KR20130027551A - 부탄올 생산을 위한 효모 생산 배양물 - Google Patents

Abstract

효모의 고 세포 밀도 배양물은 배지 중 부탄올에 대한 내성이 더욱 높은 것으로 밝혀졌다. 고 세포 밀도 효모 배양물은 저 세포 밀도를 갖는 배양물보다 더 큰 생존성 및 더욱 높은 글루코스 이용성을 가졌다. 따라서 고 세포 밀도 배양물에서의 효모를 사용한 부탄올의 생산은 부탄올 생산을 향상시키는 데 유익하다.

Description

부탄올 생산을 위한 효모 생산 배양물{YEAST PRODUCTION CULTURE FOR THE PRODUCTION OF BUTANOL}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2010년 6월 17일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/355,733호의 우선권에 대한 이익을 청구한다.

전자 제출된 서열 목록에 대한 언급

전자 제출된 서열 목록[파일명: 20110616_CL4590USNA_SEQLIST.txt; 크기: 244,365 바이트; 및 생성일: 2011년 6월 16일]의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 산업 미생물학 분야 및 부탄올의 생산에 관한 것이다. 구체적으로, 고농도의 부탄올에 대하여 내성을 갖는 효모 유기체의 생산 배양물이 개발되었다.

부탄올은 연료 첨가제, 플라스틱 산업에서의 공급원료 화학물질, 및 식품 및 향미료 산업에서의 식용 등급 추출제로서 유용한 산업용 화학물질이다. 매년 100억 내지 120억 파운드의 부탄올이 석유화학적 수단에 의해 생산되며 이 화학 상품에 대한 요구는 증가할 가능성이 있을 것이다.

부탄올은 화학적 합성을 통하여 또는 발효에 의해 제조될 수 있다. 효모 발효의 부산물로서 아이소부탄올이 생물학적으로 생성된다. 이것은 이 군의 진균류에 의한 아미노산의 불완전한 대사의 결과로서 형성되는 "퓨젤유(fusel oil)"의 성분이다. 아이소부탄올은 L-발린의 이화작용에 의해 특정적으로 생성되며, 그 수율은 전형적으로 매우 낮다. 부가적으로, 1-부탄올 생합성 경로(도날드슨(Donaldson) 등, 미국 특허 공개 제20080182308A1호), 2-부탄올 생합성 경로(도날드슨 등, 미국 특허 공개 제20070259410A1호 및 미국 특허 공개 제20070292927호) 및 아이소부탄올 생합성 경로(마기오-홀(Maggio-Hall) 등, 미국 특허 공개 제20070092957호)를 발현하는 재조합 미생물 생산 숙주가 기재된 바 있다.

일반적으로, 부탄올 생산을 위한 발효에 사용되는 숙주 미생물에 대한 부탄올 독성에 의해 부탄올의 생물학적 생산이 제한된다. 전형적으로 효모는 배지 중 부탄올에 민감하다. 유전 공학적 접근법을 사용하여 유전자 발현을 변경시켜 부탄올에 대한 효모 세포 내성을 증가시켰었다. 생산을 개선시키는 다른 접근법은 발효 공정을 개선하는 것이다. 미국 특허 제4,765,992호에는 알코올 발효 동안 발효의 중단을 야기하는, 효모에게 유독한 물질을 흡착하기 위하여 발효 전에 또는 발효 동안 미생물 세포벽을 첨가하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제4,414,329호에는 단일 세포 단백질을 생성하는 방법에서 적어도 약 60 내지 160 g/리터의 세포를 포함하는 고 미네랄 염 배지를 사용하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제4,284,724호에는 발효 브로쓰의 제거, 여과, 및 효모 세포의 발효기로의 재순환에 의해 6% 내지 약 20% (건조 세포 중량) 밀도의 발효를 성취하는 것이 개시되어 있다.

부탄올 민감성으로 인한 영향이 감소되고 이럼으로써 증가된 부탄올 수율을 허용하는 효모의 부탄올 생산 배양물을 개발할 필요성이 남아있다.

본 발명은 고밀도의 효모 세포의 존재로 인하여 부탄올에 대한 내성이 증가된 부탄올 생산용 배양물을 제공한다.

a) 효모의 대사에 적합한 탄소 기질을 포함하는 배지; b) 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.5 g (g/gdcw/h) 이상인 부탄올 생산 효모 세포의 배양물; 및 c) 배지 중 약 2% (중량/부피) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는, 부탄올의 발효 생산용 생산 배양물이 본 발명에서 제공된다.

다른 실시 형태에서, 본 발명은 a) 효모의 대사에 적합한 탄소 기질을 포함하는 배지; b) 세포 밀도가 리터 당 약 2.4 g의 건조 세포 중량(gdcw/L) 이상인 부탄올 생산 효모 세포의 배양물; 및 c) 배지 중 약 2% (중량/부피) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는, 부탄올의 발효 생산용 생산 배양물을 제공한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 생산 배양물을 제조하는 단계 - 여기서 효모는 아이소부탄올 경로 및 1-부탄올 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 부탄올 생합성 경로를 포함함 - 와; 부탄올이 생산되는 조건 하에 효모를 발효시키는 단계를 포함하는, 부탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

a) 효모의 대사에 적합한 탄소 기질을 포함하는 배지; b) 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.5 g 이상인 부탄올 생산 효모 세포의 배양물; 및 c) 배지 중 약 2% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는, 부탄올의 발효 생산용 생산 배양물이 본 발명에서 제공된다.

실시 형태들에서, 세포 밀도는 리터 당 적어도 약 2.4 g의 건조 세포 중량이다. 실시 형태들에서, 세포 밀도는 리터 당 적어도 약 7 g의 건조 세포 중량이다. 실시 형태들에서, 부탄올 생산 효모 세포의 글루코스 이용률은 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 1 g 이상이다.

실시 형태들에서, 부탄올 생산 효모 세포는 a) 돌연변이 유발; 및 b) 3% 아이소부탄올에의 노출; 및 C) 반복된 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법에 의해 생성되었다. 실시 형태들에서, 냉동-해동 사이클은 2회보다 많이 반복된다. 실시 형태들에서, 세포는 적어도 5회의 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법에 의해 생성된다.

실시 형태들에서, 부탄올 생산 효모 세포는 a) 에탄올을 함유하는 배지에서의 부탄올 생산 효모 세포의 성장; b) 상기 세포의 30 gdcw/L의 범위의 밀도로의 농축; c) 3% 아이소부탄올에의 노출; 및 d) 반복된 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법에 의해 생성되었다. 실시 형태들에서, 냉동-해동 사이클은 2회보다 많이 반복된다. 실시 형태들에서, 세포는 적어도 5회의 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법에 의해 생성된다.

실시 형태들에서, 부탄올 생산 효모 세포는 a) 에탄올을 함유하는 배지에서의 부탄올 생산 효모 세포의 성장; b) 최소 10시간, 그리고 최대 72시간 동안 성장을 위하여 0.1% 내지 2.0%의 부탄올을 함유하는 배지로 연속적으로 옮김; c) 부탄올 생산 세포의 성장 속도 증가를 위하여 후속적인 계대에서 배지 중 부탄올 농도를 점진적으로 증가시킴; 및 d) 성장 속도가 빠른 세포를 풀링함; e) 3% 아이소부탄올에의 노출; 및/또는 반복된 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법에 의해 생성되었다.

실시 형태들에서, 효모는 크랩트리(crabtree) 양성이며, 실시 형태들에서, 효모는 크랩트리 음성이다. 실시 형태들에서, 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia), 이사첸키아(Issatchenkia) 및 피키아(Pichia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원이다. 실시 형태들에서, 효모는 아이소부탄올 경로 및 1-부탄올 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 부탄올 생합성 경로를 포함한다.

실시 형태들에서, 배양물은 하기 조건에서 약 1시간 내지 약 200시간 동안 유지된다: a) 약 20℃ 내지 37℃인 온도; b) 미호기성 조건들 사이에서 3% 초과로 유지되는 용존 산소량; c) 액화된 바이오매스(biomass)에 의해 제공되는 과량의 탄소 기질; d) 약 3 내지 7.5인 pH; 및 d) 진공 인가 및 액체-액체 추출로부터 선택되는 부탄올 제거.

실시 형태들에서, 배양물의 글루코스 이용률은 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.5 g 이상이다. 실시 형태들에서, 세포 밀도는 리터 당 적어도 약 7 g의 건조 세포 중량이다. 실시 형태들에서, 부탄올 농도는 약 2.5% 이상이며, 배양물의 글루코스 이용률은 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.4 g 이상이다. 실시 형태들에서, 효모는 아이소부탄올 경로, 1-부탄올 경로 및 2-부탄올 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 부탄올 생합성 경로를 포함한다.

실시 형태들에서, 배양물은 PNY0602 또는 PNY0614를 포함한다. 실시 형태들에서, 배양물은 부탄올 생합성 경로를 추가로 포함하는 PNY0602 또는 PNY0614를 포함한다. 실시 형태들에서, 부탄올 생합성 경로는 아이소부탄올 생합성 경로이다.

도면의 간단한 설명 및 서열 설명

본 발명의 다양한 실시 형태는 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 첨부된 서열 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있으며, 이들은 본 출원의 일부를 형성한다.

<도 1>

도 1은 4가지의 상이한 2-부탄올 생합성 경로를 나타낸다.

<도 2>

도 2는 3가지의 상이한 아이소부탄올 생합성 경로를 나타낸다.

<도 3>

도 3은 1-부탄올 생합성 경로를 나타낸다.

<도 4>

도 4는 아이소부탄올의 존재 하에 고 세포 밀도 효모 배양물에서의 글루코스 이용률의 그래프를 나타낸다.

하기의 생물 기탁은 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 인식에 대한 부다페스트 조약(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure) 하에 이루어졌다:

본 출원과 함께 제공되고 본 명세서에 참고로 포함된 하기 서열 및 서열 목록은 37 C.F.R. 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허 출원에 관한 요건 - 서열 규정"(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules))을 따르며 세계 지적 재산권 기구(World Intellectual Property Organization; WIPO) 표준 ST.25 (2009), 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요건 (규정 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행 세칙의 섹션 208 및 부칙 C)에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 준수한다.

본 발명은 본 출원의 일부를 형성하는 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충될 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 좌우할 것이다. 문맥에 의해 다르게 요구되지 않으면, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이며, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 다른 참고 문헌은, 특허 또는 특허 공개의 단지 특정한 섹션이 참고로 포함되는 것으로 나타내어지지 않으면, 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타내어지는 것처럼 모든 목적을 위하여 전체적으로 참고로 포함된다.

본 발명은 배양 배지에 존재하는 부탄올에 대한 감소된 민감성으로 인하여 부탄올을 생산하는 발효가 개선된 효모 생산 배양물에 관한 것이다. 부탄올은 아이소부탄올 및 1-부탄올을 포함한다. 게다가, 본 발명은 본 배양물을 이용하여 부탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 부탄올은 화석 연료 대체에 유용하며, 이외에도 용매 및/또는 추출제로서의 응용에 유용하다.

하기 정의 및 약어가 특허청구범위 및 명세서의 해석에 사용되어야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "포함하고 있다", "포함하고 있는", "갖다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는", 또는 임의의 다른 그 변이형은 비배타적인 포함을 커버하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 제한되지는 않고, 명확하게 열거되지 않거나 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치에 내재적인 다른 요소를 포함할 수도 있다. 더욱이, 달리 표현되어 언급되지 않는 한, "또는"은 포함적인 의미이고 제한적인 의미가 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A는 참 (또는 존재함)이고 B는 거짓 (또는 존재하지 않음), A는 거짓 (또는 존재하지 않음)이고 B는 참 (또는 존재함), A 및 B가 모두가 참 (또는 존재함).

또한, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사 ("a" 및 "an")는 요소 또는 성분의 경우 (즉, 발생)의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정관사("a" 또는 "an")는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 당해 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백하게 단수임을 의미하는 것이 아니라면 복수형을 또한 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적인 용어이며, 특정 발명의 임의의 단일 실시 형태를 언급하는 것으로 의도되지 않고, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 특허청구범위에 기재된 바와 같은 모든 가능한 실시 형태를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이용되는 발명의 성분 또는 반응물의 양을 수식하는 용어 "약"은, 예를 들어, 현실에서 농축물 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 통상적인 측정 및 액체 취급 절차; 이들 절차에서의 우발적인 오차; 조성물을 제조하거나 방법을 실시하기 위해 이용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이 등을 통해 발생할 수 있는 수치적 양의 변이를 말한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물에서 생긴 조성물에 있어서 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"으로 수식되든지 수식되지 않든지 간에, 특허청구범위는 당해 양에 상당하는 양을 포함한다. 일 실시 형태에서, 용어 "약"은 보고된 수치값의 10% 이내, 바람직하게는 보고된 수치값의 5% 이내를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "부탄올"은 1-부탄올, 아이소부탄올 또는 그 혼합물을 말한다.

용어 "아이소부탄올 생합성 경로" 또는 "아이소부탄올 경로"는 피루베이트로부터 아이소부탄올을 생성하는 효소 경로를 말한다.

용어 "1-부탄올 생합성 경로" 또는 "1-부탄올 경로"는 피루베이트로부터 1-부탄올을 생성하는 효소 경로를 말한다.

용어 "저 세포 밀도"는 약 6 × 10⁵개의 세포/ml 미만의 세포 농도를 말한다. 예를 들어, OD₆₀₀이 0.05인 배양물은 1.0의 OD₆₀₀이 10⁷개의 세포/ml에 상응하는 관계를 바탕으로 하면, 저 세포 밀도 배양물이다.

용어 "고 세포 밀도"는 약 5 × 10⁷개의 세포/ml 초과의 세포 농도를 말한다. 예를 들어, OD₆₀₀이 5.0이며 리터 당 약 2.4 g의 건조 세포 중량(gdcw/L)을 갖는 배양물은 1.0의 OD₆₀₀이 10⁷개의 세포/ml 및 0.4 gdcw/L에 상응하는 관계를 바탕으로 하면, 고 세포 밀도 배양물이다.

용어 "글루코스 이용률" 및 "글루코스 소비율"은 세포 배양물이 과도한 글루코스의 조건 하에서 대사하는 글루코스의 양을 말한다. 글루코스 이용률은 탄소 기질로서 글루코스를 이용하여 본 명세서에서 실시예 3에 기재된 바와 같이 배양 조건에서 부탄올의 규정된 농도에서 규정된 세포 밀도의 배양물에서 측정된다. 대안적인 탄소 기질이 생산에 사용되는 배지에 존재할 때, 글루코스 이용률은 그 배양물에서 측정될 수 없으며, 탄소 기질로서 글루코스를 포함하는 별도의 배양물에서 측정되어야 한다.

용어 "탄소 기질" 또는 "발효성 탄소 기질" 또는 "적합한 탄소 기질"은 본 발명의 배양물에 의해 대사될 수 있는 탄소 공급원을 말하며, 특히 단당류, 올리고당류, 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소 공급원을 포함한다.

용어 "발효 생산"은 미생물의 대사 활성에 의한, 예를 들어 이 경우 본 발명의 배양물에 의한 탄소 공급원의 생성물로의 전환을 말한다.

용어 "생존가능한"은 본 발명에서 제공된 성장 조건 하에 또는 약 2% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 함유하는 성장 배지에서 번식하거나 또는 배양될 수 있는 세포(예를 들어, 효모 세포)의 배양물을 말한다. 일부 실시 형태에서, 생존가능한 배양물은 그러한 조건 하에 24시간 동안 번식하거나 또는 배양될 수 있다.

용어 "코돈-최적화된"은 이것이 다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 코딩 영역 또는 유전자를 언급할 때, DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 이용을 반영하도록 핵산 분자의 코딩 영역 또는 유전자 내의 코돈을 변경함을 말한다. 이러한 최적화는 적어도 하나 또는 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 그 유기체의 유전자에서 더욱 자주 사용되는 하나 이상의 코돈으로 대체하는 것을 포함한다.

고 세포 밀도 배양물에서의 향상된 부탄올 내성

효모 세포가 고 세포 밀도 배양물 중에 있을 때, 상기 세포는 저 세포 밀도 배양물 중 효모 세포와 비교하여 부탄올에 대하여 증가된 내성을 나타낸다는 발견이 본 명세서에 개시된다. 본 발명의 목적을 위한 고 세포 밀도 배양물은 세포 밀도가 리터 당 약 2.4 g의 건조 세포 중량(gdcw/L) 이상인 배양물을 말한다. 약 2.4 gdcw/L보다 큰 세포 밀도를 갖는 임의의 배양물, 예를 들어 적어도 약 3.8 gdcw/L 또는 그보다 큰 것 - 24 gdcw/L 또는 그보다 큰 것을 포함함 - 이 고 세포 밀도 배양물이다. 고 세포 밀도는 약 3 gdcw/L 초과, 약 5 gdcw/L 초과, 약 7 gdcw/L 초과, 약 10 gdcw/L 초과, 약 20 gdcw/L 초과, 또는 약 30 gdcw/L 초과일 수 있다. 약 35-40 gdcw/L만큼 높은 세포 밀도가 유용할 수도 있다고 예상된다. 효모에 있어서, 고 세포 밀도는 또한 약 5 × 10⁷개의 세포/ml 초과의 세포 농도 또는 약 5 이상의 측정된 OD₆₀₀으로 특성화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 밀도는 본 명세서에 기재된 임의의 범위의 세포 밀도, 예를 들어 약 2.4 gdcw/L 내지 약 40 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 35 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 30 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 20 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 10 gdcw/L, 약 2.4 gcdw/L 내지 약 7 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 5 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 40 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 35 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 30 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 20 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 10 gdcw/L, 약 3 gcdw/L 내지 약 7 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 5 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 40 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 35 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 30 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 20 gdcw/L, 또는 약 7 gdcw/L 내지 약 10 gdcw/L일 수 있다. 비교를 위하여, 저 세포 밀도 배양물은 약 6 × 10⁵개의 세포/ml 미만이다.

부탄올에 대한 효모의 증가된 내성은 생존성 및/또는 글루코스의 이용성으로 본 발명에서 평가하였으며, 이는 저 세포 밀도의 효모 세포의 배양물에서의 것에 대하여 고 세포 밀도 배양물에서 개선된 것으로 밝혀졌다. 생존성은 살아있는 세포의 척도인 콜로니 형성 단위(colony forming unit; CFU)의 수를 평가함으로써 측정하였다. 1% 부탄올의 존재 하에 고 세포 밀도를 갖는 효모 배양물의 생존율은 본 명세서에서 분석된 조건 하에 부탄올을 포함하지 않는 대조 배양물의 생존율과 비교하여 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 그리고 최대 100%인 것으로 밝혀졌다. 생존율은 다양하며, 부탄올의 농도, 특정 부탄올 이성체 및 효모 주(strain)를 포함하는 다수의 요인에 의존적이다. 이와는 대조적으로, 세포가 100배 더 적은 저 세포 밀도 배양물의 생존율은 부탄올을 포함하지 않는 대조 배양물의 생존율과 비교하여 1% 부탄올에서 최대 13%의 생존율인 것으로 밝혀졌다.

알코올에 대한 내성에 대한 효모 세포 밀도의 영향은 알코올의 존재에 대하여 일반화되는 하나의 응답은 아닌 것으로 밝혀졌다. 부탄올 내성에 대한 세포 밀도의 영향은 가장 널리 생성되는 알코올인 에탄올의 존재 하에서의 세포 밀도의 영향과는 상이하였다. 실제, 본 명세서에 나타낸 바와 같이 (실시예 1 참조), 역효과가 에탄올에서 관찰되었으며, 이때 저 세포 밀도 배양물은 고 세포 밀도 배양물보다 더 높은 생존율을 나타냈다.

본 발명에서 3.8 gdcw/L 및 24 gdcw/L을 갖는 고 세포 밀도 배양물은 시간 당 gdcw 당 약 1 g 이상의 비율로 1.5% 아이소부탄올에서 글루코스를 이용하는 것으로 밝혀졌다. 1% 아이소부탄올에서, 계산된 비율은 시간 당 gdcw 당 약 1.4 g 이상이었다. 2% 아이소부탄올에서 상기 비율은 시간 당 gdcw 당 약 0.5 g 이상이었으며, 2.5% 아이소부탄올에서 상기 비율은 시간 당 gdcw 당 약 0.4 g 이상이었으며, 3% 아이소부탄올에서 상기 비율은 시간 당 gdcw 당 약 0.2 g 이상이었다.

따라서, 부탄올에 대한 더욱 높은 내성이 성취되도록 약 2.4 gdcw/L 이상의 고 세포 밀도를 갖는 부탄올 생산 배양물이 본 발명에서 제공된다. 고 세포 밀도 배양물은 적어도 약 2.4 gdcw/L, 3.8 gdcw/L, 또는 24 gdcw/L이거나, 또는 그보다 높을 수 있다. 생산 배양물 중 부탄올 농도는 적어도 약 1%이며, 적어도 약 1.5%, 2.0%, 2.5%, 또는 3.0% (w/v)일 수도 있다. 일부 실시 형태에서, 부탄올 농도는 약 2.0% 이상이다. 일부 실시 형태에서, 부탄올 농도는 본 명세서에 개시된 임의의 범위의 부탄올 농도, 예를 들어, 약 1% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 또는 약 2% 내지 약 3% (w/v)이다. 부탄올은 아이소부탄올 또는 1-부탄올일 수 있다. 본 생산 배양물에서, 글루코스 이용률은 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.2 g(g/gdcw/h) 이상이다. 글루코스 이용률은 시간 당 gdcw 당 적어도 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 1, 1.5, 2.4, 또는 3 g과 같이 더욱 높을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 부탄올 농도는 약 2% (w/v) 이상이며, 글루코스 이용률은 시간 당 gdcw 당 적어도 약 0.5, 0.6, 1, 1.5, 2.4, 또는 3 g이다. 일부 실시 형태에서, 글루코스 이용률은 시간 당 gdcw 당 약 0.5 g 이상이다. 일부 실시 형태에서, 글루코스 이용률은 본 명세서에 기재되어 있는 임의의 범위의 글루코스 이용률, 예를 들어 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 3 g/gdcw/h, 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 2.4 g/gdcw/h, 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 1.5 g/gdcw/h, 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 1 g/gdcw/h, 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 0.6 g/gdcw/h, 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 0.5 g/gdcw/h, 약 0.3 g/gdcw/h 내지 약 0.4 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 3 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 2.4 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 1.5 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 1 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 0.6 g/gdcw/h, 약 1 g/gdcw/h 내지 약 3 g/gdcw/h, 약 1 g/gdcw/h 내지 약 2.4 g/gdcw/h, 또는 약 1 g/gdcw/h 내지 약 1.5 g/gdcw/h일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 글루코스 농도는 약 2.0% (w/v) 이상이며, 글루코스 이용률은 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 3 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 2.4 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 1.5 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 1 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 0.6 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 3 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 2.4 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 1.5 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 1 g/gdcw/h, 약 0.5 g/gdcw/h 내지 약 0.6 g/gdcw/h, 약 1 g/gdcw/h 내지 약 3 g/gdcw/h, 약 1 g/gdcw/h 내지 약 2.4 g/gdcw/h, 또는 약 1 g/gdcw/h 내지 약 1.5 g/gdcw/h의 범위이다. 성취되는 글루코스 이용률은 배양 배지 중 부탄올의 농도 및 부탄올의 특정 유형에 의존적일 것이다. 일반적으로, 상기 이용률은 부탄올 농도가 증가하면 감소될 것이다. 일반적으로, 효모 세포는 아이소부탄올 및 1-부탄올에 대하여 유사한 응답성을 가지며, 이때 2-부탄올에 대해서는 덜 민감하다.

전형적으로 글루코스 이용률은 약 30℃ 내지 약 45℃의 온도에서 결정된다. 또한 글루코스 이용률은 약 30℃ 내지 약 37℃의 온도에서 결정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 배양물의 글루코스 이용률은 약 30℃ 내지 약 45℃의 온도에서 시간 당 건조 세포 중량 g 당 약 0.5 g 초과이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 배양물의 글루코스 이용률은 약 30℃ 내지 약 37℃의 온도에서 시간 당 건조 세포 중량 g 당 약 0.5 g 초과이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 배양물의 글루코스 이용률은 약 30℃ 내지 약 32℃의 온도에서 시간 당 건조 세포 중량 g 당 약 0.5 g 초과이다. 일부 실시 형태에서, 글루코스 이용률은 약 6시간 이상 동안 약 2% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는 배지와 접촉시킨 배양물에 대하여 측정된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에서 제공되는 배양물은 약 6시간 이상 동안 약 2% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는 배지와 접촉시킨 배양물의 경우 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 g 당 약 0.5 g 초과이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명에 개시된 배양물은 생존가능한 배양물이다.

