JP2013528398A - ブタノール産生用の酵母生産培養物 - Google Patents

Abstract

酵母培養物の菌体密度が高い場合の方が、培地中のブタノールに対する耐性が良好になることが発見された。高菌体密度の酵母培養物は、低菌体密度の培養物と比べて生存が長くかつグルコース利用率が高い。したがって、酵母を高菌体密度の培養物に用いるブタノール生産はブタノール産量を増やすうえで有利である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１０年６月１７日に出願の米国仮出願番号第６１／３５５，７３３号の優先権の利益を主張するものであり、この米国仮出願の内容全体は参照により本明細書に援用されている。

電子的に提出された配列表への参照
電子的に提出された配列表の内容（名前：２０１１０６１６＿ＣＬ４５９０ＵＳＮＡ＿ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ；サイズ：２４４，３６５バイト；作成日付：２０１１年６月１６日）は、その全体が参照により本明細書に援用されている。

本発明は、工業微生物学の分野及びブタノールの生成に関し、詳細には、高濃度のブタノールに対して耐性がある酵母有機体の生産培養物に関する。

ブタノールは燃料添加剤として、プラスチック産業においては化学物質原料として、更に食品／フレーバー産業においては食品グレードの抽出剤として役立つ重要な工業化学製品である。毎年１００〜１２０億ポンドものブタノールが石油化学的手段によって生産されており、この汎用化学製品に対する需要は増大する一方であると見込まれる。

ブタノールは化学合成又は発酵によって生産できる。イソブタノールは生物学的に酵母発酵の副生成物として生成され、この属の菌がアミノ酸の不完全代謝の結果として化成する「フーゼル油」の成分でもある。イソブタノールはＬ−バリンの異化作用により特異的に生成されるものであり、一般的に収率が極めて低い。加えて、１−ブタノール生合成経路（特許文献１）、２−イソブタノール生合成経路（特許文献２及び３）、並びにイソブタノール生合成経路（特許文献４）を発現する組み換え微生物産生系の宿主に関しても記載されている。

ブタノール生産のための発酵には宿主微生物が用いられるが、ブタノールはその宿主微生物に対して毒性を持つため、ブタノールの生物産量は概して制限されている。酵母は一般に、培地内のブタノールに対して感応性を持つ。ブタノールに対する酵母菌体の耐性が強まるように遺伝子発現を変更するにあたって、遺伝子工学的手法が採用されてきた。産量を向上させる手法としては、ほかにも、発酵工程の改善が挙げられる。特許文献５には、発酵前又は発酵中に微生物細胞壁を付加して、酵母に対して毒性がありアルコール発酵中に発酵の中断を引き起こす物質を吸着する方法が開示されている。特許文献６には、少なくとも約６０〜１６０ｇ／ｌの菌体のある高ミネラルの塩培地を使用して単細胞蛋白質を生成する方法が開示されている。特許文献７には、発酵ブロスを除去して濾過してから、酵母菌を発酵槽に移して再利用することにより、６％〜約２０％（乾燥菌体重量）密度の発酵を達成する方法が開示されている。

ブタノール感度に起因する影響を低減させることでブタノール収率の増大を可能にする、ブタノール産生用酵母培養物を育成させる方法が、依然求められている。

Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書 Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書 Ｍａｇｇｉｏ−Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開２００７００９２９５７号明細書 米国特許第４，７６５，９９２号明細書 米国特許第４，４１４，３２９号明細書 米国特許第４，２８４，７２４号明細書

本発明は、酵母菌を高密度で存在させたことでブタノールに対する耐性を高めた、ブタノール産生用の培養物を提供する。

本明細書に記載されているのは、ブタノールの発酵産生のための生産培養物であり、
ａ）酵母の代謝に適した炭素基質を含有する培地と、ｂ）グルコース利用率が少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時（ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ）であるブタノール産生用酵母菌の培養物と、ｃ）培地内での濃度が少なくとも約２％（重量／容量）であるブタノールとを含んで構成される。

別の実施形態において、本発明はブタノールの発酵産生用の生産培養物が提供する。この生産培養物は、ａ）酵母の代謝に適した炭素基質を含有する培地と、ｂ）菌密度が少なくとも乾燥菌体重量約２．４グラム／リットル（ｇｄｃｗ／ｌ）であるブタノール産生用酵母菌の培養物と、ｃ）培地内での濃度が少なくとも約２％（重量／容量）であるブタノールとを含む。

更に別の実施形態において、本発明はブタノールの生産方法を提供する。この方法は、本発明の生産培養物を調製する工程であって、酵母がイソブタノール経路及び１−ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む、工程と、酵母をブタノール生産条件の下で発酵させる工程とを含む。

本明細書に記載されているのはブタノールの発酵産生のための生産培養物であり、ａ）酵母の代謝に適した炭素基質を含有する培地と、ｂ）グルコース利用率が少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時であるブタノール産生用酵母菌の培養物と、ｃ）培地内での濃度が少なくとも約２％（ｗ／ｖ）であるブタノールとを含む。

いくつかの実施形態において、菌密度は少なくとも乾燥菌体重量約２．４グラム／リットルである。いくつかの実施形態において、菌密度は少なくとも乾燥菌体重量約７グラム／リットルである。いくつかの実施形態においては、ブタノール産生用酵母菌のグルコース利用率が少なくとも約１グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時である。

いくつかの実施形態において、ブタノール産生用酵母菌は、ａ）突然変異誘発の工程と、ｂ）３％イソブタノールへ曝露する工程と、Ｃ）凍結融解サイクルを反復する工程とを含む方法によって生成された。いくつかの実施形態において、凍結融解サイクルは３回以上繰り返される。いくつかの実施形態において、菌体は少なくとも５回の凍結融解サイクルを含む方法で生成される。

いくつかの実施形態において、ブタノール産生用酵母菌は、ａ）エタノールを含有する培地でブタノール産生用酵母菌を育成する工程と、ｂ）菌体を３０ｇｄｃｗ／Ｌの範囲の密度に濃縮する工程と、ｃ）３％イソブタノールへ曝露する工程と、ｄ）凍結融解サイクルを反復する工程とを含む方法によって生成された。いくつかの実施形態において、凍結融解サイクルは３回以上繰り返される。いくつかの実施形態において、菌体は少なくとも５回の凍結融解サイクルを含む方法で生成される。

いくつかの実施形態においては、ブタノール産生用酵母菌が、ａ）エタノールを含有する培地でブタノール産生用酵母菌を育成する工程と、ｂ）最小１０時間、最大７２時の間にわたって生育させるために、０．１％〜２．０％ブタノールを含有する培地に順次に移す工程と、ｃ）ブタノール産生用の菌体の成長速度を上昇させるために後続の経路にて培地のブタノール濃度を次第に増加させる工程と、ｄ）生育速度の高い菌体を貯留する工程と、ｅ）３％イソブタノールへ曝露する、及び／又は凍結融解サイクルを反復する工程とを含む方法によって生成された。

いくつかの実施形態において、酵母はクラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陽性であり、いくつかの実施形態において、酵母はクラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陰性である。いくつかの実施形態において、酵母はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属のメンバーである。いくつかの実施形態において、酵母はイソブタノール経路及び１−ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む。

いくつかの実施形態においては、ａ）約２０℃〜約３７℃の温度、ｂ）微好気性条件の範囲内で３％より上に維持された溶存酸素、ｃ）液化バイオマスによって過剰に供給された炭素基質、ｄ）約３〜約７．５のｐＨ、（ｄ）真空適用及び液液抽出から選択されたブタノールの除去法、という条件で、培養が約１時間から約２００時間にわたって維持される。

いくつかの実施形態において、培養物のグルコース利用率は少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時である。いくつかの実施形態において、菌密度は少なくとも乾燥菌体重量約７グラム／リットルである。いくつかの実施形態において、ブタノール濃度は少なくとも約２．５％であり、かつ培養物のグルコース利用率は少なくとも約０．４グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時である。いくつかの実施形態において、酵母はイソブタノール経路、１−ブタノール経路及び２−ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む。

いくつかの実施形態において、培養物はＰＮＹ０６０２又はＰＮＹ０６１４を含んで構成される。いくつかの実施形態において、培養物は、ＰＮＹ０６０２又はＰＮＹ０６１４を含みかつブタノール生合成経路を更に含む。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路は、イソブタノール生合成経路である。

本発明の種々の実施形態は、下掲の詳細な説明、図面、及び本出願の一部を構成する添付の配列の記述からより完全に理解し得る。

４つの異なる２−ブタノール生合成経路の図である。 ３つの異なるイソブタノール生合成経路の図である。 １−ブタノール生合成経路の図である。 高菌体密度の酵母培養物における、イソブタノールの存在下でのグルコース利用率を示すグラフある。

特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で、次の生物学的材料が寄託された。

参照によって本明細書に援用されている、次の配列及びこれに添えて提供される配列表は、連邦規則法典第３７巻１．８２１条〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）、及びＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件（規則５．２及び４９．５（ａ−ｂｉｓ）、及び実施細則第２０８号及び附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに使用される記号及び型式は、連邦規則法典第３７巻１．８２２条に記載されている規則に従う。

本出願の一部を構成する詳細な説明から、本発明をより完全に理解できる。

別途定義がない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明の帰属する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、当該の定義を含む本出願によって統制されるものとする。文脈により別段要求されない限り、その用語が単数形であっても複数を含み、その用語が複数形であっても単数を含むものとする。特許又は特許公報を特定の項のみに限定して参照により引用したことが明示されていない限り、本明細書中で言及されている全ての公告、特許及び他の参照は、あらゆる目的のために、個々の公告又は特許出願を参照により引用したことを具体的かつ個別に示してあるかのように、全体として参照することによって引用したものとする。

本発明は、ブタノール生産において培地内に存在するブタノールに対する感度を低減することで発酵面での改良を施した酵母生産培養物に関する。ブタノールは、イソブタノールと１−ブタノールとを含有する。加えて、本発明は本培養物を用いたブタノール生産方法に関する。ブタノールは溶剤及び／又は抽出剤として利用されているほか、化石燃料の代替としても役立つ。

特許請求の範囲及び明細書を解釈するにあたって、次の定義及び略語を使用する。

本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有してなる（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」若しくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、又は他の何らかの変形態様は、非排除的な包含を規定することを意図したものである。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、物品又は装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるわけでなく、明示的に記載されていない他の要素、又はそのような組成物、混合物、工程、方法、物品若しくは装置に固有の他の要素も含み得る。更に、そうでない旨を明示的に記述しない限り、「又は（ｏｒ）」は、排他的な「又は」でなく包含的な「又は」を指す。例えば、条件Ａ又はＢは、「Ａが真で（又は存在し）かつＢが偽である（又は存在しない）」、「Ａが偽で（又は存在せず）かつＢが真である（又は存在する）」、並びに「Ａ及びＢが共に真である（又は存在する）」のいずれかよって満たされる。

また、本発明の要素又は成分に先行する不定冠詞「１つの（ａ）」、及び「１つの（ａｎ）」は、要素又は成分の実例（即ち、実現値）の数に関して非制限的であることを意図したものである。したがって、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ又は少なくとも１つを含むものとして読むべきであり、数が単一である旨が明らかに意味されていない限り、要素又は成分の単数形の単語も複数を含むものとする。

