CN110257438B - 使含co气态底物发酵的方法 - Google Patents

使含co气态底物发酵的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使含CO气态底物发酵的方法。在含CO底物的发酵期间提供高的乙醇生产率水平的方法。所述方法控制CO底物的进料速率和细胞密度以避免培养基扰动和CO抑制。所述方法包括使含CO气态底物发酵以获得目标细胞密度和目标CO进料速率，然后周期性降低和提高CO进料速率。

Description

使含CO气态底物发酵的方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2014年2月11日，申请号为201480008788.9(PCT/US2014/015892)，发明名称为“使含CO气态底物发酵的方法”。
技术领域
提供了使含CO气态底物发酵的方法。更具体地说，所述方法包括使含CO气态底物发酵以获得目标细胞密度和目标CO进料速率，然后周期性地降低和提高CO进料速率。所述方法有效用于保持发酵中的溶解CO浓度为约0.25mM或更少。
背景技术
产乙酸微生物可由一氧化碳(CO)通过气态底物的发酵产生醇。使用来自梭菌属(Clostridium)的厌氧微生物的发酵产生乙醇和其它有用的产物。例如，美国专利号5,173,429描述了杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC号49587，由合成气产生醇和乙酸盐的厌氧微生物。美国专利号5,807,722描述了使用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ATCC号55380将废气转化为有机酸和醇的方法和设备。美国专利号6,136,577描述了使用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC号55988和55989将废气转化率为乙醇的方法和设备。
由一氧化碳生产乙醇的方法包括在随时间提高的CO量下培养产乙酸菌。在发酵中高或低水平的CO可导致更低的生产率。当通往发酵器的CO进料速率提高时，在发酵介质中溶解的CO浓度可提高。在发酵介质中溶解的CO浓度的提高可导致CO抑制和降低的生产率水平。
发明内容
在含CO底物发酵期间提供高的乙醇生产率水平的方法。该方法控制CO底物进料速率和细胞密度以避免培养基扰动和CO抑制。
使含CO底物发酵的方法包括将含CO底物提供至发酵器以获得目标CO进料速率，并将CO进料速率保持在目标CO进料速率的约7个标准偏差内。CO进料速率有效用于保持约0.25mM或更少的发酵中的溶解CO浓度和10g总醇/(L•天)或更高的STY。在一方面，所述方法包括使CO进料速率在目标CO进料速率和距离目标CO进料速率约7个标准偏差之间循环。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率保持在目标CO进料速率的约4-约7个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约1%-约20%。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率保持在目标CO进料速率的约3-约5个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约1%-约10%。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率保持在目标CO进料速率的约1-约3个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约1%-约10%。
使含CO底物发酵的方法包括将含CO底物提供至发酵器并使含CO底物发酵以获得目标细胞密度和目标CO进料速率。所述方法还包括将目标CO进料速率降低约35%或更少以提供降低的CO进料速率，保持降低的CO进料速率约20分钟或更少，和将降低的CO进料速率返回至目标CO进料速率。所述方法有效用于提供10g总醇/(L•天)或更高的STY。
使含CO底物发酵的方法包括将含CO底物提供至发酵器，使含CO底物发酵以获得目标细胞密度和目标CO进料速率；并保持约0.25mM或更少的发酵中的溶解CO浓度。在该方面，所述方法有效用于提供10g醇/(L•天)或更高的STY。在另一方面，溶解的CO浓度通过以下保持：a)将通往发酵的目标CO进料速率降低所述目标CO进料速率的约25%-约35%，以提供第一降低CO进料速率，并保持第一降低CO进料速率约1-约10分钟；b)提高通往发酵的第一降低CO进料速率以提供降低目标CO进料速率的约15-约25%的第二降低CO进料速率，并保持第二降低进料速率约1-约5分钟；c)提高通往发酵的第二降低CO进料速率以提供降低目标CO进料速率的约5%-约15%的第三降低CO进料速率，并保持第三降低进料速率约1-约5分钟；和d)将第三降低CO进料速率提高至目标进料速率或更高。在一方面，步骤a)至d)每小时重复至少约1次。
在另一方面，在含CO底物发酵期间，避免CO抑制的方法包括：将含CO底物提供至发酵器并将含CO底物与发酵介质接触和使含CO底物发酵。所述方法包括测定发酵介质中的溶解CO浓度并在发酵中保持约0.25mM或更少的溶解CO浓度。所述方法有效用于提供10g醇/(L•天)或更高的STY。
在另一方面，含CO底物的发酵方法包括将含CO底物提供至发酵器并使含CO底物发酵以获得目标细胞密度和目标CO进料速率。所述方法包括保持至少约25%或更高的H2转化率。所述方法有效用于提供10g醇/(L•天)或更高的STY。
