CN103497922A

CN103497922A - 一种联产3-hp和p3hp的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103497922A
Application number: CN201310409148.6A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 冯新军; 赵广; 张汝兵
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN103497922B

Abstract

本发明公开了一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用。是将甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，醛脱氢酶基因，丙酰辅酶A合成酶基因和聚羟基脂肪酸合成酶基因导入敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因的宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌。本发明降低了3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸的生产成本，实现了以同一菌体为宿主同时合成3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。

Description

一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用。

技术背景

由于化石能源危机的日益严重以及利用化石能源带来的环境问题，制造生物燃料成为迫切问题。生物柴油是生物燃料的重要组成部分。随着生物柴油的大量生产，积累了大规模作为副产物的甘油。据估算，每生产10吨生物柴油大约生成1吨粗甘油。甘油的生产增长迅速，致使甘油价格一直较低，且还将会持续下降。充分利用甘油这种来源丰富、价格低廉的原料，可以带来巨大经济和环境效益。

3-HP是一种重要的平台化合物。以3-HP为底物可以合成一系列具有较高商业价值的化学物质，如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙烯酸甲酯、丙二酸、丙烯酰胺、羟基酰胺等。由3-HP还可以用于生产涂料、胶粘剂、抗冻剂、吸水树脂等高附加值产品。P3HP是一种非常有发展前景的生物降解性塑料，其生物材料性质和机械性能优良，如具有高机械强度和延展性、高断裂伸长量、生物兼容性、生物降解性、压电性、热塑性、不溶于水、无毒等。对比研究较多的生物降解性塑料聚乳酸（PLA）和聚3-羟基丁酸（PHB），P3HP比PLA具有更好的稳定性而不易水解，因碳链骨架中不含甲基而比PHB更易被微生物降解。基于其优良性能，P3HP可以被用于地膜、矫形外科、个人卫生用品、药物控制、包装等领域。

3-HP和P3HP均可以通过化学合成获得，但是化学合成途径具有原料受限、成本居高不下以及容易造成环境污染等问题；与化学法相比，生物合成操作简单、条件温和、绿色环保。越来越多的科研工作者将研究重点放在了生物合成途径上。

已知的由甘油制备3-HP的微生物包括脱硫弧菌属的Desulfovibrio carbinolicus和Desulfovibrio fructosovorans、威尼斯暗杆菌（Pelobacter venetianus）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）和多营养泥杆菌（Ilyobacter polytropus），但是，以上微生物合成3-HP的产量很低，代谢途径不清。可以直接合成P3HP的微生物尚未发现。研究人员把研究重点放在了构建基因工程菌合成3-HP或P3HP上。

已报道的3-HP或P3HP的合成只针对二者中某一种的合成，尚未发现以同一菌体为宿主实现3-HP和P3HP同时合成的报道。

发明内容

本发明提供了一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，是将甘油脱水酶基因（dhaB123）和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB），醛脱氢酶基因（aldH），丙酰辅酶A合成酶基因（prpE）以及聚羟基脂肪酸合成酶基因（phaC）导入宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌；所述重组肺炎克雷伯氏菌是敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到的。

本发明不仅克隆了E.coli醛脱氢酶基因aldH，同时克隆了K.penumoniae的甘油脱水酶基因dhaB123及甘油脱水酶激活再基因gdrAB，构建重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB，以甘油为底物达到合成3-HP的目的。

本发明克隆了丙酰辅酶A合成酶基因（prpE）和聚羟基脂肪酸合成酶基因（phaC），构建了重组质粒pBAD18-phaC-prpE。

本发明所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，是敲除了与副产物1,3-丙二醇合成相关的基因1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT和醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD，达到减少副产物1,3-丙二醇的合成并提高目的产物3-羟基丙酸产量的目的。

