ES2426070T3 - Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas - Google Patents

Abstract

Un método para la conversión de acetolactato a dihidroxiisovalerato, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende una construcción genética que codifica unpolipéptido que tienen una actividad específica de cetol-ácido reductoisomerasa mayor que la actividad específica deuna cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli, en el que dicho polipéptido tiene una actividad específica de cetol-ácidoreductoisomerasa mayor que 1,1 μmoles/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo deconsumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: i) pH de aproximadamente 7,5; ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM; y b) poner en contacto la célula hospedante de a) con acetolactato, en el que se produce 2,3-dihidroxiisovalerato.

Description

Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y a la producción de alcoholes. De modo más específico, se produce isobutanol a través de la fermentación industrial de un microorganismo recombinante utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas (KARI) especiales con un número de recambio alto. Esta invención también se refiere a métodos para descubrir enzimas KARI muy activas a partir de microorganismos naturales.

Antecedentes de la invención

El butanol es un importante producto químico, útil como aditivo de combustibles, como materia prima química en la industria del plástico, y como extractante de calidad alimentaria en la industria alimentaria y de aromatizantes. Cada año, de diez a doce mil millones de libras de butanol son producidas por medios petroquímicos, y es probable que aumente la necesidad de esta materia prima química.

Los métodos para la síntesis química del isobutanol son conocidos, tales como la síntesis oxo, la hidrogenación catalítica del monóxido de carbono (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6ª edición, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH and Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, pp. 716-719), y la condensación de Guerbet del metanol con n-propanol (Carlini et ál., J. Molec. Catal. A:Chem., 220, 215-220, 2004). Estos procesos emplean materiales de partida derivados de petroquímicos y, en general, son caros y perjudiciales para el medioambiente. La producción de isobutanol a partir de materias primas derivadas de plantas podría minimizar las emisiones de gases causantes del efecto invernadero y representarán un avance en la técnica.

El isobutanol se produce de modo biológico como subproducto de la fermentación de levaduras. Es un componente del "aceite de fusel" que se forma como resultado del metabolismo incompleto de los aminoácidos por este grupo de hongos. El isobutanol se produce específicamente a partir del catabolismo de la L-valina. Después de que el grupo amina de la L-valina se haya recogido como fuente de nitrógeno, el a-cetoácido resultante es descarboxilado y reducido a isobutanol por enzimas de la denominada vía de Ehrlich (Dickinson et ál., J. Biol. Chem., 273, 2575225756, 1998). Los rendimientos del aceite de fusel y/o sus componentes logrados durante la fermentación de bebidas generalmente son bajos. Por ejemplo, se ha indicado que la concentración de isobutanol producido en la fermentación de la cerveza es menor que 16 partes por millón (García et ál., Process Biochemistry, 29, 303-309, 1994). La adición de L-valina exógena a la fermentación aumenta el rendimiento de isobutanol, según describen Dickinson et ál., supra, en donde se indica que se obtiene un rendimiento de isobutanol de 3 g/l proporcionando Lvalina a una concentración de 20 g/l en la fermentación. Además, se ha demostrado la producción de n-propanol, isobutanol y alcohol isoamílico por células inmovilizadas por alginato de calcio de Zymomonas mobilis. Se empleó un medio que contenía glucosa al 10% suplementado con L-Leu, L-Ile, L-Val, ácido alfa-cetoisocaproico (alfa-KCA), ácido alfa-cetobutírico (alfa-KBA) o ácido alfa-cetoisovalérico (alfa-KVA) (Oaxaca, et ál., Acta Biotechnol., 11, 523532, 1991). El alfa-KCA aumenta los niveles de isobutanol. Los aminoácidos también producen los correspondientes alcoholes, pero en un grado menor que los cetoácidos. Se demostró un aumento en el rendimiento de alcoholes C3-C5 a partir de carbohidratos cuando se añaden los aminoácidos leucina, isoleucina y/o valina al medio de crecimiento como fuente de nitrógeno (documento WO 20055040392).

Aunque los métodos descritos anteriormente indican el potencial de producción de isobutanol a través de medios biológicos, estos métodos tienen un coste prohibitivo a escala industrial para la producción de isobutanol. La biosíntesis de isobutanol directamente desde azúcares sería económicamente viable y representaría un avance en la técnica. Sin embargo, esta producción se ve gravemente obstaculizada por la lenta enzima cetol-ácido reductoisomerasa (KARI), que cataliza la segunda etapa en la vía del isobutanol que convierte el acetolactato en dihidroxivalerato. Debido a que esta enzima ya se expresa a niveles altos (S. Epelbaum et ál., J. Bacteriol., 180, 4056-4067, 1998), resulta necesario aumentar la actividad de KARI sin aumentar la cantidad de proteína, es decir, aumentar la actividad específica de la enzima.

Los solicitantes han resuelto el problema mencionado a través del descubrimiento de una enzima KARI que tiene una alta actividad específica que puede utilizarse para potenciar la producción biológica del isobutanol.

Resumen de la invención

La invención se refiere a organismos recombinantes que expresan enzimas KARI muy activas. El microorganismo modificado tendrá niveles altos de la forma corta de la enzima KARI que posee una actividad específica significativamente mayor (6-8 veces mayor que la enzima KARI en E. coli) y puede utilizarse para la producción comercial de isobutanol. Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un método para la conversión de acetolactato a dihidroxiisovalerato, que comprende:

a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende una construcción genética que codifica un polipéptido que tiene una actividad específica de cetol-ácido reductoisomerasa mayor que la actividad específica de

una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli; y b) poner en contacto la célula hospedante de a) con acetolactato, por lo que se produce 2,3-dihidroxiisovalerato. En una realización preferida, la construcción genética codifica un polipéptido que tiene una actividad específica de

cetol-ácido reductoisomerasa mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: a) pH de aproximadamente 7,5; b) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y c) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.

En otra realización, la invención proporciona un método para la producción de isobutanol, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana recombinante que comprende las siguientes construcciones genéticas:

1) al menos una construcción genética que codifica una enzima acetolactato sintasa para la conversión del piruvato

a acetolactato (etapa a de la vía); 2) al menos una construcción genética que codifica una enzima cetol-ácido reductoisomerasa con una actividad específica mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7,5; ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM, para la conversión de (S)-acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato

(etapa b de la vía);

3) al menos una construcción genética que codifica una acetohidroxiácido deshidratasa para la conversión de 2,3dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato (etapa c de la vía); 4) al menos una construcción genética que codifica una cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa para la

conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído (etapa d de la vía);

5) al menos una construcción genética que codifica una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa para la conversión de isobutiraldehído a isobutanol (etapa e de la vía); y b) cultivar la célula hospedante de a) bajo condiciones en las que se produce isobutanol. En otra realización, la invención proporciona una célula hospedante recombinante, que comprende una enzima

cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que la actividad específica de una cetol-ácido

reductoisomerasa de E. coli. En otra realización, la invención proporciona un método para la identificación y el aislamiento de una construcción genética, que codifica una enzima cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7,5; ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM; que comprende las etapas de: a) identificar especies bacterianas que tengan un tiempo de duplicación más corto que E. coli cuando se cultivan en

medio mínimo M9;

b) seleccionar las especies bacterianas de (a) para la actividad cetol-ácido reductoisomerasa para identificar las especies bacterianas activas; c) sondar el ADN genómico de las especies bacterianas activa des b) con secuencias de ácidos nucleicos que

tengan homología con construcciones genéticas conocidas por codificar una cetol-ácido reductoisomerasa, para identificar y aislar las construcciones genéticas que codifican una cetol-ácido reductoisomerasa a partir de dichas especies bacterianas activas; y

d) amplificar y expresar las construcciones genéticas que codifican una cetol-ácido reductoisomerasa a partir de dichas especies bacterianas activas; y

e) seleccionar las construcciones genéticas expresadas de la etapa d) para detectar las que tengan una actividad 5 específica mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7,5;

ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y

iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.

10 Breve descripción de las figuras y las secuencias de la invención

La invención puede entenderse más a fondo a partir de la siguiente descripción detallada, la figura y las descripciones de las secuencias adjuntas, que forman parte de esta solicitud.

La figura 1 muestra cuatro vías biosintéticas del isobutanol diferentes. Las etapas denominadas "a", "b", "c", "d", "e", "f’, "g", "h", "i", "j" y "k" representan el sustrato para producir las conversiones descritas a continuación.

15 Las siguientes secuencias se ajustan a 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures -the Sequence Rules") y son coherentes con la norma ST.25 (1998) de la World Intellectual Property Organization (WIPO) y los requisitos para el listado de secuencias de la EPO y PCT (regla 5.2 y 49.5(a-bis), y la sección 208 y el anexo C de las instrucciones administrativas). Los símbolos y el formato utilizado para los datos de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos

20 se ajustan a las reglas indicadas en 37 C.F.R. §1.822.

Tabla 1

Resumen de SEQ ID NO: de los genes y proteínas de la vía del isobutanol preferida

Descripción

SEQ ID NO: ácido nucleico SEQ ID NO: péptido

Klebsiella pneumoniae budB (acetolactato sintasa)

1 2

E. coli ilvC (acetohidroxiácido reductoisomerasa)

3 4

E. coli ilvD (acetohidroxiácido deshidratasa)

5 6

Lactococcus lactis kivD (a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa), con codones optimizados

7 8

E. coli yqhD (alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa)

9 10

Las SEQ ID NO:11-22 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores oligonucleotídicos utilizados para generar las construcciones en el ejemplo 1. Las SEQ ID NO:23-30 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores oligonucleotídicos utilizados para generar

25 las construcciones en el ejemplo 2. Las SEQ ID NO:11 y 12 son las secuencias de ADN de los cebadores utilizados en el ejemplo 1 para la amplificación mediante PCR del gen ilvc.

La SEQ ID NO:13 es la secuencia de ADN directa para el cebador utilizado para clonar el gen KARI en el vector pBAD en E. coli. 30 La SEQ ID NO:14 es la secuencia de ADN inversa para el cebador utilizado para clonar el gen KARI en el vector pBAD en E. coli. La SEQ ID NO:15 es la secuencia de ADN directa para ilvC-trc-SacI-F utilizada para amplificar el gen KARI. La SEQ ID NO:16 es la secuencia de ADN inversa para ilvC-trc-HindIII-R utilizada para amplificar el gen KARI. Las SEQ ID NO:17 a 22 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores utilizados para confirmar la presencia 35 de la inserción de ilvC de E. coli mediante digestión con SacI y secuenciación del ADN. SEQ ID NO:17 -ilvC-trc-F3

SEQ ID NO:18 -ilvC-trc-F5 SEQ ID NO:19 -ilvC-trc-R2 SEQ ID NO:20 -ilvC-trc-R4 SEQ ID NO:21 -pBAD-eF1 SEQ ID NO:22 -PALPK-R1 Las SEQ ID NOS:23 a 26 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores oligonucleotítidos utilizados en la

dirección directa e inversa para amplificar los genes ilvC a partir del ADN genómico de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) y Pseudomonas fluorescens (PF5) mediante PCR. SEQ ID NO:23 -PAO1-C-F1 SEQ ID NO:24 -PAO1-C-R1 SEQ ID NO:25 -PF5-C-F1

SEQ ID NO:26 -PF5-C-R1 Las SEQ ID NO:21, 22, 27 y 28 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores oligonucleotítidos utilizados para validar las secuencias de ADN de los clones positivos de los genes ilvC de Pseudomonas.

SEQ ID NO:27 -PF5-S-F2 SEQ ID NO:28 -PF5-S-R2 Las siguientes SEQ ID NO: se corresponden con las secuencias de ADN de los genes KARI utilizados en esta

invención: SEQ ID NO:29 -E. coli K12 -ilvC SEQ ID NO:30 -KARI con codones optimizados de Vibrio para la expresión en E. coli SEQ ID NO:31 -Pseudomonas aeruginosa -PAO1 -ilvC SEQ ID NO:32 -Pseudomonas tluorescens -PF5 -ilvC

Las siguientes SEQ ID NO: son las secuencias de aminoácidos que corresponden con SEQ ID NO:29-32, respectivamente: SEQ ID NO:33 -E. coli K12 -ilvC -[KARI de E. coli K12] SEQ ID NO:34 -KARI de Vibrio cholerae SEQ ID NO:35 -PAO1-ilvC (1aa-338aa) SEQ ID NO:36 -PF5-ilvC (1aa-338aa) La SEQ ID NO:37 es el cebador directo PAL-F1. La SEQ ID NO:38 es el cebador inverso (PAL-R1). La SEQ ID NO:39 es el cebador directo (PAL-EcoR1-F1). La SEQ ID NO:40 es el cebador inverso (PAL-EcoR1-R1).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para la converción de acetolactato a 2,3-dihidroisovalerato utilizando células hospedantes microbianas que contienen una enzima KARI muy activa. El 2,3-dihidroisovalerato formado de esta manera después se convierte, a través de las etapas mostradas en la figura 1, en isobutanol. La invención también describe métodos para descubrir enzimas KARI más rápidas en sus microorganismos hospedantes naturales y la evolución molecular de estas enzimas para mejorar aún más su actividad catalítica.

La presente invención satisface una serie de necesidades comerciales e industriales. El butanol es una importante materia prima química industrial con una diversidad de aplicaciones, siendo su potencial como combustible o aditivo de combustibles particularmente significativo. Aunque es un alcohol de solo cuatro átomos de carbono, el butanol tiene un contenido energético similar al de la gasolina y puede mezclarse con cualquier combustible fósil. El butanol se prefiere como combustible o aditivo de combustibles porque sólo produce CO2 y pocos o ningún SOx o NOx cuando se quema en un motor de combustión interna convencional. Además, el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo para combustibles más preferido hasta la fecha.

Además de su utilidad como biocombustible o aditivo de combustibles, el butanol tiene el potencial de afectar a los problemas de distribución del hidrógeno en la emergente industria de las células de combustible. A día de hoy, las células de combustible están plagadas de problemas de seguridad asociados con el transporte y la distribución del hidrógeno. El butonol puede reformarse con facilidad con respecto a su contenido en hidrógeno, y puede distribuirse a través de las gasolineras existentes con la pureza requerida para las células de combustible o los vehículos.

