定義及背景
術語「超過細胞需要量」係指以大於用於生物質合成之微生物所需要的組分之量向微生物提供組分。 術語「ATP密集產物」係指一種代謝物，其合成至少需要在其合成路徑之一個步驟中輸入ATP(能量)(例如，在路徑中具有ATP相關性反應)。 術語「比生長速率」係指每小時每種細胞生物質的細胞生物質生長速率。 術語「倍增時間」係指細胞生物質增加一倍所花費的時間(以小時為單位)。 術語「精胺酸代謝路徑」泛指涉及精胺酸代謝之任何路徑。精胺酸代謝路徑通常包括精胺酸脫胺酶路徑及精胺酸脫羧酶路徑中之至少一者。 術語「基因修飾」或「基因工程改造」泛指對微生物之基因組或核酸之操縱。類似地，術語「經基因工程改造」係指微生物包括經操縱之基因組或核酸。基因修飾方法包含例如異源基因表現、基因或啟動子插入或缺失、核酸突變、經改變之基因表現或不活化、酶工程改造、定向進化、基於知識之設計、隨機突變誘發方法、基因改組及密碼子最佳化。 「重組」指示核酸、蛋白質或微生物為基因修飾、工程改造或重組之產物。通常，術語「重組」係指核酸、蛋白質或微生物含有衍生自多個來源之遺傳物質或由來源於多個來源之遺傳物質編碼，諸如兩種或大於兩種不同品系或種屬的微生物。如本文所用，術語「重組」亦可用於描述微生物包括突變核酸或蛋白質，包含突變形式之內源性核酸或蛋白質。 「內源性」係指核酸或蛋白質存在或表現於衍生本發明微生物之野生型或親本微生物中。舉例而言，內源性基因為天然地存在於衍生本發明微生物之野生型或親本微生物中之基因。在一個實施例中，內源性基因之表現可以藉由諸如外源性啟動子之外源性調節元件控制。 「外源性」係指核酸或蛋白質不存在於衍生本發明微生物之野生型或親本微生物中。在一個實施例中，外源性基因或酶可衍生自異源(亦即不同)品系或種屬且引入或表現於本發明微生物中。在另一實施例中，外源性基因或酶可以人工方式或以重組方式形成且引入或表現於本發明微生物中。外源性核酸可經改適以整合至本發明微生物之基因組中或保持於本發明微生物中之染色體外態(例如質體)中。 「酶活性」或簡言之「活性」泛指酶活性，包含(但不限於)酶之活性、酶之量或酶催化反應之可利用性。因此，「增加」酶活性包括增加酶之活性、增加酶之量或增加酶催化反應之可利用性。類似地，「降低」酶活性包含降低酶之活性、降低酶之量或降低酶催化反應之可利用性。 「突變」係指本發明微生物中之核酸或蛋白質相較於衍生本發明微生物之野生型或親本微生物已經過修飾。在一個實施例中，突變可為編碼酶之基因的缺失、插入或取代。在另一實施例中，突變可為酶中一或多種胺基酸之缺失、插入或取代。 特定言之，「斷裂性突變」為減少或消除(亦即「干擾」)基因或酶之表現或活性的突變。斷裂性突變可使基因或酶部分不活化、完全不活化或缺失。斷裂性突變可為基因剔除(KO)突變。斷裂性突變可為減少、阻止或阻斷藉由酶產生之產物之生物合成的任何突變。斷裂性突變可包含例如編碼酶之基因的突變、參與編碼酶之基因之表現的遺傳調節元件的突變、引入產生降低或抑制酶之活性的蛋白質的核酸或引入抑制酶之表現的核酸(例如反義RNA、siRNA、CRISPR)或蛋白質。可使用此項技術中已知之任何方法引入斷裂性突變。 引入斷裂性突變產生如下本發明微生物，其不產生目標產物或實質上不產生目標產物或相較於衍生本發明微生物之親本微生物產生減少量之目標產物。舉例而言，本發明微生物可不產生目標產物或比親本微生物所產生之目標產物少至少1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。舉例而言，本發明微生物可產生少於0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0 g/L目標產物。 「密碼子最佳化」係指核酸(諸如基因)突變以使特定品系或種屬之核酸的轉譯最佳化或改良。密碼子最佳化可產生較快的轉譯速率或較高的轉譯準確性。在一較佳實施例中，本發明基因針對梭菌屬、尤其自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌中之表現進行密碼子最佳化。在另一較佳實施例中，本發明基因針對自產乙醇梭菌LZ1561中之表現進行密碼子最佳化，所述自產乙醇梭菌LZ1561以DSMZ寄存編號DSM23693寄存。 「過度表現」係指本發明微生物中核酸或蛋白質之表現相較於衍生本發明微生物之野生型或親本微生物增加。過度表現可以藉由本領域中已知的任何手段達成，包含修飾基因複本數、基因轉錄率、基因轉譯率或酶降解率。 術語「變異體」包括序列不同於參考核酸及蛋白質之序列(諸如先前技術中所揭示或本文中所例示之參考核酸及蛋白質之序列)的核酸及蛋白質。本發明可以使用變異體核酸或蛋白質實施，所述變異體核酸或蛋白質之功能與參考核酸或蛋白質實質上相同。舉例而言，變異體蛋白質可實施與參考蛋白質基本上相同的功能或催化與參考蛋白質基本上相同的反應。變異基因可編碼與參考基因相同或實質上相同的蛋白質。變異啟動子啟動一或多個基因之表現的能力可與參考啟動子實質上相同。 此類核酸或蛋白質在本文中可稱為「功能等效變異體」。舉例而言，核酸之功能等效變異體可包含對偶基因變異體、基因片段、突變基因、多形現象及其類似者。來自其他微生物之同源基因亦為功能等效變異體之實例。此等基因包含諸如丙酮丁醇梭菌(
Clostridium acetobutylicum
)、拜氏梭菌(
Clostridium beijerinckii
)或永達爾梭菌之種屬中之同源基因，其詳情在諸如基因庫或NCBI之網站上可公開獲得。功能等效變異體亦包含由於針對特定微生物之密碼子最佳化而引起序列變化之核酸。核酸之功能等效變異體將較佳與參考核酸具有至少大約70%、大約80%、大約85%、大約90%、大約95%、大約98%或大於98%的核酸序列一致性(同源性百分比)。蛋白質之功能等效變異體將較佳與參考蛋白質具有至少大約70%、大約80%、大約85%、大約90%、大約95%、大約98%或大於98%的胺基酸一致性(同源性百分比)。變異體核酸或蛋白質之功能等效性可使用此項技術中已知之任何方法評估。 核酸可使用此項技術中已知之任何方法傳遞至本發明微生物。舉例而言，核酸可以裸核酸形式傳遞，或可用一或多種試劑(諸如脂質體)調配。核酸可視情況為DNA、RNA、cDNA或其組合。限制抑制劑可用於某些實施例中。其他載體可包含質體、病毒、噬菌體、黏質體及人工染色體。在一較佳實施例中，使用質體將核酸傳遞至本發明微生物。舉例而言，轉型(包含轉導或轉染)可藉由電致孔、超音波處理、聚乙二醇介導之轉型、化學或天然感受態、原生質體轉型、原噬菌體誘導或接合達成。在具有活性限制酶系統之某些實施例中，可能需要在將核酸引入微生物中之前甲基化所述核酸。 此外，核酸可經設計以包括調節元件，諸如啟動子，以提高或以其他方式控制特定核酸之表現。啟動子可為組成性啟動子或誘導性啟動子。理想地，啟動子為伍德-永達爾路徑啟動子、鐵氧化還原蛋白啟動子、丙酮酸:鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf複合物操縱子啟動子、ATP合成酶操縱子啟動子或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。 「微生物」為微觀生物，尤其為細菌、古細菌(archaea)、病毒或真菌。本發明微生物通常為細菌。如本文所用，「微生物」之引述應理解為涵蓋「細菌」。 「親本微生物」為用於產生本發明微生物之微生物。親本微生物可為天然存在之微生物(亦即，野生型微生物)或先前經修飾之微生物(亦即，突變或重組微生物)。本發明微生物可經修飾以表現或過度表現一或多種在親本微生物中不表現或不過度表現之酶。類似地，本發明微生物可經修飾以含有一或多個親本微生物所不含之基因。本發明微生物亦可經修飾以不表現或表現較少量之一或多種表現於親本微生物中之酶。在一個實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。在一較佳實施例中，親本微生物為自產乙醇梭菌LZ1561，其在2010年6月7日，根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款及所授予之寄存編號DSM23693，於2010年6月7日寄存在位於Inhoffenstraß 7B, D-38124 Braunschwieg, Germany之德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)。 術語「衍生自」指示核酸、蛋白質或微生物由不同(例如，親本或野生型)核酸、蛋白質或微生物修飾或改適，以產生新穎核酸、蛋白質或微生物。此類修飾或調適通常包括核酸或基因之插入、缺失、突變或取代。通常，本發明微生物衍生自親本微生物。在一個實施例中，本發明微生物衍生自自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自以DSMZ寄存編號DSM23693寄存之自產乙醇梭菌LZ1561。 本發明微生物可基於功能特徵進一步分類。舉例而言，本發明微生物可為或可衍生自C1固定微生物、厭氧菌、產乙酸菌、產乙醇菌、一氧化碳氧化菌及/或甲烷氧化菌。表1提供微生物之代表性清單且鑑別其功能特徵。
1
伍氏乙酸桿菌可自果糖而非氣體產生乙醇。
2
尚未研究大梭菌是否可生長於CO上。
3
已報導熱乙酸穆爾氏菌之一個菌株穆爾氏菌屬HUC22-1自氣體產生乙醇。
4
尚未研究卵形鼠孢菌是否可生長於CO上。
5
尚未研究銀乙酸鼠孢菌是否可生長於CO上。
6
尚未研究球形鼠孢菌是否可生長於CO上。 「C1」係指單碳分子，例如CO、CO
2
、CH
4
或CH
3
OH。「C1-氧合物」係指以包括至少一個氧原子之單碳分子，例如CO、CO
2
或CH
3
OH。「C1-碳源」係指充當本發明微生物之部分或唯一碳源之單碳分子。舉例而言，C1-碳源可包括CO、CO
2
、CH
4
、CH
3
OH或CH
2
O
2
中之一或多者。較佳地，C1-碳源包括CO及CO
2
中之一者或兩者。「C1固定微生物」為具有自C1-碳源產生一或多種產物之能力的微生物。通常，本發明微生物為C1固定細菌。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自表1中鑑別之C1固定微生物。 「厭氧菌」為生長不需要氧氣之微生物。若氧氣以高於某一臨限值存在，則厭氧菌可能會消極反應或甚至死亡。通常，本發明微生物為厭氧菌。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自表1中鑑別之厭氧菌。 通常，「產乙酸菌」為使用伍德-永達爾路徑作為其能量守恆及合成乙醯基-CoA及乙醯基-CoA衍生產物(諸如乙酸酯)之主要機制的絕對厭氧細菌(Ragsdale, 《生物化學與生物物理學學報(Biochim Biophys Acta)》, 1784:1873-1898, 2008)。產乙酸菌使用乙醯基-CoA路徑作為(1)自CO
2
還原合成乙醯基-CoA之機制，(2)終端接受電子、能量守恆方法，(3)固定(同化)細胞碳之合成中之CO
2
之機制(Drake, 《產乙酸原核生物》,《原核生物》, 第3版, 第354頁, New York, NY, 2006)。所有天然存在之產乙酸菌為C1固定、厭氧、自營及非甲烷氧化的。通常，本發明微生物為產乙酸菌。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自表1中鑑別之產乙酸菌。 「產乙醇菌」為產生或能夠產生乙醇之微生物。通常，本發明微生物為產乙醇菌。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自表1中鑑別之產乙醇菌。 「自營生物」為能夠在不存在有機碳的情況下生長之微生物。取而代之，自營生物使用無機碳源，諸如CO及/或CO