本发明通过将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌实现3-HP和P3HP的联产。

所述甘油脱水酶基因来自肺炎克雷伯氏菌。

所述甘油脱水酶再激活酶基因来自肺炎克雷伯氏菌。

所述醛脱氢酶基因来自大肠埃希氏杆菌。

所述丙酰辅酶A合成酶基因来自大肠埃希氏杆菌。

所述聚羟基脂肪酸合成酶基因来自产碱杆菌属真氧产碱杆菌。

所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，为缺失了1,3-丙二醇脱氢酶基因（dhaT）和醛还原酶/醇脱氢酶基因（yqhD）的菌株。

所述醛脱氢酶基因（aldH）、甘油脱水酶基因（dhaB123）和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB）通过重组载体pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB（pEdg）导入所述宿主菌中。

所述聚羟基脂肪酸合成酶基因（phaC）以及丙酰辅酶A合成酶基因（prpE）通过重组载体pBAD18-phaC-prpE（pBAD18-pp）导入所述宿主菌中。

本发明还提供了一种制备联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌的方法，技术方案如下：

1）克隆醛脱氢酶基因，同时克隆甘油脱水酶基因及甘油脱水酶再激活基因，构建重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB；

2）克隆聚羟基脂肪酸合成酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因，构建重组质粒pBAD18-phaC-prpE；

3）敲除肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到宿主重组肺炎克雷伯氏菌；

4）将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌得到联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌。

所述缺失基因的方法采用同源重组法，在本领域技术人员的能力范围之内。

所述重组载体导入宿主菌的方法采用电击转化法。

本发明还提供了一种联产3-HP和P3HP的方法，是以联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌发酵生产3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。

所述方法在以甘油为碳底物的培养集中培养，添加适当的表达诱导剂后可以同时合成3-HP和P3HP。

本发明以K.penumoniae宿主菌，在合成产物时不需要加入维生素B12，可以降低生产成本；敲除了宿主菌合成副产物1,3-丙二醇的相关基因，减少了副产物1,3-丙二醇的合成，提高了目的产物3-HP的产量；实现了在同一菌体内同时合成3-HP和P3HP。

定义和缩写

在本文中使用下列的缩写或简称：

3-羟基丙酸：3-HP

聚3-羟基丙酸：P3HP

甘油脱水酶基因：dhaB123

甘油脱水酶再激活酶基因：gdrAB

大肠杆菌醛脱氢酶基因：aldH

聚羟基脂肪酸合成酶基因：phaC

丙酰辅酶A合成酶基因：prpE

1,3-丙二醇脱氢酶基因：dhaT

醛还原酶/醇脱氢酶基因：yqhD

大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）：E.coli

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）：K.penumoniae

pBAD33-EaldH-dhaB123-gdrAB载体：pEdg质粒

pBAD18-phaC-prpE载体：pBAD18-pp质粒

“基因缺失”或“基因敲除”指将目标基因从基因组中删除或使目标基因中的一部分删除，从而使目标基因失去表达其对应功能的蛋白质，导致功能缺失。

“电击转化”或“电转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用高压电脉冲的电击穿孔作用将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又称电击法或电融合法等。

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平（即，野生型表达水平），可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

附图简述

图1.利用甘油合成3-羟基丙酸的代谢途径示意图；

图2.聚3-羟基丙酸合成代谢示意图；

图3.pBAD33-EaldH-dhaB123-gdrAB载体构建示意图；

图4.pBAD18-phaC-prpE载体构建示意图；

图5.重组肺炎克雷伯氏菌目的蛋白诱导量表达优化示意图；

（M表示分子量标记，泳道CK表示未进行诱导，泳道1—9依次为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%（W/V）浓度的阿拉伯糖诱导，箭头表示目的蛋白的表达）。

图6.重组肺炎克雷伯氏菌发酵产物3-羟基丙酸（3-HP）的高效液相色谱检测；

（A图为标准品，B图为未敲除菌发酵产物，C图为敲除菌发酵产物）。

图7.重组肺炎克雷伯氏菌发酵产物聚3-羟基丙酸（P3HP）的核磁图谱；

（A图为H谱，B图为C谱）。

具体实施方式

下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1）种子液摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2）发酵生产摇瓶培养基

