施例1中步骤(1)的方法，将FM01-Kan替换为FA08-Kan，消除菌株的卡那抗性，用iclR-IF/iclR-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FA08。
其中，FA08是将实施例1中FM07的iclR基因敲除的菌株。FM07中，iclR基因编码SEQID No.39所示的蛋白质，iclR基因的编码序列如SEQ ID No.38所示。iclR-IF/iclR-IR从FA08的基因组DNA中扩增得到一个约400bp的片段，从FM07的基因组DNA中扩增得到一个约1200bp的片段。其中iclR-IF和iclR-IR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的iclR基因的上游区域和下游区域。测序分析结果表明FA08的基因组上没有iclR基因，FA08是将实施例1中FM07的iclR基因敲除得到的菌株。
(2)α-酮戊二酸脱羧酶基因sucA的敲除。
从FA08出发，敲除了FA08的sucA基因，得到FA09，具体步骤如下：
(2-a)制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，该大肠杆菌基因片段具有sucA敲除性状。
含有sucA敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株JW0715，JW0715为日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)产品。按照实施例1步骤(1)的P1噬菌体制备方法，将JW1176菌株替换为菌株JW0715，得到含有sucA敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1virsucA。
(2-b)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株FA09-Kan：
按照实施例1中步骤(1)的方法，将大肠杆菌BW25113替换为FA08，并用sucA-IF/sucA-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FA00-Kan。
(2-c)抗性的消除：
按照实施例1中步骤(1)的方法，将FM01-Kan替换为FA09-Kan，消除菌株的卡那抗性，用sucA-IF/sucA-IR引物PCR扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为FA09。
其中，FA09是将FA08的sucA基因敲除的菌株。FA08中，sucA基因编码SEQ ID No.41所示的蛋白质，sucA基因的编码序列如SEQ ID No.40所示。sucA-IF/sucA-IR从FA09的基因组DNA中扩增得到一个约400bp的片段，从FM08基因组DNA中扩增得到一个约3200bp的片段。其中sucA-IF和sucA-IR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的sucA基因的上游区域和下游区域。测序分析结果表明FA00的基因组上没有sucA基因，FA09是将FA08的sucA基因敲除得到的菌株。
(3)通过启动子替换增强aceB基因和aceA基因的表达。
从重组菌FA09出发，将该菌株中乙醛酸途径aceBA基因簇(该基因簇含有aceB基因和aceA基因的启动子替换为大肠杆菌组成型启动子pCPA1，得到重组大肠杆菌FA10，具体步骤如下：
(3-a)含有pKD46质粒宿主菌的制备：
按照实施例1步骤(2)的方法，将pKD46质粒转化至上一步获得的FA09菌株中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌FA09/pKD46，然后制备成FA09/pKD46感受态细胞。
(3-b)打靶片段aceBAup-kan-PCPA1-aceBAdown的制备：
以实施例1步骤(2)的pUC57-9K为模板，采用引物aceBA-PF/aceBA-PR扩增出aceBAup-kan-PCPA1-aceBAdown片段，aceBAup-kan-PCPA1-aceBAdown片段的序列为序列表中SEQ ID No.42，该片段含有(a)aceBA基因簇的启动子上游同源臂aceBAup，其核苷酸序列是SEQ ID No.42的第1-51位；(b)带LOXP侧翼的卡那霉素抗性基因(LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQ ID No.42的第52-1492位；(c)大肠杆菌组成型启动子PCPA1，其核苷酸序列是SEQ ID No.42的第1493-1670位；(d)aceBA基因簇的启动子下游同源臂aceBAdown，其核苷酸序列是SEQ ID No.42的第1671-1722位。
(3-c)同源重组：
将上述aceBAup-kan-PCPA1-aceBAdown片段电转入(3-a)所制备的FA09/pKD46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)的LB平板37℃过夜，挑选克隆，用aceBA-PIF/aceBA-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约2000bp目的带为阳性，扩增出约400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FA10-kan。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的aceBA基因簇的启动子的上游和下游区域。测序分析结果表明FA10-kan的基因组上含有步骤(3-b)的aceBAup-kan-PCPA1-aceBAdown片段。
