CN102083977B - 产同型琥珀酸细菌突变体以及使用该微生物突变体制备琥珀酸的方法 - Google Patents

产同型琥珀酸细菌突变体以及使用该微生物突变体制备琥珀酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高产量产生同型琥珀酸(homo-succinic acid)的微生物突变体和使用该微生物突变体生产同型琥珀酸的方法，具体涉及通过从产琥珀酸微生物中破坏乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和乙酸激酶编码基因(ackA)构建的微生物突变体，以及高浓度生产同型琥珀酸的方法，所述方法包括使用葡萄糖作为碳源在厌氧条件下培养所述突变体。

Description

产同型琥珀酸细菌突变体以及使用该微生物突变体制备琥珀酸的方法
技术领域
本发明涉及高产量产生同型琥珀酸(homo-succinic acid)的微生物突变体和使用该微生物突变体生产同型琥珀酸的方法，具体涉及通过从产琥珀酸微生物中破坏乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和乙酸激酶编码基因(ackA)构建的微生物突变体，以及高浓度生产同型琥珀酸的方法，所述方法包括使用葡萄糖作为碳源在厌氧条件下培养所述突变体。 
背景技术
琥珀酸(HOOCCH2CH2COOH)，一种由4个碳原子构成的二羧酸，是具有高效用的有机酸，其被广泛用作药物、食物、化妆品和其他工业的化学产品(Zeikus等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，51：545，1999；Song等人，Enzyme Microbial Technol.，39：352，2006)的前体。特别是，随着最近石油价格的剧烈上涨和有关环境污染的关注日益增加，预期对于琥珀酸作为可生物降解大分子的主要来源的需要急剧增加(Willke等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，66：131，2004)。 
琥珀酸可通过化学合成和发酵来生产，并且仅仅少量用于特别用途，诸如用作药物、食品添加剂和保护剂的琥珀酸通过传统的微生物发酵进行生产。相反，目前用于工业应用的大多数琥珀酸由美国、欧洲、日本和中国的大石化公司使用来自石油或液化天然气(LNG)的n-丁烷和乙炔通过化学合成方法生产。一般说来，上面提到的化学合成方法具有的问题在于排出大量的在生产丁二醇的过程中产生的有害固体废物、废水和废气(例如CO等)。特 别是，具有高消耗可能性的化石来源被用作基本材料，因此迫切需要开发可替代原料诸如可再生来源代替化石来源的琥珀酸制备方法。 
为了克服由制备琥珀酸的化学合成工艺带来的这些问题，有关通过使用各种可再生来源通过微生物发酵生产琥珀酸已经由许多研究人员广泛深入地进行。由于这些努力的结果，可相对大量产生琥珀酸的微生物，诸如基因工程Escherichia coli，反刍细菌(放线杆菌属、拟杆菌属、曼氏杆菌属、琥珀酸单胞菌属、琥珀酸弧菌属等)和厌氧螺菌属被鉴别和开发(Song等人，Enzyme Microbial Technol.，39：352，2006)。 
作为用于使用微生物产生琥珀酸的新菌株开发的研究，使用E.coli的研究很容易操作并且对其新陈代谢特性可进行较好的研究。E.coli用于生产琥珀酸的操作包括在生产乳酸和蚁酸中涉及的dh和pf1的破坏，葡萄糖转运体基因ptsG的操作，苹果酸酶基因sfcA的扩增，来自菜豆根瘤菌菌株的在丙酮酸羧化过程中涉及的外源基因pyc的引入，磷酸转乙酰酶基因pta的破坏。另外，可在有氧条件下产生琥珀酸的基因工程E.coli菌株已经通过对在糖酵解、三羧酸(TCA)循环和乙醛酸途径中涉及的基因进行操作被开发(US5770435；Hong等人，Biotechnol.Bioeng.，74：89，2001；Venuri等人，J.Ind.Microbio1.Biotechno1.，28：325，2001；US 6648061；Lin等人，Eng.，7：116，2005；Lin等人，Biotechnol.Bioeng.，90：775，2005)。 
根据迄今为止已经报道的研究，已知作为反刍细菌种类的放线杆菌和曼氏杆菌(Mannheimia)菌株和专性厌氧细菌，厌氧螺菌菌株在厌氧条件下产生大量的琥珀酸，并具有比基因工程菌E.coli更高的产率。 
关于放线杆菌，美国密西根生物技术研究所(MBI)-领导的研究团队分离了琥珀酸放线杆菌130Z菌株(ATCC No.55618)并开发了生产琥珀酸的方法(U.S.专利号5504004)，并使用传统化学基因突变法构建了各种琥珀酸放线杆菌微生物突变体以便在开发生产和纯化琥珀酸的过程中使用(U.S.专利号5521075；U.S.专利号5168055；U.S.专利号5143834)。 
但是，到目前为止开发的使用微生物发酵的琥珀酸生产工艺产率低，并且每克碳源的琥珀酸产量非常低，因此导致商业化的困难，尤其是以发酵为基础的琥珀酸生产工艺招致从发酵液中分离和纯化琥珀酸的成本巨大，因为在发酵过程中琥珀酸与作为副产物的大量各种有机酸和乙醇一起产生。 
特别是，琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸厌氧螺菌要求大量的复合营养成分诸如发酵中提取的酵母菌，因此生产琥珀酸发生高原材料费用；而且还加入大量的MgCO3或CaCO3来调节pH，导致分离和纯化的困难(US 5504004；US 5521075；US 5168055；US 5143834)。为了克服前述缺陷并使使用微生物发酵琥珀酸的生产商业化，存在对于开发高产量有效产生同型琥珀酸但避免副产物形成的新琥珀酸产生菌以便高产量生产同型琥珀酸的迫切需要(Song等人，Enzyme Microbial Technol.，39：352，2006)。 
i [0011] 本发明的发明人已经报道他们从韩国母牛中分离了高效产生琥珀酸的M.succiniciproducens MBEL55E(于2000年4月10日被保藏在地址为韩国大田市305-333儒城区鱼隐洞#52韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保存中心(KCTC)，保藏号为KCTC0769BP)，完成了其全基因组序列，并描述了菌株的新陈代谢性质(Hong等人，Nature Biotechnol.，22：1275，2004)。而且，本发明的发明人已经通过在M.succiniciproducens MBEL55E中破坏编码乳酸脱氢酶的基因(ldhA)和编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因(pfl)构建了细菌突变体M.succiniciproducens LPK(于2003年11月26日被保藏在地址为韩国 大田市305-333儒城区鱼隐洞#52韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保存中心(KCTC)，保藏号为KCTC10558BP)。