本明細書で用いられる「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」又は「本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」は非制限的な用語であり、特定の発明に係る何らかの単一の実施形態に言及するものではなく、明細書及び特許請求の範囲に記載されている、可能なあらゆる実施形態を含む。

本明細書において、本発明に用いられる成分又は反応物の数量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実世界で濃縮物を作成する際若しくは溶液を使う際に用いられる典型的な測定手順及び液体処理手順、それらの手順における不注意による誤り、組成物の製造又は方法の実施に用いられる原料の製造過程、供給源、又は純度における差異、並びにこれらに類するものを通して発生し得る、数量における変形態様を指す。「約」という用語はまた、特定の初期混合物から生じる組成物の様々な平衡条件に起因する分量の誤差も含む。「約」という用語によって修飾されるかどうかを問わず、特許請求の範囲には量に対する等価物が含まれる。一実施形態において「約」という用語は、報告された数値の１０％の範囲内、好ましくは５％の範囲内に収まることを意味する。

本明細書において「ブタノール」という用語は、１−ブタノール、イソブタノール、又はそれらの混合物を指す。

「イソブタノール生合成経路」又は「イソブタノール経路」という用語は、ピルベートからイソブタノールを産生する酵素経路のことを指す。

「１−ブタノール生合成経路」又は「１−ブタノール経路」という用語は、ピルベートから１−ブタノールを産生する酵素経路のことを指す。

「低菌体密度」という用語は、約６×１０^５菌体／ｍｌ未満の菌体濃度を指す。例えば、ＯＤ_６００が０．０５の培養物は、１．０ ＯＤ_６００が１０^７菌体／ｍｌに相当するという関係を基準にすると、低菌体密度の培養物である。

「高菌体密度」という用語は、約５×１０^７菌体／ｍｌを超える菌体濃度を指す。例えば、ＯＤ_６００が５．０及び乾燥菌体重量約２．４グラム／リットル（ｇｄｃｗ／Ｌ）の培養物は、１．０ ＯＤ_６００が１０^７菌体／ｍｌ及び０．４ｇｄｃｗ／Ｌに相当するという関係を基準にすると、高菌体密度の培養物である。

「グルコース利用率」及び「グルコース消費率」という用語は、過剰なグルコース条件下で菌体培養物が代謝するグルコースの分量を指す。グルコース利用率は、本明細書中の実施例３に記載されている培養条件に基づき、炭素基質としてグルコースを用い、定義済みの菌体密度の培養物にて定義済みのブタノール濃度で測定される。生産に用いられる培地に代替の炭素基質が存在する場合は、その培養物ではグルコース利用率を測定できない。この場合は、炭素基質としたグルコースを含む別個の培養物で測定する必要がある。

「炭素基質」、又は「発酵性炭素基質」若しくは「好適な炭素基質」という用語は、本発明に係る培養物で代謝可能な炭素供与源を指し、特に、単糖、オリゴ糖、及び多糖からなる群から選択される炭素供与源を含む。

「発酵産生」という用語は、微生物の代謝活性によって（この場合、本発明に係る培養物によって）炭素供与源が生成物に変換されることを指す。

「生育可能」という用語は、本明細書に記載されている生育条件下で、又はブタノール含有の生育培地にて少なくとも約２％（ｗ／ｖ）の濃度で繁殖可能若しくは培養可能な菌体（例えば、酵母菌）培養物を指す。一部の実施形態において生育可能な培養物は、上述した条件下で２４時間繁殖可能又は培養可能である。

様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子又はコード領域について言及する場合の「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを変化させることなく、宿主有機体の典型的なコドン使用を反映するような核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの変化を指す。そのような最適化には、少なくとも１つ若しくは２つ以上、又は有意数のコドンを、その有機体の遺伝子内で使用頻度の高い１つ以上のコドンで置換することが含まれる。

高菌体密度の培養物におけるブタノール耐性の改善
本明細書に開示されているのは、高菌体密度の培養物内の酵母菌が、低菌体密度の培養物内の酵母菌と比較して高いブタノール耐性を示すという発見である。本目的に供する高菌体密度の培養物とは、菌体密度が少なくとも乾燥菌体重量約２．４グラム／リットル（ｇｄｃｗ／ｌ）である培養物を指す。菌体密度が約２．４のｇｄｃｗ／Ｌより大きい培養物（例えば、２４ｇｄｃｗ／Ｌ以上を含む、少なくとも約３．８ｇｄｃｗ／ｌ以上）は、高菌体密度の培養物である。高菌体密度は、約３ｇｄｃｗ／Ｌ超、約５ｇｄｃｗ／Ｌ超、約７ｇｄｃｗ／Ｌ超、約１０ｇｄｃｗ／Ｌ超、約２０ｇｄｃｗ／Ｌ超、又は約３０ｇｄｃｗ／Ｌ超であり得る。約３５〜４０ｇｄｃｗ／Ｌと同程度の菌体密度が有用となり得ると想定される。酵母にとっては、高菌体密度は、菌体濃度が約５×１０^７菌体／ｍｌを超えるか、又はＯＤ_６００の測定値が少なくとも５であると特徴づけることができる。一部の実施形態において、菌体密度は、本明細書に記載されている任意の範囲の菌体密度であり得る。例えば、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｄｇｄｃｗ／Ｌ〜約３５ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約１０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｃｄｗ／Ｌ〜約７ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約５ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｄｇｄｃｗ／Ｌ〜約３５ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約１０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｃｄｗ／Ｌ〜約７ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約５ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｄｇｄｃｗ／Ｌ〜約３５ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３０ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約１０ｇｄｃｗ／Ｌである。比較目的のために、低菌体密度の培養物は約６×１０^５菌体／ｍｌ未満である。

本明細書で、酵母のブタノール耐性の上昇が、生存率及び／又はグルコース利用率によって評価された。これにより、低菌体密度の酵母菌体培養物と比較して高菌体密度の培養物の方が、ブタノール耐性が改善されたことが発見された。一定量の生きた菌体のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を分析して生存を測定した。１％ブタノールの存在下における高菌体密度の酵母培養物の生存率は、本明細書で検定された条件下にてブタノールを含まない対照培養物の生存率と比較して、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、及び最大１００％であることが見出された。生存率は変化し、ブタノール濃度、特定のブタノール異性体、酵母の菌株等の複数因子に影響される。一方、１％ブタノール中での低菌体密度１／１００の培養物の生存率は、ブタノールを含まない対照培養物の生存率と比較して最大１３％であることが見出された。

酵母菌体密度がアルコール耐性に及ぼす影響は、アルコール類の存在に対すして一般化される反応のひとつでないことが分かった。菌体密度がブタノール耐性に及ぼす影響は、最も広範に生産されるアルコールであるエタノールの存在下で菌体密度が及ぼす影響とは異なっていた。事実上、本明細書に記載されているように（実施例１を参照）、エタノール中では逆の影響が観測された。つまり、高菌体密度培養物よりも低菌体密度の培養物の方が、高い生存率を示した。

本明細書で、高菌体密度（３．８ｇｄｃｗ／Ｌ及び２４ｇｄｃｗ／Ｌ）の培養物が、１．５％イソブタノール中では少なくとも１グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時の速度でグルコースを利用することが見出された。１％イソブタノール中では、計算速度は少なくとも約１．４グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時であった。２％イソブタノール中では、速度は少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時、２．５％イソブタノール中では、速度は少なくとも約０．４グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時、３％イソブタノール中では、速度は少なくとも約０．２グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時であった。

ゆえに、本明細書で提供されるのは、ブタノール耐性の上昇を達成するために、少なくとも約２．４ｇｄｃｗ／Ｌの高菌体密度を有するブタノール産生用の培養物である。高菌体密度の培養物は、少なくとも約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ、３．８ｇｄｃｗ／Ｌ、又は２４ｇｄｃｗ／Ｌ以上であってもよい。生産培養物中のブタノール濃度は少なくとも約１％であり、少なくとも約１．５％、２．０％、２．５％、又は３．０％（ｗ／ｖ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ブタノール濃度は、少なくとも約２．０％である。いくつかの実施形態において、ブタノール濃度は、本明細書に開示されている任意の範囲のブタノール濃度である。例えば、約１％〜約３％、約１．５％〜約３％、約２％〜約３％、約１．５％〜約２．５％、又は約２％〜約３％（ｗ／ｖ）である。ブタノールはイソブタノール又は１−ブタノールのいずれであってもよい。本生産培養物において、グルコース利用率は、少なくとも約０．２グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時（ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ）である。グルコース利用率はそれよりも上昇してもよい。例えば、少なくとも約０．３、０．４、０．５、０．６、１、１．５、２．４又は３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈである。一部の実施形態においてブタノール濃度は少なくとも約２％ｗ／ｖであり、グルコース利用率は少なくとも約０．５、０．６、１、１．５、２．４又は３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈである。一部の実施形態において、グルコース利用率は、少なくとも約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈである。一部の実施形態において、グルコース利用率は、本明細書に記載されている任意の範囲のグルコース利用率であり得る。例えば、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約２．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約０．６ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約０．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約２．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約０．６ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約２．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、又は約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈであり得る。一部の実施形態において、グルコース濃度は少なくとも約２．０％ｗ／ｖであり、グルコース利用率は約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約２．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約０．６ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約２．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約０．６ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約３ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約２．４ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ、又は約１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ〜約１．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈであり得る。達成されるグルコース利用率は、ブタノール濃度及び培地内の特定の種類のブタノールによって決まる。一般的に、ブタノール濃度が増えるにつれ、速度は低減する。酵母菌は一般的に、イソブタノール及び１−ブタノールに対して同様に反応するが、２−ブタノールに対する感度は低い。

グルコース利用率は、約３０℃〜約４５℃の温度で定量されるのが一般的であるが、約３０℃〜約３７℃の温度で定量することもできる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている培養物のグルコース利用率は、約３０℃〜約４５℃の温度で約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時を上回る。一部の実施形態において、本明細書に記載されている培養物のグルコース利用率は、約３０℃〜約３７℃の温度で約０．５ｇ／ｇｄｃｗ／ｈを上回る。一部の実施形態において、本明細書に記載されている培養物のグルコース利用率は、約３０℃〜約３２℃の温度で約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時を上回る。一部の実施形態においては、少なくとも約２％（ｗ／ｖ）の濃度のブタノールを含む培地に少なくとも約６時間接触させた培養物について、グルコース利用率を定量する。一部の実施形態において、本明細書に記載の培養物は、少なくとも約２％（ｗ／ｖ）の濃度のブタノールを含む培地に少なくとも約６時間接触させた培養物のグルコース利用率は、約０．５グラム／乾燥菌体重量のグラム換算値／時を上回る。

