JP6554102B2 - 発酵プロセス - Google Patents
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Description
本出願は、2013年9月22日に出願された米国仮出願第61/880,970号からの優先権を主張するものであり、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
定義
本発明の1つの態様は、炭素質のガス状基質を分岐鎖アミノ酸に変換する能力の低下を有するカルボキシド栄養性酢酸生成微生物の提供である。ケトール酸レダクトイソメラーゼである酵素は、部分的または全体的にその活性を減少させる突然変異によって不活性化され得る。微生物が天然にまたは修飾によって、アセト乳酸塩由来の有用な炭素含有化合物を生成する能力を有する場合、ケトール酸レダクトイソメラーゼの能力を減少させることは、有用な化合物の蓄積をもたらすであろう。
本発明の1つの態様は、アセト乳酸シンターゼ活性のレベルを増加させるように適合される1つ以上の遺伝的修飾を含むカルボキシド栄養性酢酸生成微生物の提供である。ガス状の炭素質基質の増殖及び/または発酵時、微生物は、親微生物と比較して、増加した量のアセト乳酸塩を生成する。アセト乳酸シンターゼは、配列番号2に従うアミノ酸配列を有し得る。
ガス状基質(上記の背景技術の項で記載されたもの等)からエタノール及び他のアルコールの生成のためのプロセスは既知である。例示的プロセスとしては、例えば、国際公開第WO2007/117157号及び同第WO2008/115080号、ならびに米国特許第6,340,581号、同第6,136,577号、同第5,593,886号、同第5,807,722号、及び同第5,821,111号に記載されるものが挙げられ、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
COを含有する基質
二酸化炭素及び水素を含む基質は、発酵反応において使用し、本発明のある特定の実施形態に従って、酢酸塩を生成する。ガス状基質は、COを含有する基質に関して、上記に論じられるように、産業プロセスの副生成物として得られる廃ガスでもよい。当業者であれば、CO2を生成するプロセスが論じられたものに限定されないことが理解されよう。CO2及びH2は、任意の好適な源に由来され得る。CO2及びH2は、同じ源に由来され得るか、またはあるいは、CO2及びH2は、異なる源に由来され、次いで、混ぜ合わせて、CO2及びH2を含む基質を生成し得る。
本発明の他の態様によれば、産業廃ガスが発酵反応に使用され、その際、それに好適なガスを作製するために使用される追加のスクラビングまたは前処理ステップがないかまたはごく最小限である。
発酵反応.発酵反応の効率、アルコール生成、及び/または全体的な炭素捕捉を改善するために、CO及びH2を含む改質された基質流を1つ以上のさらなる流とブレンドすることが望ましい場合がある。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のいくつかの実施形態において、カルボキシド栄養性細菌は、下記に従ってCOをエタノールに変換する。
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
しかしながら、H2の存在下では、全体的な変換は次の通りであり得る。
6CO+12H2→3C2H5OH+3H2O
1つ以上の微生物及び基質の増殖からエタノール及び/または酢酸塩への発酵を生じさせるために、基質に加えて、好適な栄養培地は、バイオリアクタに供給される必要があることが理解されるであろう。栄養培地は、使用される微生物を増殖させるのに十分なビタミン及びミネラル等の成分を含有する。ほんの一例として、クロストリジウム・オートエタノゲナムの増殖に適している嫌気性培地は、例えば、Abriniら(Clostridium autoethanogenum,sp.Nov.,An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide;Arch.Microbiol.,161:345−351(1994))によって記載されるように、当該技術分野で既知である。以下の本明細書の「実施例」の項は、好適な培地のさらなる例を提供する。
発酵は、例えば、固定化細胞反応器、ガスリフト反応器、バブルカラム反応器(BCR)、膜反応器、例えば、中空繊維膜バイオリアクタ(HFM BR)、またはトリクルベッド反応器(TBR)等の、任意の好適なバイオリアクタ内で行うことができる。また、本発明のいくつかの実施形態において、バイオリアクタは、微生物が培養される第1の増殖リアクタと、増殖リアクタからの発酵ブロスが供給され、かつ発酵生成物(例えば、エタノール及び酢酸塩)の大部分が生成され得る第2の発酵リアクタとを備え得る。本発明のバイオリアクタは、CO2、H2、及び任意に、COを含有する基質を受容するように適合される。