另外，本发明的发明人已经通过在所述微生物突变体M.succiniciproducens LPK中破坏磷酸转乙酰基酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)构建了微生物突变体M.succiniciproducens LPK7(于2004年04月22日被保藏在地址为韩国大田市305-333儒城区鱼隐洞#52韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保存中心(KCTC)，保藏号为KCTC10626BP)，从而增加了琥珀酸的产生(WO 2005/052135 A1)。但是，在这种微生物变种的情况下，虽然副产物乳酸、蚁酸和醋酸的形成可被有效抑制，但在发酵过程中大量丙酮酸作为副产物积累。特别是，与野生型菌株相比M.succiniciproducens LPK7的生长率变得非常低，以至于不能达到显著的琥珀酸的高产。虽然本发明的发明人已经通过在M.succiniciproducensMBEL55E(PCT/KR2007/003574)中破坏乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、磷酸转乙酰基酶编码基因(pta)和醋酸激酶编码基因(ackA)构建了微生物突变体M.succiniciproducens PALK(于2006年07月26日被保藏在地址为韩国大田市305-333儒城区鱼隐洞#52韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保存中心(KCTC)，保藏号为KCTC 10973BP)，结果，实现了细胞生长率的增加并提高了琥珀酸产率，仍然存在对于更好的产琥珀酸突变微生物的开发的需要。 
本发明的发明人付出了极大的努力通过在M.succiniciproducensMBEL55E和M.succiniciproducens ALKt中破坏乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和醋酸激酶编码基因(ackA)构建微生物突变体(M.succiniciproducens ALK)，其作为与基于实际细胞模型的结果的所述突变体相同效果的突变体，并发现当使用葡萄糖作为碳源在厌氧条件下对微生物突变体进行培养时，它们可高产量地生产同型琥珀酸，从而完成了本发明。 
发明内容
因此，本发明的目的在于提供具有高琥珀酸产率的缺少乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和醋酸激酶编码基因(ackA)的反刍微生物突变体，以及制备该微生物突变体的方法。 
本发明的另一目的在于通过使用葡萄糖作为碳源在厌氧条件下培养所述微生物突变体来提供高产量产生同型琥珀酸而不积累其他副产物的方法。 述微生物突变体来提供高产量产生同型琥珀酸而不积累其他副产物的方法。 
为了实现上述目的，本发明提供了缺少乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和醋酸激酶编码基因(ackA)同时在产琥珀酸微生物中保持了磷酸转乙酰基酶基因(pta)的产琥珀酸微生物突变体，其可在厌氧条件下高浓度产生琥珀酸。 
本发明还提供了产琥珀酸微生物突变体M.succiniciproducens ALKt，其中编码磷酸转乙酰基酶的基因(pta)被引入到缺少乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)和醋酸激酶编码基因(ackA)的M.succiniciproducens PALK中。 
本发明还提供了产琥珀酸微生物突变体M.succiniciproducens ALK，其中在M.succiniciproducens MBEL55E中乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)被破坏。 
另外，本发明提供了生产产琥珀酸微生物突变体的方法，其包括下列步骤：(a)通过同源重组在产琥珀酸微生物的基因组中破坏编码乳酸脱氢酶基因(ldhA)的基因得到缺乏乳酸脱氢酶基因(ldhA)的产琥珀酸微生物突变体；和(b)通过同源重组在缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)的产琥珀酸微生物突变体的基因组中破坏编码醋酸激酶的基因(ackA)得到缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)的产琥珀酸微生物突变体。 
本发明还提供了制备产琥珀酸微生物突变体的方法，其中编码磷酸转乙酰基酶的基因(pta)被引入到缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)和醋酸激酶基因(ackA)的产琥珀酸微生物突变体中。 
此外，本发明提供了生产琥珀酸的方法，其包括在厌氧条件下培养产琥珀酸微生物突变体的步骤和从培养液中回收琥珀酸的步骤。 
通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加清楚。 
附图简述 
图1是显示在曼氏杆菌属微生物突变体中的同型琥珀酸产生途径的示意图，其中同型琥珀酸高产量产生。 
图2显示了构建用于破坏ldhA的载体(pMLKO-sacB)的过程。 
图3显示了构建用于破坏ldhA的载体(pMFldhA)的过程。 
图4显示了通过从M.succiniciproducens MBEL55E中破坏ldhA以构建微生物突变体(M.succinicproducens LK)的过程。 
图5显示了通过从M.succiniciproducens MBEL55E中破坏ldhA以构建微生物突变体(M.succinicproducens MFLK)的过程。 
图6显示了构建用于破坏pta和ackA的载体(pPTA-sacB)的过程。 
图7显示了构建用于破坏ackA的载体(pAckAKO)的过程。 
图8显示了通过从M.succiniciproducens LK中破坏pta-ackA以构建微生物突变体(M.succinicproducens PALK)的过程。 
图9显示了通过从M.succiniciproducens MFLK中破坏ackA以构建微生物突变体(M.succinicproducens ALK)的过程。 
图10是显示用于通过在M.succinicproducens PALK中表达pta来制备微生物突变体(M.succinicproducens ALKt)的pta表达载体(pME18PTA)的示意图。 
图11显示在厌氧条件下使用CO2饱和的本发明的M.succiniciproducensPALK、M.succiniciproducens ALKt和M.succiniciproducens ALK的培养特性。 
具体实施方式
在本发明中，设计了实际细胞模型以便开发通过使副产物形成最小化高浓度有效生产同型琥珀酸的微生物突变体。M.succiniciproducens MBEL55E的基因组包括2314078个碱基对(Hong等人，Nat.Biotechnol.，22：12275， 2005)，并含有2384个候选基因，其由生物信息学所揭示(Kim等人，Biotechnol，Bioeng.，97：657，2007)。M.succiniciproducens MBEL55E的基因分布在整个基因组中，并根据其全基因组的性质被评估的细胞功能分类。基因组信息的综合分析被提供以设定M.succiniciproducens MBEL55E的实际细胞模型。实际细胞包括686个酶反应和516个代谢，其代谢级联的变化被定量比较。 