2
。通常，本發明微生物為自營生物。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自表1中鑑別之自營生物。 「一氧化碳氧化菌」為能夠利用CO作為唯一碳源之微生物。通常，本發明微生物為一氧化碳氧化菌。在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自表1中鑑別之一氧化碳氧化菌。 「甲烷氧化菌」為能夠使用甲烷作為唯一碳源及能量來源之微生物。在某些實施例中，本發明微生物衍生自甲烷氧化菌。 更廣泛地，本發明微生物可衍生自表1中鑑別之任何屬或種屬。 在一較佳實施例中，本發明微生物衍生自包括自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌種屬之梭菌屬之叢集。此等種屬首先藉由Abrini, 《微生物學檔案(
Arch Microbiol
)》, 161: 345-351, 1994(自產乙醇梭菌)，Tanner, 《國際系統細菌學雜誌(
Int J System Bacteriol
)》, 43: 232-236, 1993(永達爾梭菌)及Huhnke, WO 2008/028055(拉氏梭菌)報導及表徵。 此三種種屬具有許多相似性。特定言之，此等種屬全部為梭菌屬之C1固定、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養型成員。此等種屬具有相似基因型及表現型及能量守恆及醱酵代謝模式。此外，此等種屬叢集於16S rRNA DNA具有大於99%一致性之梭菌rRNA同源組I中，具有22-30 mol%之DNA G + C含量，為革蘭氏陽性的(gram-positive)，具有相似形態及大小(0.5-0.7 × 3-5 μm之間的對數生長細胞)，為嗜溫性的(最佳生長於30-37℃下)，具有4-7.5之相似pH範圍(其中最佳pH為5.5-6)，不具有細胞色素且經由Rnf錯合物使能量守恆。另外，已在此等種屬中顯示羧酸還原為其對應醇(Perez, 《生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng)》, 110:1066-1077, 2012)。重要的是，此等種屬亦全部顯示在含有CO氣體上之強自營生長、產生乙醇及乙酸酯(或乙酸)作為主要醱酵產物，且在某些條件下產生少量2,3-丁二醇及乳酸。 然而，此三種種屬亦具有多種差異。此等種屬分離自不同來源：自產乙醇梭菌分離自兔腸道，永達爾梭菌分離自雞舍廢棄物，且拉氏梭菌分離自淡水沈積物。此等種屬在各種糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸鹽、檸檬酸鹽)、胺基酸(例如精胺酸、組胺酸)及其他受質(例如甜菜鹼、丁醇)之利用方面不同。此外，此等種屬在對某些維生素(例如硫胺素、生物素)之營養缺陷型方面不同。此等種屬在伍德-永達爾路徑基因及蛋白質之核酸及胺基酸序列方面具有差異，但已發現此等基因及蛋白質之一般組織及數目在所有種屬中相同(Köpke, 《生物技術新見(
Curr Opin Biotechnol
)》, 22: 320-325, 2011)。 因此，總體而言，自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌之許多特徵並非為所述種屬所特異性的，而是梭菌屬之C1固定、厭氧、產乙酸、產乙醇及一氧化碳營養型成員之此叢集之一般特徵。然而，由於此等種屬實際上為相異的，此等種屬中之一者之基因修飾或操縱可不在此等種屬中之另一者中具有相同效應。舉例而言，可觀測到生長、效能或產物產生方面之差異。 本發明微生物亦可衍生自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌之分離株或突變體。自產乙醇梭菌之分離株及突變體包含JA1-1(DSM10061)(Abrini,《微生物學檔案》, 161: 345-351, 1994)、LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200)及LZ1561(DSM23693)。永達爾梭菌之分離株及突變體包含ATCC 49587(Tanner,《國際系統細菌學雜誌》, 43: 232-236, 1993)、PETCT(DSM13528, ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)及OTA-1(Tirado-Acevedo, 《使用永達爾梭菌自合成氣產生生物乙醇(Production of bioethanol from synthesis gas using
Clostridium ljungdahlii
)》, 《博士畢業論文(PhD thesis)》, North Carolina State University, 2010)。拉氏梭菌之分離株及突變體包含PI 1(ATCC BAA-622，ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。 「受質」係指本發明微生物之碳源及/或能量來源。通常，受質為氣態受質，且包括C1-碳源，例如CO、CO
2
及/或CH
4
。較佳地，受質包括CO或CO + CO
2
之C1-碳源。受質可進一步包括其他非碳組分，諸如H
2
、N
2
或電子。 受質通常包括至少一些量之CO，諸如1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mol% CO。受質可包括一定範圍之CO，諸如20-80、30-70或40-60 mol% CO。較佳地，受質包括40-70 mol% CO(例如，鋼鐵廠或高爐氣體)、20-30 mol% CO(例如，鹼性氧氣轉爐氣體)或15-45 mol% CO(例如，合成氣)。在一些實施例中，受質可包括相對較低量之CO，諸如1-10或1-20 mol% CO。本發明微生物通常將受質中之至少一部分CO轉化為產物。在一些實施例中，受質不包括或實質上不包括CO(＜ 1 mol%)。 受質可包括一定量之H
2
。例如，受質可包括1、2、5、10、15、20或30 mol% H
2
。在一些實施例中，受質可包括相對較高量之H
2
，諸如60、70、80或90 mol% H
2
。在其他實施例中，受質不包括或實質上不包括H
2
(＜1 mol%)。 受質可包括一定量之CO
2
。例如，受質可包括1-80或1-30 mol% CO
2
。在一些實施例中，受質可包括小於20、15、10或5 mol% CO
2
。在另一實施例中，受質不包括或實質上不包括CO
2
(＜1 mol%)。 儘管受質通常為氣態，但受質亦可以替代形式提供。舉例而言，受質可使用微泡分散發生器溶解於含CO氣體飽和液體中。另外舉例而言，受質可吸附至固體載體上。 受質及/或C1-碳源可為作為工業方法之副產物獲得或來自一些其他來源(諸如來自汽車排出之煙或生物質氣化)的廢氣。在某些實施例中，工業方法選自由以下組成之群：鐵金屬產品製造(諸如鋼鐵廠製造)、非鐵產品製造、石油精煉方法、煤炭氣化、電力生產、碳黑生產、氨氣生產、甲醇生產及焦炭製造。在此等實施例中，受質及/或C1-碳源可在其排放至大氣中之前使用任何便利方法自工業方法捕獲。 受質及/或C1-碳源可為合成氣，諸如藉由煤炭或精煉廠殘餘物氣化、生物質或木質纖維素材料氣化或天然氣重整獲得的合成氣。在另一實施例中，合成氣可獲自城市固體廢物或工業固體廢物之氣化。 受質之組成可對反應效率及/或成本具有顯著影響。舉例而言，氧氣(O
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)之存在可降低厭氧醱酵方法之效率。視受質之組成而定，可能需要處理、洗滌或過濾受質以移除任何不合需要之雜質，諸如毒素、不合需要之組分或粉塵粒子，及/或增加所需組分之濃度。 本發明微生物可經培養以產生一或多種產物。舉例而言，自產乙醇梭菌產生或可經工程改造以產生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸酯(WO 2007/117157)、丁醇(WO 2008/115080及WO 2012/053905)、丁酸酯(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342)、乳酸酯(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522及WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、異丙醇(WO 2012/115527)、脂質(WO 2013/036147)、3-羥丙酸酯(3-HP)(WO 2013/180581)、異戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/0369152)及1-丙醇(WO 2014/0369152)。除一或多種目標產物以外，本發明微生物亦可產生乙醇、乙酸酯及/或2,3-丁二醇。在某些實施例中，微生物生物質本身可視為產物。 「天然產物」為藉由未經基因修飾之微生物產生之產物。舉例而言，乙醇、乙酸酯及2,3-丁二醇為自產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌之天然產物。「非天然產物」為由經基因修飾微生物產生而非由衍生經基因修飾微生物的未經基因修飾微生物產生的產物。 「選擇性」係指目標產物之產量與藉由微生物產生的所有醱酵產物之產量的比率。本發明微生物可經工程改造而以特定選擇性或最小選擇性產生產物。在一個實施例中，目標產物佔藉由本發明微生物產生之所有醱酵產物之至少5%、10%、15%、20%、30%、50%或75%。在一個實施例中，目標產物占藉由本發明微生物產生之所有醱酵產物之至少10%，使得本發明微生物對目標產物之選擇性為至少10%。在另一實施例中，目標產物占藉由本發明微生物產生之所有醱酵產物的至少30%，使得本發明微生物對目標產物之選擇性為至少30%。 「提高效率」及其類似物術語包含(但不限於)提高比生長速率、產物產生速率或體積、每消耗單位體積之受質的產物體積或產物選擇性。效率可相對於衍生本發明微生物之親本微生物之效能量測。 術語「生產力」或「生產速率」為產物之體積生產力。在連續系統中，體積生產力計算為產物穩態濃度與液體滯留時間之比。在分批系統中，體積生產力計算為在分批系統中的濃度及產生所述濃度所需之時間。體積生產力以公克/公升/天報導。 通常，在生物反應器中進行培養。術語「生物反應器」包含培養/醱酵裝置，其由一或多個容器、塔或管道配置組成，諸如連續攪拌槽反應器(CSTR)、固定細胞反應器(ICR)、滴流床反應器(TBR)、氣泡柱、氣升式醱酵槽、靜態混合器或適合於氣-液接觸之其他容器或其他裝置。在一些實施例中，生物反應器可包括第一生長反應器及第二培養/醱酵反應器。可將受質提供至此等反應器中之一者或兩者。如本文所用，術語「培養」及「醱酵」可互換使用。此等術語涵蓋培養/醱酵過程之生長階段及產物生物合成階段。 通常在含有足以准許微生物生長之營養物、維生素及/或礦物質之水性培養基中維持培養物。較佳地，水性培養基為厭氧微生物生長培養基，諸如最小厭氧微生物生長培養基。適合培養基為此項技術中所熟知。 培養/醱酵期望應在適用於產生目標產物之條件下進行。通常，培養/醱酵在厭氧條件下執行。應考慮到的反應條件包含壓力(或分壓)、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基氧化還原電位、攪拌速率(若使用連續攪拌槽反應器)、接種物水準、確保液相中之氣體不會變成限制因素的最大氣體受質濃度及避免產物抑制的最大產物濃度。