CN110791531B - 在厌氧发酵中控制电导率 - Google Patents

在厌氧发酵中控制电导率 Download PDF

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Abstract

提供了在含有CO的气态底物的发酵期间有效控制培养基电导率同时提供约10 g乙醇/(L·天)或更多的STY的方法。所述方法包括平衡培养基电导率、比碳吸收或细胞密度水平。

Description

在厌氧发酵中控制电导率
本申请是申请日为2014年6月5日，中国国家申请号为201480032866.9，发明名称为“在厌氧发酵中控制电导率”的发明申请的分案申请。
本申请要求2013年6月10日提交的美国临时申请61/833,189的权益，其通过引用而全文结合到本文中。
提供了在合成气发酵期间控制电导率和保持约10 g乙醇/(L·天)或更多的STY的方法。更具体地，用于控制电导率的方法包括平衡培养基电导率、比碳吸收或细胞密度。
背景
厌氧微生物可通过气态底物的发酵由CO产生乙醇。利用来自梭状芽孢杆菌(Clostridium)属的厌氧微生物的发酵产生乙醇和其它有用的产物。例如，美国专利5,173,429描述杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ATCC No. 49587，一种由合成气体产生乙醇和乙酸盐的厌氧产乙酸微生物。美国专利5,807,722描述了利用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 55380用于将废气转化为有机酸和醇的方法和设备。美国专利6,136,577描述了利用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 55988和55989用于将废气转化为乙醇的方法和设备。
产乙酸菌需要恒定的营养物进料用于稳定的性能和乙醇生产率。较高的生产率水平可能需要使用更加浓缩的培养基以提供有效量的营养物。使用更加浓缩的培养基导致具有较高的离子强度的发酵培养液。较高的离子强度对培养物性能引起有害的影响。
概述
提供了在含有CO的气态底物的发酵期间有效控制培养基电导率同时提供约10 g乙醇/(L·天)或更多的STY的方法。所述方法包括平衡培养基电导率、比碳吸收或细胞密度水平。
用于发酵含有CO的气态底物的方法包括向发酵培养基提供含有CO的气态底物。在一方面，所述方法包括根据公式保持电导率对于比碳吸收(SCU，以mmol/分钟/g干细胞计)的关系，其中SCU=SCUmax – F*电导率，其中SCUmax=0-3，并且F=0-1。发酵培养基具有约30mS/cm或更少的电导率，并且所述方法有效保持约10 g乙醇/(L·天)或更多的STY。
用于发酵含有CO的气态底物的方法包括向发酵培养基提供含有CO的气态底物和发酵所述合成气。所述方法还包括根据公式保持对于比气体进料速率(x)的电导率(y)，其中y=-6.0327x+12.901，直至达到目标细胞密度，其中x为约0.2-约0.7 mmol/分钟/g细胞。在另一方面，所述方法包括保持细胞密度高于目标细胞密度，和保持约30 mS/cm或更少的电导率。所述方法有效保持约10 g乙醇/(L·天)或更多的STY。
一种用于含有CO的气态底物的发酵的方法包括在包括发酵培养基的反应器容器中引入含有CO的气态底物，和发酵所述含有CO的气态底物。在所述方法的一方面，发酵培养基中的至少一个或多个氯离子被选自氢氧根、乙酸根、碳酸根、碳酸氢根和它们的混合物的离子替代，其量有效提供约30 mS/cm或更少的电导率。所述方法有效保持约10 g乙醇/(L·天)或更多的STY。
附图简述
由下图，所述方法的若干方面的以上和其它方面、特征和优点将更加显而易见。
图1说明在1x生长培养基和25 ml/分钟合成气进料速率中杨氏梭菌的生长。
图2说明在1x生长培养基和35 ml/分钟合成气进料速率中杨氏梭菌的生长。
图3说明在1x生长培养基和40 ml/分钟合成气进料速率中杨氏梭菌的生长。
图4说明在1x生长培养基和45 ml/分钟合成气进料速率中杨氏梭菌的生长。
图5说明在1x生长培养基和50 ml/分钟合成气进料速率中杨氏梭菌的生长。
图6说明在1x生长培养基和50 ml/分钟合成气进料速率中在较高的初始接种物下的杨氏梭菌生长。
图7说明在1.5x生长培养基和45 ml/分钟合成气进料速率中在较高的初始接种物下的杨氏梭菌生长。
图8说明在1.5x生长培养基和35 ml/分钟合成气进料速率中在较高的初始接种物下的杨氏梭菌生长。
图9说明在1.5x生长培养基和30 ml/分钟合成气进料速率中在较高的初始接种物下的杨氏梭菌生长。
图10说明在1.5x生长培养基20 ml/分钟合成气进料速率中在较高的初始接种物下的杨氏梭菌生长。
图11显示在含有氯化铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收。
图12显示在含有氯化铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率。
图13说明含有l-赖氨酸的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收。
图14说明含有l-赖氨酸的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率。
图15显示含有l-赖氨酸的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率。
图16显示在含有乙酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收。
图17说明在含有乙酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率。
图18说明在含有乙酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率。
图19显示在含有碳酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收。