需要大量微生物突变体来使用每种基因的组合构建多基因突变体。在现实中，由于在实验台上构建这种数目巨大的微生物突变体困难到不可能；使用实际细胞模型进行计算机模拟(in silico simulation)(韩国专利号630,836)。特别是，在计算机中在两个或三个基因的每个被组合和消除之后，对于每种突变体的产物形成率和特定生长率被计算，通过上述计算推导选择曲线(trade off curve)。另外，在所述选择曲线上，待消除的基因组合被选择，其可假定消除使细胞生长速率的抑制最小化并使琥珀酸的产率最大化的基因组合。在本发明中，具有ackA和ldhA同时破坏的组合的ΔackAΔldhA菌株被生产以产生用于琥珀酸产率对菌株的特定生长速率的优化曲线。 
在本发明中，检查了含有编码磷酸转乙酰基酶(pta)的基因并具有破坏的编码乳酸脱氢酶的基因(ldhA)和编码醋酸激酶的基因(ackA)的产琥珀酸微生物突变体是否能够在厌氧条件下高浓度产生琥珀酸。 
为了检查其能力，在通过由M.succiniciproducens MBEL55E，一种产琥珀酸细菌中破坏乳酸脱氢酶基因(ldhA)、醋酸激酶基因(ackA)和磷酸转乙酰基酶的基因(pta)构建的M.succiniciproducens PALK中重新表达编码磷酸转乙酰基酶的基因(pta)，由此构建了微生物突变体(M.succiniciproducensALKt)。 
另外，通过在M.succiniciproducens MBEL55E，一种产琥珀酸细菌中破坏乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)构建微生物突变体(M.succiniciproducens ALK)。 
因此，在一个方面，本发明涉及缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)的同时将磷酸转乙酰基酶基因(pta)保持在产琥珀酸微生物中的产琥珀酸微生物突变体，其能够在厌氧条件下高浓度产生同型琥珀酸。 
在本发明中，所述产琥珀酸微生物优选选自下组，该组包括放线杆菌属，厌氧螺菌属，拟杆菌属，曼氏杆菌属，琥珀酸单胞菌属，琥珀酸弧菌属和基因工程大肠杆菌，更优选曼氏杆菌属，但不限于此，并且任何微生物都可被使用而没有限制，只要其能够在厌氧条件下产生琥珀酸。 
在本发明中，如果产琥珀酸微生物含有磷酸转乙酰基酶基因(pta)，所述产琥珀酸微生物突变体可通过破坏乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)构建。并且如果产琥珀酸微生物固有或非固有地失去磷酸转乙酰基酶基因(pta)，则所述琥珀酸微生物突变体可通过破坏乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)并引入磷酸转乙酰基酶基因(pta)构建。 
本发明还涉及产琥珀酸微生物突变体(M.succiniciproducens ALKt)，其中磷酸转乙酰基酶基因(pta)被引入到缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)和醋酸激酶基因(ackA)产琥珀酸微生物突变体(M.succiniciproducens PALK)中。 
本发明还涉及产琥珀酸微生物突变体(M.succiniciproducens ALK)，其中醋酸激酶基因(ackA)在通过从M.succiniciproducens MBEL55E中破坏乳酸脱氢酶基因(ldhA)构建的产琥珀酸微生物突变体(M.succiniciproducensMFLK)中被破坏。 
在本发明中，所述产琥珀酸微生物突变体优选为仅仅能够高浓度产生琥珀酸同时很少或者不产生作为副产物的其他有机酸和乙醇的同型发酵微生物(homo-fermentative microorganism)。 
所述产琥珀酸微生物突变体可高浓度生产同型琥珀酸，因为在厌氧条件下当葡萄糖被用作碳源时在一般发酵过程中副产物诸如乙醇和其他有机酸的形成可有效地被防止。 
通过产琥珀酸微生物诸如琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌和已知产琥珀酸的各种产琥珀酸的微生物的部分遗传信息(16s rRNA)、新陈代谢特征和发酵结果，发现在所属产琥珀酸微生物中由碳源产生琥珀酸的主要生物合成途径与曼氏杆菌属中琥珀酸产生的生物合成途径几乎相同(Van der Werf等人，Arch Microbiol.，167：332，1997；Laivenieks等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：2273，1997；Samuelov等人，App.Environ.Microbiol.，65：2260，1999；Kim等人，Appl.Environ.Microbiol.，70：1238，2004)。尤其是，在琥珀酸产生中参与的所有细菌在琥珀酸生产时都使用CO2固定酶将磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸、C3化合物转化成草酰乙酸和苹果酸、C4化合物，从而产生琥珀酸(图1)。另外，在厌氧条件下产琥珀酸微生物产生乙酸、甲酸、乳酸和乙醇作为发酵副产物。 
在另一方面，本发明涉及生产产琥珀酸微生物突变体的方法，包括下列步骤：(a)通过同源重组在M.succiniciproducens MBEL55E中破坏编码乳酸脱氢酶基因(ldhA)的基因得到缺乏乳酸脱氢酶基因(ldhA)的产琥珀酸微生物突变体；和(b)通过同源重组在缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)的产琥珀酸微生物突变体的基因中破坏编码醋酸激酶的基因(ackA)得到缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)的产琥珀酸微生物突变体。 
在本发明中，同源重组优选通过使用含有破坏ldhA的遗传交换载体和含有破坏ackA的遗传交换载体进行。 
在本发明中，所述含有破坏ldhA的遗传交换载体优选为pMLKO-sacB和pMF1dhA，并且所述含有破坏ackA的遗传交换载体优选为pPTA-sacB和pAckAKO。 
在又一方面，本发明涉及构建产琥珀酸微生物突变体的方法，其包括将磷酸转乙酰基酶基因(pta)引入到缺少编码乳酸脱氢酶的基因(ldhA)、编码醋酸激酶的基因(ackA)和磷酸转乙酰基酶的基因(pta)的产琥珀酸微生物突变体中。 
在本发明中，所述缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)、醋酸激酶基因(ackA)和磷酸转乙酰基酶基因(pta)的产琥珀酸微生物突变体优选M.succiniciproducens PALK(KCTC10973BP)。 
在又一方面，本发明涉及生产琥珀酸的方法，包括下列步骤：在厌氧条件下培养所述产琥珀酸微生物突变体；并从培养液中回收琥珀酸。 
在本发明中，优选葡萄糖作为用于培养的碳源。 
在本发明中，基因工程微生物的培养和琥珀酸的生产工艺可通过常规发酵过程中已知的培养方法以及用于分离和纯化琥珀酸的方法来进行。 
实施例
下面将通过实施例进一步描述本发明。但是对本领域技术人员来说容易想到的是，这些实施例仅仅用于说明的目的，本发明不限于这些实施例或者不由这些实施例限定。 