ガス状基質からエタノール及び他のアルコールの生成のためのプロセスは既知である。例示的なプロセスとしては、例えば、国際公開第2007/117157号、同第2008/115080号、同第2009/022925号、同第2009/064200号、米国第6,340,581号、同第6,136,577号、同第5,593,886号、同第5,807,722号、及び同第5,821,111号に記載されるものが挙げられ、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
発酵は、望ましくは、基質からエタノール及び/または酢酸塩への発酵を生じさせるために、適切な条件下で行われるべきである。考慮されるべき反応条件としては、温度、培地流量、pH、培地の酸化還元電位、撹拌速度(連続撹拌槽リアクタを使用する場合)、植菌レベル、基質レベルが制限的にならないことを確保するバイオリアクタへの基質の導入の最大基質濃度及び速度、ならびに生成物抑制を回避するための最大生成物濃度が挙げられる。
本発明の方法は、様々な炭化水素生成物のうちのいずれかを生成するために使用することができる。これは、アルコール、酸、及び/またはジオールを含む。より具体的には、本発明は、ブチレート、プロピオネート、カプロン酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、2,3−ブタンジオール、プロピレン、ブタジエン、イソブチレン、及びエチレンを生成するための発酵に適用可能であり得る。一実施形態において、本発明は、プロパノール及びブタノールが挙げられるが、これらに限定されない、アルコールを生成するために使用することができる。次いで、アルコール(複数可)を酢酸塩と反応させて、酢酸プロピルまたは酢酸ブチルを含む生成物(複数可)を生成することができる。当業者であれば、本発明が言及されるアルコール及び生成物に限定されず、任意の適切なアルコール及びまたは酸が生成物を生成するために使用することができることを理解されよう。
発酵反応の生成物は、既知の方法を用いて回収され得る。例示的な方法としては、国際公開第07/117157号、国際公開第08/115080号、米国第6,340,581号、米国第6,136,577号、米国第5,593,886号、米国第5,807,722号、及び米国第5,821,111号に記載のものが挙げられる。しかしながら、簡潔に、単なる例として、エタノールは、分別蒸留または蒸発、及び抽出発酵等の方法によって、発酵ブロスから回収され得る。
本発明の実施形態は、例として記載されている。しかしながら、一実施形態で必要な特定のステップまたは段階が、別の実施形態において必要でない場合があることが理解されるべきである。反対に、特定の実施形態の説明に含まれるステップまたは段階は、具体的に記載されない実施形態において任意に有利に利用されてもよい。
実施例
材料及び方法
C.オートエタノゲナムDSM23693を用いた発酵を1.5Lのバイオリアクタ中で、37℃で行った。表1に従って、培地を調製した。嫌気性を得るために、反応容器に窒素を散布した。植菌前に、ガスを、H2(3%)、N2(30%)、CO(47%)、及びCO2(20%)を含有する製鋼所ガスまたは純ガス(50%のCO、18〜40%のCO2、バランスN2を含む)のいずれかに交換した。ガス流を、初めに、67ml/分/Lに設定し、中間対数期間中、200ml/分まで増加させるが、撹拌は、200rpmから800に増加させた。Na2Sを、バイオリアクタ内に、0.25ml/時で投与した。OD600が1.5に達した時点で、バイオリアクタは、希釈率2.0〜1.6d−1及び細菌の希釈率0.9〜0.6d−1で、連続モードに切り替えられた。連続モード時、ガス及び撹拌は、900〜950rpm及び800〜900ml/分に調節された。Na2Sを、1.0ml/時に増加した。
液体培養サンプルを、発酵の持続時間を通して異なる間隔で採取した。これらのサンプルを使用して、600nmでの光学密度(分光光度計)、ならびに基質及び生成物のレベル(高性能液体クロマトグラフィー−HPLC)を構築した。HPLCを、通常、使用して、酢酸塩、エタノール、及び2,3−ブタンジオールのレベルを定量化した。入力及び出力ガス組成を、ガスクロマトグラファー(GC)を用いて分析し、培養によるCO及びH2の消費量及びCO2生成量の測定を可能にした。