图20显示在含有碳酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率。
图21说明在含有碳酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率。
图22说明在具有碳酸铵作为碱的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收。
图23显示在具有碳酸铵作为碱的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率。
图24显示在具有碳酸铵作为碱的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率。
在具有碳酸氢铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图25。
在具有碳酸氢铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率示于图26。
在具有碳酸氢铵的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率示于图27。
图28说明逐步提高培养基电导率对杨氏梭菌性能的影响。
图29说明逐步提高培养基电导率对杨氏梭菌性能的影响。
图30显示在杨氏梭菌的发酵期间比CO进料速率和电导率之间的关系。
图31显示在杨氏梭菌的发酵期间比碳吸收和电导率之间的关系。
在数个附图中相应的附图标记始终指示相应的组分。专业技术人员认识到图中的要素为了简化和清楚而说明，并且不必然按比例绘制。例如，图中的一些要素的尺寸可能相对于其它要素放大，以帮助改进本发明的方法和设备的各方面的理解。同样，在工业可行的方面有用或必要的常用但是充分理解的要素通常不描述，以便促进对这些各方面的较少混淆的观察。
详述
以下描述不是采用限制性含义，而是仅用于描述示例性实施方案的通用原则的目的。本发明的范围应参考权利要求来确定。
在具有本文描述培养基和产乙酸菌的生物反应器中进行的合成气发酵有效提供合成气中的CO转化为醇和其它产物。控制电导率、电导率和细胞密度有效提供高生产率水平。在该方面，醇生产率可表述为STY (空时收率，表述为g乙醇/(L·天) )。在该方面，所述方法有效提供至少约10 g乙醇/(L·天)的STY (空时收率)。可能的STY值包括约10 g乙醇/(L·天)-约200 g乙醇/(L·天)，在另一方面，约10 g乙醇/(L·天)-约160 g乙醇/(L·天)，在另一方面，约10 g乙醇/(L·天)-约120 g乙醇/(L·天)，在另一方面，约10 g乙醇/(L·天)-约80 g乙醇/(L·天)，在另一方面，约20 g乙醇/(L·天)-约140 g乙醇/(L·天)，在另一方面，约20 g乙醇/(L·天)-约100 g乙醇/(L·天)，在另一方面，约40 g乙醇/(L·天)-约140 g乙醇/(L·天)，和在另一方面，约40 g乙醇/(L·天)-约100 g乙醇/(L·天)。
定义
除非另外限定，否则从始至终在本说明书中用于本公开的以下术语如下定义，并且可包括以下限定的定义的单数或复数形式：
修饰任何量的术语“约”指在实际的条件下遇到的该量的变动，例如，在实验室、中试或生产设备中。例如，当被“约”修饰时，用于混合物或量的成分或测量的量包括在实验条件下在生产设备中或在实验室中通常用于测量的关注的变动和程度。例如，当被“约”修饰时，产品的组分的量包括在设备中或在实验室中在多个实验的批次之间的变动以及在分析方法中固有的变动。无论是否被“约”修饰，该量包括那些量的等价物。本文陈述的和被“约”修饰的任何量也可用于本公开作为不被“约”修饰的量。
“电导率”和“平均电导率”指传导电的能力。水传导电，因为其含有携带电荷的溶解的固体。例如，氯离子、硝酸根和硫酸根携带负电荷，而钠、镁和钙携带正电荷。这些溶解的固体影响水传导电的能力。电导率通过在两个电极之间施加电压的探针测量。电压降用于测量水的电阻，其随后转换为电导率。平均电导率可通过已知的技术和方法来测量。平均电导率测量的一些实例在ASTM D1125，“用于电导率和水的电阻率的标准测试方法”和“用于检验水和废水的标准方法”，1999，American Public Health Association，AmericanWater Works Association，Water Environment Federation中提供，两者均通过引用结合到本文中。
术语“合成气”或“合成气体”表示对于含有不同量的一氧化碳和氢的气体混合物命名的合成气体。生产方法的实例包括天然气或烃的蒸汽重整以产生氢，煤的气化和一些类型的废物至能量气化设备。该名字来自它们在产生合成天然气(SNG)和用于生产氨或甲醇中用作中间体。合成气可燃并且通常用作燃料来源或用作用于生产其它化学品的中间体。
术语“发酵”、发酵过程”或“发酵反应”等旨在包括过程的生长阶段和产物生物合成阶段二者。在一方面，发酵指CO转化为醇。
术语“细胞密度”指每单位体积的发酵培养液中微生物细胞的质量，例如，克/升。在该方面，所述方法和培养基有效提供至少约1.0 g/L的细胞密度。
术语“细胞再循环”指微生物细胞与发酵培养液分离，并且那些已分离的微生物细胞的全部或部分返回至发酵器。通常，过滤装置用于完成分离。
术语"发酵器"、“反应器容器”或“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道装置组成的发酵装置，其包括连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定单元反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、泡罩塔、气体上升发酵器、膜反应器例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)、静态搅拌器或适用于气-液接触的其它容器或其它装置。
含有CO的底物
含有CO的底物可包括包括CO的任何气体。在该方面，含有CO的气体可包括合成气、工业用气和它们的混合物。
