CN103201376A - 用于生产丁醇的酵母生产培养物 - Google Patents
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Abstract
本发明发现酵母的高细胞密度培养物对于培养基中的丁醇具有更高的耐受性。与具有低细胞密度的培养物相比，所述高细胞密度酵母培养物具有更高的生存性和更高的葡萄糖利用速率。因此，使用酵母高细胞密度培养物生产丁醇对于提高丁醇产量是有利的。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2010年6月17日提交的美国临时申请61/355,733的优先权的权益，其全文均以引用方式并入本文。
参考以电子方式提交的序列表
以电子方式提交的序列表内容全文均以引用方式并入本文，该序列表名称：20110616_CL4590USNA_SEQLIST.txt；大小：244,365字节；以及创建日期：2011年6月16日。
发明领域
本发明涉及工业微生物和丁醇生产的领域。具体地，已经开发出耐高浓度丁醇的酵母生物生产培养物。
发明背景
丁醇是重要的工业化学品，其用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级萃取剂。每年由石油化学方法生产了100至120亿磅的丁醇，并且对这种通用化学品的需求还很可能会增加。
丁醇可通过化学合成或通过发酵来制备。异丁醇在生物学上作为发酵的副产物生产。它是“杂醇油”的一种组分，杂醇油由于该真菌群组氨基酸的不完全代谢形成。异丁醇具体地是由L-缬氨酸的分解代谢生产的，并且其产量通常非常低。另外，已经描述了表达1-丁醇生物合成途径(Donaldson等人，美国专利公开申请公布US20080182308A1)，2-丁醇生物合成途径(Donaldson等人，美国专利公布US 20070259410A1和US20070292927)和异丁醇生物合成途径(Maggio-Hall等人，美国专利公布US 20070092957)的重组微生物生产宿主。
生物性生产丁醇一般会受丁醇对用于丁醇生产的发酵中的宿主微生物毒性的限制。酵母通常对培养基中的丁醇敏感。基因工程方法已经用于改变基因表达以提高酵母细胞对丁醇的耐受性。另一种用来改善生产的方法是改善发酵方法。美国专利4,765,992公开了在发酵前或发酵过程中加入微生物细胞壁以吸附导致酒精发酵过程中发酵停止的对酵母有毒的物质。美国专利4,414,329公开了使用含至少约60至160克/升细胞的高矿物盐培养基的方法来生产单细胞蛋白质。美国专利4,284,724公开了通过取出发酵液、过滤、以及将酵母细胞回收到发酵罐中来实现6％至约20％(细胞干重)密度的发酵。
目前仍需要开发酵母生产丁醇培养物，其中降低了由于丁醇敏感性对酵母的影响，从而使丁醇产量提高。
发明概述
本发明提供了用于生产丁醇的培养物，其由于高密度酵母细胞的存在而提高了对丁醇的耐受性。
本文提供了用于发酵生产丁醇的生产培养物，其包含：a)培养基，其包含适用于酵母代谢的碳底物；b)生产丁醇的酵母细胞培养物，其具有至少约0.5克/克细胞干重/小时(g/gdcw/h)的葡萄糖利用速率；和c)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2％(重量/体积)。
在本发明的在另一个实施方案中，提供了用于发酵生产丁醇的生产培养物，其包含：a)培养基，其包含适用于酵母代谢的碳底物；b)生产丁醇的酵母细胞培养物，其具有至少约2.4克细胞干重/升(gdcw/L)的细胞密度；和c)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2％(重量/体积)。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于生产丁醇的方法，其包括制备本发明的生产培养物，其中所述酵母包含选自异丁醇途径和1-丁醇途径的丁醇生物合成途径；以及在生产丁醇的条件下发酵所述酵母。
本文提供了用于发酵生产丁醇的生产培养物，其包含：a)培养基，其包含适用于酵母代谢的碳底物；b)生产丁醇的酵母细胞培养物，其具有至少约0.5克/克细胞干重/小时(g/gdcw/h)的葡萄糖利用速率；和c)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2％(重量/体积)。
在一些实施方案中，所述细胞的密度为至少约2.4克细胞干重/升。在一些实施方案中，所述细胞的密度为至少7克细胞干重/升。在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞具有至少约1克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，该方法包括：a)诱变；和b)暴露于3％的异丁醇；和C)重复冻-融循环。在一些实施方案中，所述冻-融循环重复多于两次。在一些实施方案中，所述细胞是由包含至少5次冻-融循环的方法产生的。
在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，该方法包括：a)生产丁醇的酵母细胞在含乙醇的培养基中生长；b)使细胞浓缩至密度在30gdcw/L的范围内；c)暴露于3％的异丁醇；和d)重复冻-融循环。在一些实施方案中，所述冻-融循环重复多于两次。在一些实施方案中，所述细胞由包含至少5次冻-融循环的方法产生。
在一些实施方案中，所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，该方法包括：a)生产丁醇的酵母细胞在含乙醇的培养基中生长；b)依次地转移至包含0.1％至2.0％丁醇的培养基中，以用于生长至少10小时且最多72小时；c)在后续的过程中逐渐提高培养基中的丁醇浓度，以增加生产丁醇细胞的生长速率；和d)集合生长速率高的细胞，e)暴露于3％的异丁醇；和/或重复冻-融循环。
在一些实施方案中，所述酵母是克拉布特里(crabtree)阳性的，并且在一些实施方案中，所述酵母是克拉布特里阴性的。在一些实施方案中，所述酵母是选自酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。在一些实施方案中，所述酵母包含选自异丁醇途径和1-丁醇途径的丁醇生物合成途径。
在一些实施方案中，所述培养物在以下条件下保持1小时至200小时：a)介于20℃和37℃之间的温度；b)保持在微氧条件至高于3％之间的溶解氧；c)由液化的生物质提供的过量碳底物；d)介于约3和7.5之间的pH；和d)选自施加真空和液-液萃取丁醇移除。
在一些实施方案中，所述培养物具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，所述细胞的密度为至少约7克细胞干重/升。在一些实施方案中，所述丁醇浓度为至少约2.5％，并且所述培养物具有至少约0.4克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，所述酵母包含选自异丁醇途径、1-丁醇途径和2-丁醇途径的丁醇生物合成途径。
在一些实施方案中，所述培养物包含PNY0602或PNY0614。在一些实施方案中，所述培养物包含还包括丁醇生物合成途径的PNY0602或PNY0614。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径为异丁醇生物合成途径。
附图简述和序列描述
从下文的发明详述、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的多个实施方案，它们形成本专利申请的一部分。
图1显示了四种不同的2-丁醇生物合成途径。
图2显示了三种不同的异丁醇生物合成途径。
图3显示了一种1-丁醇生物合成途径。
图4显示了在异丁醇的存在下在高细胞密度的酵母培养物中的葡萄糖利用率图。
下面的生物保藏已根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款进行：
本文所附的且以引用方式并入本文的下列序列和序列表符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis规则)，以及行政指导的208节和附录C相一致。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。
表1：表达编码区和蛋白质的SEQ ID号
*相同的氨基酸序列由SEQ ID NOs：51和53编码
SEQ ID NO：55-59是杂合启动子序列。
通过下列发明详述可更好的理解本发明，所述发明详述也是本专利申请的一部分。
发明详述
除非另行定义，本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。本文提及的所有公布、专利和其它参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每一单独的公布或专利申请均具体地且单独地以引用方式并入一样，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。
本发明涉及酵母生产培养物，其通过降低对培养基中存在的丁醇的敏感性而改善发酵以生产丁醇。丁醇包括异丁醇和1-丁醇。此外，本发明涉及采用本发明培养物生产丁醇的方法。丁醇除了用作溶剂和/或萃取剂之外，还可用于替代化石燃料
下列定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或“容纳”或其任何其它变型旨在涵盖非排他性的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下中的任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)，A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)，以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单一的实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：实际上用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”是指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。
如本文所用的术语“丁醇”是指1-丁醇、异丁醇或它们的混合物。
术语“异丁醇生物合成途径”或“异丁醇途径”是指由丙酮酸生产异丁醇的酶途径。
术语“1-丁醇生物合成途径”或“1-丁醇途径”是指由丙酮酸生产1-丁醇的酶途径。
术语“低细胞密度”是指低于约6×105细胞/毫升的细胞浓度。例如，OD600为0.05的培养物是低细胞密度培养物，基于1.0的OD600值对应于107细胞/毫升的关系计。
术语“高细胞密度”是指高于约5×107细胞/毫升的细胞密度。例如，5.0的OD600和约2.4克细胞干重/升(gdcw/L)为高细胞密度培养物，基于1.0的OD600值对应于107细胞/毫升和0.4gdcw/L的关系计。