2−HIBAの影響は、2,3−BDOの生成において最適化された単一のリアクタシステム上で調査された。これは、この化学物質が高性能システム上に有するであろう影響を究明し、全体的な発酵の安定性を妨げないであろう好適な濃度に関する情報を得るために行われた。0.5g/L(4.8mM)の2−HIBAを、7.95日目に発酵槽に添加し、この添加からの結果を図1に示す。2−HIBAの添加により、発酵の代謝産物プロファイルが変化し、2,3−ブタンジオールの生成を増加させる一方、エタノール、酢酸塩、及びバイオマスの生成を減少させた。
2つのリアクタシステムを使用して、代謝産物プロファイルにおける連続的な2−HIBA添加の影響を試験した。初めに、0.5g/L/日(4.8mM/日)の2−HIBAをR2のみに添加し、これにより、2,3−BDOの生成は増加したが、比率のみが1.9:1の低比率に下がった。次いで、2−HIBAの連続添加を、0.5g/L/日(4.8mM/日)でR1に行った。2−HIBAが細菌によって変換されないため、R1への添加は2,3−BDOの全体的な生成を著しく増加し得ると仮定した。これは、改善された2,3−BDO濃度に伴って、2−HIBAがR1からR2(液体の流れを通して)に移動されるため、R1及びR2の両方の濃度を改善させることによって達成され得る。この連続添加からの結果を図3〜6に示す。2,3−BDO濃度は、R1では5.7g/Lから14g/L、R2では16g/Lから21g/Lに増加した(図3及び4を参照のこと)。エタノール:2,3−BDOの比率は、R1では1:1、R2では1.3:1まで下がり、8日間安定した状態を保った。比率の改善は、2,3−BDO濃度の増加及びエタノール生成の減少の結果として達成された。
実施例2において得られた結果は、2,3−BDOの全体的な力価を改善することを目的として繰り返された。この実験において、2−HIBAの濃度を1g/L/日(9.6mM/日)まで増加した。上記の実験において得られた結果と同様に、ガスの取り込みは、悪影響を受けず、R2におけるエタノール:2,3−BDO比は、1.3:1で7日間安定した状態を保った。1g/L/日(9.6mM/日)の添加は、全体的な2,3−BDO濃度の改善をもたらし、これは、23.9g/Lまで達した(図7を参照のこと)。
最低濃度の決定は、2,3−ブタンジオの生成に対する影響を認めないために必要であった。
2−HIBAが増殖に悪影響を与えるかどうかを確認するために、0.05g/L(0.48mM)の2−HIBAの存在下で、発酵を開始した。増殖時、5.0日目までに、撹拌が最大950rpm及びガス流れ800ml/分に達するように、ガス及び撹拌を増加した。この時点で、希釈率は、1.8日−1であり、細菌希釈率は、0.85日−1であった。2−HIBAの存在は、発酵の増殖に対しては影響がなかったが、どれだけ素早く低いエタノール:2,3−ブタンジオール比を達し得るかにおいて大きく影響を及ぼした。2.0日までに、エタノール:2,3−BDO比が2:1に達し、次いで、継続して、ゆっくりと減少し、最終的には、17g/Lの平均エタノール濃度及び15.5g/Lの2,3−ブタンジオール濃度で、比率は、1.1:1に達した。この発酵に対する結果を図9及び図10に示す。これらの結果は、増殖に悪影響を与えずに、発酵培地中の2−HIBAを、1:1の範囲内でエタノール:2,3−BDO比を得るのに十分な0.05g/L(0.48mM)で添加することが可能であることを示す。
2−HIBA遺伝子発現
LZ1561の代謝における2−HIBAの影響を理解するために、サンプルを遺伝子発現分析のために採取した。リアクタをバッチとして開始し、1日後、D=1.4日−1で連続的にした。酢酸塩を最小限に抑え、エタノール及び2,3−BDOの生成を最大限にするために、ガス流れ及び撹拌を調整した。7日目までに、エタノール:2,3−BDO比は、5:1未満であり、ガスは、5〜6mol/L/日の標的COの取り込みに達した。9.6日目に、2−HIBAを含まない安定したデータを示す、サンプルを遺伝子発現分析のために採取した。10.78日目に、0.5g/L(4.8mM_の2−HIBAを注入物として、培地瓶に添加を通して、発酵に添加した。2−HIBAの添加後、代謝産物において特徴的な反応が見られ、これには、2,3−BDOの増加に伴って、酢酸塩、エタノール、及びバイオマスの減少が含まれた。13.8日目に、安定した2−HIBAの添加を示す、別の遺伝子発現サンプルを採取した。表5は、データが遺伝子発現分析のために回収された2つの時点を示す。2−HIBAの添加前、エタノール:2,3−BDO比は4:1であり、添加後、この比率は、1.5:1に達した。小サブセットの遺伝子は、著しく上方制御または下方制御されることが見出され、これらの遺伝子を表6及び表7に示す。この分析における結果は、2−HIBAが分岐鎖アミノ酸生合成経路(BCAA)と相互作用することを非常に明らかに示した。これらの結果から、2−HIBAの作用モードを提案し、これを、図11に例示し、説明する。
実施例7:
2−HiBAが分岐鎖アミノ酸生成を妨げるさらなる証拠を導き出すために、これらのアミノ酸の濃度を2−HIBAの添加前及び後に直接監視した。図11は、2−HIBAの添加直後の、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの濃度がバイオマスと同様に減少する、結果を例証する。経時的に、バイオマス濃度は、横ばいの状態であり、イソロイシンの濃度は、2−HIBA添加前の値よりも依然として低いままであるロイシン及びバリンの濃度によって回復すると思われる。このデータは、2,3−BDOの生成が分岐鎖アミノ酸経路の妨害により増加することを示す遺伝子発現データを協調すると思われる。
2−ヒドロキシ−2−メチルブチレートを、2,3−ブタンジオールの生成に最適化された発酵に添加した。この化学物質は、2−HiBAに対するその構造相関性及びilvCの既知の阻害剤として参考文献中のその参照に基づいて選択された。2−ヒドロキシ−2−メチル酪酸(15mM)の単一添加を13.2日目に安定したリアクタに行い、代謝産物プロファイルにおける結果を観察した。結果を図13に示す。添加は、2,3−ブタンジオールの生成を増加させ、エタノール:2,3−BDO比を減少させると思われる。
アセト乳酸塩から2,3−ジヒドロキシ−3−メチルブチレートへの減少したフラックス
アセト乳酸塩から2,3−ジヒドロキシ−3−メチルブチレートへのフラックスを阻害するために、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を除去する。これは、ClosTronシステムを用いて遺伝子破壊によって達成され得る(Heap et al 2007)。
ピルビン酸塩から2−ヒドロキシ−2−メチル−3−ケトブチレート(アセト乳酸塩)へのフラックスの増加
ピルビン酸塩から2−ヒドロキシ−2−メチル−3−ケトブチレート(アセト乳酸塩)へのフラックスを増加させるために、天然異化アセト乳酸シンターゼを過剰発現する。
Claims (18)
- 少なくとも1つの発酵生成物の生成を増加させる方法であって、
a.液体栄養培地中の少なくとも1つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供することと、
b.少なくとも1つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を発酵させ、少なくとも1つの発酵生成物を生成することと、
c.2−ヒドロキシイソ酪酸(2−HIBA)、2−ヒドロキシル−2−メチル酪酸、2−ヒドロキシブチレート、2−ヒドロキシ−3−メチル酪酸、2−ケト−3−ヒドロキシイソバレレート、及び2−ケトイソバレレートからなる群から選択される、少なくとも1つの化合物を前記液体栄養培地に添加することにより、炭素の分岐鎖アミノ酸へのフラックスを阻害することと、
を含み、
それにより、少なくとも1つの発酵生成物の生成を増加させる、方法。 - 前記少なくとも1つの発酵生成物が、酢酸、エタノール、2,3−ブタンジオール、2−ブタノン、2−ブタノール、アセトイン、イソプロパノール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン(MEK)、プロパンジオール、2−プロパノール、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、ポリ乳酸、3−ヒドロキシブチレート、イソブチレン、3−ヒドロキシプロピオネート(3HP)、アセトン、及び脂肪酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの発酵生成物が、2,3−ブタンジオールである、請求項1に記載の方法。
- 前記ガス状基質が、CO、CO2、CH4、H2、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記酢酸生成カルボキシド栄養性微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、及びクロストリジウム・マグナムからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 2,3−ブタンジオールの生成を増加させる方法であって、
a.液体栄養培地中の少なくとも1つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を含むバイオリアクタに、COを含むガス状基質を提供すること、
b.少なくとも1つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を発酵させ、ガス状基質から少なくとも2,3−ブタンジオールを生成することと、