在另一方面，使含CO底物发酵的方法包括将含CO底物提供至发酵器并使含CO底物发酵以获得目标H2转化率和目标CO吸收。所述方法包括监控H2转化率和CO吸收，并保持H2转化率为约25%-约95%和CO吸收为约0.001-约10毫摩尔/分钟/克干细胞。
附图说明
所述方法的数个方面的以上和其它方面、特征和优点将由以下图形更显而易见。
图1A和1B显示了通往发酵的CO循环的重复模式。
图2说明随变化的气体流速发酵的结果。
图3显示气体循环对H2转化率的影响。
图4说明在恢复气流循环之后，H2转化率的恢复。
图5显示在中试设备发酵器中气体保留时间和流速。
图6显示在中试设备发酵器中在10%和20%气体流速变化下的气体转化率。
图7说明在中试设备发酵器中的底物吸收。
图8说明在中试设备发酵器中的产物浓度。
图9说明在中试设备发酵器中气体循环速率对理论乙醇生产率的影响。
图10显示了中试设备发酵器中的乙醇生产率。
详述
以下描述不应理解为限制意义，但是仅为了描述示例性实施方案的通用原理而作出。本发明的范围应参考权利要求决定。
如本文描述的在具有介质和产乙酸菌的生物反应器中进行的合成气发酵，有效用于提供合成气中的CO到醇和其它产物的转化率。通过控制发酵介质中的CO进料速率和细胞密度对发酵中CO浓度的控制有效用于提供高生产率水平。在该方面，生产率可表示为STY(空时产率，表示为g总醇/(L•天)。在该方面，所述方法有效用于提供至少约10g总醇/(L•天)的STY(空时产率)。可能的STY值包括约10g总醇/(L•天)-约200g总醇/(L•天)，在另一方面约10g总醇/(L•天)-约160g总醇/(L•天)，在另一方面约10g总醇/(L•天)-约120g总醇/(L•天)，在另一方面约10g总醇/(L•天)-约80g总醇/(L•天)，在另一方面约20g总醇/(L•天)-约140g总醇/(L•天)，在另一方面约20g总醇/(L•天)-约100g总醇/(L•天)，在另一方面约40g总醇/(L•天)-约140g总醇/(L•天)，和在另一方面约40g总醇/(L•天)-约100g总醇/(L•天)。
定义
除非另外限定，在本公开的说明书通篇使用的以下术语如下限定并可包括如下限定定义的单数或复数形式：
修饰作何数量的术语“约”是指现实世界条件中遇到的该量的变化，例如，在实验室、中试设备或生产设施中。例如，用于混合物成分或测量的量或数量当用“约”修饰时包括在生产工厂或实验室中在试验条件下通常用于测量的关注的变化和程度。例如，产物组分的量当用“约”修饰时包括在工厂或实验室中在多个试验中的批次之间的变化，和分析方法中固有的变化。不论是否用“约”修饰，量包括那些量的等价物。本文所述的和由“约”修饰的任意量还可按未用“约”修饰的量用于本公开。
术语“气态底物”用于非限制性意义，包括包含或源自一种或多种气体的底物。
术语“合成气”或“合成气”是指包含不同量的一氧化碳和氢的气体混合物的合成气的名称。生产方法的实例包括天然气或烃蒸汽重整以产生氢，煤的气化和在某些类型的废物至能源气化设备中。名称来源于它们在产生合成天然气(SNG)并用于生产氨或甲醇中作为中间体的用途。合成气可燃和通常用作燃料源或其它化学品生产的中间体。
术语“发酵器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、泡罩塔、气升式发酵器、膜反应器例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)、静态混合器或适合于气-液接触的其它容器或其它装置。
术语“发酵”、“发酵方法”或“发酵反应”等是指包括所述方法的生长阶段和产物生物合成阶段两者。在一方面，发酵是指CO转化为醇。
术语“细胞密度”指每单位体积发酵液的微生物细胞质量，例如克/升。
术语“提高效率”、“提高的效率”等，当关于发酵方法使用时，包括提高以下的一个或多个：在发酵中微生物的增长速率、消耗每体积或质量底物(例如一氧化碳)产生的期望产物(例如醇)的体积或质量、期望产物的生产速率或生产水平，和与其它的发酵副产物相比期望产物的相应比例。
如本文所用，“总醇”包括乙醇、丁醇、丙醇和甲醇。在一方面，总醇可包括至少约75重量%或更多的乙醇，在另一方面，约80重量%或更多的乙醇，在另一方面，约85重量%或更多的乙醇，在另一方面，约90重量%或更多的乙醇，和在另一方面，约95重量%或更多的乙醇。在另一方面，总醇可包括约25重量%或更少的丁醇。
术语“比CO吸收”指由单位质量微生物细胞(g)在每单位时间（以分钟计）内消耗的CO的毫摩尔量，即毫摩尔/克/分钟。
含CO底物
含CO底物可包括含有CO的任何气体。在该方面，含CO气体可包括合成气、工业煤气和它们的混合物。
合成气可由任何已知的来源提供。在一方面，合成气可来自含碳物质的气化。气化包括在氧的有限供应下生物质的部分燃烧。得到的气体主要包含CO和H2。在该方面，合成气包含至少约10摩尔%的CO，在一方面，至少约20摩尔%，在一方面，约10-约100摩尔%，在另一方面，约20-约100摩尔%CO，在另一方面，约30-约90摩尔%CO，在另一方面，约40-约80摩尔%CO，和在另一方面，约50-约70摩尔%CO。适合的气化方法和设备的一些实例由以下提供：美国序列号61/516,667、61/516,704和61/516,646，全部在2011年4月6日提交，和美国序列号13/427,144、13/427,193和13/427,247，全部在2012年3月22日提交，和其全部通过引用并入本文。
在另一方面，所述方法可应用于支持由气态底物生产醇，例如高体积含CO工业烟道气。在一些方面，包含CO的气体衍生自含碳废物，例如，工业废气，或衍生自其它废物的气化。因此，所述方法代表捕集碳的有效方法，否则所述碳将排入环境中。工业烟道气的实例包括在铁类金属产品制造、非铁类金属产品制造、石油精制过程、煤的气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造期间产生的气体。
