CN108431208A

CN108431208A - 增补精氨酸以改善气体发酵产乙酸菌的效率

Info

Publication number: CN108431208A
Application number: CN201680078415.8A
Authority: CN
Inventors: K·瓦尔格佩; M·科普克; J·B·Y·H·拜仁道夫; E·马塞兰; L·K·尼尔森; R·D·S·P·伦格鲁贝
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2018-08-21
Also published as: TWI824995B; US11965201B2; EA201891335A1; ZA201804358B; CA3010412A1; US20210230648A1; CA3010412C; KR20180127632A; EP3384005B1; EP3981869A1; WO2017096324A1; DK3384005T3; EP3384005A1; US10995347B2; ES2909579T3; TW201723170A; US20170159083A1; PT3384005T; EP3384005A4

Abstract

本发明提供了通过增补精氨酸来改善发酵效率的方法和其所用的基因修饰细菌。更具体地说，本发明提供(i)通过增补精氨酸来增加ATP密集型产物的产量；(ii)通过C1固定细菌来增加精氨酸的利用；和(iii)向C1固定细菌提供优化的精氨酸脱胺酶路径的方法。

Description

增补精氨酸以改善气体发酵产乙酸菌的效率

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月3日提交的美国临时专利申请第62/262,886号和2015年12月3日提交的美国临时专利申请第62/262,888号的权益，所述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

目前全世界有大约10％的能量需求及商用化学品是由可再生原料生产，主要使用种植糖生产。然而，为了满足气候目标，非食物资源的未来使用受到越来越多的关注。气体发酵提供了一条将广泛范围的易得低成本C1原料(例如工业废气、合成气或重整甲烷)利用于化学品及燃料的途径。伍德永达尔路径(Wood Ljungdahl pathway)据信为问世的第一生物化学路径之一，其使得产乙酸梭菌(acetogenic Clostridia)能够将这些C1气体固定在乙酰基-CoA中。自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)尤其为气体发酵提供稳固及灵活都平台且已在工业规模上得到采用。气体自产乙醇梭菌发酵具有高度选择性，耐受污染物，解决了费歇尔-托普希方法(Fischer-Tropsch process)的折射问题且即使以小体积气体流供应，仍为经济可行的。

已知尽管产乙酸菌能够制造许多有用的短链化学品，但归因于ATP限制性，生产适用于生物柴油或喷气燃料的较长链碳分子超出产乙酸细菌自身代谢能力之外。Fast等人确定，尽管伍德永达尔路径是制造乙酸酯及乙醇的最佳实施路径，但丁醇发酵是ATP限制性过程，致使通过伍德永达尔路径进行的丁醇厌氧制造效率低下。

自产乙醇梭菌天然地产生乙酸酯、乙醇、2,3-丁二醇(2,3-BDO)及乳酸酯。如果能克服能量阻碍，则合成生物学有望增大产乙醇梭菌的产物范围。产乙酸细菌在自然界中分布广泛且在全球碳循环中起主要作用，但被认为是生存于热力学生命边缘。

厌氧产乙酸菌的伍德-永达尔路径的能量学刚刚兴起，但不同于在好氧生长条件下或糖发酵生物糖解，伍德-永达尔路径不能通过底物水平的磷酸化而获得ATP，实际上，活化CO₂成为甲酸酯实际上需要一个ATP分子且需要膜梯度。[WO2013/180584]。

通过底物水平磷酸化产生ATP可以用作产物合成的驱动力，尤其在ATP限制性系统中。具体地说，已知产乙酸细菌生存于热力学生命边缘(Schuchmann,《自然评论：微生物(Nat Rev Microbiol)》,12:809-821,2014)。因此，迄今分离出的可产生乙酸酯的产乙酸微生物已有描述(Drake,产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes),《原核生物(TheProkaryotes)》,第3版,第354-420页,New York,NY,Springer,2006；Liew等人，通过靶向突变诱发洞察自产乙醇梭菌的CO2固定路径(Insights into CO2Fixation Pathway ofClostridium autoethanogenum by Targeted Mutagenesis)》.mBio2016,7:e00427-16)，因为乙酸酯的产生向微生物提供直接产生ATP的选项，这是磷酸化转乙酰酶(Pta)(EC2.3.1.8)和乙酸激酶(Ack)(EC 2.7.2.1)通过底物水平磷酸化来实现。Pta-Ack系统对乙酰基-CoA转化为乙酸酯具有高度特异性且不利用其它酰基-CoA。尽管例如膜梯度及与离子或质子易位系统(例如Rnf复合物)(Schuchmann,《自然评论：微生物》,12:809-821,2014)偶合的电子分叉酶的机制使这些微生物中的ATP得以保存，但直接的ATP产生对其存活仍为至关重要的。因此，在引入不允许ATP产生之异源路径时，乙酸酯作为副产物产生(Schiel-Bengelsdorf,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett)》,586:2191-2198,2012)。

发明内容

本发明提供了一种用于改善发酵效率的方法，所述方法包含：使含C1气态底物流到生物反应器，所述生物反应器含有一种或多种C1固定微生物于液态营养培养基中的培养物；且使所述培养物发酵以产生至少一种产物。将超过生物质合成需要量的精氨酸提供到培养物中。通常，C1固定微生物包含精氨酸代谢路径。

在第二方面中，本发明提供一种用于增加至少一种ATP密集型产物的产量的方法，所述方法包含：使含C1气态底物流到生物反应器中，所述生物反应器含有一种或多种C1固定微生物于液态营养培养基中的培养物；且使所述培养物发酵以产生至少一种产物。在某些实施例中，向培养物中提供超过生物质合成需要量的精氨酸且C1固定微生物包含精氨酸代谢路径。

在特定实施例中，精氨酸代谢路径包含精氨酸脱胺酶路径及精氨酸脱羧酶路径。精氨酸脱胺酶路径包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)及氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)。精氨酸脱羧酶路径包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)、推定精氨酸脱胺酶(EC 3.5.3.12)、腐胺氨甲酰基转移酶(EC2.1.3.6)及氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)。

通常，向C1固定微生物的培养物提供的精氨酸量超过生物质合成需要量。在某些实施例中，按照细胞需要量到1000倍的细胞需要量向培养物提供精氨酸。在某些实施例中，按照细胞需要量的2至1000倍或2至800倍或2至500倍或2至100倍或2至50倍或2至10倍或50至1000倍、或50至800倍、或50至600倍、或50至500倍、或50至300倍或50至200倍、或50至100倍或100至1000倍或100至800倍或100至600倍或100至500倍或100至300倍或100至200倍向培养物提供精氨酸。

根据某些实施例，向培养物提供精氨酸，使得精氨酸浓度维持在至少20mg/L、或至少100mg/L或至少300mg/L或至少500mg/L、或至少1g/L或至少2g/l、或至少3g/l、或至少4g/L或至少5g/L或至少10g/L、或至少20g/L的量。在某些实施例中，精氨酸浓度维持在20mg/L与20g/l之间、或100mg/L至20g/L之间、或500mg/l至20g/L之间、或500mg/L至10g/L之间、或1g/L至10g/L之间或5g/L至10g/L之间、或5g/L至20g/L之间。在某些实施例中，向培养物提供精氨酸，使得培养物所消耗的精氨酸是每克细胞干重至少20mg精氨酸或每克细胞干重至少100mg精氨酸、或每克细胞干重至少1克精氨酸、或每克细胞干重至少5克精氨酸、或每克细胞干重至少10克精氨酸。在某些实施例中，向培养物提供精氨酸，使得培养物所消耗的精氨酸在每克细胞干重20mg至每克细胞干重20克之间、或每克细胞干重100mg与每克细胞干重20克之间、或每克细胞干重1克与每克细胞干重10克之间。

在某些实施例中，培养物消耗至少0.012g精氨酸，产生1g生物质。在某些实施例中，用于生物质合成的精氨酸细胞需要量在每克生物质0.012g至每克生物质24g之间。在某些实施例中，用于生物质合成的精氨酸需要量是每克生物质至少0.012g、或每克生物质至少0.024g、每克生物质0.048g、或每克生物质至少0.120g、或每克生物质至少0.24g、或每克生物质至少0.48g、或每克生物质至少1.2g、或每克生物质至少2.4g、或每克生物质至少4.8g、或每克生物质至少12g。

通常，精氨酸作为连续馈入生物反应器中的液态培养基组分提供到C1固定微生物的培养物中。在其它实施例中，精氨酸独立于液态培养基提供到生物反应器中(例如通过连续馈入或给与)。

在某些实施例中，与其中精氨酸不超过培养物细胞需要量提供的培养物相比，当精氨酸超过微生物细胞需要量提供到培养物中时，培养物的倍增时间增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％。

在特定实施例中，C1固定微生物包含精氨酸脱亚胺酶路径或精氨酸脱羧酶路径中的至少一种。

在特定实施例中，C1固定微生物是产乙酸一氧化碳营养型微生物。适合C1固定微生物的实例包括梭菌属、穆尔氏菌属(Moorella)、产乙酸杆菌属(Oxobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、乙酸杆菌属(Acetobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)或丁酸杆菌属(Butyribacterium)。在各种实施例中，微生物选自包含以下的组：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)、嗜一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、科斯卡梭菌(Clostridium coskatii)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏乙酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi)、布劳特氏菌产物(Blautia producta)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热乙酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、银乙酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusasphaeroides)、普氏产乙酸杆菌(Oxobacter pfennigii)及柯氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。

在特定实施例中，C1固定微生物是自产乙醇梭菌或永达尔梭菌。在一个特定实施例中，微生物是自产乙醇梭菌。在一个特定实施例中，细菌具有寄存编号DSM10061、DSM19630或DSM23693之识别特征。这些细菌寄存在德国生物物质资源中心(GermanResource Centre for Biological Material；DSMZ)，其地址为DSMZ GmbH Inhoffenstraβe,7B,D-38124。

在某些实施例中，C1固定微生物选自由以下组成的组：自产乙醇梭菌、永达尔梭菌、粪味梭菌、德雷克梭菌及长醋丝菌(Acetonema longum)。

至少一种产物可以是由天然或重组C1固定微生物产生的任何产物。在某些实施例中，至少一种产物选自由以下组成的组：乙醇、2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、乳酸酯、丁二酸酯、甲基乙基酮(MEK)、丁酸酯、2-丁醇、1,2-丙二醇(1,2-PDO)1-丙醇、异丙醇(IPA)、乙偶姻(acetoin)、异丁醇、异戊二烯、菌绿烯(farnesene)、红没药烯(bisabolene)、苹烯(pinine)、柠檬烯、丙酮、3-羟丁酸酯、2-羟异丁酸(2-HIBA)、柠苹酸酯、丁二烯、聚乳酸、1-丁醇、3-羟丙酸酯(3-HP)、苯甲酸酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸、异丁烯。

在特定实施例中，增加向培养物提供的精氨酸浓度以便增加至少一种ATP密集型产物的产量。一般来说，至少一种ATP密集型产物的产生速率是当精氨酸不超过培养物细胞需要量提供时的至少一种ATP密集型产物的产生速率的至少1.5倍大。在某些实施例中，至少一种ATP密集型产物的产生速率是至少2倍大、或至少3倍大、或至少4倍大、或至少5倍大、或至少10倍大。

ATP密集型产物一般定义为代谢路径中直接需要ATP的产物。ATP密集型产物实例(直接需要ATP进行合成的产物，其路径中发生ATP依赖性反应)包括(但不限于)类萜/甲羟戊酸路径衍生产物，其包括异戊二烯、菌绿烯、红没药烯及柠檬烯；脂肪酸路径衍生产物，其包括脂肪酸、脂肪酸乙酯或例如3-羟丙酸酯(3-HP)或异丁烯等分子。

在特定实施例中，增加向培养物提供的精氨酸浓度以便增加至少一种产物的产量，所述至少一种产物选自如下产物的组：不直接需要ATP，而且每个乙酰基-CoA不产生与乙酸酯形成相同量的ATP。在某些实施例中，增加向培养物提供的精氨酸浓度以便增加至少一种产物的产量，所述至少一种产物选自由以下组成的组：丙酮、IPA、3-HB、2-HIBA、1,3-BDO、2,3-BDO、乳酸酯、1,2-PDO、1-丙醇、异丁醇、丁酸酯、丁醇、柠苹酸酯、丁二酸酯及MEK。

在优选实施例中，与其中精氨酸不超过细胞需要量提供的培养物相比，培养物产生的乙酸酯的量减少。在某些实施例中，培养物产生的乙酸酯减少至少10％、或乙酸酯减少至少20％、或乙酸酯减少至少30％、或乙酸酯减少至少40％、或乙酸酯减少至少50％、或乙酸酯减少至少60％、或乙酸酯减少至少80％。在某些实施例中，不产生净乙酸酯，乙酸酯小于1g/L，乙酸酯小于0.5g/L，乙酸酯小于0.1g/L，乙酸酯小于0.05g/L或乙酸酯小于0.01g/L。

本发明进一步提供一种用于改善发酵效率的方法，所述方法包含：向培养物提供一种或多种气态底物及精氨酸，以及使培养物发酵，以便培养物利用精氨酸和一种或多种气态底物。在特定实施例中，气态底物选自由以下组成的组：CO、H₂及CO₂。在特定实施例中，精氨酸和气态底物按照至少2:1或至少1:1或至少1:2的比率被培养物吸收。