Las siguientes definiciones y abreviaturas deben emplearse para la interpretación de las reivindicaciones y la memoria descriptiva.

El término "invención" o la expresión "presente invención", tal como se emplean en la presente, se aplican en general atodas las realizaciones de la invención según se define en las reivindicaciones según están presentadas o tal como se modificarán y suplementarán posteriormente, o en la memoria descriptiva.

La expresión "vía biosintética del isobutanol" se refiere a la vía enzimática para producir isobutanol. Las vías biosintéticas del isobutanol preferidas se ilustran en la figura 1 y se describen en la presente.

La expresión "ensayo de consumo de NADPH" se refiere a un ensayo enzimático para la determinación de la actividad específica de la enzima KARI, que implica medir la desaparición del cofactor de KARI, NADPH, de la reacción enzimática, según se describe en Aulabaugh et ál., Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990).

"KARI" es la abreviatura de la enzima cetol-ácido reductoisomerasa.

Las expresiones "acetohidroxiácido isomerorreductasa" y "cetol-ácido reductoisomerasa" se utilizarán de modo intercambiable y se refieren a la enzima que tiene el número EC, EC 1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego. La cetol-ácido reductoisomerasa cataliza la reacción de (S)-acetolactato a 2,3dihidroxiisovalerato, tal como se describe con más detalle a continuación. Estas enzimas están disponibles en una serie de fuentes que incluyen, pero no se limitan a E. coli n.º de registro de GenBank NC_000913 REGIÓN: 3955993..3957468, Vibrio cholerae n.º de registro de GenBank NC_002505 REGIÓN: 157441..158925, Pseudomonas aeruginosa n.º de registro de GenBank NC_002516 REGIÓN: 5272455..5273471, y Pseudomonas fluorescens n.º de registro de GenBank C_004129 REGIÓN: 6017379..6018395.

La expresión "acetolactato sintasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de piruvato a acetolactato y CO2. El acetolactato tiene dos estereoisómeros, (R) y (S); la enzima prefiere el (S)-isómero, que es el producido por los sistemas biológicos. Las acetolactato sintasas preferidas se conocen con el número EC 2.2.1.6 9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego). Estas enzimas están disponibles en una serie de fuentes que incluyen, pero no se limitan a Bacillus subtilis (GenBank n.os: CAB15618, Z99122, NCBI (National Center for Biotechnology Information), secuencia de aminoácido, secuencias de nucleótidos NCBI, respectivamente), Klebsiella pneumoniae (GenBank n.os: AAA25079 (SEQ ID NO:2), M73842 (SEQ ID NO:1)), y Lactococcus lactis (GenBank n.os: AAA25161, L16975).

La expresión "acetohidroxiácido deshidratasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de 2,3dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato. Las acetohidroxiácido deshidratasas preferidas se conocen con el número EC 4.2.1.9. Estas enzimas están disponibles en una amplia gama de microorganismos que incluyen, pero no se limitan a E. coli (GenBank n.os: YP_026248 (SEQ ID NO:6), NC_000913 (SEQ ID NO:5)), S. cerevisiae (GenBank n.os: NP_012550, NC_001142), M. maripaludis (GenBank n.os: CAF29874, BX957219), y B. subtilis (GenBank n.os: CAB14105, Z99115).

La expresión "a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído y CO2. Las a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasas preferidas se conocen con el número EC 4.1.1.72, y están disponbiles en una serie de fuentes que incluyen, pero no se limitan a Lactococcus lactis (GenBank n.os: AAS49166, AY548760, CAG34226 (SEQ ID NO:8), AJ746364), Salmonella typhimurium (GenBank n.os: NP_461346, C_003197), y Clostridium acetobutylicum (GenBank n.os: NP_149189, NC_001988).

La expresión "alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de isobutiraldehído a isobutanol. Las alcohol de cadena ramificada deshidrogenasas preferidas se conocen con en número EC 1.1.1.265, pero también pueden clasificarse bajo otras alcohol deshidrogenasas (de modo específico, EC 1.1.1.1 y EC 1.1.1.2). Estas enzimas utilizand NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducido) y/o NADPH como donante de electrones, y están disponibles en una serie de fuentes que incluyen, pero no se limitan a S. cerevisiae (GenBank n.os: NP_010656, NC_001136; NP_014051, NC_001145), E. coli (GenBank n.os: NP_417484 (SEQ ID NO:10), NC_000913 (SEQ ID NO:9)), y C. acetobutylicum (GenBank n.os: NP_349892, NC_003030).

La expresión "cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiril-CoA (isobutiril-coenzima A), empleando NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido)

como aceptor de electrones. Las cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasas preferidas se conocen con en número EC 1.2.4.4. Estas cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasas están formadas por cuatro subunidades, y las secuencias de todas las subunidades están disponibles en una ampla gama de microorganismos que incluyen, pero no se limitan a B. subtilis (GenBank n.os: CAB14336, Z99116; CAB14335, Z99116; CAB14334, Z99116; y CAB14337, Z99116), y Pseudomonas putida (GenBank n.os: AAA65614, M57613; AAA65615, M57613; AAA65617, M57613; y AAA65618, M57613).

La expresión "sustrato de carbono" o "sustrato de carbono fermentable" se refiere a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por los organismos hospedantes de la presente invención y, en particular, a fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un solo carbono o sus mezclas.

Los términos "kcat" y "Km" son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en Enzyme Structure and Mechanism, 2ª ed. (Ferst, W. H. Freeman, NY, 1985, pp. 98-120). El término"kcat", a menudo denominado "número de recambio", se define como el número máximo de moléculas de sustrato convertidas en producto por sitio activo por unidad de tiempo, o el número de veces que la enzima sufre un recambio por unidad de tiempo. kcat = Vmax/[E], siendo [E] la concentración de enzima (Ferst, supra). Las expresiones "recambio total" y "número de recambio total" se emplean en la presente para indicar la cantidad de producto formado mediante la reacción de una enzima KARI con el sustrato.

La expresión "eficacia catalítica" se define como la kcat/KM de una enzima. La "eficacia catalítica" se emplea para cuantificar la especificidad de una enzima por un sustrato.

La expresión "actividad específica" significa las unidades de enzima/mg de proteín, definiéndose la unidad de enzima como los moles de producto formado/minuto bajo condiciones especificadas de temperatura, pH, [S], etc.

Los términos "lento" o "rápido", cuando se emplean con respecto a una actividad enzimática, se refieren al número de recambio de la enzima comparado con un patrón.

Las expresiones "molécula de ácido nucleico aislada", "fragmento de ácido nucleico aislado" y "construcción genética" se emplean de modo intercambiable y significan un polímero de ARN o ADN que es monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar formado por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de ser expresado como una proteína específica, que incluye opcionalmente secuencias reguladoras anteriores (secuencias no codificadoras 5') y posteriores (secuencias no codificadoras 3') a la secuencia codificadora. Un "gen nativo" se refiere a un gen según se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. Un "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Un "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedante, pero que se introduce en el organismo hospedante mediante transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "secuencia codificadora" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Las "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas cadena arriba (secuencias no codificadoras 5'), dentro, o cadena abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora, y que influyen en la transcripción, el procesamiento

o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitios de procesamiento del ARN, sitios de unión de efectores y estructuras de tallo-bucle.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. En general, una secuencia codificador se localiza 3' a la secuencia del promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que provocan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares la mayor parte del tiempo se denominan habitualmente "promotores constitutivos". También se reconocen que, puesto que en la mayoría de los casos, no se han definido por completo los límites exactos de las secuencias reguladoras, unos fragmentos de ADN de diferente longitud pueden tener idéntica actividad promotora.

La expresión "unido operablemente" se refiere a la asociación de secuencias de ácidos nucleicos sobre un único fragmento de ácido nucleico, de modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente con una secuencia codificadora cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificadora (es decir, la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras pueden estar unidas operablemente a secuencias reguladoras en la orientación sentido o antisentido.

El término "expresión", tal como se emplea en la presente, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido.

Tal como se emplea en la presenhte, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico hacia el genoma de un organismo hospedante, dando como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos hospedantes que contienen los fragmentos de ácidos nucleicos transformados se denominan organismos "transgénicos", "recombinantes" o "transformados".

Los términos "plásmido", "vector" y "módulo" se refieren a un elemento extracromosómico que a menudo porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y normalmente está en forma de un fragmento de ADN bicatenario circular. Estos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración en el genoma, fagos o secuencias de nucleótidos, lineales o circulares, de un ARN o ADN monocatenario o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en las que una serie de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción exclusiva que es capaz de introducir un fragmento de promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado, junto con secuencias no traducidas 3' apropiadas, en una célula. Un "módulo de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que facilitan la transformación de una célula hospedante concreta. Un "módulo de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que permiten una expresión potenciada de este gen en un hospedante extraño.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "degeneración de codones" se refiere a la naturaleza del código genético que permite variaciones en la secuencia de nucleótidos que no afectan a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Los expertos en la técnica conocerán el "sesgo de codones" que muestra una célula hospedante específica en cuanto a la utilización de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido concreto. Por tanto, cuando se sintetiza un gen para una mayor expresión en una céula hospedante, resulta deseable diseñar el gen de modo que su frecuencia de utilización de codones se parezca a la frecuencia de utilización de codones preferida de la célula hospedante.

La expresión "con codones optimizados", con respecto a los genes o las regiones codificadoras de moléculas de ácidos nucleicos para la transformación de diversos hospedantes, se refiere a la alteración de codones en el gen o las regiones codificadoras de las moléculas de ácidos nucleicos para que reflejen la utilización de codones típica del organismo hospedante sin alterar el polipéptido codificado por el ADN.

Las técnicas de ADN recombinante y de clonación molecular convencionales utilizadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook et ál. (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) (en lo sucesivo "Maniatis"); y en Silhavy et ál. (Silhavy, et ál., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY, 1984); y en Ausubel, F. M. et ál., (Ausubel, et ál., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987).

La presente invención produce isobutanol a partir de fuentes de carbono derivadas de plantas, evitando el impacto ambiental negativo asociado con los procesos petroquímicos convencionales para la producción de butanol. En una realización, la presente invención proporciona un método para la identificación de enzimas KARI con alta eficacia catalítica que podrían eliminarlo como etapa limitante de la velocidad en la conversión de carbohidratos en isobutanol. El método comprende la identificación y las enzimas KARI adecuadas y su mutagénesis utilizando métodos muy conocidos en la técnica, para aumentar la actividad específica de la enzima, tal como se describe en detalle a continuación.

Enzimas cetoácido reductoisomerasas (KARI)

La acetohidroxiácido isomerorreductasa o cetol-ácido reductoisomerasa (KARI, EC 1.1.1.86) cataliza dos etapas de la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, y es una enzima clave en su biosíntesis. KARI se encuentra en una diversidad de organismos, y la comparación de secuencias de aminoácidos a través de especies ha revelado que existen dos tipos de esta enzima: una forma corta (clase I) que se encuentra en hongos y la mayoría de las bacterias, y una forma larga (clase II) típica de plantas.

La forma corta de KARI generalmente tiene entre 330-340 restos aminoácidos. La forma larga de KARI tiene aproximadamente 490 restos aminoácidos. Sin embargo, algunas bacterias, tales como Escherichia coli, poseen una forma larga, en la que la secuencia de aminoácidos se diferencia de forma apreciable de la que se encuentra en plantas. KARI es codificada por el gen ilvc y es una enzima fundamental para el crecimiento de E. coli y otras bacterias en un medio mínimo. KARI utiliza NADPH como cofactor y requiere un catión divalente, tal como Mg++, para su actividad. Además de la utilización de acetolactato en la vía de la valina, KARI también convierte acetohidroxibutanoato en dihidroximetilpentanoato en la vía de producción de isoleucina.

Se ha resuelto la estructura cristalina de la enzima KARI de E. coli a una resolución de 2,6 A (Tyagi, et ál., Protein

5 Science, 14, 3089-3100, 2005). Esta enzima está formada por dos dominios, uno con una estructura a/p mixta, que es similar al que se encuentra en otras deshidrogenasas dependientes de nucleótidos de piridina. El segundo dominio es fundamentalmente una a-hélice y muestra bastantes pruebas de duplicación interna. La comparación de los sitios activos de KARI de E. coli, Pseudomonas aeruginosa y la espinaca demuestra que la mayoría de los restos en el sitio activo de la enzima ocupan posiciones conservadas. Mientras que KARI de E. coli cristaliza como un tetrámero, que posiblemente sea la probable unidad biológicamente activa, la KARI de P. aeruginosa (Ahn, et ál., J. Mol. Biol., 328, 505-515, 2003) forma un dodecámero, y la enzima de la espinaca forma un dímero. Las KARI conocidas son enzimas lentas con el número de recambio (kcat) indicado de 2 s-1 (Aulabaugh et ál., Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990) o 0,12 s-1 (Rane et ál., Arch. Biochem. Biophys., 338, 83-89, 1997) para el acetolactato. Los estudios han demostrado que el control genético de la biosíntesis de isoleucina-valina en E. coli es diferente del que

15 se encuentra en Ps. aeruginosa (Marinus, et ál., Genetics, 63, 547-556, 1969).

Identificación e aislamiento de enzimas KARI de alta actividad

Se realizó un examen de organismos con unas velocidades de duplicación mayores que E. coli. Se identificaron tres microorganismos, Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Pseudomonas fluorescens (PF5), y Vibrio cholerae (N16961), con unos tiempos de duplicación más rápidos que E. coli cuando se cultivan en medio mínimo M9. Los genes que codifican una enzima KARI se aislaron de cada una de estas variedades, y las proteínas codificadas se expresaron y se purificaron parcialmente. La actividad específica de las enzimas aisladas de los organismos con alta velocidad de duplicación se compararon frente a la de KARI de E. coli empleando el método de ensayo del consumo de NADPH que mide la desaparición del cofactor, NADPH, durante la conversión enzimática de acetolactato a a,pdihidroxiisovalerato a 340 nm. La actividad se calcula utilizando el coeficiente de extinción molar de 6220 M-1 cm-1

25 para NADPH y se indica como !mol de NADPH consumido por min por mg de proteínas totales en extractos celulares (véase Aulabaugh y Schloss, Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990).