取决于含CO底物的组成，含CO底物可直接提供至发酵过程或还可经进一步改性以包括适当的H2:CO摩尔比。在一方面，提供至发酵器的含CO底物具有约0.2或更多的H2:CO摩尔比，在另一方面，约0.25或更多，和在另一方面，约0.5或更多。在另一方面，提供至发酵器的含CO底物可包括约40摩尔%或更多的CO+H2，和约30摩尔%或更少的CO，在另一方面，约50摩尔%或更多的CO+H2，和约35摩尔%或更少的CO，和在另一方面，约80摩尔%或更多的CO+H2，和约20摩尔%或更少的CO。
在一方面，含CO底物主要包含CO和H2。在该方面，含CO底物包含至少约10摩尔%CO，在一方面，至少约20摩尔%，在一方面，约10-约100摩尔%，在另一方面，约20-约100摩尔%CO，在另一方面，约30-约90摩尔%CO，在另一方面，约40-约80摩尔%CO，和在另一方面，约50-约70摩尔%CO。含CO底物具有至少约0.75，在另一方面，至少约1.0，和在另一方面，至少约1.5的CO/CO2比率。
在一方面，气体分离器配置用以将气流的至少一部分基本分离，其中所述部分包含一个或多个组分。例如，气体分离器可由包含以下组分CO、CO2、H2的气流中分离出CO2，其中CO2可通至CO2去除器和气流的剩余部分(包含CO和H2)可通至生物反应器。可利用本领域已知的任何气体分离器。在该方面，提供至发酵器的合成气具有约10摩尔%或更少的CO2，在另一方面，约1摩尔%或更少的CO2，和在另一方面，约0.1摩尔%或更少的CO2。
某些气流可包括高浓度的CO和低浓度的H2。在一方面，可期望优化底物流的组成以便获得更高效率的醇生产和/或总体碳捕集。例如，在所述流通至生物反应器之前，在底物流中的H2浓度可提高。
根据本发明的具体方面，来自两个或更多个来源的流可组合和/或共混以产生期望的和/或优化的底物流。例如，包含高浓度CO的流，例如来自钢厂转换器的废气，可与包含高浓度H2的流组合，例如来自钢厂炼焦炉的废气。
取决于气态含CO底物的组成，在将其引入至发酵之前，还可期望将其处理以去除任何不想要的杂质，例如尘粒。例如，气态底物可使用已知的方法过滤或洗涤。
生物反应器设计与操作
发酵器设计的说明描述在美国序列号13/471,827和13/471,858中(两个都在2012年5月15日提交)，和2012年5月16日提交的美国序列号13/473,167中，全部通过引用并入本文。
根据一个方面，通过添加介质至反应器容器中来启动发酵过程。介质组合物的一些实例描述在2012年5月22日提交的美国序列号61/650,098和61/650,093，和2001年7月23日提交的美国专利号7,285,402中，全部通过引用并入本文。介质可经杀菌以去除不期望的微生物，和用期望的微生物接种反应器。可能不总是需要杀菌。
在一个方面，所用微生物包括产乙酸菌。可用产乙酸菌的实例包括梭菌属(Clostridium)产乙酸菌，例如杨氏梭菌(lostridium ljungdahlii)菌株，包括WO 2000/68407、EP 117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 1998/00558和WO2002/08438中所述的那些菌株；自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSMZ的DSM 10061和DSM 19630, 德国)菌株，包括WO 2007/117157和WO 2009/151342中所述的那些菌株；和拉格利梭菌(Clostridium ragsdali) (P11, ATCC BAA-622)及巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi)(CP11, ATCC BAA-1772)，包括分别描述于美国专利7,704,723和“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”(来自生物质产生的合成气的生物燃料和生物产物), Hasan Atiyeh, 提出于Oklahoma EPSCoR AnnualState Conference, 2010年4月29日的那些菌株；及食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans) (ATCC PTA-7827)，描述于美国专利申请2007/0276447。其它适用的微生物包括穆尔菌(Moorella)属，包括穆尔菌种(Moorella sp. ) HUC22-1；和羧基嗜热菌(Carboxydothermus)属。这些文献分别通过引用结合到本文中。可使用两种或更多种微生物的混合培养物。
可用细菌的一些实例包括凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi) CP11(ATCC BAA-1772)、产生性布洛提菌(Blautia producta)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、产氢羧基嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸杆菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) P262、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 19630, DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 