CN109593697A - 一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法 - Google Patents

一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

一种产3‑羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法，属于基因工程领域和发酵工程领域，构建方法为：将假单胞菌脂肪酸合成相关基因fabF进行敲除，并通过过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酰辅酶A还原酶的基因mcrN、mcrC，构建一种可以使丙二酰辅酶A的代谢通量更多导向合成3‑羟基丙酸的重组菌株。获得的重组菌株能够在以乙酸为唯一碳源的培养基中生产3‑羟基丙酸，相比于原始菌株，fabF缺失体的3‑羟基丙酸合成量得到大大增高。

Description

一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体涉及一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法。
背景技术
3-羟基丙酸，是合成具有高附加经济价值的丙烯酸的绿色原料，广泛用于婴儿纸尿裤、表面涂层、油漆涂料和粘合剂工业上。乙酸是一种低廉价格的原料，在我国来源丰富，工农业排放的废水中富含大量的乙酸；合成生物气转化，一碳物质甲醇和甲烷转化，污水污泥厌氧消化等也会产生大量的乙酸。乙酸衍生的乙酰辅酶A也是3-羟基丙酸合成的前体，乙酰辅酶A是通过进入丙二酰辅酶A途径合成3-羟基丙酸的。乙酸在乙酰辅酶A合成酶的催化下合成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A经过乙酰辅酶A羧化酶生成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A在丙二酰辅酶A还原酶的作用下合成3-羟基丙酸。在乙酸合成3-羟基丙酸的代谢路径中，丙二酰辅酶A既是合成3-羟基丙酸的重要前体物质，在胞内也大多被用于生成脂肪酸和磷脂，只有很少的一部分被用于生产目标产物。
发明内容
本发明的目的在于，通过在假单胞菌中敲除编码β-酮酰基酰基载体蛋白合成酶II(由fabF基因编码)，抑制脂肪酸合成途径，使更多的丙二酰辅酶A用于3-羟基丙酸的合成，从而提高乙酸合成3-羟基丙酸的产量。
作为本发明的第一方面，提供了一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，包括步骤：
S1：敲除脱氮假单胞菌基因组DNA中的fabF基因；
S2：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因在fabF基因缺失的脱氮假单胞菌中过表达。
作为进一步优选的技术方案，所述丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC来源于嗜热光合绿丝菌。
作为进一步优选的技术方案，所述乙酰辅酶A基因accADBC来源于脱氮假单胞菌。
作为进一步优选的技术方案，所述步骤S2中的过表达方法为下列方法之一：
方法一：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因构建到原核表达载体上，然后导入fabF基因缺失的脱氮假单胞菌中，构建得到重组假单胞菌；
方法二：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因整合到fabF基因缺失的脱氮假单胞菌基因组中，构建得到重组假单胞菌。
作为进一步优选的技术方案，所述方法一具体包括：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因构建到大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pUCPK上，得到的重组菌体pUCPK-AMnc，然后用pUCPK-AMnc转化假单胞菌，得到的重组菌ZAP_ΔfabF-AMnc。
作为本发明的第二方面，提供了由上述构建方法所构建的基因工程假单胞菌菌株。
作为本发明的第三方面，提供了上述基因工程假单胞菌菌株在生产中的3-羟基丙酸应用。
作为进一步优选的技术方案，所述应用具体包括：以乙酸为原料进行好氧发酵，所用发酵培养基配方为：100mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液、8g/L乙酸钠、0.25g/L硫酸镁、1g/L氯化铵、1g/L酵母膏；生物素2.2mg/L；摇床发酵条件为：以接种后OD600＝0.1的接种量将种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵采用250mL三角瓶，控制温度37℃、250rpm，发酵时间47小时。
本发明的有益效果：本发明通过构建脂肪酸合成途径缺失菌株ΔfabF并外源表达3-羟基丙酸生产途径，获得了能够在以乙酸为唯一碳源产3-羟基丙酸的菌株，相比于原始菌株，fabF缺失体的3-羟基丙酸合成量增高了22％。
附图说明
图1为本发明实施例构建的fabF缺失菌株ZAP_ΔfabF与原始菌株ZAP以乙酸为唯一碳源的生长差异对比图；
图2为本发明实施例构建的重组菌株ZAP_ΔfabF-AMnc与ZAP-AMnc生产3-羟基丙酸的差异对比图。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，如Sambrook等分子克隆实验手册，或按照产品说明书建议的条件。本发明所使用的宿主菌为假单胞菌sp.ATCC13867，所使用的大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pUCPK为前期构建。
