KR20210092691A - 개선된 대사 활성을 갖는 혐기성 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예는, 일산화탄소의 농도에 무관하게 일산화탄소 탈수소효소(CODH)를 발현시킴으로써 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주를 제공한다.
Description
본 발명은 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주, 보다 구체적으로는, 일산화탄소의 농도에 무관하게 일산화탄소 탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, CODH 또는 CooS, EC 1.2.7.4)를 발현시킴으로써 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주에 관한 것이다.
폐기물 가스화에 의해 생산되는 합성가스(syngas)의 조성은 일산화탄소(CO, 20~35%), 수소(H2, 20~35%)를 주성분으로 하며 부분산화 조건에 이산화탄소(CO2)가 함께 생산된다. 생산된 합성가스는 1,365~2,125Nm3/hr에 이르는데, 이러한 합성가스는 스팀생산, 전력생산, 고부가가치의 바이오 연료, 바이오 원자재, 화학원료의 생산에 이용될 수 있어 가스발효(gas fermentation) 기술에 대한 연구가 전 세계적으로 활발히 이루어지고 있다.
이러한 합성가스들은 미생물을 이용한 생물전환공정(biorefinery)을 거쳐 이용될 수 있다. 대표적으로, 아세토젠(Acetogen)으로 통칭되는 혐기성 아세트산 생성균이 이용된다. 이러한 생물전환공정을 통한 C1 카스의 전환은 상온/상압 운전으로 공정 운전 비용의 절감이 가능하다는 장점이 있다.
그러나, 아세토젠을 이용한 합성가스 생물전환공정은 미생물의 생장 속도 및 가스 소비속도에 직접적인 영향을 받게 되므로, 기존의 화학전환공정과 비교하여 상대적으로 낮은 반응 속도 및 생산 효율을 가진다는 문제점이 있었다.
따라서 이러한 문제를 해결하기 위하여, 합성가스는 에너지가 낮기 때문에, 초기 높은 세포의 농도를 확보하기 위해 포도당(glucose), 과당(fructose), 엿당(maltose), 메탄올 등 비교적 에너지가 높은 물질과 함께 사용하기도 한다. 대부분의 아세토젠 균주의 경우, 합성가스보다 당류를 기질로서 더 선호하기 때문에 초기 고농도의 세포 확보가 가능하다.
그러나, 아세토젠 균주가 당류를 기질로서 사용하는 경우 합성가스 사용 시 이용되는 우드-융달 회로의 주요한 핵심 효소인 일산화탄소 탈수소효소의 발현량이 감소하게 된다. 이러한 이유로 인하여 아세토젠 균주가 타 기질을 이용시에는 C1 가스의 소비가 저해되게 되며, 당류를 먼저 소비한 후 곧바로 합성가스를 기질로서 사용하지 못하는 문제점이 있어 고에너지 기질을 통한 고농도의 세포 확보 후 C1 가스의 즉각적 소비가 가능하도록 하는 균주 개질이 필요한 실정이었다.
본 발명의 일 과제는 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 일산화탄소의 농도에 무관하게 일산화탄소 탈수소효소(CODH)를 발현시킴으로써 일산화탄소 대사 활성이 개선된 형질전환 혐기성 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 과제는 상기 혐기성 균주를 형질전환하기 위한 혐기성 균주 형질전환용 벡터 및 이를 이용한 일산화탄소 대사 활성이 개선된 형질전환 혐기성 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주를 제공한다.
상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주는, 일산화탄소 존재 여부와 무관하게 일산화탄소 탈수소효소를 항시 발현하도록 형질전환 된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이는 상기 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터를 개선하여 전사 조절자가 결합할 수 없도록 형질전환 된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 혐기성 균주는, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium Woodii), 옥소박터 페니기이(Oxobacter pfenigii), 부티리박테리움 리모숨(Butyribacterium limosum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 알칼리바큘룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 모어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 모어렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica) 및 써모아내로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터의 개선은 상기 일산화탄소 탈수소효소 프로모터에 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 H2 프로모터의 도입을 통해 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 균주는 크리스퍼(CRISPR) 시스템을 통해 형질전환 된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터를 제공한다.