一部の実施形態において本明細書に記載されている培養物は、生育可能な培養物である。

高菌体密度の生産培養物の調製
本ブタノール産生用の高菌体密度の培養物は、菌体密度を少なくとも約２．４ｇｄｃｗ／Ｌとする任意の方法で調整できる。菌体密度が、例えば２．４ｇｄｃｗ／Ｌ、２．７ｇｄｃｗ／Ｌ、２．８ｇｄｃｗ／Ｌ、３．８ｇｄｃｗ／Ｌ、又は２４ｇｄｃｗ／Ｌ以上の培養物は、高菌体密度の培養物として調整し得る。一部の実施形態において菌体密度は、本明細書に記載されている任意の範囲の菌体密度であり得る。例えば、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３５ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約１０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｃｄｗ／Ｌ〜約７ｇｄｃｗ／Ｌ、約２．４ｇｄｃｗ／Ｌ〜約５ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３５ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約１０ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｃｄｗ／Ｌ〜約７ｇｄｃｗ／Ｌ、約３ｇｄｃｗ／Ｌ〜約５ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３５ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約３０ｇｄｃｗ／Ｌ、約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約２０ｇｄｃｗ／Ｌ、又は約７ｇｄｃｗ／Ｌ〜約１０ｇｄｃｗ／Ｌである。例えば、ブタノール生産能を有する酵母菌を、曝気された培養物中で生育させることにより、ブタノール産量を最小限に抑えるという方法もある。例えば、クラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陽性酵母菌は、高曝気かつ低グルコース濃度にて生育することができ、これにより、当該技術分野で周知であるように、ブタノール産量ではなく、呼吸及び菌体の量産が最大となる。グルコース濃度は概して約０．２ｇ／Ｌ未満に維持される。曝気された培養物は、高菌体密度に生育させた後、本生産培養物として使用できる。別の態様では、ブタノール生産能を有する酵母菌を生育させ、濃縮して高菌体密度の培養物を生産し得る。

更に、酵母菌の生育中に活性を最小限に抑えられるようにブタノール生合成経路の発現を調節することによっても、高菌体密度を得ることができる。生育条件又は培地成分により制御可能なプロモーターからその経路の１種以上の遺伝子を発現させ、その発現を調節することもできる。本培養物においては菌体を高菌体密度まで生育させ、生産培養物として用いるか又は種培養物として用い、高菌体密度の生産培養を開始することもできる。

高菌体密度の培養物は、下掲の発酵培地及び培養条件の項に記載されている条件を用いた培地にて生育される。ただし、呼吸による成長を最大にするために、グルコースを約２ｇ／Ｌまでに制限し、好気条件を上に記載した通りとする。

ブタノール産生用酵母菌
本高菌体密度の生産培養物は、ブタノールを産生する任意の酵母の培養物であってもよい。酵母はクラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陽性であってもよいし、クラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陰性であってもよい。クラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陽性の酵母菌は、クラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）効果、即ち、好気性培地に高濃度のグルコースを添加したときに細胞呼吸が阻害されるという現象を示す。好適な酵母としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な菌株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、イサチェンキアオリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

エンジニアリング又は別の方法によってブタノールを産生し得る酵母であればどのようなものでも、本培養物に使用できる。酵母菌体内にイソブタノール、１−ブタノール、又は２−ブタノール産生用の生合成経路が構成されると、ブタノールが生産されるようになる。経路遺伝子は、内因性遺伝子及び／又は非相同遺伝子を含み得る。

組み換え宿主菌体のための標準組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ． Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称する）によって記載されているほか、Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）によっても記載がなされている。当該技術分野で周知の分子ツール及び技術としては、ほかにも、オーバラップ伸長ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子座における突然変異のための陽性選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７，３４５−３４６；Ｍ Ａ Ｒｏｍａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎｕａｒｙ １１；１９（１）：１８７）、Ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組み換えシステム、変異体ｌｏｘ部位及びＦＬＰ基質の突然変異（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：２０８７−２０９６；Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１，Ｉｓｓｕｅ ２，Ｐａｇｅｓ ４０５−４２１；Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐａｇｅｓ ６４９−６５９）、「シームレスな」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、並びにギャップ修復の方法論（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８：２０１−２１６；１９８１）が挙げられる。

酵母の遺伝子発現の方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載されているように、当該技術分野で知られている。例えば、プロモーター及びターミネーターをコード領域に操作可能に結合することによって、キメラ遺伝子を発現用に構築できる。使用し得るプロモーターとしては、例えば、構成的プロモーターＦＢＡ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１及びＧＰＭ１、並びに誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０及びＣＵＰ１が挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーター ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号：５５）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ（配列番号：５６）、ＵＡＳ（ＦＢＡ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号：５７）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号：５８）、及びＵＡＳ（ＰＧＫ）−ＯＬＥ１ｐ（配列番号：５９）が挙げられる。キメラ遺伝子構造内に発現用に使用し得る好適な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、及びＡＤＨ１ｔが挙げられるが、これらに限定されない。

好適なプロモーター、転写ターミネーター及びコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローニングすることによって、酵母菌内に入れて形質転換できる。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母菌株の両方での繁殖を可能にしている。ベクターは典型的には、所望の宿主内での自律増殖又は染色体組み込みを可能にする、選択可能マーカー及び配列を含んでいる。酵母内で一般に使用されるプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母の２μ複製起点、及び栄養選択用のマーカーを含んだシャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５及びｐＲＳ４２６（米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）であり、これら４つのベクター用の選択マーカーは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ２（ベクターｐＲＳ４２５）及びＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。発現用のキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での標準分子クローニング技術、又は酵母内でのギャップ修復組み換え法のいずれかかによって実施できる。

ギャップ修復クローニング手法は、酵母内での高効率な相同組み換えを利用する。典型的には、酵母ベクターＤＮＡは（例えば、その多重クローニング部位内で）消化されるため、その配列内には「ギャップ」が生じる。５’末端及び３’末端の両方に２１番目以降の塩基対配列を含んだインサートＤＮＡがいくつか生成され、それらの末端は互いに順次に重なり、ベクターＤＮＡの５’及び３’終端とも順次に重なる。例えば、「遺伝子Ｘ」用に酵母発現ベクターを構築するには、酵母プロモーター及び酵母ターミネーターを発現カセット用として選択する。プロモーター及びターミネーターは発酵ベクターＤＮＡから増幅され、遺伝子Ｘは、そのソース有機体からＰＣＲ増幅されるか、又は遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから採取される。線状化ベクターの５’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、及びターミネーターと線状化ベクターの３’末端との間には少なくとも２１番目の塩基対オーバーラップ配列が存在する。次いで、「ギャップを生じた」ベクター及びインサートＤＮＡを一緒に酵母菌株に入れて形質転換し、プラスミド上での栄養選択マーカーの相補を可能にする適切な混合化合物を含む培地上に蒔く。正しい挿入物の組み合わせが存在することは、選択した菌体から調製したプラスミドＤＮＡを用いてＰＣＲマッピングにより確認できる。次いで、酵母菌から単離されたプラスミドＤＮＡ（通常は低濃度）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（例えば、ＴＯＰ１０）に入れて形質転換することができ、その後、ミニプレップ及び制限酵素マッピングを行ってプラスミド構築物を更に検証する。最後に、構築物をＤＮＡ配列分析で検証してもよい。

ギャップ修復技術と同様に、酵母ゲノムへの組み込みにおいても酵母内の相同組み換え系を利用する。典型的に、制御要素（プロモーター及びターミネーター）を加えたコード領域と栄養要求性マーカーとを含んでなるカセットは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅する際、プライマーを用いる。このプライマーはカセットにハイブリダイズし、かつ挿入の所望されるゲノム領域の領域５’及び３’に対して配列相同性を有する塩基対を４０〜７０個含んだプライマーである。次いで、ＰＣＲ生成物を酵母に入れて形質転換し、組み込まれた栄養選択マーカーの選択を可能にする適切な混合化合物を含む培地上に蒔く。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体の位置「Ｙ」に組み込むためには、プロモーターとコード領域Ｘとターミネーターとの構築物をプラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増幅し、ＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７：６１−６８）によるか又は一般の制限消化及びクローニングによるかのいずれかで独立栄養性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合させる。プロモーターとコード領域ＸとターミネーターとＵＲＡ３領域とを含む全カセットを、酵母菌染色体上の場所「Ｙ」の領域５’及び３’に対して相同性を有する塩基対を４０〜７０個含んだプライマー配列を用いて、ＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ生成物を酵母に入れて形質転換し、ウラシル欠乏の生育培地上で選択する。形質転換体は、コロニーＰＣＲ又は染色体ＤＮＡの直接シークエンシングのいずれかで検証できる。

ブタノール生合成経路
ブタノール産生用の好適な経路は、当該技術分野において周知であり、特定の好適な経路は本明細書に記載されている。一部の実施形態において，ブタノール生産経路は、宿主菌体に対して非相同遺伝子を少なくとも１つ含んで構成される。一部の実施形態においてブタノール生合成経路は、宿主菌体に対して非相同遺伝子を２つ以上含んで構成される。一部の実施形態においてブタノール生合成経路は、生合成経路のあらゆるステップと一致するポリペプチドをコードする非相同遺伝子を含んで構成される。当該技術分野で公知であるように、配列は宿主菌体における発現のためにコドン最適化できる。

基質から生成物への変換に使用できる遺伝子及びポリペプチドは本明細書に記載されており、そのような遺伝子及びポリペプチドを同定する方法は本明細書及び／又は当該技術分野において記載されている。例えば、イソブタノールに関しては米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載がある。

本菌体においてエンジニアリングし得る２−ブタノール産生用の生合成経路は、当該技術分野（例えば、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書）に開示されている。図１は、開示されている２−ブタノール生合成経路の線図である。例えば、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書中の経路は、
− 例えばアセト乳酸シンターゼで触媒される、ピルベートからアセト乳酸への変換ステップ（図１のステップａ）と、
− 例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼで触媒される、アセト乳酸からアセトインへの変換ステップ（図１のステップｂ）と、
− 例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼで触媒される、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換ステップ（図１のステップｉ）と、
− 例えばジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼで触媒される、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換ステップ（図１のステップｊ）と、
− 例えばブタノールデヒドロゲナーゼで触媒される、２−ブタノンから２−ブタンノールへの変換ステップ（図１のステップｆ）とを含む。

米国特許出願公開第２００９−０３０５３６３号明細書に開示されているように、酵母ｐｄｃ−宿主菌体内での２，３−ブタンジオール中間体の生成においては、細胞質ゾル内にアセト乳酸シンターゼが発現し得る。ＥＣ２．２．１．６（２００２年に４．１．３．１８から転換された）に属するアセト乳酸シンターゼ酵素（別称：アセトヒドロキシ酸シンターゼ）は周知であり、蛋白新生アミノ酸ロイシン及びバリンの生合成経路、並びに若干の有機体のアセトインからの２，３−ブタンジオールの発酵産生の経路に関与する。アセト乳酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが様々な供与源から単離されることは、当業者であれば理解されよう。ケト酪酸よりも寧ろピルベートに対して強い基質選択性を有するアセト乳酸シンターゼ（Ａｌｓ）の酵素活性は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のａｌｓＳ及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のｂｕｄＢを介してコードされるといったように、用益が特定されている（Ｇｏｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（６）：３４４４−３４４９（１９９０）；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１（３）：９１７−９２２（１９７５））。Ａｌｓはバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：３、蛋白質：配列番号：４）由来、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：１、蛋白質：配列番号：２）由来のものと、及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：５、蛋白質：配列番号：６）由来のものとがあり、それらは本明細書に記載されている。