在第三方面中，本发明提供一种用于改善发酵过程可持续性的方法，所述方法包含：使含C1气态底物流到生物反应器中，所述生物反应器含有至少一种C1固定细菌于液态营养培养基中的培养物，所述C1固定细菌包含精氨酸脱亚胺酶路径或精氨酸脱羧酶路径中的至少一种；以及使培养物发酵以产生至少一种产物。在某些实施例中，向培养物提供超过培养物细胞需要量的精氨酸。在某些实施例中，向培养物提供的精氨酸通过精氨酸脱亚胺酶路径而发生分解代谢而产生铵，所述铵作为氮源被培养物利用。

本发明进一步提供一种利用精氨酸作为唯一氮源使C1固定细菌生长的方法。在特定实施例中，向培养物提供精氨酸且不以外部方式向培养物提供铵。

C1固定细菌可选自由以下组成的组：梭菌属、穆尔氏菌属、真杆菌属、产乙酸杆菌属、鼠孢菌属及嗜热厌氧杆菌属。在某些实施例中，细菌选自由以下组成的组：伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜碱菌、布劳特氏菌产物、食甲基丁酸杆菌、乙酸梭菌、自产乙醇梭菌、嗜一氧化碳梭菌、科斯卡梭菌、德雷克梭菌、甲酸乙酸梭菌、永达尔梭菌、大梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自营穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、热乙酸穆尔氏菌、普氏产乙酸杆菌、卵形鼠孢菌、银乙酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、柯氏嗜热厌氧杆菌。在优选实施例中，细菌选自由以下组成的组：自产乙醇梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌及科斯卡梭菌。

本发明的另一方面进一步提供一种经基因工程改造的C1固定细菌，其包含优化的精氨酸脱亚胺酶路径。在一个实施例中，本发明提供一种经基因工程改造的C1固定细菌，其包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、氨甲酰基转移酶(鸟氨酸氨甲酰基转移酶、腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)及氨基甲酸激酶(EC2.7.2.2)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。在特定实施例中，C1固定细菌是梭菌属细菌。在特定实施例中，细菌是自产乙醇梭菌。

本发明进一步提供一种经基因工程改造的C1固定细菌，与亲代微生物相比，其具有改善的精氨酸细胞代谢，其中经基因工程改造的C1固定细菌包含一种或多种干扰精氨酸转运子的基因修饰。在特定实施例中，基因修饰是精氨酸:鸟氨酸转运子(CAETHG_3023-24)的基因剔除或置换。在某些实施例中，细菌进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)、2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC2.3.1.B10)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。

本发明进一步提供一种由底物产生至少一种产物的方法，所述方法包含培养经基因工程改造的C1固定细菌，其包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、氨甲酰基转移酶(鸟氨酸氨甲酰基转移酶、腐胺氨甲酰基转移酶)(EC2.1.3.3)及氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。

本发明进一步提供一种用于改善精氨酸并入代谢中的效率的方法，所述方法包含培养经基因工程改造的C1固定细菌，其包含一种或多种选自由以下组成的组的基因修饰：(i)干扰精氨酸转运子的干扰性突变；(ii)过度表达一种或多种选自由以下组成的组的内源酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)及2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC2.3.1.B10)；(iii)表达一种或多种选自由以下组成的组的突变内源酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)及2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)及(iv)表达一种或多种选自由以下组成的组的外源酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)及2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)。

本发明进一步提供一种用于改善精氨酸与一种或多种气态底物的共利用效率的方法，所述一种或多种气态底物选自由以下组成的组：CO、H₂及CO₂，所述方法包含培养经基因工程改造的C1固定细菌，其包含一种或多种基因修饰，其中所述一种或多种基因修饰选自由以下组成的组：(i)调控元件的干扰性突变和(ii)用组成型启动子或合成启动子置换操纵基因结合位点或天然启动子。在特定实施例中，所述干扰性突变是精氨酸抑制子argR的基因剔除，且所述置换是用组成型启动子或合成启动子置换精氨酸脱胺酶路径操纵子启动子。

附图说明

图1图示了自产乙醇梭菌DSM10061在20种氨基酸限定培养基+5g果糖/L中的生长。

图2图示了20AA培养基上生长的自产乙醇梭菌DSM10061的氨基酸消耗量和产量数据。标记表示取样时的OD；前两个样品的半胱氨酸测量超出校正范围。

图3图示了自产乙醇梭菌DSM10061在14AA和8AA培养基上的生长以及与20AA培养基的对比。误差条表示双重培养物之间的标准偏差。4×和2×意指与20AA培养基相比，AA浓度分别高4倍及2倍。

图4图示了与20AA培养基相比，14AA及8AA培养基中的自产乙醇梭菌DSM10061的倍增时间tD。tD，倍增时间；误差条表示双重培养基之间的标准偏差。4×及2×意指与20AA培养基相比，AA浓度分别高4倍及2倍。

图5图示了自产乙醇梭菌DSM10061在14AA 4×培养基中的氨基酸消耗量和产量数据。4×意指与20AA培养基相比，AA浓度高4倍。标记表示取样时的OD。

图6图示了自产乙醇梭菌DSM10061在8AA2×培养基中的氨基酸消耗量和产量数据。2×意指与20AA培养基相比，AA浓度高2倍。标记表示取样时的OD；第一个样品的半胱氨酸测量超出校正范围。

图7图示了自产乙醇梭菌DSM10061在12AA和4AA培养基中的生长数据。误差条表示双重培养物之间的标准偏差。

图8图示了自产乙醇梭菌DSM10061在12AA培养基中的氨基酸消耗量和产量数据。标记表示取样时的OD。

图9图示了自产乙醇梭菌DSM10061在4AA培养基中的氨基酸消耗量和产量数据。标记表示取样时的OD；μM单位不适用于8.3min峰。

图10图示了自产乙醇梭菌DSM10061在4AA培养基中的生长数据，所述生长数据使用BugLab得到。原始数据的Bug单位：ln。0.34h-1特定生长速率是tD～2h。

图11图示了自产乙醇梭菌DSM10061在含有5g精氨酸/L+5g果糖/L的无YE的PETC-MES培养基中的生长数据。

图12图示了自产乙醇梭菌DSM10061在含有5g精氨酸/L+5g果糖/L的无YE的PETC-MES培养基中的乙酸酯产量数据。

图13图示了自产乙醇梭菌DSM10061在5g精氨酸/L+5g果糖/L中的氨基酸消耗量和产量数据。标记表示取样时的OD；μM单位不适用于8.3min峰。

图14图示了自产乙醇梭菌DSM10061在含有5g精氨酸/L+5g果糖/L的无YE的PETC-MES培养基中的生长数据，所述生长数据使用BugLab得到。原始数据的Bug单位：ln。0.21h-1特定生长速率是tD～3h。

图15图示了含有果糖的生物反应器实验中精氨酸和酵母萃取物的生长分布和倍增时间之差异。

图16图示了在精氨酸增补存在(△)和不存在(●)的情况下，自产乙醇梭菌DSM23693的自营生长。

图17图示了在精氨酸增补存在(△)和不存在(●)的情况下，自产乙醇梭菌DSM23693的自营生长及在CO/CO₂/H₂气体(□)不存在的情况下，基于单独精氨酸的生长。

图18是在精氨酸增补存在(△)和不存在(●)的情况下，自产乙醇梭菌DSM23693的自营生长的对数图。

图19图示了在精氨酸增补存在(△)和不存在(●)的情况下，自产乙醇梭菌DSM23693在自营生长期间的乙酸酯产量。

图20是精氨酸脱羧酶路径的示意图。

图21是精氨酸脱亚胺酶路径中的L-精氨酸降解的示意图。

图22是展示产物的碳通量的饼图。

图23展示斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)中发生鸟氨酸消耗所需的酶。

图24图示了自产乙醇梭菌在含有果糖的4AA或ARG培养基上异营生长期间的ATP产量分布。

具体实施方式

定义及背景

术语“超过细胞需要量”是指向微生物提供的组分大于微生物合成生物质所必需的组分的量。

术语“ATP密集型产物”是指一种代谢物，其合成至少需要在其合成路径的一个步骤中输入ATP(能量)(例如，在路径中具有ATP依赖性反应)。

术语“比生长速率”是指每小时每种细胞生物质的细胞生物质生长速率。

术语“倍增时间”是指细胞生物质增加一倍所花费的时间(小时)。

术语“精氨酸代谢路径”泛指涉及精氨酸代谢的任何路径。精氨酸代谢路径通常包含精氨酸脱胺酶路径和精氨酸脱羧酶路径中的至少一种。

术语“基因修饰”或“基因工程”泛指对微生物基因组或核酸的操纵。类似地，术语“基因工程”是指微生物包含经操纵的基因组或核酸。基因修饰方法包括例如异源基因表达、基因或启动子插入或缺失、核酸突变、改变的基因表达或不活化、酶工程、定向进化、基于知识的设计、随机突变诱发方法、基因改组及密码子优化。

“重组”表示核酸、蛋白质或微生物为基因修饰、工程改造或重组的产物。通常，术语“重组”是指核酸、蛋白质或微生物含有衍生自多个来源的遗传物质或由来源于多个来源的遗传物质编码，例如两种或超过两种不同品系或菌种的微生物。如本文所用，术语“重组”还可以用于描述微生物包含突变核酸或蛋白质，包括突变形式的内源核酸或蛋白质。

“内源”是指核酸或蛋白质存在或表达于衍生本发明微生物的野生型或亲代微生物中。举例来说，内源基因为天然地存在于衍生本发明微生物的野生型或亲代微生物中的基因。在一个实施例中，内源基因的表达可以通过外源调控元件控制，例如外源启动子。

“外源”是指核酸或蛋白质不存在于衍生本发明微生物的野生型或亲代微生物中。在一个实施例中，外源基因或酶可衍生自异源(即不同)品系或菌种且引入或表达于本发明微生物中。在另一实施例中，外源基因或酶可以人工方式或以重组方式形成且引入或表达于本发明微生物中。外源核酸可以适于整合至本发明微生物的基因组中或在本发明微生物中保持染色体外状态，例如在质体中。

“酶活性”或简言之“活性”泛指酶活性，包括(但不限于)酶的活性、酶的量或酶催化反应的可利用性。因此，“增加”酶活性包含增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可利用性。类似地，“降低”酶活性包括降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反应的可利用性。

“突变”是指本发明微生物中的核酸或蛋白质相较于衍生本发明微生物的野生型或亲代微生物已经过修饰。在一个实施例中，突变可以是编码酶的基因中的缺失、插入或取代。在另一实施例中，突变可以是酶中的一种或多种氨基酸的缺失、插入或取代。

具体地说，“干扰性突变”为减少或消除(即“干扰”)基因或酶表达或活性的突变。干扰性突变可使基因或酶部分不活化、完全不活化或缺失。干扰性突变可以是基因剔除(KO)突变。干扰性突变可以是减少、阻止或阻断酶所产生的产物的生物合成的任何突变。干扰性突变可包括例如编码酶的基因的突变、参与编码酶的基因的表达的遗传调控元件的突变、产生降低或抑制酶活性的蛋白质的核酸的引入或抑制酶之表达的核酸(例如反义RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白质的引入。可使用所属领域中已知的任何方法引入干扰性突变。

引入干扰性突变产生如下本发明微生物，其不产生目标产物或实质上不产生目标产物或相较于衍生本发明微生物的亲代微生物产生目标产物的量减少。举例来说，本发明微生物可不产生目标产物或产生的目标产物比亲代微生物少至少1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。举例来说，本发明微生物可产生少于0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0g/L目标产物。

“密码子优化”是指核酸(例如基因)突变以使特定品系或菌种的核酸的翻译优化或改善。密码子优化可产生较快的翻译速率或较高的翻译准确性。在一个优选实施例中，本发明基因针对梭菌属、尤其自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌中的表达进行密码子优化。在另一个优选实施例中，本发明基因针对自产乙醇梭菌LZ1561中的表达进行密码子优化，所述自产乙醇梭菌LZ1561以DSMZ寄存编号DSM23693寄存。

“过度表达”是指本发明微生物中核酸或蛋白质的表达相较于衍生本发明微生物的野生型或亲代微生物增加。过度表达可以通过本领域中已知的任何手段达成，包括修改基因拷贝数、基因转录速率、基因翻译速率或酶降解速率。

术语“变异体”包含序列不同于参考核酸及蛋白质的序列(例如现有技术中所公开或本文中所例示的参考核酸及蛋白质的序列)的核酸及蛋白质。本发明可以使用变异型核酸或蛋白质实施，所述变异型核酸或蛋白质的功能与参考核酸或蛋白质实质上相同。举例来说，变异体蛋白质可以发挥与参考蛋白质基本上相同的功能或催化与参考蛋白质基本上相同的反应。变异型基因可编码与参考基因相同或实质上相同的蛋白质。变异型启动子启动一个或多个基因表达的能力与参考启动子实质上相同。

此类核酸或蛋白质在本文中可称为“功能等效变异体”。举例来说，核酸的功能等效变异体可包括等位基因变异体、基因片段、突变基因、多形现象等。来自其它微生物的同源基因也是功能等效变异体的实例。这些基因包括例如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或永达尔梭菌等菌种中的同源基因，其详情在例如基因库或NCBI的网站上可公开获得。功能等效变异体还包括由于针对特定微生物的密码子优化而引起序列变化的核酸。核酸的功能等效变异体将优选与参考核酸具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或大于98％的核酸序列一致性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变异体将优选与参考蛋白质具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或大于98％的氨基酸一致性(同源性百分比)。变异体核酸或蛋白质的功能等效性可使用所属领域中已知的任何方法评估。