实施例
1.敲除基因以获得fabF缺失菌株
采用无痕敲除基金技术敲除基因fabF。具体操作如下：
对于基因fabF的敲除，首先以脱氮假单胞菌ATCC13867基因组DNA为模板PCR克隆fabF基因(SEQ ID No.1)上游序列约600bp的DNA片段fabF US(SEQ ID No.2)，和fabF基因下游序列约600bp的DNA片段fabF DS(SEQ ID No.3)，然后融合PCR方法将fabF US和fabFDS片段融合为一个片段fabF del，将融合后片段克隆至pQSAK质粒中，形成重组质粒pQSAK-fabF del。假单胞菌中电转化导入质粒pQSAK-fabF del，用卡那霉素筛选发生同源重组的转化子。随后用含10％蔗糖LB培养基筛选发生第二次同源重组的转化子。使用菌落PCR鉴定敲除成功的转化子与野生菌PCR的目的片段大小差异，能够判定是否重组成功。PCR产物送测序，野生型PCR基因跳的与fabF基因序列相同，而重组菌PCR基因条带中间部分与fabFdel片段基因序列相同，则证明基因确实被敲除成功。缺失菌株命名为ZAP_ΔfabF。
2.在ZAP_ΔfabF中过表达乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC和丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN和mcrC
以假单胞菌ZAP(Pseudomonas sp.ATCC13867)的基因组为模板，设计引物进行PCR分别扩增accA(SEQ ID NO.4)，accB(SEQ ID NO.5)，accC(SEQ ID NO.6)，accD(SEQ IDNO.7)，然后进行重叠PCR，以获得accADBC的一个基因簇。以NCBI嗜热光合绿丝菌的基因组信息查询mcr基因的核苷酸序列，然后进行密码子优化后，送去基因合成公司合成mcrN(SEQID NO.8)和mcrC(SEQ ID NO.9)，将合成的基因进行PCR扩增。将大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pUCPK用XbaI和HindIII进行酶切，将mcrN、mcrC片段连接到pUCPK上，获得的重组质粒命名为pUCPK-Mnc；此质粒用BamHI和EcoRI进行酶切，将accABDBC片段连接到pUCPK-Mnc上，获得的重组质粒命名为pUCPK-AMnc。利用电穿孔仪(伯乐)将pUCPK-AMnc通过电转化分别转入到假单胞菌ZAP_ΔfabF和假单胞菌野生菌株ZAP中，电极条件为25μF，200Ω，180V(电击杯宽度为2mm)。在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，命名为ZAP_ΔfabF-AMnc。
3.利用重组假单胞菌ZAP_ΔfabF-AMnc发酵生产3-羟基丙酸
将重组假单胞菌野生菌株ZAP-AMnc以及fabF缺失重组菌ZAP_ΔfabF-AMnc分别在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有10mL种子培养基的50mL三角瓶中，37℃、250rpm培养12小时，所得种子液OD600值为3-4。种子培养基Luria-Bertani(LB)的配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠。
分别将假单胞菌原始菌株ZAP以及fabF缺失菌ZAP_ΔfabF以接种后OD600＝0.1的接种量将种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵采用250mL三角瓶，控制温度37℃、250rpm，发酵时间24小时。发酵培养基的配方包括：100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、8g/L乙酸钠、0.25g/L硫酸镁、1g/L氯化铵、1g/L酵母膏。如图1所示，fabF缺失重组菌ZAP_ΔfabF-Amnc和原始重组菌ZAP-Amnc生长差异不大。
分别将重组假单胞菌野生菌株ZAP-AMnc以及fabF缺失重组菌ZAP_ΔfabF-AMnc以接种后OD600＝0.1的接种量将种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵采用250mL三角瓶，控制温度37℃、250rpm，补料发酵，在9h、23h分别补料2g/L和8g/L的乙酸钠，发酵时间47小时。发酵培养基的配方包括：100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、8g/L乙酸钠、0.25g/L硫酸镁、1g/L氯化铵、1g/L酵母膏；生物素2.2mg/L。发酵47小时后，如图2所示，fabF缺失重组菌ZAP_ΔfabF-AMnc产29.8mM的3-羟基丙酸，相比原始重组菌ZAP-AMnc，产量增高了22％。
应当指出的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1245
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp. ATCC13867)
<400> 1
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cagtacatgt ccgccaagga agctcgcaaa ctcgacctgt tcatccagta cggccttgcc 240
gccagttacc aggcggtgcg cgactccggc ctggaagtca ccgacgccaa ccgggagcgc 300
atcggcgttg ccatcggttc gggcatcggc ggtctgacca acattgaaaa tacttgccgt 360