特别是，下面的实施例仅仅示出了特定载体和作为产琥珀酸微生物的曼氏杆菌属作为宿主细胞以便剔除根据本发明的基因。但是，本领域技术人员容易想到的是，即便当使用其他种类的载体和产琥珀酸微生物时也可得到产琥珀酸的微生物突变体。 
对本领域技术人员来说还显而易见的是，缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)和醋酸激酶基因(ackA)的微生物突变体的效果与通过在缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)、醋酸激酶基因(ackA)和磷酸转乙酰基酶基因(pta)的微生物突变体中重新表达磷酸转乙酰基酶基因(pta)构建的微生物突变体的效果相同。 
实施例1：ldhA破坏载体(pMLKO-sacB)的构建 
为了通过同源重组破坏产琥珀酸微生物中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，以下列方式构建遗传交换载体。首先，使用在下面序列号：1和序列号：2中阐明的引物以M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)基因组DNA作为模板进行PCR，然后使用SacI和PstI切割得到的PCR片段并将其引入 到pUC18载体(New England Biolabs，Inc.，USA)中，由此构建pUC18-L1。 
序列号：1：5’-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG-3’ 
序列号：2：5’-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA-3’ 
另外，以M.succiniciproducens MBEL55E的基因组DNA作为模板，使用在下面序列号：3和序列号：4中阐明的引物进行PCR，使用PstI和HindIII切割得到的PCR片段，并将其引入到pUC18-L1中，由此构建pUC18-L1-L2。 
序列号：3：5’-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC-3’ 
序列号：4：5’-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG-3’ 
为了将卡那霉素抗性基因插入到pUC18-L1-L2中作为选择标记物，使用PstI切割pUC4K载体(Pharmacia，Freiburg，Germany)，并将卡那霉素抗性基因与使用PstI切割的pUC18-L1-L2融合，从而构建pUC18-L1-KmR-L2。将在序列号：5中阐明的连接子插入到使用SacI切割的pUC 18-L1-KmR-L2中，从而形成新的XbaI切割位点。 
序列号：5：5’-TCTAGAAGCT 
以pKmobsacB(Schafer等人，Gene，145：69，1994)作为模板，使用在下面序列号：6和序列号：7中阐明的引物进行PCR。然后，将得到的PCR片段使用XbaI切割，并将其插入到新的XbaI限制酶位点中，从而构建pMLKO-sacB(图2)。 
序列号：6：5’-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3’ 
序列号：7：5’-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC-3’ 
实施例2：ldhA破坏载体(pMFldhA)的构建 
为了通过同源重组破坏M.succiniciproducens MBEL55E基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)，以下列方式构建遗传交换载体。首先，以M.succiniciproducens MBEL55E的基因组DNA作为模板使用在下面序列号：8和序列号：9中阐明的引物进行PCR，然后使用BamHI和PstI切割得到的 PCR片段并将其引入到pSacHR06(Park等人，PNAS.，104：7797，2007)中，从而构建pldhAL。 
序列号：8：5′-TTGCAACATGGCGAACTTAGC-3′ 
序列号：9：5′-ATATCTGCAGTTAATAAAATGCGCGACGG-3′ 
接着，以M.succiniciproducens MBEL55E的基因组DNA作为模板，使用在下面序列号：10和序列号：11中阐明的引物进行PCR，然后使用SalI和SphI切割得到的PCR片段并将其插入到pldhAL中，从而构建pldhALR。 
序列号：10：5’5′-ATATGTCGACCAACTTTCATAGTTAGCTCC-3′ 
序列号：11：5′-ATCCGCATGCTTGCCGTCGTTTAGTGCTG-3′ 
以pMSmulox(Kim等人，FEMS Microbial Lett.，278：78，2008)作为模板，使用在下面序列号：12和序列号：13中阐明的引物进行PCR。然后使用S1核酸酶处理得到的PCR片段以产生平头末端，并插入到pldhALR中，从而构建pMFldhA(图3)。 
序列号：12：5′-ATATAAGCTTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGACGGGCTGGCGGTATTGG-3′ 
序列号：13：5′-AATTCCCGGGTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAA GTTATTGCCAGTTGATCACCTCGGG-3′ 
实施例3：M.succiniciproducens LK菌株的构建 
通过破坏M.succiniciproducens MBEL55E基因组中的ldhA基因构建微生物突变体(M.succiniciproducens LK)(图4)。 
特别是，将M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)接种于含有10g/L葡萄糖的LB-琼脂糖培养基上并在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种到10ml LB-葡萄糖液体培养基中，并培养12小时。将已经充分生长的1％的培养液接种在100ml LB-葡萄糖液体培养基中，并以200rpm在37℃下在摇床中培养。 
4-5小时之后当培养液的OD600达到大约0.3-0.4时，将其在4℃下 4500rpm离心20分钟以收集细胞。然后，在4℃下200ml 10％甘油溶液中细胞悬浮并在4℃下5500rpm离心20分钟以收集细胞。重新悬浮之后，以上面描述的过程同样的方式收集一半上述甘油溶液两次，将细胞以1∶1的体积比悬浮在甘油溶液中以得到细胞浓缩液。 
将由此得到的细胞浓缩液与在实施例1中构建的遗传交换载体pMLKO-sacB混合，然后通过在1.8kV、25μF和200ohms条件下电穿孔将pMLKO-sacB引入到培养的M.succiniciproducens MBEL55E中。将1ml LB-葡萄糖液体培养基加入到引入了pMLKO-sacB的菌株中，并在37℃下以200rpm在摇床中预培养一小时。将培养液接种于含有抗生素卡那霉素(终浓度25μg/ml)的LB-葡萄糖液体培养基上并在37℃下培养48小时或者更长。为了选择其中仅仅发生双交换的菌落，将形成的菌落在含有卡那霉素(25μg/ml)和100g/L蔗糖的LB-蔗糖固体培养基上划线。24小时以后，再次将形成的菌落在相同培养基上划线。 