고 세포 밀도 생산 배양물의 제조

본 발명의 고 세포 밀도 부탄올 생산 배양물은 약 2.4 gdcw/L 이상의 세포 밀도를 제공하는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 세포 밀도가 예를 들어 2.4 gdcw/L, 2.7 gdcw/L, 2.8 gdcw/L, 3.8 gdcw/L 또는 24 gdcw/L 또는 그보다 더 높은 배양물이 고 세포 밀도 배양물로서 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 밀도는 본 명세서에 기재된 임의의 범위의 세포 밀도, 예를 들어 약 2.4 gdcw/L 내지 약 40 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 35 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 30 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 20 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 10 gdcw/L, 약 2.4 gcdw/L 내지 약 7 gdcw/L, 약 2.4 gdcw/L 내지 약 5 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 40 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 35 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 30 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 20 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 10 gdcw/L, 약 3 gcdw/L 내지 약 7 gdcw/L, 약 3 gdcw/L 내지 약 5 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 40 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 35 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 30 gdcw/L, 약 7 gdcw/L 내지 약 20 gdcw/L, 또는 약 7 gdcw/L 내지 약 10 gdcw/L일 수 있다. 예를 들어, 1가지 방법에서, 부탄올을 생산할 수 있는 효모 세포는 부탄올 생산을 최소화하는 통기 배양에서 성장시킨다. 예를 들어, 크랩트리 양성 효모 세포는 고 통기를 이용하여 그리고 저 글루코스 농도에서 성장시켜서, 부탄올 생산이라기보다는 오히려 당업계에 공지된 바와 같이 세포 매스(mass) 생성 및 호흡을 최대화할 수 있다. 전형적으로, 글루코스 농도는 약 0.2 g/L 미만으로 유지된다. 통기된 배양물은 고 세포 밀도로 성장시킬 수 있으며, 이는 그 후 본 생산 배양물로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 부탄올을 생산할 수 있는 효모 세포는 고 세포 밀도 배양물을 생성하도록 성장시키고 농축시킬 수 있다.

게다가, 부탄올 생합성 경로의 발현은 효모 세포가 고 세포 밀도로 성장하는 동안 이것이 최소의 활성을 갖도록 조절될 수 있다. 상기 경로의 하나 이상의 유전자는 그 발현을 조절하기 위하여 성장 조건 또는 배지 성분에 의해 제어될 수 있는 프로모터로부터 발현될 수 있다. 이러한 배양물에서, 세포는 고 세포 밀도로 성장시켜 생산 배양물로서 사용하거나 또는 고 세포 밀도 생산 배양을 시작하기 위한 시드(seed) 배양물로서 사용할 수 있다.

고 세포 밀도 배양물 생성용 배양물은, 글루코스가 약 2 g/L로 제한될 수 있고 호기성 조건이 호흡 성장 최대화에 대하여 상기에 기재된 바와 같을 수 있다는 것을 제외하고는, 발효 배지 및 배양 조건에 대한 섹션에서 하기에 기재된 조건을 이용하여 배지에서 성장시킨다.

부탄올 생산 효모 세포

본 발명의 고 세포 밀도 생산 배양물은 부탄올을 생산하는 임의의 효모의 배양물일 수 있다. 효모는 크랩트리 양성 또는 크랩트리 음성일 수 있다. 크랩 트리 양성 효모 세포는 크랩트리 효과를 보이며, 상기 효과는 고 농도의 글루코스가 호기성 배양 배지에 첨가될 때 세포 호흡이 저해되는 현상이다. 적합한 효모는 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 한세눌라, 칸디다, 클루이베로마이세스, 야로위아, 이사첸키아 및 피키아를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 주는 사카로마이세스 세레비시애, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 서모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

부탄올을 생산하도록 조작되거나 또는 달리 부탄올을 생산할 수 있는 이들 효모 중 임의의 것이 본 배양물에서 사용될 수 있다. 아이소부탄올, 1-부탄올 또는 2-부탄올의 생성을 위한 생합성 경로는 효모 세포가 부탄올을 생산하도록 효모 세포에서 구성된다. 상기 경로의 유전자는 내인성 유전자 및/또는 이종 유전자를 포함할 수 있다.

재조합 숙주 세포를 위한 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)(이하, "Maniatis")]; 및 문헌[Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)]; 및 문헌[Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다. 다른 분자 툴 및 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 이는 중첩 연장 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의한 스플라이싱 (문헌[Yu, et al. (2004) Fungal Genet. Biol. 41:973-981]), 사카로마이세스 세레비시애의 URA3 유전자좌에서의 돌연변이에 대한 양성 선발 (문헌[Boeke, J.D. et al. (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346]; 문헌[M A Romanos, et al. Nucleic Acids Res. 1991 January 11; 19(1): 187]), cre-lox 부위 특이적 재조합 시스템과, 돌연변이 lox 부위 및 FLP 기질 돌연변이 (문헌[Sauer, B. (1987) Mol Cell Biol 7: 2087-2096]; 문헌[Senecoff, et al. (1988) Journal of Molecular Biology, Volume 201, Issue 2, Pages 405-421]; 문헌[Albert, et al. (1995) The Plant Journal. Volume 7, Issue 4, pages 649-659]), "시임리스(seamless)" 유전자 결실 (문헌[Akada, et al. (2006) Yeast;23(5):399-405]), 및 갭 수복 방법 (문헌[Ma et al., Genetics 58:201-216; 1981])을 포함한다.

효모에서의 유전자 발현 방법은 예를 들어 문헌[Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 발현을 위한 키메라 유전자는 프로모터 및 종결자를 코딩 영역에 작동가능하게 연결함으로써 제작될 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어 구성적(constitutive) 프로모터 FBA1, TDH3, ADH1, 및 GPM1과, 유도성 프로모터 GAL1, GAL10, 및 CUP1을 포함한다. 다른 효모 프로모터는 하이브리드 프로모터 UAS(PGK1)-FBA1p (서열 번호 55), UAS(PGK1)-ENO2p (서열 번호 56), UAS(FBA1)-PDC1p (서열 번호 57), UAS(PGK1)-PDC1p (서열 번호 58), 및 UAS(PGK)-OLE1p (서열 번호 59)를 포함한다. 발현을 위한 키메라 유전자 제작물에서 사용될 수 있는 적합한 전사 종결자는 FBA1t, TDH3t, GPM1t, ERG10t, GAL1t, CYC1t, 및 ADH1t를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

적합한 프로모터, 전사 종결자 및 코딩 영역을 이. 콜라이(E. coli)-효모 셔틀 벡터 내로 클로닝하고, 효모 세포를 형질전환시킬 수 있다. 이들 벡터는 이. 콜라이 및 효모 주 둘 모두에 있어서 번식을 허용한다. 전형적으로, 벡터는 선발가능한 마커 및 원하는 숙주에서 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 함유한다. 효모에서 전형적으로 사용되는 플라스미드는 셔틀 벡터 pRS423, pRS424, pRS425, 및 pRS426 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection))이며, 이는 이. 콜라이 복제 원점(예를 들어, pMB1), 효모 2μ복제 원점 및 영양 선발을 위한 마커를 함유한다. 이들 4 가지 벡터를 위한 선발 마커는 His3(벡터 pRS423), Trp1 (벡터 pRS424), Leu2 (벡터 pRS425) 및 Ura3 (벡터 pRS426)이다. 발현을 위한 키메라 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제작은 이. 콜라이에서의 표준 분자 클로닝 기술에 의하여 또는 효모에서의 갭 수복 재조합 방법에 의하여 수행될 수 있다.

갭 수복 클로닝 접근법은 효모에서의 고도로 효율적인 상동성 재조합을 이용한다. 전형적으로, 효모 벡터 DNA를 (예를 들어, 그의 다중 클로닝 부위에서) 절단하여 그의 서열 내에 "갭"을 생성한다. 순차적으로 서로와 중첩되는 그리고 벡터 DNA의 5' 및 3' 말단과 중첩되는 5' 및 3' 말단 둘 모두에서 a ≥ 21 bp의 서열을 함유하는 다수의 관심있는 삽입 DNA가 생성된다. 예를 들어, "유전자 X'를 위한 효모 발현 벡터를 제작하기 위하여, 발현 카세트를 위한 효모 프로모터 및 효모 종결자를 선택한다. 프로모터 및 종결자는 효모 게놈 DNA로부터 증폭되고, 유전자 X는 그의 공급원 유기체로부터 PCR 증폭되거나 유전자 X 서열을 포함하는 클로닝 벡터로부터 수득된다. 선형화된 벡터의 5' 말단과 프로모터 서열 사이, 프로모터와 유전자 X 사이, 유전자 X와 종결 서열 사이, 및 종결자와 선형화된 벡터의 3' 말단 사이에는 적어도 21 bp의 중첩 서열이 있다. 그 후, "갭 형성된(gapped)" 벡터 및 삽입 DNA로 효모 주를 공동형질전환시키고, 플라스미드 상의 영양 선발 마커의 상보성을 허용하는 적절한 화합물 혼합물을 함유하는 배지 상에 도말한다. 선택된 세포로부터 제조된 플라스미드 DNA를 사용하여 PCR 맵핑에 의해 올바른 인서트 조합의 존재를 확인할 수 있다. 그 다음, 효모로부터 단리된 플라스미드 DNA (통상 농도가 낮음)로 이. 콜라이 주, 예를 들어 TOP10을 형질전환시키고, 이어서 미니 프렙(mini prep) 및 제한효소 맵핑을 하여 플라스미드 제작물을 추가로 입증할 수 있다. 마지막으로, DNA 서열 분석에 의해 제작물을 입증할 수 있다.

갭 수복 기술과 같이, 효모 게놈 내로의 통합은 또한 효모 내에서 상동성 재조합 시스템을 이용한다. 전형적으로, 코딩 영역 플러스 제어 요소(프로모터 및 종결자) 및 영양요구성 마커를 함유하는 카세트는 카세트에 혼성화하는 그리고 삽입이 요망되는 게놈 영역의 5' 및 3' 영역에 40-70개 염기쌍의 서열 상동성을 함유하는 프라이머를 사용하여, 고충실도 DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR-증폭된다. 그 다음, PCR 생성물로 효모를 형질전환시키고, 이를 통합된 영양요구성 마커에 대한 선발을 허용하는 적절한 화합물 혼합물을 함유하는 배지 상에 도말한다. 예를 들어,"유전자 X"를 염색체 위치 Y 내로 통합시키기 위해, 프로모터-코딩 영역X-종결자 제작물은 플라스미드 DNA 제작물로부터 PCR 증폭되고, SOE PCR (문헌[Horton et al. (1989) Gene 77:61-68])에 의해 또는 일반적인 제한효소 절단 및 클로닝에 의해 독립영양 마커(예컨대 URA3)에 연결된다. 프로모터-코딩 영역X-종결자-URA3 영역을 함유하는 전체 카세트는 효모 염색체 상의 위치 "Y"의 5' 및 3' 영역에 상동성인 40-70 bp를 함유하는 프라이머 서열을 사용하여 PCR 증폭된다. PCR 생성물로 효모를 형질전환시키고, 우라실이 결여된 성장 배지에서 이를 선발한다. 형질전환체는 콜로니 PCR에 의해서, 또는 염색체 DNA의 직접적 서열결정에 의해 입증될 수 있다.

부탄올 생성 경로

부탄올 생성에 적합한 경로는 당업계에 공지되어 있으며, 소정의 적합한 경로는 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 부탄올 생성 경로는 숙주 세포에 이종성인 적어도 하나의 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 부탄올 생합성 경로는 숙주 세포에 이종성인 하나 초과의 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 부탄올 생합성 경로는 생합성 경로의 매 단계에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 유전자를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 서열은 숙주 세포에서의 발현에 대하여 최적화된 코돈일 수 있다.

본 명세서에 기재된 기질에서 생성물로의 전환에 사용될 수 있는 유전자 및 폴리펩티드와, 그러한 유전자 및 폴리펩티드의 확인 방법은 본 명세서에 및/또는 당업계에, 예를 들어 아이소부탄올의 경우 미국 특허 제7,851,188호에 개시되어 있다.

본 세포에서 조작될 수 있는 2-부탄올의 생합성 생성 경로는 당업계에, 예를 들어 미국 특허 공개 제20070292927A1호 및 미국 특허 공개 제20070259410A1호에 개시되어 있으며, 상기 미국 특허 공개는 본 명세서에 참고로 포함된다. 개시된 2-부탄올 생합성 경로의 다이아그램은 도 1에 제공되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20070292927A1호의 경로는 하기 전환 단계를 포함한다:

- 예를 들어 아세토락테이트 신타아제에 의해 촉매되는, 피루베이트의 아세토락테이트로의 전환 (도 1의 단계 a);

- 예를 들어 아세토락테이트 데카르복실라아제에 의해 촉매되는, 아세토락테이트의 아세토인으로의 전환 (도 1의 단계 b);

- 예를 들어 부탄다이올 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 아세토인의 2,3-부탄다이올로의 전환 (도 1의 단계 i);

- 예를 들어 다이올 데하이드라타아제 또는 글리세롤 데하이드라타아제에 의해 촉매되는, 2,3-부탄다이올의 2-부타논으로의 전환 (도 1의 단계 j);

- 예를 들어 부탄올 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 2-부타논의 2-부탄올로의 전환 (도 1의 단계 f).

미국 특허 공개 제2009-0305363호에 개시된 바와 같이, 효모 pdc- 숙주 세포에서의 2,3-부탄다이올 중간체의 생성에 있어서, 아세토락테이트 신타아제가 사이토졸에서 발현될 수 있다. 아세토하이드록시산 신타아제로도 칭해질 수 있는 아세토락테이트 신타아제 효소는 EC 2.2.1.6 (2002년에 4.1.3.18로부터 스위칭됨)에 속하며, 잘 알려져 있고, 상기 효소는 다수의 유기체에서 아세토인으로부터의 2,3-부탄다이올의 발효 생성 경로에서뿐만 아니라 단백질 생성 아미노산 류신 및 발린의 생합성 경로에도 참여한다. 당업자라면 다양한 공급원으로부터 단리된, 아세토락테이트 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 본 세포에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 케토부티레이트에 비하여 피루베이트에 대하여 기질 선호성을 갖는 아세토락테이트 신타아제(Als) 효소 활성, 예를 들어 바실루스의 alsS 및 클렙시엘라(Klebsiella)의 budB에 의해 코딩되는 것이 특히 유용하다 (문헌[Gollop et al., J. Bacteriol. 172(6):3444-3449 (1990)]; 문헌[Holtzclaw et al., J. Bacteriol. 121(3):917-922 (1975)]). 바실루스 섭틸리스 유래의 Als (DNA: 서열 번호 3; 단백질: 서열 번호 4), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 유래의 Als (DNA: 서열 번호 1; 단백질: 서열 번호 2), 및 락토코쿠스 락티스 유래의 Als (DNA: 서열 번호 5; 단백질: 서열 번호 6)가 본 명세서에 제공되어 있다.

사용될 수 있는 추가의 Als 코딩 영역 및 코딩된 단백질은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (DNA: 서열 번호 7; 단백질: 서열 번호 8), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) (DNA: 서열 번호 9; 단백질: 서열 번호 10), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (DNA: 서열 번호 11; 단백질: 서열 번호 12), 스트렙토코쿠스 서모필루스 (DNA: 서열 번호 13; 단백질: 서열 번호 14), 비브리오 안구스툼(Vibrio angustum) (DNA: 서열 번호 15; 단백질: 서열 번호 16), 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) (DNA: 서열 번호 17; 단백질: 서열 번호 18) 유래의 것을 포함한다. 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 또는 18의 서열을 갖는 것들 중 임의의 것에 대하여 서열 동일성이 적어도 약 80-85%, 85%-90%, 90%-95%, 또는 적어도 약 96%, 97%, 또는 98%인 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 임의의 Als 유전자가 사용될 수 있다. 동일성은 갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=0.1, 및 고넷(Gonnet) 250 시리즈의 단백질 중량 매트릭스의 디폴트 파라미터를 사용한 클러스탈(Clustal) W 정렬 방법을 바탕으로 한다.

부가적으로, 미국 특허 공개 제20090305363호에는 임의의 것이 사용될 수 있는, 비. 섭틸리스 AlsS 서열의 100가지의 가장 가까운 이웃인 아세토락테이트 신타아제를 도시한 계통수가 제공되어 있다. 본 주에서 사용될 수 있는 추가의 Als 서열이 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 생물정보 데이터베이스에서 그리고 문헌에서 확인될 수 있다. 전형적으로, 생물정보학을 이용한 코딩 및/또는 단백질 서열의 확인은 공지된 Als 코딩 서열 또는 코딩된 아미노산 서열, 예를 들어 본 명세서에 제공된 것을 포함하는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스의 BLAST (상기에 기재됨) 검색을 통한 것이다. 아이덴티티(identity)는 상기에 특정된 바와 같이 클러스탈 W 정렬 방법을 바탕으로 한다. 부가적으로, 상기에 기재된 바와 같이 자연에서 다른 상동체를 확인하기 위하여 본 명세서에 개시된 서열 또는 당업계에서 열거된 것이 사용될 수 있다.

아세토락테이트 신타아제의 사이토졸 발현은 아세토락테이트 신타아제 단백질을 코딩하는 서열을 포함하며 미토콘드리아 표적화 시그널 서열은 포함하지 않는 유전자를 이용한 형질전환에 의해 성취된다. 효모에서의 유전자 발현 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌[Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA] 참조). 키메라 유전자 (프로모터 및 종결자가 작동가능하게 연결된 코딩 영역을 포함함)를 사용한 발현, 벡터, 클로닝 방법, 및 통합 방법은 상기에 기재된 바와 같다.

아세토락테이트의 아세토인으로의 전환은 EC 4.1.1.5로 공지된 아세토락테이트 데카르복실라아제 효소에 의한 것이며, 이는 예를 들어 바실루스 섭틸리스 (DNA: 서열 번호 21; 단백질: 서열 번호 22), 클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena) (DNA: 서열 번호 23, 단백질: 서열 번호 24) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (DNA: 서열 번호 19, 단백질: 서열 번호: 20)로부터 입수가능하다. 아세토락테이트를 아세토인으로 전환시키는, 서열 번호 20, 22, 또는 24의 서열을 갖는 것들 중 임의의 것에 대하여 서열 동일성이 적어도 약 80-85%, 85%-90%, 90%-95%, 또는 적어도 약 96%, 97%, 또는 98%인 아세토락테이트 데카르복실라아제를 코딩하는 임의의 유전자가 사용될 수 있다.

아세토인의 2,3-부탄다이올로의 전환은 아세토인 리덕타아제로도 공지된 부탄다이올 데하이드로게나아제 효소에 의한 것이다. 부탄다이올 데하이드로게나아제 효소는 알코올 생성물에서의 (R)- 또는 (S)-입체화학의 생성에 대하여 특이성을 가질 수 있다. (S)-특이적 부탄다이올 데하이드로게나아제는 EC 1.1.1.76으로 공지되어 있으며, 예를 들어 클렙시엘라 뉴모니애 (DNA: 서열 번호 25; 단백질: 서열 번호 26)로부터 입수가능하다. (R)-특이적 부탄다이올 데하이드로게나아제는 EC 1.1.1.4로 공지되어 있으며, 예를 들어 바실루스 세레우스 (DNA: 서열 번호 27, 단백질: 서열 번호 28), 락토코쿠스 락티스 (DNA: 서열 번호 29, 단백질: 서열 번호 30), 및 사카로마이세스 세레비시애 (BDH1; DNA: 서열 번호 54, 단백질: 서열 번호 55)로부터 입수가능하다. 아세토인을 2,3-부탄다이올로 전환시키는, 서열 번호 26, 28, 30 또는 55의 서열을 갖는 것들 중 임의의 것에 대하여 서열 동일성이 적어도 약 80-85%, 85%-90%, 90%-95%, 또는 적어도 약 98%인 부탄다이올 데하이드로게나아제를 코딩하는 임의의 유전자가 사용될 수 있다.

보조인자 아데노실 코발아민(비타민 B12)을 이용하는, 부탄다이올 데하이드라타아제로도 공지된 다이올 데하이드라타아제는 EC 4.2.1.28로 공지되어 있다. 보조인자 아데노실 코발아민을 또한 이용하는 글리세롤 데하이드라타아제는 EC 4.2.1.30으로 공지되어 있다. 다이올 및 글리세롤 데하이드라타아제는 활성에 필요한 3개의 서브유닛을 갖는다. 사용될 수 있는 추가의 다이올 및 데하이드라타아제 효소를 확인하기 위한 히든 마르코프 모델(Hidden Markov Model)의 사용 및 준비뿐만 아니라 본 세포에서 2-부타논 또는 2-부탄올 경로에서 사용될 수 있는 다수의 다이올 및 글리세롤 데하이드라타아제의 3개의 서브유닛의 서열의 예가 미국 특허 공개 제20070292927A1호에 제공되어 있다.

부탄올 데하이드로게나아제는 알코올 데하이드로게나아제의 광범위한 패밀리의 하위세트이며, NAD⁺- 또는 NADP⁺-의존성일 수 있다. NAD-의존성 효소는 EC 1.1.1.1로 공지되어 있으며, NADP-의존성 효소는 EC 1.1.1.2로 공지되어 있다. 본 세포에서 개시된 2-부탄올 생합성 경로에서 사용될 수 있는 부탄올 데하이드로게나아제의 서열의 예가 미국 특허 공개 제20070292927A1호에 제공되어 있다.

미국 특허 공개 제20070292927A1호에 개시된 생합성 경로를 이용한 2-부탄올 생성을 위한 효모의 유전자 조작 및 키메라 유전자의 제작이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제20090155870 A1호에 개시되어 있다. 유전자 제작 및 발현에 대한 추가의 설명이 상기 및 본 명세서의 실시예에 있다.

로세부리아 이눌리니보란스(Roseburia inulinivorans)로부터의 부탄다이올 데하이드라타아제, RdhtA(단백질: 서열 번호 32, 코딩 영역: 서열 번호 31)의 효모에서의 이 경로의 사용은 본 출원과 공히 소유되고 공계류 중인 미국 특허 공개 제20090155870 A1호에 개시되어 있다. 이 효소는 로세부리아 이눌리니보란스로부터의 부탄다이올 데하이드라타아제 리액티바아제, RdhtB(단백질: 서열 번호 34, 코딩 영역: 서열 번호 33)와 함께 사용된다. 이러한 부탄다이올 데하이드라타아제는 그것이 조효소 B₁₂를 필요로 하지 않기 때문에 많은 숙주에서 요구된다. 사용될 수 있는 다른 B₁₂-의존성 다이올 데하이드라타아제로는 3개의 서브유닛, 즉 pduC, pduD, 및 pduE를 갖는 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 것이 있으며, 이는 국제특허 공개 WO2009046370호에 개시되어 있다.

도 2의 모든 경로에서 2-부타논을 2-부탄올로 전환시키는 마지막 단계에 유용한 것은 미국 특허 공개 제20090269823호에 개시된 아크로모박터 자일로속시단스(Achromobacter xylosoxidans)로 확인되는 박테리아의 환경적 단리체로부터 단리된 부탄올 데하이드로게나아제 (DNA: 서열 번호 35, 단백질: 서열 번호 36)인데, 상기 미국 특허 공개는 본 명세서에 참고로 포함된다.

도 2의 다른 경로들에 있어서의 유전자 및 그 발현은 미국 특허 공개 제20070259410A1호에 개시되어 있다. 본 주에서 개시된 효소 활성을 발현시키기 위하여 사용될 수 있는 추가의 서열이 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 생물정보 데이터베이스에서 그리고 문헌에서 확인될 수 있다. 생물정보학을 이용한 코딩 및/또는 단백질 서열의 확인은 전형적으로 BLAST (BLASTP, BLASTN, BLASTX (문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)])와 같은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 그리고 공지된 코딩 서열 또는 코딩된 아미노산 서열, 예를 들어 본 명세서에 제공된 것을 포함하는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스를 검색하여 행해진다. 아이덴티티는 클러스탈 W 정렬 방법 (문헌[Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)]; 문헌[Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)]에 기재)을 바탕으로 하며, 레이저진 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(LASERGENE bioinformatics computing suite)의 멕얼라인(MegAlign™) v6.1 프로그램 (디엔에이스타 인크.(DNASTAR Inc.))에서 찾아진다. 다중 정렬에 대한 디폴트 파라미터(갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=0.2, 지연 일탈 서열(Delay Divergen Seqs)(%)=30, DNA 전이 중량=0.5, 단백질 중량 매트릭스=고넷 시리즈, DNA 중량 매트릭스=IUB).