M9改良培养基：1.09g/L一水合柠檬酸，1.14g/L二水合柠檬酸三钠，0.25g/LMgSO₄·7H₂O，1g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，1g/L酵母粉，5mg/L CoCl₂·6H₂O，100mmol/L甘油，100mmol/L pH=7.0磷酸钾缓冲液。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氯霉素或卡那霉素。

实施例1.菌株构建

通过在缺失了1,3-丙二醇脱氢酶基因（dhaT）和醛还原酶/醇脱氢酶基因（yqhD）的肺炎克雷伯氏菌（K.penumoniae）菌株基础上，过量表达内源的甘油脱水酶基因（dhaB123）和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB），以及外源的醛脱氢酶基因（aldH）、丙酰辅酶A合成酶基因（prpE）和聚羟基脂肪酸合成酶基因（phaC）实现以甘油为碳底物生物联产3-HP和P3HP。

本领域技术人员应该理解，上述肺炎克雷伯氏菌（K.penumoniae）基因的缺失实验，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述过量表达的五种基因共同克隆到肺炎克雷伯氏菌（K.penumoniae）中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

1.1基因的敲除

以肺炎克雷伯氏菌（K.penumoniae）野生菌株的1,3-丙二醇脱氢酶基因（dhaT）（Gene ID：7946507）上下游约500个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增1,3-丙二醇脱氢酶基因（dhaT）上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段。

扩增引物序列为：

Kp-dhaT-Up-5'：

5'-CGGGGTACCATGAGCTATCGTATGTTTG-3'

Kp-dhaT-Up-3'：5'-GATGAGGCGGATCGCCTGCGATCACAAACTTCACTTTG-3'

Kp-dhaT-Down-5'：5'-CAAAGTGAAGTTTGTGATCGCAGGCGATCCGCCTCATC-3'

Kp-dhaT-Down-3'：

5'-GTCCGAGCTCTCAGAATGCCTGGCGGAAAATCG-3'

以上述回收片段为模板进行搭桥PCR，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔdhaT。以自杀质粒pRE112为媒介（Robert A.Edwards,Linda H.Keller,Dieter M.Schifferli.Improved allelicexchange vectorsandtheir use to analyze987Pfimbria gene expression.Gene1998;207:149-157.）与K.penumoniae野生菌株进行同源重组敲除dhaT基因，通过PCR验证获得已经敲除dhaT的K.penumoniae工程菌即K.penumoniaeΔdhaT。

验证引物序列：

ID-Kp-dhaT-del-5'：5'-GCATTATAACCTGAAGCGAG-3'

ID-Kp-dhaT-del-inside-3'：5'-CGAGGTTGGCGTTATTGAAAG-3'

ID-Kp-dhaT-del-3'：5'-TACGCCTGGCGGTGAAAGCGAC-3'

醛还原酶/醇脱氢酶基因（yqhD）（Gene ID：6934748）的敲除在K.penumoniaeΔdhaT基础上以相同方法进行，获得菌株为K.penumoniaeΔdhaTΔyqhD。

扩增引物序列为：

Kp-yqhD-Up-5'：5'-ATGAGCTCTACAGCAGGCGGACGTCAGGC-3'

Kp-yqhD-Up-3'：5'-GGCTCGATGCCGCCAAATTC-3'

Kp-yqhD-Down-5'：

5'-GAATTTGGCGGCATCGAGCCGTATCGATGCCGCTATTGCC-3'

Kp-yqhD-Down-3'：5'-ATTCTAGATGGTACGCGGCGGCGGTGTC-3'

验证引物序列：

ID-K.p-yqhD-3’：5'-GGTGATGAACAGCTCATCGC-3'

ID-K.p-yqhD-5’：5'-GTCATCTGGCAGCGGTATCGT-3'

1.2外源基因的克隆

醛脱氢酶基因（aldH）（Gene ID:8183735）的克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得（引物：5'-CATGAGCTCGATAGACGTGAAACAGGAGTC-3'和