Un objeto de la presente invención es proporcionar una enzima KARI que tenga una actividad específica mayor que 1,1 !mol/min/mg de KARI, medida utilizando la proteína purificada según el ensayo de consumo de NADPH descrito en la presente, La KARI de E. coli es una enzima lenta, y resulta fundamental para la vía sintética de aminoácidos de cadena ramificada. El gen que codifica KARI (ilvc) está desactivado cuando las células crecen en un medio rico, pero se expresa a niveles elevados (aproximadamente 10% de las proteínas solubles) cuando se cultivan en un medio mínimo (S. Epelbaum et ál., supra).

El proceso de selección de una enzima KARI adecuada implica dos estrategias. La primera consiste en buscar una nueva KARI entre la diversidad natural. Esta búsqueda implica aislar homólogos de las enzimas disponibles en

35 general de otros organismos, utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Esta búsqueda se fundamenta en una hipótesis acerca de los organismos que más probabilidad tienen las KARI adecuadas, basada en el tiempo de duplicación del organismo. Una segunda estrategia implica crear y buscar una diversidad artificial mediante la construcción de un vector de expresión fuerte, una mutagénesis y evolución de la secuencia codificadora de KARI y, por último, una selección de los variantes con mejor actividad KARI.

Utilizando los anteriores métodos, se aislaron enzimas KARI de Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO:35 [PAO1ilvC], SEQ ID NO:36 [PF5-ilvC]) y Vibrio cholerae (SEQ ID NO:34) que tienen unas actividades específicas que son mayores que las de la enzima KARI aislada a partir de E. coli (SEQ ID NO:33 [E. coli K12 -ilvC]). En la presente invención se prefieren las enzimas KARI con unas actividades específicas mayores que aproximadamente 1,1 !mol/min/mg, siendo unas actividades específicas de aproximadamente 5-40 !mol/min/mg particularmente

45 adecuadas. Resulta preferible que la actividad específica de la KARI se mida utilizando proteínas purificadas e incorporando el ensayo de consumo de NADPH (Aulabaugh, supra), ejecutado entre 20 ºC y 25 ºC, siendo preferido aproximadamente 22,5 ºC, a un pH entre 7,0 y 8,0, siendo preferido un pH de aproximadamente 7,5, y en un tampón que tenga potasio al menos 10 mM, siendo adecuado al menos aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Algunas de las enzimas específicas útiles en la invención se listan a continuación en la tabla 2.

Tabla 2

Enzimas KARI de la presente invención

Gen

Índice de GenBank

E. coli K12 ilvC

n.º de registro de GenBank NC_000913 REGION: 3955993..3957468

Con codones optimizados para la expresión en E. coli de KARI de Vibrio cholerae

n.º de registro de GenBank NC_002505 REGIÓN: 157441..158925

Enzimas KARI de la presente invención

Gen

Índice de GenBank

Pseudomonas aeruginosa PA01 ilvC

n.º de registro de GenBank NC_002516 REGIÓN: 5272455..5273471

Pseudomonas fluorescens PF5 ilvC

n.º de registro de GenBank NC_004129 REGIÓN: 6017379..6018395

La presente invención no se limita a las enzimas de Pseudomonas y Vibrio específicas descritas en la presente. Por ejemplo, estos polipéptidos pueden utilizarse como base para descubrir homólogos que tengan una actividad similar,

o como moldes para la mutagénesis y evolución de proteínas.

Aislamiento de homólogos de KARI

5 El fragmento de ácido nucleico de la presente invención puede utilizarse para aislar genes que codifican proteínas homólogas a partir de la misma especie microbiana o de otra distinta. El aislamiento de genes KARI homólogos empleando protocolos dependientes de la secuencia es muy conocido en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de la secuencia incluyen, pero no se limitan a métodos de hibridación de ácidos nucleicos, y métodos de amplificación de ADN y ARN, según se ejemplifica en diversos usos de la tecnología de la amplificación de ácidos

10 nucleicos, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis et ál., patente de EEUU n.º 4.683.202), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Tabor, et ál., Proc. Acad. Sci. USA, 82, 1074, 1985) o la amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) (Walker, et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 392, 1992).

Por ejemplo, los genes que codifican proteínas o polipéptidos similares a los de la presente invención pueden aislarse directamente utilizando todo el fragmento, o una porción, del presente ácido nucleico como sonda de 15 hibridación de ADN para seleccionar bancos de cualquier bacteria deseada utilizando metodologías muy conocidas por los expertos en la técnica. Pueden diseñarse sondas oligonucleotídicas específicas basadas en la presente secuencia de ácido nucleico y sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica (Maniatis, supra). Además, la secuencia completa puede utilizarse directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como marcaje de ADN de cebadores aleatorio, traducción de desplazamiento de

20 mella, o técnicas de marcaje terminal, o sondas de ARN que empleen sistemas de transcripción in vitro disponibles. Además, pueden diseñarse cebadores específicos y emplearse para amplificar una parte o la longitud completa de la presente secuencia. Los productos de la amplificación resultantes pueden marcarse directamente durante las reacciones de amplificación o marcarse después de las reacciones de amplificación, y emplearse como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa bajo condiciones de rigurosidad apropiadas.

25 Generalmente, en las técnicas de amplificación de tipo PCR, los cebadores tienen diferentes secuencias y no son complementarios entre sí. Dependiendo de las condiciones de ensayo deseadas, las secuencias de los cebadores deben diseñarse para proporcionar una replicación eficaz y fiel del ácido nucleico diana. Los métodos de diseño de cebadores de PCR son habituales y muy conocidos en la técnica, por ejemplo, Thein et ál. (Thein, et ál., "The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", en Human Genetic Diseases:

30 A Practical Approach, K. E. Davis ed., 1986, pp. 33-50, IRL Press, Hemdon, Virginia); y Rychlik (Rychlik, 1993, en White, B. A. (ed.), Methods in Molecular Biology, vol. 15, pp. 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications, Humana Press, Inc., Totowa, NJ).

En general, pueden utilizarse dos segmentos cortos de la presente secuencia en los protocoles de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácidos nucleicos más largos que codifican genes homólogos

35 a partir del ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también puede realizarse con un banco de fragmentos de ácidos nucleicos clonados, en los que la secuencia de un cebador se deriva del presente fragmento de ácido nucleico, y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de los tramos de poli(ácido adenílico) hacia el extremo 3' del ARNm precursor que codifica genes microbianos.

Como alternativa, la segunda secuencia del cebador puede basarse en secuencias derivadas del vector de

40 clonación. Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden seguir el protocolo RACE (Frohman et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998, 1988) para generar ADNc utilizando la PCR para amplificar copias de la región entre un punto individual de la transcripción y el extremo 3' o 5'. Pueden diseñarse cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' a partir de la presente secuencia. Utilizando sistemas RACE 3' o RACE 5' disponibles en el mercado (Life Technologies, Rockville, MD), pueden aislarse fragmentos de ADNc 3’ o 5’ específicos (Ohara et ál., Proc. Natl.

45 Acad. Sci. USA, 86, 5673, 1989; y Loh et ál., Science, 243, 217-220, 1989).

Como alternativa, la presente secuencia puede emplearse como reactivo de hibridación para la identificación de homólogos. Los componentes básicos de un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos incluyen una sonda, una muestra de la cual se sospecha que contiene el gen o fragmento del gen de interés, y un método de hibridación específico. Las sondas de la presente invención generalmente son secuencias de ácidos nucleicos monocatenarios 50 que son complementarias con las secuencias de los ácidos nucleicos que se van a detectar. Las sondas son

"hibridables" con la secuencia del ácido nucleico que se va a detectar. La longitud de la sonda puede variar desde 5 bases a decenas de miles de bases, y dependerá del ensayo específico que se va a realizar. Generalmente, resulta adecuada una longitud de la sonda de aproximadamente 15 bases a aproximadamente 30 bases. Solo es necesario que una parte de la molécula de la sonda sea complementaria con la secuencia del ácido nucleico que se va a detectar. Además, no es necesario que la complementariedad entre la sonda y la secuencia diana sea perfecta. La hibridación se produce entre moléculas imperfectamente complementarias, con el resultado de que una determinada fracción de las bases en la región hibridada no están apareadas con la base complementaria adecuada.

Los métodos de hibridación están bien definidos. Generalmente, la sonda y la muestra deben mezclarse bajo condiciones que permitan la hibridación de los ácidos nucleicos. Esto implica poner en contacto la sonda y la muestra en presencia de una sal inorgánica u orgánica bajo las condiciones de concentración y temperatura adecuadas. Los ácidos nucleicos de la muestra y la sonda deben ponerse en contacto durante un tiempo suficiente para que se produzca cualquier hibridación posible entre el ácido nucleico de la muestra y la sonda. La concentración de la sonda o diana en la mezcla determinará el tiempo necsario para que se produzca la hibridación. Cuanta mayor sea la concentración de la sonda o diana, más corto será el tiempo necesario de incubación de la hibridacion. Opcionalmente, puede añadirse un agente caotrópico. El agente caotrópico estabiliza los ácidos nucleicos inhibiendo la actividad nucleasa. Además, el agente caotrópico permite una hibridación sensible y rigurosa de sondas oligonucleotídicas cortas a temperatura ambiente (Van Ness et ál., Nucl. Acids Res., 19, 5143-5151, 1991). Los agentes caotrópicos adecuados incluyen cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, tiocianato de sodio, tetracloroacetato de litio, perclorato de sodio, tetracloroacetato de rubidio, yoduro de potasio, y trifluoroacetato de cesio, entre otros. Generalmente, el agente caotrópico estará presente a una concentración final de aproximadamente 3 M. Si se desea, se puede añadir formamida a la mezcla de hibridación, generalmente al 30-50% (en v/v).

Pueden emplearse diversas disoluciones de hibridación. Generalmente, estas comprenden de aproximadamente 20% a 60% en volumen, preferiblemente 30% de un disolvente orgánico polar. Una disolución de hibridación habitual emplea aproximadamente 30-50% en v/v de formamida, cloruro de sodio de aproximadamente 0,15 a 1,0 M, tampones de aproximadamente 0,05 a 0,1 M, tales como citrato de sodio, Tris-HCl, PIPES o HEPES (pH en el intervalo de aproximadamente 6-9), detergente de aproximadamente 0,05% al 0,2%, tal como dodecilsulfato de sodio, o EDTA entre 0,5-20 mM, FICOLL (Pharmacia Inc.) (aproximadamente 300-500 kiloDaltons), polivinilpirrolidona (aproximadamente 250-500 kiloDaltons), y albúmina de suero. En la disolución de hibridación típica también se incluyen ácidos nucleicos vehículo sin marcar, de aproximadamente 0,1 a 5 mg/ml, ADN nucleico fragmentado, por ejemplo, ADN de timo de ternera o de esperma de salmón, o ARN de levadura, y opcionalmente de aproximadamente 0,5% al 2% en p/v de glicina. También pueden incluirse otros aditivos, tales como agentes de exclusión de volumen, que incluyen una diversidad de agentes que se hinchan en agua o hidrosolubles polares, tales como polietilenglicol, polímeros aniónicos, tales como poliacrilato o polimetacrilato, y polímeros sacarídicos aniónicos, tales como sulfato de dextrano.

La hibridación de ácidos nucleicos puede adaptarse a una diversidad de formatos de ensayo. Uno de los más adecuados es el formato de ensayo de "sandwich". El ensayo de "sandwich" puede adaptarse particularmente a la hibridación bajo condiciones no desnaturalizantes. Un componente prncipal de un ensayo de tipo "sandwich" es un soporte sólido. El soporte sólido tiene adsorbido sobre él o unido covalentemente a él una sonda de ácido nucleico inmovilizada que no está marcada y es complementaria con una porción de la secuencia.

Vías biosintéticas del isobutanol

Uno de los principales usos de las presentes enzimas KARI de alta actividad será como elemento en las vías metabólicas útiles para la producción de isobutanol. Se ha aclarado y caracterizado una serie de estas vías.

Los micoorganismos que utilizan carbohidratos emplean la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la vía de Entner y Doudoroff, y el ciclo de pentosa fosfato como las principales vías metabólicas para propocionar energía y precursores celulares para el crecimiento y el mantenimiento. Estas vías tienen en común el intermedio gliceraldehído-3-fosfato y, en último término, se forma piruvato directamente o en combinación con la vía EMP. Después, el piruvato se transforma en acetil-coenzima A (acetil-CoA) a través de una diversidad de medios. El acetilcoA actúa como intermedio clave, por ejemplo, para generar ácidos grasos, aminoácidos y metabolitos secundarios. Las reacciones combinadas de la conversión de azúcares en piruvato producen energía (por ejemplo, adenosina-5'trifosfato, ATP) y equivalentes reductores (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucléotido reducido, NADH, y nicotinamida adenina dinucléotido fosfato reducido, NADPH). El NADH y el NADPH deben reciclarse a sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+, respectivamente). En presencia de aceptores de electrones inorgánicos (por ejemplo, O2, NO3 y SO42-), los equivalentes reductores pueden utilizarse para aumentar la agrupación de energía; como alternativa, puede formarse un subproducto de carbono reducido.

Existen cuatro vías potenciales para la producción de isobutanol a partir de fuentes de carbohidratos con microorganismos recombinantes, tal como se muestra en la figura 1. Todas las vías potenciales para la conversión de carbohidratos en isobutanol se han descrito en la solicitud de patente de EEUU de propiedad de los solicitantes n.º 11/586315.

La vía preferida para la converisión del piruvato en isobutanol consiste en las etapas enzimáticas "a", "b", "c", "d", y "e" (figura 1) e incluye las siguientes conversiones de sustrato a producto:

a) piruvato a acetolactato, catalizado, por ejemplo, por acetolactato sintasa,

b) (S)-acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato, catalizado, por ejemplo, por acetohidroxiácido isomerorreductasa,

c) 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato, catalizado, por ejemplo, por acetohidroxiácido deshidratasa,

d) a-cetoisovalerato a isobutiraldehído, catalizado, por ejemplo, por cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa, y

e) isobutiraldehído a isobutanol, catalizado, por ejemplo, por alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa.