核酸可使用所属领域中已知的任何方法递送至本发明微生物。举例来说，核酸可以裸核酸形式递送，或可用一种或多种试剂(例如脂质体)配制。适当时，核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。某些实施例中可以使用限制抑制剂。其它载体可以包括质体、病毒、噬菌体、粘质体和人工染色体。在一个优选实施例中，使用质体将核酸递送至本发明微生物中。举例来说，转化(包括转导或转染)可以通过电致孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或接合实现。在具有活性限制酶系统的某些实施例中，可能需要在核酸引入微生物中之前使所述核酸发生甲基化。

此外，核酸可以设计成包含调控元件，例如启动子，以提高或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。理想地，启动子是伍德-永达尔路径启动子、铁氧化还原蛋白启动子、丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸化转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

“微生物”为微观生物，尤其为细菌、古细菌(archaea)、病毒或真菌。本发明微生物通常为细菌。如本文所用，“微生物”的引述应理解为涵盖“细菌”。

“亲代微生物”为用于产生本发明微生物的微生物。亲代微生物可以是天然存在的微生物(即，野生型微生物)或预先经修饰的微生物(即，突变或重组微生物)。本发明微生物可经修饰以表达或过度表达一种或多种在亲代微生物中不表达或不过度表达的酶。类似地，本发明微生物可经修饰以含有亲代微生物所不含的一个或多个基因。本发明微生物还可以经修饰以不表达或表达较少量的一种或多种表达于亲代微生物中的酶。在一个实施例中，亲代微生物是自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在一个优选实施例中，亲代微生物是自产乙醇梭菌LZ1561，其在2010年6月7日，根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款及所授予的寄存编号DSM23693，于2010年6月7日寄存在位于Inhoffenstraβ7B,D-38124Braunschwieg,Germany的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)。

术语“衍生自”表示核酸、蛋白质或微生物由不同(例如亲代或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或改适，以产生新的核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或调适通常包含核酸或基因的插入、缺失、突变或取代。通常，本发明微生物衍生自亲代微生物。在一个实施例中，本发明微生物衍生自自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自以DSMZ寄存编号DSM23693寄存的自产乙醇梭菌LZ1561。

本发明微生物可基于功能特征进一步分类。举例来说，本发明微生物可以是或可衍生自C1固定微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳氧化菌和/或甲烷氧化菌。表1提供微生物的代表性清单且鉴别其功能特征。

¹伍氏乙酸杆菌可利用果糖而非气体产生乙醇。

²尚未研究大梭菌是否能够依赖CO生长。

³已报导热乙酸穆尔氏菌的一个菌株穆尔氏菌属HUC22-1利用气体产生乙醇。

⁴尚未研究卵形鼠孢菌是否能够依赖CO生长。

⁵尚未研究银乙酸鼠孢菌是否能够依赖CO生长。

⁶尚未研究球形鼠孢菌是否能够依赖CO生长。

“C1”是指单碳分子，例如CO、CO₂、CH₄或CH₃OH。“C1-氧合物”是指还包含至少一个氧原子的单碳分子，例如CO、CO₂或CH₃OH。“C1-碳源”是指充当本发明微生物的部分或唯一碳源的单碳分子。举例来说，C1-碳源可包含CO、CO₂、CH₄、CH₃OH或CH₂O₂中的一种或多种。优选地，C1-碳源包含CO及CO₂中的一种或两种。“C1固定微生物”是具有利用C1-碳源产生一种或多种产物的能力的微生物。通常，本发明微生物是C1固定细菌。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自表1中鉴别的C1固定微生物。

“厌氧菌”为生长不需要氧气的微生物。如果氧气以高于某一临限值存在，则厌氧菌可能会消极反应或甚至死亡。通常，本发明微生物是厌氧菌。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自表1中鉴别的厌氧菌。

通常，“产乙酸菌”为利用伍德-永达尔路径作为其能量守恒和合成乙酰基-CoA与乙酰基-CoA衍生产物(例如乙酸酯)的主要机制的绝对厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)》,1784:1873-1898,2008)。产乙酸菌利用乙酰基-CoA路径作为(1)自CO2还原合成乙酰基-CoA的机制，(2)终端接受电子的能量守恒过程，(3)细胞碳合成中固定(同化)CO2的机制(Drake,产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes),《原核生物》,第3版,第354页,New York,NY,2006)。所有天然存在的产乙酸菌为C1固定、厌氧、自营及非甲烷氧化的。通常，本发明微生物是产乙酸菌。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自表1中鉴别的产乙酸菌。

“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。通常，本发明微生物是产乙醇菌。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自表1中鉴别的产乙醇菌。

“自营生物”是能够在有机碳不存在下生长的微生物。相反，自营生物利用无机碳源，例如CO和/或CO₂。通常，本发明微生物是自营生物。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自表1中鉴别的自营生物。

“一氧化碳氧化菌”是能够利用CO作为唯一碳源的微生物。通常，本发明微生物是一氧化碳氧化菌。在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自表1中鉴别的一氧化碳氧化菌。

“甲烷氧化菌”是能够利用甲烷作为唯一碳源和能量来源的微生物。在某些实施例中，本发明微生物衍生自甲烷氧化菌。

更广泛地，本发明微生物可衍生自表1中鉴别的任何属或菌种。

在一个优选实施例中，本发明微生物衍生自梭菌属丛集，包含菌种自产乙醇梭菌、永达尔梭菌及拉氏梭菌。这些均种首先被Abrini,《微生物学档案(Arch Microbiol)》,161:345-351,1994(自产乙醇梭菌)；Tanner,《国际系统细菌学杂志(Int J SystemBacteriol)》,43:232-236,1993(永达尔梭菌)及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)报道和表征。

这些三种菌种具有许多相似性。具体地说，这些菌种全部是梭菌属的C1固定、厌氧、产乙酸、产乙醇及一氧化碳营养型成员。这些菌种具有相似基因型和表达型和能量守恒和发酵代谢模式。此外，这些菌种丛集于16S rRNA DNA大于99％一致性的梭菌rRNA同源组I中，具有22-30mol％的DNA G+C含量，呈革兰氏阳性(gram-positive)，具有相似形态及大小(0.5-0.7×3-5μm之间的对数生长细胞)，是嗜温性的(最佳生长于30-37℃下)，具有4-7.5的相似pH范围(其中最佳pH是5.5-6)，不具有细胞色素且通过Rnf复合物保持能量守恒。另外，在这些菌种中已显示羧酸还原成其对应醇(Perez,《生物技术与生物工程(BiotechnolBioeng)》,110:1066-1077,2012)。重要的是，这些菌种还全部显示针对含CO气体的强自营生长作用，产生乙醇及乙酸酯(或乙酸)作为主要发酵产物，且在某些条件下产生少量2,3-丁二醇及乳酸。

然而，这些三种菌种还具有多种差异。这些菌种自不同来源分离：自产乙醇梭菌自兔肠道分离，永达尔梭菌自鸡舍废弃物分离，且拉氏梭菌自淡水沉积物分离。这些菌种在各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)及其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的利用方面不同。此外，这些菌种在对某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型方面不同。这些菌种在伍德-永达尔路径基因及蛋白质的核酸及氨基酸序列方面具有差异，但已发现这些基因及蛋白质的一般组织及数目在所有菌种中相同(《生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)》,22:320-325,2011)。

因此，总体而言，自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的许多特征并非是所述菌种所特有的，而是梭菌属的C1固定、厌氧、产乙酸、产乙醇及一氧化碳营养型成员的此丛集的一般特征。然而，由于这些菌种实际上是不同的，因此这些菌种中的一种的基因修饰或操纵可以不具有这些菌种中的另一种的相同效应。举例来说，可观测到生长、性能或产物产量方面的差异。

本发明微生物还可以衍生自产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌的分离株或突变体。自产乙醇梭菌的分离株和突变体包括JA1-1(DSM10061)(Abrini,《微生物学档案》,161:345-351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)及LZ1561(DSM23693)。永达尔梭菌的分离株和突变体包括ATCC 49587(Tanner,《国际系统细菌学杂志》,43:232-236,1993)、PETCT(DSM13528,ATCC 55383)、ERI-2(ATCC55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo,使用永达尔梭菌自合成气产生生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gas usingClostridium ljungdahlii),《博士毕业论文(PhD thesis)》,North Carolina StateUniversity,2010)。拉氏梭菌的分离株及突变体包括PI 1(ATCC BAA-622，ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

“底物”是指本发明微生物的碳源和/或能量来源。通常，底物是气态底物，且包含C1-碳源，例如CO、CO₂和/或CH₄。优选地，底物包含CO或CO+CO₂的C1-碳源。底物可进一步包含其它非碳组分，例如H₂、N₂或电子。

底物通常包含至少一些量的CO，例如1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol％CO。底物可包含一定范围的CO，例如20-80、30-70或40-60mol％CO。优选地，底物包含40-70mol％CO(例如，钢铁厂或高炉气体)、20-30mol％CO(例如，碱性氧气转炉气体)或15-45mol％CO(例如，合成气)。在一些实施例中，底物可包含相对较低量的CO，例如1-10或1-20mol％CO。本发明微生物通常将底物中的至少一部分CO转化为产物。在一些实施例中，底物不包含或实质上不包含CO(<1mol％)。

底物可包含一定量的H₂。例如，底物可包含1、2、5、10、15、20或30mol％H₂。在一些实施例中，底物可包含相对较高量的H₂，例如60、70、80或90mol％H₂。在其它实施例中，底物不包含或实质上不包含H₂(<1mol％)。

底物可包含一定量的CO₂。例如，底物可包含1-80或1-30mol％CO₂。在一些实施例中，底物可包含小于20、15、10或5mol％CO₂。在另一实施例中，底物不包含或实质上不包含CO₂(<1mol％)。

尽管底物通常是气态，但底物还可以替代形式提供。举例来说，底物可使用微泡分散发生器溶解于含CO气体饱和液体中。另外举例来说，底物可吸附至固体载体上。

底物和/或C1-碳源可以是作为工业制程的副产物获得或来自一些其它来源(例如来自汽车排出的烟或生物质气化)的废气。在某些实施例中，工业制程选自由以下组成的组：铁金属产品制造(例如钢铁厂制造)、非铁产品制造、石油精炼方法、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨气生产、甲醇生产及焦炭制造。在这些实施例中，底物和/或C1-碳源可在其排放至大气中之前使用任何便利方法自工业制程中捕获。

底物和/或C1-碳源可以是合成气，例如通过煤炭或精炼厂残余物气化、生物质或木质纤维素材料气化或天然气重整获得的合成气。在另一实施例中，合成气可获自城市固体废物或工业固体废物的气化。

底物的组成可对反应效率和/或成本具有显著影响。举例来说，氧气(O₂)的存在可能降低厌氧发酵方法的效率。视底物的组成而定，可能需要处理、洗涤或过滤底物以去除任何不合需要的杂质，例如毒素、不合需要的组分或粉尘粒子，和/或增加所需组分的浓度。

本发明微生物可加以培养以产生一种或多种产物。举例来说，自产乙醇梭菌产生或可经工程改造以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸酯(WO 2007/117157)、丁醇(WO 2008/115080及WO 2012/053905)、丁酸酯(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸酯(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522及WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟丙酸酯(3-HP)(WO 2013/180581)、异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)及1-丙醇(WO 2014/0369152)。除一种或多种目标产物以外，本发明微生物还可以产生乙醇、乙酸酯和/或2,3-丁二醇。在某些实施例中，微生物生物质本身可视为产物。

“天然产物”是未经基因修饰的微生物所产生的产物。举例来说，乙醇、乙酸酯和2,3-丁二醇是自产乙醇梭菌、永达尔梭菌及拉氏梭菌的天然产物。“非天然产物”是由经基因修饰的微生物产生而非由衍生经基因修饰的微生物的未经基因修饰微生物产生的产物。

“选择性”是指目标产物的产量与微生物所产生的所有发酵产物的产量的比率。本发明微生物可经工程改造而以特定选择性或最小选择性产生产物。在一个实施例中，目标产物占本发明微生物所产生的所有发酵产物的至少5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施例中，目标产物占本发明微生物所产生的所有发酵产物的至少10％，使得本发明微生物对目标产物的选择性是至少10％。在另一实施例中，目标产物占本发明微生物所产生的所有发酵产物的至少30％，使得本发明微生物对目标产物的选择性是至少30％。

“提高效率”等包括(但不限于)提高比生长速率、产物产生速率或体积、每个所消耗底物体积的产物体积或产物选择性。效率可相对于衍生本发明微生物的亲代微生物的性能测量。

术语“生产率”或“生产速率”是产物的体积生产率。在连续系统中，体积生产率按照产物稳态浓度与液体滞留时间的比率计算。在分批系统中，体积生产率按照分批系统中的浓度和产生所述浓度所需的时间来计算。体积生产率按照克/升/天报道。

通常，在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包括培养/发酵装置，其由一个或多个容器、塔或管道配置组成，例如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵槽、静态混合器或适合于气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施例中，生物反应器可包含第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可将底物提供至这些反应器中的一个或两个中。如本文所用，术语“培养”与“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵过程的生长阶段和产物生物合成阶段。

培养物通常在水性培养基中维持，所述水性培养基含有足以容许微生物生长的营养物、维生素和/或矿物质。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，例如最小厌氧微生物生长培养基。适合培养基在所属领域中已熟知。