术语“葡萄糖利用率”和“葡萄糖消耗”是指在葡萄糖过剩条件下细胞培养物代谢的葡萄糖量。葡萄糖利用速率是在如本文实施例3中所述的培养物条件下以葡萄糖作为碳底物在限定的丁醇浓度下和在限定的细胞密度下测定的。当培养基中存在用于生产的可替代的碳底物时，不能在这种培养物中测定葡萄糖利用速率，而是必须在以葡萄糖作为碳底物的单独培养物中进行测定。
术语“碳底物”或“可发酵碳底物”或“适宜的碳底物”是指能够被本发明培养物代谢的碳源，尤其是包括选自单糖、低聚糖和多糖的碳源。
术语“发酵性生产”是指通过微生物的代谢活动将碳源转化为产品的过程，如本发明的培养物的情况。
术语“活体”是指能够在为本文提供的生长条件下或在包含浓度为至少约2％(w/v)丁醇的生长培养基中繁殖或培养的细胞(例如酵母细胞)培养物。在一些实施方案中，活体培养物能够在此类条件下繁殖或培养24小时。
如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区域的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区域的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个或多于一个或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
在高细胞密度培养物中改善的丁醇耐受性
本文所公开的是发现与在低细胞密度培养物中的酵母细胞相比，当酵母细胞在高细胞密度培养物中时细胞提高了对丁醇的耐受性。对于本发明目的的高细胞密度培养物是指具有至少约2.4克细胞干重/升(gdcw/L)细胞密度的培养物。任何具有高于约2.4gdcw/L，如具有至少约3.8gdcw/L或更高，包括24gdcw/L或更高细胞密度的培养物，是高细胞密度培养物。高细胞密度可高于约3gdcw/L、高于约5gdcw/L、高于约7gdcw/L、高于约10gdcw/L、高于约20gdcw/L或高于约30gdcw/L。据设想高达约35-40gdcw/L的细胞密度可能是有用的。对于酵母，高细胞密度的特征也在于细胞浓度高于约5×107细胞/毫升，或测定的OD600为至少约5。在一些实施方案中，所述细胞的密度可为任何范围的本文所述细胞的密度，例如约2.4gdcw/L至约40gdcw/L、约2.4gdcw/L至约35gdcw/L、约2.4gdcw/L至约30gdcw/L、约2.4gdcw/L至约20gdcw/L、约2.4gdcw/L至约10gdcw/L、约2.4gcdw/L至约7gdcw/L、约2.4gdcw/L至约5gdcw/L、约3gdcw/L至约40gdcw/L、约3gdcw/L至约35gdcw/L、约3gdcw/L至约30gdcw/L、约3gdcw/L至约20gdcw/L、约3gdcw/L至约10gdcw/L、约3gcdw/L至约7gdcw/L、约3gdcw/L至约5gdcw/L、约7gdcw/L至约40gdcw/L、约7gdcw/L至约35gdcw/L、约7gdcw/L至约30gdcw/L、约7gdcw/L至约20gdcw/L或约7gdcw/L至约10gdcw/L。作为比较，低细胞密度培养物具有少于约6×105细胞/毫升。
本文中酵母细胞对丁醇耐受性的提高是通过生存情况和/或葡萄糖利用速率进行评估的，其中发现针对低细胞密度的酵母培养物来说在高细胞密度培养物中发现了耐受性的提高。生存情况是通过测定菌落形成单位数(CFU)的数量来测量的，其为活细胞的量度。在本文测定的条件下，与不含丁醇的对照培养物的生存率相比，在1％丁醇的存在下发现高细胞密度的酵母培养物具有至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％和至多100％生存率。生存率发生变化并取决于多种因素，包括丁醇浓度、特异性丁醇异构体和酵母菌株。相比之下，与不含丁醇的对照培养物的生存率相比，发现在1％的丁醇中具有稀100倍细胞的低细胞密度培养物的生存率为至多13％。
酵母细胞的密度对醇的耐受性影响不是对一般性醇的存在的反应。所述细胞的密度对丁醇耐受性的影响不同于细胞的密度在最广泛生产的醇、乙醇的存在下的影响。事实上，如本文所示(见实施例1)，在乙醇中观察到相反的效应，即低细胞密度培养物显示出的生存情况高于高细胞密度培养物。
本文发现，在1.5％的异丁醇中，具有3.8gdcw/L和24gdcw/L的高细胞密度培养物以至少约1克/克细胞干重/小时的速率利用葡萄糖。在1％的异丁醇中，计算出的速率为至少约1.4克/克细胞干重/小时。在2％的异丁醇中，所述速率为至少约0.5克/克细胞干重/小时，在2.5％的异丁醇中所述速率为至少约0.4克/克细胞干重/小时，并且在3％的异丁醇中所述速率为至少约0.2克/克细胞干重/小时。
因此，本文提供了具有至少约2.4gdcw/L的高细胞密度的丁醇生产培养物，以便获得对丁醇的高耐受性。高细胞密度培养物可为至少约2.4gdcw/L、3.8gdcw/L或24gdcw/L或更高。生产培养物中的丁醇浓度为至少约1％，并可为至少约1.5％、2.0％、2.5％或3.0％(w/v)。在一些实施方案中，所述丁醇浓度为至少约2.0％。在一些实施方案中，所述丁醇浓度为本文所公开的任何范围的丁醇浓度，例如约1％至约3％、约1.5％至约3％、约2％至约3％、约1.5％至约2.5％或约2％至约3％(w/v)。丁醇可为异丁醇或1-丁醇。在本发明生产培养物中，所述葡萄糖利用速率为至少约0.2克/克细胞干重/小时(g/gdcw/h)。所述葡萄糖利用速率可为更高，如至少约0.3、0.4、0.5、0.6、1、1.5、2.4或3克/克细胞干重/小时。在一些实施方案中，所述丁醇浓度为至少约2％w/v，并且所述葡萄糖利用速率为至少约0.5、0.6、1、1.5、2.4或3克/克细胞干重/小时。在一些实施方案中，所述葡萄糖利用速率为至少约0.5克/克细胞干重/小时。在一些实施方案中，所述葡萄糖利用速率可为任何范围的本文所述葡萄糖利用速率，例如约0.3g/gdcw/h至约3g/gdcw/h、约0.3g/gdcw/h至约2.4g/gdcw/h、约0.3g/gdcw/h至约1.5g/gdcw/h、约0.3g/gdcw/h至约1g/gdcw/h、约0.3g/gdcw/h至约0.6g/gdcw/h、约0.3g/gdcw/h至约0.5g/gdcw/h、约0.3g/gdcw/h至约0.4g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约3g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约2.4g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约1.5g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约1g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约0.6g/gdcw/h、约1g/gdcw/h至约3g/gdcw/h、约1g/gdcw/h至约2.4g/gdcw/h或约1g/gdcw/h至约1.5g/gdcw/h。在一些实施方案中，所述葡萄糖浓度为至少约2.0％w/v，并且所述葡萄糖利用速率的范围为约0.5g/gdcw/h至约3g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约2.4g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约1.5g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约1g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约0.6g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约3g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约2.4g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约1.5g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约1g/gdcw/h、约0.5g/gdcw/h至约0.6g/gdcw/h、约1g/gdcw/h至约3g/gdcw/h、约1g/gdcw/h至约2.4g/gdcw/h或约1g/gdcw/h至约1.5g/gdcw/h。达到的所述葡萄糖利用速率将取决于培养基中的丁醇浓度和丁醇的具体类型。一般来讲，所述速率将随着丁醇浓度增加而降低。一般来讲，酵母细胞对异丁醇和1-丁醇具有相似的反应，对于2-丁醇的敏感性低一些。
所述葡萄糖利用速率通常在约30℃至约45℃的温度下测定。所述葡萄糖利用速率也可在约30℃至约37℃的温度下测定。在一些实施方案中，本文提供的培养物在约30℃至约45℃的温度下具有高于0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，本文提供的培养物在约30℃至约37℃的温度下具有高于0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，本文提供的培养物在约30℃至约32℃的温度下具有高于0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。在一些实施方案中，所述葡萄糖利用速率是对已经接触了包含浓度为至少约2％(w/v)丁醇的培养物至少约6小时的培养物进行测定。在一些实施方案中，本文提供的培养物已经接触了包含浓度为至少约2％(w/v)丁醇的培养物至少约6小时，具有高于0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
在一些实施方案中，本文所述培养物是活的培养物。
高细胞密度生产培养物的制备
本发明高细胞密度丁醇生产培养物可通过任何方法制备，所述方法提供了至少约2.4gdcw/L的细胞密度。具有例如2.4gdcw/L、2.7gdcw/L、2.8gdcw/L、3.8gdcw/L或24gdcw/L或更高细胞密度的培养物可被制备作为高细胞密度培养物。在一些实施方案中，所述细胞的密度可为任何范围的本文所述细胞的密度，例如约2.4gdcw/L至约40gdcw/L、约2.4gdcw/L至约35gdcw/L、约2.4gdcw/L至约30gdcw/L、约2.4gdcw/L至约20gdcw/L、约2.4gdcw/L至约10gdcw/L、约2.4gcdw/L至约7gdcw/L、约2.4gdcw/L至约5gdcw/L、约3gdcw/L至约40gdcw/L、约3gdcw/L至约35gdcw/L、约3gdcw/L至约30gdcw/L、约3gdcw/L至约20gdcw/L、约3gdcw/L至约10gdcw/L、约3gcdw/L至约7gdcw/L、约3gdcw/L至约5gdcw/L、约7gdcw/L至约40gdcw/L、约7gdcw/L至约35gdcw/L、约7gdcw/L至约30gdcw/L、约7gdcw/L至约20gdcw/L或约7gdcw/L至约10gdcw/L。例如，在一种方法中能够生产丁醇的酵母细胞在透气的培养物中生长，所述培养物最小化丁醇生产。例如，如本领域已知的，克拉布特里阳性酵母细胞可在高透气和低葡萄糖浓度下生长，以最大化呼吸作用和细胞群生产，而不是丁醇生产。通常所述葡萄糖浓度保持低于约0.2g/L。所述透气的培养物可生长至高细胞密度，并且然后用于本发明培养物的生产。作为另外一种选择，能够生产丁醇的酵母细胞可生长并浓缩成生产高细胞密度的培养物。