부가적으로, 자연에서 다른 상동체를 확인하기 위하여 본 명세서에 개시된 서열 또는 당업계에서 열거된 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 코딩 핵산 단편 각각을 사용하여 상동 단백질을 코딩하는 유전자를 단리할 수 있다. 서열-의존성 프로토콜을 사용한 상동 유전자의 단리는 당업계에 잘 알려져 있다. 서열-의존성 프로토콜의 예에는 1) 핵산 혼성화 방법; 2) 다양한 핵산 증폭 기술 사용에 의해 예시되는 바와 같이 DNA 및 RNA의 증폭 방법 [예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 물리스(Mullis) 등의 미국 특허 제4,683,202호; 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 문헌[Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985)]); 또는 가닥 대체 증폭(strand displacement amplification; SDA) (문헌[Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; 및 3) 라이브러리 제작 및 상보성에 의한 스크리닝 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본 세포에서 조작될 수 있는 아이소부탄올의 생합성 생성 경로는 당업계에 개시되어 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 개시되어 있다. 개시된 아이소부탄올 생합성 경로의 다이아그램이 도 2에 제공되어 있다. 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 개시된 바와 같이, 예시적 아이소부탄올 생합성 경로의 단계들은 하기를 포함한다:

- 예를 들어 아세토락테이트 신타아제에 의해 촉매되는, 피루베이트의 아세토락테이트로의 전환 (도 2의 경로의 단계 a)

- 예를 들어, 케톨-산 리덕토아이소머라아제로도 칭해지는 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타아제에 의해 촉매되는, 아세토락테이트의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환 (도 2의 경로의 단계 b);

- 예를 들어, 다이하이드록시-산 데하이드라타아제로도 칭해지는 아세토하이드록시산 데하이드라타아제에 의해 촉매되는, 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트의 α-케토아이소발레레이트로의 전환 (도 2의 경로의 단계 c);

- 예를 들어, 분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제에 의해 촉매되는, α-케토아이소발레레이트의 아이소부티르알데히드로의 전환 (도 2의 경로의 단계 d);

- 예를 들어, 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 아이소부티르알데히드의 아이소부탄올로의 전환 (도 2의 경로의 단계 e).

2,3-부탄다이올 경로에 있어서 아세토락테이트 신타아제가 상기에 설명되었다.

케톨-산 리덕토아이소머라아제(KARI)로도 칭해지는 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타아제는 전자 공여체로서 NADPH(환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트)를 자연적으로 사용할 수 있다. KARI는 EC 번호 1.1.1.86로 공지된 것을 포함한다. KARI 효소의 서열 및 그의 코딩 영역의 예가 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 제공되어 있으며, 이는 사카로마이세스 세레비시애 유래의 ILV5 (DNA: 서열 번호 37; 단백질: 서열 번호 38)를 포함한다. 케톨-산 리덕토아이소머라아제(KARI) 효소는 미국 특허 공개 제20080261230 A1호, 미국 특허 공개 제20090163376 A1호, 미국 특허 공개 제20100197519 A1호, 및 국제특허 공개 WO/2011/041415호에 기재되어 있으며, 이들 전부는 본 명세서에 참고로 포함된다. 그 안에 개시된 KARI의 예로는 비브리오 콜레래(Vibrio cholerae) 유래의 것 (DNA: 서열 번호 39; 단백질: 서열 번호 40), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1, (DNA: 서열 번호 41; 단백질: 서열 번호 42), 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) PF5 (DNA: 서열 번호 43; 단백질: 서열 번호 44) 및 Pf5.IlvC-Z4B8 돌연변이체 슈도모나스 플루오레센스 아세토하이드록시산 리덕토아이소머라아제 (DNA: 서열 번호 45; 단백질: 서열 번호 46)가 있다. 다른 KARI는 락토코쿠스 락티스의 ilvC 유전자에 의해 코딩된다 (DNA: 서열 번호 58; 단백질: 서열 번호 59). KARI는 또한 언에어로스티페스 카카에(Anaerostipes caccae) KARI 변이체 "K9G9" 및 "K9D3" (각각 서열 번호 62 및 61)을 포함한다.

다이하이드록시산 데하이드라타아제(DHAD)로도 칭해지는 아세토하이드록시산 데하이드라타아제는 EC 번호 4.2.1.9로 공지되어 있다. DHAD 효소의 서열 및 그의 코딩 영역의 예가 미국 특허 제7,851,188호의 다이하이드록시산 데하이드라타아제(DHAD)에 제공되어 있으며, 이는 사카로마이세스 세레비시애의 ILV3 (DNA: 서열 번호 47; 단백질: 서열 번호 48)을 포함한다. 추가의 [2Fe-2S] ²⁺ DHAD 서열, 예를 들어 스트렙토코쿠스 뮤탄스 DHAD (DNA: 서열 번호 49; 단백질: 서열 번호 50) 및 사용될 수 있는 추가의 DHAD 서열을 얻는 데 사용될 수 있는 [2Fe-2S] ²⁺ DHAD 효소를 확인하는 방법이 본 출원과 공계류 중인 미국 특허 공개 제20100081154호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.

분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제 (KivD)는 EC 번호 4.1.1.72로 공지되어 있다. 분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제 효소의 서열 및 그의 코딩 영역의 예가 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 제공되어 있으며, 이는 락토코쿠스 락티스 KivD (DNA: 서열 번호 51; 에스. 세레비시애에서의 발현에 대하여 최적화된 코돈: 서열 번호 53; 단백질: 서열 번호 52)를 포함한다. 추가의 분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제는 에스. 세레비시애에서의 발현에 대하여 최적화된 코딩 서열을 갖는 바실루스 섭틸리스 유래의 것 (DNA: 서열 번호 54; 단백질: 서열 번호 55), 및 상기에 기재된 바와 같이 생물정보학을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 확인되는 다른 것들을 포함한다.

분지쇄 알코올 데하이드로게나아제는 EC 번호 1.1.1.265로 공지되어 있지만, 다른 알코올 데하이드로게나아제(구체적으로는, EC 1.1.1.1 또는 1.1.1.2)로 또한 분류될 수도 있다. 이들 효소는 NADH (환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드) 및/또는 NADPH를 전자 공여체로서 이용하며, 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제 효소의 서열 및 그의 코딩 영역의 예는 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 제공되어 있다.

미국 특허 공개 제20090269823 A1호에는 아크로모박터 자일로속시단스 유래의 알코올 데하이드로게나아제(ADH)인 SadB (DNA: 서열 번호 35, 단백질: 서열 번호 36)가 기재되어 있다. 알코올 데하이드로게나아제는 또한 말 간 ADH (HADH; 에스. 세레비시애에서의 발현에 대하여 최적화된 코돈; DNA: 서열 번호 56; 단백질: 서열 번호 57)및 베이제린키아 인디카(Beijerinkia indica) ADH (단백질: 서열 번호 74)와, 상기에 기재된 바와 같이 생물정보학을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 확인되는 다른 것들을 포함한다.

2개의 추가의 아이소부탄올 경로에 있어서의 효소의 발현에 사용될 수 있는 유전자가 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 기재되어 있다. 모든 3개의 경로에서 사용될 수 있는 추가의 유전자는 상기에 기재된 바와 같이 당업자에 의해 확인될 수 있다.

개시된 생합성 경로를 이용하는 아이소부탄올 생성을 위한 사카로마이세스 세레비시애에 의해 예시되는 효모의 유전자 조작 및 키메라 유전자의 제작이 미국 특허 공개 제20070092957 A1호에 추가로 기재되어 있다. 유전자 제작 및 발현에 대한 추가의 설명이 상기 및 본 명세서의 실시예에 있다.

본 세포에서 조작될 수 있는 1-부탄올의 생합성 생성 경로는 본 출원과 공계류 중인 미국 특허 공개 제20080182308A1호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 개시된 1-부탄올 생합성 경로의 다이아그램은 도 3에 제공되어 있다. 미국 특허 공개 제20080182308A1호에 기재되어 있는 바와 같이, 1-부탄올 생합성 경로는 하기를 포함한다:

- 예를 들어 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제아제에 의해 촉매되는, 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환 (Fig. 3의 경로의 단계 a);

- 예를 들어 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 전환 (도 3의 경로의 단계 b);

- 예를 들어 크로토나아제로 촉매되는, 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환 (도 3의 경로의 단계 c);

- 예를 들어 부티릴-CoA 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환 (도 3의 경로의 단계 d);

- 예를 들어 부티르알데히드 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 부티릴-CoA의 부티르알데히드로의 전환 (도 3의 경로의 단계 e); 및

- 예를 들어 부탄올 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는, 부티르알데하이드의 1-부탄올로의 전환 (도 3의 경로의 단계 f).

이들 효소의 발현에 사용될 수 있는 유전자는 미국 특허 공개 제20080182308A1호에 기재되어 있으며, 사용될 수 있는 추가의 유전자는 상기에 기재된 바와 같이 당업자에 의해 확인될 수 있다. 효모에서의 이들 유전자의 발현 방법은 본 명세서에 상기에 기재되어 있을 뿐만 아니라 미국 특허 공개 제20080182308A1호에도 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 부탄올 생합성 경로는 효모 세포에 대하여 이종성인 적어도 하나의 유전자, 적어도 2개의 유전자, 적어도 3개의 유전자, 적어도 4개의 유전자, 또는 적어도 5개의 유전자를 포함한다. 실시 형태들에서, 재조합 숙주 세포에서의 부탄올 생합성 경로의 각각의 기질의 생성물로의 전환은 이종성 폴리펩티드에 의해 촉매된다. 실시 형태들에서, 부탄올 생합성 경로는 아이소부탄올 생합성 경로이며, 아세토락테이트의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 기질의 생성물로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드 및/또는 아이소부티르알데히드의 아이소부탄올로의 기질의 생성물로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 NADH를 보조인자로서 이용할 수 있다.

본 발명에서 제공되는 아이소부탄올 생합성 경로와 같은 부탄올 생합성 경로를 포함하는 숙주 세포는 하나 이상의 추가의 변형을 추가로 포함할 수 있음이 인식될 것이다. 미국 특허 공개 제20090305363호 (참고로 포함됨)에는 사이토졸-국소화된 아세토락테이트 신타아제의 발현을 위하여 효모를 조작하고 피루베이트 데카르복실라아제 활성을 상당히 제거함에 의한 피루베이트의 아세토락테이트로의 전환 증가가 개시되어 있다. 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나아제 활성을 감소시키기 위한 변형 및/또는 피루베이트 데카르복실라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 파괴 또는 미국 특허 공개 제20090305363호(본 명세서에 참고로 포함)에 기재된 바와 같은 피루베이트 데카르복실라아제 유전자 발현을 제어하는 조절 요소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 파괴, 미국 특허 공개 제20100120105호(본 명세서에 참고로 포함)에 기재된 바와 같은 당량 균형(equivalents balance)을 줄이거나, 엔트너-도우도로프(Entner-Doudoroff) 경로를 통한 증가된 탄소 유동을 제공하는 숙주 세포에 대한 변형. 다른 변형은 피루베이트-이용 생합성 경로에서의 단계를 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 통합을 포함한다. 다른 변형은 아세토락테이트 리덕타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함한다. 실시 형태들에서, 아세토락테이트 리덕타아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 사카로마이세스 세레비시애의 YMR226C (서열 번호 63) 또는 그 상동체이다. 추가의 변형은 알데히드 데하이드로게나아제 및/또는 알데히드 옥시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 폴리뉴클레오티드에서의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함한다. 실시 형태들에서, 알데히드 데하이드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 사카로마이세스 세레비시애 유래의 ALD6 (서열 번호 60) 또는 그 상동체이다. 글루코스 억제를 감소시키는 효과를 갖는 유전자 변형 - 여기서, 효모 생산 숙주 세포는 pdc-임 - 이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제20110124060호에 기재되어 있다.

재조합 숙주 세포는 (a) 다이하이드록시-산 데하이드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드; 및(b) (i) Fe-S 클러스터(cluster) 생합성에 영향을 미치는 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자에서의 적어도 하나의 결실, 돌연변이 및/또는 치환, 및/또는 (ii) Fe-S 클러스터 생합성에 영향을 미치는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 실시 형태들에서, Fe-S 클러스터 생합성에 영향을 미치는 폴리펩티드는 AFT1 (핵산: 서열 번호 64, 아미노산: 서열 번호 65), AFT2 (서열 번호 66 및 67), FRA2 (서열 번호 68 및 69), GRX3 (서열 번호 70 및 71), 또는 CCC1(서열 번호 72 및 73)에 의해 코딩된다. 실시 형태들에서, Fe-S 클러스터 생합성에 영향을 미치는 폴리펩티드는 구성적 돌연변이 AFT1 L99A, AFT1 L102A, AFT1 C291F, 또는 AFT1 C293F이다.

발효 배지

본 발명에서 개시된 고 세포 밀도 생산 배양물은 부탄올 생성을 위한 대사를 지원하는 배양 배지에서 유지된다. 배양 배지는 부탄올 생성을 위한 배양물 생존도를 또한 제공할 수 있다. 전형적으로 본 발명에 사용되는 배지는 약 2 g/L 이상의 글루코스 또는 당량의 탄소 기질을 함유할 수 있다. 탄소 기질은 단당류, 예를 들어 프룩토스, 올리고당류, 예를 들어 락토스, 말토스, 갈락토스 또는 수크로스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로오스 또는 그 혼합물과, 재생가능한 공급원료로부터의 정제되지 않은 혼합물, 예를 들어 유장(cheese whey) 투과물, 옥수수 침지액, 사탕무, 당밀 및 보리 맥아를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 탄소 기질은 에탄올, 락테이트, 석시네이트 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 그러므로, 배지 중 탄소의 공급원은 매우 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있음이 고려된다. 또한 탄소 기질은 옥수수 매시(mash), 사탕수수즙, 당밀, 밀 매시, 또는 내부의 탄소 공급원을 방출하도록 처리 및 당화되거나 또는 액화된 다른 형태의 바이오매스에 의해 제공될 수 있다. 전형적으로 탄소 기질을 과량으로 유지하여 최대의 대사를 허용한다.

적절한 탄소 공급원 외에도, 발효 배지는 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 완충제, 및 배양물의 대사 및 부탄올 생산에 필요한 효소 경로의 촉진에 적합한, 당업자에게 공지된 다른 성분들을 함유해야 한다.

적합한 배지는, 상업적으로 제조된 일반적인 배지, 예를 들어 효모 질소 베이스(yeast nitrogen base), 황산암모늄, 및 탄소/에너지 공급원으로서의 덱스트로스를 포함하는 브로스 또는 대부분의 사카로마이세스 세레비시애 주의 성장을 위한 최적 비율의 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스의 블렌드인 YPD 배지를 포함한다. 다른 규정 또는 합성 성장 배지가 또한 사용될 수 있으며, 이는 미생물학 또는 발효 과학 분야의 숙련자가 알고 있다.

배양 조건

전형적으로 배양물은 적절한 배지 중에 약 20℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도를 포함하는, 생존가능 부탄올 생산 효모 세포를 지원하기 위한 조건 하에서 유지된다. 발효에 적합한 pH 범위는 전형적으로 pH 3.0 내지 pH 7.5이며, 여기서 일부 실시 형태에서 pH 4.5 내지 pH 6.5가 초기 조건이다.

발효는 호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 용존 산소량은 미호기성 조건들 사이에서 3% 초과로 유지된다.

전형적으로 발효 배지 중 부탄올의 양은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)에 의해 결정된다. 그러나, 당업계에 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다.

배양물은 배치식(batch), 유가식(fed-batch), 또는 연속식 시스템에서 발효될 수 있다. 유가식 시스템은 탄소 공급원 기질이 발효가 진행됨에 따라 증분식으로 첨가된다는 것을 제외하고는 전형적인 배치식 시스템과 유사하다. 배치식 및 유가식 발효가 일반적이며, 이는 당업계에 잘 알려져 있고, 그 예를 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.] 또는 문헌[Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227,(1992)]에서 찾아볼 수 있다.

전형적인 생산 조건은 소정의 기간 동안의 유가식 공정 - 이때 일단 탄소 공급원 전부가 첨가되면 배치식 모드로 바꿈 - 을 포함할 수 있다. 상업적 조건 하에서, 액화된 매시 또는 공급원료는 소정의 기간에 걸쳐 공급되며, 당화 효소가 발효기에 또한 첨가되는데, 이는 시간이 지남에 따라 글루코스를 전분으로부터 방출시킨다. 시간이 지남에 따른 전분으로부터의 글루코스의 이러한 느린 방출은 발효기에 첨가되는 당화 효소의 양에 의해 제어된다. 사탕수수즙 발효의 경우, 기질은 모든 기질이 첨가될 때까지 시간이 지남에 따라 서서히 첨가되며, 그 후 발효가 배치식 모드 하에 진행된다. 발효는 약 1시간 내지 200시간인 기간 동안 실행될 수 있다.

발효 배지로부터의 생성물 단리

생성 동안, 부탄올 생성물은 진공 인가 및 액체-액체 추출을 포함하는 당업계에 공지된 공정에 의해 발효 배지로부터 제거될 수 있다.

생성물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 생성된 아이소부탄올은 ABE 발효에 대해서 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Durre, Appl., Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27:61-75 (1992)] 및 상기 문헌 내의 참고문헌 참조). 예를 들어, 원심분리, 여과, 경사분리(decantation) 등에 의해 발효 배지로부터 고형물을 제거할 수 있다. 그 후, 아이소부탄올은 증류, 공비 증류, 액체-액체 추출, 흡착, 가스 스트립핑(gas stripping), 막 증발, 투과증발 또는 진공 플래시 발효와 같은 방법을 사용하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제20090171129 A1호, 및 국제특허 공개 WO2010/151832 A1호를 참조하며, 이들 둘 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 진공은 수성상으로부터의 부탄올의 제거를 위하여 발효 브로쓰의 일부분 또는 그 전부에 인가될 수 있다.

부탄올이 물과 저비점의 공비성 혼합물을 형성하기 때문에, 증류를 사용하여 이의 공비 조성까지 상기 혼합물을 분리할 수 있다. 증류를 다른 분리 방법과 조합하여 사용하여 공비점 부근의 분리를 얻을 수 있다. 부탄올의 단리 및 정제를 위하여 증류와 조합하여 사용할 수 있는 방법은 경사분리, 액체-액체 추출, 흡착 및 막-기반 기술을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 부탄올을 엔트레이너(entrainer)를 사용하여 공비 증류를 이용하여 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Doherty and Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, New York, 2001] 참조).

부탄올-물 혼합물은 이질적인 공비혼합물을 형성하여, 증류를 경사분리와 조합하여 사용하여 아이소부탄올을 단리 및 정제할 수 있다. 이 방법에서는 아이소부탄올을 함유하는 발효 브로쓰를 공비 조성 부근까지 증류한다. 그 후, 공비 혼합물을 응축하고, 아이소부탄올을 경사분리에 의하여 발효 배지로부터 분리한다. 경사분리된 수성상은 환류물로서 제1 증류 컬럼으로 돌아갈 수 있다. 아이소부탄올이 풍부한 경사분리된 유기상을 제2 증류 컬럼에서의 증류에 의해 추가로 정제할 수 있다.

부탄올은 또한 액체-액체 추출을 증류와 조합하여 사용하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다. 이 방법에서는 적합한 용매를 이용하여 액체-액체 추출을 사용하여 발효 브로쓰로부터 아이소부탄올을 추출한다. 그 후, 아이소부탄올을 함유하는 유기상을 증류하여 부탄올을 용매로부터 분리한다. 첨가되는 추출제의 양은 발효 동안 수성 매질로부터 부탄올을 제거하기 위하여 액체-액체 추출(LLE)에서 사용하기 위한 발효기 부피의 5% 내지 50%일 수 있다.

또한 흡착과 조합된 증류를 사용하여 발효 배지로부터 아이소부탄올을 단리할 수 있다. 이 방법에서는, 아이소부탄올을 함유하는 발효 브로쓰를 공비 조성 부근까지 증류한 후에 분자체와 같은 흡착제를 사용하여 잔류하는 물을 제거한다(문헌[Aden et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, June 2002]).

또한, 투과증발과 조합된 증류를 사용하여 발효 배지로부터 아이소부탄올을 단리 및 정제할 수도 있다. 이 방법에서는, 아이소부탄올을 함유하는 발효 브로쓰를 공비 조성 부근까지 증류한 후에 친수성 막을 통한 투과증발에 의해 잔류하는 물을 제거한다(문헌[Guo et al., J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)]).

원위치 생성물 제거(in situ product removal; ISPR)(also referred to as extractive fermentation)는 부탄올 (또는 다른 발효 알코올)을 이것이 생성될 때 발효 용기로부터 제거하고 이럼으로써 미생물이 부탄올을 고수율로 생산하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 당업계에 개시된, 발효 알코올 제거를 위한 하나의 ISPR 방법으로는 액체-액체 추출이 있다. 일반적으로, 부탄올 발효와 관련하여, 예를 들어 미생물을 포함하는 발효 배지를 부탄올 농도가 독성 수준에 도달하기 전에 한 번에 유기 추출제와 접촉시킨다. 유기 추출제 및 발효 배지는 2상 혼합물을 형성한다. 부탄올은 유기 추출제 상 내로 분배되어, 미생물을 함유하는 수성상 중의 농도가 감소되고 이럼으로써 저해성 부탄올에 미생물이 노출되는 것이 제한된다.

액체-액체 추출은 예를 들어 미국 특허 공개 제20090305370호에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상기 미국 특허 공개의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 포함된다. 미국 특허 공개 제20090305370호에는 액체-액체 추출을 이용하여 발효 브로쓰로부터 부탄올을 생성 및 회수하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 발효 브로쓰를 수혼화성 추출제와 접촉시켜 수성상 및 유기상을 포함하는 2상 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 추출제는 포화된, 단일불포화된, 다중불포화된 (및 그 혼합물의) C₁₂ 내지 C₂₂ 지방 알코올, C₁₂ 내지 C₂₂ 지방산, C₁₂ 내지 C₂₂ 지방산 에스테르, C₁₂ 내지 C₂₂ 지방 알데히드 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 추출제일 수 있다. ISPR을 위한 추출제(들)는 비-알코올 추출제일 수 있다. ISPR 추출제는 외인성 유기 추출제, 예를 들어 올레일 알코올, 베헤닐 알코올, 세틸 알코올, 라우릴 알코올, 미리스틸 알코올, 스테아릴 알코올, 1-운데칸올, 올레산, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 메틸 미리스테이트, 메틸 올레에이트, 운데카날, 라우릭 알데히드, 20-메틸운데카날 및 그 혼합물일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 알코올은 발효 배지 중 알코올을 유기 산에 의해 알코올을 에스테르화할 수 있는 촉매 (예를 들어, 리파아제와 같은 효소) 및 유기 산 (예를 들어, 지방산)과 접촉시킴으로써 에스테르화할 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 유기 산은 알코올 에스테르가 내부로 분배되는 ISPR 추출제로서의 역할을 할 수 있다. 유기 산은 발효 용기에 공급되고/되거나 발효 용기에 공급되는 발효성 탄소를 공급하는 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 공급원료에 존재하는 지질은 촉매에 의해 유기 산으로 가수분해될 수 있으며, 상기 촉매 (예를 들어, 효소)는 알코올에 의해 유기 산을 에스테르화할 수 있다. 촉매는 발효 이전에 공급원료에 공급될 수 있거나, 또는 공급원료의 공급 전에 또는 그와 동시에 발효 용기에 공급될 수 있다. 촉매가 발효 용기에 공급될 때, 알코올 에스테르는 유기 산으로의 지질의 가수분해 및 발효 용기에 존재하는 부탄올에 의한 유기 산의 실질적 동시 에스테르화에 의해 얻어질 수 있다. 공급원료로부터 유래되지 않은 천연 오일 및/또는 유기 산이 발효 용기에 또한 공급될 수 있으며, 이때 천연 오일은 유기 산으로 가수분해된다. 알코올에 의해 에스테르화되지 않은 임의의 유기 산이 ISPR 추출제의 일부로서의 역할을 할 수 있다. 알코올 에스테르를 함유하는 추출제가 발효 배지로부터 분리될 수 있으며, 알코올이 추출제로부터 회수될 수 있다. 추출제는 발효 용기로 재순환될 수 있다. 따라서, 부탄올 생성의 경우, 예를 들어 부탄올의 에스테르로의 전환은 발효 배지 중 자유 부탄올 농도를 감소시켜서, 미생물을 부탄올 농도 증가의 독성 효과로부터 보호한다. 게다가, 비분획화 곡물이 그 내부의 지질의 분리 없이 공급원료로서 사용될 수 있으며, 그 이유는 지질이 촉매에 의해 유기 산으로 가수분해되고 이럼으로써 ISPR 추출제에서의 지질의 증가율을 감소시킬 수 있기 때문이다.

원위치 생성물 제거는 배치식 모드 또는 연속식 모드로 실시될 수 있다. 원위치 생성물 제거의 연속식 모드에서, 생성물은 반응기로부터 계속적으로 제거된다. 원위치 생성물 제거의 배치식 모드에서, 소정 부피의 유기 추출제가 발효 용기에 첨가되며, 추출제는 당해 공정 동안 제거되지 않는다. 원위치 생성물 제거에 있어서, 유기 추출제는 발효 시작시에 발효 배지와 접촉되어 2상 발효 배지를 형성한다. 대안적으로, 유기 추출제는 미생물이 배양물의 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있는 원하는 양의 성장을 이룬 후에 발효 배지와 접촉할 수 있다. 또한, 유기 추출제는 발효 배지 중 생성물 알코올 수준이 소정의 수준에 도달하는 시점에 발효 배지와 접촉할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에 따른 부탄올 생성의 경우, 유기 산 추출제를 부탄올 농도가 독성 수준에 도달하기 전의 시점에 발효 배지와 접촉시켜서, 유기 산에 의해 부탄올을 에스테르화하여 부탄올 에스테르를 생성하고 그 결과 발효 용기 내의 부탄올의 농도를 감소시킬 수 있다. 그 후, 에스테르 함유 유기상은 부탄올 에스테르의 원하는 유효 역치가 성취된 후 발효 용기로부터 제거될 수 있다 (그리고 수성상을 구성하는 발효 브로쓰로부터 분리될 수 있다). 일부 실시 형태에서, 에스테르 함유 유기상은 발효 용기 내의 이용가능한 발효성 당의 발효가 실질적으로 완료된 후 수성상으로부터 분리된다.