合成气可由任何已知的来源提供。在一方面，合成气可源自碳质材料的气化。气化涉及在限制供应的氧中部分燃烧生物质。所得到的气体主要包括CO和H2。在该方面，合成气将含有至少约10 mol % CO，在一方面，至少约20 mol %，在一方面，约10-约100 mol %，在另一方面，约20-约100 mol % CO，在另一方面，约30-约90 mol % CO，在另一方面，约40-约80 mol % CO，和在另一方面，约50-约70 mol % CO。合适的气化方法和设备的一些实例在均在2011年4月6日提交的美国序列号61/516,667、61/516,704和61/516,646和均在2012年3月22日提交的美国序列号13/427,144、13/427,193和13/427,247中提供，均通过引用结合到本文中。
在另一方面，所述方法适用于支持由气态底物(例如高体积含有CO的工业烟道气)生产醇。在一些方面，包括CO的气体源自含碳废物(例如，工业废气)或源自其它废物的气化。因此，所述方法代表用于捕集原本排放至环境的碳的有效方法。工业烟道气的实例包括在黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造期间产生的气体。
取决于含有CO的底物的组成，含有CO的底物可直接提供至发酵过程或可进一步改性以包括合适的H2:CO摩尔比。在一方面，提供至发酵器的含有CO的底物的H2:CO摩尔比为约0.2或更多，在另一方面，约0.25或更多，和在另一方面，约0.5或更多。在另一方面，提供至发酵器的含有CO的底物可包括约40摩尔%或更多的CO加上H2和约30摩尔%或更少的CO，在另一方面，约50摩尔%或更多的CO加上H2和约35摩尔%或更少的CO，和在另一方面，约80摩尔%或更多的CO加上H2和约20摩尔%或更少的CO。
在一方面，含有CO的底物主要包括CO和H2。在该方面，含有CO的底物将含有至少约10 mol % CO，在一方面，至少约20 mol %，在一方面，约10-约100 mol %，在另一方面，约20-约100 mol % CO，在另一方面，约30-约90 mol % CO，在另一方面，约40-约80 mol %CO，和在另一方面，约50-约70 mol % CO。含有CO的底物的CO/CO2比率为至少约0.75，在另一方面，至少约1.0，和在另一方面，至少约1.5。
在一方面，气体分离器设置以基本上分离至少一部分气体流，其中该部分包括一种或多种组分。例如，气体分离器可由包含以下组分CO、CO2、H2的气体流分离CO2，其中可将CO2通向CO2去除器，剩余的气体流(包含CO和H2)可通向生物反应器。可利用本领域已知的任何气体分离器。在该方面，提供至发酵器的合成气将具有约10 mol %或更少的CO2，在另一方面，约1 mol %或更少的CO2，和在另一方面，约0.1 mol %或更少的CO2。
某些气体流可包括高浓度的CO和低浓度的H2。在一方面，可期望优化底物流的组成，以实现较高效率的醇生产和/或总体碳捕集。例如，在将流通向生物反应器之前可提高底物流中H2的浓度。
根据本发明的具体的方面，可将来自两个或更多个来源的流合并和/或共混，以产生期望的和/或优化的底物流。例如，包含高浓度的CO的流(例如来自轧钢机转化炉的排气)可与包含高浓度的H2的流(例如来自轧钢机焦炭炉的尾气)合并。
取决于含有CO的气态底物的组成，还可期望在将其引入到发酵之前进行处理以除去任何不期望的杂质，例如灰尘颗粒。例如，可利用已知的方法过滤或洗涤气态底物。
生物反应器设计和操作
发酵器设计的说明描述于均在2012年5月15日提交的美国序列号13/471,827和13/471,858和2012年5月16日提交的美国序列号13/473,167，均通过引用结合到本文中。
根据一方面，通过向反应器容器加入培养基，开始发酵过程。培养基组成的一些实例描述于2012年5月22日提交的美国序列号61/650,098和61/650,093和2001年7月23日提交的美国专利7,285,402，均通过引用结合到本文中。可将培养基灭菌以除去不期望的微生物，并且反应器用期望的微生物接种。可能不总是需要灭菌。
在一个方面，所用微生物包括产乙酸菌。可用产乙酸菌的实例包括梭菌属(Clostridium)产乙酸菌，例如杨氏梭菌(lostridium ljungdahlii)菌株，包括WO 2000/68407、EP 117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 1998/00558和WO2002/08438中所述的那些菌株；自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSMZ的DSM 10061和DSM 19630, 德国)菌株，包括WO 2007/117157和WO 2009/151342中所述的那些菌株；和拉格利梭菌(Clostridium ragsdali)(P11, ATCC BAA-622)及巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi)(CP11, ATCC BAA-1772)，包括分别描述于美国专利7,704,723和“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”(来自生物质产生的合成气的生物燃料和生物产物), Hasan Atiyeh, 提出于Oklahoma EPSCoR AnnualState Conference, 2010年4月29日的那些菌株；及食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans) (ATCC PTA-7827)，描述于美国专利申请2007/0276447。其它适用的微生物包括穆尔菌(Moorella)属，包括穆尔菌种(Moorella sp. ) HUC22-1；和羧基嗜热菌(Carboxydothermus)属。这些文献分别通过引用结合到本文中。可使用两种或更多种微生物的混合培养物。