tcgctgttcg agcagggccc gcggcgcatt tcgccgttct tcgtgcccgg ctcggtcatc 420
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ctggaagagc tggagcacgc ccaggcccgt ggcgcgcgta tctacgccga agtcgtaggc 780
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ggcggcacca acggttccct ggtgttccgc cggttccacg gctga 1245
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<211> 599
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<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp. ATCC13867)
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ggcgagttcg aagagctgca cggcgaccgt catttcgccg atgatgcggc catcgttggc 300
ggcgttgccc gcctcgacga gcaaccggtg atgatcatcg gtcaccagaa gggtcgcgaa 360
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acctacgcgg tgatctcccc ggaaggctgc gcctcgattc tctggcgtac cgccgagaag 720
gcgccggaag cggccgaggc gatgggcatc accgccaacc gcctgaagga tctgggcatt 780
gtcgacagca tcatccccga gccgctgggc agcgctcacc gcgacccggc cgcgatgtcc 840
cagtcgatcc gcaaggccct gctcggccag ctggatgttc tcaagcaact gagcaccgaa 900
gagctgctgg cgcgccgcta cgagcgcctg atgagctacg gcgtcgcctg a 951
<210> 5
<211> 468
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp. ATCC13867)
<400> 5
atggacatcc gtaaagtcaa gaaactgatc gaactgctcg aagaatccgg catcgacgaa 60
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cagccggtct acgccgccgc cccggcctac gccccggctc ccgtcgcagc cgctccggtc 180
gctgccgccg cagccccgac cgccgaagcc gctccggccg caccggtgct caacggcaac 240
gccgtgcgct cgccgatggt cggcaccttc tatcgcgccg cctcgccgac ctccgccaac 300
ttcgtcgaag tcggccagag cgtgaagaaa ggcgacatcc tgtgcatcgt cgaagccatg 360
aagatgatga accacatcga ggccgagacc agcggcgtga tcggtcaagt cctcgtggag 420
aacggccagc cggtcgagtt cgaccagccc ctgttcacca tcgtttaa 468
<210> 6
<211> 1350
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp. ATCC13867)
<400> 6
atgttggaaa aagtactgat cgccaaccgc ggcgaaatcg cgctgcgcat cctgcgcgcg 60
tgcaaggagc tgggcatcaa gacggtggct gtgcattcga ccgccgaccg cgaactgatg 120
cacctgtcgc tggccgacga agcggtctgc atcggtccgg ccccggctgc gcagtcctac 180
ctgcacatcc cggcgatcat cgccgcggcc gaggtcaccg gtgccgtggg tatccatccc 240
ggctacggct tcctcgccga gaacgccgac ttcgccgagc aggtcgagcg ctcgggcttc 300
accttcatcg gcccgagcgc cgacgtcatc cgcctgatgg gtgacaaggt gtccgccaag 360
gacgccatga agaaagccgg cgtgccgacc gtaccgggct ccgacggccc gctgcccgaa 420
gacgaagaga ccgcgctggc gatcgcccgc gaggttggct acccggtgat catcaaggcc 480
gccggtggcg gcggtggtcg cggcatgcgc gtcgtgcacc acgaggaaga cctgatcaag 540
tccgccaagc tgacccgtac cgaagcgggc gcggccttcg gcaactcgat ggtctacctg 600
gagaagttcc tgaccaaccc gcgtcacgtg gaagtccagg tgctctccga cggccagggc 660