将在培养基上形成的菌落(突变体)在含有抗生素的LB-葡萄糖液体培养基中培养，并从菌株中通过Rochelle等人描述的方法分离基因组DNA(Rochelle等人，FEMS Microbiol.Lett.，100：59，1992)。使用分离的突变体基因组DNA作为模板进行PCR，并将PCR产物电穿孔以证实基因组DNA中ldhA的破坏。 
为了证实ldhA基因的破坏，以下列方式进行两次PCR。首先，以突变体基因组DNA作为模板使用在序列号：14和序列号：15中阐明的引物进行PCR。 
序列号：14：5’-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC-3’(KM1) 
序列号：15：5′-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC-3’(LU1) 
然后，以突变体基因组DNA作为模板使用在序列号：16和序列号：17中阐明的引物进行PCR。将在两种PCR中得到的PCR片段进行凝胶电泳以根据它们的大小(1.5kb)证实ldhA的破坏。 
序列号：16：5’-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2) 
序列号：17：5’-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LU2) 
通过如下事实确认具有破坏ldhA的基因组DNA的PCR片段：使用引物序列号：14(KM1)和序列号：15(LU1)通过PCR得到的产物具有1.5kb的大小，同时，使用引物序列号：16(KM2)和序列号：17(LU2)通过PCR得到的产物具有1.7kb的大小。每个引物的位置在图4中显示。 
实施例4：M.succiniciproducens MFLK菌株的构建 
通过破坏M.succiniciproducens MBEL55E基因组中的ldhA基因构建微生物突变体(M.succiniciproducens MFLK)(图5)。 
特别是，将M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)接种子含有10g/L葡萄糖的TSA-葡萄糖培养基上，并在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种到10ml LB-葡萄糖液体培养基中并培养12小时。将已经充分生长的1％的培养液接种到100ml LB-葡萄糖培养液中并在摇床中200rpm37℃下培养。 
在以与实施例3中描述的相同方式从所述培养液中得到的浓缩液与在实施例2中构建的遗传交换载体pMFldhA混合，然后在1.8kV、25μF和200ohms条件下通过电穿孔将pMFldhA引入到培养的M.succiniciproducensMBEL55E中。将1ml LB-葡萄糖培养液加入到引入了pMFldhA的菌株中，并37℃下以200rpm在摇床中预培养1小时。将培养液接种于含有抗生素氯霉素(终浓度6.8μg/ml)的TSA-葡萄糖培养基上并在37℃下培养48小时或者更长。为了选择其中仅仅发生双交换的菌落，将形成的菌落在含有氯霉素(6.8μg/ml)和100g/L蔗糖的TSA-蔗糖平板上划线。24小时以后，再次将形成的菌落在相同培养基上划线。使用通过重复上述过程得到的菌落进行PCR，并将得到的PCR产物电穿孔以证实基因组DNA中ldhA基因的破坏。 
为了证实ldhA基因的破坏，以下列方式进行两次PCR。首先，以突变体基因组DNA作为模板使用在序列号：18和序列号：19中阐明的引物进行 PCR。 
序列号：18：5′-ACCTTTACTACCGCACTGCTGG-3′ 
序列号：19：5′-GCGGGAGTCAGTGAACAGGTAC-3′ 
然后，以突变体基因组DNA作为模板使用在序列号：20和序列号：21中阐明的引物进行PCR。将在两种PCR中得到的PCR片段进行凝胶电泳以证实基因组DNA中ldhA基因的破坏。 
序列号：20：5′-TTACAGCTCACCGAAAGCACGC-3′ 
序列号：21：5′-ATAAGCGGCGTTAACCTTCAAC-3′ 
为了从所述ldhA双交换微生物突变体中破坏抗生素基因，得到ldhA双交换突变体的细胞浓缩物，然后使用TS质粒pCRX5(Kim等人，FEMSMicrobial Lett.，278：78，2008)以上面描述的相同方式进行转化。pCRX5插入到表达Cre重组酶的细胞中以破坏定位在lox位点之间的氯霉素基因。将含有pCRX5的ldhA双交换微生物突变体接种到含有氨苄西林的TSB液体培养基中并培养24小时，然后接种于含有氨苄西林的TSB琼脂培养基上。缺少抗生素基因的ldhA双交换微生物突变体使用在序列号：22和序列号：23中阐明的引物通过PCR证实。 
序列号：22：5′-TTACAGCTCACCGAAAGCACGC-3′ 
序列号：23：5′-AATTCGTAACGCATCCGCCG-3′ 
然后，为了破坏pCRX5，将细胞(ldhA双交换突变菌株)转移到不含抗生素的TSB液体培养基中，在42℃下培养24小时，并再次在不含抗生素的TSB琼脂培养基上培养(30℃)。将形成的菌落在含有氨苄西林和抗生素的TSB培养基上划线并在30℃下培养，由此得到不能在含有氨苄西林的培养基上生长的破坏pCRX5的M.succinicproducens MFLK。 
实施例5：用于pta和ackA破坏的遗传交换载体(pPTA-sacB)的构建 
为了通过同源重组破坏M.succiniciproducens LK菌株基因组中的磷酸转乙酰基酶基因(pta)和醋酸激酶基因(ackA)，以下列方式构建遗传交换载体。 以含有sacB基因(GenBank 02730)的载体pKmobsacB作为模板使用在序列号：24和序列号：25中阐明的引物进行PCR。将得到的sacB产物使用PstI和BamHI切割并插入到pUC19(Stratagene Cloning Systems.USA)中，从而构建pUC19-sacB。 
序列号：24：5′-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′ 
序列号：25：5′-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC-3′ 
同时，以M.succiniciproducensLK(KCTC10558BP)的基因组DNA作为模板，使用在序列号：26和序列号：27中阐明的引物进行PCR，将得到的PCR片段使用XbaI和BamHI进行切割并将其插入到pUC19中，由此构建pUC19-PTA1。 
序列号：26：5′-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC-3′ 
序列号：27：5′-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG-3′ 
然后以M.succiniciproducens LK的基因组DNA作为模板，使用在序列号：28和序列号：29中阐明的引物进行PCR，并将得到的PCR片段使用XbaI和SacI切割并将其插入到pUC19-PTA1中，由此构建pUC19-PTA12。 