此外，丁醇生物合成途径的表达可被调控，使得在酵母细胞生长至高细胞密度的过程中保持最小化的活性。所述途径的一个或多个基因可通过一个启动子表达，所述启动子可通过生长条件或培养基组分来控制以调控它们的表达。在该培养物中，细胞可生长至高细胞密度以用作生产培养物或用作对于开始高细胞密度生产培养物的种菌培养。
生产高细胞密度培养物的培养物在采用如下面“发酵培养基”和“培养条件”章节中所述条件下生长在培养基中，不同的是葡萄糖可被限制到约2g/L并且有氧条件可如上所述最大化呼吸生长。
丁醇生产酵母细胞
本发明高细胞密度生产培养物可为生产丁醇的任何酵母细胞的培养物。所述酵母可为克拉布特里阳性的或克拉布特里阴性的。克拉布特里阳性酵母细胞展示出克拉布特里效应，这是一种当高浓度葡萄糖加入有氧培养基中时细胞呼吸作用被抑制的现象。适宜的酵母包括但不限于酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。适宜的菌株包括但不限于啤酒糖酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
这些工程化的或换句话讲能够生产丁醇的酵母中的任何一种可用于本发明培养物中。已经构建了在所述酵母细胞中生产异丁醇、1-丁醇或2-丁醇的生物合成途径，以便酵母细胞生产丁醇。所述途径基因可包括内源性基因和/或异源性基因。
对于重组宿主细胞的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且被Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.所著的MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.所著的Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人所著的Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)进行了描述。其它的分子工具和技术是本领域已知的，并且包括剪接重叠延伸聚合酶链反应(PCR)(Yu等人(2004)Fungal Genet.Biol.41：973-981)，啤酒糖酵母的URA3基因座突变体的阳性选择(Boeke，J.D.等人(1984)Mol.Gen.Genet.197，345-346；M A Romanos等人Nucleic Acids Res.，1991，1月11日；19(1)：187)，cre-lox位点专一性重组系统以及突变体lox位点和FLP底物突变体(Sauer，B.(1987)Mol Cell Biol 7：2087-2096；Senecoff等人(1988)Journal of Molecular Biology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人(1995)The Plant Journal，第7卷，第4期，第649-659页)，“无缝”基因删除(Akada等人(2006)Yeast；23(5)：399-405)，以及缺口修复方法学(Ma等人，Genetics 58：201-216；1981)。
酵母中基因表达的方法是本领域已知的，例如Methods inEnzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and CellBiology(A部分，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)中所描述的。例如，通过将启动子和终止子可操作地连接到编码区来构建用于表达的嵌合基因。可用的启动子包括例如组成型启动子FBA、TDH3、ADH1和GPM1，以及诱导型启动子GAL1、GAL10和CUP1。其它酵母启动子包括杂合启动子UAS(PGK1)-FBA1p(SEQ ID NO：55)、UAS(PGK1)-ENO2p(SEQ ID NO：56)、UAS(FBA1)-PDC1p(SEQ ID NO：57)、UAS(PGK1)-PDC1p(SEQ IDNO：58)和UAS(PGK)-OLE1p(SEQ ID NO：59)。可用于表达的嵌合基因构建体的适宜转录终止子包括但不限于FBA1t、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t和ADH1t。
可将适宜的启动子、转录终止子和编码区克隆进大肠杆菌-酵母穿梭载体中并转入酵母细胞中。这些载体既可在大肠杆菌菌株中增殖也可在酵母菌株中增殖。载体通常包含选择性标记和允许在目标宿主中自主复制或染色体整合的序列。通常用于酵母中的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，它们包含大肠杆菌复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记物是HIS3(载体pRS423)、TRP1(载体pRS424)、LEU2(载体pRS425)和URA3(载体pRS426)。构建带有用于表达的嵌合基因的表达载体可采用在大肠杆菌中的标准分子克隆技术或在酵母中的缺口修复重组方法来进行。
所述缺口修复克隆方法充分利用了酵母中高效的同源重组。典型地，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点)，以在其序列中生产“缺口”。生成的许多受关注的插入DNA在5′和3′末端包含有≥21bp序列，所述序列依次相互重叠，并且与载体DNA的5′和3′末端重叠。例如，为了构建“基因X”的酵母表达载体，选择了用于表达盒的酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物，或者从包含基因X序列的克隆载体获得。线性化载体的5’末端和启动子序列之间、启动子和基因X之间、基因X和终止子序列之间以及终止子和线性化载体的3’末端之间有至少21bp的重叠序列。然后将“带缺口”的载体和插入DNA共转入酵母菌株，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许质粒上营养选择标记的互补作用。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图，能够验证正确的插入组合的存在。然后，可将与酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转入大肠杆菌菌株，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后所述构建体可通过DNA序列分析进行验证。
与缺口修复技术类似，向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。典型地，利用高保真度DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组区域的5’和3’区域同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合到染色体位置“Y”上，所述启动子-编码区X-终止子的构建体从质粒DNA构建体上扩增，并通过重叠延伸剪接-聚合酶链反应(Horton等人(1989)Gene 77：61-68)或通过常见限制性酶切消化和克隆连接到自养型标记上(如URA3)。利用引物PCR扩增了包含启动子-编码区X-终止子-URA3区域的完整的盒，其中所述引物序列包含与酵母染色体上“Y”位置的5’和3’区域同源的40-70bp序列。上述PCR产物被转入酵母，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
丁醇生产途径
用于生产丁醇的适宜途径是本领域已知的，并且某些适宜的途径在本文中有所描述。在一些实施方案中，所述丁醇生产途径包含至少一种对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含多于一种的对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含异源基因，其编码多肽对应于生物合成途径的每个步骤。如本领域已知，序列可经密码子优化以在宿主细胞中表达。
本文所述可用于底物进行产品转化的基因和多肽，以及鉴定此类基因和多肽的方法可在本文和/或本领域有所描述，例如对于异丁醇，描述于美国专利公开7,851,188中。
可在本发明细胞中工程化的生产2-丁醇的生物合成途径为本领域所公开的，例如，在美国专利申请公布US20070292927A1和US20070259410A1，其以引用方式并入本文。图1提供了公开的2-丁醇生物合成途径的图表。例如，在US20070292927A1中的途径包括以下转化步骤：
-丙酮酸至乙酰乳酸(图1步骤a)由例如乙酰乳酸合酶进行催化；
-乙酰乳酸至乙偶姻(图1步骤b)由例如乙酰乳酸脱羧酶进行催化；
-乙偶姻至2，3-丁二醇(图1步骤i)由例如丁二醇脱氢酶进行催化；
-2，3-丁二醇至2-丁酮(图1步骤j)由例如二醇脱水酶或甘油脱水酶进行催化；以及
-2-丁酮至2-丁醇(图1步骤f)由例如丁醇脱氢酶进行催化。
如美国专利申请公布US 2009-0305363中所公开的，对于在酵母pdc-宿主细胞中生产2，3-丁二醇中间体，乙酰乳酸合酶可在胞质溶胶中表达。乙酰乳酸合酶为人们所熟知，其也可称为乙酰乳酸合酶，属于EC 2.2.1.6(在2002年转换自4.1.3.18)，它们参与蛋白源性氨基酸亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径，以及在许多生物体中从乙偶姻发酵生产2，3-丁二醇的途径。有经验的技术人员将会知道分离自多种来源的具有乙酰乳酸合酶活性的多肽可用于本发明细胞中。对于丙酮酸的底物偏好性在酮丁酸之上的乙酰乳酸合酶(Als)活性是特别有用的，如那些由芽孢杆菌属(Bacillus)的alsS和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)的budB所编码的(Gollop等人，J.Bacteriol.172(6)：3444-3449(1990)；Holtzclaw等人，J.Bacteriol.121(3)：917-922(1975))。本文提供的Als来源于枯草芽孢杆菌(DNA：SEQ ID NO：3；蛋白质：SEQ ID NO：4)、来源于肺炎克雷伯氏菌的(DNA：SEQ ID NO：1；蛋白质：SEQ ID NO：2)和来源于乳酸乳球菌(DNA：SEQ ID NO：5；蛋白质：SEQ ID NO：6)。