Esta vía combina enzimas implicadas en vías bien caracterizadas para la biosíntesis de valina (piruvato a acetoisovalerato) y el catabolismo de la valina (a-cetoisovalerato a isobutanol). Puesto que muchas enzimas biosintéticas de la valina también catalizan reacciones análogas en la vía biosintética de la isoleucina, la especificidad de sustrato es una consideración importante a la hora de elegir las fuentes de genes.Por esta razón, los principales genes de interés para la enzima acetolactato sintasa son las procedentes de Bacillus (alsS) y Klebsiella (budB). Se sabe que estas acetolactato sintasas concretas participan en la fermentación del butandiol en estos organismos, y muestran mayor afinidad por el piruvato frente al cetobutirato (Gollop et ál., J. Bacteriol., 172, 3444-3449, 1990; y Holtzclaw et ál., J. Bacteriol., 121, 917-922, 1975). La segunda y tercera etapas de la vía son catalizadas por la acetohidroxiácido reductoisomerasa y deshidratasa, respectivamente. Estas enzimas se han caracterizado a partir de una serie de fuentes tales como, por ejemplo, E. coli (Chunduru et ál., Biochemistry, 28, 486-493,1989; y Flint et ál., J. Biol. Chem., 268, 14732-14742,1993). Se sabe que las últimas dos etapas de la vía del isobutanol preferida se producen en levaduras, que pueden utilizar la valina como fuente de nitrógeno y, en el proceso, segregar isobutanol. El a-cetoisovalerato puede convertirse en isobutiraldehído mediante una serie de enzimas cetoácido descarboxilasas tales como, por ejemplo, piruvato descarboxilasa. Para evitar que el piruvato se dirija hacia fuera de la producción de isobutanol, se desea una descarboxilasa con una menor afinidad por el piruvato. Hasta la fecha, existen dos enzimas de este tipo conocidas en la técnica (Smit et ál., Appl. Environ. Microbiol., 71, 303-311, 2005; y de la Plaza et ál., FEMS Microbiol. Lett., 238, 367-374, 2004). Ambas enzimas proceden de cepas de Lactococcus lactis y tienen una preferencia mayor en 50-200 veces por el cetoisovalerato frente al piruvato. Por último, se ha identificado una serie de aldehído reductasas en levaduras, muchas con especifidades de sustrato solapantes. Las que prefieren sustratos de cadena ramificada frente al acetaldehído incluyen, pero no se limitan a alcohol deshidrogenasa VI (ADH6) e Ypr1p (Larroy et ál., Biochem. J., 361, 163-172, 2002; y Ford et ál., Yeast, 19, 1087-1096, 2002), y ambas utilizan el NADPH como donante de electrones. También se ha identificado recientemente en E. coli una reductasa dependiente de NADPH, YqhD, que es activa con sustratos de cadena ramificada (Sulzenbacher et ál., J. Mol. Biol., 342, 489-502, 2004).

Dos de las otras vías potenciales para la producción de isobutanol también contienen las tres etapas iniciales de "a", "b" y "c". Una vía consiste en las etapas enzimáticas "a","b", "c", "f", "g", "e". La etapa "f" contiene una "cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa" con el número EC 1.2.4.4. La etapa "g" contiene una "aldehído acilante deshidrogenasa" con los números EC 1.2.1.10 y 1.2.1.57, además de la etapa "e", que contiene la "alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa". Las otras vías potenciales consisten en las etapas "a", "b", "c", "h", "i","j", "e". El término "transaminasa" (etapa "h") tiene los números EC 2.6.1.42 y 2.6.1.66. La etapa "h" consiste en una "valina deshidrogenasa" con los números EC 1.4.1.8 y 1.4.1.9, o la etapa "i", una "valina descarboxilasa" con el número EC

4.1.1.14. Por último, la etapa "j" emplea una "omega transaminasa" con el número EC 2.6.1.18 para generar isobutiraldehído, que será reducido por la etapa "e" para producir isobutanol. Todas las vías potenciales para la conversión del piruvato en isobutanol se representan en la figura 1.

Además, se sabe que una serie de organismos producen butirato y/o butanol a a través de un intermedio de butiril-CoA (Dürre et ál., FEMS Microbiol. Rev., 17, 251-262, 1995; y Abbad-Andaloussi et ál., Microbiology, 142, 11491158, 1996). Por tanto, la producción de isobutanol en estos organismos tendrá lugar utilizando las etapas "k", "g" y "e", mostradas en la figura 1. La etapa "k" empleará una "isobutiril-CoA mutasa" con el número EC 5.4.99.13. La siguiente etapa implica el uso de "aldehído acilante deshidrogenasa" con los números EC 1.2.1.10 y 1.2.1.57 para producir isobutiraldehído, seguido de la etapa enzimática "e" para producir isobutanol. Todas estas vías se describen a fondo en la solicitud de patente de EEUU de propiedad de los solicitantes 11/586315.

Hospedantes microbianos para la producción de isobutanol

Los hospedantes microbianos para la producción de isobutanol pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras. El hospedante microbiano utilizado para la producción de isobutanol debe ser tolerante al isobutanol, de modo que el rendimiento no se vea limitado por la toxicidad del butanol. Los microbios que son metabólicamente activos a altos niveles de titulación de isobutanol no son muy conocidos en la técnica. Aunque se han aislado mutantes tolerantes al butanol a partir de Clostridium disolventegénicas, existe poca información disponible acerca de la tolerancia al butanol de otras cepas bacterianas potencialmente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de la tolerancia a alcoholes en bacterias sugieren que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho et ál., Microsc. Res. Tech., 64, 215-222, 2004; y Kabelitz et ál., FEMS Microbiol. Lett., 220, 223227, 2003). Tomas et ál., J. Bacteriol., 186, 2006-2018, 2004 indican que el rendimiento de 1-butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede verse limitado por la toxicidad del 1-butanol. El principal efecto del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la alteración de las funciones de membrana (Hermann et ál., Appl. Environ. Microbiol., 50, 1238-1243, 1985).

Los hospedantes microbianos seleccionados para la producción de isobutanol deben ser tolerantes al isobutanol, y deben ser capaces de convertir los carbohidratos en isobutanol. Los criterios para la selección de hospedantes microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al isobutanol, alta tasa de utilización de la glucosa, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación de genes, y capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables.

Las cepas de hospedantes adecuadas con tolerancia al isobutanol pueden identificarse mediante una selección basada en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microbios al isobutanol puede medirse determinando la concentración de isobutanol que es responsable del 50% de inhibición de la velocidad de crecimiento (CI50) cuando se cultiva en un medio mínimo. Los valores de CI50 pueden determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los microbios de interés pueden cultivarse en presencia de diversas cantidades de isobutanol, y controlarse la velocidad de crecimiento midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros (DO600). Puede calcularse el tiempo de duplicación a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento, y emplearse como medición de la velocidad de crecimiento. Puede determinarse la concentración de isobutanol que produce 50% de inhibición del crecimiento a partir de una gráfica del porcentaje de inhibición del crecimiento frente a la concentración de isobutanol. Preferiblemente, la cepa hospedante debe tener una CI50 para el isobutanol mayor que aproximadamente 0,5%.

El hospedante microbiano para la producción de isobutanol también debe poder utilizar la glucosa a una alta tasa. La mayoría de los microbios son capaces de utilizar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios ambientales no pueden utilizar carbohidratos con alta eficacia y, por tanto, no son hospedantes adecuados.

La capacidad para modificar genéticamente el hospedante es fundamental para la producción de cualquier microorganismo recombinante. El modo de la tecnología de transferencia de genes puede ser mediante electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Está disponible una amplia gama de plásmidos que se conjugan con hospedantes y marcadores de resistencia a fármacos. Los vectores de clonación se adaptan a los organismos hospedantes basándose en la naturaleza de los marcadores de resistencia a antibióticos que pueden funcionar en ese hospedante.

El hospedante microbiano también tiene que manipularse para inactivar las vías competitivas por el flujo de carbono mediante la deleción de diversos genes. Esto requiere la disponibilidad de transposones para dirigir la inactivación o vectores de integración cromosómica. Además, debe poder hacerse una mutagénesis química en el hospedante productor, de modo que puedan obtenerse mutaciones para mejorar la tolerancia al isobutanol intrínseca.

Basándose en los criterios descritos anteriormente, los hospedantes microbianos adecuados para la producción de isobutanol incluyen, pero no se limitan a miembros de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces. Los hospedantes preferidos incluyen Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae.

Construcción del hospedante de producción

Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la vía enzimática para la conversión de un sustrato de carbono fermentable en isobutanol pueden construirse utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. En la presente invención, los genes que codifican las enzimas de una de las vías biosintéticas del isobutanol de la invención, por ejemplo, acetolactato sintasa, acetohidroxiácido isomerorreductasa, acetohidroxiácido deshidratasa, a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa, y alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa, pueden aislarse a partir de diversas fuentes, tal como se describió anteriormente.

Los métodos para obtener genes deseados a partir de un genoma bacteriano son habituales y muy conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, si se conoce la secuencie del gen, pueden crearse bancos genómicos adecuados mediante digestión con endonucleasas de restricción y pueden seleccionarse con sondas complementarias a la secuencia génica deseada. Tras haber aislado la secuencia, el ADN puede amplificarse utilizando métodos convencionales de amplificación dirigida por cebadores, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (documento US 4.683.202), para obtener cantidades de ADN adecuadas para la transformación utilizando vectores apropiados. Las herramientas para la optimización de codones para la expresión en un hospedante heterólogo están disponibles con facilidad. Están disponibles algunas herramientas para la optimización de codones basadas en el contenido en GC del organismo hospedante.

Tras haber identificado y aislado los genes de la vía pertinente, estos pueden transformarse en hospedantes de expresión adecuados por medios muy conocidos en la técnica. Los vectores o módulos útiles para la transformación de una diversidad de células hospedantes son habituales y están disponibles en el mercado en empresas, tales como EPICENTRE® (Madison, WI), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA), y New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Generalmente, el vector o módulo contiene secuencias que dirigen la transcripción y la traducción del gen pertinente, un marcador seleccionable, y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del gen que porta los controles de inicio de la transcripción, y una región 3' del fragmento de ADN que controla la terminación de la trancripción. Ambas regiones de control pueden derivase de genes homólogos a la célula hospedante transformada, aunque debe entenderse que estas regiones de control también pueden derivarse de genes que no son nativos a las especies específicas elegidas como hospedante de producción.

Los promotores o las regiones de control del inicio, que son útiles para conducir la expresión de las regiones codificadoras de la vía pertinentes en la célula hospedante deseada, son numerosos y familiares para los expertos en la técnica. Casi todos los promotores capaces de dirigir estos elementos genéticos son adecuados para la presente invención e incluyen, pero no se limitan a CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (útiles para la expresión en Saccharomyces); AOX1 (útil para la expresión en Pichia); y lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac, y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes, y Pseudomonas), así como los promotores amy, apr, npr y diversos promotores de fagos útiles para la expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, y Paenibacillus macerans.

Las regiones de control de la terminación también pueden derivarse de diversos genes nativos a los hospedantes preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser innecesario, aunque se prefiere que se incluya.

Ciertos vectores son capaces de replicarse en una amplia gama de bacterias hospedantes y pueden ser transferidos mediante conjugación. Está disponible la secuencia completa y comentada de pRK404 y tres vectores relacionados (pRK437, pRK442, y pRK442(H)). Estos derivados han demostrado ser herramientas valiosas para la manipulación genética de bacterias Gram-negativas (Scott et ál., Plasmid, 50, 74-79, 2003). También están disponibles varios derivados de plásmidos del plásmido RSF1010 Inc P4 de amplia gama de hospedantes, con promotores que pueden actuar en una diversidad de bacterias Gram-negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos junto con múltiples sitios de clonación para permitir la expresión heteróloga en bacterias Gram-negativas.

Las herramientas de sustitución de genes cromosómicos también están ampliamente disponibles. Por ejemplo, un variante termosensible del replicón de amplia gama de hospedantes pWV101 se ha modificado para construir el plásmido pVE6002, que puede utilizarse para realizar la sustitución de genes en una gama de bacterias Gramnegativas (Maguin et ál., J. Bacteriol., 174, 5633-5638, 1992). Además, están disponibles transposomas in vitro para crear mutaciones aleatorias en una diversidad de genomas, a partir de fuentes comerciales, tales como EPICENTRE®.

La expresión de una vía biosintética del isobutanol en diversos hospedantes microbianos preferidos se describe con más detalle a continuación.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en E. coli

Los vectores o módulos útiles para la transformación de E. coli son habituales y están disponibles en el mercado en las empresas listadas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una vía biosintética del isobutanol pueden aislarse a partir de diversas fuentes, clonarse en un vector pUC19 modificado, y transformarse en E. coli NM522.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en Rhodococcus erythropolis

Está disponible una serie de vectores lanzadera de E. coli-Rhodococcus para la expresión en R. erythropolis que incluyen, pero no se limitan a pRhBR17 y pDA71 (Kostichka et ál., Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 61-68, 2003). Además, está disponible una serie de promotores para la expresión de genes heterólogos en R. erythropolis (Nakashima et ál., Appl. Environ. Microbiol., 70, 5557-5568, 2004; y Tao et ál., Appl. Microbiol. Biotechnol., 68, 346354, 2005). La alteración de genes cromosómicos dirigida en R. erythropolis puede crearse utilizando el método descrito por Tao et ál., supra, y Brans et ál. (Appl. Environ. Microbiol., 66, 2029-2036, 2000).