실시예

본 발명을 하기 실시예에서 추가로 정의한다. 이들 실시예는 본 발명의 실시 형태들을 나타내는 한편, 단지 예시로 주어짐을 이해해야 한다. 상기 토의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있고, 그의 사상 및 범주를 벗어나지 않고서 본 발명의 다양한 변화 및 변경을 하여서 본 발명이 다양한 용도와 조건에 적합하도록 할 수 있다.

사용되는 약어의 의미는 하기와 같다: "min"은 분을 의미하며, "h"는 시간을 의미하고, "㎕"은 마이크로리터를 의미하며, "mL"은 밀리리터를 의미하고, "L"은 리터를 의미하며, "㎚"은 나노미터를 의미하고, "㎜"은 밀리미터를 의미하며, "㎝"은 센티미터를 의미하고, "㎛"은 마이크로미터를 의미하며, "mM"은 밀리몰랄을 의미하고, "M"은 몰랄을 의미하며, "mmol"은 밀리몰을 의미하고, "μmole"는 마이크로몰을 의미하며, "g"는 그램을 의미하고, "㎍"는 마이크로그램을 의미하며, "㎎"는 밀리그램을 의미하고, "OD₆₀₀"은 600 ㎚의 파장에서 측정된 광학 밀도를 의미하며, "CFU"는 콜로니 형성 단위를 의미하고, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미한다.

일반 방법:

효모의 성장 및 배지는 문헌[Amberg, Burke and Strathern, 2005, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있다. 또한 방법은 문헌[Yeast Protocol (Editor W. Xiao, Humana Press, Totowa, New Jersey]에 기재되어 있다. 600 ㎚에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 울트라스펙(Ultraspec) 3100 분광 광도계 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬스케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences))를 사용하여 측정하였다.

실시예 1

사카로마이세스 세레비시애 BY4743에 있어서의 저 세포 밀도 및 고 세포 밀도에서의 24시간 생존성

사카로마이세스 세레비시애 BY4743 (ATCC 201390)을 냉동 바이알로부터 YPD 한천 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바(Teknova); 카탈로그 번호 Y1000) 상에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. YPD 플레이트로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (테크노바; 카탈로그 번호 Y5000)의 25 ml 예비 배양물 내로 접종하였다. 상기 예비 배양물을 호기성 진탕기에서 30℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 상기 예비 배양물의 분취물을 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 200 ml의 YPD 브로쓰 내로 접종하고, 이 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다. 이 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 배양물을 원심분리하고, 세포를 신선 YPD 브로쓰에 5의 OD₆₀₀이 생성되도록 재현탁시켰다. 이를 고 세포 밀도(HCD) 배양물로 칭한다. 이 배양물을 신선 YPD 브로쓰 내로 100배 희석시켜 OD₆₀₀이 0.05인 배양물을 제공하였다. 이를 저 세포 밀도(LCD) 배양물로 칭한다. 이들 배양물을 순응 기간을 위하여 30분 동안 30℃에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 30분의 순응 기간의 마지막에, OD₆₀₀을 측정하였다. 5 ml의 저 또는 고 세포 밀도 배양물은 시험할 상이한 농도들의 알코올을 함유하는 15 ml 코니칼(conical) 튜브에 분배하였다. 대조 튜브는 알코올을 포함하지 않았다. 튜브들을 30℃의 회전 드럼 내에 넣고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 첨가 시점을 "시점 0"으로 칭하였다. 시험한 농도들은 다음과 같았다: 1.0% (w/v), 1.5% 및 2%의 1-부탄올; 1.0%, 1.5% 및 2.5%의 아이소부탄올; 2.0%, 3.0% 및 3.5%의 2-부탄올; 및 2.0%, 4.0%, 및 5%의 에탄올. 각각의 배양물의 알코올 농도를 24시간 후에 HPLC에 의해 측정하였으며, 이는 < 0.01%의 알코올이 인큐베이션 기간 동안 손실됨을 나타냈다.

콜로니 형성 단위(CFU)를 미생물학적 표준 방법을 이용하여 대조군의 경우 시점 0에서, 그리고 대조 배양물을 포함하여 각각의 배양물의 경우 24시간에 YPD 플레이트 상에서 결정하였다. 배양물을 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석시키고 (20 ㎕의 배양물 및 180 ㎕의 YPD 브로쓰), 10 ㎕의 다양한 희석물을 삼중 한천 배지 상에 스포팅하고(spotted), 30℃에서 24시간 및 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에 콜로니를 계수하고, CFU/ml을 계산하였다. 시점 0에서, 저 세포 밀도 배양물은 약 4.8×10⁵개의 CFU/ml을 가졌으며, 고 세포 밀도 배양물은 약 5.4×10⁷개의 CFU/ml을 가졌다. 생존율 (%)을 24시간 대조 (0의 부탄올) HCD 또는 LCD 배양물의 CFU/ml을 바탕으로 하여 계산하였으며, 그 결과는 표 2에 주어져 있다.

알코올을 포함하지 않는 대조 고 세포 밀도 배양물은 24시간 후에 5.4×10⁷개의 세포/ml로부터 6.5×10⁷개의 세포/ml로 증가하였다. 알코올을 포함하지 않는 대조 저 세포 밀도 배양물은 24시간 후에 4.8×10⁵개의 세포/ml로부터 2.8×10⁷개의 세포/ml로 증가하였다. 1-부탄올, 아이소부탄올 또는 2-부탄올에 노출시킨 배양물에서, 생존율 (%)은 저 세포 밀도 배양물보다 고 세포 밀도 배양물이 유의하게 더 높았다 (표 2). 이와는 대조적으로, 고 세포 밀도 배양물은 저 세포 밀도 배양물보다 2.0% 또는 4.0% 에탄올에의 노출에 대하여 더욱 민감하였다.

실시예 2

비-사카로마이세스 효모에 있어서의 저 세포 밀도 및 고 세포 밀도에서의 24시간 생존성

비-사카로마이세스 효모 주들을 시험하여 이들 효모에 있어서 아이소부탄올 내성이 세포 밀도에 의해 영향을 받는지를 결정하였다. 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) PNY0577 (미국 버지니아주 매너서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC"); ATCC 번호 8554), 클루이베로마이세스 마르시안스(Kluyveromyces marxians) PNY0578 (ATCC 번호 16045), 피키아 멤브라니파시엔스(Pichia membranifaciens) PNY0572, 피키아 아노말라(Pichia anomala) PNY0573, 피키아 sp. PNY0574, 이사첸키아 오리엔탈리스 PNY0575 및 이사첸키아 오리엔탈리스 PNY0576을 시험하였다. 사용한 피키아 및 이사첸키아 주는 표기된 속의 대표적인 야생형이다. 다른 대표적인 주는 예를 들어 ATCC로부터 구매가능하다.

비-사카로마이세스 효모 주를 냉동 바이알로부터 YPD 한천 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바) 상에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. YPD 플레이트로부터의 각각의 주로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바)의 25 ml 예비 배양물 내로 접종하고, 호기성 진탕기에서 30℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 각각의 예비 배양물의 분취물을 200 ml YPD 브로쓰 내로 접종하여 0.06 내지 0.08의 초기 OD₆₀₀을 제공하고, 생성된 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다. 이 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 배양물을 원심분리하고, 세포를 신선 YPD 브로쓰에 5의 OD₆₀₀이 생성되도록 재현탁시켰다. 이를 고 세포 밀도(HCD) 배양물로 칭한다. 이 배양물을 신선 YPD 브로쓰 내로 100배 희석시켜 OD₆₀₀이 0.05인 배양물을 제공하였다. 이를 저 세포 밀도(LCD) 배양물로 칭한다. 이들 배양물을 순응 기간을 위하여 30분 동안 30℃에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 30분의 순응 기간의 마지막에, OD₆₀₀을 측정하였다.

5 ml의 저 또는 고 세포 밀도 배양물은 시험할 상이한 농도들의 아이소부탄올을 함유하는 15 ml 코니칼 튜브에 분배하였다. 튜브들을 30℃의 회전 드럼 내에 넣고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 아이소부탄올 농도는 1.0% 또는 2.0%였다. 각각의 주의 대조 배양물은 아이소부탄올을 함유하지 않았다. 세포 첨가 시점을 "시점 0"으로 칭하였다. 각각의 샘플의 아이소부탄올 농도를 24시간 후에 HPLC에 의해 측정하였으며, 이는 < 0.01%의 알코올이 인큐베이션 기간 동안 손실됨을 나타냈다. 모든 샘플을 아크로디스크(Acrodisc) CR PTFE 0.2 ㎛ 필터 (미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재의 폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences))로 여과시키고, 쇼덱스(Shodex) SH1011 컬럼 (8 ㎜ ID × 300 ㎜ 길이; 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 쇼와 덴코 아메리카, 인크.(Showa Denko America, Inc.)) 및 쇼덱스 SH-G - 가드(guard) 컬럼으로서 - 를 사용하여 분석하였다. 주입 부피는 10 ㎕였다. 이동상은 0.01 N 황산이었다. 컬럼 온도는 50℃였으며, 이때 이동상 유량은 0.5 mL/min이었다. 검출을 위하여, 210 ㎚ 에서의 광도 검출기 및 굴절률 검출기를 사용하였다.

콜로니 형성 단위(CFU)를 미생물학적 표준 방법을 이용하여 대조군의 경우 시점 0에서, 그리고 대조 배양물을 포함하여 모든 샘플의 경우 24시간에 YPD 플레이트 상에서 결정하였다. 본질적으로, 세포를 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석시키고 (20 ㎕의 배양물 및 180 ㎕의 YPD 브로쓰), 10 ㎕의 다양한 희석물을 삼중 한천 배지 상에 스포팅하고, 30℃에서 24시간 및 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에 콜로니를 계수하고, CFU/ml을 계산하였다. 생존율 (%)을 각각의 주의 24시간 HCD 또는 LCD 대조 배양물의 CFU/ml을 바탕으로 하여 계산하였으며, 그 결과는 표 3에 주어져 있다.

아이소부탄올을 포함하지 않는 대조 고 세포 밀도 배양물은 24시간 후에 약 1.0×10⁸개의 세포/ml로부터 약 1.5×10⁸개의 세포/ml로 증가하였다. 아이소부탄올을 포함하지 않는 대조 저 세포 밀도 배양물은 24시간 후에 약 1.1×10⁶개의 세포/ml로부터 약 1.0×10⁸개의 세포/ml로 증가하였다. 비-사카로마이세스 효모 주들 전부는 1.0% 아이소부탄올에 노출시킨 LCD 배양물에서보다 HCD 배양물에서 생존 수준이 유의하게 더 높았다 (표 3). 단지 하나의 주(PNY0574)가 2.0% 아이소부탄올에의 노출을 견뎌냈다. 또한 이 주는 2.0% 아이소부탄올에 노출시킨 LCD 배양물에서보다 HCD 배양물에서 생존 수준이 유의하게 더 높았다.

실시예 3

고 세포 밀도 배양물 중 아이소부탄올의 존재 하에서의 사카로마이세스 세레비시애 주의 글루코스 이용률

사카로마이세스 세레비시애 BY4743을 냉동 바이알로부터 YPD 한천 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y1000) 상에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. YPD 플레이트로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y5000)의 25 ml 예비 배양물 내로 접종하고, 이 배양물을 공기 진탕기(air shaker)에서 30℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 상기 예비 배양물의 분취물을 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 200 ml의 YPD 브로쓰 내로 접종하고, 이 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다. 이 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 배양물을 원심분리하고, 세포를 신선 YPD 브로쓰에 8의 OD₆₀₀이 생성되도록 재현탁시켰다. 이 시점에서, 10 ml의 배양물의 분취물을 건조 세포 중량 결정에 사용하였으며, 이는 3.89 gdcw/L의 결과를 제공하였다.

20 ml의 배양물을 0.0%, 0.5%, 1.0%, 1.25%, 1.5%, 1.75% 또는 2.0%의 아이소부탄올을 함유하는 플라스크로 옮겼다. 세포의 첨가 시점을 0시간으로 칭하였다. 다양한 시점에서 샘플 (1.5 ml)을 꺼내고, 마이크로퓨지(microfuge) (소발 바이오퓨지 피코(Sorvall Biofuge pico))에서 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2 ㎛ 필터 (미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재의 폴 라이프 사이언시즈) 0.2 ㎛ GHP 막을 갖춘 폴 GHP 아크로디스크 13 ㎜ 시린지 필터를 통하여 여과시키고, 여과액을 10배 희석시키고, 글루코스 농도를 와이에스아이(YSI) 글루코스 분석기 (와이에스아이 2700 셀렉트(Select); 미국 오하이오주 옐로우 스프링즈 소재의 와이에스아이, 인크.(YSI, Inc.))를 사용하여 측정하였다.

또한, 아이소부탄올의 존재 하에서의 글루코스 소비율을 세포 농도가 18 gdcw/L 또는 24 gdcw/L일 때 결정하였다. YPD 플레이트로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바, #Y5000)의 25 ml 예비 배양물 내로 접종하고, 이 배양물을 공기 진탕기에서 30℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 예비 배양물의 분취물을 초기 OD₆₀₀을 0.1로 하여 300 ml의 YPD 브로쓰를 포함하는 8개의 플라스크 내로 접종하고, 이 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다. 이 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 배양물을 원심분리하고, 세포를 신선 YPD 브로쓰에 38의 OD₆₀₀ (18 gdcw/L)이 생성되도록 재현탁시켰다. 샘플 (15 ml)을 2 %, 3%, 또는 4%의 아이소부탄올을 함유하는 플라스크로 옮기고, 글루코스 소비를 150분 동안 추적하였다.

출발 OD₆₀₀이 49.1 (24 gdcw/L)이라는 것을 제외하고는 상기 실험을 반복하였다. 샘플 (15 ml)을 1.5 %, 3%, 또는 4%의 아이소부탄올을 함유하는 플라스크로 옮기고, 글루코스 소비를 150분 동안 추적하였다. BY4743에 대한 결과가 도 4에 그래프로 도시되어 있다.

대조 배양물 (아이소부탄올을 포함하지 않음)에서, 글루코스 소비율은 시험한 실험 조건 하에서 대략 2.17 g/gdcw/h였다. 1.5% 아이소부탄올에서, 3.8 및 24 gdcw/L의 배양물 둘 모두의 글루코스 소비율은 대조군의 소비율 (약 1.1 g/gdcw/h)의 대략 50%였다. 글루코스 소비는 심지어 2.0% 및 2.5% 아이소부탄올의 존재 하에서도 관찰되었으며, 이것은 대조군 소비율의 20 내지 25% 범위였다. 대조군에서의 실제 글루코스 소비율은 실험할 때마다 5% 달라질 수 있다. 그러나, 상대적인 아이소부탄올 저해 백분율은 재현가능하였다.

실시예 4

고 세포 밀도 배양물을 생성하는 방법

사카로마이세스 세레비시애 BY4743을 냉동 바이알로부터 YPD 한천 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y1000) 상에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. YPD 플레이트로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y5000)의 25 ml 예비 배양물 내로 접종하였다. 상기 예비 배양물을 호기성 진탕기에서 30℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 상기 예비 배양물의 분취물을 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 125 ml의 YPD 브로쓰 내로 접종하고, 이 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다.

150 ml의 YPD의 출발 배양물에 5 ml의 하룻밤 배양물을 초기 OD₆₀₀을 0.15로 하여 접종하였다. 이 배양물을 2시간 동안 통기시키면서 30℃에서 인큐베이션하여 0.38의 OD₆₀₀에 도달하였다. 이 시점 (시간 = 0)에서, 표 4에 주어진 다양한 농도의 아이소부탄올로 배양물을 챌린징하였으며, OD₆₀₀을 5시간 동안 매 시간마다 그리고 24시간에 분석하였다. 결과가 표 4에 주어져 있다.

이 주에 있어서, 1의 OD₆₀₀은 10⁷개의 세포/ml에 해당하기 때문에, 에스. 세레비시애는 1% 아이소부탄올의 존재 하에 하룻밤 성장 후 약 4×10⁷개의 세포/ml로 성장하였다.

1% 아이소부탄올, 또는 더 적은 아이소부탄올 (<1%의 아이소부탄올의 농도)에서 4.41 이상의 OD₆₀₀으로 성장시킨 배양물은 고 세포 밀도 배양물이다. 이들 배양물은 아이소부탄올 생산에 사용할 수 있다.

실시예 5

고 글루코스 소비율을 갖는 주의 생성 방법

사용한 에스. 세레비시애 주는 PNY0602 및 PNY0614뿐만 아니라 센트랄뷰로 푸어 쉼멜컬쳐스, 펑갈 앤드 이스트 콜렉션(Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast Collection; 네덜란드)로부터 획득한 PNY0569 CEN.PK122 (MATa MAL2-8c SUC2 / MATalpha MAL2-8c SUC2) 및 PNY0571 (CEN.PK 113-7D MATa MAL2-8c SUC2)이었다. PNY0602 및 PNY0614를 PNY0571의 돌연변이 유발 배양물로부터 단리하였다. PNY0571 (CEN.PK 113-7D)은 표준 방법을 사용하여 N-메틸-N' -니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 에틸메탄 설포네이트(EMS)를 이용하여 10라운드의 화학적 돌연변이 유발에 처하였다 (문헌[Barbour, L., M. Hanna and W. Xiao. 2006. Mutagenesis, p. 121 - 127. In W. Xiao (ed.), Yeast Protocols, Second Edition. Humana Press, NJ]). 세포를 진탕시키면서 30℃에서 10 ml의 YPD에서 하룻밤 성장시켰다. 하룻밤 배양물을 원심분리시키고, 펠렛을 pH 7.0의 50 mM 인산칼륨 완충제에 재현탁시켰다. 세포를 다시 원심분리시키고, 10 ml의 동일 완충제에 재현탁시켰다. 일부분의 재현탁 세포 (2.5 ml)를 플라스틱 15 ml 스크류 캡(screw cap) 원심분리 튜브로 옮기고, 세포를 진탕 없이 30℃에서 40분 동안 NTG (10 ㎍/ml의 최종 농도) 또는 EMS (3% (w/v))로 처리하였다. 동일 부피의 필터 살균 10% (w/v) 티오황산나트륨을 첨가하여 돌연변이 유발원을 불활성화시켰다. 처리한 세포를 원심분리시키고 물에 재현탁시키는 것을 2회 행하였다. 처리 프로토콜은 돌연변이 유발원들 중 하나 (예를 들어, NTG)로 효모 세포를 처리하고, 1% 아이소부탄올을 포함하는 YPD에서 생존 세포를 하룻밤 성장시키고, 그 후 상기 하룻밤 배양물을 다른 하나의 돌연변이 유발원 (예를 들어, EMS)으로 처리하는 반복 사이클을 포함하였다. 제5 사이클(즉, 돌연변이 유발원으로 총 10회 처리) 후, 세포를 아이소부탄올 내성에 대하여 스크리닝하였다. PNY0602를 3.0% 아이소부탄올에의 장시간 (24시간) 노출 후 단리하였다. PNY0614는 돌연변이 유발된 세포를 증류수에 재현탁시키고 상기 세포를 드라이아이스 에탄올 조 및 37℃ 수조로 각각 20분 동안 옮겨놓음에 의한 돌연변이 유발 배양물의 반복된 냉동 및 해동의 5회 사이클 후 단리하였다.

ATCC 등록 번호 PTA-11918과 관련된 단리된 미생물은 본 명세서에서 PNY0602로도 공지되어 있다. ATCC 등록 번호 PTA-11918과 관련된 단리된 미생물은 부다페스트 조약 하에 미국 20110-2209 버지니아주 머내서스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 특허 기탁 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 2011년 6월 1일자로 기탁되었다. ATCC 등록 번호 PTA-11919와 관련된 단리된 미생물은 본 명세서에서 PNY0614로도 공지되어 있다. ATCC 등록 번호 PTA-11919와 관련된 단리된 미생물은 부다페스트 조약 하에 미국 20110-2209 버지니아주 머내서스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 특허 기탁 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 2011년 6월 1일자로 기탁되었다.

또한 YPD 중 아이소부탄올의 존재 하에서의 글루코스 소비율을 세포 농도가 약 8의 O.D. (약 3.9 gdcw/L)일 때 결정하였다. 사카로마이세스 세레비시애 주 PNY0571, PNY0602 및 PNY0614를 냉동 바이알로부터 YPD 한천 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y1000) 상에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. YPD 플레이트로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y5000)의 25 ml 예비 배양물 내로 접종하고, 이 배양물을 공기 진탕기에서 30℃에서 7시간 동안 성장시켰다. 상기 예비 배양물의 분취물을 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 200 ml의 YPD 브로쓰 내로 접종하고, 이 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다. 이 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 배양물을 원심분리하고, 세포를 신선 YPD 브로쓰에 8의 OD₆₀₀이 생성되도록 재현탁시켰다. 이 시점에서, 10 ml의 배양물의 분취물을 건조 세포 중량 결정에 사용하였으며, 이는 3.89 gdcw/L 범위의 건조 세포 중량을 제공하였다.

20 ml의 배양물을 0.0%, 0.5%, 0.75%, 1.0%, 1.25%, 1.5%, 1.75%, 2.0% 및 2.5%의 아이소부탄올을 함유하는 플라스크로 옮겼다. 세포의 첨가 시점을 0시간으로 칭하였다. 다양한 시점에서, 샘플들 (500 내지 700ul)을 동일 부피의 10% TCA를 함유하는 튜브로 옮겼다. 샘플들을 원심분리시키고, 글루코스를 와이에스아이 글루코스 분석기(와이에스아이 2700 셀렉트)에서 측정하였다.

결과를 표 5에 나타낸다. 이들 결과는 글루코스 소비율이 돌연변이 유발 및 선발에 의해 모(parent)와 비교하여 개선될 수 있음을 나타낸다.

아이소부탄올 생성은 성장과 커플링될 수 있거나 커플링되지 않을 수 있다. 따라서, 3가지의 상이한 pH의 완충제를 이용하여 비-성장 조건 하에 글루코스 소비율을 측정하였다.

문헌[Diderich, J. A., et al., Microbiology, 1999, 145 p. 3447-54]에 약술된 바와 같이 pH 6.5의 인산염 완충제에서 글루코스 소비율을 측정하였다. 또한, MES 완충제를 사용하여 pH 5.25 및 pH 4.0에서 글루코스 소비율을 측정하였다.

세포를 YPD (500 ml 플라스크 중 125 ml)에서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 세포를 원심분리시키고 완충제 (pH 6.0의 0.1 M 인산염 완충제 또는 pH 5.25의 0.1 M MES 완충제 또는 pH 4.0의 0.1 M MES 완충제)에 재현탁시키고, 1회 세척하고, 그 후 재현탁시켜서 각각의 세포 현탁물이 대략 16의 OD 또는 1억 6000만개의 세포/ml을 갖도록 하였다. 10 ml의 이들 스톡 세포를 다양한 농도의 아이소부탄올 및 40 g/L의 글루코스를 함유하는 상응하는 완충제 10 ml을 함유하는 플라스크로 옮겼다. 다양한 시점에서, 샘플들 (500 내지 700ul)을 동일 부피의 10% TCA를 함유하는 튜브로 옮겼다. 샘플들을 원심분리시키고, 글루코스를 와이에스아이 글루코스 분석기에서 측정하였다. 글루코스 소비율은 시간이 지남에 따라 소비되는 글루코스의 양을 도시함으로써 결정하였다. 결과는 표 6에 주어져 있다. pH 6.5보다 더 낮은 pH에서 20 g/L의 아이소부탄올의 존재 하에 더욱 높은 글루코스 소비율이 관찰되었다.