(3-d)抗性的消除：
按照实施例1步骤(2)的方法利用pCP20质粒消除FA10-kan的卡那霉素抗性，利用aceBA-PIF/aceBA-PIR引物PCR扩增鉴定(扩增出约600bp目的带为阳性，扩增出约2000或者400bp目的带为阴性)，挑选阳性克隆命名为FA10。
其中，FA10是将FA09的aceBA基因簇的启动子替换为组成型启动子PCPA1的菌株。FA09中，aceBA基因簇中aceB基因编码SEQ ID No.44所示的蛋白质，aceB基因的编码序列如SEQ ID No.43所示，aceA基因编码SEQ ID No.46所示的蛋白质，aceA基因的编码序列如SEQID No.45所示。测序分析结果表明FA10的基因组上aceBA基因簇的启动子替换为了组成型启动子PCPA1，aceBA基因簇中aceB基因和aceA基因的表达由PCPA1启动。
(4)表达大肠杆菌(Escherichia coli)天冬氨酸转氨酶基因aspC的质粒的构建。
(4-a)大肠杆菌基因组DNA的提取和aspC基因的PCR扩增。
采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，产品目录为DP302)提取大肠杆菌基因组DNA。以提取大肠杆菌基因组总DNA作为模板，以aspC-F和aspC-R为引物，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为AP221)PCR扩增出序列正确的基因片段aspC。
(4-b)构建含有aspC基因的重组表达载体。
用Ncol和Xhol酶切载体pLB1a(载体pLB1a核苷酸序列如SEQ ID No.24)，回收载体大片段LB1a-NX。用Gibson组装方法将上述步骤得到的序列正确的基因片段aspC与LB1a-NX片段进行连接反应。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将其均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物F105-F/aspC-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pLB1a-aspC。
(5)表达大肠杆菌(Escherichia coli)谷氨酸脱氢酶基因gdhA基因的质粒的构建。
从大肠杆菌中提取基因组DNA，用引物gdhA-F/gdhA-R扩增gdhA基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。用Xhol和Spel酶切载体pLB1a-aspC获得大片段LB1a-aspC-XP。用Gibson组装方法将gdhA基因片段与LB1a-aspC-XP片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，用引物gdhA-F/T58-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pLB1a-aspC-gdhA。
(6)表达除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因的质粒的构建。
从除烃海杆菌中提取基因组DNA，用引物alkL-F″/alkL-R″扩增alkL基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。用Spel和EcoRI酶切载体pLB1a-aspC-gdhA获得大片段LB1a-aspC-gdhA-PE。用Gibson组装方法将alkL基因片段与LB1a-aspC-gdhA-PE片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，用引物alkL-F/T58-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pLB1a-aspC-gdhA-alkL。
pLB1a-aspC-gdhA-alkL含有SEQ ID No.47所示的aspC基因、SEQ ID No.49所示的gdhA基因和SEQ ID No.28所示的DNA片段(含有alkL基因)。其中，SEQ ID No.49的第2-7位为RBS的序列，SEQ ID No.49的第15-1358位为gdhA基因的序列。pLB1a-aspC-gdhA-alkL能表达SEQ ID No.48所示的aspC蛋白质、SEQ ID No.50所示的gdhA蛋白质和SEQ ID No.29所示的alkL蛋白质。
(7)表达赤拟谷盗(Tribolium castaneum)L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD基因的质粒的构建。
全基因合成赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD基因，连接在pUC57载体上，获得载体pUC57-panD。panD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.51。以panD-F和panD-R为引物，载体pUC57-panD质粒为模板，用高保真TransStart FastPfuDNA聚合酶PCR扩增出panD基因片段。用Ncol和Xhol酶切载体pXB1k(载体pXB1k核苷酸序列如SEQ ID No.35)，回收载体大片段XB1k-NX。用Gibson组装方法将panD基因片段与XB1k-NX片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，涂布含卡那霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑选克隆。用引物F105-F/panD-R鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pXB1k-panD。pXB1k-panD含有SEQ ID No.51所示的panD基因，能表达SEQID No.52所示的panD蛋白质。