培养/发酵期望应在适用于产生目标产物的条件下进行。通常，培养/发酵在厌氧条件下执行。应考虑到的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(若使用连续搅拌槽反应器)、接种物含量、确保液相中的气体不会变成限制因素的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。具体地说，可以控制底物的引入速率以确保液相中的气体浓度不会变成限制因素，因为在气体限制条件下，培养物可能会消耗产物。

在高压下操作生物反应器实现了从气相到液相的气体质量转移速率的增大。因此，通常优选在高于大气压的压力下进行培养/发酵。此外，由于既定气体转化率在某种程度上是底物滞留时间的函数，且滞留时间决定了生物反应器的所需体积，因此使用加压系统能大大减小所需生物反应器的体积，且因此降低培养/发酵设备的资金成本。此又意味着当生物反应器维持在高压而非大气压下时，能缩短滞留时间(定义是生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件将部分地取决于所用特定微生物。然而，一般来说，优选在高于大气压的压力下操作发酵。此外，由于既定气体转化速率在某种程度上是底物滞留时间的函数，且实现所需的滞留时间又决定了生物反应器的所需体积，因此使用加压系统能大大减小所需生物反应器的体积，且因此降低发酵设备的资金成本。

目标产物可以使用任何方法或所属领域中已知方法的组合从发酵液中分离或提纯，包括例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气体汽提、相分离及萃取发酵，包括例如液-液萃取。在某些实施例中，目标产物通过以下步骤从发酵液回收：从生物反应器中连续去除发酵液的一部分，从发酵液中分离出微生物细胞(宜通过过滤进行)且从发酵液中回收一种或多种目标产物。醇和/或丙酮可例如通过蒸馏回收。酸可例如通过吸附于活性炭上回收。优选使所分离的微生物细胞返回至生物反应器中。还优选使已去除目标产物后剩余的无细胞渗透物返回至生物反应器中。可将其它营养物(例如B维生素)添加至无细胞渗透物中以补充培养基后再返回至生物反应器中。

当提及将“酸”添加至根据本发明的培养物或生物反应器中时，术语“酸”等的使用应从广义上理解，包括任何单羧酸和二羧酸。因此，提及添加或产生等效盐应视为包括提及酸或混合物。举例来说，提及所述术语时，乙酸盐应视为包括乙酸且反的还然。发酵液中的分子酸与羧酸的比率取决于系统的pH。例示性酸包括乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸和苯甲酸。

本发明提供用于改善发酵效率的方法。本发明人已发现向微生物培养物中添加超过细胞需要量的特定氨基酸对培养物生长具有深远作用。此外，本发明人已鉴别出过量添加氨基酸能够增加发酵产物，尤其具有高能量/ATP需求的发酵产物的产量。

本发明提供用于改善发酵效率的方法。本发明人已发现向微生物培养物中添加超过细胞需要量的精氨酸对培养物生长具有深远作用。此外，本发明人鉴别出过量添加精氨酸能够增加发酵产物，尤其具有高能量/ATP需求的发酵产物的产量。

在不希望受理论束缚的情况下，相信精氨酸的生长提升作用视为来自通过微生物的精氨酸代谢期间产生ATP。精氨酸通过精氨酸脱亚胺酶(ADI)路径或精氨酸脱羧酶路径代谢。

通过精氨酸脱亚胺酶的精氨酸代谢通过以下机制进行：

通过ADI路径的精氨酸代谢使得产生铵、CO₂及ATP。

通过精氨酸脱羧酶路径的精氨酸代谢通过以下机制进行：

由精氨酸代谢产生的所得ATP实现微生物的生长分布增加。

在不希望受理论束缚的情况下，本发明人相信尽管精氨酸代谢提供微生物生长的ATP需要量，但精氨酸并未用作微生物的碳源，确切而言，所用碳源是含C1气体中的碳组分。

用于使含C1气态底物的微生物发酵以产生例如乙醇和乙酸酯等产物的方法在本领域中广泛已知。此类方法提供由包含C1碳源的工业废气产生商业上有用燃料的手段。这些方法通常涉及将包含例如CO的气态底物馈入生物反应器中，所述生物反应器包含至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物于液态培养基中的培养物。气态底物经厌氧发酵以产生醇、酸和其混合物。用于生物反应器中的液态培养基通常含有支持所述至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物生长的各种营养物，且用于一种或多种微生物的代谢路径中以便产生醇。此类营养物的实例包括MgCl、CaCl、KCl、H₃PO₄、Fe、Ni、Zn、Mn、B、W、Se等。

还已知梭菌属菌株可经基因修饰以能够产生多种其它有用产物，包括丁二酸酯、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、异戊二烯、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸酯、丁二烯和聚乳酸、丙酮、丁醇、异丁烯3-羟丙酸酯(3HP)和脂肪酸。

出人意料地，本发明人已发现增加提供至微生物培养物中的精氨酸浓度使微生物的生长分布增加，且使培养物所能产生的ATP密集型产物的量增加。

本发明的一个实施例涉及向液态培养基提供精氨酸，其中向液态培养基所提供的精氨酸的量超过C1固定微生物的细胞需要量。提供超过C1固定微生物的细胞需要量的精氨酸具有提高微生物培养物的比生长速率的作用。在一些实施例中，与不存在过量精氨酸的情况下的微生物相比，C1固定微生物的比生长速率增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％。

微生物对精氨酸的细胞需要量可通过测定生物质水解之后的生物质的氨基酸组成和氨基酸分析来估计。

已证明通过将液态营养培养基中的精氨酸浓度自等于细胞需要量提高至超过生物质合成需要量的1000倍(或大于1000倍)，微生物的倍增时间降低。在某些实施例中，与不存在过量精氨酸的情况下的培养物中的7.3h的倍增时间相比，提供有过量精氨酸的培养物的倍增时间降低至3.5h。在不希望受理论束缚的情况下，本发明人还相信通过将精氨酸浓度自超过细胞需要量2倍提高至80倍(或大于80倍)，ATP密集发酵产物的生产率增加。在某些实施例中，精氨酸按照生物质合成需要量的2至1000倍或2至800倍或2至500倍或2至100倍或2至50倍或2至10倍或50至1000倍、或50至800倍、或50至600倍、或50至500倍、或50至300倍或50至200倍、或50至100倍或100至1000倍或100至800倍或100至600倍或100至500倍或100至300倍或100至200倍提供到培养物中。

就实际浓度而言，本发明的一个宽泛实施例是其中液态培养基中的精氨酸浓度是20mg/L至20g/L的实施例。在特定实施例中，精氨酸浓度是按照至少20mg/L、或至少100mg/L、或至少300mg/L或至少500mg/L、或至少1g/L或至少2g/l、或至少3g/l、或至少4g/L或至少5g/L或至少10g/L或至少20g/L的量维持。在某些实施例中，精氨酸浓度维持在20mg/L与20g/l之间、或100mg/L至20g/L之间、或500mg/l至20g/L之间、或500mg/L至10g/L之间、或1g/L至10g/L之间或5g/L至10g/L之间、或5g/L至20g/L之间。在某些实施例中，向培养物提供精氨酸，使得培养物所消耗的精氨酸是每克细胞干重至少20mg精氨酸或每克细胞干重至少100mg精氨酸、或每克细胞干重至少1克精氨酸、或每克细胞干重至少5克精氨酸、或每克细胞干重至少10克精氨酸。在某些实施例中，向培养物提供精氨酸，使得培养物所消耗的精氨酸在每克细胞干重20mg至每克细胞干重20克之间、或每克细胞干重100mg与每克细胞干重20克之间、或每克细胞干重1克与每克细胞干重10克之间。

在本发明的一些实施例中，将液态营养培养基中的精氨酸浓度自超过细胞需要量2倍提高至80倍(或大于80倍)会使微生物的倍增时间增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％。

当精氨酸增加超过自产乙醇梭菌的细胞需要量时，微生物所产生的乙酸酯减少。在不希望受理论束缚的情况下，本发明人相信当供应精氨酸时，自产乙醇梭菌能够利用精氨酸产生用于生长的ATP无需微生物来产生用于获取ATP的乙酸酯。

所有产乙酸微生物已描述可产生乙酸酯(Drake,产乙酸原核生物(AcetogenicProkaryotes),《原核生物》,第3版,第354-420页,New York,NY,Springer,2006)，因为乙酸的产生向微生物提供通过磷酸转乙酰酶(Pta)及磷酸转乙酰酶-乙酸激酶(Ack)自底物层面磷酸化直接产生ATP的选项。具体地说，在市售规模下，不希望微生物产生乙酸酯(或CoA转移酶反应所需的其它有机酸)作为副产物，因为乙酸酯自目标产物转移碳，且因此影响目标产物的效率及产量。另外，乙酸酯可能对微生物具有毒性和/或可以充当污染性微生物生长的底物。此外，乙酸酯的存在使得较难回收及分离目标产物及控制发酵条件以促进目标产物的产生。

当与其中精氨酸不超过细胞需要量提供的培养物相比时，向自产乙醇梭菌培养物提供超过细胞需要量的精氨酸使得乙酸酯产量大大降低。此外，本发明人已证明，当精氨酸源完全耗尽时，培养物中乙酸酯产量增加。在一个实施例中，向微生物培养物提供的过量精氨酸使乙酸酯产量降低20％或30％或40％或50％、或60％、或70％或80％。

本发明人已证明精氨酸按化学计量转化为鸟氨酸，这表明精氨酸脱亚胺酶路径是精氨酸代谢机制。此路径将精氨酸转化为鸟氨酸、铵、ATP和CO₂。通过精氨酸降解供应ATP和铵将促进生长强化。在一个实施例中，本发明提供一种用于改善发酵方法的可持续性的方法，其中在不存在替代性氮源的情况下向微生物培养物提供精氨酸。

所属领域中熟知氮是微生物生长所必需的。氮通常以铵盐或氢氧化铵形式提供至培养物中。氨气通常由哈伯法(Haber process)产生，其通过以下反应表征：

目前氨气主要由天然气及煤炭产生。在典型的由天然气产生氨气的方法中，氢气源于天然气且氮气衍生自大气。天然气产生温室气体，因此尽管氨气自身不产生温室气体，但氨气的制造会产生温室气体。期望发现且利用完全可再生的氨气源。[http://www.agmrc.org/renewable_energy/renewable_energy/ammonia-as-a-transportation-fuel/]。氢氧化铵(28.0至30.0w/w)的成本在每1000公斤US$9600范围内。

1886年首次自羽扇豆幼苗萃取物分离出精氨酸(L-精氨酸)。其随后鉴别为广泛地分布在食品和饲料中。可由各种方法产生精氨酸，所述方法包括蛋白质水解、化学合成和微生物合成。大多数L-精氨酸由使用可再生碳源直接发酵产生。[jn.nutrition.org/content/134/10/2854S.full]

实例3的经鉴别的路径提供将1mol精氨酸转化为3mol氨气。因此精氨酸可以是细菌提供替代性氮源，将氨气直接提供至代谢中，同时仍提供上文所述的优点。由于1个精氨酸分子可分解成3个氨分子，所需较低量由较便宜的精氨酸价格(根据Sigma Aldrich或Fisher，99％食品级精氨酸成本是大约～US$17-18,000/1000kg，而30％工业级氨成本是～US$10-11,000/1000kg)及减少的处理引起显著成本节约。此外，精氨酸可例如通过发酵可持续地衍生自生物源(T.Utagawa,《营养学杂志(J.Nutr.)》,2004,134,2854S-2857)。

精氨酸脱亚胺酶路径通过三个酶促步骤，通过精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、氨甲酰基转移酶(鸟氨酸氨甲酰基转移酶、腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)及氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)催化进行。已在自产乙醇梭菌的基因组中鉴别出相应酶。

本发明的另一方面进一步提供一种基因工程改造的C1固定细菌，其包含经改善的精氨酸脱亚胺酶路径。在一个实施例中，本发明提供一种基因工程改造的C1固定细菌，其包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、氨甲酰基转移酶(鸟氨酸氨甲酰基转移酶、腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)和氨基甲酸激酶(EC2.7.2.2)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。在特定实施例中，C1固定细菌是梭菌属细菌。在特定实施例中，细菌是自产乙醇梭菌。

尽管不希望受理论束缚，但本发明人相信如果观测到呈瓜氨酸形式的中间体积聚，则为了增加路径性能，可过度表达相应基因或可由本领域技术人员使用先前所述的方法(WO2012/053905、WO2012/115527、WO2013-180584)引入且异源表达来自其它来源的基因。

本发明进一步提供一种用于由底物产生至少一种产物的方法，所述方法包含：培养基因工程改造的C1固定细菌，其包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、氨甲酰基转移酶(鸟氨酸氨甲酰基转移酶、腐胺氨甲酰基转移酶)(EC2.1.3.3)和氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。

本发明的另一方面进一步提供一种基因工程改造C1固定细菌，其包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶。不希望受理论束缚，本发明人相信可过度表达相应基因或可由本领域技术人员使用先前所述的方法(WO2012/053905、WO2012/115527及WO2013-180584)引入且异源表达来自其它来源的基因。如果生物体适于随时间依赖于精氨酸生长，则所述生物体还可以改适且进化成更有效地利用鸟氨酸。这受到鸟氨酸积聚的观测结果的支持。

本发明人已鉴别出通过结合至回文操纵序列来控制基因表达的精氨酸抑制子，所述回文操纵序列位于精氨酸脱亚胺酶起始密码子的上游大约45bp处。添加精氨酸使得抑制子不结合操纵序列，从而使操纵序列下游的基因发生转录。在本发明的一个方面中，提供一种包含至少一种异源基因的基因工程改造重组细菌，所述异源基因提供于结合argR的操纵序列的下游，其中至少一种异源基因的基因表达能通过添加精氨酸来活化。