상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터는,
절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열;
상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 암(arm);
상기 5' 상동성 암의 3' 말단측에 연결되는, 삽입 목적 유전자인 H2 프로모터; 및
상기 도너 DNA 서열의 3' 말단측에 연결되며, 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 암(arm);
Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열;
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터;
대장균 유래의 복제 개시점;
혐기성 균주용 복제 개시점; 및
형질전환 균주 선별용 마커;를 포함하는 것을 특징으로 하되,
상기 H2 프로모터는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 절단 표적 유전자는, 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 혐기성 균주용 복제 개시점은, pIP404 replicon을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 형질전환 균주 선별용 마커는, 항생제 내성 유전자를 포함하고,
상기 항생제 내성 유전자는, 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜 및 테트라사이클린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주의 제조방법은,
형질전환 대상 혐기성 균주 내에 제6항에 따른 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터를 도입하는 단계;
상기 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및
상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 균주를 수득하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로모터가 개질 된 형질전환 혐기성 균주를 이용하여 기질 중의 일산화탄소의 농도와 무관하게 일산화탄소 탈수소효소(CODH)의 발현량을 증가시킬 수 있다. 이를 통하여 합성가스에 포함된 일산화탄소로부터 고부가가치의 유기산 또는 알코올의 생산량이 증대될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 유박테리움 리모숨 KIST612 균주의 일산화탄소 탈수소효소 클러스터를 나타내는 도면이다.
도 3은 CRISPR-CAS9 시스템을 통한 유박테리움 리모숨 KIST612 균주에서의 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터 개선 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 기질에 의한 전사 조절 기전을 확인하기 위한 기질에 따른 전사 조절자 규명을 위한 통합 시스템용 벡터의 개열 지도를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 아세토젠이 아닌 균주에서 규명된 실제 일산화탄소 탈수소효소의 전사 조절자를 도입하여 진행한 전자 조절자 규명 통합 시스템의 동작을 확인한 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 유박테리움 리모숨 KIST612 균주의 일산화탄소 탈수소효소 클러스터를 나타내는 도면이다.
도 3은 CRISPR-CAS9 시스템을 통한 유박테리움 리모숨 KIST612 균주에서의 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터 개선 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 기질에 의한 전사 조절 기전을 확인하기 위한 기질에 따른 전사 조절자 규명을 위한 통합 시스템용 벡터의 개열 지도를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 아세토젠이 아닌 균주에서 규명된 실제 일산화탄소 탈수소효소의 전사 조절자를 도입하여 진행한 전자 조절자 규명 통합 시스템의 동작을 확인한 실험 결과를 나타낸 사진이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 일산화탄소 대사 활성이 개선된 형질전환 혐기성 균주를 설명한다.
상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 형질전환 혐기성 균주는, 일산화탄소 존재 여부와 무관하게 일산화탄소 탈수소효소를 항시 발현하도록 형질전환 된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 아세토젠 균주의 사용에서, 기질에 상관없이 즉 일산화탄소의 농도에 상관없이 일산화탄소 탈수소효소의 발현량을 높게 유지함으로써 합성가스의 이용도를 개선하기 위한 연구 중 아세토젠 균주에서 CooA가 전사인자로 작용하는 프로모터를 개질함으로써 이를 실현할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
더욱 자세하게는, 상기 일산화탄소의 농도에 무관하게 일산화탄소 탈수소효소를 발현시키는 것은, 일산화탄소 탈수소효소 코딩 유전자에 대한 전사조절인자를 항상 활성화시키거나, 레귤론 전단의 프로모터를 상시 발현하도록 개질함으로써 달성할 수 있을 것이다.
가장 바람직하게는, 상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 형질전환 혐기성 균주는, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터를 개선하여 전사 조절자가 결합할 수 없도록 형질전환 된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 혐기성 균주는, 아세토젠(Acetogen) 균주를 포함할 수 있다. 아세토젠 균주는 합성가스 또는 당을 탄소 및 에너지원으로 사용하여 혐기적 대사를 통해 아세트산, 부티르산과 같은 유기산, 또는 에탄올, 부탄올과 같은 바이오알코올을 생산하는 분리 균주를 지칭하며, 예를 들어, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium Woodii), 옥소박터 페니기이(Oxobacter pfenigii), 부티리박테리움 리모숨(Butyribacterium limosum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 알칼리바큘룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 모어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 모어렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica) 및 써모아내로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주일 수 있다.
상기 혐기성 균주에서 일산화탄소 탈수소효소(CODH)를 코딩하는 유전자 cooS의 발현은 전사조절인자인 CO 결합 헴단백질(CooA)에 의하여 조절된다. 상기 CooA는 cAMP/FNR 리셉터 단백질 패밀리에 속하여, 일산화탄소(CO)가 결합함으로써 구조가 변화하여 프로모터 전단의 CooA 결합부위에 결합하도록 활성화될 수 있다. 이와 같이, 활성화된 CooA가 CooA 결합부위에 결합하여 프로모터를 활성화함으로써 일산화탄소 탈수소효소(CODH)를 코딩하는 cooS 유전자가 전사될 수 있다(Techtman et al., 2012).