特定言之，可控制受質之引入速率以確保液相中之氣體之濃度不會變成限制因素，因為在氣體限制條件下，培養物可能會消耗產物。 在高壓下操作生物反應器允許增加自氣相至液相之氣體質量轉移速率。因此，在高於大氣壓之壓力下進行培養/醱酵通常較佳。此外，由於既定氣體轉化率在某種程度上為受質滯留時間之函數，且滯留時間指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低培養/醱酵設備之資金成本。此又意謂當生物反應器維持在高壓而非大氣壓下時，滯留時間(定義為生物反應器中之液體體積除以輸入氣體流速)可減少。最佳反應條件將部分地視所用特定微生物而定。然而，一般而言，較佳在高於大氣壓之壓力下操作醱酵。此外，由於既定氣體轉化速率在某種程度上為受質滯留時間之函數，且達成所需滯留時間又指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低醱酵設備之資金成本。 目標產物可使用任何方法或此項技術中已知方法之組合自醱酵培養液分離或純化，包含例如分餾、蒸發、滲透蒸發、氣體汽提、相分離及萃取醱酵，包含例如液-液萃取。在某些實施例中，目標產物藉由以下步驟自醱酵培養液回收：自生物反應器連續移除培養液之一部分，分離微生物細胞與培養液(宜藉由過濾進行)且自培養液回收一或多種目標產物。醇及/或丙酮可例如藉由蒸餾回收。酸可例如藉由吸附於活性炭上回收。較佳使所分離微生物細胞返回至生物反應器。亦較佳使移除目標產物後剩餘之不含細胞之滲透物返回至生物反應器。可將其他營養物(諸如B維生素)添加至不含細胞之滲透物中以在滲透物返回至生物反應器前補充培養基。 當提及將「酸」添加至根據本發明之培養液或生物反應器時，術語「酸」應從廣義上理解，包含任何單羧酸及二羧酸。因此，提及添加或產生等效鹽應視為包含提及酸或混合物。針對提及所述術語之實例，乙酸鹽應視為包含乙酸且反之亦然。醱酵培養液中的分子酸與羧酸之比視系統之pH而定。例示性酸包含乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸及苯甲酸。 本發明提供用於改良醱酵效率之方法。本發明人已發現超過細胞需要量向微生物培養液添加特定胺基酸對培養液生長具有深遠作用。此外，本發明人鑑別到過量添加胺基酸能夠增加醱酵產物，尤其具有高能量/ATP需求之醱酵產物的產量。 本發明提供用於改良醱酵效率之方法。本發明人已發現超過細胞需要量向微生物培養液添加精胺酸對培養液生長具有深遠作用。此外，本發明人鑑別到過量添加精胺酸能夠增加醱酵產物，尤其具有高能量/ATP需求之醱酵產物的產量。 在不希望受理論束縛的情況下，咸信精胺酸之生長提昇作用視為來自藉由微生物之精胺酸代謝期間產生ATP。精胺酸經由精胺酸脫亞胺酶(ADI)路徑或精胺酸脫羧酶路徑代謝。 經由精胺酸脫亞胺酶之精胺酸代謝藉由以下機制進行：
經由ADI路徑之精胺酸代謝使得產生銨、CO
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及ATP。 經由精胺酸脫羧酶路徑之精胺酸代謝藉由以下機制進行：
由精胺酸代謝產生之所得ATP實現微生物之生長曲線增加。 在不希望受理論束縛的情況下，本發明人咸信儘管精胺酸代謝提供微生物生長之ATP需要量，但精胺酸並未用作微生物之碳源，確切而言，所用碳源為含C1氣體中之碳組分。 用於使含C1氣態受質之微生物醱酵以產生諸如乙醇及乙酸酯之產物的方法為本領域中廣泛已知。此類方法提供由包括C1碳源之工業廢氣產生商業上有用燃料之手段。此等方法通常涉及將包括例如CO之氣態受質饋入包括至少一種產乙酸一氧化碳營養型微生物於液態培養基中之培養物的生物反應器中。氣態受質經厭氧醱酵以產生醇、酸及其混合物。用於生物反應器中之液態培養基通常含有支持所述至少一種產乙酸一氧化碳營養型微生物生長的各種營養物，且用於一或多種微生物之代謝路徑中以便產生醇。此類營養物之實例包含MgCl、CaCl、KCl、H
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、Fe、Ni、Zn、Mn、B、W、Se等。 亦已知梭菌屬菌株可經基因修飾以能夠產生多種其他有用產物，包含丁二酸酯、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、異丙醇、異戊二烯、乙偶姻、異丁醇、檸蘋酸酯、丁二烯及聚乳酸、丙酮、丁醇、異丁烯3-羥丙酸酯(3HP)及脂肪酸。 出人意料地，本發明人已發現增加提供至微生物培養液之精胺酸濃度，微生物之生長曲線增加，且會增加可藉由培養液產生ATP密集產物之量。 本發明之一個實施例涉及向液態培養基提供精胺酸，其中液態培養基所提供之精胺酸量超過C1固定微生物之細胞需要量。超過C1固定微生物之細胞需要量提供精胺酸具有提高微生物培養液之比生長速率的作用。在一些實施例中，與不存在過量精胺酸之情況下的微生物相比，C1固定微生物之比生長速率增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%。 微生物之精胺酸之細胞需要量可藉由測定生物質水解之後生質之胺基酸組成及胺基酸分析來估計。 已證明藉由將液態營養培養基中之精胺酸濃度自等於細胞需要量提高至超過用於生物質合成之需要量1000倍(或大於1000倍)，微生物之倍增時間降低。在某些實施例中，與不存在過量精胺酸之情況下的培養液中的7.3 h之倍增時間相比，提供有過量精胺酸之培養液之倍增時間降低至3.5 h。在不希望受理論束縛的情況下，本發明人亦咸信藉由將精胺酸濃度自超過細胞需要量2倍提高至80倍(或大於80倍)，ATP密集醱酵產物之生產力增加。在某些實施例中，在用於合成生物質之需要量之2至1000倍或2至800倍或2至500倍或2至100倍或2至50倍或2至10倍或50至1000倍、或50至800倍、或50至600倍、或50至500倍、或50至300倍或50至200倍、或50至100倍或100至1000倍或100至800倍或100至600倍或100至500倍或100至300倍或100至200倍下向培養液提供精胺酸。 就實際濃度而言，本發明之一寬泛實施例為其中液態培養基中之精胺酸濃度為20 mg/L至20 g/L的實施例。在特定實施例中，精胺酸濃度維持在至少20 mg/L、或至少100 mg/L、或至少300 mg/L或至少500 mg/L、或至少1 g/L或至少2 g/l、或至少3 g/l、或至少4 g/L或至少5 g/L或至少10 g/L或至少20 g/L之量下。在某些實施例中，精胺酸濃度維持在20 mg/L與20 g/l之間、或100 mg/L至20 g/L之間、或500 mg/l至20 g/L之間、或500 mg/L至10 g/L之間、或1 g/L至10 g/L之間或5 g/L至10 g/L之間、或5 g/L至20 g/L之間。在某些實施例中，向培養液提供精胺酸，使得培養液所消耗之精胺酸為每公克細胞乾重至少20 mg精胺酸或每公克細胞乾重至少100 mg精胺酸、或每公克細胞乾重至少1公克精胺酸、或每公克細胞乾重至少5公克精胺酸、或每公克細胞乾重至少10公克精胺酸。在某些實施例中，向培養液提供精胺酸，使得培養液所消耗之精胺酸在每公克細胞乾重20 mg至每公克細胞乾重20公克之間、或每公克細胞乾重100 mg與每公克細胞乾重20公克之間、或每公克細胞乾重1公克與每公克細胞乾重10公克之間。 在某些實施例中，培養液消耗至少0.012 g精胺酸，產生1 g生物質。在某些實施例中，用於生物質合成之精胺酸的細胞需要量在每公克生物質0.012 g至每公克生物質24 g之間。在某些實施例中，用於生物質合成之精胺酸需要量為每公克生物質至少0.012 g、或每公克生物質至少0.024 g、每公克生物質0.048 g、或每公克生物質至少0.120 g、或每公克生物質至少0.24 g、或每公克生物質至少0.48 g、或每公克生物質至少1.2 g、或每公克生物質至少2.4 g、或每公克生物質至少4.8 g、或每公克生物質至少12 g。 在本發明之一些實施例中，將液態營養培養基中之精胺酸濃度自超過細胞需要量2倍提高至80倍(或大於80倍)會使微生物之倍增時間增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%。 當精胺酸增加超過自產乙醇梭菌之細胞需要量時，藉由微生物產生之乙酸酯減少。在不希望受理論束縛的情況下，本發明人咸信當供應精胺酸時，自產乙醇梭菌利用精胺酸產生ATP以供生長之能力不再需要微生物產生乙酸酯來獲取ATP。 經描述，所有產乙酸微生物均產生乙酸酯(Drake, 《產乙酸原核生物》, 《原核生物》, 第3版, 第354-420頁, New York, NY, Springer, 2006)，因為乙酸之產生向微生物提供經由磷酸轉乙醯酶(Pta)及磷酸轉乙醯酶-乙酸激酶(Ack)自受質層面磷酸化直接產生ATP的選擇。特定言之，在市售規模下，微生物產生乙酸酯(或CoA轉移酶反應所需之其他有機酸)作為副產物為不期望的，因為乙酸酯自目標產物轉移碳，且因此影響目標產物之效率及產率。另外，乙酸酯可能對微生物具有毒性及/或可充當污染性微生物之生長的受質。此外，乙酸酯之存在使得較難回收及分離目標產物及控制醱酵條件以促進目標產物之產生。 當與其中未超過細胞需要量提供精胺酸之培養液相比時，超過細胞需要量向自產乙醇梭菌培養物提供精胺酸使得乙酸酯產量大大降低。此外，本發明人已證明，當精胺酸源完全耗盡時，培養液中乙酸酯產量增加。在一個實施例中，向微生物培養液提供之過量精胺酸使乙酸酯產量降低20%或30%或40%或50%、或60%、或70%或80%。 本發明人已證明，精胺酸按化學計量轉化為鳥胺酸涉及作為精胺酸代謝之機制的精胺酸脫亞胺酶路徑。此路徑將精胺酸轉化為鳥胺酸、銨、ATP及CO
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。經強化之生長將藉由供應ATP及來自精胺酸降解之銨來促進。在一個實施例中，本發明提供一種用於改良醱酵方法之可持續性之方法，其中在不存在替代性氮源之情況下向微生物培養液提供精胺酸。 在此項技術中熟知氮氣為微生物生長所必需的。氮氣通常提供至呈銨鹽或氫氧化銨形式之培養液。氨氣通常由哈伯法(Haber process)產生，其藉由以下反應表徵：