Los genes heterólogos necesarios para la producción de isobutanol, tal como se describió anteriormente, pueden clonarse en un principio en pDA71 o pRhBR71, y transformarse en E. coli. Los vectores entonces pueden transformarse en R. erythropolis mediante electroporación, según se describe en Kostichka et ál., supra. Los recombinantes pueden cultivarse en un medio sintético que contenga glucosa, y puede seguirse la producción de isobutanol utilizando métodos conocidos en la técnica.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en B. subtillis

Los métodos para la expresión de genes y la creación de mutaciones en B. subtillis también son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los genes de una vía biosintética del isobutanol pueden aislarse a partir de diversas fuentes, clonarse en un vector pUC19 modificado, y transformarse en Bacillus subtillis BE1010. Además, los cinco genes de una vía biosintética del isobutanol pueden dividirse entre dos operones para la expresión. Los tres genes de la vía (bubB, ilvD, y kivD) pueden integrarse en el cromosoma de Bacillus subtilis BE1010 (Payne, et ál., J. Bacteriol., 173, 2278-2282, 1991). Los dos genes restantes (ilvc y bdhB) pueden clonarse en un vector de expresión y transformarse en la cepa de Bacillus que porta los genes de isobutanol integrados.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en B. licheniformis

La mayoría de los plásmidos y vectores lanzadera que se replican en B. subtillis pueden utilizarse para transformar

B. licheniformis mediante transformación de protoplastos o electroporación. Los genes necesarios para la produción de isobutanol pueden clonarse en plásmidos derivados de pBE20 o pBE60 (Nagarajan et ál., Gene, 114, 121-126, 1992). Los métodos para transformar B. licheniformis son conocidos en la técnica (Fleming et ál., Appl. Environ. Microbiol., 61, 3775-3780, 1995). Los plásmidos construidos para la expresión en B. subtillis pueden transformarse en B. licheniformis para producir un hospedante microbiano recombinante que produzca isobutanol.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en Paenibacillus macerans

Pueden construirse plásmidos tal como se describió anteriormente para la expresión en B. subtillis y emplearse para transformar Paenibacillus macerans mediante transformación de protoplastos para producir un hospedante microbiano recombinante que produzca isobutanol.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus

Los métodos para la expresión de genes y la creación de mutaciones en Alcaligenes autrophus son conocidos en la técnica (Taghavi et ál., Appl. Environ. Microbiol., 60, 3585-3591, 1994). Los genes para una vía biosintética del isobutanol pueden clonarse en cualquiera de los vectores de amplia gama de hospedantes descritos anteriormente, y electroporarse para generar recombinantes que produzcan isobutanol. La vía del polihidroxibutirato en Alcaligenes se ha descrito en detalle, se conocen una diversidad de técnicas genéticas para modificar el genoma de Alcaligenes eutrophus, y estas herramientas pueden aplicarse para modificar una vía biosintética del isobutanol.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en Pseudomonas putida

Los métodos para la expresión de genes en Pseudomonas putida son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ben-Bassat et ál., patente de EEUU n.º 6.586.229). Los genes de la vía del butanol pueden insertarse en pPCU18 y este ADN acoplado puede electroporarse en células de Pseudomonas putida DOT-T1 C5aAR1 electrocompetentes para generar recombinantes que produzcan isobutanol.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en Saccharomyces cerevisiae

Los métodos para la expresión de genes en Saccharomyces cerevisiae son conocidos en la técnica (por ejemplo, Methods in Enzymology, volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink, eds., Elsevier Academic Press, San Diego, CA). La expresión de genes en levaduras generalmente requiere un promotor, seguido del gen de interés, y un terminador de la transcripción. Puede utilizarse una serie de promotores de levaduras para construir módulos de expresión para genes que codifican una vía biosintética del isobutanol que incluyen, pero no se limitan a los promotores constitutivos FBA, GPD, ADH1, y GPM, y los promotores inducibles GAL1, GAL10, y CUP1. Los terminadores de la transcripción adecuados incluyen, pero no se limitan a FBAt, GPDt, GPMt, ERG10t, GAL1t, CYC1, y ADH 1. Por ejemplo, los promotores, terminadores de la transcripción y genes de una vía biosintética del isobutanol adecuados pueden clonarse en vectores lanzadera de E. coli-levaduras.

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en Lactobacillus plantarum

El género Lactobacillus pertenece a la familia Lactobacillales, y muchos plásmidos y vectores que se emplean para la transformación de Bacillus subtillis y Streptococcus pueden utilizarse para Lactobacillus. Los ejemplos no limitantes de vectores adecuados incluyen pABp1 y sus derivados (Renault et ál., Gene, 183, 175-182, 1996); y (O’Sullivan et ál., Gene, 137, 227-231, 1993); pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 (Wyckoff et ál., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1481-1486, 1996); pMG1, un plásmido conjugativo (Tanimoto et ál., J. Bacteriol., 184, 58005804, 2002); pNZ9520 (Kleerebezem et ál., Appl. Environ. Microbiol., 63, 4581-4584, 1997); pAM401 (Fujimoto et ál., Appl. Environ. Microbiol., 67, 1262-1267, 2001); y pAT392 (Arthur et ál., Antimicrob. Agents Chemother., 38, 18991903, 1994). También se han indicado varios plásmidos de Lactobacillus plantarum (van Kranenburg R., et ál., Appl. Environ. Microbiol., 71, 1223-1230, 2005).

Expresión de una vía biosintética del isobutanol en diversas especies de Enterococcus (E. faecium, E. gallinarium y

E. faecalis)

El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales, y muchos plásmidos y vectores que se emplean para la transformación de Lactobacillus, Bacillus y Streptococcus pueden utilizarse para especes de Enterococcus. Los ejemplos no limitantes de vectores adecuados incluyen pABp1 y sus derivados (Renault et ál., Gene, 183, 175-182, 1996); y (O’Sullivan et ál., Gene, 137, 227-231, 1993); pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 (Wyckoff et ál., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1481-1486, 1996); pMG1, un plásmido conjugativo (Tanimoto et ál., J. Bacteriol., 184, 5800-5804, 2002); pNZ9520 (Kleerebezem et ál., Appl. Environ. Microbiol., 63, 4581-4584, 1997); pAM401 (Fujimoto et ál., Appl. Environ. Microbiol., 67, 1262-1267, 2001); y pAT392 (Arthur et ál., Antimicrob. Agents Chemother., 38, 1899-1903, 1994). También pueden utilizarse vectores de expresión para E. faecalis que emplean el gen nisA de Lactococcus (Eichenbaum et ál., Appl. Environ. Microbiol., 64, 2763-2769, 1998). Además, pueden utilizarse vectores para la sustitución de genes en el cromosoma de E. faecium (Nallaapareddy et ál., Appl. Environ. Microbiol., 72, 334-345, 2006).

Medios de fermentación

Los medios de fermentación en la presente invención deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a monosacáridos, tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos, tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos, tales como almidón o celulosa o sus mezclas, y mezclas no purificadas de materias primas, tales como permeado de suero de queso, destilado de macerado de maíz, melaza de remolacha azucarera, y malta de cebada. Además, el sustrato de carbono también puede ser un sustrato de un solo carbono, tal como dióxido de carbono, o metanol, para el que se ha demostrado la conversión metabólica en intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de un solo carbono y de dos carbonos, también se sabe que los organismos metiltróficos utilizan una serie de otros compuestos que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una diversidad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que las levaduras metiltróficas utilizan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et ál., Microb. Growth C1 Compd. [Int. Symp.] 7th (1993), 415-432. eds.: Murrell, J. Collin; Kelly, Don P., edición: Intercept, Andover, Reino Unido). De modo similar, diversas especies de Candida metabolizan la alanina o el ácido oleico (Sulter et ál., Arch. Microbiol., 153, 485-489, 1990). Por tanto, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención pueda comprender una ampla gama de sustratos que contienen carbono y que estos solo se verán limitados por la elección del organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y sus mezclas son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa.

Además de una fuente de carbono adecuada, el medio de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, que sean adecuados para el crecimiento de los cultivos y la estimulación de la vía enzimática necesaria para la producción de isobutanol.

Condiciones de cultivo

Generalmente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25 ºC a aproximadamente 40 ºC en un medio apropiado. Los medios de crecimiento adecuados en la presente invención son medios habituales preparados del mercado, tales como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud dextrosa (SD), o caldo de medio de levadura (YM). También pueden utilizarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo concreto será conocido por los expertos en la técnica de la microbiología o la ciencia de la fermentación. El uso de agentes conocidos por modular la represión de catabolitos directa o indirectamente, por ejemplo, adenosina 2',3'-monofosfato cíclico (AMPc), también pueden incorporarse en el medio de fermentación.

Los intervalos de pH adecuados para la fermentación son entre pH 5,0 a pH 9,0, siendo preferido un pH 6,0 a pH 8,0 para las condiciones iniciales.

Las fermentaciones pueden realizarse bajo condiciones aerobias o anaerobias, siendo preferidas las condiciones anaerobias o microaerobias.

Fermentaciones continuas y discontinuas industriales

El presente proceso emplea un método discontinuo de fermentación. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en el que la composición del medio se ajusta al comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Así, al comienzo de la fermentación, el medio se inocula con el organismo u organismos deseados, y se deja que la fermentación se desarrolle sin añadir nada al sistema. Sin embargo, generalmente, una fermentación "discontinua" es discontinua con respecto a la adición de la fuente de carbono, y a menudo se intentan controlar factores, tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas discontinuos, las composiciones de los metabolitos y de la biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos discontinuos, las células fluctúan desde una fase de retraso estática a una fase logarítmica de alto crecimiento y, por último, a una fase estacionaria en la que la velocidad de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente mueren. Las células en la fase logarítimica en general son responsables de la producción a granel del producto final

o del intermedio.

Una variación del sistema discontinuo convencional es el sistema de alimentación discontinua. Los procesos de fermentación de alimentación discontinua también resultan adecuados en la presente invención, y comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas de alimentación discontinua son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células, y cuando resulta deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Las mediciones de la concentración real del sustrato en los sistemas de alimentación discontinua son difíciles y, por tanto, se calcula sobre la base de los cambios en los factores mensurables, tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales, tales como CO2. Las fermentaciones discontinuas y de alimentación discontinua son habituales y muy conocidas en la técnica, y pueden encontrarse ejemplos en Thomas D. Brock, en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2ª edición (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.; o Deshpande, Mukund (Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, 1992).

Aunque la presente invención se realiza en modo discontinuo, se contempla que el método podría adaptarse a métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto en el que un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor, y una cantidad igual de medio acondicionado se retira de modo simultáneo para su procesamiento. La fermentación continua en general mantiene los cultivos a una alta densidad constante, en los que las células están principalmente en fase de crecimiento logarítmico.

La fermentación continua permite la modulación de un factor o de una serie de factores que afectan al crecimiento celular o la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantiene un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, a un nivel fijo, y permite que los otros parámetros fluctúen. En otros sistemas, una serie de factores que afectan al crecimiento pueden alterarse de modo continuo, mientras que la concentración de células, medida a través de la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos buscan mantener condiciones de crecimiento en estado constante y, así, la pérdida de células debida a la extracción del medio debe equilibrarse frente a la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular los nutrientes y los factores del crecimiento para los procesos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto, son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial, y una diversidad de métodos se detallan en Brock, supra.

Se contempla que la presente invención pueda practicarse utilizando procesos discontinuos, de alimentación discontinua o continuos, y que cualquier modo de fermentación sería adecuado. Además, se contempla que las células puedan inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células enteras, y someterse a condiciones de fermentación para la producción de isobutanol.

Métodos para el aislamiento del isobutanol a partir del medio de fermentación

El isobutanol producido biológicamente puede aislarse del medio de fermentación utilizando métodos conocidos en la técnica para las fermentaciones de acetona-butanol-etanol (ABE) (véase, por ejemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol., 49, 639-648, 1998; Groot et ál., Process. Biochem., 27, 61-75, 1992; y las referencias citadas en ellos). Por ejemplo, los sólidos pueden retirarse del medio de fermentaicón mediante centrifugación, filtración, decantación, y el isobutanol puede aislarse del medio de fermentación utilizando métodos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción de líquido-líquido, adsorción, destilación de gases, evaporación de membrana, o pervaporación.

Ejemplos

La presente invención se define con más detalle en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, sólo se ofrecen como ilustración.

Métodos generales

Las técnicas de ADN recombinante y de clonación molecular convencionales utilizadas en los ejemplos son muy conocidas en la técnica, y se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989, en la presente mencionado como "Maniatis"), y en Maniatis (supra), y en Silhavy et ál. (Silhavy, et ál., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1984), y en Ausubel et ál. (Ausubel et ál., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987).

Los materiales y los métodos adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para su uso en los siguientes ejemplos pueden encontrarse en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp et ál., eds., American Society for Microbiology, Washington, DC.,1994), o en Thomas D. Brock, en Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2ª edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales utilizados para el crecimiento y el mantenimiento de las células bacterianas se obtuvieron en Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD), o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), a menos que se indique lo contrario.

Los cebadores oligonucleotídicos utilizados en los siguientes ejemplos se indican en la tabla 3.

Tabla 3

CEBADORES OLIGONUCLEOTÍDICOS UTILIZADOS EN ESTA INVENCIÓN

SECUENCIA ID NO:

SECUENCIA Descripción

11

Cebador para la amplificación de ilvC

12

Cebador para la amplificación de ilvC

13

GCTAACAGGAGGAAGAGCTCATGGCACCCTCGCTC pBAD-SAC1-F directo

14

GAGCGAGGGTGCCATGAGCTCTTCCTCCTGTTAGC pBAD-SAC1-R inverso

15

ilvC-trc-Sac1-F directo

16

ilvC-trc-HindIII-R inverso

17

CCGTAAAGATATCACCGTAG ilvC-tro-F3

18

CAGTATGAAGGCAAAATCGG ilvC-tro-F5

19

CGTACTCAGCGGTATCAGAG ilvC-tro-R2

20

CAGATTTCACTTCCGCAACG ilvC-tro-R4

21

CGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG pBAD-e-F1

22

ACCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATC PALPK-R1

23

PAO1-C-F1

24

PAO1-C-R1

25

PF5-C-F1

26

PF5-C-R1

27

GATCATGATCGCGCCGAAGG PF5-S-F2

28

CTGCTCACCGAACAGGTCGG PF5-S-R2

37

PAL-F1 directo

38

PAL-R1 inverso

39

PAL-EcoR1-F1 directo

40

PAL-EcoR1-R1 inverso

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "seg" significa segundo o segundos, "min" significa minuto o minutos, "h" significa hora u horas, "nm" significa nanómetros, "ul" significa microlitro o microlitros, "ml" significa mililitro o mililitros, "mg/ml" significa miligramos por mililitro, "l" significa litro o litros, "nm" significa nanómetros, "mM" 5 significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol o milimoles, "mmol" significa micromol o micromoles", "kg" significa kilogramo, "g" significa gramo o gramos, "mg" significa microgramo o microgramos, y "ng" significa nanogramo o nanogramos,"PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa, "DO" significa densidad óptica, "DO600" significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodaltons, "g" significa la constante de gravitación, "pb" significa par o pares de bases, "kbp" significa kilopares de bases, "kb" 10 significa kilobase, "%" significa porcentaje, "% en p/v" significa porcentaje en peso/volumen, "% en v/v" significa

porcentaje en volumen/volumen, "HPLC" significa cromatografía líquida de alta resolución, "g/l" significa gramos por litro, "ug/l" significa microgramos por litro, "ng/ul" significa nanogramos por microlitro, "pmol/ul "significa picomoles por microlitro, "rpm" significa rotaciones por minuto, "umol/min/mg" significa micromoles por minuto por miligramo, "p/v" significa peso por volumen, "v/v" significa volumen por volumen.