상기 CooA의 모티프(cAMP/FNR 리셉터 단백질 패밀리)를 기반으로 후보군으로 선택된 전사조절인자는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
| 균주 | 유전자 ID |
| 유박테리움 리모숨 KIST612 | ELI_1763 |
| ELI_2617 | |
| 아세토박테리움 우디이 DSM1030 | Awo_c01670 |
| Awo_c05050 | |
| 클로스트리디움 오토에타노게눔 DSM10061 | CLAU_0424 |
| CLAU_3090 | |
| 클로스트리디움 융달리 DSM13528 | CLJU_c10830 |
| CLJU_c23780 |
상기 전사조절인자에 의하여 활성화가 조절되는 프로모터는 하기 표 2에 나타난 바와 같다.
| 유전자ID | 유전자명(NCBI) | 프로모터 서열 | 서열번호 |
| ELI_3815 | Rubredoxin ocidoreductase | taaagtttaaaaattgtggtataattaattatatcattaagcggataagt | 1 |
| ELI_2073 | MIP family channel protein | gttttgctttgcggctgtgtaaacgctattatttttctatttacaattgaactttaacataatttcaggttatacctgttataactttaattcaatatgattataactttaattcaatatgaatttatctcaaatgggtgtattatataaatatgaatttatctcaaatgggtgtattatataagtagcgaaagaaaacg | 2 |
| ELI_1085 | Hypothetical protein | ctaaattgtaaataactttacaatttggtcaaaattatataggagggtgg | 3 |
| ELI_0993 | Hypothetical protein | acgtgacctattttgattatacgataactttgagatcttgtccacaagat | 4 |
| ELI_2650 | Hypothetical protein | tggaattttcaaattaacaacaacctgattataacacaaaaaactttttt | 5 |
| ELI_1385 | cold shock protein | ttttggttttacttttcgaaatgatttacaaaaatatgtgtttttttatttttttatttatatgttcctggaatgaagttttaatttaggaggtaccgta | 6 |
| ELI_0725 | Hypothetical protein | gcatttttggtggtctcacccctttcctgtaaattttatcaattcactcgcaattcactcggatagattctttttcaaataaaatatgatgaacttaccaaaaaaattaaaaccggctccatatttctgtacctttgtacgatggaaccg | 7 |
| ELI_1211 | extracellulartungstate binding protein | tgccgcttgaattcttcgccattttctgttaaaatagtcatatcgaaatcatcgttttaaagatttatctatccgaattttttatcctaaagtcaatccaaatggtatagaagattattcttttatatatttaattttcattatcaagga | 8 |
| ELI_2194 | Hypothetical protein | ttctggtagaaatcgctttacaaacaacaaataattagtgtataataaacatcgctttacaaacaacaaataattagtgtataataaacccatagtatag | 9 |
| ELI_2183 | Hypothetical protein | agagtaaaggtggtgattaaatgtcgattctggattcaatcaacaaggct | 10 |
| ELI_0972 | glutamate decarboxylase | tttgattacctcctaaaaatgtttgaattaaatttatttatgtcaagccaatgataattgacgacacagcgtaaaataag | 11 |
| ELI_3850 | hypothetical protein | acaacctcctttcttcaaaatttagagttaactactctatcgaaattattataacatattatagcggaataacgtataataagttttgcaaaataaaatagacataatcccaagccgtt | 12 |
이때, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터의 개선은 유박테리움 리모숨 KIST612 균주의 일산화탄소 탈수소효소(ELI_3603(CODH, cooS))의 프로모터에, 유박테리움 리모숨 KIST612 균주에서 높은 수준의 발현이 확인된 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 H2 프로모터의 도입을 통해 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 H2 프로모터의 도입은, 크리스퍼(CRISPR) 시스템을 통해 이루어진 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기와 같은 구성적 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 일산화탄소 기질의 농도나 타 기질의 존재와 무관하게 일산화탄소 탈수소효소를 발현시킴으로써 일산화탄소에 대한 반응속도가 빨라져, 합성가스 발효 운영 시 운영기간을 단축시킴으로써 전체 운전 비용을 절감할 수 있는 효과를 발휘 가능한 일산화탄소 대사 활성이 개선된 형질전환 혐기성 균주를 제공 가능한 효과가 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터를 설명한다.