目前氨氣主要由天然氣及煤炭產生。在典型的由天然氣產生氨氣之方法中，氫氣源於天然氣且氮氣衍生自大氣。天然氣產生溫室氣體，因此儘管氨氣自身不產生溫室氣體，但氨氣之製造會產生溫室氣體。期望發現且利用完全可再生的氨氣源。[http://www.agmrc.org/renewable_energy/ renewable_energy/ammonia-as-a-transportation-fuel/]。氫氧化銨(28.0至30.0 w/w)之成本在每1000公斤US$9600範圍內。 1886年首次自羽扇豆幼苗提取物分離出精胺酸(L-精胺酸)。其隨後鑑別為廣泛地分佈在食品及飼料中。可由各種方法產生精胺酸，所述方法包含蛋白質水解、化學合成及微生物合成。大多數L-精胺酸由使用可再生碳源直接醱酵產生。[jn.nutrition.org/content/134/10/2854S.full] 實例3之經鑑別之路徑提供將1 mol精胺酸轉化為3 mol氨氣。因此精胺酸可為細菌提供替代性氮源，將氨氣直接提供至代謝中，同時仍提供上文所述之優點。由於1個精胺酸分子可分解成3個氨分子，所需較低量由較便宜之精胺酸價格(根據Sigma Aldrich或Fisher，99%食品級精胺酸成本為大約~US$ 17-18,000/1000 kg，而30%工業級氨成本為~US$ 10-11,000/1000 kg)及減少之處理引起顯著成本節約。此外，精胺酸可例如藉由醱酵可持續地衍生自生物源(T. Utagawa, 《營養學雜誌(J. Nutr.)》, 2004, 134, 2854S-2857)。 精胺酸脫亞胺酶路徑經由三個酶促步驟，藉由精胺酸脫亞胺酶(EC 3.5.3.6)、胺甲醯基轉移酶(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶、腐胺胺甲醯基轉移酶)(EC 2.1.3.3)及胺基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)催化進行。已在自產乙醇梭菌之基因組中鑑別出相應酶。 本發明之另一態樣進一步提供一種基因工程改造C1固定細菌，其包括經改良之精胺酸脫亞胺酶路徑。在一個實施例中，本發明提供一種基因工程改造C1固定細菌，其包括一或多種選自由以下組成之群的酶：精胺酸脫亞胺酶(EC 3.5.3.6)、胺甲醯基轉移酶(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶、腐胺胺甲醯基轉移酶)(EC 2.1.3.3)及胺基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，其中各酶為過度表現內源酶、突變內源酶或外源酶。在特定實施例中，C1固定細菌為梭菌屬細菌。在特定實施例中，細菌為自產乙醇梭菌。 而不希望受理論束縛，本發明人咸信若觀測到呈瓜胺酸形式之中間體積聚，則為了增加路徑效能，可過度表現相應基因或可由本領域技術人員使用先前所述之方法(WO2012/053905、WO2012/115527、WO2013-180584)引入且異源表現來自其他來源之基因。 本發明進一步提供一種用於由受質產生至少一種產物之方法，所述方法包括：培養基因工程改造C1固定細菌，其包括一或多種選自由以下組成之群的酶：精胺酸脫亞胺酶(EC 3.5.3.6)、胺甲醯基轉移酶(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶、腐胺胺甲醯基轉移酶)(EC 2.1.3.3)及胺基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)，其中各酶為過度表現內源酶、突變內源酶或外源酶。 本發明之另一態樣進一步提供一種基因工程改造C1固定細菌，其包括一或多種選自由以下組成之群的酶：鳥胺酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鳥胺酸胺基變位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二胺基戊酸脫氫酶(EC 1.4.1.12)及2-胺基-4-側氧基戊酸硫解酶。在不希望受理論束縛的情況下，本發明人咸信可過度表現相應基因或可由本領域技術人員使用先前所述之方法(WO2012/053905、WO2012/115527及WO2013-180584)引入且異源表現來自其他來源之基因。若生物體適用於隨時間推移在精胺酸上生長，則亦可改適且進化生物體以較有效地利用鳥胺酸。此藉由觀測到鳥胺酸積聚來支持。 本發明人已鑑別藉由結合至回文操縱序列控制基因表現之精胺酸抑制子，所述回文操縱序列位於精胺酸脫亞胺酶起始密碼子之上游大約45 bp處。添加精胺酸使得抑制子解除結合至操縱序列，使得操縱序列之下游的基因發生轉錄。在本發明之一個態樣中，提供一種包括至少一種異源基因之基因工程改造重組細菌，所述異源基因提供於結合argR之操縱序列的下游，其中至少一種異源基因之基因表現可藉由添加精胺酸來活化。 本發明進一步提供一種用於產生至少一種產物之方法，所述方法包括：向含有包括至少一種異源基因的基因工程改造細菌之培養液提供碳源，所述異源基因提供於結合argR之操縱序列的下游；向培養液提供精胺酸且醱酵培養液。在某些實施例中，至少一種異源基因為產物之生物合成路徑中的異源基因。 在一個實例中，異源基因可編碼需要ATP以合成產物之代謝路徑。舉例而言，甲羥戊酸路徑為以每莫耳異戊烯基-二磷酸3 mol ATP為代價將乙醯基-CoA轉化為異戊烯基-二磷酸之異源路徑。使用所述方法，異源甲羥戊酸路徑之表現可藉由添加精胺酸來活化，其亦將經由精胺酸脫亞胺酶路徑經由降解精胺酸來提供針對甲羥戊酸路徑之ATP。 在另一態樣中，可經由精胺酸脫羧路徑利用精胺酸。在不希望受理論束縛的情況下，本發明人咸信精胺酸可藉由酶(精胺酸脫羧酶)脫羧成精胺及CO
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。精胺可隨後藉由酶(精胺脫亞胺酶)轉化為N-胺甲醯腐胺，亦產生銨。N-胺甲醯腐胺加上磷酸可藉由腐胺胺甲醯基轉移酶轉化為腐胺加上胺甲醯磷酸酯。胺甲醯磷酸酯加上ADP藉由胺基甲酸激酶經由與精胺酸脫亞胺酶路徑相同之機制轉化為銨+ ATP +CO
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。銨與ATP之淨產量與精胺酸脫亞胺酶路徑相同，但伴隨兩種不同中間體(精胺及N-胺甲醯腐胺)及不同副產物(腐胺)。腐胺為值大於鳥胺酸或精胺酸之副產物且可用作產生包含耐綸-4,6(Qian等人, 2009, 《生物技術與生物工程(Biotechnol. Bioeng.)》104, 第651-662頁)及聚胺基甲酸酯之各種聚合物的饋料。 在另一態樣中，細菌經修飾以過度表現一或多種內源性基因、表現一或多種突變內源性基因、或異源表現一或多種外源性基因、編碼選自由以下組成之群的酶：鳥胺酸消旋酶、鳥胺酸胺基變位酶，次單位β(OraE)、鳥胺酸胺基變位酶，次單位α(OraS)、2,4-二胺基戊酸脫氫酶、2,4-二胺基戊酸脫氫酶、2-胺基-4-側氧基戊酸硫解酶，β次單位、2-胺基-4-側氧基戊酸硫解酶，α次單位及其功能等效變異體。或者，細菌可經修飾以表現一或多種選自由以下組成之群的外源性基因：鳥胺酸消旋酶、鳥胺酸胺基變位酶，次單位β(OraE)、鳥胺酸胺基變位酶，次單位α(OraS)、2,4-二胺基戊酸脫氫酶、2,4-二胺基戊酸脫氫酶、2-胺基-4-側氧基戊酸硫解酶，β次單位及2-胺基-4-側氧基戊酸硫解酶，α次單位。在較佳實施例中，內源性基因衍生自斯氏梭菌(圖23)。在不希望受理論束縛的情況下，本發明人認為此等基因結果之過度表現將引起精胺酸脫亞胺酶路徑之效能增加，尤其當在親本菌株中觀測到鳥胺酸積聚時。或者，認為可使細菌改適且進化以較有效地利用鳥胺酸。在某些實施例中，對細菌進行選擇以在精胺酸上生長。 在另一態樣中，細菌包括一或多種干擾精胺酸:鳥胺酸轉運子之基因修飾。在一個實施例中，基因修飾干擾CAETHG_3023及CAETHG_3024之表現(基因庫基因ID：17336441及17336442；基因庫蛋白質寄存編號：YP_008700482.1及YP_008700483.1)。較佳基因修飾為基因剔除突變。精胺酸之基因剔除：鳥胺酸轉運子使得自細菌細胞輸出之鳥胺酸減少且實現藉由細胞之鳥胺酸代謝。另外，細菌可經修飾以表現替代性精胺酸轉運子以輸入精胺酸而不輸出鳥胺酸。在替代性實施例中，細菌可經修飾以表現鳥胺酸輸入子以能夠再俘獲排出之鳥胺酸。此等方法中之每一者將增加細菌代謝鳥胺酸之能力。 實例1說明藉由自產乙醇梭菌由精胺酸產生丙胺酸。在一個態樣中，本發明提供一種用於產生一或多種衍生自丙胺酸之產物的方法，衍生自丙胺酸之產物包含3-羥丙酸酯(3-HP)或丙烯酸。丙烯酸為供用於皮革品、紙品及紡織品之聚合性絮凝劑、分散劑、塗料、油漆、黏著劑及黏結劑中所用的重要商品，2014年所估計的全球需求量為5百萬公噸。3-HP為丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯醯胺或1,3-丙二醇之平台。 在一個態樣中，本發明提供一種基因工程改造C1固定細菌，其包括至少一種選自由以下組成之群的異源酶：用於將丙胺酸轉化為丙二醯半醛及3-HP之酶、用於將丙胺酸轉化為丙胺醯基-CoA之酶、用於將3-HP轉化為丙烯醯基-CoA之酶、用於將丙胺醯基-CoA轉化為丙烯醯基-CoA之酶及用於將丙烯醯基-CoA轉化為丙烯酸之酶。 在特定實施例中，C1固定微生物為產乙酸一氧化碳營養型微生物。適合C1固定微生物之實例包含梭菌屬、穆爾氏菌屬、產乙酸桿菌屬、消化鏈球菌屬、乙酸桿菌屬、真桿菌屬或丁酸桿菌屬。在各種實施例中，微生物選自表5中鑑別之微生物之群。 實例 以下實例進一步說明本發明，但當然不應視為以任何方式限制其範疇。 表1：不含酵母提取物之PETC-MES培養基
表2：具有以g/L為單位之最終濃度的胺基酸配方
實例 1 鑑別產乙酸菌自產乙醇梭菌之較佳胺基酸及用精胺酸增補之經強化之生長
此實例說明精胺酸、組胺酸、天冬胺酸及麩胺酸明顯比其他胺基酸較佳且以比藉由產乙酸菌自產乙醇梭菌DSM10061進行生物質合成所需的產量高＞ 80倍進行消耗，且成分確定之培養基中的精胺酸增補使得自產乙醇梭菌能夠以約3h之tD生長，所述tD比酵母提取物(YE)增補快約3倍。 自產乙醇梭菌DSM 10061源於DSMZ(德國微生物及細胞培養物保藏中心，Inhoffenstraße 7B，38124 Braunschweig，Germany)。 以不同胺基酸配方—20AA、7AA、8AA、14AA、12AA、4AA及精胺酸(表2)補充不含YE之PETC-MES培養基，以鑑別是否存在支持生長之任何胺基酸。將溶液過濾滅菌且藉由鼓泡N
2
使溶液缺氧。 首先，基於理論上具有支持產生1 g DCW/L生物質之最終胺基酸濃度的丙酮丁醇梭菌之生物質胺基酸組合物(Lee等人2008)設計20AA培養基。 在37℃下在震盪下(除非另外指出)在體積為50 mL之培養基中在頂部空間中含有氮氣的125 mL血清瓶中以分批培養形式進行生長研究。相對於作為參考物之完全經氧化之培養基，在厭氧腔室外部在600 nm下量測光密度(OD)之讀數為約0.5。 藉由HPLC分析有機酸、果糖及胺基酸。藉由離子排阻層析使用安捷倫1200 HPLC系統及安捷倫Hiplex H管柱(300 × 7.7 mm，PL1170-6830)及保護管柱(SecurityGuard Carbo-H，Phenomenex PN：AJO-4490)定量分析有機酸、碳水化合物及醇。一般而言，使用設定為正極性且光學單元溫度為40℃的折射率偵測器(安捷倫RID，G1362A)監測糖及醇，同時在210 nm下(安捷倫MWD，G1365B)及/或用折射率偵測器監測有機酸。使用自動取樣器(安捷倫HiP-ALS，G1367B)將30 µL樣品注入至管柱上，且使用用恆溫器控制之管柱隔室(安捷倫TCC，G1316A)將管柱溫度保持在65℃。用4 mM H
2
SO
4
以0.6 mL/min等度溶離分析物26 min。在15℃之管柱溫度下且藉由使用高純度水(18.2 MΩ.cm)作為移動相來分別分析果糖、蔗糖及葡萄糖，且以0.4 mL/min等度溶離21 min。使用ChemStation(Dietmair S、Timmins NE、Gray PP、Nielsen LK、Kromer JO:《關於哺乳動物細胞之定量代謝組研究：代謝物提取協定之研發(Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: development of a metabolite extraction protocol.)》 《分析生物化學》2010,404:155-164)整合層析圖。如先前所述量測及定量胺基酸(R. B. McQualter, C. Bellasio, L. K. Gebbie, L. A. Petrasovits, R. W. Palfreyman, M. P. Hodson, M. R. Plan, D. M. Blackman, S. M. Brumbley及L. K. Nielsen，《植物生物技術(
Plant Biotechnol. J.