本发明进一步提供一种用于产生至少一种产物的方法，所述方法包含：向培养物提供碳源，所述培养物含有包含至少一种异源基因的基因工程改造细菌，所述异源基因提供于结合argR的操纵序列的下游；向培养物提供精氨酸；和使培养物发酵。在某些实施例中，至少一种异源基因是产物的生物合成路径中的异源基因。

在一个实例中，异源基因可编码需要ATP来合成产物的代谢路径。举例来说，甲羟戊酸路径是异源路径，其以每摩尔异戊烯基-二磷酸酯3摩尔ATP的代价将乙酰基-CoA转化为异戊烯基-二磷酸酯。使用所述方法，异源甲羟戊酸路径的表达能通过添加精氨酸来活化，其还通过精氨酸经由精氨酸脱亚胺酶路径发生降解而向甲羟戊酸路径提供ATP。

在另一方面中，能通过精氨酸脱羧路径利用精氨酸。不希望受理论束缚，本发明人相信精氨酸能通过酶(精氨酸脱羧酶)脱羧成精胺和CO2。精胺随后能通过酶(精胺脱亚胺酶)转化为N-氨甲酰腐胺，还产生铵。N-氨甲酰腐胺和磷酸酯能通过腐胺氨甲酰基转移酶转化为腐胺和氨甲酰磷酸酯。氨甲酰磷酸酯和ADP通过氨基甲酸激酶、通过与精氨酸脱亚胺酶路径相同的机制转化为铵+ATP+CO2。铵和ATP的净产量与精氨酸脱亚胺酶路径相同，但存在两种不同中间体(精胺和N-氨甲酰腐胺)和不同副产物(腐胺)。腐胺是值大于鸟氨酸或精氨酸的副产物且可用作产生包括尼纶-4,6(Qian等人,2009,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》104,第651-662页)及聚氨基甲酸酯的各种聚合物的馈料。

在另一方面中，细菌经修饰以过度表达一种或多种内源基因、表达一种或多种突变内源基因或异源表达一种或多种外源基因，所述基因编码选自由以下组成的组的酶：鸟氨酸消旋酶、鸟氨酸氨基变位酶亚单元β(OraE)、鸟氨酸氨基变位酶亚单元α(OraS)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶、2,4-二氨基戊酸脱氢酶、2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶β亚单元、2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶α亚单元和其功能等效变异体。或者，细菌可经修饰以表达一种或多种选自由以下组成的组的外源基因：鸟氨酸消旋酶、鸟氨酸氨基变位酶亚单元β(OraE)、鸟氨酸氨基变位酶亚单元α(OraS)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶、2,4-二氨基戊酸脱氢酶、2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶β亚单元和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶α亚单元。在优选实施例中，内源基因衍生自斯氏梭菌(图23)。不希望受理论束缚，本发明人认为这些基因的过度表达引起/将引起精氨酸脱亚胺酶路径的性能增加，尤其当在亲代菌株中观测到鸟氨酸积聚时。或者，认为细菌可经改适且进化以更有效地利用鸟氨酸。在某些实施例中，选择依赖于精氨酸生长的细菌。

在另一方面中，细菌包含一种或多种干扰精氨酸:鸟氨酸转运子的基因修饰。在一个实施例中，基因修饰干扰CAETHG_3023和CAETHG_3024的表达(基因库基因ID：17336441和17336442；基因库蛋白质寄存编号：YP_008700482.1和YP_008700483.1)。基因修饰优选基因剔除突变。精氨酸:鸟氨酸转运子的基因剔除使得自细菌细胞输出的鸟氨酸减少且允许鸟氨酸通过细胞代谢。另外，细菌可经修饰以表达替代精氨酸转运子，从而输入精氨酸而不输出鸟氨酸。在替代实施例中，细菌可经修饰以表达鸟氨酸输入子，从而能够再俘获所分泌的鸟氨酸。这些方法中的每一者将增强细菌代谢鸟氨酸的能力。

实例1展现精氨酸通过自产乙醇梭菌产生丙氨酸。在一个方面中，本发明提供用于产生一种或多种衍生自丙氨酸的产物的方法，衍生自丙氨酸的产物包括3-羟丙酸酯(3-HP)或丙烯酸。丙烯酸是用于皮革、纸及纺织品的聚合性絮凝剂、分散剂、涂料、油漆、粘合剂和粘结剂中所用的重要商品，2014年全球需求量估计是5百万吨。3-HP是丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺或1,3-丙二醇的平台。

在一个方面中，本发明提供一种基因工程改造的C1固定细菌，其包含至少一种选自由以下组成的组的异源酶：用于将丙氨酸转化为丙二酰半醛和3-HP的酶、用于将丙氨酸转化为丙胺酰基-CoA的酶、用于将3-HP转化为丙烯酰基-CoA的酶、用于将丙胺酰基-CoA转化为丙烯酰基-CoA的酶和用于将丙烯酰基-CoA转化为丙烯酸酯的酶。

在特定实施例中，C1固定微生物是产乙酸一氧化碳营养型微生物。适合C1固定微生物的实例包括梭菌属、穆尔氏菌属、产乙酸杆菌属、消化链球菌属、乙酸杆菌属、真杆菌属或丁酸杆菌属。在各种实施例中，微生物选自表5中鉴别的微生物的组。

实例

以下实例进一步说明本发明，但当然不应视为以任何方式限制其范围。

表1：不含酵母萃取物的PETC-MES培养基

表2：氨基酸配方和最终浓度(g/L)

实例1

鉴别产乙酸菌自产乙醇梭菌的优选氨基酸和精氨酸增补实现的生长强化

此实例证明精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸明显优先于其它氨基酸且以产乙酸菌自产乙醇梭菌DSM10061进行生物质合成所需的>80倍高产量消耗，且精氨酸增补到成分确定的培养基中使得自产乙醇梭菌能够以tD～3h生长，其为酵母萃取物(YE)增补的约3倍快。

自产乙醇梭菌DSM 10061源于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心，Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany)。

为了鉴别任何氨基酸是否支持生长，用不同氨基酸配方—20AA、7AA、8AA、14AA、12AA、4AA和精氨酸(表2)增补不含YE的PETC-MES培养基。将溶液过滤灭菌且通过N2鼓泡使溶液缺氧。

首先，基于丙酮丁醇梭菌的生物质氨基酸组成(Lee等人，2008)和最终氨基酸浓度来设计20AA培养基，所述最终氨基酸浓度在理论上支持1g DCW/L生物质的产生。

在37℃下、在50mL体积的培养基中、在顶部空间含有氮气的125mL血清瓶中、在震荡下(除非另外指出)、通过分批培养进行生长研究。以完全氧化的培养基作为参考物，在厌氧室外部、在600nm下测量光密度(OD)，读数是约0.5。

通过HPLC分析有机酸、果糖和氨基酸。通过离子排阻色谱使用安捷伦1200HPLC系统和安捷伦Hiplex H柱(300×7.7mm，PL1170-6830)和保护柱(SecurityGuard Carbo-H，Phenomenex PN：AJO-4490)定量分析有机酸、碳水化合物和醇。一般来说，使用设定是正极性且光学单元温度是40℃的折射率检测器(安捷伦RID，G1362A)监测糖和醇，而有机酸是在210nm下(安捷伦MWD，G1365B)和/或用折射率检测器监测。使用自动取样器(安捷伦HiP-ALS，G1367B)将30μL样品注入柱上，且使用用恒温器控制的柱隔室(安捷伦TCC，G1316A)将柱温度保持在65℃。用4mM H2SO4以0.6mL/min等度溶离分析物26分钟。在15℃的柱温度下且通过使用高纯度水(18.2MΩ.cm)作为移动相来分别分析果糖、蔗糖和葡萄糖，且以0.4mL/min等度溶离21分钟。色谱图是利用ChemStation求积分(Dietmair S、Timmins NE、Gray PP、Nielsen LK、Kromer JO：关于哺乳动物细胞的定量代谢组研究：代谢物萃取协定的研发(Towards quantitative metabolomics of mammalian cells:development of ametabolite extraction protocol.)，《分析生物化学》2010,404:155-164)。如先前所述测量和定量氨基酸(R.B.McQualter,C.Bellasio,L.K.Gebbie,L.A.Petrasovits,R.W.Palfreyman,M.P.Hodson,M.R.Plan,D.M.Blackman,S.M.Brumbley和L.K.Nielsen，《植物生物技术(Plant Biotechnol.J.)》,2015)。

尽管20AA培养基上所达到的最大OD略微低于(约20％)酵母萃取物，但在取样开始时观测到生长同样快(倍增时间tD＝约9h；生长速率μ＝0.077)(图1)。

AA分析出人意料地表明AA的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸和苏氨酸得到优先和快速的利用(图2)。精氨酸自培养基快速耗尽。更是重要的是，丝氨酸和苏氨酸的消耗是生物质生产所需的产量的>6倍高，且天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸的消耗是其>20倍高，这表明其利用于除并入生物质中以外的其它目的。值得注意的是，在生长期间，在两种培养基上均观测到丙氨酸积聚，而非其耗尽。基于这些结果，通过省去六种根本未消耗或消耗缓慢的AA，设计具有2倍及4倍浓度高的后续培养基以获得更多的最低培养基、更快生长和更高OD：14AA培养基且通过进一步减少氨基酸来设计8AA培养基。

在AA浓度4倍增加的14AA培养基中，最大OD高于酵母萃取物上的生长(图3)。重要的是，8AA培养基上所达成的最大OD与20AA培养基的最大OD匹配，表明更多的最低AA配方能支持良好生长。提高AA浓度对倍增时间具有积极作用：与酵母萃取物和20AA培养基相比，在14AA和8AA培养基上分别达成更快和同样快的生长(图4)。

AA分析证实了先前研究结果且进一步突显天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸的AA的重要性(图5及图6)。值得注意的是，精氨酸是最佳氨基酸，因为根据OD＝0.24，其已耗尽。在其它AA中，丝氨酸和苏氨酸利用较快。此外，在两种培养基上均观测到明显的丙氨酸积聚。有趣的是，还产生鸟氨酸。天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸及精氨酸以比用于产生生物质所需的产量高>10倍消耗，表示其对于能量产生的用途。

基于这些结果，两种后续培养基被设计成用于获得较快生长：自14AA培养基省去谷氨酰胺和色氨酸且将丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸的浓度提高至20AA培养基的8倍且仅由4种经鉴别的AA--天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸组成的培养基的浓度提高至20AA培养基的80倍(14AA培养基的2倍及20倍)的12AA培养基；仅含有浓度比20AA培养基高80倍的“前4种AA”——天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸的4AA培养基。

4AA培养基的设计支持比12AA培养基高的最大OD且与在酵母萃取物及20AA培养基上获得的最大OD匹配(图7)。在4AA及12AA培养基中，tD是约2.5h的快速生长的OD测量是至多约0.3，其后生长减缓。值得注意的是，所达成的是约2.5h的tD比用1g/L如常用的酵母萃取物的增补快约4倍。

随后减缓的快速初始生长可由精氨酸耗尽来解释。根据12AA培养基AA分析数据，我们可发现，精氨酸是优选AA且根据OD＝0.37，其完全耗尽(图8)。此数据还表明，精氨酸与谷氨酸、天冬氨酸及组氨酸一起在OD 0.1-0.3之间通过支持如所测量的是约2.5h的tD来强有力地促进生长，同时生长在精氨酸耗尽之后在OD 0.3-0.37之间减缓。同时观测到鸟氨酸积聚。此外，检测到明显的丙氨酸积聚。

精氨酸耗尽之后的生长减速还在4AA培养基中显而易见(图9)。除鸟氨酸的外，在精氨酸代谢期间还检测到瓜氨酸积聚。除了丙氨酸积聚以外，第一次还有少量(约0.3mM)离氨酸及缬氨酸积聚，同时还有未知峰(滞留时间8.3min)显示峰面积增大。

当初始快速生长是未预期的时，仅一对样品可用于计算tD。因此，将BugLab生物质监测装置与4AA培养基上的血清瓶连接以自培养基持续监测精氨酸耗尽之前生物质的增加。根据tD计算是约2h，此实验证实精氨酸耗尽之前4AA上的快速生长(图10)。

甚至单独的精氨酸增补会引起极佳生长，其中最大OD与在4AA培养基和酵母萃取物上一样高。含有5g精氨酸/L+5g果糖/L的不含YE的PETC-MES培养基中的自产乙醇梭菌DSM10061的生长引起早期快速初始生长(t_D大约是3h)，随后在第二阶段中在精氨酸耗尽之后生长较为缓慢(t_D是约40h)(图11)。

出人意料地，在初始快速生长阶段期间，几乎未产生乙酸酯。此外，乙酸酯产生与第二较慢生长阶段中的生长有关(图12)。

图13展示精氨酸的快速利用。除了丙氨酸积聚以外，与4AA培养基类似，还产生少量(约0.5mM)离氨酸和缬氨酸。精氨酸耗尽之后，在4AA培养基上发现显示峰面积增大的相同未知峰(滞留时间8.3min)。

是在精氨酸培养基上获得tD的较准确值，进行BugLab实验以持续监测精氨酸耗尽之前生物质的增加。根据tD计算是约3h，此实验证实精氨酸耗尽之前的快速生长(图14)。精氨酸上快于酵母萃取物的生长在图15中加以展示。