序列号：28：5′-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTT CC-3′ 
序列号：29：5′-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC-3′ 
以含有奇霉素抗性基因(GenBank X02588)的质粒pIC156(Steinmetz等人，Gene，142：79，1994)作为模板，使用在序列号：30和序列号：31中阐明的引物进行PCR，并将得到的含有奇霉素抗性基因的PCR片段使用EcoRV切割并将其引入到pUC19-PTA12中，由此构建具有奇霉素抗性基因的pUC19-PTA1S2。将构建的pUC19-PTA1S2使用BamHI切割并将其插入到上面构建的pUC19-SacB中，由此构建pPTA-sacB(图6)。 
序列号：30：5′-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC-3′ 
序列号：31：5′-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC-3′ 
实施例6：ackA破坏载体(pAckAKO)的构建 
为了通过同源重组破坏M.succiniciproducens MBEL55E基因组中的醋酸激酶基因(ackA)，以下列方式构建遗传交换载体。以M.succiniciproducensMBEL55E的基因组DNA作为模板，使用在序列号：32和序列号：33中阐明的引物进行PCR。将得到的PCR产物使用PstI和SalI切割并插入到pSacHR06(Park等人，PNAS，104：7797，2007)中，从而构建pAckAL。 
序列号：32：5′-AACGACTGCAGCCACTAAATCCGACTTTGCGTAAAA-3′ 
序列号：33：5′-AGCATGTCGACTCTTCAGGCATTGTTTGGTGGAA-3′ 
同时，以M.succiniciproducens MBEL55E的基因组DNA作为模板，使用下述两组引物进行PCR，序列号：34和序列号：35，及序列号：36和序列号：37，用于扩增ackA的启动子区和pta ORF的正向部分。使用在序列号：34和序列号：37中阐明的引物对得到的PCR片段再次进行重叠PCR，将扩增的PCR片段使用SalI和SphI进行切割并将其插入到pACKAL中，由此构建pACKALR。 
序列号：34：5′-TGTGCTGTCGACTAAAGATCGCTTATCGCATGAAACTC-3′ 
序列号：35：5′-AGGATAATTGTACGTGACATTGAACGAATAGACGTTTGGGAATGT-3′ 
序列号：36：5′-CCCAAACGTCTATTCGTTCAATGTCACGTACAATTATCCTTATTCCAATC-3′ 
序列号：37：5′-GCACATAGCATGCGTTTGCCAAGTGTTACCTTCAATAC G-3′ 
然后以pACYC184作为模板，使用在序列号：38和序列号：39中阐明的引物进行PCR，然后将得到的PCR片段使用SacI切割并将其插入到pAckALR中，由此构建pAckAKO。 
序列号：38：5′-ATACATCGTCGACCAGGCATTTGAGAAGCACACGGT-3′ 
序列号：39：5′-ATACGGTCGACATAAATACCTGTGACGGAAGATC-3′ 
实施例7：M.succiniciproducens PALK菌株的构建 
通过破坏在实施例3中构建的M.succiniciproducens LK的基因组中的pta和ackA构建微生物突变体(M.succiniciproducens PALK)(图8)。 
将M.succiniciproducens LK接种于含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖琼脂培养基上，并在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种在10ml LB-葡萄糖液体培养基中，并培养12小时。将已经充分生长的1％(v/v)培养液接种在100ml LB-葡萄糖液体培养基中，并以200rpm在37℃下在摇床中培养。 
以与实施例2中描述的相同方式从得到的培养液中收集细胞浓缩液，并将其与在实施例5中构建的遗传交换载体pPTA-sacB混合，然后通过在2.5kV、50μF和200ohms条件下电穿孔将pPTA-sacB引入到培养的M.succiniciproducens LK。将0.8ml LB-葡萄糖液体培养基加入到引入了pPTA-sacB的菌株中，并在37℃下以200rpm在摇床中预培养一个半小时。 
为了诱导双交换，将培养液接种于含有100g/L含奇霉素(终浓度50μg/ml)的蔗糖(Becton，Dickinson and Company)的TSB蔗糖培养基上并在37℃下培养48小时或者更长。为了选择其中仅仅发生双交换的菌落，将形成的菌落分别在含有50μg/ml奇霉素的TSB蔗糖培养基和含有50μg/ml氨苄西林的TSB琼脂培养基上划线并在37℃下培养12小时。然后选择在含有50μg/ml奇霉素的TSB蔗糖培养基上形成但不在含有50μg/ml氨苄西林的TSB琼脂培养基上形成的菌落，并再次在含有50μg/ml奇霉素的TSB蔗糖培养基上划线。这里再次使用含奇霉素的培养基和含氨苄西林的培养基对形成的菌落进行筛选，然后对显示所需结果的菌落进行最终选择。使用分离的突变体基因组DNA作为模板通过PCR进行扩增，并对PCR产物电穿孔以证实基因组DNA中pta-ackA的破坏。 
为了证实pta-ackA基因的破坏，以下列方式进行两次PCR。首先，以 突变体基因组DNA作为模板使用在序列号：40和序列号：41中阐明的引物进行PCR。然后以突变基因组DNA作为模板，使用在序列号：42和序列号：43中阐明的引物进行PCR。 
序列号：40：5′-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC-3′ 
序列号：41：5′-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC-3′ 
序列号：42：5′-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG-3′ 
序列号：43：5′-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG-3′ 
将在两种PCR中得到的PCR片段进行凝胶电泳以通过pta-ackA的大小证实其破坏。微生物突变体M.succiniciproducens PALK按照上面描述的方法通过从M.succiniciproducens LK的基因组中破坏pta-ackA构建。 
实施例8：用于构建M.succiniciproducens ALKt菌株的pta-表达载体(pME18PTA)的构建 
为了在缺少乳酸脱氢酶基因(ldhA)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)和醋酸激酶基因(ackA)的微生物突变体中表达pta基因，按照如下方式构建基因表达载体： 