可被使用的附加的Als编码区和编码的蛋白质包括来源于金黄色葡萄球菌(DNA：SEQ ID NO：7；蛋白质：SEQ ID NO：8)、单细胞增生杆菌(Listeria monocytogenes)(DNA：SEQ ID NO：9；蛋白质：SEQ IDNO：10)、变异链球菌(DNA：SEQ ID NO：11；蛋白质：SEQ ID NO：12)、嗜热链球菌(DNA：SEQ ID NO：13；蛋白质：SEQ ID NO：14)、狭小弧菌(DNA：SEQ ID NO：15；蛋白质：SEQ ID NO：16)以及蜡状芽孢杆菌(DNA：SEQ ID NO：17；蛋白质：SEQ ID NO：18)的那些。可使用编码乙酰乳酸合酶的任何Als基因，所述乙酰乳酸合酶具有与那些将丙酮酸转化为乙酰乳酸的SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任何一个具有至少约80-85％、85％-90％、90％-95％或至少约96％、97％或98％的序列同一性。同一性是基于Clustal W比对方法的，所述方法采用空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵。
此外，美国专利申请公布20090305363提供了描绘乙酰乳酸合酶的系统发育树，其为100个最接近枯草芽孢杆菌AlsS序列的邻居，其中任何一个都是可用的。在本发明菌株中可用的附加Als序列可在文献中或生物信息学数据库中鉴定，这是技术人员熟知的。使用生物信息学方法鉴定编码和/或蛋白质序列通常通过BLAST(如上所述)搜索包含已知的Als编码序列或编码氨基酸序列的公开可用的数据库进行，例如本文提供的那些。基于如上所述的Clustal W比对方法进行鉴定。此外，可利用本文所述的序列或本领域所述的那些序列鉴定如上所述的其它天然同源物。
通过转化一个包含编码乙酰乳酸合酶蛋白而不含线粒体定位信号序列的序列，实现了乙酰乳酸合酶的胞质表达。酵母中基因表达的方法是本领域已知的(描述于例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to YeastGenetics and Molecular and Cell Biology(A部分，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA中)。使用嵌合基因表达(包括带有可操作地连接有启动子和终止子的编码区)、载体、克隆方法和整合方法为如上所述的。
乙酰乳酸至乙偶姻的转化是通过乙酰乳酸脱羧酶进行的，已知编号为EC 4.1.1.5，其可从枯草芽孢杆菌(DNA：SEQ ID NO：21；蛋白质：SEQ IDNO：22)、土生克雷伯氏菌(DNA：SEQ ID NO：23；蛋白质：SEQ ID NO：24)和肺炎克雷伯氏菌(DNA：SEQ ID NO：19；蛋白质：SEQ ID NO：20)中得到。可使用编码乙酰乳酸脱羧酶的任何基因，所述乙酰乳酸脱羧酶具有与那些将乙酰乳酸转化为乙偶姻的包含SEQ ID NOs：20、22或24中的任何一个至少约80-85％、85％-90％、90％-95％或至少约96％、97％或98％的序列同一性。
乙偶姻至2，3-丁二醇的转化是通过丁二醇脱氢酶，也被称为乙偶姻还原酶进行的。丁二醇脱氢酶对于在醇类产物中的(R)-或(S)-立体化学生产可具有特异性。(S)-特异性丁二醇脱氢酶已知编号为EC 1.1.1.76，可从例如肺炎克雷伯氏菌(DNA：SEQ ID NO：25，蛋白质：SEQ ID NO：26)中得到。(R)-特异性丁二醇脱氢酶已知编号为EC 1.1.1.4，可从例如蜡状芽孢杆菌(DNA：SEQ ID NO：27，蛋白质：SEQ ID NO：28)、乳酸乳球菌(DNA：SEQ ID NO：29，蛋白质：SEQ ID NO：30)、以及啤酒糖酵母(BDH1；DNA：SEQ ID NO：54，蛋白质：SEQ ID NO：55)中得到。可使用编码丁二醇脱氢酶的任何基因，所述丁二醇脱氢酶具有与那些包含SEQ IDNOs：26、28、30或55的将乙偶姻转化为2，3-丁二醇中中的任何一个具有至少约80％-85％、85％-90％、90％-95％或至少约98％的序列同一性。
二醇脱水酶也被称为丁二醇脱水酶，其利用辅因子腺苷钴胺素(维生素B12)，已知编号为EC 4.2.1.28。利用辅因子腺苷钴胺素的甘油脱水酶已知编号为EC 4.2.1.30。二醇和甘油脱水酶具有活性所需的三个亚基。在US20070292927A1中提供了许多二醇和甘油脱水酶的三个亚基序列的实施例，所述酶可用于本发明细胞中的2-丁酮或2-丁醇途径，以及制备和使用隐马尔科夫模型来鉴定可能采用的另外的二醇和甘油脱水酶。
丁醇脱氢酶是乙醇脱氢酶大家族中的一个子集，可为NAD+-或NADP+-依赖的。NAD-依赖的酶已知编号为EC 1.1.1.1，而NADP-依赖的酶已知编号为EC 1.1.1.2。在US 20070292927A1中提供了丁醇脱氢酶序列的实施例，所述酶可用于本发明细胞中的已公开的2-丁醇生物合成途径。
在美国专利申请公布US 20090155870A1(其以引用方式并入本文)中描述了采用US 20070292927A1所公开的生物合成途径构建嵌合基因和用于2-丁醇生产的酵母基因工程。以上和本文实施例中是对于基因构建和表达的进一步描述。
在酵母这个途径中所用的丁二醇脱水酶来源于食葡糖罗斯拜瑞士菌，RdhtA(蛋白质SEQ ID NO：32，编码区SEQ ID NO：31)，其公开于共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US 20090155870A1中。这个酶与来自食葡糖罗斯拜瑞士菌RdhtB(蛋白质SEQ ID NO：34，编码区SEQ ID NO：33)的丁二醇脱水酶一起使用。这种丁二醇脱水酶在许多宿主中是所期望的，因为它不需要辅酶B12。另一种可使用的B12-依赖的二醇脱水酶来自肺炎克雷伯氏菌，其具有三个亚基：pduC、pduD和pduE，其公开于WO2009046370中。
在图2的所有途径中，对于将2-丁酮转化为2-丁醇的最后一步有用的是丁醇脱氢酶，其分离自一种被鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的环境隔离的细菌，其公开于美国专利申请公布20090269823(DNA：SEQ ID NO：35，蛋白质SEQ ID NO：36)，其以引用方式并入本文。
对于图2其它途径的基因和它们的表达公开于US20070259410A1中。在本发明菌株中可用来表达所述公开的酶活性的附加序列可在有经验的技术人员所熟知的文献和生物信息数据库中鉴定。运用生物信息学对编码和/或蛋白序列的鉴定通常采用序列分析软件，如BLAST(BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))并使用已知的编码序列或编码的氨基酸序列，如本文提供的那些序列，在公开可用的数据库中搜索。同一性是基于Clustal W对比方法的(由Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)进行描述)和可在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法的。对于多重比对的默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(％)＝30，DNA过渡权重＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB)。
此外，本文所述的序列或本领域所述的那些序列还可用于鉴定天然的其它同源物。例如本文所述的每个编码的核酸片段可用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，例如核酸扩增技术的各种用法[例如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利公开4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或链置换扩增反应(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3)文库构建和互补筛选方法。
对于可在本发明细胞中工程化的异丁醇生产的生物合成途径是本领域已公开的，例如参见美国专利申请公布US 20070092957A1，其以引用方式并入本文。在图2中提供了公开的异丁醇生物合成途径的图表。如US20070092957A1中所述，在一个实施例中异丁醇生物合成途径的步骤包括以下的转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸(图2途径步骤a)由例如乙酰乳酸合酶进行催化
-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(图2途径步骤b)由例如乙酰羟酸易购还原酶，也被称为酮醇酸还原异构酶进行催化；
-2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(图2途径步骤c)由例如乙酰羟酸脱水酶，也被称为二羟酸脱水酶进行催化；
-α-酮异戊酸至异丁醛(图2途径步骤d)由例如支链α-酮酸脱羧酶进行催化；以及
-异丁醛至异丁醇(图2途径步骤e)由例如支链乙醇脱氢酶进行催化。
对于2，3-丁二醇途径，乙酰乳酸合酶为如上所述的。
乙酰羟酸异构还原酶，也被称为酮醇酸还原异构酶(KARI)，可自然地使用NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为电子供体。KARIs包括已知编号为EC编号1.1.1.86的那些。在US20070092957A1中提供了KARI是酶和它们的编码区序列的实例，包括来自啤酒糖酵母的ILV5(DNA：SEQ ID NO：37，蛋白质SEQ ID NO：38)。酮醇酸还原异构酶(KARI)描述于美国专利申请公布20080261230A1、20090163376A1、20100197519A1和PCT申请公布WO/2011/041415中，全部以引用方式并入本文。本文公开的KARIs的实例是来自霍乱弧菌(DNA：SEQ IDNO：39；蛋白质SEQ ID NO：40)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1(DNA：SEQ ID NO：41；蛋白质SEQ ID NO：42)和荧光假单胞菌PF5(DNA：SEQ ID NO：43；蛋白质SEQ ID NO：44)以及Pf5.IlvC-Z4B8突变体荧光假单胞菌乙酰羟酸还原异构酶(DNA：SEQ ID NO：45；蛋白质SEQ ID NO：46)的那些。另一个KARI是由乳酸乳球菌的ilvC基因(DNA：SEQ ID NO：58；蛋白质SEQ ID NO：59)编码的。KARIs也包括粪厌氧棒状菌KARI变体“K9G9”和“K9D3”(分别为SEQ ID NOs：62和61)。
乙酰羟酸脱水酶，也被称为二羟酸脱水酶(DHAD)，已知编号为EC4.2.1.9。DHAD酶和它们的编码区序列的实例由美国专利公开7,851，188二羟酸脱水酶(DHADs)提供，包括啤酒糖酵母的ILV3(DNA：SEQ IDNO：47；蛋白质SEQ ID NO：48)。附加的[2Fe-2S]2+DHAD序列如变异链球菌的DHAD(DNA：SEQ ID NO：49；蛋白质SEQ ID NO：50)和用于鉴定[2Fe-2S]2+DHAD酶的方法，所述方法可用于获得可用的附加DHAD序列，公开于共同未决的美国专利申请公布20100081154中，其以引用方式并入本文。