实例2

用精氨酸增补强化自营生长

此实例说明当用精氨酸增补时，产乙酸菌自产乙醇梭菌DSM 23693在自营生长下的比生长速率增加而乙酸酯产生减少。

自产乙醇梭菌DSM 23693(自产乙醇梭菌DSM 10061的衍生物；美国专利2013/0217096)来源于DSMZ(德国微生物及细胞培养物保藏中心，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Germany)。

使用标准厌氧技术(Hungate,《微生物学方法(Meth Microbiol)》,3B:117-132,1969；Wolfe,《先进微生物生理学(Adv Microb Physiol)》,6:107-146,1971)和22psi CO/CO₂/H₂气体混合物(组成：50％CO、20％CO₂、2％H₂、28％N₂)顶部空间压力，在不含酵母萃取物的PETC-MES培养基(表1)中进行生长。

为了研究精氨酸增补的作用，将5g/L精氨酸添加至培养基中且将自营生长期间的培养物生长和代谢物产量与不含精氨酸的对照物进行比较。

生长后使用Thermo Genesys 20分光亮度计测量光密度。在35℃下，在利用折射率(RI)检测的安捷伦LC上，通过高效液相色谱(HPLC)测量代谢物乙酸酯(乙酸)、乙醇、2,3-丁二醇或乳酸。通过用100μL 5-磺基水杨酸溶液(1w/v％，于1M硫酸中)稀释400μL来制备样品，随后在14,000rpm下离心3分钟；将上清液转移至玻璃瓶中进行分析。在Alltech IOA-2000柱(150mm×6.5mm×8μm)上，在等度条件下，在0.7mL/min和65℃下，使用5mM硫酸移动相，在注射10μL的情况下进行分离。

在37℃下，在利用轨道震荡(120rpm，震荡轨道)的1L肖特瓶(Schott bottle)中，在40mL体积的培养基中，使用一式三份培养物(n＝3)，针对各条件进行两次生物重复实验。在各种情况下，使产乙酸菌株自产乙醇梭菌DSM 23693在不含酵母萃取物的PETC-MES中预培养直至OD600nm为0.3且单一预培养物用于接种。

在第一次实验中，条件如下：不含酵母萃取物的PETC-MES+22psi合成气(初始OD600nm＝0.005)和不含酵母萃取物的PETC-MES+22psi合成气+5g精氨酸/L(初始OD600nm＝0.005)。

在重复实验中，还将培养物接种于增补精氨酸的培养基中，但不添加CO/CO2/H2气体(22psi的100％N2作为顶部空间压力)。这个实验包含以下三个条件：不含酵母萃取物的PETC-MES+22psi合成气(初始OD600nm＝0.03)、不含酵母萃取物的PETC-MES+22psi合成气+5g精氨酸/L(初始OD600nm＝0.003)和不含酵母萃取物的PETC-MES+5g精氨酸/L(初始OD600nm＝0.003)。含有精氨酸的培养基接种直至初始密度比不含精氨酸的培养基低以适应在第一次实验中所观测到的在精氨酸存在下比生长速率惊人的增加。

在两次实验中，含有精氨酸的培养物惊人地快速生长(<15h内，4次倍增，相当于tD＝3.5h的倍增时间且比生长速率μ＝0.198)直至OD600nm≈0.8，然而对照物的生长则缓慢得多，其中倍增时间tD＝7.3h且比生长速率μ＝0.095(图16+图17)。因此，在自营生长期间，精氨酸增补缩短倍增时间且增加培养物的比生长速率超过50％。

自产乙醇梭菌的自营生长的对数换算图清楚地展现精氨酸增补的倍增时间缩短(图18)。对于不含精氨酸增补的自营生长而言，所计算的倍增时间t_D＝7.3h±0.2，且在精氨酸增补的情况下t_D＝3.5h±0.2，降低52％。

在精氨酸存在与不存在下，培养物在自营生长期间均达到相同最终密度，表明精氨酸不是用作碳源，而是仅服务于增加比生长速率(图16+图17)。此还在其中未供应气体的培养物中得到证实，在48小时内、在增补精氨酸但不含CO/CO2/H2气体混合物的培养物中未观测到生长(图17)。这证明了精氨酸在这些条件下未用作碳源，而是CO/CO2用作碳源且通过精氨酸代谢供应ATP的假设。

产乙酸菌的自营生长通常与乙酸酯(乙酸)产量有关，因为乙酸酯形成物通过底物水平的磷酸化而在生长所必需的乙酸激酶反应中产生ATP。就此而论，到目前为止，发现所有分离出的产乙酸菌均会产生乙酸酯。然而，从过程的视角来看，乙酸酯形成并非所期望的，因为其使碳偏离目标产物且已知在几个百分比的低浓度下对微生物具有毒性(J.Ballongue,E.Masion,J.Amine,H.Petitdemange及R.Gay,《应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)》,1987,26,568-573；G.Wang和D.I.Wang,《应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)》,1984,47,294-8)。在增补5g精氨酸/L的生长培养基中，惊人地，未观测到净乙酸酯产生，直至生长在OD_600nm≈0.8时中止，仅在此阶段产生乙酸酯(图19)。

此组实验的结果表明，自产乙醇梭菌能利用精氨酸产生用于生长的ATP，且因此当供应精氨酸时，不需要产生乙酸酯。

实例3

精氨酸利用路径的鉴别和优化

此实例说明精氨酸如何向细胞提供额外ATP且能馈入产乙酸菌的中心代谢中。

如实例1中所说明，精氨酸按化学计量转化为鸟氨酸。在一些时间点还观测到瓜氨酸积聚。不希望受此理论束缚，此观测结果暗示着精氨酸脱亚胺酶路径是机制。

此路径将精氨酸转化为鸟氨酸、铵、ATP和CO2。通过精氨酸降解供应ATP和铵将促进生长强化。此ATP供应还除去了用产乙酸菌产生乙酸酯的需要。

精氨酸脱亚胺酶路径通过精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)和氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)催化的三个酶步骤而进行。已在自产乙醇梭菌的基因组中鉴别出相应酶(包括两种精氨酸/鸟氨酸转运子基因/酶)：鸟氨酸氨甲酰基转移酶，且氨基甲酸激酶以多拷贝形式存在(表4)。能够催化相同反应的酶还存在于其它生物体中，包括多种产乙酸菌，包括永达尔梭菌、粪味梭菌、德雷克梭菌及长醋丝菌(表5)。此路径还存在于斯氏梭菌或大肠杆菌中。

表4：自产乙醇梭菌的精氨酸脱亚胺酶路径的已鉴别基因/酶

表5：其它生物体的脱亚胺酶路径的已鉴别基因/酶

具体地说，如果观测到作为瓜氨酸的中间体积聚，则为了增加路径性能，可以过度表达相应基因或可由本领域技术人员使用先前所述的方法[US 2013/344547、US 2013/330809、US 2013/323820、US 2013/224838、US 2013/224839、US 2011/256600、US 2011/236941]引入且异源表达来自其它来源的基因。

鸟氨酸自身可进一步转化为丙氨酸，其在实例1中还显示会积聚。此转化还产生额外还原等效物NADP(H)，以及另一个氨分子和来自CoA的关键构建块乙酰基-CoA。

如图23中所示，鸟氨酸通过鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC2.3.1.B10)的酶步骤转化为丙氨酸和乙酰基-CoA。已描述例如斯氏梭菌或环境样品的相应酶且已鉴别出自产乙醇梭菌的同源物(表6)。

表6：斯氏梭菌或环境样品和自产乙醇梭菌同源物的鸟氨酸向丙氨酸和乙酰基-CoA转化路径的已鉴别基因/酶。

具体地说，当观测到鸟氨酸积聚时，为了增强路径性能，可以过度表达相应的自产乙醇梭菌基因或本领域技术人员可以使用先前所述的方法(WO2012/053905、WO2012/115527、WO2013/180584)引入且异源表达来自表6的斯氏梭菌或环境样品的基因。如果生物体适于随时间依赖于精氨酸生长，则所述生物体也可以加以改适且进化以更有效地利用鸟氨酸。

为了达成路径中的通量，也可能需要剔除精氨酸:鸟氨酸转运子(CAETHG_3023-24)以避免鸟氨酸输出至细胞外。此类剔除可由本领域技术人员使用先前所述的方法(W2012/053905、WO2012/115527及WO2013/180584)来达成。可能进一步需要添加替代性精氨酸转运子。剔除精氨酸:鸟氨酸转运子的替代方法可以是引入鸟氨酸输入子，因此鸟氨酸可进一步代谢。

还在基因组级模型重构中模拟已鉴别的路径以显示代谢作用且确认已鉴别的路径。

基于公开方法生成自产乙醇梭菌的基因组级代谢重构(L.-E.Quek和L.K.Nielsen,《基因组信息学报(Genome Inform.)》,2008,21,89-100；C.G.de OliveiraDal'Molin,L.-E.Quek,R.W.Palfreyman,S.M.Brumbley和L.K.Nielsen,《植物生理学报(Plant Physiol.)》,2010,152,579-89；C.Licona-Cassani,E.Marcellin,L.-E.Quek,S.Jacob和L.K.Nielsen,Antonie Van Leeuwenhoek,2012,102,493-502.)。使用SEED模型注释管线重构基因组级模型的核心(C.S.Henry,M.DeJongh,A.A.Best,P.M.Frybarger,B.Linsay和R.L.Stevens,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》,2010,28,977-82)。重构保留了来自SEED模型的所有反应属性，包括特有反应、化合物ID及反应的可逆性。在Excel(微软公司(Microsoft Corporation))中手动填充模型间隙以便注释和评论，具体地说，手动管理中心代谢和上述已鉴别的精氨酸利用路径。根据此基因中心数据库，使用Java(甲骨文公司(Oracle Corporation))应用程序生成2D反应中心系统生物学标示语言(SBML，http://www.sbml.org)表示法。使用COBRA工具箱进行基于约束条件的重构(http://opencobra.sourceforge.net/)(J.Schellenberger,R.Que,R.M.T.Fleming,I.Thiele,J.D.Orth,A.M.Feist,D.C.Zielinski,A.Bordbar,N.E.Lewis,S.Rahmanian,J.Kang,D.R.Hyduke和B.Palsson,《自然协定(Nat.Protoc.)》,2011,6,1290-307)。针对基于约束条件建模的一组脚本在MATLAB环境内运行。通量平衡分析(Orth等人，2010)用于预测生长所必需的营养物，且进行影子价格分析(shadow price analysis)以研究氨基酸(AA)对自产乙醇梭菌的有益作用，且确定何种AA对于产生ATP具有最大影响。通量平衡分析(FBA)已用于预测生长所必需的营养物(Fan等人，2014；Song等人，2008)、AA增补对目标产物合成的作用(Licona-Cassani等人，2012)且结合影子价格分析(Hillier和Lieberman，2010)确定对产生ATP具有最大作用的底物(Teusink等人，2006)。

针对AA的习知影子价格分析可能具有误导性。如果在自营条件周围(即在零摄入下)进行影子价格分析，则其将显示AA合成的机会成本，即，在培养基供应给定AA的情况下可能释放的资源。待合成的最昂贵AA未必是产生ATP的最佳底物。举例来说，可能不存在可利用的降解路径。

为了克服此问题，进行偏移影子价格分析。允许20种AA中的每一者达到1.4mmol/gDCW/h的最大通量，同时针对生物质产生进行最大化。此通量是在标准PETC-MES培养基(包括酵母萃取物(YE))和果糖上的初步生长实验期间所观测到的自产乙醇梭菌DSM 10061的最大比果糖摄入速率。不存在降解路径的AA无法利用所允许的最大通量且因此影子价格将是零。影子价格分析从传统的20种AA中鉴别出九种AA：谷氨酰胺、组氨酸(HIS)、半胱氨酸(CYS)、苏氨酸、天冬氨酸(ASP)、精氨酸(ARG)、甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸(GLU)，所述九种AA由于引起较快生长而是自产乙醇梭菌应偏好的AA。

所预测的九种AA中有8种AA的模型预测在20AA培养基上得到证实(图2)，只排除甘氨酸。值得注意的是，每种生物质的ASP、GLU、HIS和ARG摄入量比生物质合成所需的摄入量高超过20倍。基于丙酮丁醇梭菌中所获取的测量结果(Lee等人，2008)，对每克生物质的AA摄入量与生物质中的期望浓度(细胞需要量)进行比较。

惊人地，在另一种所设计的12AA培养基上发现，ASP、GLU、HIS和ARG的摄入量比生物质合成所需的摄入量高超过120倍且其能够实现明显较快生长。这表明ASP、GLU、HIS和ARG潜在地参与能量产生。有趣的是，在快速生长阶段期间、在精氨酸消耗的同时，检测到鸟氨酸积聚(图8)，表明精氨酸脱亚胺酶(ADI)路径潜在地参与向细胞提供额外ATP。值得注意的是，初始观测到的快速生长(tD＝2.5±0.1h)与使用20种AA的所预测的生长(tD＝2.9h)非常接近。

有趣的是，与YE(36.6mmol/gDCW)相比，当精氨酸充足时，在生长期间，在含有ASP、GLU、HIS和ARG的培养基(4AA培养基)(8.2±0.2mmol/gDCW)和仅含有精氨酸的培养基(ARG培养基)(6.7±0.7mmol/gDCW)中观测到每种生物质的乙酸酯产量实质上较低。精氨酸耗尽之后，乙酸酯产量大大增加(对于4AA培养基和ARG培养基而言分别是46.5±11.2mmol/gDCW和34.5±9.3mmol/gDCW)，表明精氨酸代谢的可能性大大降低了产乙酸菌产生乙酸酯的必要性。