10061, DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 23693, DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 24138, DSMZ 德国)、食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans) P7(ATCC PTA-7827)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC(ATCC 49587)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ERI2(ATCC 55380)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-01(ATCC 55988)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)O-52(ATCC 55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(DSM 525, DSMZ Germany)、拉格利梭菌(Clostridium ragsdali) P11(ATCC BAA-622)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridiumultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热乙酸穆尔氏菌(Morrella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬妮产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)及它们的混合物。
应期望地在适合于发生期望的发酵的条件下实施发酵(例如CO至乙醇)。反应条件应认为包括压力、温度、气体流速、液体流速、介质pH、介质氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器)、接种水平、保证CO在液相中不会变得有限的最大气体底物浓度、和避免产物抑制的最大产品浓度。
本发明的方法可用于维持微生物培养基的生命力，其中微生物培养基在CO方面受限，使得CO转移至溶液的速率小于培养基的吸收速率。当包含CO的底物不连续提供至微生物培养基时，可发生这些情况；质量转移速率低；或在底物流中的CO不足以在最佳温度下维持培养基的生命力。在这些实施方案中，微生物培养基将快速耗尽溶于液体培养介质的CO，并且由于未能足够快地进一步提供底物，变得底物受限。
启动：在接种时，确立初始进气供应速率，有效用于供应微生物的初始种群。分析排出气体以测定排出气体内含物。气体分析的结果用于控制进气速率。在该方面，所述方法提供约0.5-约0.9的计算CO浓度:初始细胞密度比，在另一方面，约0.6-约0.8，在另一方面，约0.5-约0.7，和在另一方面，约0.5-约0.6。
在另一方面，发酵过程包含向发酵介质提供合成气，其量有效用于在发酵介质中提供以下初始计算CO浓度：约0.15mM-约0.70mM，在另一方面约0.15mM-约0.50mM，在另一方面约0.15mM-约0.35mM，在另一方面约0.20mM-约0.30mM，和在另一方面约0.23mM-约0.27mM。所述方法有效用于提高细胞密度，与起始细胞密度相比较。
启动后：在达到期望水平时，液相和细胞物质从反应器退出并补充介质。所述方法有效用于将细胞密度提高至约2.0克/升或更多，在另一方面约2-约30克/升，在另一方面约2-约25克/升，在另一方面约2-约20克/升，在另一方面约2-约10克/升，在另一方面约2-约8克/升，在另一方面约3-约30克/升，在另一方面约3-约6克/升，和在另一方面约4-约5克/升。
在一方面，用于使含CO底物发酵的方法包含将含CO底物提供至发酵器以获得目标CO进料速率并保持CO进料速率在目标CO进料速率的约7个标准偏差之内。在另一方面，所述方法包含保持CO进料速率在目标CO进料速率的约6个标准偏差之内，在另一方面，在目标CO进料速率的约5个标准偏差之内，在另一方面，在目标CO进料速率的约4个标准偏差之内，在另一方面，在目标CO进料速率的约3个标准偏差之内，在另一方面，在目标CO进料速率的约2个标准偏差之内，和在另一方面，在目标CO进料速率的约1个标准偏差之内。
在一方面，所述方法包括使CO进料速率在目标CO进料速率和距离目标CO进料速率约7个标准偏差之间循环。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率在目标CO进料速率的约4-约7个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约1%-约20%。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率在目标CO进料速率的约4.5-约6.5个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约3%-约15%。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率在目标CO进料速率的约6-约6.5个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约5%-约12%，和在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，经过总发酵时间的约6%-约12%。