c.2−ヒドロキシイソ酪酸(2−HIBA)、2−ヒドロキシル−2−メチル酪酸、2−ヒドロキシブチレート、2−ヒドロキシ−3−メチル酪酸、2−ケト−3−ヒドロキシイソバレレート、及び2−ケトイソバレレートからなる群から選択される、少なくとも1つの化合物を前記液体栄養培地に添加することにより、炭素の分岐鎖アミノ酸へのフラックスを阻害することと、
を含み、
それにより、2,3−ブタンジオールの生成を増加させる、方法。 - 前記培養物が、酢酸、エタノール、2−ブタノン、2−ブタノール、アセトイン、イソプロパノール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン(MEK)、プロパンジオール、2−プロパノール、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、ポリ乳酸、3−ヒドロキシブチレート、イソブチレン、3−ヒドロキシプロピオネート(3HP)、アセトン、及び脂肪酸からなる群から選択される少なくとも1つの生成物をさらに生成する、請求項6に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの化合物が2−HIBAである、請求項6に記載の方法。
- 2,3−ブタンジオールが、1日当たり少なくとも10g/Lの速度で生成される、請求項6に記載の方法。
- 前記培養物が、エタノール対2,3−ブタンジオールの比率が、4:1〜1:2で、エタノールをさらに生成する、請求項7に記載の方法。
- 液体栄養培地中の少なくとも1つの組換え酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供し、少なくとも1つの発酵生成物を生成することを含む、発酵方法であって、
前記少なくとも1つの組換え酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物が、少なくとも1つの遺伝的修飾を有し、
前記少なくとも1つの遺伝的修飾が、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化、及び/又はアセト乳酸シンターゼ遺伝子の過剰発現である、方法。 - ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化突然変異を含み、親微生物と比較して、より多量の2,3−ブタンジオールを生成することができる、酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
- COを含む基質の増殖及び/または発酵時、前記微生物が、親微生物と比較して、分岐鎖アミノ酸を生成する低減された能力を有する、請求項12に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
- 前記微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される、請求項12に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
- 過剰発現されたアセト乳酸シンターゼ遺伝子をさらに含む、請求項12に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
- アセト乳酸シンターゼの活性レベルを増加させるように適合される1つ以上の遺伝的修飾を含む、酢酸生成カルボキシド栄養性酢酸生成クロストリジウム属微生物。
- COを含む基質の増殖及び/または発酵時、前記微生物が、親微生物と比較して、より多量の2,3−ブタンジオールを生成する、請求項16に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性酢酸生成クロストリジウム属微生物。
- アセト乳酸シンターゼのレベルを増加させるように適合される前記1つ以上の遺伝的修飾が、内因性異化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、内因性同化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、外因性異化アセト乳酸シンターゼの発現、外因性同化アセト乳酸シンターゼの発現、内因性アセト乳酸シンターゼの外因性異化アセト乳酸シンターゼとの置換、内因性同化シンターゼのサブユニットの過剰発現からなる群から選択され、前記サブユニットが分岐鎖アミノ酸によるフィードバック阻害に非感受性である、請求項16に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性酢酸生成微生物クロストリジウム属。
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