支链α-酮酸脱羧酶(KivD)已知编号为EC 4.1.1.72。支链α-酮酸脱羧酶和它们的编码区序列的实例由US20070092957A1提供，包括乳酸乳球菌KivD(DNA：SEQ ID NO：51；其经密码子优化以在啤酒糖酵母SEQ IDNO：53，蛋白质SEQ ID NO：52)中表达。附加的支链α-酮酸脱羧酶包括来自枯草芽孢杆菌的支链α-酮酸脱羧酶，其经编码序列优化以在啤酒糖酵母(DNA：SEQ ID NO：54；蛋白质SEQ ID NO：55)中表达，以及其它已被本领域技术人员利用如上所述的生物信息学进行鉴定过的。
支链乙醇脱氢酶已知编号为EC 1.1.1.265，但也可被归类为其它乙醇脱氢酶(具体地讲，为EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体，并且支链乙醇脱氢酶和它们的编码区序列的实例由US20070092957A1提供。
美国专利申请公布20090269823A1描述了SadB(DNA：SEQ IDNO：35，蛋白质SEQ ID NO：36)，来自木糖氧化无色杆菌的乙醇脱氢酶。乙醇脱氢酶也包括马肝脏ADH(HADH；其经密码子优化以在啤酒糖酵母中表达；DNA：SEQ ID NO：56；蛋白质SEQ ID NO：57)并且印度拜叶杯克氏菌ADH(蛋白质SEQ ID NO：74)以及其它已被本领域技术人员利用如上所述的生物信息学进行鉴定过的。
可用于表达两个附加的异丁醇途径的酶的基因描述于US 20070092957A1中。附加的可用于所有三个途径的基因可由本领域的技术人员进行鉴定，如上所述。
对于利用所公开的生物合成途径的异丁醇生产，US 20070092957A1中还描述了嵌合基因的构建和酵母，例如啤酒糖酵母(啤酒糖酵母)酵母的基因工程。上文以及在本文实施例中有对基因构建和表达的进一步描述。
对于可在本发明细胞中工程化的生产1-丁醇的生物合成途径已公开于共同未决的美国专利申请公布US 20080182308A1中，其以引用方式并入本文。图3提供了公开的1-丁醇生物合成途径的图表。如US 20080182308A1中所述，公开的1-丁醇生物合成途径的步骤包括以下的转化：
-乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA(图3途径步骤a)，由例如乙酰-CoA乙酰转移酶进行催化；
-乙酰乙酰-CoA至3-羟基丁酰基-CoA(图3途径步骤b)，由例如3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶进行催化；
-3-羟基丁酰基-CoA至巴豆酰基-CoA(图3途径步骤c)，由例如巴豆酸酶进行催化；
-巴豆酰基-CoA至丁酰基-CoA(图3途径步骤d)，由例如丁酰基-CoA脱氢酶进行催化；
-丁酰基-CoA至丁醛(图3途径步骤e)，由例如丁醛脱氢酶进行催化；以及
-丁醛至1-丁醇(图3途径步骤f)，由例如丁醇脱氢酶进行催化。
可用于表达这些酶的基因描述于US 20080182308A1中，并且可用的附加基因可由本领域技术人员进行鉴定，如上所述。在US 20080182308A1中以及上文描述了这些基因在酵母中的表达方法。
在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含与酵母细胞异源的至少一个基因、至少两个基因、至少三个基因、至少四个基因或至少5个基因。在一些实施方案中，在重组宿主细胞中丁醇生物合成途径的每种产物转化过程的底物是由异源性多肽进行催化的。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径为异丁醇生物合成途径，并且催化底物以进行乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的产物转化的多肽、和/或催化底物以进行异丁醛至异丁醇的产物转化的多肽能够利用NADH作为辅因子。
应当理解，包含丁醇生物合成途径如本文所提供的异丁醇生物合成途径的宿主细胞可进一步包含一种或多种附加的修饰。美国专利申请公布20090305363(以引用方式并入)公开了通过工程化酵母以增加丙酮酸至乙酰乳酸的转化，所述工程化酵母表达定位于胞质溶胶的乙酰乳酸合酶并且基本消除了丙酮酸脱羧酶的活性。对于降低甘油3-磷酸脱氢酶活性、和/或干扰至少一个编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的基因或干扰至少一个编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件的基因的修饰如美国专利申请公布20090305363中所述的(以引用方式并入本文)，对宿主细胞的修饰通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳流量或降低等同物平衡，如美国专利申请公布20100120105中所述的(以引用方式并入本文)。其它的修饰包括整合至少一种多核苷酸，其编码在利用丙酮酸生物合成途径中催化一个步骤的多肽。其它的修饰包括在一种编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸中的至少一个缺失、突变和/或取代。在一些实施方案中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisae)的YMR226C(SEQ ID NO：63)或其同源物。附加的修饰包括在编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变和/或取代。在一些实施方案中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽为来自啤酒糖酵母的ALD6(SEQ ID NO：60)或其同源物。具有降低葡萄糖抑制作用的基因修饰，其中所述酵母生产宿主细胞为pdc-，其描述于美国专利申请公布20110124060中，该专利以引用方式并入本文。
重组宿主细胞可进一步包括(a)至少一种编码具有二羟酸脱水酶活性的异源多肽；和(b)(i)在编码影响铁-硫簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或取代；和/或(ii)至少一种编码影响铁-硫簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸。在一些实施方案中，所述影响铁-硫簇生物合成的多肽是由AFTl(核酸SEQ ID NO：64、氨基酸SEQ ID NO：65)、AFT2(SEQ ID NOs：66和67)、FRA2(SEQ ID NOs：68和69)、GRX3(SEQ ID NOs：70和71)或CCC1(SEQ ID NOs：72和73)编码的。在一些实施方案中，所述影响铁-硫簇生物合成的多肽是组成型突变体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F或AFT1C293F。
发酵培养基
本文所公开的高细胞密度生产培养物保持在培养基中以支持生产丁醇的代谢。所述培养基也能提供用于生产丁醇的培养物生存能力。通常本发明所用的培养基可包含至少约2g/L的葡萄糖或等量的碳底物。碳底物可包括但不限于单糖如果糖、低聚糖如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖、多糖如淀粉或纤维素或它们的混合物，以及来自于可再生原料的未纯化的混合物如干酪乳清渗透物、玉米浸液、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。因此可预期，培养基中的碳源可涵盖各种各样的含碳底物。碳底物也可由玉米浆、甘蔗汁、糖蜜、小麦醪或其它形式的生物质提供，所述生物质经液化或处理和糖化以释放其中的碳源。碳底物通常保持过量以使代谢最大化。
除了包含适宜的碳源外，发酵培养基还必须包含本领域的技术人员已知的适宜矿物、盐、辅因子、缓冲液和其它组分，那些组分适用于培养物的代谢和促进生产丁醇所需的酶促途径。
适宜的培养基包括常见的商业制备的培养基，如包括酵母含氮碱基、硫酸铵和作为碳/能量源的右旋糖的肉汤，或YPD培养基，由蛋白胨、酵母提取物和对于大多数啤酒糖酵母菌株生长的最佳比例的右旋糖组成的共混物。也可使用微生物学和发酵科学领域的技术人员所已知的、其它定义的或合成的生长培养基。
培养条件
通常培养物保持在支持活的丁醇生产酵母细胞的条件下，包括在适宜的培养基中温度在约20℃至约37℃的范围内。对于发酵适宜的pH范围通常在pH 3.0和pH 7.5之间，在一些实施方案中pH 4.5至pH 6.5是初始条件。
发酵可在有氧或厌氧条件下进行。在一些实施方案中，溶解氧保持在微氧条件至高于3％之间。
所述发酵培养基中的丁醇的量通过高效液相色谱法(HPLC)来测定。然而也可采用其它业内已知的方法。
培养物可为成批发酵、分批补料发酵或连续发酵系统。补料-分批系统与典型的成批系统类似，不同的是随着发酵过程的进行添加碳源底物。成批和分批补料发酵是本领域常用和熟知的，并且实施例可描述于Thomas D.Brock在Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，1989，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.)，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)中，其以引用方式并入本文。
典型的生产条件可包括一段时间的分批补料过程，一旦加入所有的碳源都后切换至成批模式。在商业条件下，过一段时间添加所述液化醪或原料，并且糖化酶也加入发酵罐中，其随着时间的推移从淀粉中释放葡萄糖。这种随着时间的推移将葡萄糖从淀粉中缓慢释放的过程是由加入发酵罐中的糖化酶的量所控制的。就甘蔗汁发酵而言，随着时间的推移缓慢加入所述底物，直至所有底物都已加入，之后发酵过程进入成批模式。所述发酵可进行约1小时至200小时的时间。
从发酵培养基中分离产物
在生产过程中，丁醇产物可通过本领域已知的方法从发酵培养基中移出，包括真空应用和液-液萃取。
产物能通过本领域技术人员已知的方法从发酵培养基中分离出来。例如，生物生产的异丁醇可采用本领域已知的ABE发酵(参见例如Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中的参考文献)的方法从发酵培养基中分离。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，所述异丁醇可采用如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气提、膜蒸发、全蒸发或真空闪蒸发酵(描述于例如美国专利公布20090171129A1和国际专利公布WO2010/151832A1中，两者均全文以引用方式并入本文)。真空可被应用于发酵液的部分或全部以从水相中移出丁醇。