有用的细菌的一些实例包括凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi) CP11(ATCC BAA-1772)、产生性布洛提菌(Blautia producta)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、产氢羧基嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸杆菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)P262 (德国DSMZ之DSM 19630)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ之DSM 19630)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ之DSM 10061)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ之DSM 23693)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ之DSM 24138)、食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans)P7(ATCC PTA-7827)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC(ATCC 49587)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ERI2(ATCC 55380)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-01(ATCC 55988)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) O-52(ATCC55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum (德国DSMZ之DSM 525)、拉格利梭菌(Clostridium ragsdali) P11(ATCC BAA-622)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridiumultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热乙酸穆尔氏菌(Morrella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬妮产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)及它们的混合物。
发酵应期望在发生期望的发酵(例如，CO至乙醇)的适当的条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果利用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、最大气体底物浓度，以确保液相中的CO不会变为限制性，且确保最大产物浓度以避免产物抑制。
本发明的方法可用于维持微生物培养物的生存能力，其中微生物培养物为CO受限，使得CO传递到溶液中的速率低于培养物的吸收速率。当包含CO的底物不能连续提供至微生物培养物时，可出现这种情况；传质速率低；或在底物流中存在不足够的CO以在优化的温度下维持培养物活力。在这样的实施方式中，微生物培养物将快速耗尽在液体营养培养基中溶解的CO，并且由于其它底物不能足够快速提供而变得底物受限。
启动：在接种后，建立有效供应初始微生物群落的初始进料气体供应速率。分析流出物气体，以测定流出物气体的含量。气体分析的结果用于控制进料气体速率。在该方面，所述方法可提供约0.5-约0.9的计算CO浓度:初始细胞密度比率，在另一方面，约0.6-约0.8，在另一方面，约0.5-约0.7，和在另一方面，约0.5-约0.6。
在另一方面，发酵方法包括向发酵培养基提供合成气，其量有效提供在发酵培养基中约0.15 mM-约0.70 mM的初始计算CO浓度，在另一方面，约0.15 mM-约0.50 mM，在另一方面，约0.15 mM-约0.35 mM，在另一方面，约0.20 mM-约0.30 mM，和在另一方面，约0.23mM-约0.27 mM。与起始细胞密度相比，所述方法有效提高细胞密度。
在一方面，用于发酵含有CO的气态底物的方法包括向发酵培养基提供含有CO的气态底物，和根据公式保持对于比碳吸收(SCU，以mmol/分钟/g干细胞计)的电导率，其中SCU=SCUmax – F*电导率，其中SCUmax=0-3，并且F=0-1。图31用图表说明该等式。在该方面，发酵培养基具有约30 mS/cm或更少的电导率，在其它方面，可具有本文描述的电导率。在另一方面，F (其为线的斜率)可为0-1，在另一方面，0.05-1，在另一方面，0.1-1，在另一方面，0.2-1，在另一方面，0.3-1，在另一方面，0.4-1，和在另一方面，0.5-1。
在一方面，所述方法包括根据公式y=-10.109x+14.2保持对于比气体进料速率(x)的电导率(y)，直至达到目标细胞密度。图30用图表说明该等式。在该方面，发酵培养基具有约30 mS/cm或更少的电导率，在其它方面，可具有本文描述的电导率。在该方面，x为约0.2-约0.7 mmol/分钟/g细胞。在另一方面，x为约0.3-约0.6 mmol/分钟/g细胞，和在另一方面，x为约0.4-约0.5 mmol/分钟/g细胞。
在另一方面，所述方法有效提供约3-约30 g/L的目标细胞密度，在另一方面，约4-约25 g/L，在另一方面，约5-约25 g/L，在另一方面，约7-约25 g/L，在另一方面，约10-约25g/L，在另一方面，约12-约20 g/L，和在另一方面，约15-约20 g/L。
启动后：在达到期望的水平后，从反应器取出液相和细胞材料并且补充培养基。所述方法有效提高细胞密度至约2.0 克/升或更多，在另一方面，约2-约30 克/升，在另一方面，约2-约25 克/升，在另一方面，约2-约20 克/升，在另一方面，约2-约10 克/升，在另一方面，约2-约8 克/升，在另一方面，约3-约30 克/升，在另一方面，约3-约6 克/升，和在另一方面，约4-约5 克/升。