Ejemplo 1 (comparativo)

Análisis de la actividad de la enzima KARI

Este ejemplo describe la preparación de construcciones de sobreexpresión del gen ilvC y la medición de la actividad enzimática utilizando la oxidación dependiente de acetolactato de NADPH por la enzima KARI codificada por el gen ilvC de E. coli.

Construcción del plásmido de expresión pBAD-ilvC y aislamiento del gen ilvC de E. coli

La región codificadora del gen ilvC se amplificó a partir del ADN genómico de E. coli cepa FM5 (ATCC 53911) utilizando PCR. Las células se cultivaron durante la noche (37 ºC, mientra se agita a 300 rpm) en tubos de cultivo de 50 ml que contenían 4 ml de medio Luria Bertani (LB) (Mediatech Inc., Herndon, VA). Después se recolectaron mediante centrifugación a 1000 x g durante 3 min, y el ADN genómico de las células se preparó utilizando el kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; n.º de catálogo D-5000A) según las instrucciones del fabricante. Se preparó un fragmento de ADN de la región codificadora de ilvC mediante PCR utilizando ADN de E. coli como molde y los cebadores SEQ ID NO:11 y 12.

La PCR se realizó utilizando Finnzymes Phusion™ High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs Inc., Beverly, MA, n.º de catálogo F-531) según el protocolo del fabricante. La amplificación se realizó en un termociclador de ADN GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster city, CA). El producto de la PCR (0,5 ul), sin más purificación, se acopló en pCR4Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, n.º de catálogo 45-0031) y se transformó en células TOP10 químicamente competentes (Invitrogen 44-0301). El producto del acoplamiento se sembró en estrías sobre una placa que contenía el medio LB más ampicilina 100 ug/ml (Teknova Inc, Hollister, CA, n.º de catálogo L1004). Los clones que contenía la inserción de ilvC fueron confirmados mediante digestión de restricción con SacI/BamHI. Tres de los cuatro plásmidos digeridos tenían la banda de 1,5 kpb esperada. El clon resultante se denominó pCR4Blunt TOPO-ilvC.

El fragmento ilvC del vector de clonación pCR4Blunt TOPO-ilvC fue liberado mediante digestión con SacI/BamHI, y se acopló en pTrc99A digerido con SacI/BamHI (Amann, et ál., Gene, 69, 301-315, 1988) utilizando ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Esta construcción se electroporó en células de E. coli TOP10 electrocompetentes (Invitrogen 44-0035), y estas se sembraron en estrías sobre una placa de LB/ampicilina tal como se describió anteriormente. El vector que contiene la inserción de 1,5 kb se denominó pTrc99A-ilvC.

Preparación del vector pBAD para la clonación

Se construyó un derivado del vector pBAD.HisA (Invitrogen) que contenía un sitio SacI en el extremo 5' del gen, para la clonación del gen ilvC en pBAD utilizando sitios de restricción SacI/HindIII. Esta construcción se creó en tres etapas. En primer lugar, la región codificadora de fenilalanina amoniaco liasa (PAL, EC 4.3.1.5) de Rhodotorula glutinis se clonó en el vector pBAD-HisA para fabricar pBAD-PAL. En segundo lugar, se añadió el sitio EcoRI en el extremo 5' del gen inmediatamente antes del codón de inicio sobre la construcción pBAD-PAL para fabricar pBADPAL-EcoRI. En tercer lugar, el sitio EcoRI fue reemplazado por un sitio SacI, y el vector resultante se digirió con SacI/HindIII para fabricar un vector pBAD-SacI para la clonación del gen ilvC. El gen PAL primero se amplificó mediante PCR a partir del vector pKK223-PAL (patente de EEUU n.º 6521748) utilizando un cebador directo (PAL-F1) (SEQ ID NO: 37) y un cebador inverso (PAL-R1) (SEQ ID NO:38).

La PCR se realizó en un termociclador Perkin Elmer PCR9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando la premezcla de ADN polimerasa Taq TaKaRa (TAKARA Bio USA, Madison, WI, n.º de catálogo TAK_R004A) según el protocolo del fabricnte. El producto de la PCR fue parcialmente purificado utilizando el kit de purificación de PCR QIAuik (Qiagen, n.º de catálogo 28106) y se digirió con BbsI y HindIII. Esto produjo un fragmento que contenía una proyección NcoI en el extremo 5'. El producto de la digestión después se acopló en un vector pBAD.HisA (Invitrogen) que se había digerido con NcoI/HindIII. La reacción de acoplamiento se realizó utilizando ADN ligasa de T4 (Promega) siguiendo el protocolo convencional proporcionado por el fabricante. Se emplaron 2 ul del producto de acoplamiento para transformar células electrocompetentes TOP10 (Invitrogen) empleando un Bio-RAD Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las células transformadas se sembraron en estrías sobre placas de agar que contenían medio LB más ampicilina 100 ug/ml (Teknova Inc., Hollister, CA, n.º de catálogo L1004) y se incubaron durante la noche a 37 ºC. Los clones que contenían la inserción PAL se confirmaron mediante digestión de restricción con NcoI/HindII. Esta construcción se denominó pBAD-PAL. Entonces se añadió el sitio EcoRI al extremo 5' del gen PAL en la anterior construcción utilizando un kit de mutagénesis específica dirigida a sitio QuikChange II (Stratagene, La Jolla, CA, n.º de catálogo 200524). Se diseñaron el cebador directo (PAL-EcoRI-F1) (SEQ ID NO:39) y el cebador inverso (PAL-EcoRI-R1) (SEQ ID NO:40), y las mezclas de reacción se prepararon siguiendo las indicaciones del fabricante. Se empleó la construcción pBAD-PAL preparada anteriormente como molde en la siguiente reacción.

Los 50 ul de la mezcla de reacción contenían 1,0 ul de 50 ng/ul del plásmido molde, 1,0 ul de 10 pmol/ul de cada cebador, 5 ul de 10x tampón de reacción, 1,0 ul de mezcla de dNTP, y 3 ul de disolución Quik, 30 ul de agua y 1,0 ul de ADN polimerasa de alta fidelidad pfu-ultra en un tubo de 200 ul de pared fina. Todos los reactivos y la polimerasa utilizados en esta reacción fueron proporcionados por el anterior kit QuikChange II XL. La reacción se realizó en un termociclador de ADN GeneAmp 2400 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando las siguientes condiciones. La temperatura de inicio fue de 96 ºC durante 2 min, tras lo cual se realizaron 18 ciclos de calentamiento/enfriamento. Cada ciclo consistió en 96 ºC durante 30 seg, seguido de 60 ºC durante 30 seg, y 72 ºC durante 160 seg. Cuando finalizaron los ciclos de temperatura, las muestras se mantuvieron a 72 ºC durante 600 seg más, y después se mantuvieron a la espera de la recuperación de la muestra a 4 ºC.

Tras completar la reacción, se añadió 1,0 ul de la enzima de restricción DpnI (del anterior kit) a la reacción, seguido de una incubación a 37 ºC durante 3 h para digerir los plásmidos molde en la reacción.

Entonces se transformaron 2,0 ul del producto de la reacción digerido con DpnI en 50 ul de células electrocompetentes E. coli TOP10 (Invitrogen) utilizando un Bio-RAD Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Se sembraron en estrías diferentes volúmenes (2,0 ul, 5,0 ul y 20 ul) de las células tgransformadas sobre placas de agar de 10 cm que contenían medio LB y ampicilina 100 ug/ml, y las placas se incubaron a 37 ºC durante la noche. Se escogieron tres clones de la placa que contenía las colonias bien separadas. Los plásmidos de los tres clones se purificaron utilizando un kit de minipreparación Spin Qiaprep (Qiagen, Valencia, CA, n.º de catálogo 27106) siguiendo las intrucciones del fabricante. Los clones positivos fueron confirmados mediante un análisis de digestión de restricción empleando las enzimas de restricción EcoRI y HindIII (Promega, Madison, WI) colocando 1,0 ul de 10x tampón de reacción (tampón Promega), 1,0 ul del plásmido purificado y 1,0 ul de cada enzima de restricción en 6,0 ul de agua desionizada. La mezcla de reacción se incubó a 37 ºC durante 60 min. El producto digerido de cada clon se separó en un gel de agarosa E al 0,8% (Invitrogen, n.º de catálogo G5018-08). Se detectó un fragmento de ADN de 2,1 kpb y otro de 4,0 kpb sobre el gel en las muestras con ambos sitios de restricción EcoRI y HindIII en la construcción. El sitio EcoRI en esta construcción entonces se reemplazó por un sitio SacI utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente con el plásmido molde pBAD-PAL-EcoRi y los cebadores de SEQ ID NO:13 y 14.

Los clones positivos fueron confirmados por análisis de digestión de restricción utilizando las enzimas de restricción SacI y HindIII (Promega, Madison, WI). Tras haber identificado los clones positivos, la anterior reacción de digestión de restricción se ajustó a una escala mayor (50 ul). El fragmento de 4 kpb que contenía el vector digerido se purificó en gel de la mezcla utilizando un gel de agarosa al 1% y un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA, n.º de catálogo 28704) siguiendo el protocolo del fabricante. Esta construcción se denominó pBAD-SacI.

Cepas hospedantes utilizadas para sobreexpresar KARI

La cepa hospedante E. coli Bw25113 (LilvC), una cepa con el gen ilvC inactivado, se empleó para fabricar construcciones que sobreexpresan la enzima KARI. En esta cepa, el gen ilvC completo sobre el cromosoma de E. coli ha sido reemplazado por un módulo de kanamicina empleando la tecnología de recombinación de homología de rojo lambda (Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000). Todas las cepas y los vectores necesarios para la creación de la cepa inactivada utilizando esta tecnología fueron obtenidos del profesor Barry Wanner (Purdue University, West Lafayette, IN).

Preparación de la región codificadora de ilvC para la clonación

La región codificadora para ilvC se amplificó utilizando la polimerasa de alta fidelidad pfu-ultra (Stratagene, La Jolla, CA) con la adición de un sitio SacI en el extremo 5' del cebador directo justo antes de ATG, y se añadió un sitio HindIII al extremo 5' del cebador inverso justo después del codón de fin. Se empleó el cebador con SEQ ID NO:15 (directo: ilvc-trc-SacI-F) y el cebador con SEQ ID NO:16 (inverso: ilvc-trc-HindIII-R) para esta reacción. El molde utilizado en la reacción de PCR fue la construcción pTrc99A-ilvC descrita anteriormente.

Los 50 ul de la mezcla de reacción contenían 5,0 ul de 10x tampón de reacción suministrado con la polimerasa pfuultra (Stratagene), 1,0 ul de 50 ng/ul del plásmido molde, 1,0 ul de 10 pmol/ul de cada uno de los cebadores directo e inverso, 1,0 ul de mezcla de dNTP 40 mM (Clonetech, Mountain View, CA), 1,0 ul de ADN polimerasa de pfu-ultra (Stratagene) y 39 ul de agua. Esta mezcla de reacción se colocó en un tubo de 200 ul de pared fina para la reacción de PCR en un termociclador de ADN GeneAmp 2400 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Se emplearon las siguientes condiciones para realizar la reacción de PCR. La temperatura de inicio fue de 94 ºC durante 2 min. Después se realizaron 30 ciclos de calentamiento/enfriamento. Cada ciclo consiste en 94 ºC durante 30 seg, 58 ºC durante 30 seg, y 68 ºC durante 1 min y 40 seg. Cuando finalizaron los ciclos de temperatura, las muestras se mantuvieron a 60 ºC durante 10 min más, y después se mantuvieron a la espera de la recuperación de la muestra a 4 ºC.

El producto de la PCR fue parcialmente purificado utilizando el kit de purificación de PCR QIAquik (Qiagen, n.º de catálogo 28106) y se digirió con HindIII y SacI, y después se purificó en gel utilizando el protocolo descrito anteriormente. El fragmento de la PCR digerido se acopló en el vector pBAD-SacI digerido con el mismo conjunto de enzimas. Los 20 ul de la mezcla de acoplamiento contenían 1,0 ul de ADN ligasa de T4 (Promega), 2,0 ul de 10x tampón de reacción que contiene la ADN ligasa de T4, 45 ng de vector y 45 ng de la inserción y agua desionizada. La reacción se incubó a 16 ºC durante la noche en un termociclador Eppendorf (Eppendorf North America, Westbury, NY).

Se transformaron 2 ul del producto de acoplamiento en células electrocompetentes E. coli TOP10 (Invitrogen) empleando un Bio-RAD Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA). Los clones transformados se seleccionaron en placas de agar que contenían medio LB y ampicilina 100 ug/ml. La presencia de la inserción del gen ilvC de E. coli en el clon se confirmó mediante digestión con SacI y secuenciación de ADN utilizando los cebadores de SEQ ID NO:17-22. La construcción con la inserción del gen ilvC se denominó pBAD-K12-ilvC.