aacgccatcc acctgggcga ccgcgactgc tccctgcagc gtcgtcacca gaaggtactg 720
gaagaagccc cagccccggg catcgacgag aaggcccgcg aagaagtgct ggcccgctgc 780
gtccaggcct gcatcgagat cggctatcgt ggcgccggca ccttcgagtt cctctacgag 840
aacggccgct tctacttcat cgagatgaac acccgcgtcc aggtggagca tccggtgtcg 900
gagatggtca ccggtatcga catcgtcaag gaaatgctca gcatcgcctc gggcaacaag 960
ctgtcgatcc gccaggaaga cgtggtcatc cgtggccatg cgctggaatg ccggatcaat 1020
gccgaagacc cgaagacctt catgccgagc cctggcaagg tcaagcactt ccacgcgccg 1080
ggcggcaacg gcgtgcgcgt cgattcgcac ctgtacagcg gctacgccgt accgccgaac 1140
tatgactcgc tggtgggcaa ggtcatcacc tacggcaagg accgagccga agccctggcg 1200
cgcatgcgca atgccctgga cgagctgatc gtcgacggca tcaagaccaa taccgagctg 1260
cacaaggatc tggtccgcga caaggagttc tgcaaaggtg gcgtgaacat ccactacctg 1320
gagaagaagc tgggcatgga caagcactaa 1350
<210> 7
<211> 876
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp. ATCC13867)
<400> 7
atgagcaact ggctggtaga caagctgatc ccttccatca tgcgttccga agcgaagaag 60
agctcggttc cggaaggcct gtggcacaag tgcccgtcct gcgaggcggt gctgtaccgt 120
cccgagctgg aaaagaccct ggacgtctgc ccgaagtgcg atcaccacat gcgcatcggc 180
gcccgtgccc gcctggacat cttcctcgat gaagagggtc gcgaagagct tggcgccgag 240
ctggagccgg tggatcgcct gaagttccgc gacagcaaga agtacaagga ccgcctgagc 300
gccgcgcaga aggacaccgg cgagaaggat gcgctgatct ccatgagcgg caagctgatg 360
ggcatgccgg tggtggccag cgccttcgag ttctccttca tgggcggctc gatgggctcc 420
atcgtcggcg agcgtttcgt gcgcgccgcc aactacgcct tggaaaaccg ttgcccgatg 480
atctgcttct ccgcttcggg cggtgcgcgc atgcaggaag cgctgatttc cctgatgcag 540
atggccaaga cctccgccgc gctggcgcgc ctgcgcgaag aaggcattcc gttcatctcc 600
gtgctgaccg acccggtcta cggcggcgtt tccgccagcc tggcgatgct cggcgacgtg 660
atcgtcggcg agccgcgcgc cctgatcggc ttcgccggcc cgcgggtgat cgagcagacc 720
gtgcgcgaga agctgcccga aggcttccag cgtagcgagt tcctgctgga gcacggtgcc 780
atcgacatga tcgtccaccg ttcggaaatg cgtcagcggc tcgccagcct gctggccaag 840
ttcaccaaca ctccaagtac cgcgctcgca ggatga 876
<210> 8
<211> 1653
<212> DNA
<213> 嗜热光合绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)
<400> 8
atgtctggta ccggtcgtct ggcaggtaag atcgcactga tcaccggcgg tgctggtaac 60
atcggttctg agctgactcg tcgtttcctg gcagagggtg caactgtcat catcagcggt 120
cgtaaccgcg caaagctgac cgcactggca gagcgtatgc aagcagaggc aggtgtacct 180
gcaaagcgta tcgacctgga ggtgatggac ggtagcgacc ctgtagcagt gcgtgcaggt 240
atcgaggcaa tcgtggctcg tcatggtcag atcgacatcc tggtcaacaa cgcgggcagc 300
gcaggtgcac aacgtcgtct ggctgaaatc ccactgactg aggcagagct gggtcctggt 360
gcagaagaga ctctgcatgc aagcatcgca aacctgctgg gcatgggttg gcacctgatg 420
cgtatcgcag cacctcacat gcctgtcggt agcgcagtca tcaacgtctc taccatcttc 480