因为丁醇形成了低沸点、含水的共沸混合物，蒸馏可用于分离这种混合物直至其达到其共沸组合物。蒸馏可与其它分离方法组合使用以分离共沸物。可与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附和基于膜的技术。此外，可采用共沸蒸馏使用夹带剂(参见例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)分离丁醇。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而可组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化异丁醇。在这种方法中，蒸馏包含异丁醇的发酵液使其接近共沸组成。然后冷凝共沸混合物，并且通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗析后的含水相可作为回流返回第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
丁醇也可采用液-液萃取与蒸馏的结合从发酵培养基中分离。在这种方法中，采用液-液萃取用适宜溶剂从发酵液中萃取异丁醇。然后蒸馏所述包含异丁醇的有机相以从溶剂中分离出丁醇。加入的萃取剂量可为发酵罐体积的5％至50％以用于液-液萃取(LLE)，在发酵过程中从含水介质中移出丁醇。
蒸馏与吸附的组合也可用于从发酵培养基中分离异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组合物，然后通过使用吸附剂如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design andEconomics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and EnzymaticHydrolys1s for Corn Stover，报告NREL/TP-510-32438，国家可再生能源实验室，2002年6月)除去残留的水分。
此外，也可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵培养基中分离并纯化异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组合物，然后通过亲水性膜渗透全蒸发(Guo等人，J.Membr.Sci.，245，199-210(2004))除去残留的水分。
就地产物移除(ISPR)(也被称为萃取发酵)可用于从其生产的发酵容器中移出丁醇(或其它发酵的醇)，从而使微生物以高产率生产丁醇。如本领域已描述的用于移出发酵性醇的一种ISPR方法为液-液萃取。一般来讲，关于丁醇发酵，例如包括微生物的发酵培养基，在所述丁醇浓度达到毒性水平之前与有机萃取剂接触。有机萃取剂和发酵培养基形成两相混合物。进入有机萃取相的丁醇部分降低了包含微生物的水相中的浓度，从而限制了丁醇对暴露的微生物的抑制作用。
液-液萃取可按照例如美国专利申请公布20090305370中所述的方法进行，其公开内容全文以并入本文。美国专利申请公布20090305370描述了生产丁醇和采用液-液萃取从发酵液中回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液与水不混溶的萃取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，所述萃取剂可为有机萃取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的萃取剂可为非醇萃取剂。ISPR萃取剂可为外来有机萃取剂，如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、1-十一烷醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一烷醛、月桂醛、20-甲基十一烷醛、以及它们的混合物。
在一些实施方案中，所述醇可通过如下方法酯化：使发酵培养基中的醇与有机酸(例如脂肪酸)和能够将所述醇与有机酸酯化的催化剂(例如酶，如酯酶)接触。在此类实施方案中，所述有机酸能作为ISPR萃取剂，醇酯部分进入该ISPR萃取剂中。有机酸可被供给到发酵容器中，和/或来源于提供加入发酵容器中的可发酵碳的生物质。原料中存在的脂类可被催化水解成有机酸，且相同的催化剂(例如酶)可使有机酸与醇酯化。催化剂可在发酵前被供给到原料中，或可在原料供给之前或同时供给到发酵容器中。当催化剂被供给到发酵容器中时，能通过脂类水解成有机酸，并且有机酸与发酵容器中存在的丁醇基本上同时酯化而获得醇酯。来源于原料的有机酸和/或天然油脂也能进料到发酵容器中，其中天然油脂被水解成有机酸。任何不与醇酯化的有机酸均能够作为ISPR萃取剂的一部分。包含醇酯的萃取剂能从发酵培养基分离出来，并且所述醇可从萃取剂中回收利用。萃取剂可从发酵容器中回收使用。因此，就生产丁醇而言，例如丁醇至酯的转化降低了发酵培养基中的游离丁醇浓度，防护微生物免受增加的丁醇浓度毒性作用。此外，未被分馏的颗粒能用作原料，但不用分离其中的脂类，因为这些脂类可被催化水解成有机酸，从而降低ISPR萃取剂中的脂类的积聚率。
就地产物移除可以分批模式或连续模式进行。在连续模式的就地产物移除中，产物从反应器中持续地移出。在分批模式的就地物移除中，将一定体积的有机萃取剂加入发酵容器中，并且所述萃取剂在这个过程中不去除。对于就地产物移除，有机萃取剂可在发酵开始时接触发酵培养基，从而形成两相发酵培养基。作为另外一种选择，有机萃取剂可在微生物已达到期望的生长量后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可通过测定培养物的光密度来确定。此外，有机萃取剂可在发酵培养基中的产物醇含量达到预选的水含量时接触所述发酵培养基。就根据本发明的一些实施方案的丁醇生产而言，有机萃取剂可在丁醇浓度到达毒性水平之前接触发酵培养基，以便使丁醇和有机酸酯化以生产丁醇酯，并因而降低发酵容器中的丁醇浓度。在获得了期望的有效丁醇酯滴度后，包含酯的有机相能从发酵容器中取出(并与构成水相的发酵液分离)。在一些实施方案中，在发酵容器中的可利用的可发酵糖基本上完全发酵后，包含酯的有机相与水相中分离。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的实施方案，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实施例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离本发明实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
所用缩写的意义如下：“min”是指分钟，“h”是指小时，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“nn”是指纳米，“mm”是指毫米，“cm”是指厘米，“μm”是指微米，“mM”是指微摩尔，“M”是指摩尔，“mmol”是指毫摩尔，“μmole”是指微摩尔，“g”是指克，“μg”是指微克，“mg”是指毫克，“OD600”是指在600纳米波长内测量的光密度，“CFU”是指菌落形成单位数，“HPLC”是指高效液相色谱法。
一般方法：
酵母的培养基和生长描述于Amberg，Burke和Strathern，2005，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY中。方法也描述于酵母规程(Editor W.Xiao，Humana Press，Totowa，New Jersey)中。在600纳米处的光密度值(OD600)利用Ultraspec3100分光光度计(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)测量。
实施例1
对于啤酒糖酵母BY4743在低细胞密度和高细胞密度的24小时生存情
况
啤酒糖酵母BY4743(ATCC 201390)从冷冻机小瓶铺到YPD琼脂(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y1000)上，并在30℃下温育过夜。将来自于YPD平板的细胞接种到25ml YPD肉汤预培养物(Teknova；目录号Y5000)中，其具有0.06至0.08的初始OD600。该预培养物在30℃下在透气振荡器中生长7小时。将预培养物的等分试样接种到200ml的YPD肉汤中，其具有0.06至0.08的初始OD600，并且该培养物在30℃下透气温育大约17小时。测定所述培养物的光密度，离心所述培养物并使细胞重悬浮在新鲜YPD肉汤中以得到5的OD600。这被称之为高细胞密度(HCD)培养物。所述培养物稀释100倍到新鲜YPD肉汤中，得到OD600为0.05的培养物。这被称之为低细胞密度(LCD)培养物。这些培养物在30℃下振荡温育30分钟以作为适应期。在30分钟振荡期结束后，测量OD600值。5ml的低细胞密度培养物或高细胞密度培养物分发到15ml锥形管中，其中包含用于测试的不同浓度的醇。在对照管中不包含醇。所述管放置于30℃的旋转转筒中并温育24小时。细胞加入的时间被称为“零时”。测试的浓度为：1.0％(w/v)、1.5％和2％的1-丁醇；1.0％、1.5％和2.5％的异丁醇；2.0％、3.0％和3.5％的2-丁醇；以及2.0％、4.0％和5％的乙醇。每种培养物的醇浓度在24小时后用HPLC来测定，其表明在温育期损失了＜0.01％的醇。
采用标准微生物学方法，在零时测定YPD平板上的菌落形成单位数(CFU)作为对照，并在24小时时测定每种培养物，包括对照培养物。培养物在酶标板中连续稀释(20μl的培养物和180μl的YPD肉汤)，然后将10μl的不同的稀释液点在三层琼脂平板上并在30℃下温育24至48小时。菌落在48小时后计数，并计算出CFU/ml。在零时，所述低细胞密度培养物具有约4.8×105CFU/ml，并且所述高细胞密度培养物具有约5.4×107CFU/ml。所述生存百分数基于24小时的对照(0丁醇)HCD或LCD培养物的CFU/ml计进行计算，结果在表2中给出。
表2：啤酒糖酵母在暴露于各种醇24小时后的生存情况
不含醇的对照高细胞密度培养物在24小时内从5.4×107细胞/毫升增至6.5×107细胞/毫升。不含醇的对照低细胞密度培养物在24小时内从4.8×105细胞/毫升增至2.8×107细胞/毫升。在暴露于1-丁醇、异丁醇或2-丁醇的培养物中，高细胞密度培养物的生存百分数显著地高于低细胞密度培养物的生存百分数(表2)。与之相反，对于暴露于2.0％或4.0％的乙醇，高细胞密度培养物比低细胞密度培养物更敏感。
实施例2
对于非酵母属酵母的低细胞密度和高细胞密度的24小时生存情况