실시예 6

고 세포 밀도 배양물 중 아이소부탄올의 존재 하에서의 이사첸키아 오리엔탈리스 주의 글루코스 이용률

이사첸키아 오리엔탈리스 PNY0660 주는 이전에 칸디다 애시도서모필륨(Candida acidothermophilium)으로 칭해진 ATCC 20381 주로부터 유래하였다. PNY0660 주를 냉동 바이알로부터 YPD 한천 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y1000) 상에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. YPD 플레이트로부터의 세포를 초기 OD₆₀₀을 0.06 내지 0.08로 하여 YPD 브로쓰 (미국 캘리포니아주 홀리스터 소재의 테크노바; 카탈로그 번호 Y5000)의 50 ml 예비 배양물 내로 접종하고, 이 배양물을 공기 진탕기에서 30℃에서 5시간 동안 성장시켰다. 상기 예비 배양물의 분취물을 초기 OD₆₀₀을 0.6으로 하여 200 ml의 YPD 브로쓰 내로 접종하고, 이 배양물을 통기시키면서 30℃에서 대략 17시간 동안 인큐베이션하였다. 이 배양물의 광학 밀도를 측정하고, 배양물을 원심분리하고, 당 소비율을 옥수수 시험 배지에서 측정하였다. 옥수수 시험 배지는 0.2% 카사미노산 및 2% 글루코스 및 pH 5.25의 100 mM MES 완충제를 함유하였으며, 리터 당 (i) 염: 황산암모늄 5.0 g, 1염기성 인산칼륨 2.8 g, 및 황산마그네슘 7수화물 0.5 g, (ii) 비타민: 바이오틴 (D-) 0.40 ㎎, Ca D(+) 판토테네이트 8.00 ㎎, 미오이노시톨 200.00 ㎎, 피리독솔 염산염 8.00 ㎎, p-아미노벤조산 1.60 ㎎, 리보플라빈 1.60 ㎎, 엽산 0.02 ㎎, 나이아신 30.0 ㎎, 및 티아민 30 ㎎; 및 (iii) 미량 원소: EDTA (타이트라이플렉스(Titriplex) III7) 99.38 ㎎, 황산아연 7수화물 29.81 ㎎, 탈수 염화망간 5.57 ㎎, 염화코발트(II) 6수화물 1.99 ㎎, 황산구리(II) 5수화물 1.99 ㎎, 탈수 다이소듐 몰리브덴 2.65 ㎎, 탈수 염화칼슘 29.81 ㎎, 황산철 7수화물 19.88 ㎎, 및 붕산을 함유하였다.

옥수수 시험 배지 중 배양물 20 ml (2.7 gdcw/L)을 0.0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 1.75% 또는 2.0%의 아이소부탄올을 함유하는 플라스크로 옮겼다. 세포의 첨가 시점을 0시간으로 칭하였다. 다양한 시점에서 샘플 (1.5 ml)을 꺼내고, 마이크로퓨지 (소발 바이오퓨지 피코)에서 10,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2 ㎛ 필터 (미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재의 폴 라이프 사이언시즈) 0.2 ㎛ GHP 막을 갖춘 폴 GHP 아크로디스크 13 ㎜ 시린지 필터를 통하여 여과시키고, 여과액을 10배 희석시키고, 글루코스 농도를 와이에스아이 글루코스 분석기 (와이에스아이 2700 셀렉트; 미국 오하이오주 옐로우 스프링즈 소재의 와이에스아이, 인크.)를 사용하여 측정하였다. 0시간 내지 6시간 측정한 당 소비율을 표 7에 나타낸다.

아이. 오리엔탈리스 주의 당 소비율은 20 g/l의 아이소부탄올의 존재 하에서 0.7 g/gdw/h이다.

본 발명의 전술한 설명은 예시 및 설명을 목적으로 제시되었다. 더욱이, 상기 설명은 본 발명을 본 명세서에 개시된 형태에 한정하고자 하는 것이 아니다.

본 명세서에 기재된 다양한 태양들, 실시 형태들 및 선택사항들 전부는 임의의 그리고 모든 변형 형태로 조합될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타내어지는 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