tcccgtgctg agtactacgg ccgtatcccg tacgtcaccc ctaaggctgc tctgaacgct 540
ctgtcccagc tggctgcacg tgagctgggt gcacgtggta tccgtgttaa tacgatcttc 600
ccgggcccta tcgagagcga ccgtatccgt accgtgttcc agcgtatgga ccagctgaaa 660
ggccgtccag agggtgacac tgcacaccac ttcctgaaca ccatgcgtct gtgccgtgca 720
aacgaccagg gtgcactgga gcgtcgtttc ccaagcgtcg gtgacgtagc agacgcagct 780
gtattcctgg caagcgcaga gtctgcagct ctgtctggtg agactatcga ggtcacgcac 840
ggtatggagc tgccagcatg ctctgagacc tctctgctgg cacgtactga cctgcgtact 900
atcgacgcat ctggtcgtac gactctgatc tgcgctggtg accagatcga ggaggtgatg 960
gcactgaccg gtatgctgcg tacctgcggt tctgaggtga tcatcggctt ccgttccgca 1020
gccgccctgg cacaattcga acaggcggtc aacgaatccc gccgtctggc aggcgctgat 1080
ttcactccac caatcgctct gccactggac ccacgtgatc cagctactat cgatgcggtc 1140
ttcgactggg gtgctggtga aaacaccggt ggtatccacg cagctgtaat cctgccagct 1200
accagccacg aaccggctcc gtgtgtaatc gaagtggacg acgaacgtgt gctgaacttc 1260
ctggccgacg aaatcaccgg cacgatcgtg atcgccagcc gtctggctcg ttactggcaa 1320
tcccaacgtc tgaccccggg tgctcgtgct cgtggtccgc gtgttatttt cctgtctaac 1380
ggtgctgacc aaaacggcaa cgtgtacggc cgtattcagt ccgccgctat cggtcagctg 1440
atccgtgtgt ggcgtcacga agctgaactg gactaccagc gtgctagcgc tgctggtgac 1500
cacgtgctgc cgccggtttg ggctaatcaa atcgtgcgtt tcgctaaccg tagcctggaa 1560
ggtctggaat ttgcgtgcgc gtggactgct cagctgctgc acagccagcg tcatatcaac 1620
gaaatcaccc tgaacatccc ggcgaacatc taa 1653
<210> 9
<211> 2016
<212> DNA
<213> 嗜热光合绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)
<400> 9
atgagcgcga ccaccggtgc tcgtagcgct tctgtgggtt gggctgaatc cctgatcggt 60
ctgcacctgg gtaaagtggc tctgattacc ggcggtagcg ctggtatcgg tggtcagatc 120
ggtcgtctgc tggctctgtc tggcgctcgt gtaatgctgg ctgctcgcga tcgtcataaa 180
ctggaacaga tgcaggcgat gatccagtcc gaactggccg aagtgggcta caccgacgtg 240
gaagaccgcg tgcacatcgc tccgggttgt gacgttagct ccgaagctca gctggctgac 300
ctggttgaac gtactctgtc cgctttcggt accgtggact acctgatcaa caatgcgggc 360
atcgcgggtg tggaagaaat ggttatcgac atgccggttg aaggctggcg ccacaccctg 420
ttcgcgaacc tgatctccaa ctactccctg atgcgcaaac tggcgccgct gatgaaaaaa 480
cagggctccg gctacatcct gaacgtttcc tcctacttcg gcggcgaaaa agacgcggcg 540
atcccgtacc cgaaccgcgc ggattacgcg gtttccaaag ccggccagcg cgctatggcg 600
gaagttttcg cgcgtttcct gggcccggaa attcagatta acgcgattgc gccgggcccg 660
gttgaaggtg atcgcctgcg tggtactggt gaacgtccgg gtctgttcgc tcgtcgtgcc 720
cgtctgattc tggaaaacaa acgcctgaac gaactgcacg ccgccctgat tgctgcggcg 780
cgtactgatg aacgttccat gcacgaactg gttgaactgc tgctgccgaa cgatgttgcg 840
gccctggaac agaacccggc cgccccgact gcgctgcgtg aactggcccg tcgttttcgt 900
tctgaaggcg atccggcggc gtctagcagc tccgcgctgc tgaatcgttc tattgcggcc 960