)》
,
2015)。 儘管達至20AA培養基上之最大OD略微低於(約20%)達至酵母提取物上之最大OD，但在取樣開始時觀測到同樣快之生長(倍增時間tD = 約9 h；生長速率µ = 0.077)(圖1)。 AA分析出人意料地顯示天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、組胺酸及蘇胺酸之AA之較佳及快速利用(圖2)。精胺酸自培養基快速耗盡。更為重要的是，絲胺酸及蘇胺酸以比用於產生生物質所需的產量高＞ 6倍消耗，且天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸及精胺酸以高＞ 20倍消耗，指示其用於除併入生物質中以外之其他目的的利用。值得注意的是，在生長期間在兩種培養基上均觀測到丙胺酸積聚，而非其耗盡。基於此等結果，具有高2倍及4倍濃度之後續培養基被設計成用於獲得較低培養基、較快生長及較高OD：省去六種根本未消耗或消耗緩慢的AA之14AA培養基及藉由進一步減少胺基酸之8AA培養基。 與酵母提取物上之生長相比，在具有4×增加之AA濃度的14AA培養基中，達成較高最大OD(圖3)。重要的是，8AA培養基上所達成之最大OD與20AA培養基之最大OD匹配，顯示較少AA配方可支持良好生長。提高AA濃度對倍增時間具有積極作用：與酵母提取物及20AA培養基相比，在14AA及8AA培養基上分別達成較快及同樣快之生長(圖4)。 AA分析證實了先前研究結果且進一步突顯天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸及精胺酸之AA的重要性(圖5及圖6)。值得注意的是，精胺酸為最佳胺基酸，因為根據OD=0.24，其已耗盡。在其他AA中，絲胺酸及蘇胺酸利用較快。此外，在兩種培養基上均觀測到明顯之丙胺酸積聚。有趣的是，亦產生鳥胺酸。天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸及精胺酸以比用於產生生物質所需的產量高＞ 10倍消耗，指示其對於能量產生之用途。 基於此等結果，兩種後續培養基被設計成用於獲得較快生長：自14AA培養基省去麩醯胺酸及色胺酸且將絲胺酸、蘇胺酸及半胱胺酸之濃度提高至20AA培養基之8倍且僅由4種經鑑別之AA-天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸及精胺酸組成的培養基之濃度提高至20AA培養基之80倍(14AA培養基之2倍及20倍)的12AA培養基；僅含有濃度比20AA培養基高80倍的「前4種AA」—天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸及精胺酸之4AA培養基。 4AA培養基之設計支持比12AA培養基高之最大OD且與在酵母提取物及20AA培養基上獲得之最大OD匹配(圖7)。在4AA及12AA培養基中，tD為約2.5 h之快速生長的OD量測為至多約0.3，其後生長減緩。值得注意的是，所達成的為約2.5h之tD比用1 g/L如常用之酵母提取物的增補快約4倍。 隨後減緩之快速初始生長可由精胺酸耗盡來解釋。根據12AA培養基AA分析資料，吾人可發現，精胺酸為較佳AA且根據OD=0.37，其完全耗盡(圖8)。此資料亦指示，精胺酸與麩胺酸、天冬胺酸及組胺酸一起在OD 0.1-0.3之間藉由支持如所量測的為約2.5h之tD來強有力地促進生長，同時生長在精胺酸耗盡之後在OD 0.3-0.37之間減緩。同時觀測到鳥胺酸積聚。此外，偵測到明顯之丙胺酸積聚。 精胺酸耗盡之後的生長減速亦在4AA培養基中顯而易見(圖9)。除鳥胺酸之外，在精胺酸代謝期間亦偵測到瓜胺酸積聚。除了丙胺酸積聚以外，第一次亦有少量(約0.3mM)離胺酸及纈胺酸積聚，同時亦有未知峰(滯留時間8.3 min)顯示峰面積增大。 當初始快速生長為未預期的時，僅一對樣品可用於計算tD。因此，將BugLab生物質監測裝置與4AA培養基上之血清瓶連接以自培養基持續監測精胺酸耗盡之前生物質的增加。根據tD計算為約2 h，此實驗證實精胺酸耗盡之前4AA上之快速生長(圖10)。 甚至單獨的精胺酸增補會引起極佳生長，其中最大OD與在4AA培養基及酵母提取物上一樣高。含有5 g精胺酸/L + 5 g果糖/L的不含YE之PETC-MES培養基中的自產乙醇梭菌DSM10061之生長引起早期快速初始生長(t
D
大約為3 h)，隨後在第二階段中在精胺酸耗盡之後生長較為緩慢(t
D
為約40 h)(圖11)。 出人意料地，在初始快速生長階段期間，幾乎未產生乙酸酯。此外，乙酸酯產生與第二較慢生長階段中之生長有關(圖12)。 圖13展示精胺酸之快速利用。除了丙胺酸積聚以外，與4AA培養基類似，亦產生少量(約0.5 mM)離胺酸及纈胺酸。精胺酸耗盡之後在4AA培養基上發現顯示峰面積增大之相同未知峰(滯留時間8.3min)。 為在精胺酸培養基上獲得tD之較準確值，進行BugLab實驗以持續監測精胺酸耗盡之前生物質的增加。根據tD計算為約3 h，此實驗證實精胺酸耗盡之前之快速生長(圖14)。精胺酸上快於酵母提取物之生長在圖15中加以展示。
實例 2 用精胺酸增補強化自營生長
此實例說明當用精胺酸增補時自營生長下產乙酸菌自產乙醇梭菌DSM 23693的比生長速率增加且產生較少乙酸酯。 自產乙醇梭菌DSM 23693(自產乙醇梭菌DSM 10061之衍生物；美國專利2013/0217096)來源於DSMZ(德國微生物及細胞培養物保藏中心，Inhoffenstraße 7B，38124 Braunschweig，Germany)。 使用標準厭氧技術(Hungate, 《微生物學方法(
Meth Microbiol
)》, 3B: 117-132, 1969；Wolfe, 《先進微生物生理學(
Adv Microb Physiol
)》, 6: 107-146, 1971)及22 psi CO/CO
2
/H
2
氣體混合物(組成：50% CO、20% CO
2
、2% H
2
、28% N
2
)頂部空間壓力在不含酵母提取物之PETC-MES培養基(表1)中進行生長。 為研究精胺酸增補之作用，將5 g/L精胺酸添加至培養基中且將自營生長期間之培養物生長及代謝物產量與不含精胺酸之對照物進行比較。 生長後使用Thermo Genesys 20分光光度計量測光密度。藉由高效液相層析(HPLC)在具有在35℃下進行折射率(RI)偵測之安捷倫LC上量測代謝物乙酸酯(乙酸)、乙醇、2,3-丁二醇或乳酸。藉由用100 µL 5-磺基水楊酸溶液(1 w/v%，於1 M硫酸中)稀釋400 µL製備樣品，隨後在14,000 rpm下離心3分鐘；將上清液轉移至玻璃瓶中以進行分析。藉由以0.7 mL/min及在65℃下在等度條件下使用5 mM硫酸移動相於Alltech IOA-2000管柱(150 mm×6.5 mm×8 µm)上注射10 µL進行分離。 在37℃下以軌道震盪(120 rpm，震盪軌道)在體積為40 mL之培養基中在1 L肖特瓶(Schott bottle)中針對各條件用一式三份培養物(n = 3)以兩次生物重複進行實驗。在各情況下，產乙酸菌株自產乙醇梭菌DSM 23693預培養於不含酵母提取物之PETC-MES中至OD600 nm為0.3且單一預培養物用於接種。 在第一次實驗中，條件如下：不含酵母提取物之PETC-MES + 22 psi 合成氣(初始OD600 nm = 0.005)及不含酵母提取物之PETC-MES + 22 psi合成氣+ 5 g精胺酸/L(初始OD600 nm = 0.005)。 在重複實驗中，培養物亦接種於經精胺酸增補之培養基中但不添加CO/CO
2
/H
2
氣體(22 psi之100% N
2
作為頂部空間壓力)。此實驗包括以下三個條件：不含酵母提取物之PETC-MES + 22 psi 合成氣(初始OD600 nm = 0.03)、不含酵母提取物之PETC-MES + 22 psi 合成氣+ 5 g精胺酸/L(初始OD600 nm = 0.003)及不含酵母提取物之PETC-MES + 5 g精胺酸/L(初始OD600 nm = 0.003)。含有精胺酸之培養基接種直至初始密度比不含精胺酸之培養基低以接納第一次實驗中觀測到的使用精胺酸之出人意料地增加之比生長速率。 在兩次實驗中，含有精胺酸之培養物出人意料地快速生長(呈＜ 15 h之4次倍增，相當於tD = 3.5 h之倍增時間且比生長速率µ = 0.198)直至OD600 nm 為大約0.8，然而對照物之生長要較為緩慢得多，其中倍增時間tD = 7.3 h且特定生長速率µ = 0.095(圖16 +圖17)。因此在自營生長期間，精胺酸增補降低倍增時間且增加培養物之比生長速率超過50%。 自產乙醇梭菌之自營生長之對數轉換圖清楚地展示精胺酸增補降低倍增時間(圖18)。對於不含精胺酸增補之自營生長而言，所計算之倍增時間t
D
= 7.3 h ± 0.2，且在精胺酸增補之情況下t
D
= 3.5 h ± 0.2，降低52%。 在存在及不存在精胺酸下，培養物在自營生長期間均達至相同最終密度，指示精胺酸並未用作碳源而是僅服務於增加比生長速率(圖16 +圖17)。此亦在其中未供應氣體之培養物中得到證實，在48小時內在增補有精胺酸但不含CO/CO
2
/H
2
氣體混合物之培養物中未觀測到生長(圖17)。此支持了精胺酸在此等條件下並未用作碳源，而是使用CO/CO
2
用作碳源且藉由精胺酸代謝供應ATP之假設。 產乙酸菌之自營生長通常與乙酸酯(乙酸)產量有關，因為經由生長必不可少的乙酸激酶反應中的受質水準磷酸化乙酸酯形成物產生ATP。就此而論，到目前為止，發現所有經分離之產乙酸菌均會產生乙酸酯。然而，從方法的視角來看，乙酸酯形成並非所期望的，因為其使碳轉向遠離目標產物且已知為在若干百分比之低濃度下已對微生物具有毒性(J. Ballongue, E. Masion, J. Amine, H. Petitdemange及R. Gay, 《應用微生物學與生物技術(
Appl. Microbiol. Biotechnol.