在另一方面，所述方法包含在获得目标CO进料速率之后，将CO进料速率在目标CO进料速率和目标CO进料速率的约3-约5个标准偏差内循环，经过总发酵时间的至少约1%-约10%。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率在目标CO进料速率的约3-约4个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约1%-约10%，在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，经过总发酵时间的约1%-约7%，和在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，经过总发酵时间的约1%-约5%。
在另一方面，所述方法包含在获得目标CO进料速率之后，将CO进料速率在目标CO进料速率和目标CO进料速率的约1-约3个标准偏差内循环，经过总发酵时间的至少约1%-约10%。在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，CO进料速率在目标CO进料速率的约2-约3个标准偏差内，经过总发酵时间的至少约1%-约10%，在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，经过总发酵时间的约1%-约6%，和在另一方面，在获得目标CO进料速率之后，经过总发酵时间的约1%-约5%。
在相关方面，一旦获得目标进料速率，监控实际的CO进料速率。当CO进料速率在目标CO进料速率范围内时，通过测量至少3次CO进料速率来测定平均CO进料速率。CO进料速率的测量可进行3次或更多次，在另一方面，任何次数，例如约4-约50次的任何测量次数。然后可基于平均CO进料速率计算标准偏差。
在一方面，所述方法包含以有效用于提供期望的CO浓度、H2转化率或CO吸收的任何方式循环降低和提高CO进料速率。在一方面，所述方法包含将目标CO进料速率降低约35%或更少，经过约20分钟或更少。在另一方面，所述方法包含将通往发酵的目标CO进料速率降低约25%-约35%，在另一方面，约26%-约34%，和在另一方面，约28%-约32%，以提供第一降低CO进料速率。所述第一降低CO进料速率保持约1-约10分钟，在另一方面，约2-约8分钟，在另一方面，约3-约7分钟，和在另一方面，约4-约6分钟。
根据所述方法的另一方面，所述方法包含提高第一降低CO进料速率以提供降低目标CO进料速率的约15%-约25%的第二降低CO进料速率，在另一方面，约17%-约23%，和在另一方面，约18%-约22%。所述方法还包含保持第二降低CO进料速率约1-约5分钟，在另一方面，约1-约4分钟，和在另一方面，约1-约3分钟。
根据所述方法的另一方面，所述方法包含提高第二降低CO进料速率以提供降低目标CO进料速率的约5%-约15%的第三降低CO进料速率，在另一方面，约7%-约13%，和在另一方面，约8%-约12%。所述方法还包含保持第三降低CO进料速率约1-约5分钟，在另一方面，约1-约4分钟，和在另一方面，约1-约3分钟。所述方法还可包括将第三降低CO进料速率提高至目标进料速率或超过目标进料速率。循环提高和降低CO进料速率可每小时重复至少约1次，和在另一方面，每小时1-20个循环范围内的任意次数。循环提高和降低CO进料速率可持续到发酵结束。
图1(a)和1(b)显示循环CO用于发酵的重复模式的变化的两个实例。在图1(a)和1(b)显示的两个图表中，x轴为时间和y轴为目标CO进料速率的%降低。图1(a)描绘平直台阶模式，其中流速快速调节。图1(b)显示渐进台阶模式，其中流速更接近地调节。重复模式不局限于图1(a)和1(b)中显示的那些，但可包括允许CO流速循环的任何类型的模式。
CO进料速率可表示为标准立方英尺/分钟(SCFM)或标准立方英尺/小时/升。在该方面，标准立方英尺/小时/升可为约0.9-约2.0，和在另一方面，约1.25-约1.75 SCFM。在另一方面，平均CO进料速率为有效用于将通往发酵器的CO进料速率:发酵器体积的比率保持在约0.016:1-约0.04:1，在另一方面，约0.02:1-约0.04:1，在另一方面，约0.02:1-约0.035:1，在另一方面，约0.025:1-约0.035:1，和在另一方面，约0.025:1-约0.03:1。
在另一方面，所述方法包含监控H2转化率和保持约25%或更多的H2转化率，在另一方面，约25%-约95%，在另一方面，约30%-约90%，在另一方面，约35%-约85%，在另一方面，约40%-约80%，在另一方面，约40%-约70%，在另一方面，约40%-约60%，和在另一方面，约40%-约50%。所述方法还可包括监控CO吸收和保持CO吸收为约0.001-约10毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.001-约5毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.001-约4毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.001-约3毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.001-约2毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.001-约1毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.05-约9毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.05-