ATCC PTA-11918 20110601 ATCC PTA-11919 20110601

SEQUENCE LISTING <110> BUTAMAX(TM) Advanced Biofuels <120> YEAST PRODUCTION CULTURE FOR THE PRODUCTION OF BUTANOL <130> CL4590 <150> US 61/355,733 <151> 2010-06-17 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1680 <212> DNA <213> K. pneumoniae <400> 1 atggacaaac agtatccggt acgccagtgg gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagtcag 60 ctggaagctc agggagtacg ccaggtgttc ggcatccccg gcgccaaaat cgacaaggtc 120 tttgattcac tgctggattc ctccattcgc attattccgg tacgccacga agccaacgcc 180 gcatttatgg ccgccgccgt cggacgcatt accggcaaag cgggcgtggc gctggtcacc 240 tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc ggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgac 300 ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtaaaa cgcgccgata aagcgaagca ggtccaccag 360 agtatggata cggtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccatcga ggtgacggcg 420 ccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaac gccttccgcg ccgccgagca gggccggccg 480 ggcagcgcgt tcgttagcct gccgcaggat gtggtcgatg gcccggtcag cggcaaagtg 540 ctgccggcca gcggggcccc gcagatgggc gccgcgccgg atgatgccat cgaccaggtg 600 gcgaagctta tcgcccaggc gaagaacccg atcttcctgc tcggcctgat ggccagccag 660 ccggaaaaca gcaaggcgct gcgccgtttg ctggagacca gccatattcc agtcaccagc 720 acctatcagg ccgccggagc ggtgaatcag gataacttct ctcgcttcgc cggccgggtt 780 gggctgttta acaaccaggc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840 atcggctaca gcccggtgga atacgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900 gtgcacatcg acgtgctgcc cgcctatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960 gtgggcgata tcgccggcac tctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca tcggctggtg 1020 ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080 cgccgcggcg cgcagctcaa ccagtttgcc ctgcatcccc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140 caggatatcg tcaacagcga cgtcacgttg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200 attgcccgct acctgtacac gttccgcgcc cgtcaggtga tgatctccaa cggccagcag 1260 accatgggcg tcgccctgcc ctgggctatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgcaaa 1320 gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380 gtccgcctga aagccaacgt gctgcatctt atctgggtcg ataacggcta caacatggtc 1440 gctatccagg aagagaaaaa atatcagcgc ctgtccggcg tcgagtttgg gccgatggat 1500 tttaaagcct atgccgaatc cttcggcgcg aaagggtttg ccgtggaaag cgccgaggcg 1560 ctggagccga ccctgcgcgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtagt ggccatcccg 1620 gtggattatc gcgataaccc gctgctgatg ggccagctgc atctgagtca gattctgtaa 1680 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> K. pneumoniae <400> 2 Met Asp Lys Gln Tyr Pro Val Arg Gln Trp Ala His Gly Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Val Ser Gln Leu Glu Ala Gln Gly Val Arg Gln Val Phe Gly Ile 20 25 30 Pro Gly Ala Lys Ile Asp Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asp Ser Ser 35 40 45 Ile Arg Ile Ile Pro Val Arg His Glu Ala Asn Ala Ala Phe Met Ala 50 55 60 Ala Ala Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Ala Gly Val Ala Leu Val Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Gly Cys Ser Asn Leu Ile Thr Gly Met Ala Thr Ala Asn 85 90 95 Ser Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Gly Gly Ala Val Lys Arg Ala 100 105 110 Asp Lys Ala Lys Gln Val His Gln Ser Met Asp Thr Val Ala Met Phe 115 120 125 Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Ile Glu Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu 130 135 140 Ala Glu Val Val Ser Asn Ala Phe Arg Ala Ala 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aactcatgaa aacgaaagct ctctag 1716 <210> 4 <211> 571 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Met Leu Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His 20 25 30 Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu 35 40 45 Gln Asp Lys Gly Pro Glu Ile Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala 50 55 60 Ala Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val 65 70 75 80 Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly Asn 100 105 110 Val Ile Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Leu Asp Asn 115 120 125 Ala Ala Leu Phe Gln Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Val Glu Val Gln Asp 130 135 140 Val Lys Asn Ile Pro Glu Ala Val Thr Asn Ala Phe Arg Ile Ala Ser 145 150 155 160 Ala Gly Gln Ala Gly Ala Ala Phe Val Ser Phe Pro Gln Asp Val Val 165 170 175 Asn Glu Val Thr Asn Thr Lys Asn Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Lys 180 185 190 Leu 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tggtgatatc 960 gcagcaacat tggataatct tttaccagct gttcgtggct acaaaattcc aaaaggaaca 1020 aaagattatc tcgatggcct tcatgaagtt gctgagcaac acgaatttga tactgaaaat 1080 actgaagaag gtagaatgca ccctcttgat ttggtcagca ctttccaaga aatcgtcaag 1140 gatgatgaaa cagtaaccgt tgacgtaggt tcactctaca tttggatggc acgtcatttc 1200 aaatcatacg aaccacgtca tctcctcttc tcaaacggaa tgcaaacact cggagttgca 1260 cttccttggg caattacagc cgcattgttg cgcccaggta aaaaagttta ttcacactct 1320 ggtgatggag gcttcctttt cacagggcaa gaattggaaa cagctgtacg tttgaatctt 1380 ccaatcgttc aaattatctg gaatgacggc cattatgata tggttaaatt ccaagaagaa 1440 atgaaatatg gtcgttcagc agccgttgat tttggctatg ttgattacgt aaaatatgct 1500 gaagcaatga gagcaaaagg ttaccgtgca cacagcaaag aagaacttgc tgaaattctc 1560 aaatcaatcc cagatactac tggaccggtg gtaattgacg ttcctttgga ctattctgat 1620 aacattaaat tagcagaaaa attattgcct gaagagtttt attga 1665 <210> 6 <211> 554 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 6 Met Ser Glu Lys Gln Phe Gly Ala Asn Leu Val Val Asp Ser Leu Ile 1 5 10 15 Asn His Lys 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Asp Tyr Leu Phe Asn Ala Leu Ile Asp Asp Gly Pro Glu Leu Ile Val 35 40 45 act cgt cat gaa caa aat gct gca atg atg gca caa ggt att gga aga 192 Thr Arg His Glu Gln Asn Ala Ala Met Met Ala Gln Gly Ile Gly Arg 50 55 60 tta aca ggt aaa ccg ggt gta gta ctt gtt aca agt ggc cct ggt gta 240 Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Val 65 70 75 80 agt aat tta acg act gga cta tta aca gct aca tct gaa ggg gat cct 288 Ser Asn Leu Thr Thr Gly Leu Leu Thr Ala Thr Ser Glu Gly Asp Pro 85 90 95 gta tta gcg tta ggt ggc caa gtg aaa cgt aat gat tta tta cga tta 336 Val Leu Ala Leu Gly Gly Gln Val Lys Arg Asn Asp Leu Leu Arg Leu 100 105 110 acg cat caa agt att gat aat gct gcg cta tta aaa tat tca tca aaa 384 Thr His Gln Ser Ile Asp Asn Ala Ala Leu Leu Lys Tyr Ser Ser Lys 115 120 125 tac agt gaa gaa gta caa gat cct gaa tca tta tca gaa gtt atg aca 432 Tyr Ser Glu Glu Val Gln Asp Pro Glu Ser Leu Ser Glu Val Met Thr 130 135 140 aat gca att cga att gct act tca gga aaa aat ggc gca agt ttt att 480 Asn Ala Ile Arg Ile Ala Thr Ser Gly Lys Asn Gly Ala Ser Phe Ile 145 150 155 160 agt att ccg caa gac gtt att tct tca cca gtt gaa tct aaa gct ata 528 Ser Ile Pro Gln Asp Val Ile Ser Ser Pro Val Glu Ser Lys Ala Ile 165 170 175 tca ctt tgc caa aaa cca aat tta gga gta ccg agt gaa caa gat att 576 Ser Leu Cys Gln Lys Pro Asn Leu Gly Val Pro Ser Glu Gln Asp Ile 180 185 190 aat gat gtc att gaa gcg att aaa aat gca tca ttt cct gtt tta tta 624 Asn Asp Val Ile Glu Ala Ile Lys Asn Ala Ser Phe Pro Val Leu Leu 195 200 205 gct ggt atg aga agt tca agt gca gaa gaa aca aat gcc att cgc aaa 672 Ala Gly Met Arg Ser Ser Ser Ala Glu Glu Thr Asn Ala Ile Arg Lys 210 215 220 tta gtt gag cgc acg aat tta cca gtt gta gaa aca ttc caa ggt gca 720 Leu Val Glu Arg Thr Asn Leu Pro Val Val Glu Thr Phe Gln Gly Ala 225 230 235 240 ggt gta att agt cgt gaa tta gaa aat cat ttc ttc ggt cgt gtg ggc 768 Gly Val Ile Ser Arg Glu Leu Glu Asn His Phe Phe Gly Arg Val Gly 245 250 255 tta ttc cgc aat caa gtt ggt gat gaa tta tta cgt aaa agt gat tta 816 Leu Phe Arg Asn Gln Val Gly Asp Glu Leu Leu Arg Lys Ser Asp Leu 260 265 270 gtt gtt aca atc ggt tat gat cca att gaa tac gaa gct agt aac tgg 864 Val Val Thr Ile Gly Tyr Asp Pro Ile Glu Tyr Glu Ala Ser Asn Trp 275 280 285 aat aaa gaa tta gaa aca caa att atc aat att gac gaa gtt caa gct 912 Asn Lys Glu Leu Glu Thr Gln Ile Ile Asn Ile Asp Glu Val Gln Ala 290 295 300 gaa att act aat tat atg caa ccg aaa aaa gag ttg att ggt aat att 960 Glu Ile Thr Asn Tyr Met Gln Pro Lys Lys Glu Leu Ile Gly Asn Ile 305 310 315 320 gct aaa acg att gaa atg att tct gaa aaa gtg gat gag cca ttt ata 1008 Ala Lys Thr Ile Glu Met Ile Ser Glu Lys Val Asp Glu Pro Phe Ile 325 330 335 aat caa caa cat tta gac gaa tta gaa caa tta aga aca cat att gat 1056 Asn Gln Gln His Leu Asp Glu Leu Glu Gln Leu Arg Thr His Ile Asp 340 345 350 gaa gaa act ggt att aaa gcg acg cat gaa gaa gga att cta cat cca 1104 Glu Glu Thr Gly Ile Lys Ala Thr His Glu Glu Gly Ile Leu His Pro 355 360 365 gtg gaa att att gaa tct atg caa aag gta tta act gat gat act act 1152 Val Glu Ile Ile Glu Ser Met Gln Lys Val Leu Thr Asp Asp Thr Thr 370 375 380 gta aca gtt gat gtt gga agt cac tat att tgg atg gca cgt aat ttc 1200 Val Thr Val Asp Val Gly Ser His Tyr Ile Trp Met Ala Arg Asn Phe 385 390 395 400 aga agt tac aat cca aga cat tta tta ttt agc aat ggt atg caa acg 1248 Arg Ser Tyr Asn Pro Arg His Leu Leu Phe Ser Asn Gly Met Gln Thr 405 410 415 ctt ggt gta gca tta ccg tgg gca att tca gct gca ctt gtg cgc cct 1296 Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Ala Leu Val Arg Pro 420 425 430 aat acg caa gtt gtg tcc gtt gct ggc gat ggt ggc ttt tta ttt tca 1344 Asn Thr Gln Val Val Ser Val Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser 435 440 445 tca caa gat tta gaa acg gcc gta cgt aaa aat tta aat atc atc cag 1392 Ser Gln Asp Leu Glu Thr Ala Val Arg Lys Asn Leu Asn Ile Ile Gln 450 455 460 ctt att tgg aat gat gga aaa tat aac atg gtt gaa ttc caa gaa gaa 1440 Leu Ile Trp Asn Asp Gly Lys Tyr Asn Met Val Glu Phe Gln Glu Glu 465 470 475 480 atg aaa tat aaa cgt tcg tca ggt gta gac ttc ggt cct gta gat ttt 1488 Met Lys Tyr Lys Arg Ser Ser Gly Val Asp Phe Gly Pro Val Asp Phe 485 490 495 gta aaa tat gca gaa tca ttt ggc gcg aaa ggt tta cga gtt act aat 1536 Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Leu Arg Val Thr Asn 500 505 510 caa gaa gaa tta gaa gcg gca att aaa gag ggc tat gaa aca gat ggt 1584 Gln Glu Glu Leu Glu Ala Ala Ile Lys Glu Gly Tyr Glu Thr Asp Gly 515 520 525 cca gta tta att gat ata cct gta aat tac aaa gat aat atc aaa ctt 1632 Pro Val Leu Ile Asp Ile Pro Val Asn Tyr Lys Asp Asn Ile Lys Leu 530 535 540 tca aca aat atg tta cct gac gta ttt aac taa 1665 Ser Thr Asn Met Leu Pro Asp Val Phe Asn 545 550 <210> 8 <211> 554 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8 Met Thr Asp Lys Lys Tyr Thr Ala Ala Asp Met Val Ile Asp Thr Leu 1 5 10 15 Lys Asn Asn Gly Val Glu Tyr Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile 20 25 30 Asp Tyr Leu Phe Asn Ala Leu Ile Asp Asp Gly Pro Glu Leu Ile Val 35 40 45 Thr Arg His Glu Gln Asn Ala Ala Met Met Ala Gln Gly Ile Gly Arg 50 55 60 Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Leu Thr Thr Gly Leu Leu Thr Ala Thr Ser Glu Gly Asp Pro 85 90 95 Val Leu Ala Leu Gly Gly Gln Val Lys Arg Asn Asp Leu Leu Arg Leu 100 105 110 Thr His Gln Ser Ile Asp Asn Ala Ala Leu Leu Lys Tyr Ser Ser Lys 115 120 125 Tyr Ser Glu Glu Val Gln Asp Pro Glu Ser Leu Ser Glu Val Met Thr 130 135 140 Asn Ala Ile Arg Ile Ala Thr Ser Gly Lys Asn Gly Ala Ser Phe Ile 145 150 155 160 Ser Ile Pro Gln Asp Val Ile Ser Ser Pro Val Glu Ser Lys Ala Ile 165 170 175 Ser Leu Cys Gln Lys Pro Asn Leu Gly Val Pro Ser Glu Gln Asp Ile 180 185 190 Asn Asp Val Ile Glu Ala Ile Lys Asn Ala Ser Phe Pro Val Leu Leu 195 200 205 Ala Gly Met Arg Ser Ser Ser Ala Glu Glu Thr Asn Ala Ile Arg Lys 210 215 220 Leu Val Glu Arg Thr Asn Leu Pro Val Val Glu Thr Phe Gln Gly Ala 225 230 235 240 Gly Val Ile Ser Arg Glu Leu Glu Asn His Phe Phe Gly Arg Val Gly 245 250 255 Leu Phe Arg Asn Gln Val Gly Asp Glu Leu Leu Arg Lys Ser Asp Leu 260 265 270 Val Val Thr Ile Gly Tyr Asp Pro Ile Glu Tyr Glu Ala Ser Asn Trp 275 280 285 Asn Lys Glu Leu Glu Thr Gln Ile Ile Asn Ile Asp Glu Val Gln Ala 290 295 300 Glu Ile Thr Asn Tyr Met Gln Pro Lys Lys Glu Leu Ile Gly Asn Ile 305 310 315 320 Ala Lys Thr Ile Glu Met Ile Ser Glu Lys Val Asp Glu Pro Phe Ile 325 330 335 Asn Gln Gln His Leu Asp Glu Leu Glu Gln Leu Arg Thr His Ile Asp 340 345 350 Glu Glu Thr Gly Ile Lys Ala Thr His Glu Glu Gly Ile Leu His Pro 355 360 365 Val Glu Ile Ile Glu Ser Met Gln Lys Val Leu Thr Asp Asp Thr Thr 370 375 380 Val Thr Val Asp Val Gly Ser His Tyr Ile Trp Met Ala Arg Asn Phe 385 390 395 400 Arg Ser Tyr Asn Pro Arg His Leu Leu Phe Ser Asn Gly Met Gln Thr 405 410 415 Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Ala Leu Val Arg Pro 420 425 430 Asn Thr Gln Val Val Ser Val Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser 435 440 445 Ser Gln Asp Leu Glu Thr Ala Val Arg Lys Asn Leu Asn Ile Ile Gln 450 455 460 Leu Ile Trp Asn Asp Gly Lys Tyr Asn Met Val Glu Phe Gln Glu Glu 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Ser Arg His Glu Gln Asn 50 55 60 gcg gcg ttt atg gct gct gct atc ggt cgt cta acc ggg aaa cct ggt 240 Ala Ala Phe Met Ala Ala Ala Ile Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 gtt gta ctt gta act agt gga cct ggc gca tcg aat ctt gca aca ggg 288 Val Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly 85 90 95 ctt gta acc gca act gca gaa gga gat cca gtc gtt gcg att gct ggt 336 Leu Val Thr Ala Thr Ala Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Ile Ala Gly 100 105 110 aac gta aca agg caa gac cgc tta aaa aga acc cac caa tca atg gat 384 Asn Val Thr Arg Gln Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Met Asp 115 120 125 aat gca gca ctt ttc cgt ccg att aca aaa tac agc gaa gaa gta gtt 432 Asn Ala Ala Leu Phe Arg Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Glu Glu Val Val 130 135 140 cac gcc gaa agt att cca gaa gca atc act aac gct ttt cgc tcg gca 480 His Ala Glu Ser Ile Pro Glu Ala Ile Thr Asn Ala Phe Arg Ser Ala 145 150 155 160 aca gaa cca aac caa ggc gct gct ttt gtc agt ttg cca caa gat atc 528 Thr Glu Pro Asn Gln Gly Ala Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Ile 165 170 175 gtg aac gaa cca aac gta cca gta aaa gcg att cgc cca ctt gct aaa 576 Val Asn Glu Pro Asn Val Pro Val Lys Ala Ile Arg Pro Leu Ala Lys 180 185 190 cca gaa aat ggt cct gct tcc aaa gaa caa gtt gca aaa ctt gtt aca 624 Pro Glu Asn Gly Pro Ala Ser Lys Glu Gln Val Ala Lys Leu Val Thr 195 200 205 cgt ttg aaa aaa gcg aaa tta ccg gta ttg cta ttg ggt atg cga gca 672 Arg Leu Lys Lys Ala Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Met Arg Ala 210 215 220 tct agt cca gaa gta act ggt gca att cgt cgc tta ctc caa aaa aca 720 Ser Ser Pro Glu Val Thr Gly Ala Ile Arg Arg Leu Leu Gln Lys Thr 225 230 235 240 agt atc cca gta gta gaa act ttc caa gca gct ggc gtc att tca cgc 768 Ser Ile Pro Val Val Glu Thr Phe Gln Ala Ala Gly Val Ile Ser Arg 245 250 255 gac tta gaa gat aac ttc ttt gga cgt gtt ggt ctg ttc cgc aac caa 816 Asp Leu Glu Asp Asn Phe Phe Gly Arg Val Gly Leu Phe Arg Asn Gln 260 265 270 cca ggg gat att ttg tta aat aaa gct gat tta gtt att aca gtg ggt 864 Pro Gly Asp Ile Leu Leu Asn Lys Ala Asp Leu Val Ile Thr Val Gly 275 280 285 tat gat cca att gaa tac gat cca aaa gct tgg aat gcc tct ggt gat 912 Tyr Asp Pro Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Ala Trp Asn Ala Ser Gly Asp 290 295 300 aga acg att gtc cat tta gac gac att cgc gct gat att gat cat tat 960 Arg Thr Ile Val His Leu Asp Asp Ile Arg Ala Asp Ile Asp His Tyr 305 310 315 320 tac caa cca gtg aca gag cta gtc gga aac atc gcg ctt act tta gac 1008 Tyr Gln Pro Val Thr Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala Leu Thr Leu Asp 325 330 335 cga gtg aat gcg aaa ttc agc ggt tta gaa tta gcg gaa aaa gaa ctt 1056 Arg Val Asn Ala Lys Phe Ser Gly Leu Glu Leu Ala Glu Lys Glu Leu 340 345 350 gaa aca tta aaa gaa ctt cat gct caa tta gaa gag cga gat gtt ccg 1104 Glu Thr Leu Lys Glu Leu His Ala Gln Leu Glu Glu Arg Asp Val Pro 355 360 365 cca gaa agt gat gaa act aac cga gta cat cca ttg tcg gtc att caa 1152 Pro Glu Ser Asp Glu Thr Asn Arg Val His Pro Leu Ser Val Ile Gln 370 375 380 aca cta cgt tcg gca att gat gac aac gta act gtg aca gtc gac gtt 1200 Thr Leu Arg Ser Ala Ile Asp Asp Asn Val Thr Val Thr Val Asp Val 385 390 395 400 ggt tca cat tat att tgg atg gca cgt cat ttc cgc tcc tat gaa cca 1248 Gly Ser His Tyr Ile Trp Met Ala Arg His Phe Arg Ser Tyr Glu Pro 405 410 415 cgc cgt ctg ctt ttc agt aac ggt atg caa acg ctt ggt gtt gcg ctt 1296 Arg Arg Leu Leu Phe Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu 420 425 430 cct tgg gga att gct gca aca ctt gta cat ccg ggt gaa aaa gtg gtt 1344 Pro Trp Gly Ile Ala Ala Thr Leu Val His Pro Gly Glu Lys Val Val 435 440 445 tcg att tct ggt gac ggt ggt ttc tta ttt tcc gcg atg gaa tta gaa 1392 Ser Ile Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu 450 455 460 aca gct gtc cgc ttg cgt gcg cca ctt gta cac cta gta tgg aat gac 1440 Thr Ala Val Arg Leu Arg Ala Pro Leu Val His Leu Val Trp Asn Asp 465 470 475 480 gga agc tat gac atg gtt gct ttc caa caa aaa atg aaa tac ggc aaa 1488 Gly Ser Tyr Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Lys Met Lys Tyr Gly Lys 485 490 495 gaa gca gct gtt cgt ttt ggc gat gtt gat atc gta 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Lys Pro Gly 65 70 75 80 Val Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly 85 90 95 Leu Val Thr Ala Thr Ala Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Ile Ala Gly 100 105 110 Asn Val Thr Arg Gln Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Met Asp 115 120 125 Asn Ala Ala Leu Phe Arg Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Glu Glu Val Val 130 135 140 His Ala Glu Ser Ile Pro Glu Ala Ile Thr Asn Ala Phe Arg Ser Ala 145 150 155 160 Thr Glu Pro Asn Gln Gly Ala Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Ile 165 170 175 Val Asn Glu Pro Asn Val Pro Val Lys Ala Ile Arg Pro Leu Ala Lys 180 185 190 Pro Glu Asn Gly Pro Ala Ser Lys Glu Gln Val Ala Lys Leu Val Thr 195 200 205 Arg Leu Lys Lys Ala Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Met Arg Ala 210 215 220 Ser Ser Pro Glu Val Thr Gly Ala Ile Arg Arg Leu Leu Gln Lys Thr 225 230 235 240 Ser Ile Pro Val Val Glu Thr Phe Gln Ala Ala Gly Val Ile Ser Arg 245 250 255 Asp Leu Glu Asp Asn Phe Phe Gly Arg Val Gly Leu Phe Arg Asn Gln 260 265 270 Pro Gly Asp Ile Leu Leu Asn Lys Ala Asp Leu Val Ile Thr Val Gly 275 280 285 Tyr Asp Pro Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Ala Trp Asn Ala Ser Gly Asp 290 295 300 Arg Thr Ile Val His Leu Asp Asp Ile Arg Ala Asp Ile Asp His Tyr 305 310 315 320 Tyr Gln Pro Val Thr Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala Leu Thr Leu Asp 325 330 335 Arg Val Asn Ala Lys Phe Ser Gly Leu Glu Leu Ala Glu Lys Glu Leu 340 345 350 Glu Thr Leu Lys Glu Leu His Ala Gln Leu Glu Glu Arg Asp Val Pro 355 360 365 Pro Glu Ser Asp Glu Thr Asn Arg Val His Pro Leu Ser Val Ile Gln 370 375 380 Thr Leu Arg Ser Ala Ile Asp Asp Asn Val Thr Val Thr Val Asp Val 385 390 395 400 Gly Ser His Tyr Ile Trp Met Ala Arg His Phe Arg Ser Tyr Glu Pro 405 410 415 Arg Arg Leu Leu Phe Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu 420 425 430 Pro Trp Gly Ile Ala Ala Thr Leu Val His Pro Gly Glu Lys Val Val 435 440 445 Ser Ile Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu 450 455 460 Thr Ala Val Arg Leu Arg Ala Pro Leu Val His Leu Val Trp Asn Asp 465 470 475 480 Gly Ser Tyr Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Lys Met Lys Tyr Gly 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Ile 50 55 60 ggc cgt att act ggt gag cct ggt gtt gtg att aca acc agc ggt ccc 240 Gly Arg Ile Thr Gly Glu Pro Gly Val Val Ile Thr Thr Ser Gly Pro 65 70 75 80 ggt gtt tcc aat ctg gtg act ggt ctt gtt act gcg aca gct gag gga 288 Gly Val Ser Asn Leu Val Thr Gly Leu Val Thr Ala Thr Ala Glu Gly 85 90 95 gat cct gtc ctt gct att ggt ggt cag gtt aaa cgt gct gat ttg ctc 336 Asp Pro Val Leu Ala Ile Gly Gly Gln Val Lys Arg Ala Asp Leu Leu 100 105 110 aaa cgg gct cac cag tca atg aat aat gtt gct atg ctc gat ccc att 384 Lys Arg Ala His Gln Ser Met Asn Asn Val Ala Met Leu Asp Pro Ile 115 120 125 acc aaa tat tca gca gaa att cag gat ccc gca aca ctt tca gaa aat 432 Thr Lys Tyr Ser Ala Glu Ile Gln Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Asn 130 135 140 att gct aat gcc tat cgt ttg gct aaa gca gga aag ccg gga gct agt 480 Ile Ala Asn Ala Tyr Arg Leu Ala Lys Ala Gly Lys Pro Gly Ala Ser 145 150 155 160 ttc tta tct att cct caa gat ata act gat agt cct gtt act gtc aag 528 Phe Leu Ser Ile Pro Gln Asp Ile Thr Asp Ser Pro Val 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Asp Val Gly Ser His Tyr Ile Trp Met Ala 385 390 395 400 cgt tat ttt aaa agc tat gaa gca cgg cac tta ctt ttc tca aat ggt 1248 Arg Tyr Phe Lys Ser Tyr Glu Ala Arg His Leu Leu Phe Ser Asn Gly 405 410 415 atg caa acc tta ggt gtt gct ttg cct tgg gca att tcg gca gct ctt 1296 Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Ala Leu 420 425 430 gta cgg cca aat gag aag att att tct att tca ggt gat ggt ggt ttc 1344 Val Arg Pro Asn Glu Lys Ile Ile Ser Ile Ser Gly Asp Gly Gly Phe 435 440 445 ctc ttt tct ggc caa gaa ttg gaa aca gct gtt cgt tta cat tta cca 1392 Leu Phe Ser Gly Gln Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu His Leu Pro 450 455 460 att gtt cat atc att tgg aat gat ggt aaa tat aat atg gtt gaa ttc 1440 Ile Val His Ile Ile Trp Asn Asp Gly Lys Tyr Asn Met Val Glu Phe 465 470 475 480 caa gaa gaa atg aaa tac ggc cgt tca gca ggt gtt gat ttt ggt cct 1488 Gln Glu Glu Met Lys Tyr Gly Arg Ser Ala Gly Val Asp Phe Gly Pro 485 490 495 gtt gat ttt gtc aag tat gct gat agt ttc ggt gct aaa ggt tac cgt 1536 Val Asp Phe Val Lys Tyr Ala Asp Ser Phe Gly Ala Lys Gly Tyr Arg 500 505 510 gct gat agt aaa gaa aag ttt gat caa gtt ctt caa aca gca ctc aag 1584 Ala Asp Ser Lys Glu Lys Phe Asp Gln Val Leu Gln Thr Ala Leu Lys 515 520 525 gaa gct gca aat ggc cca gtt ctc att gat gtt cca atg gac tat aaa 1632 Glu Ala Ala Asn Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Met Asp Tyr Lys 530 535 540 gat aat gta aaa ttg ggt gaa act att ttg cct gat gaa ttc tac taa 1680 Asp Asn Val Lys Leu Gly Glu Thr Ile Leu Pro Asp Glu Phe Tyr 545 550 555 <210> 12 <211> 559 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 12 Met Thr Glu Ile Asn Lys Glu Gly Tyr Gly Ala Asp Leu Ile Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Ile Asn His Asp Val Asn Tyr Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala 20 25 30 Lys Ile Asp Arg Val Phe Asp Thr Leu Glu Asp Lys Gly Pro Glu Leu 35 40 45 Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala Ala Phe Met Ala Gln Gly Ile 50 55 60 Gly Arg Ile Thr Gly Glu Pro Gly Val Val Ile Thr Thr Ser Gly Pro 65 70 75 80 Gly Val Ser Asn Leu Val Thr Gly Leu Val Thr Ala Thr Ala Glu 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295 300 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Thr Tyr Phe Gln Pro Glu Arg Glu Leu Ile 305 310 315 320 Gly Asp Ile Ala Glu Thr Leu Asp Leu Leu Leu Pro Ala Ile Ser Gly 325 330 335 Tyr Ser Leu Pro Lys Gly Ser Leu Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Arg Asp 340 345 350 Asn Val Val Glu Asp Val Lys Phe Asp Lys Thr Val Lys Ser Gly Leu 355 360 365 Val His Pro Leu Asp Val Ile Asp Val Leu Gln Lys Gln Thr Thr Asp 370 375 380 Asp Met Thr Val Thr Val Asp Val Gly Ser His Tyr Ile Trp Met Ala 385 390 395 400 Arg Tyr Phe Lys Ser Tyr Glu Ala Arg His Leu Leu Phe Ser Asn Gly 405 410 415 Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Ser Ala Ala Leu 420 425 430 Val Arg Pro Asn Glu Lys Ile Ile Ser Ile Ser Gly Asp Gly Gly Phe 435 440 445 Leu Phe Ser Gly Gln Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu His Leu Pro 450 455 460 Ile Val His Ile Ile Trp Asn Asp Gly Lys Tyr Asn Met Val Glu Phe 465 470 475 480 Gln Glu Glu Met Lys Tyr Gly Arg Ser Ala Gly Val Asp Phe Gly Pro 485 490 495 Val Asp Phe Val Lys Tyr Ala Asp Ser Phe Gly Ala Lys Gly Tyr Arg 500 505 510 Ala Asp Ser Lys Glu Lys Phe Asp Gln Val Leu Gln Thr Ala Leu Lys 515 520 525 Glu Ala Ala Asn Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Met Asp Tyr Lys 530 535 540 Asp Asn Val Lys Leu Gly Glu Thr Ile Leu Pro Asp Glu Phe Tyr 545 550 555 <210> 13 <211> 1683 <212> DNA <213> Streptococcus thermophilus <220> <221> CDS <222> (1)..(1683) <400> 13 gtg ttc atg tca gaa gaa aag caa ttg tat ggt gca gat tta gtg gtt 48 Val Phe Met Ser Glu Glu Lys Gln Leu Tyr Gly Ala Asp Leu Val Val 1 5 10 15 gat agt ttg atc aac cat gat gtt gag tat gtc ttt ggg att cca ggc 96 Asp Ser Leu Ile Asn His Asp Val Glu Tyr Val Phe Gly Ile Pro Gly 20 25 30 gca aaa atc gat agg gtt ttt gat acc ttg gaa gat aag gga cct gaa 144 Ala Lys Ile Asp Arg Val Phe Asp Thr Leu Glu Asp Lys Gly Pro Glu 35 40 45 ttg att gtt gcc cgt cat gag caa aat gct gct ttt atg gct caa ggt 192 Leu Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala Ala Phe Met Ala Gln Gly 50 55 60 gtt gga cgt att act ggg aaa cca ggt gta gta ttg gta aca tct ggt 240 Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu Val Thr Ser Gly 65 70 75 80 cca ggt gtc tcc aat ttg gct act ggt ttg gta aca gcg acg gat gaa 288 Pro Gly Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu Val Thr Ala Thr Asp Glu 85 90 95 gga gac cct gtt ctt gct att ggt ggt cag gtt aag cgt gca gat ctc 336 Gly Asp Pro Val Leu Ala Ile Gly Gly Gln Val Lys Arg Ala Asp Leu 100 105 110 ttg aaa cgt gcc cac caa tca atg aat aac gtt gct atg ctt gag cca 384 Leu Lys Arg Ala His Gln Ser Met Asn Asn Val Ala Met Leu Glu Pro 115 120 125 att acc aaa tat gct gct gaa gta cat gat gct aac acc ctt tct gaa 432 Ile Thr Lys Tyr Ala Ala Glu Val His Asp Ala Asn Thr Leu Ser Glu 130 135 140 acg gtt gct aat gcc tat cgt cac gct aag tca ggg aaa cca ggt gca 480 Thr Val Ala Asn Ala Tyr Arg His Ala Lys Ser Gly Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 agc ttc att tca att cct caa gac gtg acg gat gct ccg gtc agt gtt 528 Ser Phe Ile Ser Ile Pro Gln Asp Val Thr Asp Ala Pro Val Ser Val 165 170 175 aag gct att aag cct atg aca gat cca aaa ctt ggt tca gca tct gtt 576 Lys Ala Ile Lys Pro Met Thr Asp Pro Lys Leu Gly Ser Ala Ser Val 180 185 190 tct gat att aac tat cta gca caa gcc att aaa aat gca gtg ttg cca 624 Ser Asp Ile Asn Tyr Leu Ala Gln Ala Ile Lys Asn Ala Val Leu Pro 195 200 205 gtc ttt ctt ttg ggg aat ggt gcc tca tca gaa gcc gta act tac tct 672 Val Phe Leu Leu Gly Asn Gly Ala Ser Ser Glu Ala Val Thr Tyr Ser 210 215 220 att cgc caa att ttg aag cat gtt aaa ttg cca gtt gtt gaa act ttc 720 Ile Arg Gln Ile Leu Lys His Val Lys Leu Pro Val Val Glu Thr Phe 225 230 235 240 caa ggt gcc ggt atc gtg tca cgt gac ctt gaa gaa gat act ttc ttt 768 Gln Gly Ala Gly Ile Val Ser Arg Asp Leu Glu Glu Asp Thr Phe Phe 245 250 255 ggt cgt gta ggt ctt ttc cgt aac caa ccc gga gac atg ttg ctt aaa 816 Gly Arg Val Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly Asp Met Leu Leu Lys 260 265 270 aaa tcc gac tta gtt att gcc att ggt tat gat cca atc gaa tat gaa 864 Lys Ser Asp Leu Val Ile Ala Ile Gly Tyr Asp Pro Ile Glu Tyr Glu 275 280 285 gca cgt aac tgg aat gct gaa att tca gca cgt atc atc gtt att gat 912 Ala Arg Asn Trp Asn Ala Glu Ile Ser Ala Arg Ile Ile Val Ile Asp 290 295 300 gtc gag ccg gcc gag gtg gac act tac ttc caa ccg gaa cgt gaa ttg 960 Val Glu Pro Ala Glu Val Asp Thr Tyr Phe Gln Pro Glu Arg Glu Leu 305 310 315 320 att ggt aat gta gaa gcg agc tta gac ttg ctt ttg ccc gct att caa 1008 Ile Gly Asn Val Glu Ala Ser Leu Asp Leu Leu Leu Pro Ala Ile Gln 325 330 335 ggt tat aaa ttg cct gaa ggt gcg gtt gaa tat ctt aaa ggt ttg aaa 1056 Gly Tyr Lys Leu Pro Glu Gly Ala Val Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Lys 340 345 350 aac aat gtt gtt gag gat gtt aag ttt gac cgt cag cct gat gaa ggt 1104 Asn Asn Val Val Glu Asp Val Lys Phe Asp Arg Gln Pro Asp Glu Gly 355 360 365 acg gtg cat ccg cta gat ttc atc gaa aat ttg caa gaa cac aca gat 1152 Thr Val His Pro Leu Asp Phe Ile Glu Asn Leu Gln Glu His Thr Asp 370 375 380 gat gat atg act gtt acg ttt gat gtt ggt agt cac tat att tgg atg 1200 Asp Asp Met Thr Val Thr Phe Asp Val Gly Ser His Tyr Ile Trp Met 385 390 395 400 gca cgt tat ctc aaa tcg tat gaa cca cgt cat ttg ctt ttc tca aat 1248 Ala Arg Tyr Leu Lys Ser Tyr Glu Pro Arg His Leu Leu Phe Ser Asn 405 410 415 ggg atg caa acg ata ggt att gct att aca tgg gct atc tct gca gca 1296 Gly Met Gln Thr Ile Gly Ile Ala Ile Thr Trp Ala Ile Ser Ala Ala 420 425 430 ttg gtt cgt cct aag aca aaa gtg att tct gta tct ggt gat ggt ggt 1344 Leu Val Arg Pro Lys Thr Lys Val Ile Ser Val Ser Gly Asp Gly Gly 435 440 445 ttc ctc ttc tca gca caa gaa ttg gaa aca gca gtt cgt ttg aaa ttg 1392 Phe Leu Phe Ser Ala Gln Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu Lys Leu 450 455 460 cca att gtc cat att atc tgg aac gat ggt cat tac aat atg gtg gaa 1440 Pro Ile Val His Ile Ile Trp Asn Asp Gly His Tyr Asn Met Val Glu 465 470 475 480 ttc cag gaa gaa atg aag tac ggt cgt tca tct ggg gtt gac ttt ggt 1488 Phe Gln Glu Glu Met Lys Tyr Gly Arg Ser Ser Gly Val Asp Phe Gly 485 490 495 cct gta gat ttt gta aaa tat gct gag agc ttt gga gcc aaa ggt tat 1536 Pro Val Asp Phe Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Tyr 500 505 510 cgt gca aca agt aaa gca gcg ttt gct agc ttg ctt caa gag gct ttg 1584 Arg Ala Thr Ser Lys Ala Ala Phe Ala Ser Leu Leu Gln Glu Ala Leu 515 520 525 act cag gct gta gat gga cca gtc ctt att gat gtt cca att gac tat 1632 Thr Gln Ala Val Asp Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Ile Asp Tyr 530 535 540 aaa gat aac att aaa ctc ggc gaa act att ttg cca gat gaa ttt tac 1680 Lys Asp Asn Ile Lys Leu Gly Glu Thr Ile Leu Pro Asp Glu Phe Tyr 545 550 555 560 taa 1683 <210> 14 <211> 560 <212> PRT <213> Streptococcus thermophilus <400> 14 Val Phe Met Ser Glu Glu Lys Gln Leu Tyr Gly Ala Asp Leu Val Val 1 5 10 15 Asp Ser Leu Ile Asn His Asp Val Glu Tyr Val Phe Gly Ile Pro Gly 20 25 30 Ala Lys Ile Asp Arg Val Phe Asp Thr Leu Glu Asp Lys Gly Pro Glu 35 40 45 Leu Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala Ala Phe Met Ala Gln Gly 50 55 60 Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Pro Gly Val Val Leu Val Thr Ser Gly 65 70 75 80 Pro Gly Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu Val Thr Ala Thr Asp Glu 85 90 95 Gly Asp Pro Val Leu Ala Ile Gly Gly Gln Val Lys Arg Ala Asp Leu 100 105 110 Leu Lys Arg Ala His Gln Ser Met Asn Asn Val Ala Met Leu Glu Pro 115 120 125 Ile Thr Lys Tyr Ala Ala Glu Val His Asp Ala Asn Thr Leu Ser Glu 130 135 140 Thr Val Ala Asn Ala Tyr Arg His Ala Lys Ser Gly Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Phe Ile Ser Ile Pro Gln Asp Val Thr Asp Ala Pro Val Ser Val 165 170 175 Lys Ala Ile Lys Pro Met Thr Asp Pro Lys Leu Gly Ser Ala Ser Val 180 185 190 Ser Asp Ile Asn Tyr Leu Ala Gln Ala Ile Lys Asn Ala Val Leu Pro 195 200 205 Val Phe Leu Leu Gly Asn Gly Ala Ser Ser Glu Ala Val Thr Tyr Ser 210 215 220 Ile Arg Gln Ile Leu Lys His Val Lys Leu Pro Val Val Glu Thr Phe 225 230 235 240 Gln Gly Ala Gly Ile Val Ser Arg Asp Leu Glu Glu Asp Thr Phe Phe 245 250 255 Gly Arg Val Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly Asp Met Leu Leu Lys 260 265 270 Lys Ser Asp Leu Val Ile Ala Ile Gly Tyr Asp Pro Ile Glu Tyr Glu 275 280 285 Ala Arg Asn Trp Asn Ala Glu Ile Ser Ala Arg Ile Ile Val Ile Asp 290 295 300 Val Glu Pro Ala Glu Val Asp Thr Tyr Phe Gln Pro Glu Arg Glu Leu 305 310 315 320 Ile Gly Asn Val Glu Ala Ser Leu Asp Leu Leu Leu Pro Ala Ile Gln 325 330 335 Gly Tyr Lys Leu Pro Glu Gly Ala Val Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Lys 340 345 350 Asn Asn Val Val Glu Asp Val Lys Phe Asp Arg Gln Pro Asp Glu Gly 355 360 365 Thr Val His Pro Leu Asp Phe Ile Glu Asn Leu Gln Glu His Thr Asp 370 375 380 Asp Asp Met Thr Val Thr Phe Asp Val Gly Ser His Tyr Ile Trp Met 385 390 395 400 Ala Arg Tyr Leu Lys Ser Tyr Glu Pro Arg His Leu Leu Phe Ser Asn 405 410 415 Gly Met Gln Thr Ile Gly Ile Ala Ile Thr Trp Ala Ile Ser Ala Ala 420 425 430 Leu Val Arg Pro Lys Thr Lys Val Ile Ser Val Ser Gly Asp Gly Gly 435 440 445 Phe Leu Phe Ser Ala Gln Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu Lys Leu 450 455 460 Pro Ile Val His Ile Ile Trp Asn Asp Gly His Tyr Asn Met Val Glu 465 470 475 480 Phe Gln Glu Glu Met Lys Tyr Gly Arg Ser Ser Gly Val Asp Phe Gly 485 490 495 Pro Val Asp Phe Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Tyr 500 505 510 Arg Ala Thr Ser Lys Ala Ala Phe Ala Ser Leu Leu Gln Glu Ala Leu 515 520 525 Thr Gln Ala Val Asp Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Ile Asp Tyr 530 535 540 Lys Asp Asn Ile Lys Leu Gly Glu Thr Ile Leu Pro Asp Glu Phe Tyr 545 550 555 560 <210> 15 <211> 1665 <212> DNA <213> Vibrio angustum <220> <221> CDS <222> (1)..