对非酵母属酵母菌株进行了测试以测定对于这些酵母的异丁醇耐受性是否受到了细胞密度的影响。对马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)PNY0577(美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，Manassas，VA；ATCC#8554)，马克思克鲁维酵母PNY0578(ATCC#16045)，膜璞毕赤酵母(Pichia membranifaciens)PNY0572，异常毕赤酵母(Pichiaanomala)PNY0573，毕赤酵母属(Pichia sp.)PNY0574，东方伊萨酵母PNY0575和东方伊萨酵母PNY0576进行了测试。使用的毕赤酵母属(Pichia)和伊萨酵母属(Issatchenkia)菌株是指定属的野生型代表。其它的代表性菌株可例如从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)商购获得。
非酵母属酵母菌株从冷冻机小瓶中铺到YPD琼脂平板(Teknova，Hollister，CA)上并在30℃下温育过夜。将来自于所述YPD平板的每种菌株的细胞接种到25ml的YPD肉汤预培养物中(Teknova，Hollister，CA)，其具有0.06至0.08的初始OD600，在30℃下在有氧振荡器中生长7小时。将每种预培养物的等分试样接种到200ml YPD肉汤中，以提供0.06至0.08的初始OD600，并且所得培养物在30℃下透气温育大约17小时。测量所述培养物的光密度，离心所述培养物离心并使细胞重悬浮在新鲜YPD肉汤中以得到5的OD600。这被称之为高细胞密度(HCD)培养物。这种培养物被稀释100倍到新鲜YPD肉汤中，以得到OD600为0.05的培养物。这被称之为低细胞密度(LCD)培养物。这些培养物在30℃下振荡温育30分钟以作为适应期。在30分钟的适应期结束时，测量OD600。
将5毫升低细胞密度培养物或高细胞密度培养物分配到15毫升锥形管中，其中含有用于测试的多种浓度的异丁醇。所述管子放置在旋转的转筒中，在30℃下温育24小时。所述异丁醇浓度为1.0％或2.0％。每种菌株的对照培养物不含异丁醇。细胞加入的时间为“零时”。在24小时后，用HPLC测量每种样品的异丁醇浓度，其表明在温育过程中损失了＜0.01％的醇。所有样品用Acrodisc CR PTFE 0.2μm过滤器(Pall Life Sciences，PortWashington，NY)进行过滤，并使用Shodex SH1011柱进行分析(8mm ID×300mm length；Showa Denko America，Inc.，New York，N Y)和用Shodex SH-G作为保护柱。注射体积为10μL。流动相为0.01N硫酸。柱温为50℃，流动相流量为0.5ml/min。对于检测，使用210nm的光度检测器和折射指数检测器。
菌落形成单位数(CFU)在YPD板上进行测定，采用标准微生物学方法，以零时作为对照测定所有样品24小时，包括对照培养物。基本上，细胞在酶标板中连续稀释(20μl培养物和180μl YPD肉汤)，并且将10μl的不同的稀释液点在三层琼脂平板上并在30℃下温育24至48小时。菌落在48小时后计数，计算出CFU/ml。基于24小时HCD的CFU/ml或每种菌株的LCD对照培养物计，计算出生存百分比，结果在表3中给出。
不含异丁醇的对照高细胞密度培养物在24小时中约1.0×108细胞/毫升增至约1.5×108细胞/毫升。不含异丁醇的对照低细胞密度培养物在24小时中约1.1×106细胞/毫升增至约1.0×108细胞/毫升。在暴露于1.0％的异丁醇情况下，所有的非酵母属酵母菌株的HCD培养物的生存水平显著地高于LCD培养物(表3)。在暴露于2.0％的异丁醇情况下，只有一种菌株(PNY0574)生存下来。在暴露于2.0％的异丁醇情况下，这种菌株的HCD培养物的生存水平也显著地高于LCD培养物的生存水平。
表3：非酵母属酵母在暴露于异丁醇24小时后的生存情况
实施例3
在异丁醇的存在下，啤酒糖酵母菌株在高细胞密度培养物中的葡萄糖
利用速率
啤酒糖酵母BY4743从冷冻机小瓶铺到YPD琼脂(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y1000)上并在30℃下温育过夜。将来自于YPD平板的细胞接种到25ml YPD肉汤预培养物(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y5000)中，其具有0.06至0.08的初始OD600，并且该培养物在30℃下在透气振荡器中生长7小时。所述预培养物的等分试样接种到200ml的YPD肉汤中，其具有0.06至0.08的初始OD600，然后该培养物在30℃下透气温育大约17小时。测定所述培养物的光密度，离心所述培养物并使细胞重悬浮在新鲜YPD肉汤中以得到OD600为8。此时，所述培养物的10ml的等分试样用于细胞干重测定，该测定得出的结果为3.89gdcw/L。
将20ml的培养物转移至烧瓶中，所述烧瓶包含0.0％、0.5％、1.0％、1.25％、1.5％、1.75％或2.0％的异丁醇。细胞加入的时间被称为零小时。在不同的时间，样品(1.5ml)被取出并在microfuge(Sorvall Biofuge pico)中以10,000rpm离心2分钟。所述上层清夜通过0.2μm的过滤器(Pall LifeSciences，Port Washington，NY)Pall GHP Acrodisc 13mm带有0.2μm GHPMembrane的注射器过滤器)进行过滤，所述滤液被稀释十倍，采用YSIGlucose Analyzer(YSI 2700 Select；YSI，Inc.，Yellow Springs，Ohio)测定葡萄糖浓度。
当所述细胞浓度为18gdcw/L或24gdcw/L时，也测定在异丁醇存在下的葡萄糖消耗速率。将来自于所述YPD平板的细胞接种到25ml YPD肉汤预培养物(Teknova，Hollister，CA Cat.#Y5000)中，其具有0.06至0.08的初始OD600，并且该培养物在30℃下在透气振荡器中生长7小时。将所述预培养物的等分试样接种到8个装有300ml YPD肉汤的烧瓶中，其具有0.1的初始OD600，并且该培养物在30℃下透气温育大约17小时。测定所述培养物的光密度，离心所述培养物并使细胞重悬浮在新鲜YPD肉汤中以得到38(18gdcw/L)的OD600。将样品(15ml)转移至烧瓶中，所述烧瓶包含2％、3％或4％的异丁醇，葡萄糖消耗持续了150分钟。
重复该实验，不同的是起始OD600为49.1(24gdcw/L)。将样品(15ml)转移至烧瓶中，所述烧瓶包含1.5％、3％或4％的异丁醇，葡萄糖消耗持续了150分钟。图4中是对于BY4743结果的作图。
在测试的实验条件下，对照培养物中(不含异丁醇)的葡萄糖消耗速率为大约2.17g/gdcw/h。在1.5％的异丁醇中，对于3.8和24gdcw/L的培养物，所述葡萄糖消耗速率是对照速率(约1.1g/gdcw/h)的大约50％。甚至观察了在2.0％和2.5％的异丁醇存在下的葡萄糖消耗，其范围是对照速率的20％至25％。在对照中的真实葡萄糖消耗速率在一个实验和另一个实验之间可变化5％。然而，异丁醇抑制作用的相对百分比是可再现的。
实施例4
生成高细胞密度培养物的方法
啤酒糖酵母BY4743从冷冻机小瓶铺到YPD琼脂(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y1000)上并在30℃下温育过夜。将来自于YPD平板的细胞接种到25ml YPD肉汤预培养物(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y5000)中，其具有0.06至0.08的初始OD600。所述预培养物在30℃下在透气振荡器中生长7小时。所述预培养物的等分试样接种到125ml的YPD肉汤中，其具有0.06至0.08的初始OD600，并且该培养物在30℃下透气温育大约17小时。
将150ml YPD的起始培养物接种到5ml的过夜培养物中，其具有0.15的初始OD600。所述培养物在30℃下透气温育两小时，达到0.38的OD600。此时(时间＝0)，所述培养物挑战了表4给出的不同浓度的异丁醇，其OD6005小时中每小时测一次，在24小时测一次。结果在表4中给出。
表4：酵母在不同异丁醇浓度下的生长(OD
600
)
由于对于该菌株，1OD600等于107细胞/毫升，在1％异丁醇的存在下，啤酒糖酵母在过夜生长后生长至约4×107细胞/毫升。
生长于1％或更低(异丁醇浓度为1％)的异丁醇、其OD600为4.41，或更高的所述培养物是高细胞密度培养物。这些培养物可用于异丁醇生产。
实施例5
生成具有高葡萄糖消耗的菌株的方法
使用的啤酒糖酵母菌株为PNY0569CEN.PK122(MATa MAL2-8c SUC2/MATalpha MAL2-8c SUC2)和PNY0571(CEN.PK 113-7D MATa MAL2-8cSUC2)，得自Centraalbureau voor Schimmelcultures，Fungal and YeastCollection(Netherlands)以及PNY0602和PNY0614。PNY0602和PNY0614与PNY0571的一个诱变处理的培养物分离。PNY0571(CEN.PK 113-7D)经受10轮的化学诱变，使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸乙酯(EMS)，采用标准方法(Barbour，L.，M.Hanna和W.Xiao.2006.Mutagenesis，第121-127页，W.Xiao(编辑)，Yeast Protocols，第二版，Humana Press，NJ)。细胞在30℃的10ml YPD中生长过夜，并伴随振荡。离心所述过夜培养物，并且使所述粒料重悬浮于pH 7.0的50mM的磷酸钾缓冲液中。再次离心所述细胞，并使其重悬浮于相同的10ml缓冲液中。将重悬浮细胞(2.5ml)的一部分转移至15ml塑性螺帽离心管中，并且这些细胞用NTG(10μg/ml最终浓度)或EMS(3％w/v)在30℃下处理40分钟，不振荡。通过加入等体积的过滤灭菌的10％(w/v)硫代硫酸钠使诱变剂失活。离心所述处理的细胞并使其在水中重悬浮两次。所述处理规程涉及反复循环：用所述诱变剂中的一种(例如NTG)处理酵母细胞，让生存下来的细胞在含1％的异丁醇的YPD中生长过夜，并且然后用其它的诱变剂(例如EMS)处理该过夜的培养物。在第五次循环后(即总共10次诱变剂处理)，筛选对异丁醇耐受的细胞。持续很久的暴露于3.0％的异丁醇(24小时)后，分离出PNY0602。将诱变的细胞重悬浮于蒸馏水中并将细胞转移至干冰乙醇浴中，每20分钟在37℃下水浴一次，诱变的培养物的重复的冻融循环5次后，分离出PNY0614。
所述与ATCC保藏号PTA-11918相关联的分离的微生物在本文中也已知为PNY0602。所述与ATCC保藏号PTA-11918相关联的分离的微生物被沉积，这根据布达佩斯条约于2011年6月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，Patent Depository 10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209。所述与ATCC保藏号PTA-11919相关联的分离的微生物在本文中也已知为PNY0614。所述与ATCC保藏号PTA-11919相关联的分离的微生物被沉积，这根据布达佩斯条约于2011年6月1日保藏于美国典型培养物保藏中心，Patent Depository 10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209。