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ctgccgaatc cgccggatcc gtttttcact cgtgcgcaga ttgatcgtga agcccgtaaa 1080
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gcgatggcga ccgtttatta tctggcggat cgcaacgttt ccggcgaaac cttccacccg 1200
tccggcggcc tgcgctatga acgcaccccg accggcggcg aactgttcgg cctgccgtct 1260
ccggaacgtc tggcggaact ggttggctct actgtttatc tgattggcga acacctgacg 1320
gaacacctga acctgctggc gcgtgcgtat ctggaacgtt acggcgcgcg ccaggttgtt 1380
atgattgttg aaacggaaac cggcgccgaa acgatgcgcc gcctgctgca cgatcacgtt 1440
gaagccggcc gcctgatgac tattgttgcg ggcgatcaga ttgaagccgc gattgatcag 1500
gccattaccc gctatggccg cccgggtccg gttgtatgta ctccgttccg cccgctgccg 1560
actgtaccgc tggtaggccg caaagattct gattggtcta ctgttctgtc tgaagcggaa 1620
tttgcggaac tgtgtgaaca ccagctgacc caccattttc gcgtagcgcg caaaattgcg 1680
ctgtctgatg gcgcgtctct ggcgctggta accccggaaa ccaccgcgac ctctaccacc 1740
gaacagtttg cgctggccaa ctttattaaa acgaccctgc atgcgtttac ggcgaccatt 1800
ggcgtagaat ctgaacgcac ggcccagcgc attctgatta accaggtaga tctgacccgc 1860
cgcgcgcgcg ccgaagaacc gcgcgatccg catgaacgcc agcaggaact ggaacgcttt 1920
attgaagccg ttctgctggt aaccgccccg ctgccgccgg aagcggatac ccgctatgcg 1980
ggccgcattc atcgcggccg cgcgattacc gtttaa 2016

Claims (8)

1.一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：
S1：敲除脱氮假单胞菌基因组DNA中的fabF基因；
S2：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因在fabF基因缺失的脱氮假单胞菌中过表达。
2.根据权利要求1所述的一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC来源于嗜热光合绿丝菌。
3.根据权利要求1所述的一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A基因accADBC来源于脱氮假单胞菌。
4.根据权利要求1所述的一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中的过表达方法为下列方法之一：
方法一：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因构建到原核表达载体上，然后导入fabF基因缺失的脱氮假单胞菌中，构建得到重组假单胞菌；
方法二：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因整合到fabF基因缺失的脱氮假单胞菌基因组中，构建得到重组假单胞菌。
5.根据权利要求4所述的一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述方法一具体包括：将乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD，丙二酰辅酶A还原酶基因mcrN、mcrC基因构建到大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pUCPK上，得到的重组菌体pUCPK-AMnc，然后用pUCPK-AMnc转化假单胞菌，得到的重组菌ZAP_ΔfabF-AMnc。
6.由上述任一权利要求所述的一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法所构建的基因工程假单胞菌菌株。
7.权利要求6所述的基因工程假单胞菌菌株在生产中的3-羟基丙酸应用。
8.根据权利7中所述的基因工程假单胞菌菌株在生产中的3-羟基丙酸应用，其特征在于，所述应用具体包括：以乙酸为原料进行好氧发酵，所用发酵培养基配方为：100mmol/LpH＝7.0的磷酸缓冲液、8g/L乙酸钠、0.25g/L硫酸镁、1g/L氯化铵、1g/L酵母膏；生物素2.2mg/L；摇床发酵条件为：以接种后OD600＝0.1的接种量将种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵采用250mL三角瓶，控制温度37℃、250rpm，发酵时间47小时。
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