(8)重组大肠杆菌FA11的构建。
将步骤(3)得到的菌株FA10制备感受态细胞，将质粒pLB1a-aspC-gdhA-alkL及pXB1k-panD用CaCl2法转化FA10。涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选含有pLB1a-aspC-gdhA-alkL及pXB1k-panD的阳性克隆，命名为FA11。
FA11为将大肠杆菌BW25113进行如下(c1)-(c14)的改造得到的菌株：
(c1)将脂肪酸降解转录因子fadR基因敲除；
(c2)将fadL基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(c3)将fadD基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(c4)将sthA基因启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(c5)将β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因敲除；
(c6)将β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH基因敲除；
(c7)将atoSC基因簇启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(c8)将乙醛酸途径转录抑制因子基因iclR基因敲除；
(c9)将α-酮戊二酸脱羧酶基因sucA基因敲除；
(c10)将aceBA基因簇启动子替换为大肠杆菌组成型启动子PCPA1；
(c11)导入天冬氨酸转氨酶基因aspC基因；
(c12)导入谷氨酸脱氢酶基因gdhA基因；
(c13)导入外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因；
(c14)导入L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD基因。
将菌株FA10制备感受态细胞，将质粒pLB1a及pXB1k用CaCl2法转化FA10。涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选含有pLB1a及pXB1k的阳性克隆，命名为FA00。
表4.实施例4所用引物序列列表
二、β-丙氨酸的制备
1、培养基的制备
F培养基：F培养基是向实施例2的A培养基中添加棕榈酸、聚氧乙烯醚Brii58乳化剂和维生素B6得到的无菌培养基，其中，棕榈酸的质量百分比浓度为0.5％，聚氧乙烯醚Brij58乳化剂的质量百分比浓度为0.2％，维生素B6的浓度为10mg/L。
G培养基：G培养基是向实施例2的A培养基中添加棕榈酸、聚氧乙烯醚Brii58乳化剂、维生素B6和谷氨酸得到的无菌培养基，其中，棕榈酸的质量百分比浓度为1％，聚氧乙烯醚Brij58乳化剂的质量百分比浓度为0.2％，维生素B6的浓度为10mg/L，谷氨酸的浓度为2mM。
2、β-丙氨酸的制备
实验重复三次，每次实验重复的具体步骤如下：
2.1、菌体的培养。
将过夜培养的步骤一得到的菌株FA11按照如下方法进行培养：将菌株按1％接种量接种于含20ml实施例2的含有链霉素和卡纳霉素的A培养基(链霉素和卡纳霉素的浓度均为50mg/L)中，37℃培养12h后收集菌体；将收集的菌体转接于20ml含有链霉素和卡纳霉素的F培养基(链霉素和卡纳霉素的浓度均为50mg/L)中，37℃培养6h后，得到培养液，该培养液的OD600为6，向培养液中添加阿拉伯糖诱导使阿拉伯糖诱导在培养液中的质量百分比浓度为0.2％，37℃培养12h，收集菌体，即得到FA11菌体。
按照上述方法，将FA00利用不含有链霉素和卡纳霉素的A培养基与F培养基进行培养，得到FA00菌体。
2.2、β-丙氨酸的全细胞催化生产。
将上述步骤2.1收集的30mg(即1×1011cfu)干重的FA11菌体重悬于含20ml G培养基的摇瓶中，37℃培养24h后，离心取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为FA11待测样品。
按照上述方法，将FA11替换为FA00菌体，其他步骤均不变，得到FA00待测样品。
以β-丙氨酸(Sigma，05159-100G)为标准品采用标准曲线法(外标法)利用HPLC定量分析各待测样品中β-丙氨酸的含量。
定量检测结果如图3，FA11待测样品中β-丙氨酸的平均含量为4-2g/L(即4.2g/5×1012cfu)，棕榈酸的质量百分比浓度为0.31％；FA00待测样品中β-丙氨酸的平均含量为0g/L，棕榈酸的质量百分比浓度为0.90％。利用FA11以棕榈酸为底物制备β-丙氨酸的转化率为60.87％，利用FA00无法得到β-丙氨酸。表明，可以利用FA11制备β-丙氨酸。

Claims (10)

1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行甲或乙的改造，得到所述重组菌；所述甲为A6；所述乙为A6以及A1、A2、A3、A4、A5、A7和A8这七种中的全部或部分；
A1、敲除所述受体菌的脂肪酸降解转录因子fadR基因或抑制除所述fadR基因的表达或抑制所述fadR基因编码的蛋白质的活性；