约5毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.05-约4毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.05-约3毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.05-约2毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约0.05-约1毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约1-约8毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约1-约5毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约1-约4毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约1-约3毫摩尔/分钟/克干细胞，在另一方面，约1-约2毫摩尔/分钟/克干细胞。
在另一方面，所述方法有效用于保持约0.001-约1.0的计算CO浓度(mM) :细胞密度(克/升)比率。在另一方面，约0.01-约0.9的计算CO浓度(mM) :细胞密度比率，在另一方面，约0.01-约0.8，在另一方面，约0.02-约0.8，在另一方面，约0.02-约0.75，在另一方面，约0.03-约0.75和在另一方面，约0.03-约0.5。
CO浓度的测定-计算值
溶解CO浓度按以下公式计算。
气体减少时，溶解的CO也减少，由于在排出气体中降低的CO分压和降低的KLa(质量转移系数)。当没有气体循环时，溶解的CO保持相对稳定。
所述方法有效用于保持约0.25mM或更少的溶解CO浓度，在另一方面，约0.20mM或更少，在另一方面，约0.15mM或更少，在另一方面，约0.10mM或更少，在另一方面，约0.08mM或更少，和在另一方面，约0.06mM或更少。在另一方面，溶解的CO浓度可与CO的检测限一样低，且可基本为零。
实施例
实施例1：气体循环
用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)进行发酵。在初始启动之后，所述发酵经历性能扰动，由下降的H2转化率发出信号。当H2转化率为23.5%时，在126小时实施气体循环。
气体循环如下进行：将气体流速降低30%，经5分钟→从-30%坡道返回至-20%，经另外2分钟→从-20%坡道返回至-10%，经另外2分钟→坡道返回至初始流速；每1小时重复该过程。
发酵结果在图2中说明。在气体循环处理期间，H2吸收继续下降，和在160小时H2转化率到达底部15.6%。H2转化率趋势反转并提高和在237小时到达顶部，并保持随后30小时。气体循环在270小时有意停止，以便：a)潜在地降低高酸的风险；和b)验证H2转化率下降，和使得气体循环再测试有可能。乙醇和酸两者在一天(在296小时)之后开始下降，随着氢转化率趋势向下。在308-316的时间段内，H2转化率下降加速。当H2转化率在319小时达到24%时，气体循环恢复。在气体循环期间溶解的CO为3.1-3.8psia。
在6小时后，在气体循环恢复之后见到改善的氢转化率，和氢转化率在20小时内改善为32%。在余下的发酵期间，气体循环继续。
实施例2：使用气体循环的H2转化率恢复
用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)进行发酵。如图3说明，在运行期间，发酵具有低的氢转化率。在氢转化率的下降趋势期间，执行气体循环，并能恢复转化率。当从所述方法中去除气体循环时，氢转化率下降。在气体循环期间溶解的CO为3.1-4.1psia。
实施例3：使用气体循环的H2转化率恢复
用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)进行发酵。如图4所示，在480小时之前，按所述执行气体循环，然后当发酵器在低细胞密度下运行时，关闭480-600小时。在624小时，发酵器再坡道上升，然而，气体循环保持关闭直到722小时过程时间。在恒定的气体流速下，氢转化率已由50%(和以上)下降低至40%。在气体循环恢复之后，H2转化率恢复回到45%以上。在气体循环期间，溶解的CO为2.2-3.2psia。
实施例4：中试设备发酵器的气体循环
在开始任何气体循环之前，根据以下条件操作中试设备主发酵器。
反应器体积：245升
气体进料速率：6SCFM
气体组成：15%H2，10%CO2，30%CO，和45%N2
搅拌保持在38Hz或355rpm。
发酵器工作压力为45psig，50%充满液体，具有温度控制夹套。
理论乙醇生产率(假定全部转化的气体产生乙醇)为约125g/L天，水再循环系统开启。
CO和H2转化率为约77%和42%。
乙醇和乙酰浓度为23和2.3g/L。
细胞停留时间为19小时和液体停留时间为4.4小时。
气体循环如下：在每小时的第一个10分钟，气体流速提高10%，然后返回到起始气体进料速率经50分钟。在下一小时内，气体流速降低10%经10分钟，然后回到起始气体进料速率再经50分钟。
发酵器在6 SCFM的起始气体进料速率下运行约1天。通过将气体进料速率每2小时降低0.1 SCFM，气体速率降低至5.4 SCFM。然后气体进料速率在5.4 SCFM下保持另外54小时。气体循环变化为20%提高和降低，经15分钟持续时间。发酵器在20%循环下运行另外76小时，没有任何困难。循环量级然后提高至50%，持续时间延伸至4小时和循环时间延伸至8小时。