Preparación de cepas para el análisis de la expresión de KARI

Los plásmidos de la anterior construcción pBAD-K12-ilvC y pTrc99A-ilvC, ambos en la cepa hospedante TOP10, se prepararon a partir de 3 ml del cultivo durante la noche en medio LB que contenía amplicilina 100 ug/ml utilizando el kit de minipreparación Spin Qiaprep (Qiagen, Valencia, CA, n.º de catálogo 27106) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se tranformó 1 ul de pBAD-K12-ilvC y 1 ul de pTrc99A-ilvC por separado en células electrocompetentes

E. coli Bw25113 (LilvC) utilizando un Bio-RAD Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las células transformadas se sembraron en estrías sobre placas de agar que contenían medio LB más ampicilina 100 ug/ml y se incubaron durante la noche a 37 ºC. Las colonias de estas placas se utilizaron para la preparación de extractos sin células.

Preparación del extracto sin células

Las células que contenían pBAD-K12-ilvC y pTrc99A-ilvC se cultivaron en 3,0 ml de medio LB que contenía ampicilina 100 ug/ml y el inductor arabinosa al 0,02% (en p/v) e isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM, respectivamente, a 37 ºC mientras se agitaba a 250 rpm. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 6000 x g durante 5 min a 22,5 ºC, los sedimentos celulares se resuspendieron en 300 ul de tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se colocaron en un baño de agua relleno con 40% de agua y 60% de hielo (en volumen), y se sonicaron durante 2-3 min (activaciones de 3,0 seg a fuerza 1,0, seguido de 3,0 seg de reposo) utilizando un sonicador Misonix 300 (Misonix, Farmingdale, NY). Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación (microcentrífuga Eppendorf, modelo 5415D, a 9300 x g durante 5 min a 22,5 ºC).

Como alternativa, los extractos celulares se prepararon utilizando la mezcla maestra BugBuster de reactivo de extracción de proteínas basado en detergentes (Novagen, n.º de catálogo 71456). Los sedimentos celulares de 3,0 ml de los cultivos se resuspendieron en 300 ul de mezcla maestra BugBuster y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugación (microcentrífuga Eppendorf, modelo 5415D) a 9300 x g durante 5 min a 22,5 ºC.

Cuantificación de las proteínas

Se midió la concentración de proteínas totales en las muestras mediante el ensayo de Coomassie de Bradford (BCA) empleando Coomassie Plus (Pierce n.º 23238, Rockford, IL). Las muestras y los patrones de proteínas (albúmina de suero bovino, BSA) se dispusieron en una microplaca de 96 pocillos siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración de proteínas se midió tras leer la absorbancia a 595 nm utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA).

Protocolo de ensayo de la enzima KARI

El sustrato de ensayo, (R,S)-acetolactato, se sintetizó como se describe en Aulabaugh y Schloss (Aulabaugh y Schloss, Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990): se mezclaron 1,0 g de éster etílico del ácido 2-acetoxi-2-metil-3oxibutírico (Aldrich, Milwaukee, WI) con 10 ml de NaOH 1,0 M y se agitó a temperatura ambiente. Cuando el pH de la disolución llegó a la neutralidad, se añadió lentamente más NaOH para mantener el pH a aproximadamente 8,0. Todos los demás productos químicos utilizados en el ensayo se obtuvieron en Sigma.

La conversión enzimática de acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato mediante KARI fue seguida midiendo la desaparación del cofactor, NADPH, de la reacción a 340 nm utilizando un espectrofotómetro (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La actividad se calculó utilizando el coeficiente de extinción molar de 6220 M-1 cm-1 para NADPH. Las disoluciones madre utilizadas fueron: HEPES-sal de potasio 100 mM, ajustado mediante HCl/KOH a pH 7,5, MgCl2 1,0 M, NADPH 20 mM y acetolactato 90 mM. Los 40 ml de la disolución madre de mezcla de reacción contenían disolución madre de HEPES 100 mM y 400 ul de disolución madre de MgCl2.

El tampón de reacción (194 ul) se mezcló con disolución madre de NADPH (2,0 ul) y extracto celular (2,0 ul) en una cubeta de plástico desechable (Eppendorf UVette, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y se registró la absorbancia a 340 nm a 22,5 ºC durante 20 segundos. La A340 inicial normalmente fue de aproximadamente 0,9-1,0. Después se añadió acetolactato (2,0 ul) a la cubeta para iniciar la reacción. La concentración final de los ingredientes en el ensayo fue de: HEPES-potasio 100 mM a pH 7,5, MgCl2 1,0 mM, NADPH 200 uM y acetolactato 900 uM. Esta disolución se mezcló a fondo y se registró su absorbancia a 340 nm durante 80 seg más. La actividad KARI indicada en la presente se define como !moles de NADPH consumidos por min por mg de proteína total en los extractos celulares. Los resultados de las concentraciones de proteínas y actividades KARI en los extractos celulares

preparados a partir de células E. coli Bw25113 (LilvC) transformadas con plásmidos pBAD-K12-ilvC y plásmidos

pTrc99A-ilvC se muestran en la tabla 4. Se prepararon dos muestras de extracto celular para la construcción pBAD

K12-ilvC, una por sonicación y la otra utilizando BugBuster. La muestra de extracto celular para la construcción

5 pTrc99A-ilvC se preparó utilizando BugBuster. Estos análisis demuestran que la proteína KARI se expresa a un nivel

mayor en las células que contenían los plásmidos pBAD-K12-ilvC que en las que contenían pTrc99A-ilvC, aunque

las actividades específicas de la enzima en las muestras de extractos celulares preparadas mediante dos métodos

diferentes no fueron significativamente diferentes. La cepa Bw25113 de E. coli transformada con pBAD-HisB

(Invitrogen) se empleó como control negativo. La velocidad de consumo de NADPH en el control negativo fue 10 extremedamente baja (aproximadamente 1% al 2% de la velocidad de consumo medida en las células que contienen

el gen pBAD-K12-ilvC).

Tabla 4

Concentración de proteínas totales y KARI en clones que contienen el gen ilvC

Clones

Proteína total (!g/ml) Actividad KARI umol/min/mg de proteína total

BW25113(LilvC)-ptrc99A-ilvC-Bugbuster

8007 0,16

BW25113(LilvC)-pBAD-K12-ilvC-sonicación

9707 0,83

BW25113(LilvC)-pBAD-K12-ilvC-BuqBuster

4595 0,78

Ejemplo 2

Identificación de KARI con alta actividad enzimática específica a partir de diversos microorganismos

15 El objetivo de este ejemplo es describir el modo de identificar microorganismos que contienen enzimas KARI con alta actividad específica.

Se estableció la hipótesis de que los organismos que contienen KARI con un tiempo de duplicación más rápido que

E. coli, durante el crecimiento en un medio mínimo, contendrían enzimas KARI muy activas. Se identificaron tres microorganismos, Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Pseudomonas fluorescens (PF5), y Vibrio cholerae (N16961),

20 con unos tiempos de duplicación más rápidos que E. coli cuando se cultivan en medio mínimo M9 (véase a continuación). Las preparaciones de ADN genómico de estos organismos están disponibles en el mercado. La tabla 5 muestra los tiempos de duplicación de estos organismos comparado con E. coli tras el crecimiento en medio M9 mínimo.

Tabla 5

Tiempo de duplicación de las cepas ensayadas durante el crecimiento en medio M9

Organismo

Tiempo de duplicación en medio M9 Referencia bibliográfica

E. coli

55-60 min 1

V. cholerae (N16961)

45 min 3

P. aeruginosa (PAO1)

42 min 2

P. fluorescens (PF5)

38 min 2

25 Referencias bibliográficas

1.

Neidhardt, F. C., et ál., J. Bacteriol., 119, 736-747, 1974.

2.

Brinkman, F. S. L., et ál., J. Bacteriol., 181, 4746-4754, 1999.

3.

Silva, A. J. y Benítez, J. A., J. Bacteriol., 188, 794-800, 2006.

Tal como se indicó anteriormente, las enzimas KARI se han agrupado en diferentes clases. Las enzimas de 30 Pseudomonas PF5 y PAO1 pertenecen al grupo de KARI de clase I, que es el grupo más grande de la familia, mientras que las enzimas de E. coli y V. cholerae pertenecen al grupo de KARI bacteriana de clase II.

Los ADN genómicos purificados de P. aeruginosa (PAO1, ATCC 47085) y P. fluorescens (PF5, ATCC BAA-477) se obtuvieron en ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA). El ADN genómico de cada organismo (10 ug cada uno) se rehidrató en 100 ul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 para su uso en una reacción de PCR. Se emplearon los siguientes pares de cebadores, con un sitio SacI unido a los cebadores directos (SEQ ID NO:23 y 25) y un sitio HindIII unido a los cebadores inversos (SEQ ID NO:24 y 26), para amplificar las regiones codificadoras del gen ilvC a partir de los ADN genómicos de PAO1 y PF5 mediante PCR utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad pfu-ultra (Stratagene). Los cebadores se diseñaron basándose en las secuencias públicas

5 (GeneBank) de los genes ilvC de PF5 y PAO1 para estos organismos.

Cada 50 ul de la reacción de PCR contiene 1,0 ul de ADN genómico y 1,0 ul de cada uno de 10 pmol/ul de cebadores directos e inversos para los respectivos genes.

Las reacciones de PCR se realizaron en un gradiente de cicladores maestros Eppendorfm (Eppendorf North America, Westbury, NY) utilizando las siguientes condiciones de reaccion. La temperatura de inicio fue de 95 ºC

10 durante 2 min. Después se realizaron 5 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consiste en 95 ºC durante 30 seg, 55 ºC durante 30 seg, y 72 ºC durante 1 min y 30 seg. Después se realizaron 25 ciclos más de calentamiento/enfriamiento. Cada uno de estos ciclos consiste en 95 ºC durante 30 seg, 65 ºC durante 30 seg, y 72 ºC durante 1,0 min y 30 seg. Después de finalizar estos ciclos de temperatura, las muestras se mantuvieron a 72 ºC durante 10 min más, y después se mantuvieron a la espera de la recuperación de la muestra a 4 ºC.

15 Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron con HindIII y SacI, se clonaron en el vector de expresión pBAD-SacI, y se transformaron en la cepa con ilvC inactivado BW25113(LilvC) utilizando los procedimientos descritos en el ejemplo 1. Los clones positivos se identificaron mediante digestión con enzimas de restricción y se validaron mediante secuenciación de ADN de longitud completa empleando los cebadores SEQ ID NO:21 (pBAD-eF1), SEQ ID NO:22 (PALPK-R1), SEQ ID NO: 27 (PF5-S-F2), y SEQ ID NO: 28 (PF5-S-R2). Las cepas resultantes se

20 denominaron BW25113(LilvC)-PAO1-ilvC y BW25113(LilvC)-PF5-ilvC.

La región codificadora del gen VC0162 de V. cholerae fue sometida a una optimizaciones de codones para la expresión de E. coli, basándose en la secuencia conocida de la proteína (n.º de registro NP-229819.1) y se preparó mediante síntesis de genes personalizada sintética (DNA 2.0, Inc., Menlo Park, CA). Se preparó con sitios SacI y HindIII unidos a los extremos del gen. Este fragmento de ADN también se clonó en el vector de expresión pBAD

25 SacI utilizando sitios de restricción SacI y HindIII, y se transformó en la cepa con ilvC inactivado BW25113(LilvC). La cepa resultante se denominó BW25113(LilvC)-VCopt-VC0162. La secuencia de VC0162 con codones optimizados se indica en SEQ ID NO:30.

Ensayos de actividad KARI y de proteínas de las cepas K12, PAO1, PF5 y VC

Se prepararón extractos sin células de las cepas BW25113(LilvC)-K12-ilvC, BW25113(LilvC)-PAO1-ilvC,

30 BW25113(LilvC)-PF5-ilvC y BW25113(LilvC)-VCopt-VC0162, que expresan la enzima KARI, utilizando BugBuster según se describe en el ejemplo 1. El ensayo KARI se realizó utilizando 188 ul de tampón de reacción, 2,0 ul de disolución madre de NADPH 20 mM, 5,0 ul de extracto de células al 20% diluido en tampón de ensayo, y 5,0 ul de acetolactato 90 mM. Por tanto, la disolución de ensayo final utilizada en este ejemplo contenía enzima, HEPESpotasio 100 mM, MgCl2 10 mM, NADPH 200 uM y acetolactato 2,25 mM.

35 La tabla 6 muestra las actividades específicas de KARI de cuatro organismos diferentes cultivados durante la noche en presencia de arabinosa al 0,02% (en p/v) como inductor. La cantidad de proteína total en el extracto celular y la actividad KARI se midieron según se describió anteriormente. Tal como se resume en la tabla 6, las enzimas KARI de los organismos identificados con unos tiempos de duplicación más rápidos cuando se cultivan en medio mínimo (tabla 5) tienen una actividad específica mayor que la KARI de E. coli. Cada uno de los extractos tiene unos niveles

40 aproximadamente iguales de expresión de la proteína KARI, según se calcula mediante SDS-PAGE (los datos no se muestran). Estos resultados apoyan la hipótesis de que el tiempo de duplicación durante el crecimiento en medio mínimo puede utilizarse como medio para identificar enzimas KARI con mayor actividad específica.

Tabla 6

Comparación de las actividades específicas de KARI de diferentes organismos

Cepa

PM (KDa) Clase de KARI Proteína total en el extracto celular, ug/ml Actividad específica de KARI, umol/min/mg de proteína total

BW25113(LilvC)-K12-ilvC

54 II 6693 0,72

BW25113(LilvC)-VCopt-VC0162

54 II 6730 1,1

BW25113(Li/vC)-PAO1-ilvC

36 I 4988 1,2

BW25113(LilvC)-PF5-ilvC

36 I 7671 1,8

Ejemplo 3 Análisis de la actividad específica de K12-KARI y PF5-KARI purificadas

Para resolver mejor los aumentos en la actividad específica de KARI observados con los extractos de células brutos en el ejemplo 2, K12-KARI y PF5-KARI se purificaron hasta la homogeneidad para permitir la cuantificación precisa de la concentración de las proteínas individuales y determinar la actividad específica de las enzimas KARI purificadas.