使用し得る付加的なＡｌｓコード領域及びコードされた蛋白質としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：７、蛋白質：配列番号：８）、リステリアモノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ （ＤＮＡ： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；蛋白質：配列番号：１０）、ストレプトコッカスムタン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：１１、蛋白質：配列番号：１２）、ストレプトコッカス好熱性（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：１３、蛋白質：配列番号：１４）、ビブリオ・アングスタム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｓｔｕｍ）（ＤＮＡ：配列番号：１５、蛋白質：配列番号：１６）、及びバシラス−セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：１７、蛋白質：配列番号：１８）由来のものが挙げられる。アセト乳酸シンターゼをコードするＡｌｓ遺伝子で、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８を有する任意の遺伝子に対して少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、又は少なくとも約９６％、９７％若しくは９８の配列同一性を有し、かつピルベートをアセト乳酸に変換するものであれば、どのようなものでも使用できる。同一性算出はＣｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１及び蛋白質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いることによって行う。

加えて、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書には、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ配列の最も近い１００個のアセト乳酸シンターゼ類を記述した系統樹が提供されており、それらはいずれも使用し得る。当業者に周知であるように、本菌株に使用できる付加的なＡｌｓ配列は、文献及びバイオインフォマティクスデータベースで同定し得る。バイオインフォマティクスを使用したコード及び／又は蛋白質配列の同一性算出は、典型的には、ＢＬＡＳＴ（上述）を使用し、一般公開されているデータベースで、本明細書に記載されているような既知のＡｌｓコード配列又はコードされたアミノ酸配列で検索して行う。すでに特定したように、同一性算出はＣｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法に基づく。加えて、上に記載したように、自然における他の相同体を同定する際は、本明細書に記載されている配列、又は当該技術分野において記述されている配列を用いることもできる。

アセト乳酸シンターゼの細胞質ゾル発現は、アセト乳酸シンターゼ蛋白質をコードする配列を含むがミトコンドリアターゲティングシグナル配列を含まない遺伝子で形質転換するによって達成される。酵母の遺伝子発現の方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を参照のこと）。キメラ遺伝子（プロモーター及びターミネーターを作動可能に結合したコード領域を含む）、ベクター、クローニング法及び組み込み法を使用した発現は、上に記載した通りである。

アセト乳酸からアセトインへの変換は、ＥＣ４．１．１．５と呼ばれるアセト乳酸デカルボキシラーゼ酵素による。この酵素は、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：２１、蛋白質：配列番号：２２）、クレブシエラ−テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ＤＮＡ：配列番号：２３、蛋白質：配列番号：２４）、及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：１９、蛋白質：配列番号：２０）から得られる。アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子で、配列番号：２０、２２又は２４を有する任意の遺伝子に対して少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、又は少なくとも約９６％、９７％若しくは９８％の配列同一性を有し、かつアセト乳酸をアセトインに変換するものであれば、どのようなものでも使用できる。

アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換は、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（別名：アセトインレダクターゼ）による。ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アルコール生成物における（Ｒ）−又は（Ｓ）−立体化学的生成に対して特異性を有し得る。（Ｓ）−特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．１．１．７６として知られており、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：２５、蛋白質：配列番号：２６）から得られる。（Ｒ）−特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．１．１．４として知られており、例えば、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号２７、蛋白質：配列番号：２８）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号２９、蛋白質：配列番号３０）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＢＤＨ１；ＤＮＡ：配列番号：５４、蛋白質：配列番号５５）から得られる。ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子で、配列番号：２６、２８、３０又は５５を有する任意の遺伝子に対して少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、又は少なくとも約９８の配列同一性を有し、かつアセトインを２，３−ブタンジオールに変換するものであれば、どのようなものでも使用できる。

補因子アデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２）を利用するジオールデヒドラターゼ（別称：ブタンジオールデヒドラターゼ）は、ＥＣ４．２．１．２８として知られている。同じく補因子アデノシルコバラミンを利用するグリセロールデヒドラターゼは、ＥＣ４．２．１．３０として知られている。ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、活性に必要な３種のサブユニットを有する。米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書には、本菌体における２−ブタノン経路若しくは２−ブタノール経路に使用できる様々なジオールデヒドラターゼ類及びグリセロールデヒドラターゼに関して一連の３種のサブユニットが記載されているほか、使用し得る付加的なジオール酵素及びデヒドラターゼ酵素を同定する隠れマルコフモデルの作成及び使用例も記載されている。

ブタノールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの広範なファミリーのサブセットであり、ＮＡＤ^＋依存又はＮＡＤＰ^＋依存であってもよい。ＮＡＤ依存酵素はＥＣ１．１．１．１として知られており、ＮＡＤＰ依存酵素はＥＣ１．１．１．２として知られている。米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書には、本菌体における開示の２−ブタノール生合成経路内に使用し得るブタノールデヒドロゲナーゼの配列の例が挙げられている。

その全体が参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００９０１５５８７０Ａ１号明細書には、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書に開示されている生合成経路を用いた２−ブタノール生産のための、キメラ遺伝子の構築物及び酵母の遺伝子工学が記載されている。遺伝子構築及び発現の詳細は上述の通りであり、本明細書の実施例にも記載されている。

この経路でのロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＲｄｈｔＡ）（蛋白質配列番号：３２、コード領域配列番号：３１）からのブタンジオールデヒドラターゼの酵母に使用する方法は、共通に所有されている同時係属の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０Ａ１号明細書に開示されている。この酵素は、ロゼブリアイヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＲｄｈｔＢ）から（蛋白質配列番号：３４，コード領域配列番号：３３）からのブタンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼと共に用いられる。このブタンジオールデヒドラターゼは、補酵素Ｂ_１２を必要としないため多くの宿主内で所望される。使用し得る別のＢ_１２依存ジオールデヒドラターゼは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来で、かつｐｄｕＣ、ｐｄｕＤ及びｐｄｕＥの３つのサブユニットを有するものであり、国際公開第２００９０４６３７０号パンフレットに開示されている。

図２のあらゆる経路内での２−ブタノンから２−ブタノールへの変換の最終ステップに有用な酵素は、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）として同定されるバクテリアの環境分離から単離されるブタノールデヒドロゲナーゼは、であり、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００９０２６９８２３号明細書（ＤＮＡ：配列番号：３５、蛋白質配列番号：３６）に開示されている。

図２の他の経路における遺伝子及びその発現は、米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書に開示されている。当業者に周知であるように、開示されている酵素活性を本菌株内で発現させるために使用し得る付加的な配列は、バイオインフォマティクスデータベース内の文献で同定し得る。バイオインフォマティクスを用いたコード及び／又は蛋白質配列の同一性算出は、典型的には、ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））等の配列分析ソフトを使用し、一般公開されているデータベースで、本明細書に記載されているような既知のコード配列又はコードされたアミノ酸配列で検索して行う。同一性算出は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づいて行う（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２））に記載されているほか、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標） ｖ６．１プログラムにも見られる）。マルチプルアラインメント用のデフォルトパラメーター（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、遅延分岐配列（％）＝３０、ＤＮＡトランジション重量＝０．５、蛋白質重量マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡ重量マトリックス＝ＩＵＢ）。

加えて、本明細書に記載されている配列、又は当該技術分野において記述されている配列を用いて、自然における他の相同体を同定することもできる。例えば、本明細書に記載されているコード用の核酸フラグメントのそれぞれを用い、相同蛋白質をコードする遺伝子を単離することもできる。配列依存プロトコールを使用した相同遺伝子の単離は、当該技術分野において周知である。配列依存プロトコールの例としては、
１）核酸ハイブリダイゼーションの方法、
２）ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅の方法。核酸増幅技術（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４（１９８５）に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、又はＷａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）に記載の鎖置換増幅（ＳＤＡ）等）の多様な用途によって例証されているもの。並びに
３）ライブラリ構築及び相補によるスクリーニングの方法が挙げられるが、これらに限定されない。

本菌体内でエンジニアリングし得るイソブタノール産生用の生合成経路は、当該技術分野（例えば、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書）において開示されている。図２は、開示されているイソブタノール生合成経路の線図である。米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１に記載されているように、実施例のイソブタノール生合成経路におけるステップは、
− 例えばアセト乳酸シンターゼで触媒される、ピルベートからアセト乳酸への変換ステップ（図２のステップａ）と、
− 例えばアセトヒドロキシ酸イソマーレダクターゼ（別称：ケトール酸レダクトイソメラーゼ）で触媒される、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換ステップ（図２のステップｂ）と、
− 例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（別称：ジヒドロキシ酸脱水酵素デヒドラターゼ）で触媒される２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換ステップ（図２のステップｃ）と、
− 例えば分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼで触媒される、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換ステップ（図２のステップｄ）と、
− 例えば分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼで触媒される、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換ステップ（図２のステップｅ）とを含む。

アセト乳酸シンターゼについては、２，３−ブタンジオール経路との関連で上述した通りである。

アセトヒドロキシ酸イソマーレダクターゼ（別称：ケトール酸レダクトイソメラーゼ）（ＫＡＲＩ）は、電子供与体としてＮＡＤＰＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩）を当然使用し得る。ＫＡＲＩには、ＥＣ番号１．１．１．８６によって知られているものが含まれる。ＫＡＲＩ酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：３７、蛋白質：配列番号：３８）からのＩＬＶ５を含めて記載されている。ケトール酸リダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）は、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９０１６３３７６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９７５１９Ａ１号明細書、及びＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレットに記載されており、全ては参照により本明細書に援用される。上記特許文献で開示されているＫＡＲＩの実施例は、コレラ菌（ＤＮＡ：配列番号：３９、蛋白質：配列番号：４０）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１（ＤＮＡ：配列番号：４１、蛋白質：配列番号：４２）、蛍光菌ＰＦ５（ＤＮＡ：配列番号：４３、蛋白質：配列番号：４４）、及びＰｆ５．ＩｌｖＣ−Ｚ４Ｂ８変異体蛍光菌アセトヒドロキシ酸リダクトイソメラーゼ（ＤＮＡ：配列番号：４５、蛋白質：配列番号：４６）由来のものである。別のＫＡＲＩは、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：５８、蛋白質：配列番号：５９）のｉｌｖＣ遺伝子によってコードされる。ＫＡＲＩには、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変種「Ｋ９Ｇ９」及び「Ｋ９Ｄ３」（それぞれ配列番号：６２及び６１）も含まれる。

アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ（別称：ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）（ＤＨＡＤ）は、ＥＣ番号４．２．１．９によって知られている。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許第７，８５１，１８８号明細書に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：４７、蛋白質：配列番号：４８）のＩＬＶ３を含めて記載されている。ストレプトコッカスムタン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ（ＤＮＡ：配列番号：４９、蛋白質：配列番号：５０）等の付加的な［２Ｆｅ−２Ｓ］^２＋ ＤＨＡＤ配列、及び使用し得る付加的なＤＨＡＤ配列を得る目的に使用可能な［２Ｆｅ−２Ｓ］^２＋ ＤＨＡＤ酵素の同定方法は、参照により本明細書に援用されている同時係属の米国特許出願公開第２０１０００８１１５４号明細書に開示されている。