在达到目标细胞密度后，所述方法有效保持细胞密度。细胞密度可通过细胞再循环保持。所述方法可利用细胞再循环来提高或降低在反应器内的细胞浓度。在该方面，将来自反应器的液体流出物送至细胞分离器，在此细胞和渗透物分离。可将细胞送回至反应器。细胞密度可通过再循环过滤器来控制。生物反应器和细胞再循环的一些实例描述于2011年6月30日提交的美国序列号61/571,654和61/571,565、2011年9月13日提交的美国序列号61/573,845、2012年5月15日提交的美国序列号13/471,827和13/471,858和2012年5月16日提交的美国序列号13/473,167，均通过引用结合到本文中。
在一方面，所述方法有效保持约25%或更多的H2转化率。在另一方面，所述方法有效保持约25%-约95%的H2转化率，在另一方面，约30%-约90%，在另一方面，约35%-约85%，在另一方面，约40%-约80%，在另一方面，约40%-约70%，在另一方面，约40%-约60%，和在另一方面，约40%-约50%。
在另一方面，所述方法有效保持CO吸收在约0.001-约10 mmol/分钟/g干细胞范围。在另一方面，所述方法有效保持CO吸收在约0.001-约5 mmol/分钟/g干细胞范围，在另一方面，约0.001-约4 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.001-约3 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.001-约2 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.001-约1 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.05-约9 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.05-约5 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.05-约4 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.05-约3mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.05-约2 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约0.05-约1 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约1-约8 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约1-约5mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约1-约4 mmol/分钟/g干细胞，在另一方面，约1-约3mmol/分钟/g干细胞，和在另一方面，约1-约2 mmol/分钟/g干细胞。
在一方面，所述方法有效提供约5-约99%的CO转化率。在另一方面，CO转化率为约10-约90%，在另一方面，约20-约80%，在另一方面，约30-约70%，在另一方面，约40-约60%，在另一方面，约50-约95%，在另一方面，约60-约95%，在另一方面，约70-约95%，和在另一方面，约80-约95%。
控制培养基电导率
使用配制以具有较低电导率和/或通过稀释调节培养基电导率的培养基有效控制培养基电导率。在一方面，所述方法有效提供约30 mS/cm或更少的平均电导率，在另一方面，约25 mS/cm或更少，在另一方面，约20 mS/cm或更少，在另一方面，16 mS/cm或更少，在另一方面，约12 mS/cm或更少，在另一方面，约8 mS/cm或更少，在另一方面，约6.5 mS/cm或更少，在另一方面，约6.0 mS/cm或更少，在另一方面，约5.5 mS/cm或更少，在另一方面，约5.0 mS/cm或更少，在另一方面，约4.7 mS/cm或更少，在另一方面，约4.5 mS/cm或更少，在另一方面，约4.0 mS/cm-约6.5 mS/cm，在另一方面，约5.0 mS/cm-约6.0 mS/cm，和在另一方面，约4.0 mS/cm-约5.0 mS/cm。
根据一方面，通过向反应器容器加入合适的培养基，开始发酵过程。包含在反应器容器中的液体可包括任何类型的合适的营养培养基或发酵培养基。营养培养基包括有效允许使用的微生物生长的维生素和矿物质。适用于利用CO作为碳源发酵乙醇的厌氧培养基为已知的。合适的发酵培养基的一个实例描述于美国专利7,285,402，其通过引用结合到本文中。合适的培养基的其它实例描述于均在2012年5月22日提交的美国序列号61/650,098和61/650,093，均通过引用结合到本文中。在一方面，所用的培养基包括小于约0.01 g/L酵母提取物和小于约0.01 g/L碳水化合物。
替代氯离子：在一方面，通过用非氯离子替代培养基中的氯离子，所述方法提供平均电导率小于约30 mS/cm的培养基。更具体地，氯化铵可被选自氢氧化铵、乙酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵及它们的混合物的氮源替代。
在一方面，培养基包括至少一种或多种氮源、至少一种或多种磷源和至少一种或多种钾源。培养基可包括这三个中的任何一个、这三个的任何组合，和在一个重要的方面，包括所有这三个。磷源可包括选自磷酸、磷酸铵、磷酸钾和它们的混合物的磷源。钾源可包括选自氯化钾、磷酸钾、硝酸钾、硫酸钾和它们的混合物的钾源。
在一方面，培养基包括铁、钨、镍、钴、镁、硫和硫胺中的一种或多种。培养基可包括这些组分中的任何一个、任何组合，和在一个重要的方面，包括所有这些组分。铁可包括选自氯化亚铁、硫酸亚铁和它们的混合物的铁源。钨源可包括选自钨酸钠、钨酸钙、钨酸钾和它们的混合物的钨源。镍源可包括选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍和它们的混合物的镍来源。钴来源可包括选自氯化钴、氟化钴、溴化钴、碘化钴和它们的混合物的钴源。镁源可包括选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁和它们的混合物的镁源。硫源可包括半胱氨酸、硫化钠和它们的混合物。