5'-CAGCTCTAGATCAGGCCTCCAGGCTTATCC-3'），再利用回收试剂盒回收目的片段。

甘油脱水酶基因（dhaB123）（dhaB1Gene ID:7947197;dhaB2Gene ID:7947198;dhaB3Gene ID:7947200）和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB）（gdrA Gene ID：6936977；gdrB GeneID：6938011）的克隆是以K.peneumoniae为模板，通过PCR扩增获得（引物：5'-CAGCTCTAGAGGATTTCACCTTTTGAGCCGATG-3'和

5'-TTAACGGCATGCTGACCTCCGCTTAG-3'；5'-GCGGAGGTCAGCATGCCGTTAATAG-3'和5'-CAGAAGCTTCAGTTTCTCTCACTTAACG-3'），再利用回收试剂盒回收目的片段。

以甘油脱水酶基因（dhaB123）片段和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB）片段为底物，通过搭桥PCR获得dhaB123-gdrAB。

1.3表达载体的构建

将质粒pBAD33和割胶回收后的aldH基因片段用SacI和XbaI酶切，回收酶切产物，再进行连接，载体与aldH基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pBAD33-EaldH后，再通过限制性酶和测序鉴定。

重组质粒pEdg（pBAD33-EaldH-dhaB123-gdrAB）的构建是以质粒pBAD33-EaldH和割胶回收后的dhaB123-gdrAB基因片段为基础获得，进行双酶切所用的酶为XbaI和HindIII。

对质粒pBAD18和pET21a-phaC-prpE（参见Qi Wang et al.2012（Qi Wang,Changshui Liu,MoXian,Yongguang Zhang,Guang Zhao.Biosynthetic pathway for poly(3-Hydroxypropionate)in recombinantEscherichia coli.Journal of Microbiology2012;50(4):693-697.）；phaC Gene ID:4250156；prpE Gene ID：12930817）进行双酶切，前者所用的酶为XbaI和SalI，后者所用的酶为XbaI和XhoI，将酶切后的pBAD18和phaC-prpE片段酶连后得到重组质粒pBAD18-pp（pBAD18-phaC-prpE）。

1.4重组菌株构建

接K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD于20mL的LB液体培养基中，加入50μg·mL^-1的氨苄青霉素，培养至一定菌体浓度。用灭菌离心管在4℃下5500rpm离心5分钟，去除上清，再用4℃保存的10%甘油悬浮后再次离心，重复2次。再用4℃冷藏的10%甘油重悬浮，分装，-80℃保存，得到感受态细胞。

重组质粒pEdg通过电击转化K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD感受态细胞，涂布于加有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆。

在以上重组菌的基础上，通过电击转化将重组质粒pBAD18-pp导入，最终得到工程菌株K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD（pEdg,pBAD18-pp）。

实施例2.SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达及优化

将活化后的工程肺炎克雷伯氏菌按1:100的接种量接种到20mL液体培养基中（内含100μg·mL^-1的氯霉素和100μg·mL^-1的卡那霉素），37℃，180rpm振荡培养，OD₆₀₀达到0.6时，在菌液中加入一定浓度的阿拉伯糖，而后调节温度至30℃继续培养3h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心10min收集菌体，菌体细胞用0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤一次。再加入1mL磷酸缓冲液，破碎细胞，取10μL上清加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴5min，瞬时高速离心，10%SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达情况（图5），其中箭头表示目的蛋白的表达，甘油脱水酶DhaB123（100KDa）、甘油脱水酶再激活酶GdrAB（82KDa）、丙酰辅酶A合成酶PrpE（70KDa）、醛脱氢酶EaldH（55KDa）、聚羟基脂肪酸合成酶PhaC（40KDa）。

实施例3.重组菌株的摇瓶发酵试验

将活化后的重组菌株按1:100的比例接种到含有50mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中（内含100μg·mL^-1的氯霉素和100μg·mL^-1的卡那霉素），37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，加入0.05%阿拉伯糖，此后，每隔12h添加一次阿拉伯糖和抗生素，阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。