Purificación de K12-KARI y PF5-KARI

Se purificaron K12-KARI y PF5-KARI utilizando una columna Spin de intercambio aniónico débil Vivapure IEX D, miniH (Vivascience AG, Hannover, Alemania), seguido de una concentración en un dispositivo Microcon con un límite de exclusión molecular de 100 KDa (YM100, Millipore, Bedford, MA). El procedimiento de purificación se realizó a temperatura ambiente (22,5 ºC).

Las disoluciones madre utilizadas en la columna Spin de intercambio aniónico fueron: HEPES-potasio 100 mM a pH 7,0, MgCl2 1,0 mM, EDTA 250 mM, Brij35 al 10% y KCl 2 M. El tampón de lavado (tampón A) se preparó añadiendo 5,0 ml de disolución madre de HEPES 100 mM a 15 ml de agua con la adición de 50 ul de disolución madre de MgCl2, 20 ul de disolución madre de EDTA y 10 ul de Brij35 al 10%. El tampón de elución n.º 1 (tampón B) se preparó añadiendo 5,0 ml de HEPES 100 mM, 2,0 ml de disolución madre de KCl a 13 ml de agua con la adición de 50 ul de disolución madre de MgCl2, 20 ul de disolución madre de EDTA y 10 ul de Brij35 al 10%. El tampón de elución n.º 2 (tampón C) se preparó añadiendo 5 ml de disolución madre de HEPES 100 mM, 5,0 ml de disolución madre de KCl a 10 ml de agua con la adición de 50 ul de disolución madre de MgCl2, 20 ul de disolución madre de EDTA y 10 ul de Brij35 al 10%. La concentración final de KCl en el tampón B es de aproximadamente 200 mM y de aproximadamente 500 mM en el tampón C.

Se preparon extractos sin células de las cepas BW25113(LilvC)-K12-ilvC y BW25113(LilvC)-PF5-ilvC utilizando BugBuster según se describe en el ejemplo 1. Para preparar el extracto celular diluido para cargarlo en las columnas Vivapure IEX D, se añadieron 600 ul agua doblemente ionizada a 200 ul del extracto.

Las columnas Vivapure IEX D primero se lavaron con 400 ul de tampón A mediante centrifugación (microcentrifuga Eppendorf, modelo 5415D) a 2000 x g durante 5 min. Se empleó un equipo y un proceso idénticos en el procedimiento de purificación de Vivapure IEX D completo. El extracto celular diluido (descrito anteriormente) se cargó sobre la columna y se centrifugó en dos lotes de 400 ul cada uno. La columna entonces se lavó (x2) con 400 ul de tampón A. Para la muestra de PF5-KARI, se cargaron 400 ul del tampón B para eluir la enzima de la columna hacia un tubo de recolección. Para la muestra de K12-KARI, se emplearon, en su lugar, 400 ul del tampón C.

Los dispositivos Microcon YM100 primero se lavaron con 400 ul de agua desionizada mediante centrifugación (microcentrifuga Eppendorf, modelo 5415D) a 13800 x g durante 5 min. La muestra recogida de la purificación de Vivapure IEX D después se cargó y se centrifugó a 13800 x g durante 4 min. Se rechazó la corriente y se añadieron 400 ul del tampón B a la cámara de muestras y se centrifugó a 13800 x g durante 4 min. El procedimiento de lavado se repitió (x2) antes de añadir 200 ul del tampón B a la cámara de muestras. La cámara de muestras se invirtió hacia un tubo de recolección limpio y se centrifugó a 5000 x g durante 2 min para recoger la muestra purificada.

La pureza de cada muestra de KARI purificada se validó mediante electroforesis capilar (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technology, Santa Clara, CA). Las muestras se prepararon utilizando el kit de reactivo Protein 230 y se aplicaron a un Protein Labchip (suministrado con los kits de reactivo) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se analizó con el Bioanalyzer. Se observó un único pico con poco fondo en el electrograma para cada muestra purificada.

Cuantificación de proteínas de las muestras KARI purificadas

Se realizó la medición de la absorción de UV de las muestras KARI purificada a 280 nm utilizando un espectrofotómetro (Agilent Technology, Santa Clara, CA) y cubetas de plástico desechables de 1 cm de longitud de paso (UVette, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) para cuantificar la cantidad de KARI en las muestras purificadas. Los coeficientes de extinción a 280 nm para PF5-KARI (0,73 para 1 mg/ml) y K12-KARI (0,98 para 1 mg/ml) fueron predichos por el programa Protparam, disponible en el sitio web ExPAsy (Pace, C. N., et ál., Protein Sci., 11, 24112423, 1995). La muestra purificada fue diluida hasta 20% (en v/v) en tampón B para la medición de la absorción de UV. La A280 para la muestra de PF5-KARI diluida fue de 0,41 y para la K12-KARI diluida fue de 0,36.

Ensayo de actividad para KARI purificada

Las condiciones de ensayo utilizadas en este ejemplo fueron las mismas que en el ejemplo 2, excepto que se emplearon 5 ul de muestra purificada al 20% (en v/v) en lugar de extracto celular. Las concentraciones de proteína de las muestras purificadas y sus actividades específicas se muestran en la tabla 7. La actividad específica de PF5-KARI purificada, de aquel que crece con más rapidez de los ensayados, fue dos veces la actividad específica de K12-KARI. Estos resultados son coherentes con los datos obtenidos utilizando las preparaciones brutas de estas dos enzimas en el ejemplo 2, por lo que esto proporciona aún más apoyo a la hipótesis de que el tiempo de duplicación durante el crecimiento en medio mínimo puede utilizarse como medio para identificar enzimas KARI con

mayor actividad específica comparada con la enzima de E. coli. Tabla 7

Concentración y actividad específica de KARI en cepas de E.coli y Pseudomonas

Muestra

Concentración de KARI (mg/ml) Actividad específica, umol/min/mg de KARI

K12-KARI

1,85 1,1

P5F-KARI

2,80 2,2

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>

E. I du Pont de Nemours and Co.

<120>

Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas

<130>

CL3761

5

<160> 40

<170>

Patent In version 3. 5

10

<210> <211> <212> <213> 1 1680 ADN K. pneumoniae

<400>

1

<210> <211> <212> <213>

2 559 PRT K. pneumoni ae

5

<400> 2

5

<210> <211> <212> <213> 3 1476 ADN E. coli

<400>

3

<210> <211> <212> <213>

4 491 PRT E. col i

5

<400> 4

<210>

5

<211>

1851

<212>

ADN

31

<400> 5

5

<210> <211> <212> <213> 6 616 PRT E. coli

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 1662 ADN Lactococcus lactis

<400>

7

5

<210> <211> <212> <213> 8 548 PRT Lact ococcus lactis

<400>

8

5

<210> <211> <212> <213> 9 1164 ADN E. coli

<400>

9

<210> <211> <212> <213>

10 387 PRT E. coli

5

<400> 10

5

<210> <211> <212> <213> 11 44 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 11 gagct cct t a agaaggaggt aat caccat g gctaactact tcaa

44

10

<210> <211> <212> <213> 12 51 ADN secuencia artificial

15

<220> <223> cebador

<400> 12 ggatccgat c gagct agcgc ggccgct t aa cccgcaacag caatacgtttc

51

20

<210> <211> <212> <213> 13 35 ADN secuecia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 13 gct aacagga ggaagagct c at ggcaccct cgctc 35

<210> 14

<211> 35

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 14 gagcgagggt gccat gagct cttcctcctgttagc 35

<210> 15

<211> 44

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 15 at caccgagc t cat ggct aa ctacttcaat acactgaat c tgcg 44

<210> 16

<211> 46

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 16 ggccgcaagc ttttaacccg caacagcaat acgtttcatatctgtc 46

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 17 ccgt aaagat at caccgt ag 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 18 cagtatgaag gcaaaatcgg 20

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 19 cgt act cagc ggt at cagag

20

<210> <211> <212> <213>

20 20 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 20 cagatttcac ttccgcaacg

20

<210> <211> <212> <213>

21 29 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 21 cgcaact ct tactgtttct ccatacccg

29

<210> <211> <212> <213>

22 25 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 22 accgct t ct g cgt tctgatt t aat c

25

<210> <211> <212> <213>

23 44 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 23 caaaacagcc aagcttttag t t ct t gct ct tgtcgacgat cttg

44

<210> <211> <212> <213>

24 43 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 24 caggaggaag agct cat gcg cgttttctac gat aaagact gtg

43

<210> <211> <212> <213>

25 44 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 25 caaaacagcc aagcttttag ttcttggctt tgtcgacgat tttg

44

<210> <211> <212> <213>

26 45 ADN secuencia artificial

5

<220> <223> cebador

<400> 26 caggaggaag agct cat gaa agt t t t ct ac gat aaagact gcgac

45

10

<210> <211> <212> <213> 27 20 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

15

<400> 27 gat cat gat gcgccgaagg 20

20

<210> <211> <212> <213> 28 20 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador

<400> 28 ct gct caccg aacaggt cgg

20

25

<210> <211> <212> <213> 29 1476 ADN secuencia genoma c

<400>

29

5

<210> <211> <212> <213> 30 1485 ADN vibrio

<400>

30

5

<210> <211> <212> <213> 31 1014 ADN Pseudomonas

<400>

31

<210>

32

<211>

1014

10

<212> ADN

<213>

Pseudomonas fluorescens

<400> 32

5

<210> <211> <212> <213> 33 491 PRT E. coli

<400>

33

5

<210> <211> <212> <213> 34 494 PRT Vi br i on

<400>

34

5

<210> <211> <212> <213> 35 338 PRT Pseudomonas

<400>

35

5

<210> <211> <212> <213> 36 338 PRT Pseudomonas

<400>

36

<210>

37

<211>

63

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador directo PAL-F1

<400>

37

<210> <211> <212> <213>

38 40 ADN secuencia artificial

<220> <223> <400>

cebador inverso PAL-R1 38

t ct ct cat cc gccaaaacag aagct t ct aa gcgagcat ct

40

<210> <211> <212> <213>

39 43 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador PAL-EcoRI -F1

<400> 39 gggct aacag gaggaagaat t cat ggcacc ct cgct cgac t cg

43

<210> <211> <212> <213>

40 42 ADN secuencia artificial

<220> <223>

cebador inverso PAL-EcoRI -R1

<400> 40 cgagt cgagc gagggt gcca tgaattcttc ctcctgtagc cc

42

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un método para la conversión de acetolactato a dihidroxiisovalerato, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende una construcción genética que codifica un polipéptido que tienen una actividad específica de cetol-ácido reductoisomerasa mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli, en el que dicho polipéptido tiene una actividad específica de cetol-ácido

   reductoisomerasa mayor que 1,1 !moles/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo de consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: i) pH de aproximadamente 7,5; ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM; y b) poner en contacto la célula hospedante de a) con acetolactato, en el que se produce 2,3-dihidroxiisovalerato. 2.-Un método para la producción de isobutanol, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende las siguientes construcciones genéticas: 1) al menos una construcción genética que codifica una enzima acetolactato sintasa para la conversión del piruvato

   a acetolactato; 2) al menos una construcción genética que codifica una enzima cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una

   actividad específica mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: i) pH de aproximadamente 7,5; ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM, para la conversión de (S)-acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato; 3) al menos una construcción genética que codifica una acetohidroxiácido deshidratasa para la conversión de 2,3

   dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato;

   4) al menos una construcción genética que codifica una cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa para la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído; 5) al menos una construcción genética que codifica una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa para la

   conversión de isobutiraldehído a isobutanol; y b) cultivar la célula hospedante de a) bajo condiciones en las que se produce isobutanol. 3.-El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que al menos una construcción genética que

   codifica un polipéptido que tiene actividad cetol-ácido reductoisomerasa se aisla de Pseudomonas. 4.-El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido que tiene actividad cetol-ácido

   reductoisomerasa se aisla de Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Pseudomonas fluorescens (PF5), o Vibrio cholerae (N16961). 5.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la célula hospedante es un miembro de un

   género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Vibrio y Saccharomyces.
2. 6.-El método según la reivindicación 5, en el que la célula hospedante es Escherichia coli, Lactobacillus plantarum,

   o Saccharomyces cerevisiae.
3. 7.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:2.
4. 8.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el polipéptido que tiene actividad cetolácido reductoisomerasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36.
5. 9.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que la actividad cetohidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:6.
6. 10.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que la alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:10.
7. 11.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en el que la a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:8.
8. 12.-Una célula hospedante recombinante que comprende una construcción genética que codifica una enzima cetolácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli, en la que la enzima cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli tiene una actividad específica mayor que 1,1 !moles/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo de consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

   a) pH de aproximadamente 7,5;

   b) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y

   c) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.
9. 13.-Un método para la identificación y el aislamiento de una construcción genética, que codifica una enzima cetolácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

   i) pH de aproximadamente 7,5;

   ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y

   iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM;

   que comprende las etapas de:

   a) identificar especies bacterianas que tengan un tiempo de duplicación más corto que E. coli cuando se cultivam en medio mínimo M9;

   b) seleccionar las especies bacterianas de (a) para la actividad cetol-ácido reductoisomerasa para identificar las especies bacterianas activas;

   c) sondar el ADN genómico de las especies bacterianas activas de b) con secuencias de ácidos nucleicos que tengan homología con construcciones genéticas conocidas por codificar una cetol-ácido reductoisomerasa, para identificar y aislar las construcciones genéticas que codifican una cetol-ácido reductoisomerasa a partir de dichas especies bacterianas activas; y

   d) amplificar y expresar las construcciones genéticas que codifican una cetol-ácido reductoisomerasa a partir de dichas especies bacterianas activas; y

   e) seleccionar las construcciones genéticas expresadas de la etapa d) para detectar las que tengan una actividad específica mayor que 1,1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

   i) pH de aproximadamente 7,5;

   ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y

   iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.
10. 14.-El método de la reivindicación 13, en el que dicha especie bacteriana activa se selecciona del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, y Brevibacterium.
11. 15.-El método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que el tiempo de duplicación de la etapa a) es igual o menor que 80% del tiempo de duplicacion de E. coli cuando se cultiva en medio mínimo M9.