도 1은 상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터는, 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열; 상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 암(arm); 상기 5' 상동성 암의 3' 말단측에 연결되는, 삽입 목적 유전자인 H2 프로모터; 및 상기 도너 DNA 서열의 3' 말단측에 연결되며, 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 암(arm); Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열; 상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 대장균 유래의 복제 개시점; 혐기성 균주용 복제 개시점; 및 형질전환 균주 선별용 마커;를 포함하는 것을 특징으로 하되, 상기 H2 프로모터는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 절단 표적 유전자는, 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 혐기성 균주용 복제 개시점은, pIP404 replicon을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
이때, 상기 형질전환 균주 선별용 마커는, 항생제 내성 유전자를 포함하고,
상기 항생제 내성 유전자는, 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜 및 테트라사이클린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 일산화탄소 기질의 농도와 무관하게 일산화탄소 탈수소효소를 발현 가능하도록 하여 일산화탄소 대사 활성이 개선되도록 혐기성 균주를 형질전환 하기 위한 형질전환용 벡터를 제공 가능한 효과가 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주의 제조방법을 설명한다.
상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주의 제조방법은, 형질전환 대상 혐기성 균주 내에 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터를 도입하는 단계; 상기 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 균주를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터에 대한 설명은 전술한 실시예의 설명으로 갈음한다.
상기와 같이 제조된 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주를 배양함으로써 유기산 또는 알코올 등의 바이오 연료가 제조 가능할 것이다.
이하에서는 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명의 일 실시예에 따른 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주를 제조하기 위하여, 유박테리움 리모숨 KIST612 균주의 일산화탄소 탈수소효소 유전자(ELI_3603 (CODH, cooS))의 프로모터를 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 H2 프로모터로 개선하였다.
이때, 상기 일산화탄소 탈수소효소 유전자(ELI_3603 (CODH, cooS))의 염기 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
| 유전자ID | 유전자 서열 | 서열번호 |
| ELI_3603 (CODH, cooS) | 5'-taaaagaagttaataaaaaataagcccctaaagtaacgctcatttcgagacccggaagggaacgttgctttaggagcccatattgaataaatgactgatttgcgttgccgcttttattattctacaataataaagtgtttttgtaaagtggaaatttttacaaagttgctgcaatgcgagtaaattactatggagaggtaaattaaattatg-3' | 13 |
도 2는 본 발명의 유박테리움 리모숨 KIST612 균주의 일산화탄소 탈수소효소 클러스터를 나타내는 도면이다.
도 3은 CRISPR-CAS9 시스템을 통한 유박테리움 리모숨 KIST612 균주에서의 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터 개선 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2 및 도 3을 참조하면, CRISPR-CAS9 시스템을 통해 유박테리움 리모숨 KIST612 균주의 ELI_3604 및 ELI_3603 사이에 H2 프로모터가 삽입됨으로써 일산화탄소 탈수소효소 프로모터를 개선하여 전사 조절 인자에 영향을 받지 않으면서 일산화탄소 탈수소효소의 항시 발현이 가능한 혐기성 균주를 제조 가능할 것임을 확인할 수 있다.
<실험예 1>
일산화탄소 탈수소효소의 일산화탄소 기질에 의한 전사 조절 기전을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
이를 위하여, 도 4의 개열 지도를 갖는 바이오 서킷 벡터를 기질에 의한 전사 조절 기전을 확인하기 위한 기질에 따른 전사 조절자 규명을 위한 통합 시스템용 벡터로 이용하였다.