A2、敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因或抑制除所述fabF基因的表达或抑制所述fabF基因编码的蛋白质的活性；
A3、敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶III基因fabH基因或抑制除所述fabH基因的表达或抑制所述fabH基因编码的蛋白质的活性；
A4、增加所述受体菌中乙酰辅酶A羧化酶acc基因或基因簇编码蛋白质的含量或增强所述acc基因或基因簇编码蛋白质的活性；
A5、增加所述受体菌中外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkL基因编码蛋白质的含量或增强所述alkL基因编码蛋白质的活性；
A6、增加所述受体菌中丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr基因编码蛋白质的含量或增强所述mcr基因编码蛋白质的活性；
所述受体菌为含有所述fadR基因、所述fabF基因和所述fabH基因的细菌或真菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌为1)或2)：
1)大肠杆菌；
2)大肠杆菌BW25113；
和/或，
所述acc基因或基因簇来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或/和混浊红球菌(Rhodococcus opacus)；
所述alkL基因来源于除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)或/和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；
所述mcr基因来源于嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)；
进一步，
所述fadR基因编码下述a1)或a2)的蛋白质：
a1)序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质；
a2)将序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述fabF基因编码下述a3)或a4)的蛋白质：
a3)序列表中SEQ ID No.14所示的蛋白质；
a4)将序列表中SEQ ID No.14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述fabH基因编码下述a5)或a6)的蛋白质：
a5)序列表中SEQ ID No.16所示的蛋白质；
a6)将序列表中SEQ ID No.16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述acc基因或基因簇编码a7)和a8)的蛋白质：
a7)下述a71)或a72)：
a71)序列表中SEQ ID No.26所示的蛋白质；
a72)将序列表中SEQ ID No.26的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
a8)下述a81)或a82)：
a81)序列表中SEQ ID No.27所示的蛋白质；
a82)将序列表中SEQ ID No.27的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述alkL基因编码下述a9)或a10)的蛋白质：
a9)序列表中SEQ ID No.29所示的蛋白质；
a10)将序列表中SEQ ID No.29的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述mcr基因编码下述a11)或a12)的蛋白质：
a11)序列表中SEQ ID No.37所示的蛋白质；
a12)将序列表中SEQ ID No.37的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
A4是通过向所述受体菌中导入所述acc基因或基因簇实现的；
A5是通过向所述受体菌中导入所述alkL基因实现的；
A6是通过向所述受体菌中导入所述mcr基因实现的；
进一步，
所述fadR基因为下述b1)或b2)：
b1)序列表中SEQ ID No.1所示的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述fabF基因为下述b3)或b4)：
b3)序列表中SEQ ID No.13所示的cDNA分子或DNA分子；
b4)与b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述fabH基因为下述b5)或b6)：
b5)序列表中SEQ ID No.15所示的cDNA分子或DNA分子；
b6)与b5)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述acc基因或基因簇为下述b7)或b8)：
b7)序列表中SEQ ID No.25的第15-3259位所示的cDNA分子或DNA分子；
b8)与b7)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述alkL基因为下述b9)或b10)：
b9)序列表中SEQ ID No.28所示的cDNA分子或DNA分子；
b10)与b9)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述mcr基因为下述b11)或b12)：
b11)序列表中SEQ ID No.36所示的cDNA分子或DNA分子；