各种组分的浓度如下：
过程操作保持pH在约4.2-约4.8范围。培养基包括小于约0.01 g/L酵母提取物和小于约0.01 g/L碳水化合物。
在另一方面，通过稀释培养基，所述方法控制培养基电导率。在该方面，一旦发酵达到约30 mS/cm的电导率，所述方法包括向发酵物加入水或低电导率培养基，其量有效降低培养基电导率。
实施例
实施例1：电导率对生长的影响
杨氏梭菌在生物反应器(New Brunswick BioFlo I或IIc)中生长。进行以下调节：
通过调节生长培养基的强度，例如所有组分的浓度，调节培养物的电导率，除了生长培养基中的维生素提高为1.5倍，以将培养物的电导率从约7 mS提高至约9.5 mS。
所有实验由0.38 (+/- 0.02)或0.48 g/L的初始细胞密度开始。
在整个实验中，每一个实验的初始气体流速保持不变。当在成功的启动后CO转化率值达到平台时，反应器参数用于计算相关条件的KLa。
合成气组成为30% CO、15% H2、10% CO2和45% N2。
生物反应器试验#1：1x生长培养基和25 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。如在图1中显示的，在约20小时的初始停滞阶段后，细菌开始以约20小时的倍增时间繁殖。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.22 mmol。(D CO：在反应器培养液中溶解的CO浓度，CD：细胞密度，SCU：比CO吸收)
生物反应器试验#2：1x生长培养基和35 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。如在图2中显示的，在约36小时的初始停滞阶段后，细菌开始以约20小时的倍增时间繁殖。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.22 mmol。
生物反应器试验#3：1x生长培养基和40 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。如在图3中显示的，在约45小时的初始停滞阶段后，细菌开始以约20小时的倍增时间繁殖。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.22 mmol。
生物反应器试验#4：1x生长培养基和45 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。如在图4中显示的，在约50小时的初始停滞阶段后，细菌开始以约20小时的倍增时间繁殖。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.17 mmol。
生物反应器试验#5：1x生长培养基和50 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。如在图5中显示的，即使在接种后约70小时，培养物继续停滞。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.23 mmol。
生物反应器试验#6：1x生长培养基和50 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。该实验由4.8 g/L细菌的接种物开始。如在图6中显示的，在约10小时的初始停滞阶段后，细菌开始以约20小时的倍增时间繁殖。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.12 mmol。
生物反应器试验#7：1.5x生长培养基和45 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。该实验由3.8 g/L细菌的接种物开始。如在图7中显示的，细菌细胞密度随着时间下降。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.25 mmol。
生物反应器试验#8：1.5x生长培养基和35 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。该实验由3.8 g/L细菌的接种物开始。如在图8中显示的，细菌细胞密度随着时间下降。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.22 mmol。
生物反应器试验#9：1.5x生长培养基和30 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。该实验由3.8 g/L细菌的接种物开始。如在图9中显示的，细菌细胞密度随着时间下降。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.22 mmol。
生物反应器试验#10：1.5x生长培养基和20 ml/分钟合成气进料速率用于该实验。该实验由3.8 g/L细菌的接种物开始。如在图10中显示的，细菌细胞密度随着时间上升并且达到约20小时的倍增时间。在反应器培养液中最大计算溶解CO为约0.22 mmol。
实施例2：以备选氮源生长
杨氏梭菌C-01在具有以下培养基的生物反应器(BioFlo/CelliGen 115)中生长。
对于每一个实验，从培养基中省略NH4Cl，并且用摩尔当量的以下描述的含氮化合物中的一种代替。
将这些培养基的pH调节至~4.0-4.4。通过利用0.25M (24.02 g/L)和0.125M(12.01 g/L)两种浓度，还测试碳酸铵作为碱溶液作为7.7% NaHCO3的替代物。
在含有氯化铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图11。
在含有氯化铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率示于图12。