10%和20%量级循环的性能显示在图5-10中。图5显示了在运行中的气体进料速率和气体停留时间。气体进料速率基于基础气体进料速率和气体停留时间基于每小时取样期间记录的气体进料速率。测量数据为每小时1次。如图5所示，当在循环时间期间测量时，在循环之后，气体停留时间稳定为具有恒定量级和频率有一些振动的平坦直线。当在循环期间测量时，在20%气体循环期间的振动量级比10%气体循环更高。
图6显示H2和CO转化率。该图包含在循环之前5天的取样。循环之前与循环之后相比，CO转化率更不规律。循环之前的H2转化率明显更不稳定，和z形的量级更宽且频率不规律。气体循环之后，H2转化率稳定在大约44%，具有规率的振动。
图7类似于图5所示的转化率，除了其还包含气体进料速率的影响。循环之前的CO吸收比循环之后更高，由于更高的气体进料速率。循环之后的H2吸收更高。
图8显示循环前后的产物浓度。通常，循环之后，乙醇浓度提高和乙酸浓度降低。
图9显示气体循环前后的理论生产率。理论生产率假定消耗的全部合成气用于乙醇生产。
图10显示实际生产率，其基于测量的液体产物浓度和液体流速，不是来自气体吸收的计算。
实现气体循环优点的另一个方法基于相同操作区域的平均值。表1列出了气体循环相对于无气体循环的平均CO和H2转化率和吸收以及理论生产率。表2列出了在相同时间段内的平均产物浓度和细胞浓度。约6 SCFM的合成气进料速率的10%循环使H2转化率由39-42%的范围提高至44.5%，但是仅稍微影响了CO转化率。这可稍微提高理论生产率。在扰动之后，有提高H2转化率和降低CO转化率的趋势。如果仅计算气体循环之前的前几个小时，H2转化率为约42.8%，仍低于循环之后的44.5%的平均值。CO转化率非常接近，为76.45%相对76.33%。如果基于没有循环的两个13小时，6 SCFM运行，平均H2转化率为38.92%和CO转化率为77.98%。10%循环降低了1.65%CO转化率，但是提高了约5.56%的H2转化率。理论生产率从128.06稍微提高至133.12 g/L天。无循环的平均乙醇和乙酸浓度为23.65和2.23g/L。循环将乙醇浓度提高至24.31g/L，并将乙酸浓度提高至2.83g/L。
在约5.4 SCFM的循环中优势更明显。不仅平均H2转化率更高，为44-45%相对33-42%，而且理论生产率更高，为124-125g/L天相对112.5-114g/L天。
循环量级由10至20%的改变仅稍微影响平均转化率率和生产率。CO转化率提高约0.85%和H2转化率降低约0.75%。平均乙醇浓度由24.72稍微提高至25.92 g/L，乙酸浓度由2.73降低至2.23g/L。
表1. 平均气体转化率、吸收和理论生产率。
持续时间，小时 基础气体，SCFM 循环% CO转化率% H2转化率% 理论STY，g/L天 CO吸收，毫摩尔/分钟 H2吸收，毫摩尔/分钟
17 5.4 0 77.55 41.81 114.09 1.406 0.404
31.5 5.4 0 78.68 32.65 112.49 1.404 0.318
13 6.0 0 78.25 39.37 134.98 1.607 0.433
42 6.3 0 79.34 28.72 131.79 1.690 0.330
58 6.1 0 78.85 34.31 121.77 1.633 0.375
1* 3.5-> 5 0 89.28 76.07 75.28 1.065 0.477
2* 5.0 -> 6.0 0 79.64 35.46 106.58 1.432 0.340
13 6.0 0 77.71 38.46 121.13 1.578 0.412
6# 6.0 0 76.76 41.85 127.61 1.558 0.447
3# 6.0 0 76.45 42.81 131.00 1.552 0.456
1# 6.0 0 76.34 42.16 131.61 1.547 0.448
14 6.0 10% 76.33 44.48 133.12 1.549 0.480
10 6.0 -> 5.4 10% 77.74 47.13 130.24 1.493 0.475
54 5.4 10% 78.57 44.88 123.88 1.433 0.434
76 5.4 20% 79.43 44.12 124.98 1.451 0.425
*转移气体中的扰动。气体进料速率下降至3.5 SCFM，和在1小时内提高回到5.0SCFM。在接下来的2小时内，气体流速缓慢提高至6.0 SCFM。
#仅使用气体循环之前几小时的数据。
表2. 平均产物和细胞浓度
持续时间，小时 基础气体，SCFM 循环% 细胞浓度，g/L ETOH浓度，g/L HAc浓度，g/L BTOH浓度，g/L
17 5.4 0 9.626 26.70 1.39 0.34
31.5 5.4 0 7.243 21.04 2.60 0.68
13 6.0 0 8.832 23.95 2.20 0.13
42 6.3 0 9.044 24.605 1.879 0.050
58 6.1 0 9.064 24.560 2.460 0.041
1* 3.5-> 5 0 8.413 22.17 3.35 0.18
2* 5.0 -> 6.0 0 8.446 22.365 2.975 0.1
13 6.0 0 9.35 23.355 2.255 0.028
6# 6.0 0 9.663 23.225 2.405 0.025
3# 6.0 0 9.728 23.16 2.50 0.02
14 6.0 10% 10.329 24.307 2.830 0.031
10 6.0 -> 5.4 10% 10.306 24.144 2.878 0.030
54 5.4 10% 8.80 24.724 2.729 0.040
76 5.4 20% 8.934 25.924 2.228 0.042