)》, 1987,
26
, 568-573；G. Wang及D. I. Wang, 《應用環境微生物學(
Appl. Environ. Microbiol.
)》, 1984,
47
, 294-8)。在增補有5 g 精胺酸/L之生長培養基中，出人意料地，未觀測到淨乙酸酯產量直至OD
600 nm
為大約0.8下之生長中止，僅在此階段產生乙酸酯(圖19)。 此組實驗之結果表明，自產乙醇梭菌可利用精胺酸產生用於生長之ATP，且因此當供應精胺酸時，不需要產生乙酸酯。
實例 3 精胺酸利用路徑之鑑別及最佳化
此實例說明精胺酸如何向細胞提供額外ATP且可饋入至產乙酸菌之中央代謝中。 如實例1中所說明，精胺酸按化學計量轉化為鳥胺酸。在一些時間點處亦觀測到瓜胺酸積聚。在不希望受此理論束縛的情況下，此觀測結果指示精胺酸脫亞胺酶路徑作為機制。 此路徑將精胺酸轉化為鳥胺酸、銨、ATP及CO
2
。經強化之生長將藉由供應ATP及來自精胺酸降解之銨來促進。此ATP供應亦除去了用產乙酸菌產生乙酸酯之需要。
精胺酸脫亞胺酶路徑經由三個酶促步驟，藉由精胺酸脫亞胺酶(EC 3.5.3.6)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(腐胺胺甲醯基轉移酶)(EC 2.1.3.3)及胺基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)催化進行。已在自產乙醇梭菌之基因組中鑑別出相應酶(包含兩種精胺酸/鳥胺酸轉運子基因/酶)，鳥胺酸胺甲醯基轉移酶，且胺基甲酸激酶以多複本形式存在(表4)。能夠催化相同反應之酶亦存在於其他生物體中，所述生物體包含諸多產乙酸菌，包含永達爾梭菌、糞味梭菌、德雷克梭菌及長醋絲菌(表5)。此路徑亦存在於斯氏梭菌或大腸桿菌中。 表4：自產乙醇梭菌中精胺酸脫亞胺酶路徑之經鑑別之基因/酶
表5：其他生物體中脫亞胺酶路徑之經鑑別之基因/酶
特定言之，若觀測到呈瓜胺酸形式之中間體積聚，則為了增加路徑效能，可過度表現相應基因或可由本領域技術人員使用先前所述之方法[US 2013/344547、US 2013/330809、US 2013/323820、US 2013/224838、US 2013/224839、US 2011/256600、US 2011/236941]引入且異源表現來自其他來源之基因。 鳥胺酸自身可進一步轉化為丙胺酸，其在實例1中亦顯示會積聚。此轉化亦產生額外還原相等物NADP(H)，以及另一個氨分子及來自CoA之關鍵構建塊乙醯基-CoA。 如圖23中所示，經由酶促步驟鳥胺酸消旋酶(EC 5.1.1.12)、鳥胺酸胺基變位酶(EC 5.4.3.5)、2,4-二胺基戊酸脫氫酶(EC 1.4.1.12)及2-胺基-4-側氧基戊酸硫解酶(EC 2.3.1.B10)進行將鳥胺酸轉化為丙胺酸及乙醯基-CoA。已針對來自斯氏梭菌或環境樣品之實例描述相應酶且已在自產乙醇梭菌中鑑別同系物(表6)。
表 6 ： 來自斯氏梭菌或環境樣品及自產乙醇梭菌同系物的鳥胺酸轉化為丙胺酸及乙醯基 -CoA 之路徑之經鑑別之基因 / 酶。
特定言之，當觀測到鳥胺酸積聚時，為了增加路徑效能，可過度表現相應自產乙醇梭菌基因或可由本領域技術人員使用先前所述之方法(WO2012/053905、WO2012/115527、WO2013/180584)引入且異源表現來自表6之斯氏梭菌或環境樣品之基因。若生物體適用於隨時間推移在精胺酸上生長，則亦可改適且進化生物體以較有效地利用鳥胺酸。 為了達成路徑中之通量，亦可需要基因剔除精胺酸:鳥胺酸轉運子(CAETHG_3023-24)以避免鳥胺酸輸出至細胞外。此類剔除可由本領域技術人員使用先前所述之方法(W2012/053905、WO2012/115527及WO2013/180584)來達成。可能進一步需要添加替代性精胺酸轉運子。基因剔除精胺酸:鳥胺酸轉運子之替代性方法可為引入鳥胺酸輸入子，以便鳥胺酸可進一步代謝。 亦在基因組級模型重構中模擬經鑑別之路徑以顯示代謝作用且確認經鑑別之路徑。 基於公開方法生成針對自產乙醇梭菌之基因組級代謝重構(L.-E. Quek及L. K. Nielsen, 《基因組資訊學報(Genome Inform.)》, 2008, 21, 89-100；C. G. de Oliveira Dal'Molin, L.-E. Quek, R. W. Palfreyman, S. M. Brumbley及L. K. Nielsen, 《植物生理學報(Plant Physiol.)》, 2010, 152, 579-89；C. Licona-Cassani, E. Marcellin, L.-E. Quek, S. Jacob及L. K. Nielsen, Antonie Van Leeuwenhoek, 2012, 102, 493-502.)。使用SEED模型註釋管線重構基因組級模型之核心(C. S. Henry, M. DeJongh, A. A. Best, P. M. Frybarger, B. Linsay及R. L. Stevens, 《自然生物技術(
Nat. Biotechnol.
)》, 2010,
28
, 977-82)。重構保留了來自SEED模型之所有反應屬性，包含特有反應、化合物ID及反應之可逆性。以Excel(微軟公司(Microsoft Corporation))形式手動填充模型間隙以便於註釋及評論，特定言之，手動管理中央代謝及以上經鑑別之精胺酸利用路徑。根據此基因中心資料庫，使用Java(甲骨文公司(Oracle Corporation))應用程式生成2D反應中心系統生物學標示語言(SBML，http://www.sbml.org)表示法。使用COBRA工具箱進行基於約束條件之重構(http://opencobra.sourceforge.net/) (J. Schellenberger, R. Que, R. M. T. Fleming, I. Thiele, J. D. Orth, A. M. Feist, D. C. Zielinski, A. Bordbar, N. E. Lewis, S. Rahmanian, J. Kang, D. R. Hyduke及B. Ø. Palsson, 《自然協定(
Nat. Protoc.
)》, 2011,
6
, 1290-307)。針對基於約束條件之模型化之一組腳本在MATLAB環境內運行。通量平衡分析(Orth等人，2010)用於預測生長所必不可少之營養物，且進行影子價格分析(shadow price analysis)以研究胺基酸(AA)對自產乙醇梭菌之有益作用，且測定何種AA對於產生ATP具有最大影響。通量平衡分析(FBA)已用於預測生長所必不可少之營養物(Fan等人，2014；Song等人，2008)、AA增補對目標產物合成之作用(Licona-Cassani等人，2012)且結合影子價格分析(Hillier及Lieberman，2010)以測定對產生ATP具有最大作用之受質(Teusink等人，2006)。 針對AA之習知影子價格分析可能具有誤導性。若在自營條件周圍(亦即在零攝入下)進行影子價格分析，則其將顯示在培養基供應給定AA之情況下，AA合成之機會成本，亦即，可能釋放之資源。待合成的最昂貴之AA未必為產生ATP之最佳受質。舉例而言，可能不存在可利用之降解路徑。 為了克服此問題，進行偏移影子價格分析。允許20種AA中之每一者的最大通量為1.4 mmol/gDCW/h，同時針對生物質產生進行最大化。此通量為觀測到的在初步生長實驗期間在標準PETC-MES培養基(包含酵母提取物(YE))及果糖上自產乙醇梭菌DSM 10061之最大比果糖攝入速率。不存在降解路徑之情況下的AA無法利用所允許之最大通量且因此影子價格將為零。影子價格分析自習知20種AA中鑑別九種AA：麩醯胺酸、組胺酸(HIS)、半胱胺酸(CYS)、蘇胺酸、天冬胺酸(ASP)、精胺酸(ARG)、甘胺酸、絲胺酸及麩胺酸(GLU)，所述九種AA由於引起較快生長而為自產乙醇梭菌應偏好之AA。 AA之模型預測在針對所預測九種AA之8種的20AA培養基上得到證實(圖2)，僅不包括甘胺酸。值得注意的是，每生物質之ASP、GLU、HIS及ARG攝入量比生物質合成所需之攝入量高超過20倍。基於丙酮丁醇梭菌中所獲取之量測結果(Lee等人，2008)將生物質中之期望濃度(細胞需要量)與每公克生物質之AA攝入量進行比較。 出人意料地，在另一所設計的12AA培養基上發現，ASP、GLU、HIS及ARG之攝入量比生物質合成所需的攝入量高超過120倍且其能夠實現明顯較快生長。此表明ASP、GLU、HIS及ARG參與能量產生之潛能。有趣的是，伴隨快速生長階段期間精胺酸耗盡，偵測到鳥胺酸積聚(圖8)，其指出精胺酸脫亞胺酶(ADI)路徑參與提供具有額外ATP之細胞的潛能。值得注意的是，初始觀測到之快速生長(tD=2.5±0.1 h)與使用20種AA之所預測之生長(tD=2.9 h)非常接近。 有趣的是，與YE(36.6 mmol/gDCW)相比，當精胺酸充足時在生長期間在含有ASP、GLU、HIS及ARG之培養基(4AA培養基)(8.2±0.2 mmol/gDCW)及僅含有精胺酸之培養基(ARG培養基)(6.7±0.7 mmol/gDCW)中觀測到每生物質之乙酸酯產量實質上較低。精胺酸耗盡之後乙酸酯產量大大增加(對於4AA培養基及ARG培養基而言分別為46.5±11.2 mmol/gDCW及34.5±9.3 mmol/gDCW)，其表明精胺酸代謝大大降低用產乙酸菌產生乙酸酯之必要性的可能性。 在12AA培養基上生長之自產乙醇梭菌之異營培養物積聚有鳥胺酸，伴隨精胺酸耗盡(圖8)。在具有高分率(大約60%)之所消耗之碳(呈鳥胺酸形式排出)的4AA培養基及僅含精胺酸之培養基生物反應器實驗中發現相同結果(圖22)。此外，偵測到大量CO