含有l-赖氨酸的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图13。
在含有l-赖氨酸的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率示于图14。
在含有l-赖氨酸的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率示于图15。
在含有乙酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图16。
在含有乙酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率示于图17。
在含有乙酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率示于图18。
在含有碳酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图19。
在含有碳酸铵的培养基中生长的CL的比乙醇生产率示于图20。
在含有碳酸铵的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率示于图21。
在具有碳酸铵作为碱的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图22。
在具有碳酸铵作为碱的培养基中生长的CL的比乙醇生产率示于图23。
在具有碳酸铵作为碱的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率示于图24。
在具有碳酸氢铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比碳吸收示于图25。
在具有碳酸氢铵的培养基中生长的杨氏梭菌的比乙醇生产率示于图26。
在具有碳酸氢铵的培养基中生长的杨氏梭菌的电导率示于图27。
下表汇总结果。
比碳吸收和比乙醇生产率
发酵器培养基的电导率(mS/cm)
*使用来自赖氨酸实验的初始值(8.07 mS/cm)作为基线值。
**省略接近实验开始时的边远测量结果。
铵离子浓度
结果指示含氮化合物(尤其是含有铵离子的那些)可用作氯化铵的替代物。用于培养基的L-赖氨酸不能成功地作为氮源以得到高性能。赖氨酸的使用导致初始增加比碳吸收(SCU)和比乙醇生产率(SEP)二者，但是最终导致这两种度量显著下降。SCU的原始值降低58%，而SEP的原始值降低47%。平均SCU降低26%，显著改变。平均SEP提高12%，但是由于非常大的标准偏差，该提高不是统计显著的。在实验过程期间，细胞密度从2.03 g/l降低至1.02g/l。电导率原始值降低71%，从8.07 mS/cm至2.30 mS/cm，在实验过程期间随时间的平均值为3.291 mS/cm。在该实验中大多数时间，电导率小于3.0 mS/cm。
乙酸铵作为氮源在培养基中导致平均SCU仅11%的稍微提高，这不是统计显著的值。然而，SCU的原始值从开始至实验结束时降低(0.943相对0.830)，12%的下降。当与基线平均值相比时，平均SEP存在37%的显著提高。在实验期间SEP的原始值从6.43提高至8.57，有25%的提高。在该实验期间电导率降低58%，至3.32 mS/cm的低值(利用来自赖氨酸实验的初始值作为在PP-A1培养基中电导率的基线)，平均值为4.027 mS/cm。对于大多数实验，电导率值小于4.0。
当碳酸铵用于培养基作为氮来源时，观察到SCU和SEP二者显著提高。SCU提高19%，并且SEP提高57%。在实验期间SCU和SEP的原始值分别降低15%和23%。在该实验期间电导率降低46%，至4.33 mS/cm的低值，平均值为4.839 mS/cm。
通过从培养基配方中省略碳酸铵并且改为利用其作为碱溶液，还测试碳酸铵作为氮源。相对基线，供应碳酸铵的该方法导致SCU (19%)和SEP (41%)的总体显著提高。使用两种不同浓度的碳酸铵，0.25M和0.125M，并且对于每一种，存在稍微不同的结果。比起反应器基线，每一种浓度得到显著较高的SCU和SEP。对于两种测量的度量，每一种碱浓度导致稍微不同的值，但是这些测量的标准偏差彼此重叠。通过两种碱溶液，使电导率降低71%(0.25M)和78% (0.125M)，至2.34 mS/cm和1.77 mS/cm的相应的低值。平均值分别为3.065mS/cm和1.982 mS/cm。恰好在碳酸铵作为碱实验之前和在整个持续时间内，测量在反应器中铵离子的浓度。这些测量的结果显示在实验期间反应器供应有过量的铵离子(50-62%)。
还测试碳酸氢铵作为培养基的添加剂。实验数据显示SCU和SEP二者存在显著提高。平均SCU提高，超过基线19%，而平均SEP提高，超过基线53%。在该实验期间电导率降低50%，至4.02 mS/cm的低值，平均值为4.3 mS/cm。在实验的该阶段期间，还监测铵离子浓度。该值显示在反应器中离子过量26%。
实施例3：逐步提高克分子渗透浓度对培养物性能的影响
杨氏梭菌C-01在具有以下培养基的生物反应器(BioFlo/CelliGen 115)中生长。平均培养基流量/g细胞为1 mL/g/分钟。
在该21天实验中，利用NaCl提高培养物培养液的电导率。根据以下时间表，NaCl以给定间隔的每次加入示于图28。
在每次加入后的NaCl浓度。
随着每次加入NaCl，培养物的电导率上升。在整个实验期间测量比碳吸收(SCU)，这是培养物活性的指标。图28显示随着每一次NaCl加入，SCU在一定的时间段减少，但是在短的适应阶段后恢复。
图28可分成三个关注的区域：0-500小时(1)，500-1100小时(2)，和1100-1200小时。区域1，其中电导率小于15 mS/cm，显示加入NaCl对SCU具有较少的影响：仅少量损失SCU，接着完全恢复。区域2，其中电导率超过15 mS/cm，显示加入NaCl对SCU具有较高的影响：SCU大的摆动。在该区域中，NaCl加入引起SCU大的下降，接着大的向上摆动。在最后的区域中，当电导率上升至约30 mS/cm或更高时，培养物失去其活性。