在12AA培养基上生长的自产乙醇梭菌的异营培养物在精氨酸消耗的同时，发生鸟氨酸积聚(图8)。在4AA培养基和仅含精氨酸的培养基生物反应器实验中发现相同结果(图22)，其中所消耗的碳中的大部分(大约60％)以鸟氨酸形式分泌出。此外，检测到显著的CO₂碳通量以及显著的瓜氨酸积聚。其它少量副产物包括乙酸酯、丙氨酸和乙醇。总而言之，鸟氨酸、CO₂和瓜氨酸的显著碳通量表明精氨酸通过ADI路径代谢，说明通过供应ATP强化其生长的作用(图21)。此外，精氨酸按照化学计量完全转化为鸟氨酸、CO₂和瓜氨酸暗示着精氨酸严格代谢而产生能量而非合成生物质。此与当向含有无YE的PETC-MES的N₂气体加压肖特瓶中仅增补精氨酸时未观测到生长的结果一致。

通过初始计算机模拟(initial in silico simulation)来预测在4AA培养基和仅含精氨酸的培养基上，ADI路径参与促进较快生长。总比ATP产生速率(q_ATP；mmol ATP/gDCW/h)在后面的条件(SIM 4及SIM 5)下经预测比使用果糖(SIM 1)作为唯一碳源的计算结果高约6倍(表7)。当使用以实验方式自4AA(SIM 6和SIM 9)和仅含精氨酸(SIM 12和SIM 15)的培养基上的生物反应器实验测定的底物摄入量和产物分泌速率(排除瓜氨酸和CO₂)限制模型时，观测到相同结果，其中q_ATP比仅在果糖上预测的q_ATP高约3倍至4倍。可通过精氨酸代谢(通过ADI路径的氨基甲酸激酶)期间由底物水平磷酸化产生明显较多能量及间接通过由产生且排出NH₄ ⁺而产生质子原动力来解释所观测到的比不含AA增补的所预测的生长(t_D是约14h)快的AA上的生长(t_D是约3h至4h)。后者对于通过减少添加NH₄OH来中和pH的需要还有益于降低生物制程的成本。

表7：预测在存在及不存在精氨酸增补的情况下异营生长期间的比生长速率、ATP产生速率及产物的模型模拟：

通过精氨酸增补实现的快速生长和低乙酸酯合成与生物技术行业相关，因为减少针对不合需要的副产物乙酸酯的碳通量和由替代路径产生的额外ATP对扩增产乙酸菌产物光谱是至关重要的。

可使用基因组级模型估计细胞内代谢通量图且通过用实验方式测量的数据限制模型来计算碳、氧化还原和能量平衡(Bordbar等人，2014；Dash等人，2016；O'Brien等人，2015)。利用与Marcellin所述的基因组级代谢模型(来自废气的低碳燃料和商用化学品——理解产乙酸菌模型中的能量代谢的系统性方法(Low carbon fuels and commoditychemicals from waste gases-Systematic approach to understand energymetabolism in a model acetogen),《绿色化学(Green Chem)》,2016)类似的自产乙醇梭菌的基因组级代谢模型。我们针对AA培养基和仅含精氨酸的培养基上的异营实验通过进行如上所述的通量平衡分析计算来进行基因组级模型分析。另外用比底物摄入速率和比产物分泌速率(排除瓜氨酸和CO2)和细胞tD对模型加以限制。最大化ATP消耗(即未计入的ATP成本；参见下文)用作进行FBA(此处不包含维持能量成本)的目标函数。

通过比仅在果糖(SIM 1)上生长所预测的6.8mmol ATP/gDCW/h的q_ATP值高约3倍至4倍的q_ATP(对于4AA培养基及ARG培养基分别是29.3±5.5mmol ATP/gDCW/h及19.9±1.0mmol ATP/gDCW/h)来促进4AA培养基及ARG培养基(表7中的SIM6与SIM 9及SIM 12及SIM15)上的快速生长。本发明人认为4AA培养基上观测到的比ARG培养基快的生长是通过通过产生ATP的乙酸激酶反应的高2倍的特定通量来解释(图24)。然而，在两种培养基上通过ADI路径均产生约53％ATP(图24)，其显示精氨酸代谢完全重组能量代谢。有趣的是，尽管精氨酸耗尽在许多细菌中是有利的(Abdelal，1979；Adamberg等人，2006；Lahtvee等人，2011；Mehmeti等人，2011)，但其对能量产生的贡献是可变的。

还分析果糖和AA上的异营生长期间所预测的最佳通量图。当用实验方式测量的底物摄入速率和先前所计算的未计入ATP成本限制模型且针对生物质产生进行最大化时，这些计算预测生长(4AA培养基t_D＝1.4±0.2h，SIM 7及SIM 10；ARG培养基t_D＝2.2±0.1h，SIM13及SIM 16)比以实验方式观测到的生长(分别是t_D＝2.8±0.1h及t_D＝3.7±0.0h)要快。此外，在模拟中，精氨酸代谢期间产生的鸟氨酸分解代谢是GLU，其表明可通过上述鸟氨酸路径进一步代谢鸟氨酸。因此所预测的较快生长来自使用甲基天冬氨酸路径(如上所述)将GLU代谢为丙酮酸，且其进一步转化为乙酰基-CoA和乙酸酯，产生减少的Fd及ATP。

实例4

依赖于作为唯一氮源的精氨酸生长

此实例说明用精氨酸替代铵作为氮源。

氮是细菌的必不可少的营养物，且通常在发酵中使用铵，且铵还作为氮源用于公开的产乙酸菌培养基配方中(M.C.Held,S.Hujer,H.Liesegang,A.Wiezer,A.Wollherr,A.Ehrenreich,W.Liebl,G.Gottschalk及P.Dürre,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,2010,107,13087-92；J.Mock,Y.Zheng,A.P.Mueller,S.Ly,L.Tran,S.Segovia,S.Nagaraju,M.P.Dürre及R.K.Thauer,《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》,2015,197,2965-2980；H.Richter,M.E.Martin及L.T.Angenent,《能量(Energies)》,2013,6,3987-4000；J.L.Cotter,M.S.Chinn及A.M.Grunden,《生物方法生物系统工程学(Bioprocess Biosyst.Eng.)》,2009,32,369-80.M.Straub,M.Demler,D.Weuster-Botz及P.Dürre,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》,2014.)。然而，铵产量视通过哈伯-波希法(Haber-Bosch process；www.essentialchemicalindustry.org/chemicals/ammoinia.html)的能量(主要是天然气或液化石油气(LPG))的充裕供应而定，且因此是不可持续源。此外，铵离子对发酵中的pH具有一定影响。

实例3中的已鉴别路径允许1mol精氨酸转化为3mol氨。因此精氨酸可以向细菌提供替代氮源，从而将氨直接提供至代谢中，同时仍提供上文所述的优点。由于1个精氨酸分子可分解成3个氨分子，因此较低的需要量结合较便宜的精氨酸价格(根据Sigma Aldrich或Fisher，99％食品级精氨酸成本是大约～US$17-18,000/1000kg，而30％工业级氨成本是～US$10-11,000/1000kg)和减少的处理引起显著的成本节约。此外，精氨酸可例如通过发酵可持续地衍生自生物源(T.Utagawa,《营养学杂志(J.Nutr.)》,2004,134,2854S-2857)。

为了说明精氨酸可以作为唯一氮源用于产乙酸菌自产乙醇梭菌DSM 23693，使生物体在省去1g/L氯化铵(NH₄Cl)而含有0.33g/L非合成L-精氨酸单盐酸盐(Sigma Aldrich；A6969)的无YE的PETC-MES培养基上生长。

实例5

精氨酸增补引起异源路径，具体地说ATP消耗路径的非天然产物的产量增加

此实例说明精氨酸增补使异源路径的非天然产物的产量增加。

已说明产乙酸菌利用气体产生若干种非天然产物[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584、WO2013185123、WO2013191567]。通常观测到一定含量的乙酸酯作为副产物，因为生物体通过乙酸激酶反应由底物水平磷酸化产生ATP。对于需要ATP作为例如(但不限于)针对异戊二烯或其它萜烯酯的产生路径(甲羟戊酸路径)或产生类似生物柴油的脂肪酸衍生产物(通过脂肪酸生物合成)的路径而言情况尤其如此。然而，对于不直接需要ATP、而且在乙酸酯形成时每个乙酰基-CoA不产生相同量的ATP的其它发酵路径(例如(但不限于)产生异丙醇、丙酮、丁醇(通过ABE路径)而言情况也是如此。

使用通量平衡分析(FBA)，用自产乙醇梭菌基因组级模型(描述于实例3中)模拟由气体产生异丙醇。将异源路径(表4)添加至模型中且在存在及不存在精氨酸增补的情况下进行最大理论产量的模拟(表5)。

表8：异源路径

表9：在存在及不存在精氨酸增补的情况下来自CO及CO2/H2的目标产物异戊二烯或异丙醇的最大理论产率(mmol/gDW/h)的FBA分析：

模拟显示精氨酸增补可在CO及CO2/H2上明显增加目标化合物异丙醇和异戊二烯最大理论产量。通过摄入少量精氨酸(2mM，0.34g/L)，来自CO的最大异丙醇产量已可明显增加超过20％(自5.06mmol/gDW/h增加至6.42mmol/gDW/h)。对于由CO产生异戊二烯的消耗ATP的甲羟戊酸路径而言，最大产量可甚至较明显增加超过30％(自1.97mmol/gDW/h增加至2.58mmol/gDW/h)。对于CO₂/H₂，作用甚至更是明显，其中最大异丙醇产量可增加超过25％(自5.0mmol/gDW/h增加至6.36mmol/gDW/h)，且异戊二烯产量可增加45％(自1.26mmol/gDW/h增加至1.83mmol/gDW/h)。此清楚地表明，可使用精氨酸来增加非天然目标分子的产量。

模拟还显示，当共利用2mM精氨酸时，即便摄入较少CO，产量仍有所增加，这表明精氨酸增补改善目标分子的碳效率。

实例6

使用精氨酸抑制子作为基因开关以驱动异源路径的表达

此实例说明精氨酸可以作为基因开关用于驱动异源路径的表达。

发现实例3的已鉴别精氨酸脱胺酶路径中的所有基因群集在一起且还发现精氨酸抑制子ArgR。已在包括大肠杆菌的微生物范围内鉴别操纵序列(argR蛋白质所结合的DNA序列，以防止基因转录)(Tian等人,1992,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》,226,第387-397页)且结合位点在细菌谱系中通常是保守的(Makarova等人,2001,《基因组生物学(GenomeBiol.)》2,第1-8页)。

精氨酸抑制子通过结合至回文操纵序列控制基因表达，所述回文操纵序列位于精氨酸脱亚胺酶起始密码子的上游大约45bp处。添加精氨酸使得抑制子解除结合至操纵序列，使得操纵序列的下游的基因发生转录。在预示实例中，异源基因表达可通过添加精氨酸来活化。如果将结合argR的操纵序列添加至异源基因的上游区域，则argR蛋白质将抑制异源基因表达。随后，基因表达可通过添加精氨酸来活化。

在一个实例中，异源基因可编码需要ATP合成产物的代谢路径。举例来说，甲羟戊酸路径是以每摩尔异戊烯基-二磷酸3mol ATP为代价将乙酰基-CoA转化为异戊烯基-二磷酸的异源路径。使用所述方法，异源甲羟戊酸路径的表达可通过添加精氨酸来活化，其还将通过精氨酸脱亚胺酶路径、通过精氨酸降解来向甲羟戊酸路径提供ATP。

实例7

优化精氨酸与气态底物CO和/或H₂和/或CO₂的共利用效率

为了达成精氨酸与气态底物CO和/或H₂和/或CO₂的高效共利用，可能需要去除调节。这可通过剔除上述精氨酸抑制子ArgR以去除精氨酸脱胺酶路径的基因抑制来达成。此类基因剔除可由本领域技术人员使用先前所述的方法[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584]来达成。然而，去除精氨酸抑制子将不允许通过添加如上所述的精氨酸来活化异源基因表达。替代方法是去除精氨酸脱胺酶路径操纵子的上述操纵结合序列上游或用组成型启动子或合成启动子替代精氨酸脱胺酶路径操纵子的上游区域，包括操纵序列和启动子序列。此类修饰可由本领域技术人员使用先前所述的方法[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584]来达成。适合的组成型启动子和合成启动子是例如(但不限于)铁氧化还原蛋白启动子Pfdx、乙酸激酶启动子Ppta或先前所述的Ptet或PIPL12[US20160160223；Nagaraju等人，使用CRISPR/Cas9的自产乙醇梭菌的基因组编辑(Genomeediting of Clostridium autoethanogenum using CRISPR/Cas9)，《生物燃料生物技术(Biotechnol Biofuels.)》2016；9:219]。

类似地，可以通过剔除或阻断组成型启动子和合成启动子或相应调节子来替代负责CO和/或H₂和/或CO₂利用的基因的启动子区域，例如伍德-永达尔丛集或Hyt操纵子(Brown等人,单分子定序与处理自产乙醇梭菌的基因组的杂交方法的对比及梭菌属相关行业中CRISPR系统的分析(Comparison of single-molecule sequencing and hybridapproaches for finishing the genome of Clostridium autoethanogenum andanalysis of CRISPR systems in industrial relevant Clostridia.)《生物燃料生物技术(Biotechnology for Biofuels)》2014 7:40)。本领域中的技术人员将能够利用如实例10中所述的转录组学数据鉴别此类调节子。

实例8

替代精氨酸利用途径和腐胺的产生

此实例说明可产生腐胺作为副产物的替代性精氨酸利用路径。

利用精氨酸的另一可能途径是通过精氨酸脱羧作用而非脱胺作用：精氨酸可通过酶(精氨酸脱羧酶)脱羧为精胺和CO₂。精胺随后可通过酶(精胺脱亚胺酶)转化为N-氨甲酰腐胺，还产生铵。N-氨甲酰腐胺加上磷酸可通过腐胺氨甲酰基转移酶转化为腐胺加上氨甲酰磷酸酯。氨甲酰磷酸酯加上ADP通过氨基甲酸激酶、通过与精氨酸脱亚胺酶路径相同的机制转化为铵+ATP+CO₂。铵和ATP的净产量与精氨酸脱亚胺酶路径相同，但存在两种不同中间体(精胺和N-氨甲酰腐胺而非瓜氨酸)和不同副产物(腐胺而非鸟氨酸)。

腐胺是值大于鸟氨酸或精氨酸的副产物且可以作为馈料用于产生多种聚合物，包括尼纶-4,6(Qian等人,2009,《生物技术与生物工程》104,第651-662页)及聚氨基甲酸酯(Dahiyat等人,1993,《生物材料科学聚合物版杂志(J.Biomater.Sci.Polym.Ed.)》,4,第529-543页)。

表10.