2
碳通量以及顯著瓜胺酸積聚。其他少量副產物包括乙酸酯、丙胺酸及乙醇。總而言之，鳥胺酸、CO
2
及瓜胺酸之大量碳通量表明精胺酸經由ADI路徑代謝，說明其經由供應ATP之生長強化作用(圖21)。此外，精胺酸完全化學計量轉化為鳥胺酸、CO
2
及瓜胺酸暗示精胺酸經精確代謝以用於產生能量而非合成生物質。此與當向經N
2
氣體加壓的含有肖特瓶之不含YE之PETC-MES僅增補精胺酸時未觀測到生長之結果一致。 在4AA培養基及僅含精胺酸之培養基上藉由初始計算機模擬(initial in silico simulation)預測ADI路徑參與促進較快生長。預測總比ATP產生速率(q
ATP
；mmol ATP/gDCW/h)在後面的條件(SIM 4及SIM 5)中比使用果糖(SIM 1)作為唯一碳源之計算結果高大約6倍(表7)。當使用經以實驗方式自4AA(SIM 6及SIM 9)及僅含精胺酸(SIM 12及SIM 15)之培養基上的生物反應器實驗測定之受質攝入量及產物分泌速率(不包括瓜胺酸及CO
2
)限制模型時觀測到相同結果，其中q
ATP
比僅在果糖上預測之q
ATP
高大約3倍至4倍。可藉由精胺酸代謝(藉由ADI路徑之胺基甲酸激酶)期間由受質水準磷酸化產生明顯較多能量及間接經由由產生且排出NH
4 +
而產生質子原動力來解釋所觀測到的比不含AA增補之所預測之生長(t
D
為約14 h)快的AA上之生長(t
D
為約3 h至4 h)。後者藉由降低經添加NH
4
OH來中和pH之需要亦有益於降低生物方法成本。
表 7 ： 預測在存在及不存在精胺酸增補之情況下異營生長期間的比生長速率、 ATP 產生 速率及產物之模型模擬 ：
經由精胺酸增補實現的快速生長及低乙酸酯合成與生物技術行業相關，因為減少針對不合需要之副產物乙酸酯的碳通量及由替代性路徑產生之額外ATP對擴增產乙酸菌之產物光譜為至關重要的。 可使用基因組級模型估計細胞內代謝通量圖且藉由用以實驗方式量測之資料限制模型來計算碳、氧化還原及能量平衡(Bordbar等人，2014；Dash等人，2016；O'Brien等人，2015)。利用與Marcellin所述之基因組級代謝模型(來自廢氣之低碳燃料及商用化學品—理解產乙酸菌模型中之能量代謝的系統性方法《(Low carbon fuels and commodity chemicals from waste gases - Systematic approach to understand energy metabolism in a model acetogen)》,《綠色化學(Green Chem)》, 2016)相類似的自產乙醇梭菌之基因組級代謝模型。吾人針對AA培養基及僅含精胺酸之培養基上之異營實驗藉由進行如上所述之通量平衡分析計算來進行基因組級模型分析。另外用比受質攝入速率及比產物分泌速率(不包括瓜胺酸及CO
2
)及細胞tD對模型加以限制。最大化ATP消耗(亦即未計入之ATP成本；參見下文)用作進行FBA(此處不包括維持能量成本)之目標函數。 藉由比僅在果糖(SIM 1)上生長所預測之6.8 mmol ATP/gDCW/h之q
ATP
值高大約3倍至4倍之q
ATP
(對於4AA培養基及ARG培養基分別為29.3±5.5 mmol ATP/gDCW/h及19.9±1.0 mmol ATP/gDCW/h)來促進4AA培養基及ARG培養基(表7中的SIM 6與SIM 9及SIM 12及SIM15)上之快速生長。本發明人認為4AA培養基上觀測到的比ARG培養基快之生長係藉由經由產生ATP之乙酸激酶反應的高2倍之特定通量來解釋(圖24)。然而，在兩種培養基上經由ADI路徑均產生約53% ATP(圖24)，其顯示精胺酸代謝完全重組能量代謝。有趣的是，儘管精胺酸耗盡在許多細菌中為有利的(Abdelal，1979；Adamberg等人，2006；Lahtvee 等人，2011；Mehmeti等人，2011)，但其對能量產生之貢獻為可變的。 亦分析果糖及AA上之異營生長期間所預測的最佳通量圖。當用以實驗方式量測之受質攝入速率及先前所計算之未計入ATP成本限制模型且針對生物質產生進行最大化時，此等計算預測生長(4AA培養基t
D
=1.4±0.2 h，SIM 7及SIM 10；ARG培養基t
D
=2.2±0.1 h，SIM 13及SIM 16)比以實驗方式觀測到之生長(分別為t
D
=2.8±0.1 h及t
D
=3.7±0.0 h)要快。此外，在模擬中，精胺酸代謝期間產生之鳥胺酸分解代謝為GLU，其表明可經由上述鳥胺酸路徑進一步代謝鳥胺酸。因此所預測之較快生長來自使用甲基天冬胺酸路徑(如上所述)將GLU代謝為丙酮酸，且其進一步轉化為乙醯基-CoA及乙酸酯，產生減少之Fd及ATP。
實例 4 作為唯一氮源之精胺酸上之生長
此實例說明用精胺酸替代銨作為氮源。 氮氣為細菌之必不可少的營養物，且通常在醱酵中使用銨，且銨亦用作公開的針對產乙酸菌之培養基配方中的氮源(M. Köpke, C. Held, S. Hujer, H. Liesegang, A. Wiezer, A. Wollherr, A. Ehrenreich, W. Liebl, G. Gottschalk及P. Dürre, 《美國國家科學院院刊(
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
)》, 2010,
107
, 13087-92；J. Mock, Y. Zheng, A. P. Mueller, S. Ly, L. Tran, S. Segovia, S. Nagaraju, M. Köpke, P. Dürre及R. K. Thauer, 《細菌學雜誌(
J. Bacteriol.
)》, 2015,
197
, 2965-2980；H. Richter, M. E. Martin及L. T. Angenent, 《能量(
Energies
)》, 2013,
6
, 3987-4000；J. L. Cotter, M. S. Chinn及A. M. Grunden, 《生物方法生物系統工程學(
Bioprocess Biosyst. Eng.
)》, 2009,
32
, 369-80. M. Straub, M. Demler, D. Weuster-Botz及P. Dürre, 《生物技術雜誌(
J. Biotechnol.
)》, 2014. )。然而，銨產量視經由哈伯-波希法(Haber-Bosch process；www.essentialchemicalindustry.org/chemicals/ ammoinia.html)之能量(主要為天然氣或液化石油氣(LPG))之充裕供應而定，且因此為不可持續源。此外，銨離子對醱酵中的pH具有一定影響。 實例3之經鑑別之路徑提供將1 mol精胺酸轉化為3 mol氨氣。因此精胺酸可為細菌提供替代性氮源，將氨氣直接提供至代謝中，同時仍提供上文所述之優點。由於1個精胺酸分子可分解成3個氨分子，所需較低量由較便宜之精胺酸價格(根據Sigma Aldrich或Fisher，99%食品級精胺酸成本為大約~US$ 17-18,000/1000 kg，而30%工業級氨成本為~US$ 10-11,000/1000 kg)及減少之處理引起顯著成本節約。此外，精胺酸可例如藉由醱酵可持續地衍生自生物源(T. Utagawa, 《營養學雜誌(