分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）は、ＥＣ番号４．１．１．７２で知られている。分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＫｉｖＤ（ＤＮＡ：配列番号：５１、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）配列番号５３における発現のために最適化されたコドン、蛋白質：配列番号：５２）を含めて記載されている。付加的な分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼとしては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：５４、蛋白質：配列番号：５５）内での発現用に最適化されたコード配列を持つバシラスサチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のもの、及び上述のようにバイオインフォマティクスを用いれば当業者によって容易に同定されるその他のものが挙げられる。

分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２６５によって知られているが、他のアルコールデヒドロゲナーゼの項（特に、ＥＣ１．１．１．１又は１．１．１．２）にも分類し得る。これらの酵素は、ＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はＮＡＤＰＨを電子供与体として利用する。分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の配列及びそのコード領域の例は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書に記載されている。

米国特許出願公開第２００９０２６９８２３Ａ１号明細書には、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であるＳａｄＢ（ＤＮＡ：配列番号：３５、蛋白質：配列番号：３６）が記載されている。アルコールデヒドロゲナーゼは、ウマ肝臓ＡＤＨ（ＨＡＤＨ；Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のために最適化されたコドン、ＤＮＡ：配列番号：５６、蛋白質：配列番号：５７）及びベイエリンキアインディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ（蛋白質配列番号：７４）、及び上述のようにバイオインフォマティクスを用いれば当業者によって容易に同定されるその他のものも含有している。

付加的な２つのイソブタノール経路用の酵素を発現させる目的に使用できる遺伝子は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１に記載されている。上に記載したように、３つの経路全てに使用できる付加的な遺伝子は、当業者であれば同定し得る。

加えて、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１明細書には、キメラ遺伝子及び酵母の遺伝子エンジニアリングの構築物が記載されており、開示されている生合成経路を用いたイソブタノールの生成についてはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の例を挙げて説明してある。遺伝子構築及び発現の詳細は上述の通りであり、本明細書の実施例にも記載されている。

本菌体においてエンジニアリングが可能な１−ブタノール産生用の生合成経路は、参照により本明細書に援用されている同時係属の米国特許出願公開第２００８０１８２３０８号明細書に開示されている。図３は、開示されている１−ブタノール生合成経路の図である。米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書に記載されているように、開示されている１−ブタノール生合成経路のステップは、
− 例えばアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼで触媒される、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換工程（図３のステップａ）と、
− 例えば３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼで触媒される、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換工程（図３のステップｂ）と、
− 例えばクロトナーゼで触媒される、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換工程（図３のステップｃ）と、
− 例えばブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼで触媒される、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換工程（図３のステップｄ）と、
− 例えばブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼで触媒される、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換工程（図３のステップｅ）と、
− 例えばブタノールデヒドロゲナーゼで触媒される、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換工程（図３のステップｆ）とを含む。

これらの酵素を発現させる目的に使用できる遺伝子は、米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書に記載されている。上に記載したように、使用可能な付加的な遺伝子は、当業者であれば同定し得る。これらの遺伝子を酵母内で発現させる方法は、本明細書で上述されているほか、米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書にも記載されている。

一部の実施形態において、ブタノール生合成経路は、酵母菌体に対して非相同遺伝子を少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ含んで構成される。いくつかの実施形態において、組み換え宿主菌体内のブタノール生合成経路での基質から生成物への変換はそれぞれ、異種ポリペプチドで触媒される。いくつかの実施形態において、ブタノール生合成経路はイソブタノール生合成経路であり、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への生成物変換を行うポリペプチド及び／又は基質を触媒してイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの生成物変換を行うポリペプチドは、ＮＡＤＨを補因子として利用し得る。

本明細書中に提供されているイソブタノール生合成経路等のブタノール生合成経路を含んで構成される宿主菌体は、１つ以上の付加的な変形態様を更に含んでもよいことは明らかである。参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書には、細胞質ゾル局在性アセト乳酸シンターゼの発現及びピルベートデカルボキシラーゼ活性の実質的除去を目的に、酵母をエンジニアリングすることによってピルベートからアセト乳酸への変換を増加させる方法が開示されている。米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載されているように、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性、及び／又はピルベートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の中断、若しくはピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調整要素をコードする少なくとも１つの遺伝子の中断を抑えることを目的とした修正、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照によって本明細書に援用される）に記載されているように、エントナー−ドゥドロフ経路を介して炭素フラックスを増加させるか当量バランスを減少させるように宿主菌体を修正。その他の修正としては、ピルベート利用生合成経路のステップを触媒するように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ組み込むことが挙げられる。その他の修正では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおいて削除、突然変異及び／又は置換を少なくとも１回行う。いくつかの実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビサエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃ（配列番号６３）又はその相同体である。付加的な変形態様は、アルデヒド脱水素酵素及び／又はアルデヒド酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける削除、突然変異及び／又は置換を含む。いくつかの実施形態において、アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＬＤ６（配列番号：６０）又はその相同体である。グルコース抑制を低下させる効果を有しかつ酵母生成宿主菌体がｐｄｃである遺伝子組み換えは、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載されている。

組み換え宿主菌体は、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの非相同ポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドをコードする内因性遺伝子を少なくとも１回削除、突然変異及び／若しくは置換する工程、並びに／又は（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドをコードする少なくとも１つの非相同ポリヌクレオチドを更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドは、ＡＦＴ１（核酸配列番号：６４、アミノ酸配列番号：６５）、ＡＦＴ２（配列番号：６６及び６７）、ＦＲＡ２（配列番号：６８及び６９）、ＧＲＸ３（配列番号：７０及び７１）、又はＣＣＣ１（配列番号：７２及び７３）によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドは、構成的突然変異株ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、又はＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆである。

発酵培地
本明細書に開示されている高菌体密度の生産培養物は、ブタノール生産のための代謝を支持する培地内で維持される。培地によって培養物の生存力も得られ、ブタノール生産が可能になる。典型的には、本発明に使用される培地は、少なくとも約２ｇ／Ｌグルコース又は当量の炭素基質を含んでいてもよい。炭素基質はフルクトース等の単糖類、ラクトース、マルトース、ガラクトース、若しくは蔗糖等のオリゴ糖類、澱粉やセルロース等の多糖類、又はそれらの混合物、及び乳清濾液、コーンスティープリーカー、甜菜糖蜜、大麦モルト等の再生可能な原料からの精製混合物を含んでもよいが、これらに限定されない。他の炭素基質は、エタノール、乳酸塩、コハク酸塩又はグリセリンを含んでもよい。したがって、培地内の炭素源は、基質を含有する多種多様な炭素を含んでいてもよいと考えられる。炭素基質は、コーン粉餌、砂糖黍液、糖蜜、小麦粉餌、又は他の形態のバイオマスで提供されてもよい。代謝を最大限に高められるように、典型的には炭素基質を過度に維持する。

発酵培地は、適切な炭素供与源に加えて、好適な無機質、塩類、補因子、緩衝液、及び当業者に知られていて培養物の代謝及び酵素の経路促進に好適でありかつブタノールの生成に必要な他の成分を含有する必要がある。

好適な培地としては、炭素／エネルギー源又はＹＰＤ培地（ペプトン、酵母抽出物及びブドウ糖の配合物）として酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム及びブドウ糖を大抵のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株を生育させるための最適比率に含むブロス等の、商業的に調製された一般的な培地が挙げられる。微生物学又は発酵サイエンスの当業者に公知である、他の定義済み又は合成生育培地も使用できる。

培養条件
典型的には、培養物は生育可能なブタノール産生用酵母菌体を支持する条件（適当な培地内での約２０℃〜約３７℃の範囲の温度を含む）で維持される。発酵に好適なｐＨ範囲は典型的にｐＨ３．０〜ｐＨ７．５であり、実施形態における始源条件はｐＨ４．５〜ｐＨ６．５である。

発酵は好気性又は嫌気的条件下のどちらでも可能である。一部の実施形態においては、微好気性条件の範囲内で溶存酸素を３％を超えるように維持する。

発酵培地内のブタノールの分量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量されるのが一般的であるが、他の公知技術の方法を使用してもよい。

培養物は、回分培養、半回分培養又は連続培養系のいずれでも発酵できる。半回分培養系は、発酵の進行につれて炭素供与源基質を漸増的に添加することを除き、典型的な回分系に類する。回分培養及び半回分培養は当該技術分野において広く用いられ周知となっており、参照により本明細書に援用されているＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，又はＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）に例を見ることができる。

典型的な生成条件は、一定期間に半回分工程を含むが、いったん全ての炭素供与源が添加されたら回分様式に切り替えてもよい。商業的な条件では、液化粉餌又は原料を一定期間にわたって供給するだけでなく、澱粉から経時的にグルコースが放出されるように発酵槽に糖化酵素も添加する。このような澱粉からの経時的なグルコースの徐放は、発酵槽に添加される糖化酵素の分量によって制御される。砂糖黍液の場合、基質は経時的にゆっくりと発酵槽に添加されていき、最終的に全て添加された後は、回分様式で発酵が進行する。発酵の実施期間は約１〜２００時間にわたってもよい。

発酵培地からの生成物の単離
生成中は、真空適用や液液抽出等の当該技術分野で公知の工程を用いてブタノール生成物を発酵培地から除去できる。

生成物は、当業者に知られている方法によって発酵培地から単離できる。例えば、生物還元されたイソブタノールは、当該技術分野において公知のＡＢＥ発酵方法を用いて発酵培地から単離できる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８），Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、及びその文献に記載されている参考文献を参照のこと）。例えば、遠心分離、濾過、デカンテーション又はこれらに類するものによって、発酵培地から固形物を除去することができる。続いて、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、気体ストリッピング、膜蒸発、浸透気化法、又は真空閃光発酵等の方法を用いて、イソブタノールを発酵培地から単離することができる。例えば、米国特許出願公開第２００９０１７１１２９Ａ１明細書、及び国際公開第２０１０／１５１８３２Ａ１号パンフレット（両方ともその全体が参照によって本明細書に援用されている）を参照のこと。水相からブタノールを除去するには、発酵ブロスの一部又は全体に真空を適用することができる。

ブタノールは水と一緒になって沸点の低い共沸混合物を化成するため、蒸留を用いて混合物の分離により共沸組成物を生じ得る。蒸留と別の分離方法とを組み合わせて使用して分離を行うことで、共沸様組成物を生じ得る。ブタノールを単離して精製する際に蒸留と組み合わせて使用できる方法としては、デカンテーション、液液抽出、吸着及び膜による技術が挙げられるが、これらに限定されない。ブタノールを単離する方法としては、ほかにも、共沸蒸留にて共沸剤を用いる方法も挙げられる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。

ブタノールと水の混合液は、不均一な共沸混合物を生じるため、蒸留とデカンテーションとを組み合わせて使用することによってイソブタノールを単離、精製できる。この方法では、イソブタノール含有の発酵ブロスを共沸様組成物が得られるまで蒸留し、次いで、その共沸混合物を凝縮して、デカンテーションで発酵培地からイソブタノールを分離する。デカンテーション後の水相は、還流として第１の蒸留カラムに戻り得る。デカンテーション後のイソブタノール含量の多い有機相を、第２の蒸留カラムにて蒸留によって更に精製してもよい。