(1665) <400> 15 atg tcg gat aaa acc gtc tct ggt gct gaa ctg gtt gtt gaa act tta 48 Met Ser Asp Lys Thr Val Ser Gly Ala Glu Leu Val Val Glu Thr Leu 1 5 10 15 aat gca cat aac gtt cca cac att ttt ggt att cct gga gca aag gtg 96 Asn Ala His Asn Val Pro His Ile Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Val 20 25 30 gat gct gtt ttc gat gct gtt tgt gat aac gga cca gaa atc att att 144 Asp Ala Val Phe Asp Ala Val Cys Asp Asn Gly Pro Glu Ile Ile Ile 35 40 45 tgt cat cat gaa caa aat gca gcg ttt atg gca gca gca act ggg cgt 192 Cys His His Glu Gln Asn Ala Ala Phe Met Ala Ala Ala Thr Gly Arg 50 55 60 tta acg ggt aaa gca ggc att tgt tta gca acc tct gga cca ggc gca 240 Leu Thr Gly Lys Ala Gly Ile Cys Leu Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala 65 70 75 80 tca aac ctt gtc aca ggc gtt gca aca gcg aat agt gaa ggt gat cct 288 Ser Asn Leu Val Thr Gly Val Ala Thr Ala Asn Ser Glu Gly Asp Pro 85 90 95 gtg gtt gca ctt gca ggt gct gta cct ctt tct atg tat tct cac aat 336 Val Val Ala Leu Ala Gly Ala Val Pro Leu Ser Met Tyr Ser His Asn 100 105 110 act cat caa tcc atg gat acc cgt tca ctg ttt act cct atc acc aag 384 Thr His Gln Ser Met Asp Thr Arg Ser Leu Phe Thr Pro Ile Thr Lys 115 120 125 ttt tca gca gaa gtg atg gat agc agc tcg gta tct gat gtt gta cat 432 Phe Ser Ala Glu Val Met Asp Ser Ser Ser Val Ser Asp Val Val His 130 135 140 aaa gct ttt cgt att gca gag caa cct acc caa ggt gct agc ttt gtt 480 Lys Ala Phe Arg Ile Ala Glu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Ser Phe Val 145 150 155 160 agt cta ccg caa gat att cta act aac cgt att cct tac cag cca gta 528 Ser Leu Pro Gln Asp Ile Leu Thr Asn Arg Ile Pro Tyr Gln Pro Val 165 170 175 caa cag cct aat cca att ttg ttc ggt ggt gca cac cca caa gct att 576 Gln Gln Pro Asn Pro Ile Leu Phe Gly Gly Ala His Pro Gln Ala Ile 180 185 190 cgt cag gct gct gat cgc att aat gct gca aaa aat ccg gtg tta tta 624 Arg Gln Ala Ala Asp Arg Ile Asn Ala Ala Lys Asn Pro Val Leu Leu 195 200 205 ctg ggc atg gat gca agc cag cct ttt gtt gct gat gct att cgc caa 672 Leu Gly Met Asp Ala Ser Gln Pro Phe Val Ala Asp Ala Ile Arg Gln 210 215 220 cta ctc aaa caa aca cca att gcc gtt gtg aat acg ttt gcc gca gct 720 Leu Leu Lys Gln Thr Pro Ile Ala Val Val Asn Thr Phe Ala Ala Ala 225 230 235 240 ggg gtt att tct cat gat tta tac aac tgc ttt tta ggt cgt gtt ggc 768 Gly Val Ile Ser His Asp Leu Tyr Asn Cys Phe Leu Gly Arg Val Gly 245 250 255 tta ttt aaa aat caa ccc ggt gat att gca tta aac agt gca gat tta 816 Leu Phe Lys Asn Gln Pro Gly Asp Ile Ala Leu Asn Ser Ala Asp Leu 260 265 270 atc att acc att ggc tac agc cca att gaa tac gat ccg att ctt tgg 864 Ile Ile Thr Ile Gly Tyr Ser Pro Ile Glu Tyr Asp Pro Ile Leu Trp 275 280 285 aat aaa gat gca aac aca cca att att cat att ggt tat caa caa gca 912 Asn Lys Asp Ala Asn Thr Pro Ile Ile His Ile Gly Tyr Gln Gln Ala 290 295 300 gat tta gaa att agc tat aac cct gtt tgt gaa gtt gtg ggt gac tta 960 Asp Leu Glu Ile Ser Tyr Asn Pro Val Cys Glu Val Val Gly Asp Leu 305 310 315 320 gcg gtg tct gtc acg tct att gct tct gaa tta gat aag cga gaa tca 1008 Ala Val Ser Val Thr Ser Ile Ala Ser Glu Leu Asp Lys Arg Glu Ser 325 330 335 tta gaa aat aac caa caa atc caa tta tta cgc cac gat tta caa cat 1056 Leu Glu Asn Asn Gln Gln Ile Gln Leu Leu Arg His Asp Leu Gln His 340 345 350 att atg cag atg ggg gta aat aaa acc tca aca aac ggc gtt cac ccg 1104 Ile Met Gln Met Gly Val Asn Lys Thr Ser Thr Asn Gly Val His Pro 355 360 365 ctt cgt ttt gtt cat gag tta cgt cgc ttt gtt agt gac gac acc act 1152 Leu Arg Phe Val His Glu Leu Arg Arg Phe Val Ser Asp Asp Thr Thr 370 375 380 gta tgt tgt gat gta ggc tct att tat att tgg atg gca cgt tac ttc 1200 Val Cys Cys Asp Val Gly Ser Ile Tyr Ile Trp Met Ala Arg Tyr Phe 385 390 395 400 cac agc ttt gaa cct cgt cgt tta ttg ttc agc aat ggc caa caa aca 1248 His Ser Phe Glu Pro Arg Arg Leu Leu Phe Ser Asn Gly Gln Gln Thr 405 410 415 ttg 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cereus <400> 17 ttgagtacag gtgtaaaagc aaacgacgtg aagacaaaaa caaaaggagc agatcttgtt 60 gttgattgtt taattaaaca aggtgttaca catgttttcg gtattccagg agcaaagatt 120 gactctgtat ttgatgtact gcaagaaaga ggaccagagt taattgtttg tcgtcatgaa 180 caaaatgcag catttatggc agctgctatt ggtagattaa caggaaaacc gggcgtatgt 240 cttgtaactt caggaccagg gacatcaaat ttagcgacag gtcttgttac tgcgaatgcg 300 gagagtgatc ccgttgttgc tttagctggt gcagttccgc gtacggatcg attaaaacgt 360 acacatcaat ctatggataa tgctgcacta ttcgaaccaa tcacaaaata tagcgtagaa 420 gtagagcatc ctgataatgt gccagaagca ttatcaaatg cattccgaag tgcgacttct 480 acaaatccag gagcaacttt agtaagtttg ccgcaagacg ttatgactgc ggaaacgact 540 gtagagtcta tcggtgcgct ttctaagcca cagcttggaa tcgctcccac acatgatatt 600 acatatgtag tagataaaat aaaagcagcg aaattaccag ttattttact cggtatgaga 660 gcgagcacaa atgaagtgac gaaagccgtt cgtaaattaa ttgcggatac agaacttcct 720 gtcgttgaaa catatcaagc ggctggtgcc atttcacgtg agttagaaga tcatttcttc 780 ggccgtgttg gactattccg taaccaacca ggtgatattt tactagaaga ggcagatctt 840 gttatttcta tcggttatga tccaattgag tatgatccaa agttctggaa taaacttgga 900 gacagaacga ttattcatct tgatgaccat caagcagata tagatcatga ttaccaacca 960 gagcgtgaat taattggtga tattgcctta acagtaaata gcatcgcaga aaagttaccg 1020 aaacttgtgt taagtacgaa atcagaagca gtgttagaac gattacgcgc gaaattatca 1080 gaacaagcag aagttccaaa tcgtccttca gaaggtgtta cacatccgct tcaagtgatt 1140 cgtacacttc gttctttaat tagtgacgac acaaccgtta catgtgacat cggttcccat 1200 tctatttgga tggcgagatg tttccgttct tatgaaccac gtagattatt atttagtaac 1260 ggtatgcaga cgttaggtgt tgcacttcct tgggcaattg ctgctacttt agtagaacca 1320 ggtaaaaaag tagtttccgt atcaggtgac ggtggtttct tattctcagc gatggagtta 1380 gaaacggcgg tacgtttaaa ttctccaatc gtccatcttg tttggagaga cggcacatat 1440 gatatggttg cattccaaca aatgatgaaa tacggcagaa catcagctac agagtttggt 1500 gatgttgatc ttgttaaata tgcggaaagt ttcggggcgt taggtcttcg tgttaacacg 1560 cctgatgaat tagaaggggt attgaaagaa gcactagcag cagacggccc tgtcattatt 1620 gatattccaa ttgactatcg tgacaacatt aaattaagcg aaaaattatt accaaaccaa 1680 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actggtccac agggctttgg tattgcaaac 1680 gttgctgata gcttgtatac gattaagaaa ttggtgttcg aggagaagag aattacgatg 1740 ggtgaattaa agaaagcgtt ggaaatgaat tatggtaagg gtttggatgc cacaaccgct 1800 ggtgacatcg caatgcaggt cgcgaaggga ctaaaagatg ccggacagga agtgggtccc 1860 gacgtgatcg ctaatacaat ccgtcaagtt cttgaaatgg aattaccaga agatgtaaga 1920 aagagatatg aagagatcca tgaaatgata cttgagttac caaagtatgg taatgatata 1980 gatgaagttg atgaattagc tagagaagca gcttactttt acacaagacc attagaaact 2040 tttaagaatc caaggggtgg catgtatcaa gccggccttt atcccgtgtc cgctaatgtg 2100 ccactaggcg ctcaaacggg ggccacaccc gatggacgtt tggcgcatac acccgtggcg 2160 gatggcgttg gtccgacatc aggcttcgat atatccggac caacagcttc ttgcaattct 2220 gtcgccaagt tggatcatgc tatagcctct aatggtacct tatttaatat gaagatgcac 2280 ccaaccgcaa tggcaggtga aaagggctta gaatccttca tatcgttgat ccgtggttat 2340 ttcgatcaac aaggtatgca catgcaattt aacgtagtag acagggctac actgcttgat 2400 gcgcaggccc accctgaaaa gtattcaggc ttaattgtca gagtggcagg ttattctgcc 2460 ctttttacca cattgtccaa gtcattacaa 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cttgttcact gttgaagatg ctatcaagag aggtagttac 420 gttatgaact tgttgtccga tgccgctcaa tcagaaacct ggcctgctat caagccattg 480 ttgaccaagg gtaagacttt gtacttctcc cacggtttct ccccagtctt caaggacttg 540 actcacgttg aaccaccaaa ggacttagat gttatcttgg ttgctccaaa gggttccggt 600 agaactgtca gatctttgtt caaggaaggt cgtggtatta actcttctta cgccgtctgg 660 aacgatgtca ccggtaaggc tcacgaaaag gcccaagctt tggccgttgc cattggttcc 720 ggttacgttt accaaaccac tttcgaaaga gaagtcaact ctgacttgta cggtgaaaga 780 ggttgtttaa tgggtggtat ccacggtatg ttcttggctc aatacgacgt cttgagagaa 840 aacggtcact ccccatctga agctttcaac gaaaccgtcg aagaagctac ccaatctcta 900 tacccattga tcggtaagta cggtatggat tacatgtacg atgcttgttc caccaccgcc 960 agaagaggtg ctttggactg gtacccaatc ttcaagaatg ctttgaagcc tgttttccaa 1020 gacttgtacg aatctaccaa gaacggtacc gaaaccaaga gatctttgga attcaactct 1080 caacctgact acagagaaaa gctagaaaag gaattagaca ccatcagaaa catggaaatc 1140 tggaaggttg gtaaggaagt cagaaagttg agaccagaaa accaataa 1188 <210> 38 <211> 395 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 38 Met Leu Arg Thr Gln Ala Ala Arg Leu Ile Cys Asn Ser Arg Val Ile 1 5 10 15 Thr Ala Lys Arg Thr Phe Ala Leu Ala Thr Arg Ala Ala Ala Tyr Ser 20 25 30 Arg Pro Ala Ala Arg Phe Val Lys Pro Met Ile Thr Thr Arg Gly Leu 35 40 45 Lys Gln Ile Asn Phe Gly Gly Thr Val Glu Thr Val Tyr Glu Arg Ala 50 55 60 Asp Trp Pro Arg Glu Lys Leu Leu Asp Tyr Phe Lys Asn Asp Thr Phe 65 70 75 80 Ala Leu Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly Tyr Gly Gln Gly Leu Asn Leu 85 90 95 Arg Asp Asn Gly Leu Asn Val Ile Ile Gly Val Arg Lys Asp Gly Ala 100 105 110 Ser Trp Lys Ala Ala Ile Glu Asp Gly Trp Val Pro Gly Lys Asn Leu 115 120 125 Phe Thr Val Glu Asp Ala Ile Lys Arg Gly Ser Tyr Val Met Asn Leu 130 135 140 Leu Ser Asp Ala Ala Gln Ser Glu Thr Trp Pro Ala Ile Lys Pro Leu 145 150 155 160 Leu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Tyr Phe Ser His Gly Phe Ser Pro Val 165 170 175 Phe Lys Asp Leu Thr His Val Glu Pro Pro Lys Asp Leu Asp Val Ile 180 185 190 Leu Val Ala Pro Lys Gly Ser Gly Arg Thr Val Arg Ser Leu Phe Lys 195 200 205 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cgtgaacagt tggatcaact tggtcgttgc 60 cgttttatgg cgcgagaaga gtttgcaacc gaagctgatt acctaaaagg taagaaagtg 120 gtgatcgtag gttgtggggc tcaaggccta aaccaaggcc tcaatatgcg tgattcaggt 180 ttggatgttt cttacgctct gcgtcaggct gcgattgatg aacagcgtca gtcatttaag 240 aatgccaaga ataatggctt caacgtgggt agttatgaac aactcatccc aaccgcagat 300 ttggtgatta acttgacgcc agacaagcag cacaccagtg tggtcaatgc ggtgatgcct 360 ctgatgaagc aaggtgctgc cttgggttac tcacacggtt ttaatatcgt tgaagagggc 420 atgcagatcc gtaaagacat cacggttgtg atggtggcac caaaatgtcc gggtacggaa 480 gttcgtgaag agtataagcg cggtttcggc gttcctactc ttatcgcggt acaccctgaa 540 aacgatccac aaggtgaagg ttgggaaatt gctaaagcgt gggctgcggc aacgggtggc 600 catcgtgcgg gctgtttagc ttcttctttt gtggcggaag tgaaatccga tttgatgggt 660 gagcaaacca ttctctgcgg tatgctgcaa gcgggctcta tcgtttgtta cgagaaaatg 720 gttgctgatg gcatcgaccc tggttatgcg ggcaagcttt tgcaatttgg ttgggaaacc 780 attaccgaag cactcaagtt tggcggtatt actcatatga tggatcgcct gtctaaccct 840 gcaaaaatca aagcgtttga gctgtctgaa gagttgaaag atctgatgcg 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attggtgaat acatcaagaa gacaatggaa ttgggtattt tacctcgtga tatcctcaca 840 aaagaggctt ttgaaaacgc cattacttat gtcgttgcaa ccggtgggtc cactaatgct 900 gttttgcatt tggtggctgt tgctcactct gcgggtgtca agttgtcacc agatgatttc 960 caaagaatca gtgatactac accattgatc ggtgacttca aaccttctgg taaatacgtc 1020 atggccgatt tgattaacgt tggtggtacc caatctgtga ttaagtatct atatgaaaac 1080 aacatgttgc acggtaacac aatgactgtt accggtgaca ctttggcaga acgtgcaaag 1140 aaagcaccaa gcctacctga aggacaagag attattaagc cactctccca cccaatcaag 1200 gccaacggtc acttgcaaat tctgtacggt tcattggcac caggtggagc tgtgggtaaa 1260 attaccggta aggaaggtac ttacttcaag ggtagagcac gtgtgttcga agaggaaggt 1320 gcctttattg aagccttgga aagaggtgaa atcaagaagg gtgaaaaaac cgttgttgtt 1380 atcagatatg aaggtccaag aggtgcacca ggtatgcctg aaatgctaaa gccttcctct 1440 gctctgatgg gttacggttt gggtaaagat gttgcattgt tgactgatgg tagattctct 1500 ggtggttctc acgggttctt aatcggccac attgttcccg aagccgctga aggtggtcct 1560 atcgggttgg tcagagacgg cgatgagatt atcattgatg ctgataataa caagattgac 1620 ctattagtct ctgataagga aatggctcaa cgtaaacaaa gttgggttgc acctccacct 1680 cgttacacaa gaggtactct atccaagtat gctaagttgg tttccaacgc ttccaacggt 1740 tgtgttttag atgcttga 1758 <210> 48 <211> 585 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 48 Met Gly Leu Leu Thr Lys Val Ala Thr Ser Arg Gln Phe Ser Thr Thr 1 5 10 15 Arg Cys Val Ala Lys Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Ile Ile Thr Glu 20 25 30 Pro Lys Gly Gln Gly Ala Ser Gln Ala Met Leu Tyr Ala Thr Gly Phe 35 40 45 Lys Lys Glu Asp Phe Lys Lys Pro Gln Val Gly Val Gly Ser Cys Trp 50 55 60 Trp Ser Gly Asn Pro Cys Asn Met His Leu Leu Asp Leu Asn Asn Arg 65 70 75 80 Cys Ser Gln Ser Ile Glu Lys Ala Gly Leu Lys Ala Met Gln Phe Asn 85 90 95 Thr Ile Gly Val Ser Asp Gly Ile Ser Met Gly Thr Lys Gly Met Arg 100 105 110 Tyr Ser Leu Gln Ser Arg Glu Ile Ile Ala Asp Ser Phe Glu Thr Ile 115 120 125 Met Met Ala Gln His Tyr Asp Ala Asn Ile Ala Ile Pro Ser Cys Asp 130 135 140 Lys Asn Met Pro Gly Val Met Met Ala Met Gly Arg His Asn Arg Pro 145 150 155 160 Ser Ile Met 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atccgcagtt 240 aatggcttag cgggctccta tgctgagaac ctgcctgttg ttgagatcgt gggatctcct 300 acctcgaaag tgcagaacga aggtaagttt gttcaccata cgttggctga tggtgatttc 360 aagcacttta tgaagatgca cgaaccggtt actgctgcca ggactttatt gacagccgag 420 aatgcaactg ttgaaattga tagagtgttg tctgccttac taaaggaaag aaagccggtt 480 tacatcaatt tacctgtaga tgtagctgcc gctaaggctg aaaaaccatc cttgcctctt 540 aagaaggaaa attccacgtc gaatacatct gatcaagaga ttctgaacaa aatacaggaa 600 agtctgaaga atgccaagaa accaattgta atcacaggcc atgaaattat atcgttcggc 660 ctagagaaga ctgttactca gtttatttca aagactaagt tacctattac tactttgaac 720 tttggtaaat catctgttga tgaagcattg ccctcatttt tggggattta caacggtact 780 ctgtcagagc caaacttgaa ggaatttgtg gaatctgctg attttattct tatgttgggt 840 gtaaagctta ccgattctag tacgggtgca tttactcacc atcttaatga aaataaaatg 900 atttccttga atatcgatga aggtaaaatt ttcaacgaaa gaatccaaaa tttcgacttc 960 gaatccctga tatcatctct tcttgacttg tccgaaattg aatataaagg caagtacata 1020 gataaaaagc aagaagattt tgtaccttct aacgcgctgt tgtcacaaga tagactgtgg 1080 caagctgtcg aaaatttgac ccaaagtaat gagacgatcg tggctgaaca aggcacttct 1140 ttcttcggtg cctcatctat atttctgaaa tcgaaatcac attttattgg tcaacccttg 1200 tggggatcta taggatacac tttccccgca gctctaggca gccaaattgc agataaagaa 1260 tctagacatt tattgtttat cggagatgga tcattgcaac tgactgtcca agaattagga 1320 ctagccatta gagagaagat aaacccaatc tgctttatca ttaataacga tggttacacg 1380 gttgagaggg aaattcatgg tccgaaccag agttataatg acattcctat gtggaattac 1440 tcaaaactgc cagaaagttt cggggcaacg gaagacagag ttgtgtccaa aattgtgaga 1500 acagaaaatg aattcgtatc cgtgatgaaa gaagctcaag cagatccaaa taggatgtat 1560 tggatagaac ttattctagc aaaggagggt gcacctaaag ttttgaaaaa gatgggtaag 1620 ttatttgcag aacaaaacaa gagc 1644 <210> 54 <211> 1146 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 54 atgagagctt tggcatattt caagaagggt gatattcact tcactaatga tatccctagg 60 ccagaaatcc aaaccgacga tgaggttatt atcgacgtct cttggtgtgg gatttgtggc 120 tcggatcttc acgagtactt ggatggtcca atcttcatgc ctaaagatgg agagtgccat 180 aaattatcca acgctgcttt acctctggca atgggccatg agatgtcagg aattgtttcc 240 aaggttggtc ctaaagtgac aaaggtgaag gttggcgacc acgtggtcgt tgatgctgcc 300 agcagttgtg cggacctgca ttgctggcca cactccaaat tttacaattc caaaccatgt 360 gatgcttgtc agaggggcag tgaaaatcta tgtacccacg ccggttttgt aggactaggt 420 gtgatcagtg gtggctttgc tgaacaagtc gtagtctctc aacatcacat tatcccggtt 480 ccaaaggaaa ttcctctaga tgtggctgct ttagttgagc ctctttctgt cacctggcat 540 gctgttaaga tttctggttt caaaaaaggc agttcagcct tggttcttgg tgcaggtccc 600 attgggttgt gtaccatttt ggtacttaag ggaatggggg ctagtaaaat tgtagtgtct 660 gaaattgcag agagaagaat agaaatggcc aagaaactgg gcgttgaggt gttcaatccc 720 tccaagcacg gtcataaatc tatagagata ctacgtggtt tgaccaagag ccatgatggg 780 tttgattaca gttatgattg ttctggtatt caagttactt tcgaaacctc tttgaaggca 840 ttaacattca aggggacagc caccaacatt gcagtttggg gtccaaaacc tgtcccattc 900 caaccaatgg atgtgactct ccaagagaaa gttatgactg gttcgatcgg ctatgttgtc 960 gaagccttcg aagaagttgt tcgtgccatc cacaacggag acatcgccat ggaagattgt 1020 aagcaactaa tcactggtaa gcaaaggatt gaggacggtt gggaaaaggg attccaagag 1080 ttgatggatc acaaggaatc caacgttaag attctattga cgcctaacaa tcacggtgaa 1140 atgaag 1146 <210> 55 <211> 382 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 55 Met Arg Ala Leu Ala Tyr Phe Lys Lys Gly Asp Ile His Phe Thr Asn 1 5 10 15 Asp Ile Pro Arg Pro Glu Ile Gln Thr Asp Asp Glu Val Ile Ile Asp 20 25 30 Val Ser Trp Cys Gly Ile Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Leu Asp 35 40 45 Gly Pro Ile Phe Met Pro Lys Asp Gly Glu Cys His Lys Leu Ser Asn 50 55 60 Ala Ala Leu Pro Leu Ala Met Gly His Glu Met Ser Gly Ile Val Ser 65 70 75 80 Lys Val Gly Pro Lys Val Thr Lys Val Lys Val Gly Asp His Val Val 85 90 95 Val Asp Ala Ala Ser Ser Cys Ala Asp Leu His Cys Trp Pro His Ser 100 105 110 Lys Phe Tyr Asn Ser Lys Pro Cys Asp Ala Cys Gln Arg Gly Ser Glu 115 120 125 Asn Leu Cys Thr His Ala Gly Phe Val Gly Leu Gly Val Ile Ser Gly 130 135 140 Gly Phe Ala Glu Gln Val Val Val Ser Gln His His Ile Ile Pro Val 145 150 155 160 Pro Lys Glu Ile Pro Leu Asp Val Ala Ala Leu Val Glu Pro Leu Ser 165 170 175 Val 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1125 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> horse ADH coding region codon optimized for S. cerevisiae expression <400> 56 atgtcaacag ccggtaaagt tattaagtgt aaagcggcag ttttgtggga agagaaaaag 60 ccgtttagca tagaagaagt agaagtagcg ccaccaaaag cacacgaggt tagaatcaag 120 atggttgcca ccggaatctg tagatccgac gaccatgtgg tgagtggcac tctagttact 180 cctttgccag taatcgcggg acacgaggct gccggaatcg ttgaatccat aggtgaaggt 240 gttaccactg ttcgtcctgg tgataaagtg atcccactgt tcactcctca atgtggtaag 300 tgtagagtct gcaaacatcc tgagggtaat ttctgcctta aaaatgattt gtctatgcct 360 agaggtacta tgcaggatgg tacaagcaga tttacatgca gagggaaacc tatacaccat 420 ttccttggta cttctacatt ttcccaatac acagtggtgg acgagatatc tgtcgctaaa 480 atcgatgcag cttcaccact ggaaaaagtt tgcttgatag ggtgcggatt ttccaccggt 540 tacggttccg cagttaaagt tgcaaaggtt acacagggtt cgacttgtgc agtattcggt 600 ttaggaggag taggactaag cgttattatg gggtgtaaag ctgcaggcgc agcgaggatt 660 ataggtgtag acatcaataa ggacaaattt gcaaaagcta aggaggtcgg ggctactgaa 720 tgtgttaacc ctcaagatta taagaaacca atacaagaag tccttactga aatgtcaaac 780 ggtggagttg atttctcttt tgaagttata ggccgtcttg atactatggt aactgcgttg 840 tcctgctgtc aagaggcata tggagtcagt gtgatcgtag gtgttcctcc tgattcacaa 900 aatttgtcga tgaatcctat gctgttgcta agcggtcgta catggaaggg agctatattt 960 ggcggtttta agagcaagga tagtgttcca aaacttgttg ccgactttat ggcgaagaag 1020 tttgctcttg atcctttaat tacacatgta ttgccattcg agaaaatcaa tgaagggttt 1080 gatttgttaa gaagtggtga atctattcgt acaattttaa ctttt 1125 <210> 57 <211> 375 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 57 Met Ser Thr Ala Gly Lys Val Ile Lys Cys Lys Ala Ala Val Leu Trp 1 5 10 15 Glu Glu Lys Lys Pro Phe Ser Ile Glu Glu Val Glu Val Ala Pro Pro 20 25 30 Lys Ala His Glu Val Arg Ile Lys Met Val Ala Thr Gly Ile Cys Arg 35 40 45 Ser Asp Asp His Val Val Ser Gly Thr Leu Val Thr Pro Leu Pro Val 50 55 60 Ile Ala Gly His Glu Ala Ala Gly Ile Val Glu Ser Ile Gly Glu Gly 65 70 75 80 Val Thr Thr Val Arg Pro Gly Asp Lys Val Ile Pro Leu Phe Thr Pro 85 90 95 Gln Cys Gly Lys Cys Arg Val Cys Lys His Pro 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ttaaagaaga aacagaagaa gatttgtttg gagaacaagc tgttctatgt 600 ggaggtttga cagcacttgt tgaagccggt tttgaaacac tgacagaagc tggatacgct 660 ggcgaattgg cttactttga agttttgcac gaaatgaaat tgattgttga cctcatgtat 720 gaaggtggtt ttactaaaat gcgtcaatcc atctcaaata ctgctgagtt tggcgattat 780 gtgactggtc cacggattat tactgacgaa gttaaaaaga atatgaagct tgttttggct 840 gatattcaat ctggaaaatt tgctcaagat ttcgttgatg acttcaaagc ggggcgtcca 900 aaattaatag cctatcgcga agctgcaaaa aatcttgaaa ttgaaaaaat tggggcagag 960 ctacgtcaag caatgccatt cacacaatct ggtgatgacg atgcctttaa aatctatcag 1020 <210> 59 <211> 340 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 59 Met Ala Val Thr Met Tyr Tyr Glu Asp Asp Val Glu Val Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ala Gly Lys Gln Ile Ala Val Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala 20 25 30 His Ala Gln Asn Leu Arg Asp Ser Gly His Asn Val Ile Ile Gly Val 35 40 45 Arg His Gly Lys Ser Phe Asp Lys Ala Lys Glu Asp Gly Phe Glu Thr 50 55 60 Phe Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Val Ile Met Val Leu 65 70 75 80 Ala Pro Asp Glu 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ttctgcactt gatttattat 600 aaaaagacaa agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat 660 tcttctgttc ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaa 719 <210> 61 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Promoter UAS(PGK1)-ENO2 <400> 61 aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 60 tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctgc 120 ggcgttatgt cactaacgac gtgcaccaac ttgcggaaag tggaatcccg ttccaaaact 180 ggcatccact aattgataca tctacacacc gcacgccttt tttctgaagc ccactttcgt 240 ggactttgcc atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag 300 ggtagtttct ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc 360 cattgctttc tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg 420 tatgtgacaa gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt 480 tgattgttaa aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt 540 ttcttccctt gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat 600 aacaccaagc aactaatact ataacataca ataata 636 <210> 62 <211> 979 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Promoter UAS(FBA1)-PDC1 <400> 62 tgacagcagg attatcgtaa tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta 60 cgtaaataat gataggaatg ggattcttct atttttcctt tttccattct cgcacgccga 120 aatgcatgca agtaacctat tcaaagtaat atctcataca tgtttcatga gggtaacaac 180 atgcgactgg gtgagcatat gttccgctga tgtgatgtgc aagataaaca agcaaggcag 240 aaactaactt cttcttcatg taataaacac accccgcgtt tatttaccta tctctaaact 300 tcaacacctt atatcataac taatatttct tgagataagc acactgcacc cataccttcc 360 ttaaaaacgt agcttccagt ttttggtggt tccggcttcc ttcccgattc cgcccgctaa 420 acgcatattt ttgttgcctg gtggcatttg caaaatgcat aacctatgca tttaaaagat 480 tatgtatgct cttctgactt ttcgtgtgat gaggctcgtg gaaaaaatga ataatttatg 540 aatttgagaa caattttgtg ttgttacggt attttactat ggaataatca atcaattgag 600 gattttatgc aaatatcgtt tgaatatttt tccgaccctt tgagtacttt tcttcataat 660 tgcataatat tgtccgctgc ccctttttct gttagacggt gtcttgatct acttgctatc 720 gttcaacacc accttatttt ctaactattt tttttttagc tcatttgaat cagcttatgg 780 tgatggcaca tttttgcata aacctagctg tcctcgttga acataggaaa aaaaaatata 840 taaacaaggc tctttcactc tccttgcaat cagatttggg tttgttccct ttattttcat 900 atttcttgtc atattccttt ctcaattatt attttctact cataacctca cgcaaaataa 960 cacagtcaaa tcaatcaaa 979 <210> 63 <211> 994 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> UAS(PGK1)-PDC1 <400> 63 aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 60 tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctgt 120 cgacccgcac gccgaaatgc atgcaagtaa cctattcaaa gtaatatctc atacatgttt 180 catgagggta acaacatgcg actgggtgag catatgttcc gctgatgtga tgtgcaagat 240 aaacaagcaa ggcagaaact aacttcttct tcatgtaata aacacacccc gcgtttattt 300 acctatctct aaacttcaac accttatatc ataactaata tttcttgaga taagcacact 360 gcacccatac cttccttaaa aacgtagctt ccagtttttg gtggttccgg cttccttccc 420 gattccgccc gctaaacgca tatttttgtt gcctggtggc atttgcaaaa tgcataacct 480 atgcatttaa aagattatgt atgctcttct gacttttcgt gtgatgaggc tcgtggaaaa 540 aatgaataat ttatgaattt gagaacaatt ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat 600 aatcaatcaa ttgaggattt tatgcaaata tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt 660 acttttcttc ataattgcat aatattgtcc gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt 720 gatctacttg ctatcgttca acaccacctt attttctaac tatttttttt ttagctcatt 780 tgaatcagct tatggtgatg gcacattttt gcataaacct agctgtcctc gttgaacata 840 ggaaaaaaaa atatataaac aaggctcttt cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt 900 tccctttatt ttcatatttc ttgtcatatt cctttctcaa ttattatttt ctactcataa 960 cctcacgcaa aataacacag tcaaatcaat caaa 994 <210> 64 <211> 731 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> UAS(PGK1)-OLE1 <400> 64 aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 60 tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctgt 120 cgaccggggc gcccgtgcaa aaactaactc cgagcccggg catgtcccgg gttagcgggc 180 ccaacaaagg cgcttatctg gtgggcttcc gtagaagaaa aaaagctgtt gagcgagcta 240 tttcgggtat cccagccttc tctgcagacc gccccagttg gcttggctct ggtgctgttc 300 gttagcatca catcgcctgt gacaggcaga ggtaataacg gcttaaggtt ctcttcgcat 360 agtcggcagc tttctttcgg acgttgaaca ctcaacaaac cttatctagt gcccaaccag 420 gtgtgcttct acgagtcttg ctcactcaga cacacctatc cctattgtta cggctatggg 480 gatggcacac aaaggtggaa ataatagtag ttaacaatat atgcagcaaa tcatcggctc 540 ctggctcatc gagtcttgca aatcagcata tacatatata tatgggggca gatcttgatt 600 catttattgt tctatttcca tctttcctac ttctgtttcc gtttatattt tgtattacgt 660 agaatagaac atcatagtaa tagatagttg tggtgatcat attataaaca gcactaaaac 720 attacaacaa a 731 <210> 65 <211> 500 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 65 Met Thr Lys Leu His Phe Asp Thr Ala Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu 1 5 10 15 Pro Asn Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Phe Met Lys Ala Gln Asp Gly Lys Thr Tyr Pro Val Glu Asp Pro 35 40 45 Ser Thr Glu Asn Thr Val Cys Glu Val Ser Ser Ala Thr Thr Glu Asp 50 55 60 Val Glu Tyr Ala Ile Glu Cys Ala Asp Arg Ala Phe His Asp Thr Glu 65 70 75 80 Trp Ala Thr Gln Asp Pro Arg Glu Arg Gly Arg Leu Leu Ser Lys Leu 85 90 95 Ala Asp Glu Leu 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Gly Gln Ile Ala Thr Glu Asp Ile Gln Asp Val Phe Asp Thr Asn Val 115 120 125 Thr Ala Leu Ile Asn Ile Thr Gln Ala Val Leu Pro Ile Phe Gln Ala 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Asp Ile Val Asn Leu Gly Ser Ile Ala Gly Arg Asp 145 150 155 160 Ala Tyr Pro Thr Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Ser Lys Phe Ala Val Gly 165 170 175 Ala Phe Thr Asp Ser Leu Arg Lys Glu Leu Ile Asn Thr Lys Ile Arg 180 185 190 Val Ile Leu Ile Ala Pro Gly Leu Val Glu Thr Glu Phe Ser Leu Val 195 200 205 Arg Tyr Arg Gly Asn Glu Glu Gln Ala Lys Asn Val Tyr Lys Asp Thr 210 215 220 Thr Pro Leu Met Ala Asp Asp Val Ala Asp Leu Ile Val Tyr Ala Thr 225 230 235 240 Ser Arg Lys Gln Asn Thr Val Ile Ala Asp Thr Leu Ile Phe Pro Thr 245 250 255 Asn Gln Ala Ser Pro His His Ile Phe Arg Gly 260 265 <210> 69 <211> 2073 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 69 atggaaggct tcaatccggc tgacatagaa catgcgtcac cgattaattc atctgacagc 60 cattcatcct cctttgtata tgctctaccc aaaagtgcta gtgaatatgt agtcaaccat 120 aatgagggtc gtgcaagtgc aagtggaaat ccagccgcag tgccgtctcc cataatgaca 180 ctgaatctca aaagcacaca ttccctcaat attgatcagc atgttcatac ctcaacatcg 240 ccgacggaaa ctattgggca tattcatcat gtggaaaagc tgaatcaaaa caatttgatt 300 catctggatc cagtacccaa ctttgaagat aagtccgata ttaagccttg gttgcaaaag 360 attttttatc ctcaaggaat agaacttgtg atagaaaggt cggacgcatt taaagttgtc 420 ttcaagtgta aagctgctaa aaggggaagg aacgcgagaa ggaaaagaaa agataagccc 480 aaaggacagg accacgaaga cgagaaatcc aagatcaatg atgacgaatt agaatatgcg 540 agtccttcta atgccacagt aaccaatggg cctcaaacat cgcccgatca aacatcctcc 600 ataaagccaa agaaaaaaag atgtgtatcg aggtttaata actgtccgtt tagagtacga 660 gctacttatt cgttaaagag gaaaagatgg agcattgttg taatggacaa taaccattca 720 catcagctaa agtttaaccc tgattccgaa gagtacaaaa aattcaaaga aaaattaaga 780 aaggataatg acgtagatgc aatcaagaaa ttcgacgaat tggaatacag aactttggcc 840 aatttgccca ttccaacagc tacaatcccc tgtgattgtg gtttaacaaa tgaaatacaa 900 agtttcaatg tcgtattgcc cactaacagt aatgttactt catcagcatc ctcttcaact 960 gtatcgtcca tatcccttga ttcatcgaat gcatctaaaa ggccatgctt accctctgta 1020 aataacaccg gtagtatcaa taccaataac gtaaggaaac cgaaaagcca gtgtaagaat 1080 aaagacacac tcttaaaaag aaccaccatg cagaactttc tcacaactaa atcaaggctg 1140 cgtaagaccg gtacgccaac atcttcgcaa cactcatcta cagcattttc aggatatatt 1200 gatgatcctt tcaatttgaa tgaaatcttg ccactgccgg catccgattt caagctaaac 1260 actgtaacaa atttgaacga aattgacttt acgaacattt ttaccaaatc gccgcatcca 1320 catagcgggt ctacccatcc aagacaagtc ttcgaccaat tggacgattg ttcctctata 1380 ctcttctctc cattaactac aaacacgaat aatgaatttg aaggagagtc agatgatttt 1440 gttcattctc catatttgaa ctcagaggca gatttcagcc aaattcttag tagtgctccc 1500 ccagtccatc atgacccaaa tgaaacacat caggaaaacc aggatattat tgatagattt 1560 gctaatagtt cccaagaaca taatgagtat attctacaat atttgacgca ctccgatgct 1620 gctaaccaca ataacatcgg cgttccaaac aacaattcac attcgctaaa tactcagcat 1680 aacgtttctg atctgggcaa ctcactttta agacaagaag ctttagttgg cagctcttca 1740 acaaaaatct tcgacgaatt gaaatttgta caaaatggcc cacacggttc tcaacatcct 1800 atagattttc aacatgttga ccatcgtcat ctcagctcta atgaacctca agtacgatca 1860 catcaatatg gtccgcaaca gcagccaccg cagcaattgc aatatcacca aaatcagccc 1920 cacgacggcc ataaccacga acagcaccaa acagtacaaa aggatatgca aacgcatgaa 1980 tcgctagaaa taatgggaaa cacattattg gaagagttca aagacattaa aatggtgaac 2040 ggcgagttga agtatgtgaa gccagaagat tag 2073 <210> 70 <211> 690 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 70 Met Glu Gly Phe Asn Pro Ala Asp Ile Glu His Ala Ser Pro Ile Asn 1 5 10 15 Ser Ser Asp Ser His Ser Ser Ser Phe Val Tyr Ala Leu Pro Lys Ser 20 25 30 Ala Ser Glu Tyr Val Val Asn His Asn Glu Gly Arg Ala Ser Ala Ser 35 40 45 Gly Asn Pro Ala Ala Val Pro Ser Pro Ile Met Thr Leu Asn Leu Lys 50 55 60 Ser Thr His Ser Leu Asn Ile Asp Gln His Val His Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Pro Thr Glu Thr Ile Gly His Ile His His Val Glu Lys Leu Asn Gln 85 90 95 Asn Asn Leu Ile His Leu Asp Pro Val Pro Asn Phe Glu Asp Lys Ser 100 105 110 Asp Ile Lys Pro Trp Leu Gln Lys Ile Phe Tyr Pro Gln Gly Ile Glu 115 120 125 Leu Val Ile Glu Arg Ser Asp Ala Phe Lys Val Val Phe Lys Cys Lys 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ttaagtgtag gtcagtacga tcgaaagtag ggttgaaccc taaatccaaa 300 ggttcctctt caagatccca tgcatgtcca tttagaatta gagcagccta ctctgtgcgg 360 ttacagaagt ggaacgtggt tgttatgaat aacatacatt cacatgagct gagatttgat 420 ttgattacta aaacggatga ctataaaaag tttaaggaaa atcttcgtca gaagaacgac 480 gaaaaagcca tcaaaacatt tgatgaatta gaatataaag caagtctaaa cttaccactc 540 gtcacaccaa ttatttcttg tgactgtggg ttaaccaagg aaattgaagc tttcaataac 600 atttttctcc cactatcaaa cccccctttg acgtctaaaa aaaatttgct caaaacaaat 660 aaaaactccg tttctaaaat aaaatccaga cagatggata attcgaaacc taggccaagg 720 ttgaaaacga agttggatgc ggatctacat gataccggat ttttagacaa tttcaaaacg 780 cggaattcct gtgtaaagat agagaaagaa gattctttaa cgaacttaaa cgaaattgat 840 tttacgaaca tgttttgcaa cgacaatttc atccaaaatt acaaccaagg cctgatggaa 900 cttttgacag aacctacacc aggtccttcg tcctcttctt gtatacttcc ttcaacacca 960 acgaggccct tgtcacaaag caaaatggat atagccctgt cagaatcaac aacatcttca 1020 ccaaatttta tggaaacaga cgctccttat ggagatgaga tcattaaagt ttccaaagat 1080 accaaaagca acgcaccaac tgctgataca gatattgcta cgaacttagg caaagagaga 1140 aacgaaaatt ttggcatgtt aaactacaac tacgaagcgt tgcttcattt caacgatgag 1200 cattttaatg aattaaattc tattgaccca gccttaatat caaaatatta a 1251 <210> 72 <211> 416 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 72 Met Lys Ala Lys Ser Met Lys Ser Ile Ile Ser Val Pro Ile Ser Val 1 5 10 15 Ser Lys Thr Gly Lys Met Lys Leu Thr Ala Ser Pro Asp Asn Leu Ala 20 25 30 Ser Met Met Ser Lys Asp Gln Asn Lys Leu Ile His Leu Asp Pro Val 35 40 45 Pro Ser Phe Glu Asp Arg His Glu Ile Lys Pro Trp Leu Gln Lys Ile 50 55 60 Phe Tyr Pro Gln Gly Ile Asp Ile Val Ile Glu Arg Ser Asp Ser Ser 65 70 75 80 Lys Val Thr Phe Lys Cys Arg Ser Val Arg Ser Lys Val Gly Leu Asn 85 90 95 Pro Lys Ser Lys Gly Ser Ser Ser Arg Ser His Ala Cys Pro Phe Arg 100 105 110 Ile Arg Ala Ala Tyr Ser Val Arg Leu Gln Lys Trp Asn Val Val Val 115 120 125 Met Asn Asn Ile His Ser His Glu Leu Arg Phe Asp Leu Ile Thr Lys 130 135 140 Thr Asp Asp Tyr Lys Lys Phe Lys Glu Asn Leu Arg Gln Lys Asn Asp 145 150 155 160 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taatgatgaa gacgatgacg acgaagaaga ggaagaagaa 540 actgaggagc aaataaacgc tagattgact aaattggtca atgccgcgcc ggtaatgtta 600 tttatgaagg ggagcccctc tgaacctaaa tgcgggtttt cgagacaact tgtgggtatc 660 ttgagagaac atcaagtaag atttggcttc tttgatatat taagagacga atctgttaga 720 caaaacttga aaaagttttc tgaatggcca actttccctc aactttatat aaatggggag 780 tttcaaggcg gtttagacat tatcaaggaa tccttggagg aagaccctga ttttttgcag 840 catgctctcc aatcttaa 858 <210> 76 <211> 285 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 76 Met Cys Ser Phe Gln Val Pro Ser Ala Phe Ser Phe Asn Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Tyr Cys Tyr Lys Arg His Gln Ala Arg Tyr Tyr Thr Ala Ala Lys Leu 20 25 30 Phe Gln Glu Met Pro Val Ile Glu Ile Asn Asp Gln Glu Gln Phe Thr 35 40 45 Tyr Leu Thr Thr Thr Ala Ala Gly Asp Lys Leu Ile Val Leu Tyr Phe 50 55 60 His Thr Ser Trp Ala Glu Pro Cys Lys Ala Leu Lys Gln Val Phe Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ser Asn Glu Pro Ser Asn Ser Asn Val Ser Phe Leu Ser Ile 85 90 95 Asp Ala Asp Glu Asn Ser Glu Ile Ser Glu Leu Phe Glu Ile Ser Ala 100 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ggggtctgaa tcaactccct tgttgagggg tagtaatagc 120 aatagttcaa ggcatgataa cttatcctca tctagctcgg atattatcta tggtagaaat 180 tcagcgcagg atctagaaaa ctcaccgatg tcagtaggga aagataatag gaatggcgat 240 aacggttcgg ataacgaaaa ggcgaaccta gggttcttcc aatcagtaga tcctcgcgta 300 attagcgatt tgattatcgg gctaagcgac ggtttaaccg tcccctttgc tctaacagct 360 ggtctatctt cacttggtga tgcgaaattg gtcattaccg gtggctttgc tgagttgatc 420 tcaggtgcga tttctatggg ccttggtggc tatttgggag cgaagagtga atctgattat 480 tatcatgctg aagtaaagaa ggagaaaagg aaattttacg ataactccaa cctaattaac 540 agagaaattg aagacattct gttagagatt aaccctaatt tctcggacga aacaatcgtt 600 tcgttcatca aagatttaca aagaacacct gagctaatgg ttgacttcat tatcaggtac 660 ggtaggggtc tagacgaacc tgccgagaat agagaactaa tcagtgcagt cactatcggt 720 ggcggttatc tacttggtgg gctagtacca ctagtgccat atttttttgt ctcagatgtg 780 ggcacaggtc tcatttattc tataatagtc atggttgtaa cattattctg gtttggttac 840 gtaaagacaa aactatccat gggtagtggc agttcgactt caaagaaagt tacggaaggt 900 gttgaaatgg ttgttgtggg tggtgtagca gcaggtgcgg cttggttctt tgttaagtta 960 ctgggttaa 969 <210> 78 <211> 322 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 78 Met Ser Ile Val Ala Leu Lys Asn Ala Val Val Thr Leu Ile Gln Lys 1 5 10 15 Ala Lys Gly Ser Gly Gly Thr Ser Glu Leu Gly Gly Ser Glu Ser Thr 20 25 30 Pro Leu Leu Arg Gly Ser Asn Ser Asn Ser Ser Arg His Asp Asn Leu 35 40 45 Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ile Ile Tyr Gly Arg Asn Ser Ala Gln Asp 50 55 60 Leu Glu Asn Ser Pro Met Ser Val Gly Lys Asp Asn Arg Asn Gly Asp 65 70 75 80 Asn Gly Ser Asp Asn Glu Lys Ala Asn Leu Gly Phe Phe Gln Ser Val 85 90 95 Asp Pro Arg Val Ile Ser Asp Leu Ile Ile Gly Leu Ser Asp Gly Leu 100 105 110 Thr Val Pro Phe Ala Leu Thr Ala Gly Leu Ser Ser Leu Gly Asp Ala 115 120 125 Lys Leu Val Ile Thr Gly Gly Phe Ala Glu Leu Ile Ser Gly Ala Ile 130 135 140 Ser Met Gly Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Ala Lys Ser Glu Ser Asp Tyr 145 150 155 160 Tyr His Ala Glu Val Lys Lys Glu Lys Arg Lys Phe Tyr Asp Asn Ser 165 170 175 Asn Leu Ile Asn Arg Glu Ile Glu Asp Ile Leu Leu Glu 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Leu His Leu Glu Ser Leu Trp Ser His Asn Val Thr Ile Thr Thr 275 280 285 Arg Leu Val Asp Thr Ala Thr Thr Pro Met Leu Leu Lys Thr Val Gln 290 295 300 Ser His Lys Leu Asp Pro Ser Arg Leu Ile Thr His Arg Phe Ser Leu 305 310 315 320 Asp Gln Ile Leu Asp Ala Tyr Glu Thr Phe Gly Gln Ala Ala Ser Thr 325 330 335 Gln Ala Leu Lys Val Ile Ile Ser Met Glu Ala 340 345