J. Nutr.
)》, 2004,
134
, 2854S-2857)。 為了說明精胺酸可用作針對產乙酸菌自產乙醇梭菌DSM 23693之唯一氮源，使生物體在省去1 g/L氯化銨(NH
4
Cl)而含有0.33 g/L非合成性L-精胺酸單鹽酸鹽(Sigma Aldrich；A6969)的不含YE之PETC-MES培養基上生長。
實例 5 精胺酸增補引起來自異源路徑 ， 特定言之消耗 ATP 之 路徑的非天然產物之產量增加
此實例說明精胺酸增補會來自異源路徑之非天然產物的產量。 已說明在產乙酸菌中由氣體產生若干非天然產物[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584、WO2013185123、WO2013191567]。通常觀測到一定含量的呈副產物形式之乙酸酯，因為生物體經由乙酸激酶反應由受質水準磷酸化產生ATP。對於需要ATP作為例如(但不限於)針對異戊二烯或其他萜烯酯之產生路徑(甲羥戊酸路徑)或產生類似生物柴油之脂肪酸衍生產物(經由脂肪酸生物合成)的路徑而言情況尤其如此。然而，對於不直接需要ATP且伴隨乙酸酯形成，例如(但不限於)產生異丙醇、丙酮、丁醇(經由ABE路徑)每乙醯基-CoA亦不產生相同量之ATP的其他醱酵路徑而言情況亦如此。 使用通量平衡分析(FBA)用自產乙醇梭菌基因組級模型(描述於實例3中)來模擬由氣體產生異丙醇。將異源路徑(表4)添加至模型中且在存在及不存在精胺酸增補之情況下進行最大理論產量之模擬(表5)。 表8：異源路徑
表9：在存在及不存在精胺酸增補之情況下來自CO及CO
2
/H
2
之目標產物異戊二烯或異丙醇之最大理論產率(以mmol/gDW/h為單位)的FBA分析：
模擬顯示精胺酸增補可在CO及CO
2
/H
2
上明顯增加目標化合物異丙醇及異戊二烯最大理論產生產率。藉由攝入少量精胺酸(2mM，0.34 g/L)，來自CO之最大異丙醇產量已可明顯增加超過20%(自5.06 mmol/gDW /h增加至6.42 mmol/gDW/h)。對於由CO產生異戊二烯的消耗ATP之甲羥戊酸路徑而言，最大產量可甚至較明顯增加超過30%(自1.97 mmol/gDW/h增加至2.58 mmol/gDW/h)。對於CO
2
/H
2
，作用甚至更為明顯，其中最大異丙醇產量可增加超過25%(自5.0 mmol/gDW/h增加至6.36 mmol/gDW/h)，且異戊二烯產量可增加45%(自1.26 mmol/gDW/h增加至1.83 mmol/gDW/h)。此清楚地表明，可使用精胺酸來增加非天然目標分子之產量。 模擬亦顯示，當共利用2 mM精胺酸時，即便攝入較少CO，產量仍有所增加，其表明精胺酸增補改良針對目標分子之碳效率。
實例 6 使用精胺酸抑制子作為基因開關以驅動異源路徑之表現
此實例說明精胺酸可用作基因開關以驅動異源路徑之表現。 發現實例3之經鑑別之精胺酸脫胺酶路徑中的所有基因群集在一起且亦發現精胺酸抑制子ArgR。已在包含大腸桿菌之微生物範圍內鑑別操縱序列(為了防止基因轉錄argR蛋白質所結合之DNA序列)(Tian等人, 1992, 《分子生物學雜誌(J. Mol. Biol)》, 226, 第 387-397頁)且結合位點通常在細菌譜系中為保守的(Makarova等人, 2001, 《基因組生物學(Genome Biol.)》 2,第1-8頁)。 精胺酸抑制子藉由結合至回文操縱序列控制基因表現，所述回文操縱序列位於精胺酸脫亞胺酶起始密碼子之上游大約45 bp處。添加精胺酸使得抑制子解除結合至操縱序列，使得操縱序列之下游的基因發生轉錄。在預示實例中，異源基因表現可藉由添加精胺酸來活化。若將結合argR之操縱序列添加至異源基因之上游區域，則argR蛋白質將抑制異源基因表現。隨後，基因表現可藉由添加精胺酸來活化。 在一個實例中，異源基因可編碼需要ATP以合成產物之代謝路徑。舉例而言，甲羥戊酸路徑為以每莫耳異戊烯基-二磷酸3 mol ATP為代價將乙醯基-CoA轉化為異戊烯基-二磷酸之異源路徑。使用所述方法，異源甲羥戊酸路徑之表現可藉由添加精胺酸來活化，其亦將經由精胺酸脫亞胺酶路徑經由降解精胺酸來提供針對甲羥戊酸路徑之ATP。
實例 7 最佳化精胺酸與氣態受質 CO 及 / 或 H2 及 / 或 CO2 之共利用效率
為了達成精胺酸與氣態受質CO及/或H
2
及/或CO
2
之高效共利用，可需要移除調節。此可藉由基因剔除上述精胺酸抑制子ArgR以移除精胺酸脫胺酶路徑之基因之抑制來達成。此類基因剔除可由本領域技術人員使用先前所述之方法[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584]來達成。然而，移除精胺酸抑制子將不允許藉由添加如上所述之精胺酸來活化異源基因表現。替代性方法將為移除精胺酸脫胺酶路徑操縱子之上述操縱結合序列上游或用組成性啟動子或合成性啟動子替代精胺酸脫胺酶路徑操縱子之上游區域，包含操縱序列及啟動子序列。此類修改可由本領域技術人員使用先前所述之方法[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584]來達成。適合之組成性啟動子及合成性啟動子為例如(但不限於)鐵氧化還原蛋白啟動子Pfdx、乙酸激酶啟動子Ppta或先前所述之Ptet或PIPL12 [US 20160160223；Nagaraju等人，《使用CRISPR/Cas9之自產乙醇梭菌之基因組編輯(Genome editing of Clostridium autoethanogenum using CRISPR/Cas9)》，《生物燃料生物技術(Biotechnol Biofuels.)》 2016; 9: 219]。 類似地，可用組成性啟動子及合成性啟動子或相應調節子剔除或阻斷來替代對CO及/或H
2
及/或CO
2
利用負責之基因之啟動子區域，諸如伍德-永達爾叢集或Hyt操縱子(Brown等人, 《單分子定序與處理自產乙醇梭菌之基因組之雜交方法的對比及梭菌屬相關行業中CRISPR系統之分析(Comparison of single-molecule sequencing and hybrid approaches for finishing the genome of Clostridium autoethanogenum and analysis of CRISPR systems in industrial relevant Clostridia.)》 《生物燃料生物技術(Biotechnology for Biofuels)》2014 7:40)。本領域熟習此項技術者將能夠自如實例10中所述之轉錄組學資料鑑別此類調節子。
實例 8 替代性精胺酸利用途徑及腐胺之產生
此實例說明可產生呈副產物形式之腐胺的替代性精胺酸利用路徑。 利用精胺酸之另一可能性途徑係經由精胺酸脫羧作用而非脫胺作用：精胺酸可藉由酶(精胺酸脫羧酶)脫羧為精胺及CO
2
。精胺可隨後藉由酶(精胺脫亞胺酶)轉化為N-胺甲醯腐胺，亦產生銨。N-胺甲醯腐胺加上磷酸可藉由腐胺胺甲醯基轉移酶轉化為腐胺加上胺甲醯磷酸酯。胺甲醯磷酸酯加上ADP藉由胺基甲酸激酶經由與精胺酸脫亞胺酶路徑相同之機制轉化為銨+ ATP +CO
2
。銨與ATP之淨產量與精胺酸脫亞胺酶路徑相同，但伴隨兩種不同中間體(精胺及N-胺甲醯腐胺而非瓜胺酸)及不同副產物(腐胺而非鳥胺酸)。 腐胺為值大於鳥胺酸或精胺酸之副產物且可用作產生包含耐綸-4,6(Qian等人, 2009, 《生物技術與生物工程》104, 第651-662頁)及聚胺基甲酸酯(Dahiyat等人, 1993, 《生物材料科學聚合物版雜誌(J. Biomater. Sci. Polym. Ed.)》, 4,第529-543頁)之各種聚合物的饋料。 表10.
實例 9 丙胺酸之產生及經由異源路徑轉化為 3-HP 或丙烯酸
此實例說明丙胺酸轉化為3-羥丙酸酯或丙烯酸。 藉由自產乙醇梭菌由精胺酸產生丙胺酸已在實例1中加以說明。丙胺酸可進一步轉化為高值產物3-羥丙酸酯(3-HP)或丙烯酸。 丙胺酸轉化為丙烯酸酯已展示於丙酸梭菌中(Dalal RK, Akedo M, Cooney CL, Sinskey AJ (1980) 《用於產生丙烯酸之微生物途徑(A microbial route for acrylic acid production)》 《生物源分解(Biosources Dig)》 2:89-97)。可經由丙二醯半醛及3-HP或經由丙胺醯基-CoA進行轉化。3-HP及丙胺醯基-CoA可轉化為丙烯醯基-CoA且進一步轉化為丙烯酸酯。丙酸梭菌之分離基因/酶可由本領域技術人員使用先前所述之方法[W2012053905、WO2012115527、WO2013180584]引入且異源表現以產生3-羥丙酸酯或丙烯酸酯。
實例 10 轉錄組分析
使用RNA定序對4AA培養基(詳情參見表2)上異營生長的生物雙重複自產乙醇梭菌生物反應器培養液進行轉錄組分析。在平衡生長階段及所有4AA之攝入期間，收集大約35 mL之0.3 gDCW/L培養液，粒化(在4℃下，5000 × g，3 min)且再懸浮於5 mL RNAlater(凱傑(Qiagen))中。在4℃下儲存樣品隔夜，離心(在4℃下，4000 × g，10 min)且在-80℃下儲存集結粒直至進一步加工。對冷凍集結粒進行解凍，提取總RNA，且如Marcellin等人，2013中所述製備mRNA庫。使用Illumina Hiseq-2000定序器進行定序。 將4AA培養基上之基因表現圖與在標準PETC-MES(包含YE)上異營生長且先前已公開(Marcellin等人，2016)之相同自產乙醇梭菌菌株(DSM 10061)的RNA-seq資料進行比較。對兩種異營條件之定序讀數進行微調以避免讀數誤差，且隨後使用TopHat2(Kim等人，2013)針對基因組與每讀取對準所允許之兩種錯配對準/重新對準。由Cufflinks使用FPKM函數使四分位數標準化估算轉錄物豐度。CuffDiff用於估計不同經表現之轉錄物，且Cuffnorm用於資料標準化。低於0.05之q值(使用假發現率；Benjamini及Hochberg，1995)用於測定大量基因表現變化。 進行使用RNA定序(RNA-seq)之轉錄組分析以進一步得到在基因表現水準下ADI路徑參與之確定證據。就此而言，在平衡生長階段期間對4AA培養基上異營生長的生物雙重自產乙醇梭菌生物反應器培養液進行取樣。將此RNA-seq資料集與在標準含YE之PETC-MES培養基上異營生長(果糖)之相同自產乙醇梭菌菌株(DSM 10061)之先前已公開的資料集(Marcellin等人，2016)進行比較。 轉錄組分析證明ADI路徑之作用，因為與YE相比當細胞在增補有4AA之PETC-MES上生長時，所有ADI路徑基因均上調超過500倍(q值＜0.001)。此外，觀測到推定精胺酸-鳥胺酸反向轉運蛋白基因(CAETHG_3023及CAETHG_3024)上調超過380倍(q值＜0.001)。根據與自產乙醇梭菌中瓜胺酸降解為胺甲醯磷酸酯及鳥胺酸有關的四個基因，吾人之資料指示鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(CAETHG_3022)為自產乙醇梭菌中的ARG代謝期間的通量催化蛋白質(上調645倍；q＜0.001)，因為在經比較之條件之間其同功異構酶下調(CAETHG_0449及CAETHG_0591)或顯示不變(CAETHG_2082)。類似地，根據與胺甲醯磷酸酯降解為CO
2
有關的五種基因，CAETHG_3025之胺基甲酸激酶似乎為通量催化蛋白質(上調623倍；q＜0.001)，因為其FPKM值比其同功異構酶之FPKM值高1000倍。
實例 11 最佳化中央代謝中精胺酸之結合效率
鑑別天然代謝中之基因的轉錄組學分析測定精胺酸利用之通量及結合至隨鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(CAETHG_3022)及胺基甲酸激酶(CAETHG_3025)之中央代謝中。為了改良效率，可使用強或誘導性啟動子過度表現此等基因，所述啟動子例如(但不限於)鐵氧化還原蛋白啟動子Pfdx、乙酸激酶啟動子Ppta或先前所述之Ptet或PIPL12 [US 20160160223；Nagaraju等人，《使用CRISPR/Cas9之自產乙醇梭菌之基因組編輯》， 《生物燃料生物技術》 2016; 9: 219]。 本文中所引用之所有參考文獻，包含公開案、專利申請案及專利均以引用之方式併入本文中，所述引用程度就如同個別及特定地指示各參考文獻以引用之方式併入且全文闡述於本文中一般。在本說明書中對任何先前技術之提及並非且不應視為承認先前技術形成任何國家所致力領域之公共常識的一部分。 除非本文中另外指明或上下文中明顯矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)使用之術語「一(a)」與「一(an)」及「所述」及相似指示物均應解釋為涵蓋單數及複數。除非另外指出，否則術語「包括」、「具有」、「包含」及「含有」應理解為開放性術語(亦即意謂「包含(但不限於)」)。除非本文中另外指示，否則本文中值範圍的敍述僅僅意欲充當個別提及屬於所述範圍的各單獨值的速記方法，且各單獨值併入本說明書中，如同在本文中個別地敍述一般。 除非本文另外指明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅意欲更好地說明本發明而非限制本發明之範疇。本說明書中之語言均不應解釋為將任何未主張之要素指示為對實踐本發明而言必不可少。 本文中描述本發明之較佳實施例。在閱讀前文描述之後，彼等較佳實施例之變化對本領域中一般熟習此項技術者而言可變得顯而易見。本發明人期望熟習此項技術者按需要採用該等變化，且本發明人意欲以不同於本文中所特定描述之方式來實踐本發明。因此，若適用法律允許，則本發明包括在此隨附的申請專利範圍中所敍述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指明或者與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。