液液抽出と蒸留とを組み合わせて使用して、発酵培地からブタノールを単離することもできる。この方法では、好適な溶媒を用いた液液抽出によって、発酵ブロスからイソブタノールを抽出する。次いで、イソブタノール含有の有機相を蒸留し、溶媒からブタノールを分離する。発酵中に水溶媒質からブタノールを除去する際に液液抽出（ＬＬＥ）用に添加する抽出剤の分量は、発酵槽容量の５％〜５０％とすることができる。

蒸留と吸着とを組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離することもできる。この方法では、イソブタノール含有の発酵ブロスを共沸様組成物が得られるまで蒸留し、その後、モレキュラーシーブ等の吸着剤を用いて残留水分を除去する（Ａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ ２００２）。

他にも、浸透気化法と蒸留とを組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離、精製してもよい。この方法では、イソブタノール含有の発酵ブロスを共沸様組成物が得られるまで蒸留し、その後、親水性膜を用いた浸透気化によって残留水分を除去する（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。

ブタノール（又は他の発酵アルコール）は、生成されると、Ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去（ＩＳＰＲ）（別称：抽出発酵）によって発酵槽から除去でき、これにより、微生物がブタノールを高収率で生成することが可能になる。ＩＳＰＲによる発酵アルコールの除去法のなかで、当該技術分野において記載されてきたものの１つとしては、液液抽出が挙げられる。一般に、ブタノール発酵に関しては、例えば、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の一時点で、微生物を含む発酵培地を有機抽出剤と接触させる。有機抽出剤及び発酵培地は二相性混合物を形成する。有機抽出剤相中へのブタノールの分配によって、微生物を含有する水相の濃度が低下し、結果として阻害性ブタノールに対する微生物の曝露が制限される。

例えば、その開示内容全体が本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書の工程記述に従って、液液抽出を実行できる。米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを生成して回収する方法が記載されている。この方法は、水に混ざらない抽出剤に発酵ブロスを接触させて、水相と有機相とを含む二相混合を形成するステップを含む。典型的には、抽出剤は、飽和、単不飽和。多価不飽和（及びそれらの混合物）、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪族アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル類、及びＣ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒド、並びにそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。ＩＳＰＲ用の抽出剤は、非アルコール抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール等の外来性有機抽出剤、及びそれらの混合物であり得る。

一部の実施形態においては、発酵培地中のアルコールを有機酸（例えば、脂肪酸）、及びアルコールを有機酸でエステル化できる触媒（例えば、リパーゼ等の酵素）に接触させることによって、アルコールをエステル化できる。そのような実施形態において有機酸は、アルコールエステル類が分配されるＩＳＰＲ抽出剤として作用し得る。有機酸は、発酵槽に供給することも、及び／又は発酵槽に送給されたバイオマス供給用の発酵性炭素から取り出すこともできる。原料中に存在する脂質は、触媒的作用に加水分解されて有機酸を生じ得る。また、同じ触媒（例：酵素）によって有機酸をアルコールでエステル化することも可能である。触媒は、発酵に先だって原料に供給してもよいし、又は原料の供給前又は供給と同時に発酵槽に供給してもよい。触媒を発酵槽に供給すると、脂質が有機酸に加水分解され、それとほぼ同時に有機酸が発酵槽内に存在するブタノールでエステル化され、それによってアルコールエステル類が生じ得る。原料由来でない有機酸及び／又は天然油も、天然油が有機酸に加水分解されている状態で、発酵槽に送給してよい。アルコールでエステル化されない有機酸はどのようなものも、ＩＳＰＲ抽出剤の一部として作用し得る。アルコールエステル類を含有する抽出剤を発酵培地から分離でき、その抽出剤からアルコールを回収し得る。抽出剤は発酵槽に入れて再利用できる。したがって、ブタノール生産の場合、例えば、ブタノールからエステルへの変換によって発酵培地内の遊離ブタノール濃度が低下し、ブタノール濃度の増大に起因する毒性作用から微生物が保護される。加えて、脂質は触媒作用的に有機酸に加水分解できるため、分画されていない粒子を、その粒子に含まれる脂質を分離せずに原料として使用してもよく、それによりＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の蓄積速度が低下する。

Ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去は、回分様式又は連続様式で実施できる。Ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去の連続様式では、反応器から生成物を連続的に除去する。Ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去の回分様式では、多量の有機抽出剤が発酵槽に添加され、工程中に抽出剤は除去されない。Ｉｎ ｓｉｔｕ生成物除去では、発酵の開始時に有機抽出剤を発酵培地に接触させて、二相性発酵培地を形成できる。別の態様では、発酵培地と有機抽出剤との接触を、微生物が所望量の生育を達成した後で行うことができる。この微生物の生育は、培養物の光学濃度を測定することによって定量できる。更に、発酵培地と有機抽出剤との接触を、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選択されたレベルに到達した時点で行うこともできる。本発明の一部の実施形態に係るブタノール生産の例では、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の時点で、有機酸抽出剤を発酵培地に接触させてブタノールを有機酸でエステル化してブタノールエステル類を生成できるので、結果として発酵槽内のブタノール濃度が低下する。その場合、ブタノールエステル滴定値が所望の有効値に達した後で、エステル含有の有機相を発酵槽から除去（発酵ブロスから分離して水相を構成）し得る。一部の実施形態では、発酵槽内の有効な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後で、エステル含有の有機相が水相から分離される。

本発明は、更に以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の実施形態を示す一方であくまで例示目的にのみ挙げられていることを理解すべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に種々の変更及び改良を施して本発明の様々な利用及び条件に適合させ得る。

使用されている略語の意味は、以下の通りである。即ち、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ＯＤ_６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ＣＦＵ」はコロニー形成単位を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味する。

一般的方法：
酵母の培地及び生育については、Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。方法は酵母プロトコール（Ｅｄｉｔｏｒ Ｗ．Ｘｉａｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）にも記載されている。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ_６００）は、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３１００分光光度計（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して測定された。

実施例１
低菌体密度及び高菌体密度におけるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３の２４時間の時点での生存率
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３（ＡＴＣＣ ２０１３９０）をフリーザーバイアルからＹＰＤアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ；カタログ番号 Ｙ１０００）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。ＹＰＤプレートからの菌体を初期ＯＤ_６００が０．０６〜０．０８のＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ；カタログ番号Ｙ５０００）の前培養物２５ｍｌ中に接種した。前培養を好気性撹拌器中で７時間３０℃にて生育させた。前培養のアリコートをＹＰＤブロス２００ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を曝気にて３０℃で約１７時間インキュベートした。培養物の光学濃度を測定し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、ＯＤ_６００が５の新鮮なＹＰＤブロスを得た。この培養物は、高菌体密度（ＨＣＤ）の培養物と呼ばれる。この培養物を新鮮なＹＰＤブロス中に１００倍に希釈し、ＯＤ_６００が０．０５を有する培養物を得た。この培養物は、低菌体密度（ＬＣＤ）の培養物と呼ばれる。これらの培養物を振盪させて３０℃で３０分間インキュベートした。３０分の順化期間終了後、ＯＤ_６００を測定した。それぞれ異なる濃度のアルコールが入った１５ｍｌコニカルチューブに、試験対象の培養物を５ｍｌずつ分取した。対照用のチューブにはアルコールを入れなかった。チューブを３０℃の回転ドラムに置き、２４時間インキュベートした。菌体が付加された時点を「０時間」と呼んだ。試験の対象となった濃度は以下の通りである。すなわち、１−ブタノール：１．０％（ｗ／ｖ）、１．５％及び２％、イソブタノール：１．０％、１．５％及び２．５％、２−ブタノール：２．０％、３．０％及び３．５％、並びにエタノール：２．０％、４．０％及び５％。２４時間後に、各培養物のアルコール濃度をＨＰＬＣで測定した。この測定から、インキュベーション期間に０．０１％未満のアルコールが失われたことが確認された。

ＹＰＤプレート上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、対照群に関しては０時間の時点で、対照培養物を含めた各培養物に関しては２４時間の時点で、標準の微生物学的方法にて定量した。マイクロタイタープレートで培養物（２０μｌの培養物及び１８０μｌのＹＰＤブロス）を順次に希釈し、３枚の寒天板にそれぞれ異なる希釈剤を１０μｌずつ斑点状に付着させ、３０℃で２４時間及び４８時間インキュベートした。４８時間後にコロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍｌを計算した。０時間の時点で低菌体密度の培養物は約４．８×１０^５ＣＦＵ／ｍｌを有し、高菌体密度の培養物は約５．４×１０^７ＣＦＵ／ｍｌを有した。２４時間の時点での対照用の（０ブタノール）ＨＣＤ又はＬＣＤ培養物のＣＦＵ／ｍｌを基準に、生存率（％）を計算した。その結果を表２に示す。

アルコールを含まない対照用の高菌体密度の培養物は、２４時間で５．４×１０^７菌体／ｍｌから６．５×１０^７菌体／ｍｌに増加した。アルコールを含まない対照用の低菌体密度の培養物は、２４時間で４．８×１０^５菌体／ｍｌから２．８×１０^７菌体／ｍｌに増加した。１−ブタノール、イソブタノール、又は２−ブタノールに曝された培養物においては、高菌体密度培養物の方が低菌体密度の培養物よりも高い生存率を示した（表２）。対照的に、低菌体密度の培養物よりも高菌体密度培養物の方が、２．０％又は４．０％エタノールに対する感応性が高かった。

実施例２
酵母の高菌体密度及び低菌体密度の培養物におけるサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）以外の２４時間の時点での生存率
サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）以外の酵母菌株を試験して、イソブタノール耐性がこれらの酵母の菌体密度に影響されるかどうかを確認した。試験の対象となったのは、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＰＮＹ０５７７（米国培養細胞系統保存機関：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；ＡＴＣＣ ＃８５５４）、クルイベロマイセス・マルシアンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＰＮＹ０５７８（ＡＴＣＣ ＃１６０４５）、ピキア・メンブラニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）ＰＮＹ０５７２、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）ＰＮＹ０５７３、ピキア・エスピー（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）ＰＮＹ０５７４、イサチェンキアオリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＮＹ０５７５及びイサチェンキアオリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＮＹ０５７６である。使用されたピキア（Ｐｉｃｈｉａ）及びイサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）菌株は、指定された属の野生型の代表である。他の代表的な菌株は、例えば、ＡＴＣＣから市販されている。

サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）以外の酵母菌株をフリーザーバイアルからＹＰＤアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。ＹＰＤプレートからの各菌株の菌体をＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）の前培養物２５ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、好気振盪機内で３０℃にて７時間生育させた。各前培養のアリコートをＹＰＤブロス２００ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００が０．０６〜０．０８になるようにして、結果として得られた培養物を曝気にて３０℃で約１７時間インキュベートした。培養物の光学濃度を測定し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、ＯＤ_６００が５の新鮮なＹＰＤブロスを得た。この培養物は、高菌体密度（ＨＣＤ）の培養物と呼ばれる。この培養物を新鮮なＹＰＤブロス中に１００倍に希釈し、ＯＤ_６００が０．０５を有する培養物を得た。この培養物は、低菌体密度（ＬＣＤ）の培養物と呼ばれる。順化期間にわたって、これらの培養物を振盪させて３０℃で３０分間インキュベートした。３０分の順化期間終了後、ＯＤ_６００を測定した。