首先，以M.succiniciproducens MBEL55E的基因组DNA为模板，使用在下面序列号：44和序列号：45中阐明的引物进行PCR，由此构建PTA-PRO。 
序列号：44：5′-CATCAGAGCTCCCTTTGCCAACAAATCCGCTAAAT-3′ 
序列号：45：5′-AGGATAATTGTACGTGACATTGAACGAATAGACGTTTGGGAATGT-3′ 
接着，以M.succiniciproducens MBEL55E的基因组DNA为模板，使用在下面序列号：46和序列号：47中阐明的引物进行PCR，由此构建PTA-GENE。 
序列号：46：5′-CCCAAACGTCTATTCGTTCAATGTCACGTACAATTATCCTTATTCCAATC-3′ 
序列号：47：5′-CTACAGCCCGGGAGATCACAAAATGAAAAACTACTATTTGCAGG-3′ 
然后，以PTA-Pro和PTA-GENE作为模板，使用在序列号：44和序列号：47中阐明的引物进行PCR，使用SacI和XmaI切割得到的PCR片段并将其插入到穿梭载体pME18中，由此构建pME18PTA(图10)。 
实施例9：M.succiniciproducens ALKt菌株的构建 
将在实施例7中构建的M.succiniciproducens PALK接种于含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖培养基上并在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种在10ml LB-葡萄糖培养基中并培养12小时。将已经充分生长的1％(v/v)的培养液接种在100ml LB-葡萄糖液体培养基中，并在摇床中37℃下培养。以与实施例2中描述的相同方式从所述培养液中收集细胞浓缩液并将其与在实施例8中构建的pta基因表达载体pME18PTA混合，然后在2.5kV，50μF和200ohms的条件下通过电穿孔将pME18PTA引入到M.succiniciproducens PALK中。电穿孔后，将0.8ml LB-葡萄糖液体培养基加入到引入了pME18PTA的菌株中，然后在恒温箱中在37℃下预培养一个半小时。 
将培养液接种于含有抗生素氨苄西林(终浓度50μg/ml)的胰酶大豆肉汤固体培养基(Becton，Dickinson and Company)上并在37℃下培养48小时或者更长时间。将形成的菌落接种在TSB液体培养基中并在37℃下培养12小时以上。为了证实载体是否成功地被引入，通过使用GeneAllR质粒SV(GeneAll Biotechnology，Korea)从培养的菌株中分离载体。使用在下面序列号：48～62中阐明的引物通过Solgent(Korea)进行序列分析。 
序列号：48：5′-TTAGCCTGCAAATAGTAGTT-3′ 
序列号：49：5′-CCCCGCCGATATAGTTTTAA-3′ 
序列号：50：5′-GAAGCCGATTTCACAACCTC-3′ 
序列号：51：5′-CTAATTTACTTGGTGTGGTT-3′ 
序列号：52：5′-GGCGGTTACAAAATAGATTG-3′ 
序列号：53：5′-AAGACGTAAAACGTGTTGCC-3′ 
序列号：54：5′-ATCTGCGGAATCGGCGAAAT-3′ 
序列号：55：5′-GGCAATTCAGGCGACACAAT-3′ 
序列号：56：5′-CGCATAAAAATACCGCACTT-3′ 
序列号：57：5′-TCACTTTTTCAACATCTGCG-3′ 
序列号：58：5′-AACGAGCGACATAGTTTTCA-3′ 
序列号：59：5′-TGCCAAGTGTTACCTTCAAT-3′ 
序列号：60：5′-GGGCTGTTTTCAAATAGTTTGT-3′ 
序列号：61：5′-ATAACAGGTTCGGTAGTTTC-3′ 
序列号：62：5′-GCGATCTTTAAAACAGGATA-3′ 
实施例10：M.succiniciproducens ALK菌株的构建 
通过破坏在实施例4中构建的M.succiniciproducens MFLK的基因组中的ackA基因构建微生物突变体(M.succiniciproducens ALK)(图9)。 
将M.succiniciproducens MFLK接种于含有10g/L葡萄糖的TBS-葡萄糖琼脂培养基上并在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种在10ml TSB-葡萄糖液体培养基中，并培养12小时。将已经充分生长的1％(v/v)的培养液接种到100ml TSB-葡萄糖液体培养基中并37℃下在摇床中培养。 
以与实施例2中描述的相同方式从所述培养液中收集细胞浓缩液并将其与在实施例6中构建的遗传交换载体pAckAKO混合，然后在2.5kV、25μF和400ohms的条件下通过电穿孔将pAckAKO引入到M.succiniciproducensMFLK中。电穿孔后，将0.8ml LB-葡萄糖液体培养基加入到引入了pAckAKO的菌株中，然后在恒温箱中在37℃下预培养一小时。 
为了诱导双交换，将培养液接种于含有氯霉素(终浓度6.8μg/ml)的TSB蔗糖固体培养基上并在37℃下培养48小时或者更长。为了选择其中仅仅发生双交换的菌落，将形成的菌落在含有氯霉素(终浓度6.8μg/ml)的TSA蔗 糖培养基(含有100g/L蔗糖的TSA培养基)上划线。24小时以后，形成的菌落再次在相同培养基上划线。使用重复上述过程得到的菌落进行PCR，并将得到的PCR产物电穿孔以证实ackA的破坏。 
为了证实ackA的破坏，以下列方式进行两次PCR。首先，以突变体基因组DNA为模板，使用在序列号：63和序列号：64中阐明的引物作为模板进行PCR。然后，以突变体基因组DNA为模板，使用在序列号：65和序列号：66中阐明的引物作为模板进行PCR。 
序列号：63：5′-CGCTAAATGCTGATAGGTTGGGC-3′ 
序列号：64：5′-CCCAATGGCATCGTAAAGAACA-3′ 
序列号：65：5′-GGAAGCCAGTGAATGAATGAAAT-3′ 
序列号：66：5′-ACATGGAAGCCATCACAGACGG-3′ 
将在两种PCR中得到的PCR片段进行凝胶电泳根据它们的大小证实ackA的破坏。微生物突变体M.succiniciproducens ALK按照上面描述的方法通过从M.succiniciproducens MFLK的基因组中破坏ackA构建。 
实施例11：使用M.succiniciproducens ALKt和ALK菌株生产同型琥珀酸 