*转移气体中的扰动。气体进料速率下降至3.5 SCFM，和在1小时内提高回到5.0SCFM。在接下来的2小时内，气体流速缓慢提高至6.0 SCFM。
#仅使用气体循环之前几小时的数据。
虽然已经通过具体的实施方案、实施例和它们的应用描述本文公开的发明，但在不离开权利要求所阐述的本发明范围的情况下，本领域技术人员可由对此作出许多改进和变化。

Claims (5)

1.使含CO底物发酵的方法，所述方法包含：
将所述含CO底物提供至发酵器；和
用产乙酸菌发酵所述含CO底物，
其中在获得目标CO进料速率之后，将CO进料速率在所述目标CO进料速率的4-7个标准偏差的范围内循环，经过总发酵时间的至少1％-20％，其中所述目标CO进料速率为4-9标准立方英尺/分钟，并且循环包括每小时增加和降低所述CO进料速率至少一次，
其中所述CO进料速率保持0.25mM或更少的发酵培养基中的溶解CO浓度，和所述发酵方法提供10g总醇/(L·天)或更高的空时产率，
其中所述溶解的CO浓度通过以下保持：
a)将通往发酵的所述目标CO进料速率降低所述目标CO进料速率的25％-35％，以提供第一降低CO进料速率，并保持所述第一降低CO进料速率1-10分钟；
b)提高通往发酵的所述第一降低CO进料速率以提供降低所述目标CO进料速率的15％-25％的第二降低CO进料速率，并保持所述第二降低进料速率1-5分钟；
c)提高通往发酵的所述第二降低CO进料速率以提供降低所述目标CO进料速率的5％-15％的第三降低CO进料速率，并保持所述第三降低进料速率1-5分钟；和
d)将所述第三降低CO进料速率提高至所述目标进料速率或更高。
2.权利要求1的方法，其中所述目标CO进料速率有效提供目标细胞密度。
3.权利要求2的方法，其中所述目标细胞密度为3g/L-30g/L。
4.权利要求1的方法，其中提供至所述发酵器的所述含CO底物具有0.75或更高的CO/CO2摩尔比。
5.权利要求1的方法，其中所述产乙酸菌选自凯伍产醋菌(Acetogeniumkivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobiumnoterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴奇嗜碱菌(Alkalibaculumbacchi)CP11ATCCBAA-1772、产生性布洛提菌(Blautiaproducta)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneous)、太平洋地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneouspacificus)、产氢羧基嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)、醋酸杆菌(Clostridiumaceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)；自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)DSM19630,DSMZ德国；自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)DSM10061,DSMZ德国；自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)DSM23693,DSMZ德国；自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)DSM24138,DSMZ德国；食羧基梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)P7ATCCPTA-7827、克氏梭菌(Clostridiumcoskatii)ATCCPTA-10522、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)PETCATCC49587、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ERI2ATCC55380、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)C-01ATCC55988、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)O-52ATCC55889、大梭菌(Clostridiummagnum)；巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)DSM525,DSMZ德国；拉格利梭菌(Clostridiumragsdali)P11ATCCBAA-622、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridiumultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热乙酸穆尔氏菌(Morrellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬妮产醋杆菌(Oxobacterpfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcusproductus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)及它们的混合物。
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