試験対象のイソブタノール濃縮物を入れた１５ｍｌコニカルチューブに、５ｍｌの低菌体密度又は高菌体密度の培養物を分取した。そのチューブを回転ドラムに置き、３０℃で２４時間インキュベートした。イソブタノール濃度は１．０％又は２．０％であった。菌株ごとの対照培養物はイソブタノールを含有していなかった。菌体が付加された時点を「時間０」とした。２４時間後に各試料のイソブタノール濃度をＨＰＬＣで測定したところ、インキュベーション中に失われたアルコール分は０．０１％未満であることがわかった。全ての試料をＡｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ ＰＴＦＥ０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）で濾過し、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ１０１１カラム（８ｍｍＩＤ×３００ｍｍ長；Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）を使用したほかガードカラムとしてＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−Ｇを使用して分析した。注入容量は１０μＬであった。移動相は０．０１Ｎの硫酸であった。カラム温度は５０℃で、移動相流速は０．５ｍＬ／分であった。検出の目的に、２１０ｎｍにて光度測定検出器を使用したほか、屈折率検出器も使用した。

ＹＰＤプレート上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、対照群に関しては０時間の時点で、対照培養物を含めた全ての試料に関しては２４時間の時点で、標準の微生物学的方法にて定量した。基本的に、マイクロタイタープレートで培養物（２０μｌの培養物及び１８０μｌのＹＰＤブロス）を順次に希釈し、３枚の寒天板にそれぞれ異なる希釈剤を１０μｌずつ斑点状に付着させ、３０℃で２４時間及び４８時間インキュベートした。４８時間後にコロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍｌを算出した。菌株ごとに、２４時間の時点におけるＨＣＤ又はＬＣＤの対照培養物のＣＦＵ／ｍｌを基準に生存率（％）を計算した。結果を表３に示す。

イソブタノールを含まない対照用の高菌体密度の培養物は、２４時間で約１．０×１０^８菌体／ｍｌから約１．５×１０^８菌体／ｍｌへ増加した。イソブタノールを含まない対照用の低菌体密度の培養物は、２４時間で約１．１×１０^６菌体／ｍｌから約１．０×１０^８菌体／ｍｌへ増加した。サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）以外の酵母菌株は全て、１．０％イソブタノールに曝されたＨＣＤ培養物の方が、ＬＣＤ培養物よりも有意に高い生存レベルを呈した（表３）。２．０％イソブタノールに曝された出菌株のうち生存したのは１株（ＰＮＹ０５７４）のみであった。この菌株はまた、イソブタノールを２．０％に曝されたＬＣＤの培養物よりもＨＣＤ培養物における方が、有意に高い生存レベルを呈した。

実施例３
高菌体密度の酵母培養物における、イソブタノールの存在下でのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株のグルコース利用率
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３をフリーザーバイアルからＹＰＤアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ；カタログ番号Ｙ１０００）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。ＹＰＤプレートからの菌体をＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ；、カタログ番号Ｙ５０００）の前培養物２５ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を空気振盪機内で３０℃にて７時間生育させた。前培養のアリコートをＹＰＤブロス２００ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を３０℃で約１７時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、ＯＤ_６００が８の新鮮なＹＰＤブロスを得た。この時点で、培養物１０ｍｌのアリコートを使用して乾燥菌体重量を定量した。結果として３．８９のｇｄｃｗ／Ｌが算出された。

０．０％、０．５％、１．０％、１．２５％、１．５％、１．７５％、又は２．０％のイソブタノールを入れたフラスコに、培養物を２０ｍｌずつ移した。菌体が付加された時点を「０時間」と呼んだ。異なる時点で、試料（１．５ｍｌ）を回収し、微量遠心管（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｂｉｏｆｕｇｅ ｐｉｃｏ）で１０，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。上澄みを０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）Ｐａｌｌ ＧＨＰ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍｍシリンジフィルター、０．２μｍ ＧＨＰメンブレン付き）で濾過し、濾過液を１０倍に希釈して、ＹＳＩグルコース分析計（ＹＳＩ ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ；ＹＳＬ， Ｉｎｃ．， Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ， Ｏｈｉｏ）を使用してグルコース濃度を定量した。

菌体濃度が１８ｇｄｃｗ／Ｌ又は２４ｇｄｃｗ／Ｌのときの、イソブタノールの存在下でのグルコース消費率も定量した。ＹＰＤプレートからの菌体をＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ、カタログ番号Ｙ５０００）の前培養物２５ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を空気振盪機内で３０℃にて７時間生育させた。ＹＰＤブロス３００ｍｌ入りのフラスコ８本にそれぞれ前培養のアリコートを接種し、初期ＯＤ_６００を０．１にして、この培養物を３０℃で約１７時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、ＯＤ_６００が３８（１８ｇｄｃｗ／Ｌ）の新鮮なＹＰＤブロスを得た。２％、３％、又は４％イソブタノールを入れた各フラスコに試料（１５ｍｌ）を移した後、１５０分間グルコースを消費させた。

開始時のＯＤ_６００を４９．１（２４ｇｄｃｗ／Ｌ）としたことを除いて、同じ実験を繰り返した。１．５％、３％、又は４％イソブタノールを入れた各フラスコに試料を１５ｍｌずつ移した後、１５０分間グルコースを消費させた。図４に、ＢＹ４７４３の結果をグラフ化して示す。

対照培養物（イソブタノールを含まない）においては、試験された実験条件の下でのグルコース消費率が約２．１７ｇ／ｇｄｃｗ／ｈであった。１．５％イソブタノールでは、３．８及び２４ｇｄｃｗ／Ｌの両方の培養物のグルコース消費率は、対照速度の約５０％（約１．１ｇ／ｇｄｃｗ／ｈ）であった。２．０％及び２．５％イソブタノールの存在下でのグルコース消費を観測し、対照速度の２０〜２５％の範囲に及んだ。対照群における実際のグルコース消費率は実験ごとに５％変化し得る。しかしながら、相対的なイソブタノール阻害率（％）は再現可能であった。

実施例４
高菌体密度の培養を生成する工程
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４３をフリーザーバイアルからＹＰＤアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ；カタログ番号Ｙ１０００）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。ＹＰＤプレートからの菌体をＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ；カタログ番号Ｙ５０００）の前培養物２５ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にした。前培養物を好空気振盪機内で３０℃にて７時間生育させた。前培養のアリコートをＹＰＤブロス１２５ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を３０℃で約１７時間曝気にてインキュベートした。

ＹＰＤ１５０ｍｌの種培養に一晩培養物５ｍｌを接種し、初期ＯＤ_６００を０．１５にした。この培養物を２時間曝気にて３０℃でインキュベートしたところ、ＯＤ_６００が０．３８に達した。表４に示すように、この時点（時間＝０）で異なる濃度のイソブタノールにそれぞれ培養物を曝露させ、ＯＤ_６００を５時間にわたって１時間ごとにアッセイしたほか、２４時間経過した時点でもアッセイした。結果を表４に示す。

この菌株の場合、１ ＯＤ_６００が１０^７菌体／ｍｌに等しいため、１％イソブタノールの存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は一晩生育させた後で約４×１０^７菌体／ｍｌに増殖した。

１％イソブタノール又はそれ未満（１％未満のイソブタノール濃度）イソブタノール中で４．４１又はそれ以上のＯＤ_６００に増殖した培養物は、高菌体密度の培養物であり、イソブタノール生成の用に供することができる。

実施例５
グルコース消費量の多い菌株を生成する工程
使用されたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株は、ＰＮＹ０６０２及びＰＮＹ０６１４のほか、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ Ｙｅａｓｔ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手されたＰＮＹ０５６９ ＣＥＮ．ＰＫ１２２（ＭＡＴａ ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ２／ＭＡＴａｌｐｈａ ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ２）及びＰＮＹ０５７１（ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＭＡＴａ ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ２）であった。ＰＮＹ０６０２及びＰＮＹ０６１４は、ＰＮＹ０５７１の突然変異を誘発された培養物から単離された。ＰＮＹ０５７１（ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ）に対しては１０回にわたって、標準方法を用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及びエチルメタンスルホン酸塩（ＥＭＳ）で化学物質突然変異を誘発させた（Ｂａｒｂｏｕｒ，Ｌ．，Ｍ．Ｈａｎｎａ ａｎｄ Ｗ．Ｘｉａｏ． ２００６．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｐ．１２１−１２７．Ｉｎ Ｗ．Ｘｉａｏ（ｅｄ．），Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ）。ＹＰＤ１０ｍｌ中で３０℃で振盪して菌体を一晩生育させた。一晩培養物を遠心分離させ、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中でペレットを再懸濁させた。菌体を再び遠心分離し、１０ｍｌの同じ緩衝液中で再懸濁させた。再懸濁させた菌体の一部（２．５ｍｌ）をプラスチック製の１５ｍｌネジ蓋の付いた遠心管に移し、菌体を振盪せずに３０℃にて４０分間ＮＴＧ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）又はＥＭＳ（３％ ｗ／ｖ）で処理した。等量のフィルター殺菌済み１０％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウムを加えて、突然変異原を不活性化した。処理済みの菌体を遠心分離し、水中で２回再懸濁させた。処理プロトコールには突然変異原のうちの１つ（例えば、ＮＴＧ）を有する酵母細胞を繰り返し処理するサイクルが含まれ、これにより、生存中の菌体を、１％イソブタノール含有のＹＰＤ中で一晩生育させ、その後、他の突然変異原（例えば、ＥＭＳ）で一晩培養物を処理する。５回目のサイクル（即ち、突然変異原を用いて合計１０回処理）の後、イソブタノール耐性に関して菌体をスクリーニングした。ＰＮＹ０６０２を３．０％イソブタノールに長時間（２４時間）曝した後で単離した。突然変異を起こした培養物の冷凍及び解凍サイクルを５回繰り返した後、蒸留水中で突然変異細胞を再懸濁させ、菌体をドライアイス−エタノール槽、及び３７℃の水槽にそれぞれ２０分間移すことによって、ＰＮＹ０６１４を単離した。

ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１９１８に関連する単離された微生物は、本明細書中でＰＮＹ０６０２とも呼ばれている。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１９１８に関連する単離された微生物は、ブダペスト条約に基づき、２０１１年６月１日付けで、米国培養細胞系統保存機関（（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ＡＴＣＣ）の特許保管所（１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ．ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１９１９に関連する単離された微生物は、本明細書中でＰＮＹ０６１４とも呼ばれている。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１９１９に関連する単離された微生物は、ブダペスト条約に基づき、２０１１年６月１日付けで、米国培養細胞系統保存機関（（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ＡＴＣＣ）の特許保管所（１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ．ＶＡ２０１１０−２２０９）に寄託された。