实施例4：快速提高克分子渗透浓度对培养物性能的影响
使用如在实施例3中描述的相同的培养基，杨氏梭菌C-01在生物反应器(BioFlo/CelliGen 115)中生长。平均培养基流量/g细胞为1.1 mL/g/分钟。
在该10天实验中，根据以下时间表，在培养液中NaCl浓度以实施例3中NaCl浓度提高速率的两倍快提高。
在每次加入后的NaCl浓度。
图29显示在不同的电导率下培养物的SCU。如在实施例3中，一旦培养物的电导率达到约30 mS/cm，培养物失去其活性。
实施例5：CO进料速率对电导率的影响
使用如在实施例3中描述的相同的培养基，杨氏梭菌C-01在生物反应器(BioFlo/CelliGen 115)中生长。
通过调节生长培养基的强度，例如所有组分的浓度，调节培养物的电导率，除了生长培养基中的维生素提高为1.5和2倍，以分别将培养物的电导率从约7 mS提高至约9.5 mS和约12 mS。
由0.38 (+/- 0.02)或0.785 g/L的初始细胞密度开始实验。合成气组成为30%CO、15% H2、10% CO2和45% N2。在每一种给定的培养物电导率下进行数个启动实验，以测定对于给定的培养物电导率适当的(可在实践中使用的)比气体进料速率。通过这些实验，对于给定的培养物电导率，确定适当的气体进料速率。如在图30中说明的，针对培养物电导率绘制适当的/函数CO进料速率，其中
y=-6.0327x+12.901
比CO进料速率=CO的摩尔量/g细胞
适当的/函数CO进料速率=C-01可在40小时内倍增的CO进料速率。
虽然已借助具体的实施方式、实施例及其应用描述了本文公开的本发明，但是在不偏离在权利要求阐述的本发明的范围下，本领域技术人员可以进行许多修改和变化。

Claims (5)

1.一种用于发酵含有CO的气态底物的厌氧方法，所述方法包括：
(a) 向发酵培养基提供含有CO的气态底物；
(b) 使步骤(a)的得到的含有CO的发酵培养基与一种或多种产乙酸菌接触，以形成混合物；
(c) 发酵步骤(b)的混合物；
(d) 测量含有CO的气态底物的比气体进料速率和步骤(c)的混合物的电导率；
(e) 根据公式y=-6.0327x+12.901，其中电导率y为小于30 mS/cm，向混合物提供含有CO的气态底物，以保持电导率y与含有CO的气态底物的比气体进料速率x，直至达到一种或多种产乙酸菌的目标细胞密度，其中x为0.2-0.7 mmol/min/g产乙酸菌细胞；
保持所述一种或多种产乙酸菌的细胞密度高于目标细胞密度；和
获得乙醇；
其中所述方法有效保持10 g乙醇/(L·天)或更多的空时收率STY，
其中所述目标细胞密度为3-30 g/L。
2.权利要求1的方法，其中所述方法有效保持25 %或更多的H2转化率。
3.权利要求1的方法，其中所述方法有效保持CO吸收在0.001-10 mmol/min/g一种或多种产乙酸菌干细胞的范围。
4.权利要求1的方法，其中所述含有CO的气态底物的CO/CO2比率为0.75或大于0.75。
5.权利要求1的方法，其中所述产乙酸菌选自凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi) CP11 ATCC BAA-1772、产生性布洛提菌(Blautia producta)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、产氢羧基嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸杆菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)P262德国DSMZ之DSM 19630、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)德国DSMZ之DSM 19630、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)德国DSMZ之DSM 10061、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)德国DSMZ之DSM 23693、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)德国DSMZ之DSM24138、食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans) P7 ATCC PTA-7827、克氏梭菌(Clostridium coskatii) ATCC PTA-10522、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC ATCC 49587、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)ERI2 ATCC 55380、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-01 ATCC 55988、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) O-52 ATCC 55889、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)德国DSMZ之DSM 525、拉格利梭菌(Clostridium ragsdali)P11 ATCC BAA-622、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridiumultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热乙酸穆尔氏菌(Morrella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬妮产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)及它们的混合物。
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