도 4는 기질에 의한 전사 조절 기전을 확인하기 위한 기질에 따른 전사 조절자 규명을 위한 통합 시스템용 벡터의 개열 지도를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 아세토젠이 아닌 균주에서 규명된 실제 일산화탄소 탈수소효소의 전사 조절자를 도입하여 진행한 전자 조절자 규명 통합 시스템의 동작을 확인한 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 5를 참조하면, 일산화탄소를 인식하는 전사 조절자인 cooA와 cooA가 결합하는 프로모터인 cooF를 통해 GUS 리포터 유전자를 발현시키는 형태로 설계된 시스템에서 일산화탄소 존재 조건에서만 GUS 리포터 유전자의 발현(파란색)이 확인됨으로써 전사 조절자 규명을 가능케 한 것을 확인할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Gwangju Institute of Science and Technology
<120> Anaerobic strain with improved metabolic activity
<130> P-210003
<150> KR 10-2020-0005740
<151> 2020-01-16
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
<400> 1
taaagtttaa aaattgtggt ataattaatt atatcattaa gcggataagt 50
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
<400> 2
gttttgcttt gcggctgtgt aaacgctatt atttttctat ttacaattga actttaacat 60
aatttcaggt tatacctgtt ataactttaa ttcaatatga ttataacttt aattcaatat 120
gaatttatct caaatgggtg tattatataa atatgaattt atctcaaatg ggtgtattat 180
ataagtagcg aaagaaaacg 200
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
<400> 3
ctaaattgta aataacttta caatttggtc aaaattatat aggagggtgg 50
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<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
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acgtgaccta ttttgattat acgataactt tgagatcttg tccacaagat 50
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<213> Eubacterium limosum
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tggaattttc aaattaacaa caacctgatt ataacacaaa aaactttttt 50
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<212> DNA
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tatgttcctg gaatgaagtt ttaatttagg aggtaccgta 100
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<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
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gcatttttgg tggtctcacc cctttcctgt aaattttatc aattcactcg caattcactc 60
ggatagattc tttttcaaat aaaatatgat gaacttacca aaaaaattaa aaccggctcc 120
atatttctgt acctttgtac gatggaaccg 150
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agatttatct atccgaattt tttatcctaa agtcaatcca aatggtatag aagattattc 120
ttttatatat ttaattttca ttatcaagga 150
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<212> DNA
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aaacaacaaa taattagtgt ataataaacc catagtatag 100
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tttgattacc tcctaaaaat gtttgaatta aatttattta tgtcaagcca atgataattg 60
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<212> DNA
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acaacctcct ttcttcaaaa tttagagtta actactctat cgaaattatt ataacatatt 60
atagcggaat aacgtataat aagttttgca aaataaaata gacataatcc caagccgtt 119
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<211> 212
<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
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taaaagaagt taataaaaaa taagccccta aagtaacgct catttcgaga cccggaaggg 60
aacgttgctt taggagccca tattgaataa atgactgatt tgcgttgccg cttttattat 120
tctacaataa taaagtgttt ttgtaaagtg gaaattttta caaagttgct gcaatgcgag 180
taaattacta tggagaggta aattaaatta tg 212
Claims (10)
- 일산화탄소 존재 여부와 무관하게 일산화탄소 탈수소효소를 항시 발현하도록 형질전환 된 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터를 개선하여 전사 조절자가 결합할 수 없도록 형질전환 된 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 혐기성 균주는, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium Woodii), 옥소박터 페니기이(Oxobacter pfenigii), 부티리박테리움 리모숨(Butyribacterium limosum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 알칼리바큘룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 모어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 모어렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica) 및 써모아내로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주.
- 제2항에 있어서, 상기 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터의 개선은 상기 일산화탄소 탈수소효소 프로모터에 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 H2 프로모터의 도입을 통해 이루어진 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주.
- 제1항에 있어서,
크리스퍼(CRISPR) 시스템을 통해 형질전환 된 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주.
- 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열;
상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 암(arm);
상기 5' 상동성 암의 3' 말단측에 연결되는, 삽입 목적 유전자인 H2 프로모터; 및
상기 H2 프로모터 서열의 3' 말단측에 연결되며, 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 암(arm);
Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열;
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터;
대장균 유래의 복제 개시점;
혐기성 균주용 복제 개시점; 및
형질전환 균주 선별용 마커;를 포함하는 것을 특징으로 하되,
상기 H2 프로모터는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터.
- 제6항에 있어서,
상기 절단 표적 유전자는, 일산화탄소 탈수소효소의 프로모터인 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터.
- 제6항에 있어서,
상기 혐기성 균주용 복제 개시점은, pIP404 replicon을 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터.
- 제6항에 있어서,
상기 형질전환 균주 선별용 마커는, 항생제 내성 유전자를 포함하고,
상기 항생제 내성 유전자는, 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜 및 테트라사이클린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터.
- 형질전환 대상 혐기성 균주 내에 제6항에 따른 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주 형질전환용 벡터를 도입하는 단계;
상기 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및
상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 균주를 수득하는 단계;를 포함하는 일산화탄소 대사 활성이 개선된 혐기성 균주의 제조방법.
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| KR20180127632A (ko) | 2015-12-03 | 2018-11-29 | 란자테크 뉴질랜드 리미티드 | 가스 발효 아세토젠에서의 효율을 개선하기 위한 아르기닌 보충 |
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