Claims (22)

1. (i) 발효성 탄소 기질을 포함하는 배지;
   (ii) 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.5 g 이상인 효모 세포의 배양물; 및
   (iii) 배지 중 약 2% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는, 부탄올의 발효 생산용 생산 배양물.
2. 제1항에 있어서, 세포 밀도는 리터 당 약 2.4 g 이상의 건조 세포 중량인 생산 배양물.
3. 제2항에 있어서, 세포 밀도는 리터 당 약 7 g 이상의 건조 세포 중량인 생산 배양물.
4. 제1항에 있어서, 부탄올 생산 효모 세포의 글루코스 이용률은 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 1 g 이상인 생산 배양물.
5. 제4항에 있어서, 부탄올 생산 효모 세포는
   (i) 돌연변이 유발;
   (ii) 3% 아이소부탄올에의 노출; 및
   (iii) 반복된 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법에 의해 생성되는 생산 배양물.
6. 제1항에 있어서, 효모는 크랩트리(crabtree) 양성인 생산 배양물.
7. 제1항에 있어서, 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia), 이사첸키아(Issatchenkia) 및 피키아(Pichia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원인 생산 배양물.
8. 제1항에 있어서, 효모는 아이소부탄올 경로 또는 1-부탄올 경로를 포함하는 생산 배양물.
9. 제1항에 있어서, 하기 조건에서 약 1시간 내지 약 200시간 동안 유지된 생산 배양물:
   (i) 약 20℃ 내지 약 45℃인 온도;
   (ii) 미호기성 조건에서 3% 초과로 유지되는 용존 산소량;
   (iii) 액화된 바이오매스(biomass)에 의해 제공되는 과량의 탄소 기질;
   (iv) 약 3 내지 약 7.5인 pH; 및
   (v) 진공 인가 및 액체-액체 추출로부터 선택되는 부탄올 제거.
10. (i) 제1항의 생산 배양물을 제조하는 단계 - 여기서, 효모는 아이소부탄올 경로 또는 1-부탄올 경로를 포함함 - 와;
    (ii) 부탄올이 생산되는 조건 하에 효모를 발효시키는 단계를 포함하는, 부탄올을 생산하는 방법.
11. (i) 발효성 탄소 기질을 포함하는 배지;
    (ii) 세포 밀도가 리터 당 약 2.4 g 이상의 건조 세포 중량인 효모 세포의 배양물; 및
    (iii) 배지 중 약 2% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는, 부탄올의 발효 생산용 생산 배양물.
12. 제11항에 있어서, 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.5 g 이상인 생산 배양물.
13. 제11항에 있어서, 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 1 g 이상인 생산 배양물.
14. 제11항에 있어서, 세포 밀도는 리터 당 약 7 g 이상의 건조 세포 중량인 생산 배양물.
15. 제11항에 있어서, 부탄올 농도는 약 2.5% 이상이며, 배양물의 글루코스 이용률은 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.4 g 이상인 생산 배양물.
16. 제11항에 있어서, 효모는 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 한세눌라, 칸디다, 클루이베로마이세스, 야로위아, 이사첸키아 및 피키아로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원인 생산 배양물.
17. 제11항에 있어서, 효모는 아이소부탄올 경로 또는 1-부탄올 경로를 포함하는 생산 배양물.
18. 제11항에 있어서, 하기 조건에서 약 1시간 내지 약 200시간 동안 유지된 생산 배양물:
    (i) 약 20℃ 내지 약 37℃인 온도;
    (ii) 미호기성 조건에서 3% 초과로 유지되는 용존 산소량;
    (iii) 액화된 바이오매스에 의해 제공되는 과량의 탄소 기질;
    (iv) 약 3 내지 약 7.5인 pH; 및
    (v) 진공 인가 및 액체-액체 추출로부터 선택되는 부탄올 제거.
19. a. 제11항의 생산 배양물을 제조하는 단계 - 여기서, 효모는 아이소부탄올 경로, 1-부탄올 경로 및 2-부탄올 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 부탄올 생합성 경로를 포함함 - 와;
    b. 부탄올이 생산되는 조건 하에 효모를 발효시키는 단계를 포함하는, 부탄올을 생산하는 방법.
20. (i) 발효성 탄소 기질을 포함하는 배지를 제공하는 단계와;
    (ii) 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 0.5 g 이상인 부탄올 생산 효모 세포의 배양물을 제공하는 단계와;
    (iii) 효모 배양물을 발효성 탄소 기질과 접촉시키고, 그에 의해 글루코스 이용률을 적합한 기간에 걸쳐 유지하고 부탄올을 생산하는 단계를 포함하는, 부탄올 발효 생산용 생산 배양물의 내성을 증가시키는 방법.
21. (i) 발효성 탄소 기질을 포함하는 배지;
    (ii) 글루코스 이용률이 시간 당 건조 세포 중량 1 g 당 약 2.4 g 이상인 효모 세포의 배양물; 및
    (iii) 배지 중 약 1% (w/v) 이상의 농도의 부탄올을 포함하는, 부탄올의 발효 생산용 생산 배양물.
22. 제21항에 있어서, 세포 밀도는 리터 당 약 2.7 g 이상의 건조 세포 중량인 생산 배양물.

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