将在实施例9中构建的M.succiniciproducens ALKt和在实施例10中构建的M.succiniciproducens ALK分别接种于含有5g/L葡萄糖的10ml复合培养基上，并在厌氧条件下39℃下培养8小时，然后将它们移到250ml含有5g/L葡萄糖的复合培养基上并在39℃下培养。此时，将50μg/ml氨苄西林加入到培养基中用于培养M.succiniciproducens ALKt，并将6.8μg/ml氯霉素加入到培养基中用于培养M.succiniciproducens ALK。将M.succiniciproducens ALKt和M.succiniciproducens ALK的每种培养液250ml接种到含有2.25L复合培养基(1g/L NaCl，2g/L(NH4)2HPO4，0.02g/LCaCl2·2H2O，0.2g/L MgCl2·6H2O，8.709g/L K2HPO4，0.5g/L半胱氨酸，0.5g/L甲硫氨酸，0.5g/L丙氨酸，0.5g/L天冬酰胺，0.5g/L天冬氨酸，0.5g/L果仁糖，0.5g/L丝氨酸，0.005g/L烟酸，0.005g/L泛酸钙，0.005g/L烟酸 吡哆醇，0.005g/L硫胺，0.005g/L维生素C，和0.005g/L生物素)的生物反应器中，并在初始葡萄糖浓度100mM、39℃条件下进行发酵。在发酵过程中，通过使用氨水将培养物的pH调节到6.5，并且用作抗生素的氨苄西林和氯霉素的浓度与上面提到的相同。 
培养液中的细胞浓度使用分光光度计测定，然后使用分光光度计事先测定的光密度和用于细胞干重的验证试验进行计算。在发酵过程中，有规律地从生物反应器中采集样品。将采集的样品以13000rpm离心10分钟，然后将上清液用于使用高效液相色谱分析葡萄糖和各种代谢产物的浓度，包括琥珀酸和其他有机酸以及乙醇的浓度。 
如图11和表1所示，基因工程M.succiniciproducens ALKt和M.succiniciproducens ALK显示了极佳的琥珀酸产率并显著地抑制了副产物形成。与其亲本菌株M.succiniciproducens MBEL55E和M.succiniciproducensPALK相比，M.succiniciproducens ALKt菌株显示了每克葡萄糖的琥珀酸产量分别增加了61.7％和7.0％，并且与其亲本菌株M.succiniciproducensMBEL55E和M.succiniciproducens PALK相比，M.succiniciproducens ALK菌株显示了每克葡萄糖的琥珀酸产量分别增加了63.8％和8.5％。相反，与M.succiniciproducens MBEL55E和M.succiniciproducens PALK相比，M.succiniciproducens ALKt和M.succiniciproducens ALK减少了54.1％和43.4％的副产物形成，使其能够节约大量的原材料并降低了琥珀酸分离和纯化的成本。另外，M.succiniciproducens ALKt菌株的最终细胞浓度为2.29g/L，M.succiniciproducens ALK菌株的最终细胞浓度为2.22g/L，与M.succiniciproducens PALK相比最终细胞浓度分别增加了29.3％和28.4％，表明细胞生长的改善。 
表1：M.succiniciproducens ALKt和ALK的琥珀酸产量 
  菌株   MBEL55E   PALK   ALKt   ALK
  琥珀酸终浓度(g/L)   10.49   13.17   13.11   13.36
  葡萄糖消耗(g/L)   22.50   18.45   17.33   17.45
  琥珀酸产量   (g琥珀酸/g葡萄糖)   0.47   0.71   0.76   0.77
  与野生型菌株相比  琥珀酸产量的增加  (MBEL55E)(％)   0   +51.1   +61.7   +63.8
  副产物终浓度(g/L)   8.43   5.6   3.03   2.93
  副产物产量   (g副产物/g葡萄糖)   0.37   0.30   0.17   0.17
  与野生型菌株相比  副产物产量的减少  (MBEL55E)(％)   0.00   18.9   -54.1   -54.1
工业实用性 
如所描述和证实的那样，本发明具有提供了用于构建高浓度产生同型丁二醇的微生物突变体的方法和使用该突变体高产量生产同型琥珀酸的方法的效果。根据本发明的M.succiniciproducens ALKt和M.succiniciproducensALK两者都有效地抑制了在通过微生物发酵生产琥珀酸的过程中作为副产物形成的各种有机酸。因此，本发明的微生物突变体对于用于工业应用的高产量生产琥珀酸来说是有用的。 
序列表
<110>韩国科学技术院
<120>产同型琥珀酸细菌突变体以及使用该微生物突变体制备琥珀酸的方法
<130>FP10KR956
<140>PCT/KR2008/000241
<141>2008-01-15
<150>10-2007-0070219
<151>2007-07-17
<160>66
<170>PatentIn version 3.2
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acatggaagc catcacagac gg    22

Claims (10)

1.一种产琥珀酸微生物突变体，其缺少乳酸脱氢酶基因和醋酸激酶基因，同时保持了磷酸转乙酰基酶基因，并能够在厌氧条件下高浓度产生琥珀酸，
其中所述产琥珀酸微生物选自曼氏杆菌属。
2.根据权利要求1所述的产琥珀酸微生物突变体，其特征在于，所述产琥珀酸微生物突变体是高产量产生同型琥珀酸而不积累其他有机酸和乙醇作为副产物的同型发酵微生物。
3.一种产琥珀酸微生物突变体M.succiniciproducens ALKt，其中磷酸转乙酰基酶基因被引入到缺少乳酸脱氢酶基因、磷酸转乙酰基酶基因和醋酸激酶基因的M.succiniciproducens PALK中，M.succiniciproducens PALK的保藏号为KCTC10973BP。
4.一种产琥珀酸微生物突变体M.succiniciproducens ALK，其中乳酸脱氢酶基因和醋酸激酶基因从保藏号为KCTC0769BP的M.succiniciproducensMBEL55E中被破坏。
5.一种生产权利要求1所述的产琥珀酸微生物突变体的方法，包括下列步骤：
(a)通过同源重组在产琥珀酸微生物基因组中破坏编码乳酸脱氢酶基因的基因以获得缺乏乳酸脱氢酶基因的产琥珀酸微生物突变体，其中所述产琥珀酸微生物选自曼氏杆菌属；和
(b)通过同源重组在缺少乳酸脱氢酶基因的产琥珀酸微生物突变体的基因中破坏编码醋酸激酶的基因得到缺少编码乳酸脱氢酶的基因和编码醋酸激酶的基因的产琥珀酸微生物突变体。
6.根据权利要求5所述的生产产琥珀酸微生物突变体的方法，其特征在于，所述同源重组通过使用含有破坏的1dbA的遗传交换载体和含有破坏的ackA的遗传交换载体来进行。
7.一种构建权利要求1所述的产琥珀酸微生物突变体的方法，其包括将编码磷酸转乙酰基酶的基因引入到缺少乳酸脱氢酶基因、磷酸转乙酰基酶基因和醋酸激酶基因的产琥珀酸微生物突变体中，其中所述产琥珀酸微生物选自曼氏杆菌属。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缺少乳酸脱氢酶基因、磷酸转乙酰基酶基因和醋酸激酶基因的产琥珀酸微生物突变体是Mannheimia succiniciproducens PALK，保藏号为KCTC10973BP。
9.一种生产琥珀酸的方法，包括下列步骤：在厌氧条件下培养权利要求1-4中任意一项所述的产琥珀酸微生物突变体；并从培养液中回收琥珀酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，葡萄糖作为用于培养的碳源。
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