b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括下述B1-B4中的四种、任三种、任两种或任一种：
B1、增加所述受体菌中fadL基因编码蛋白质的含量或增强所述fadL基因编码蛋白质的活性；
B2、增加所述受体菌中脂肪酸β氧化途径中基因编码蛋白质的含量或增强所述脂肪酸β氧化途径中基因编码蛋白质的活性；
所述脂肪酸β氧化途径中基因是选自如下一种或多种基因：编码脂酰辅酶A合酶的fadD基因、编码脂酰辅酶A脱氢酶的fadE基因、编码3-羟酰辅酶A脱氢酶的fadB基因、编码3-酮脂酰辅酶A硫解酶的fadA基因、编码3-酮脂酰辅酶A硫解酶的fadI基因、编码3-羟酰辅酶A脱氢酶的fadJ基因和编码短链脂酰辅酶A合酶的fadK基因；
B3、增加所述受体菌中sthA基因编码蛋白质的含量或增强所述sthA基因编码蛋白质的活性；
B4、增加所述受体菌中短链脂肪酸降解途径中基因编码蛋白质的含量或增强所述短链脂肪酸降解途径中基因编码蛋白质的活性；
所述短链脂肪酸降解途径中基因为B4a或B4b：
B4a、短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC基因簇中基因；
B4b、短链脂肪酸降解基因簇atoDAEB基因簇中基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC基因簇中基因为编码atoC转录激活因子的基因atoC基因和/或编码atoS感应组氨酸激酶的基因atoS基因；
所述短链脂肪酸降解基因簇atoDAEB基因簇中基因为编码乙酰乙酰辅酶A转移酶α亚基的基因atoA基因、编码乙酰乙酰辅酶A转移酶β亚基的基因atoD基因、编码乙酰乙酸转运蛋白的基因atoE基因和/或编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的基因atoB基因；
进一步，
所述fadL基因编码下述a17)或a18)的蛋白质：
a17)序列表中SEQ ID No.6所示的蛋白质；
a18)将序列表中SEQ ID No.6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述fadD基因编码下述a19)或a20)的蛋白质：
a19)序列表中SEQ ID No.9所示的蛋白质；
a20)将序列表中SEQ ID No.9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述sthA基因编码下述a21)或a22)的蛋白质：
a21)序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质；
a22)将序列表中SEQ ID No.12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述atoSC基因簇编码下述a23)和a24)的蛋白质：
a23)下述a231)或a232)的蛋白质：
a231)序列表中SEQ ID No.19所示的蛋白质；
a232)将序列表中SEQ ID No.19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
a24)下述a241)或a242)的蛋白质：
a241)序列表中SEQ ID No.21所示的蛋白质；
a242)将序列表中SEQ ID No.21的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
B1是通过将所述fadL基因的启动子替换为启动子PCPA1实现的；
B2是通过将所述脂肪酸β氧化途径中基因的启动子替换为所述启动子PCPA1实现的；
B3是通过将所述sthA基因的启动子替换为所述启动子PCPA1实现的；
B4是通过将所述短链脂肪酸降解途径中基因的启动子替换为所述启动子PCPA1实现的；
进一步，
所述启动子PCPA1为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.3的第1443-1622位的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。
7.3-羟基丙酸的制备方法，包括：以脂肪酸为底物，采用权利要求1-6中任一所述方法制备的所述重组菌进行生物转化，制备3-羟基丙酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸、辛酸和/或己酸。
9.下述任一产品：
Z1、由权利要求1-6中任一所述的方法制备的重组菌；
Z2、蛋白质或成套蛋白质，为下述M1或M2：
M1、M1a和M1b，M1a为权利要求1-6中任一所述mcr基因编码的蛋白质，M1b为权利要求1-6中任一所述acc基因或基因簇编码的蛋白质和所述alkL基因编码的蛋白质中的全部或部分；
M2、上述M1和M2a，M2a为权利要求1-6中任一所述fadL基因编码的蛋白质、所述fadD基因编码的蛋白质、所述sthA基因编码的蛋白质和所述atoSC基因簇编码的蛋白质中的全部或部分；
Z3、基因或成套基因，为下述N1或N2：
N1、N1a和N1b，N1a为权利要求1-6中任一所述mcr基因，N1b为权利要求1-6中任一所述acc基因或基因簇和所述alkL基因中的全部或部分；
N2、上述N1和N2a，N2a为权利要求1-6中任一所述fadL基因、所述fadD基因、所述sthA基因和所述atoSC基因簇中的全部或部分；
Z4、成套试剂，由权利要求1-6中任一所述启动子PCPA1和所述基因或成套基因组成。
10.权利要求9所述产品的下述任一应用：
X1、生产3-羟基丙酸；
X2、制备生产3-羟基丙酸产品；
X3、降解脂肪酸；
X4、制备降解脂肪酸产品。
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