ＹＰＤ中でイソブタノールの存在下、菌体濃度が約８ Ｏ．Ｄ．（約 ３．９ｇｄｃｗ／Ｌ）のときのグルコース消費率も定量された。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＰＮＹ０５７１、ＰＮＹ０６０２、及びＰＮＹ０６１４をフリーザーバイアルからＹＰＤアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ；カタログ番号Ｙ１０００）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。ＹＰＤプレートからの菌体をＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ；カタログ番号Ｙ５０００）の前培養物２５ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を空気振盪機内で３０℃にて７時間生育させた。前培養のアリコートをＹＰＤブロス２００ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を３０℃で約１７時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して菌体を再懸濁させ、ＯＤ_６００が８の新鮮なＹＰＤブロスを得た。この時点で、培養物１０ｍｌのアリコートを使用して乾燥菌体重量を定量した結果、３．８９ｇｄｃｗ／Ｌの範囲内の乾燥菌体重量が算出された。

０．０％、０．５％、０．７５％、１．０％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２．０％又は２．５％のイソブタノールを入れたフラスコに、培養物を２０ｍｌずつ移した。菌体が付加された時点を０時間と呼んだ。異なる時点で、試料（５００〜７００ｕｌ）を等量の１０％ＴＣＡが入ったチューブに移した。試料を遠心分離し、ＹＳＩグルコース分析計（ＹＳＩ ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ）でグルコースを定量した。

結果を表５に示す。これらの結果から、突然変異誘発及び選択により、グルコース消費率が原種（ｐａｒｅｎｔ）と比較して改善される可能性のあることがわかった。

イソブタノールの生成は、生育に関係する場合もあれば関与しない場合もある。そのため、非生育条件の下で３通りのｐＨ緩衝液を使用してグルコース消費率を測定した。

Ｄｉｄｅｒｉｃｈ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５ｐ．３４４７−５４によって概説されているように、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中のグルコース消費率を定量した。また、ＭＥＳ緩衝液を使用してｐＨ５．２５及びｐＨ４．０でのグルコース消費率も定量した。

ＹＰＤ（５００ｍｌフラスコ中１２５ｍｌ）中で３０℃にて菌体を一晩生育させた。菌体を再び遠心分離し、緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、又は０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２５）、又は０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．０））中で再懸濁させ、１回洗浄した後、各菌体懸濁液が約１６ＯＤ、即ち、１億６０００万菌体／ｍｌとなるように再懸濁した。これらの株の菌体１０ｍｌを、対応する１０ｍｌの緩衝液（４０ｇ／Ｌグルコースとそれぞれ別の濃度のイソブタノールとを含む）が入ったフラスコに移した。異なる時点で、試料（５００〜７００ｕｌ）を等量の１０％ＴＣＡが入ったチューブに移した。試料を遠心分離し、ＹＳＩグルコース分析計でグルコースを定量した。経時的に消費されたグルコースの分量をプロットすることによってグルコース消費率を定量した。結果を表６に示す。ｐＨ６．５未満のｐＨでは、２０ｇ／Ｌイソブタノールの存在下でのグルコース消費率が上昇したことが観測された。

実施例６
高菌体密度の培養物における、イソブタノールの存在下でのイサチェンキアオリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）菌株のグルコース利用率
菌株イサチェンキアオリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＮＹ０６６０は、ＡＴＣＣ ２０３８１菌株（旧称：カンジダ・アシッドサーモフィリアム（Ｃａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ））から取り出された。菌株ＰＮＹ０６６０をフリーザーバイアルからＹＰＤアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ；カタログ番号Ｙ１０００）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。ＹＰＤプレートからの菌体をＹＰＤブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ；カタログ番号Ｙ５０００）の前培養物５０ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．０６〜０．０８にして、この培養物を空気振盪機内で３０℃にて５時間生育させた。前培養のアリコートをＹＰＤブロス２００ｍｌ中に接種し、初期ＯＤ_６００を０．６にして、この培養物を３０℃で約１７時間曝気にてインキュベートした。培養物の光学濃度を定量し、その培養物を遠心分離して、コーン試験液で糖消費率を定量した。０．２％カザミノ酸、２％グルコース、及び１００ｍＭ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．２５）を含有するコーン試験液（ｉ）塩類：硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸カリウム一塩基２．８ｇ、及び硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、（ｉｉ）ビタミン：ビオチン（Ｄ−）０．４０ｍｇ、Ｄ（＋）パントテン酸カルシウム８．００ｍｇ、ミオイノシトール２００．００ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩８．００ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸１．６０ｍｇ、リボフラビン１．６０ｍｇ、葉酸０．０２ｍｇ、ナイアシン３０．０ｍｇ及びチアミン３０ｍｇ、並びに（ｉｉｉ）微量成分：ＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ ＩＩＩ７）９９．３８ｍｇ、硫酸亜鉛七水和物２９．８１ｍｇ、塩化マンガン無水物５．５７ｍｇ、塩化コバルト（ＩＩ）六水化物１．９９ｍｇ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物１．９９ｍｇ、モリブデン酸二ナトリウム無水物２．６５ｍｇ、塩化カルシウム無水物２９．８１ｍｇ、硫酸鉄七水和物１９．８８ｍｇ及びホウ酸。

０．０％、０．５％、１．０％、１．５％、１．７５％又は２．０％イソブタノールを入れたフラスコに、コーン試験液中の２０ｍｌ培養物（２．７ｇｄｃｗ／Ｌ）を移した。菌体が付加された時点を０時間と呼んだ。異なる時点で、試料（１．５ｍｌ）を回収し、微量遠心管（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｂｉｏｆｕｇｅ ｐｉｃｏ）で１０，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。上澄みを０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）Ｐａｌｌ ＧＨＰ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍｍシリンジフィルター、０．２μｍ ＧＨＰメンブレン付き）で濾過し、濾過液を１０倍に希釈して、ＹＳＩグルコース分析計（ＹＳＩ ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ； ＹＳＩ， Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ， Ｏｈｉｏ）を使用してグルコース濃度を定量した。０時間〜６時間経過後に測定された糖消費率を、表７に示す。

Ｉ．オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）菌株は、２０ｇ／ｌイソブタノールの存在下での糖消費率が０．７ｇ／ｇｄｗ／ｈであった。

本発明の前述の記述は、図解及び説明の目的に提示されている。更にまた、説明は発明を本明細書に開示された形態だけに制限することを意図するものではない。

本明細書に記載されている種々の態様、実施形態及び選択肢はすべて、あらゆる変形態様で併用できる。

本明細書に記載されている公告、特許及び特許出願はすべて、あたかも個々の公告、特許、又は特許出願の各々が参照によって援用されているのと同じ程度に、参照によって本明細書に援用される。

Claims (22)

1. （ｉ）発酵性炭素基質を含有する培地と、
   （ｉｉ）グルコース利用率が少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体質量グラム／時である酵母菌の培養物と、
   （ｉｉｉ）培地中少なくとも約２％（ｗ／ｖ）の濃度のブタノールと、
   を含む、ブタノールの発酵生産用の生産培養物。
2. 菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約２．４グラム／リットルである、請求項１に記載の生産培養物。
3. 菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約７グラム／リットルである、請求項２に記載の生産培養物。
4. ブタノール産生酵母菌のグルコース利用率が少なくとも約１グラム／乾燥菌体質量グラム／時である、請求項１に記載の生産培養物。
5. ブタノール産生酵母菌が
   （ｉ）突然変異誘発と、
   （ｉｉ）３％イソブタノールに対する曝露と、
   （ｉｉｉ）繰り返される凍結融解サイクルと、
   を含む方法により生産される、請求項４に記載の生産培養物。
6. 酵母がクラブトリー陽性である、請求項１に記載の生産培養物。
7. 酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の生産培養物。
8. 酵母がイソブタノール経路又は１−ブタノール経路を含む、請求項１に記載の生産培養物。
9. 以下：
   （ｉ）約２０℃〜約４５℃の温度、
   （ｉｉ）微好気性条件にて３％より上に維持される溶存酸素、
   （ｉｉｉ）液化バイオマスによって過剰に供給された炭素基質、
   （ｉｖ）約３〜約７．５のｐＨ、及び
   （ｖ）真空応用及び液液抽出から選択されたブタノールの除去、
   の条件で、培養が約１時間から約２００時間維持される、請求項１に記載の生産培養物。
10. （ｉ）酵母がイソブタノール経路又は１−ブタノール経路を含む、請求項１に記載の生産培養物を調製する工程と、
    （ｉｉ）酵母をブタノールを産生する条件下で発酵させる工程と、
    を含む、ブタノールの生産方法。
11. （ｉ）発酵性炭素基質を含有する培地と、
    （ｉｉ）菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約２．４グラム／リットルである酵母菌の培養物と、
    （ｉｉｉ）培地中少なくとも約２％（ｗ／ｖ）の濃度のブタノールと、
    を含む、ブタノールの発酵生産用の生産培養物。
12. 培養物のグルコース利用率が少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体質量グラム／時である、請求項１１に記載の生産培養物。
13. 培養物のグルコース利用率が少なくとも約１グラム／乾燥菌体質量グラム／時である、請求項１１に記載の生産培養物。
14. 菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約７グラム／リットルである、請求項１１に記載の生産培養物。
15. ブタノール濃度が少なくとも約２．５％であり、培養物のグルコース利用率が少なくとも約０．４グラム／乾燥菌体質量グラム／時である、請求項１１に記載の生産培養物。
16. 酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１１に記載の生産培養物。
17. 酵母がイソブタノール経路又は１−ブタノール経路を含む、請求項１１に記載の生産培養物。
18. 以下：
    （ｉ）約２０℃〜約３７℃の温度、
    （ｉｉ）微好気性条件にて３％より上に維持される溶存酸素、
    （ｉｉｉ）液化バイオマスによって過剰に供給された炭素基質、
    （ｉｖ）約３〜約７．５のｐＨ、及び
    （ｖ）真空応用及び液液抽出から選択されたブタノールの除去、
    の条件で、培養が約１時間から約２００時間維持される、請求項１１に記載の生産培養物。
19. ａ．酵母がイソブタノール経路、１−ブタノール経路、及び２−ブタノール経路からなる群から選択されるブタノール生合成経路を含む、請求項１１に記載の生産培養物を調製する工程と、
    ｂ．酵母をブタノールを産生する条件下で発酵させる工程と、
    を含む、ブタノールの生産方法。
20. （ｉ）発酵性炭素基質を含有する培地を備える工程と、
    （ｉｉ）グルコース利用率が少なくとも約０．５グラム／乾燥菌体質量グラム／時であるブタノール産生酵母菌の培養物を備える工程と、
    （ｉｉｉ）酵母培養物を発酵性炭素基質と接触させ、それによりグルコース利用率を適した期間にわたって維持し、ブタノールを生産させる工程と、
    を含む、ブタノールの発酵生産用の生産培養物の耐性を増大させる方法。
21. （ｉ）発酵性炭素基質を含有する培地と、
    （ｉｉ）グルコース利用率が少なくとも約２．４グラム／乾燥菌体質量グラム／時である酵母菌の培養物と、
    （ｉｉｉ）培地中少なくとも約１％（ｗ／ｖ）の濃度のブタノールと、
    を含む、ブタノールの発酵産生用の生産培養物。
22. 菌密度が少なくとも乾燥菌体質量約２．７グラム／リットルである、請求項２１に記載の生産培養物。

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