取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测发酵产物。气相色谱（图6）证实得到了3-羟基丙酸；且敲除副产物合成相关基因工程菌比较未敲除菌，3-羟基丙酸产量有所提高，副产物1,3-丙二醇的产量有所降低。未敲除菌的3-羟基丙酸产量为0.6g/L，敲除菌的产量提高为2.2g/L；未敲除菌的1,3-丙二醇的产量为6.3g/L，敲除菌的1,3-丙二醇的产量降低至3.3g/L。

收集菌体，离心，水洗两遍，再用无水乙醇清洗一次，菌体烘干后用氯仿萃取，得到的聚3-羟基丙酸通过核磁共振进行定性分析，分析方法参见（Wang HH,Li XT,Chen GQ.Productionand characterization of homopolymer polyhydroxyheptanoate(P3HHp)by a fabBA knockout mutantPseudomonas putia KTOY06derived from P.putida KT2442.Process Biochemistry2009;44(1):106-111.）。核磁图谱（图7）证实获得了聚3-羟基丙酸。最终得到1.3g/L的聚3-羟基丙酸，占细胞干重的26.73%。

虽然本发明已经公开了示例性示范方案，但是本领域人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，包含：将甘油氧化为3-羟基丙醛的酶，将3-羟基丙醛氧化为3-HP的酶，将3-羟基丙酸转化为3-羟基丙酰辅酶A的酶，将3-羟基丙酰辅酶A聚合为聚3-羟基丙酸的酶。

2.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，其特征在于，是将甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，醛脱氢酶基因，丙酰辅酶A合成酶基因和聚羟基脂肪酸合成酶基因导入宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌；所述重组肺炎克雷伯氏菌是敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到的。

3.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，其特征在于，该菌株是将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌得到重组菌；所述重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB是在质粒pBAD33中插入克隆所得醛脱氢酶基因，甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活基因得到的重组质粒；所述pBAD18-phaC-prpE，是在质粒pBAD18中插入聚羟基脂肪酸合成酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因得到的重组质粒；所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，是缺失了1,3-丙二醇脱氢酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因的重组菌株。

4.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌的制备方法，其特征在于，步骤如下：

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌构建方法如下：

1）以肺炎克雷伯氏菌1,3-丙二醇脱氢酶基因上下游500个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增1,3-丙二醇脱氢酶基因上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段，以上述回收片段为模板进行搭桥PCR，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔdhaT，以自杀质粒pRE112为媒介与肺炎克雷伯氏菌进行同源重组敲除dhaT基因得到K.penumoniaeΔdhaT；

2）在K.penumoniaeΔdhaT基础上以上述步骤1）所述方法继续敲除醛还原酶/醇脱氢酶基因得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB构建方法如下：

1）醛脱氢酶基因的克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段；

2）甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因的克隆是以肺炎克雷伯氏菌为模板，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段，以甘油脱水酶基因段和甘油脱水酶再激活酶基因片段为底物，通过搭桥PCR获得dhaB123-gdrAB；

3）将质粒pBAD33和割胶回收后的aldH基因片段进行酶切，回收酶切产物，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pBAD33-EaldH；

4）以质粒pBAD33-EaldH和割胶回收后的dhaB123-gdrAB基因片段进行双酶切，得到重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，重组质粒pBAD18-phaC-prpE构建方法为：对质粒pBAD18和pET21a-phaC-prpE进行双酶切，将酶切后的pBAD18和phaC-prpE片段酶连后得到重组质粒pBAD18-phaC-prpE。

8.一种联产3-HP和P3HP的方法，其特征在于，以权利要求1所述的联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌发酵生产3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。

9.一种联产3-HP和P3HP的方法，其特征在于，步骤如下：

4）将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌得到联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌；

5）以步骤4）得到的重组肺炎克雷伯氏菌发酵生产3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤5）所述方法是将活化后的重组菌株接种到含氯霉素和卡那霉素的M9改良液体培养基中，OD₆₀₀达到0.6时，加入阿拉伯糖诱导，每隔12h添加一次阿拉伯糖和抗生素，阿拉伯糖诱导后48h终止发酵。