基因名称	EC编号	标识符
			精氨酸脱羧酶	EC 4.1.1.9	AGY76455，CAETHG_2244
精胺脱亚胺酶	EC 3.5.3.12	AGY76293.1，CAETHG_2074
			腐胺氨甲酰转移酶	EC 2.3.1.6	EKU86922，WP_003731415.1，AGY76301
氨基甲酸激酶	EC 2.7.2.2	AGY77835，CAETHG_3632

实例9

丙氨酸的产生和通过异源路径转化为3-HP或丙烯酸

此实例说明丙氨酸转化为3-羟丙酸酯或丙烯酸。

自产乙醇梭菌通过精氨酸产生丙氨酸已在实例1中说明。丙氨酸可进一步转化为高值产物3-羟丙酸酯(3-HP)或丙烯酸。

丙氨酸转化为丙烯酸酯已展示于丙酸梭菌中(Dalal RK,Akedo M,Cooney CL,Sinskey AJ(1980)，用于产生丙烯酸的微生物途径(A microbial route for acrylicacid production)《生物源分解(Biosources Dig)》2:89-97)。可通过丙二酰半醛和3-HP或通过丙胺酰基-CoA进行转化。3-HP和丙胺酰基-CoA可转化为丙烯酰基-CoA且进一步转化为丙烯酸酯。丙酸梭菌的分离基因/酶可由本领域技术人员使用先前所述的方法[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584]引入且异源表达以产生3-羟丙酸酯或丙烯酸酯。

实例10

转录组分析

使用RNA定序对4AA培养基(详情参见表2)上异营生长的生物双重复自产乙醇梭菌生物反应器培养物进行转录组分析。在平衡生长阶段及所有4AA的摄入期间，收集大约35mL的0.3gDCW/L培养物，粒化(在4℃下，5000×g，3min)且再悬浮于5mL RNAlater(凯杰(Qiagen))中。在4℃下储存样品隔夜，离心(在4℃下，4000×g，10min)且在-80℃下储存集结粒直至进一步加工。对冷冻集结粒进行解冻，萃取总RNA，且如Marcellin等人，2013中所述制备mRNA库。使用Illumina Hiseq-2000定序仪进行定序。

将4AA培养基上的基因表达图与在标准PETC-MES(包括YE)上异营生长且先前已公开(Marcellin等人，2016)的相同自产乙醇梭菌菌株(DSM 10061)的RNA-seq数据进行比较。对两种异营条件的定序读数进行微调以避免读数误差，且随后使用TopHat2(Kim等人，2013)针对基因组与每读取对准所允许的两种错配对准/重新对准。使用Cufflinks的FPKM函数、利用四分位数标准化来估算转录物丰度。CuffDiff用于估计表达不同的转录物，且Cuffnorm用于数据标准化。低于0.05的q值(使用假发现率；Benjamini和Hochberg，1995)用于确定显著的基因表达变化。

使用RNA定序(RNA-seq)进行转录组分析，以进一步得到在基因表达水平下ADI路径参与的确定证据。就此而言，在平衡生长阶段期间，对4AA培养基上异营生长的生物双重自产乙醇梭菌生物反应器培养物进行取样。将此RNA-seq数据集与含YE的标准PETC-MES培养基上的异营生长(果糖)的相同自产乙醇梭菌菌株(DSM10061)的先前已公开的数据集(Marcellin等人，2016)进行比较。

转录组分析证明ADI路径的作用，因为与YE相比当细胞在增补4AA的PETC-MES上生长时，所有ADI路径基因均上调超过500倍(q值<0.001)。此外，观测到推定精氨酸-鸟氨酸反向转运蛋白基因(CAETHG_3023及CAETHG_3024)上调超过380倍(q值<0.001)。根据与自产乙醇梭菌中瓜氨酸降解为氨甲酰磷酸酯及鸟氨酸有关的四个基因，我们的数据表明鸟氨酸氨甲酰基转移酶(CAETHG_3022)是自产乙醇梭菌在ARG代谢期间的通量催化蛋白质(上调645倍；q<0.001)，因为在所比较的条件之间，其同功异构酶下调(CAETHG_0449和CAETHG_0591)或显示不变(CAETHG_2082)。类似地，根据与氨甲酰磷酸酯降解成CO₂有关的五种基因，CAETHG_3025的氨基甲酸激酶似乎是通量催化蛋白质(上调623倍；q<0.001)，因为其FPKM值比其同功异构酶的FPKM值高1000倍。

实例11

优化精氨酸并入中心代谢中的效率

鉴别天然代谢中的基因的转录组学分析测定精氨酸利用的通量和以鸟氨酸氨甲酰基转移酶(CAETHG_3022)及氨基甲酸激酶(CAETHG_3025)形式并入中央代谢中。为了改善效率，可使用强或诱导型启动子过度表达这些基因，所述启动子例如(但不限于)铁氧化还原蛋白启动子Pfdx、乙酸激酶启动子Ppta或先前所述的Ptet或PIPL12[US 20160160223；Nagaraju等人，使用CRISPR/Cas9的自产乙醇梭菌的基因组编辑(Genome editing ofClostridium autoethanogenum)，《生物燃料生物技术》2016；9:219]。

本文中所引用的所有参考文献，包括公开、专利申请和专利均以引用的方式并入本文中，所述引用程度就如同个别及特定地指示各参考文献以引用的方式并入且全文阐述于本文中一般。本说明书中对任何现有技术的提及不视为且不应视为承认现有技术形成任何国家所致力领域的公共常识的一部分。

除非本文中另外指明或上下文中明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在以下申请专利范围的上下文中)使用的术语“一(a)”与“一(an)”和“所述”和相似指示物均应解释是涵盖单数和复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解是开放性术语(即意指“包括(但不限于)”)。除非本文中另外指示，否则本文中的值范围的叙述仅旨在充当个别地提及属于所述范围的各单独值的速记方法，且各单独值并入本说明书中，如同在本文中个别地叙述一般。

除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何适合顺序进行。除非另外主张，否则本文所提供的任何及所有实例或例示性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明而非限制本发明的范围。本说明书中的语言均不应解释为将任何未主张的要素指示是对实施本发明而言必不可少。

本文中描述本发明的优选实施例。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变化对本领域中的一般技术人员而言可变得显而易见。本发明人期望本领域中的技术人员按需要采用该等变化，且本发明人希望以不同于本文中所特定描述的方式来实施本发明。因此，如果适用法律允许，则本发明包含在此随附的申请专利范围中所叙述的目标物的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。

Claims

1.一种用于增加至少一种ATP密集型产物的产量的方法，所述方法包含：

a.使含C1气态底物流到生物反应器中，所述生物反应器含有C1固定微生物于液态营养培养基中的培养物；和

b.使所述培养物发酵以产生至少一种产物；

其中向所述培养物中提供超过所述培养物的细胞需要量的精氨酸；且其中所述C1固定微生物包含精氨酸代谢路径。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述精氨酸代谢路径包含精氨酸脱胺酶路径和精氨酸脱羧酶路径中的至少一种，其中所述精氨酸脱胺酶路径包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)和氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，且所述精氨酸脱羧酶路径包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19)、推定精氨酸脱胺酶(EC3.5.3.12)、腐胺氨甲酰基转移酶(EC 2.1.3.6)和氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中向所述培养物中提供的精氨酸的量在所述培养物的细胞需要量到所述培养物的细胞需要量的1000倍范围内。

4.根据权利要求1所述的方法，其中向所述培养物中提供的精氨酸的量在所述培养物的细胞需要量的2倍到所述培养物的细胞需要量的1000倍范围内。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物反应器中的精氨酸浓度是至少20mg/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养物的细胞需要量是每克细胞生物质0.012g精氨酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中相较于其中未提供超过所述培养物的细胞需要量的精氨酸的培养物，所述培养物的倍增时间减少至少10％。

8.根据权利要求7所述的方法，其中相较于其中未提供超过所述培养物的细胞需要量的精氨酸的培养物，所述培养物的倍增时间减少至少50％。

9.根据权利要求1所述的方法，其中相较于其中未提供超过所述培养物的细胞需要量的精氨酸的培养物，所述ATP密集型产物的选择性增加。

10.根据权利要求1所述的方法，其中相较于其中未提供超过所述培养物的细胞需要量的精氨酸的培养物，所述ATP密集型产物的生产率增加至少10％。

11.根据权利要求1所述的方法，其中相较于其中未提供超出所述培养物的细胞需要量的精氨酸的培养物，所述培养物产生乙酸酯的量减少。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养物不产生乙酸酯。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述C1固定微生物是梭菌属细菌。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物选自由以下组成的组：乙醇、乙醇、2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、乳酸酯、丁二酸酯、甲基乙基酮(MEK)、丁酸酯、2-丁醇、1,2-丙二醇(1,2-PDO)、1-丙醇、异丙醇(IPA)、乙偶姻(acetoin)、异丁醇、异戊二烯、菌绿烯(farnesene)、红没药烯(bisabolene)、苹烯(pinine)、柠檬烯、丙酮、3-羟丁酸酯、2-羟异丁酸(2-HIBA)、柠苹酸酯、丁二烯、聚乳酸、1-丁醇、3-羟丙酸酯(3-HP)、苯甲酸酯、脂肪酸乙酯和脂肪酸，以及异丁烯。

15.一种用于改善发酵过程的可持续性的方法，所述方法包含：

a.使含C1气态底物流到生物反应器中，所述生物反应器含有至少一种C1固定细菌于液态营养培养基中的培养物，所述C1固定细菌包含精氨酸脱亚胺酶路径或精氨酸脱羧酶路径中的至少一种；

b.使所述培养物发酵以产生至少一种产物；和

c.向所述培养物中提供超过所述培养物的细胞需要量的精氨酸，使得精氨酸通过所述精氨酸脱亚胺酶路径发生分解代谢以产生铵，其中所述细菌利用铵作为氮源。

16.一种用于改善发酵过程的效率的方法，所述方法包含提供精氨酸作为C1固定微生物的唯一氮源。

17.一种经基因工程改造的C1固定微生物，包含优化的精氨酸脱亚胺酶路径。

18.根据权利要求17所述的细菌，其中所述C1固定微生物包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、氨甲酰基转移酶(鸟氨酸氨甲酰基转移酶、腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)和氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。

19.根据权利要求18所述的细菌，进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC1.4.1.12)和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)，其中每种酶是过度表达的内源酶、突变内源酶或外源酶。

20.根据权利要求18所述的细菌，其中所述细菌进一步包含精氨酸:鸟氨酸转运子中的干扰性突变。

21.一种由底物生产至少一种产物的方法，所述方法包含在含C1的气态底物存在下培养根据权利要求19所述的细菌。

22.一种用于改善精氨酸并入代谢中的效率的方法，所述方法包含培养经基因工程改造的C1固定微生物，所述微生物包含一种或多种选自由以下组成的组的基因修饰：

i.精氨酸转运子中的干扰性突变；

ii.过度表达一种或多种选自由以下组成的组的内源酶：精氨酸脱亚胺酶(EC3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)；

iii.表达一种或多种选自由以下组成的组的突变内源酶：精氨酸脱亚胺酶(EC3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)；

以及

iv.表达一种或多种选自由以下组成的组的内源酶：精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(腐胺氨甲酰基转移酶)(EC 2.1.3.3)、氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)、鸟氨酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鸟氨酸氨基变位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二氨基戊酸脱氢酶(EC 1.4.1.12)和2-氨基-4-氧代戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)。

23.一种用于改善精氨酸与一种或多种气态底物的共利用效率的方法，所述一种或多种气态底物选自由CO、H₂和CO₂组成的组，所述方法包含培养经基因工程改造的包含一种或多种基因修饰的C1固定细菌，其中所述一种或多种基因修饰选自由以下组成的组：(i)调控元件的干扰性突变和(ii)用组成型启动子或合成启动子替代操纵子结合位点或天然启动子。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述干扰性突变是精氨酸抑制子argR的基因剔除。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述替代是用组成型启动子或合成启动子替代精氨酸脱胺酶路径操纵子启动子。