当细胞浓度为约8O.D.(约3.9gdcw/L)时，还测定在异丁醇的存在下YPD中的葡萄糖消耗速率。啤酒糖酵母菌株PNY0571、PNY0602和PNY0614从冷冻机小瓶铺到YPD琼脂(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y1000)上并在30℃下温育过夜。将来自于YPD平板的细胞接种到25mlYPD肉汤预培养物(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y5000)中，其具有0.06至0.08的初始OD600，并且培养物在30℃下于空气振荡器中生长7小时。将所述预培养物的等分试样接种到200ml的YPD肉汤中，其具有0.06至0.08的初始OD600，然后该培养物在30℃下透气温育大约17小时。测定所述培养物的光密度，离心所述培养物并且使细胞重悬浮在新鲜YPD肉汤中以得到8的OD600。此时所述培养物的10ml的等分试样用于细胞干重测定，该测定得出细胞干重在3.89gdcw/L的范围内。
将20ml的培养物转移至烧瓶中，所述烧瓶包含0.0％、0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.5％、1.75％、2.0％和2.5％的异丁醇。细胞加入的时间被称为零小时。在不同的时间，将样品(500至700ul)转移至含等体积的10％TCA的管中。离心样品，并在YSI葡萄糖分析仪(YSI 2700 Select)中测定葡萄糖。
结果示于表5中。这些结果显示葡萄糖消耗速率通过诱变和选择与亲本相比得以改善。
表5：在具有不同含量异丁醇的高细胞密度培养物中消耗的葡萄糖/克
细胞干重/小时
异丁醇生产可与生长相关联或不与生长相关联。因此，使用三种不同的pH缓冲液在非生长条件下测量了葡萄糖消耗速率。
葡萄糖消耗速率在pH 6.5的磷酸盐缓冲液中测定，如由Diderich，J.A.等人，Microbiology，1999，145，第3447-54页所概述的。也采用MES缓冲液在pH 5.25和pH 4.0下测定葡萄糖消耗速率。
细胞在30℃下于YPD(在500ml烧瓶中为125ml)中生长过夜。离心细胞并使其重悬浮于缓冲液中(0.1M磷酸缓冲液pH 6.0或0.1M MES缓冲液pH 5.25或0.1M MES缓冲液pH 4.0)，洗涤一次，并且然后重悬浮使得每种细胞悬浮液具有大约16OD或1亿6千万细胞/毫升。将10ml的这些原液细胞转移至烧瓶中，所述烧瓶包含10ml对应的缓冲液，所述缓冲液包含40g/L葡萄糖和不同浓度的异丁醇。在不同的时间样品(500至700ul)被转移至包含等体积的10％的TCA的管中。离心样品，并在YSI葡萄糖分析仪中测定葡萄糖。通过绘制随时间推移而消耗的葡萄糖量来测定葡萄糖消耗速率。结果示于表6中。在20g/L异丁醇的存在下，在低于pH 6.5的pH值下观察到了更高的葡萄糖消耗速率
表6：在20g/L异丁醇的存在下，在三个不同pH值下的葡萄糖利用速
率(g/gdcw/h)
实施例6
在异丁醇的存在下，东方伊萨酵母菌株在高细胞密度培养物中的葡萄
糖利用速率
东方伊萨酵母菌株PNY0660来源于先前被称为酸栖热假丝酵母(Candida acidothermophilium)的ATCC 20381菌株。菌株PNY0660从冷冻机小瓶铺到YPD琼脂(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y1000)上并在30℃下温育过夜。将来自于YPD平板的细胞接种到50ml YPD肉汤预培养物(Teknova，Hollister，CA；Cat.#Y5000)中，其具有0.06至0.08的初始OD600，并且该培养物在30℃下在空气振荡器上生长5小时。将所述预培养物的等分试样接种到200ml的YPD肉汤中，其具有0.6的初始OD600，并且该培养物在30℃下透气温育大约17小时。测定所述培养物的光密度，离心所述培养物，在玉米测试培养基中测定糖消耗速率。玉米测试培养基包含0.2％的酪蛋白氨基酸和2％的葡萄糖以及100mM pH 5.25的MES缓冲液，并且每升包含：(i)盐：硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾2.8g，和硫酸镁七水合物0.5g；(ii)维生素：生物素(D-)0.40mg，D(+)泛酸钙8.00mg，肌醇200.00mg，盐酸吡哆醇8.00mg，对氨基苯甲酸1.60mg，核黄素1.60mg，叶酸0.02mg，烟酸30.0mg，和硫胺素30mg；和(iii)痕量元素：EDTA(Titriplex III7)99.38mg，硫酸锌七水合物29.81mg，无水氯化锰5.57mg，氯化钴(II)六水合物1.99mg，硫酸铜(II)五水合物1.99mg，Di-无水钼酸钠2.65mg，无水氯化钙29.81mg，硫酸亚铁七水合物19.88mg，和硼酸。
将玉米测试培养基中的20ml培养物(2.7gdcw/L)转移至烧瓶中，所述烧瓶包含0.0％、0.5％、1.0％、1.5％、1.75％或2.0％的异丁醇。细胞加入的时间被称为零小时。在不同的时间，取出样品(1.5ml)并且在microfuge(Sorvall Biofuge pico)中以10,000rpm离心2分钟。上层清液通过0.2μm的过滤器(Pall Life Sciences，Port Washington，NY)Pall GHP Acrodisc 13mm注射器过滤器(0.2μm GHP膜)过滤，所述滤液被稀释十倍，并且使用YSI葡萄糖分析仪(YSI 2700Select；YSI，Inc.，Yellow Springs，Ohio)测定葡萄糖浓度。从零至6小时测定的糖消耗速率示于表7中。
表7
东方伊萨酵母菌株在20g/l异丁醇的存在下具有0.7g/gdw/h的糖消耗速率。
提供了本发明的前述描述以用于例证和说明的目的。此外，所述描述并不旨在将本发明限于本文所公开的形式。
本文所述的所有这些各个方面、多个实施方案和选项可以任何或所有变型形式组合。
在该说明书中提到的所有的公布、专利和专利申请以引用方式并入本文，如同每个单独的公布、专利或专利申请被专门地和单独地以引用方式并入。
Claims (22)
1.用于发酵生产丁醇的生产培养物，包含：
(i)培养基，其包含可发酵碳底物；
(ii)酵母细胞培养物，其具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率；和
(iii)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约2.4克细胞干重/升。
3.根据权利要求2所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约7克细胞干重/升。
4.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述生产丁醇的酵母细胞具有至少约1克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
5.根据权利要求4所述的生产培养物，其中所述生产丁醇的酵母细胞由以下方法产生，所述方法包括：
(i)诱变；
(ii)暴露于3％的异丁醇；以及
(iii)重复冻-融循环。
6.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母是克拉布特里阳性的。
7.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母是选自下组的属的成员：酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issaichenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。
8.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母包含异丁醇途径或1-丁醇途径。
9.根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述培养物在以下条件下保持约1小时至约200小时：
(i)约20℃至约45℃的温度；
(ii)保持在微氧条件至高于3％的溶解氧；
(iii)由液化的生物质提供的过量碳底物；
(iv)约3至约7.5的pH；和
(v)选自真空应用和液-液萃取的丁醇移除。
10.用于生产丁醇的方法，包括：
(i)制备根据权利要求1所述的生产培养物，其中所述酵母包含异丁醇途径或1-丁醇途径；以及
(ii)在生产丁醇的条件下发酵所述酵母。
11.用于发酵生产丁醇的生产培养物，包含：
(i)培养基，其包含可发酵碳底物；
(ii)酵母细胞培养物，其具有至少约2.4克细胞干重/升的细胞密度；和
(iii)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约2％(w/v)。
12.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述培养物具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
13.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述培养物具有至少约1克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
14.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约7克细胞干重/升。
15.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述丁醇浓度为至少约2.5％，并且所述培养物具有至少约0.4克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率。
16.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述酵母是选自下组的属的成员：酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
17.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述酵母包含异丁醇途径或1-丁醇途径。
18.根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述培养物在以下条件下保持约1小时至约200小时：
(i)约20℃至约37℃的温度；
(ii)保持在微氧条件至高于3％的溶解氧；
(iii)由液化的生物质提供的过量碳底物；
(iv)约3至约7.5的pH；和
(v)选自真空应用和液-液萃取的丁醇移除。
19.用于生产丁醇的方法，包括：
a.制备根据权利要求11所述的生产培养物，其中所述酵母包含选自异丁醇途径、1-丁醇途径和2-丁醇途径的丁醇生物合成途径；以及
b.在生产丁醇的条件下发酵所述酵母。
20.用于提高生产培养物对于发酵生产丁醇的耐受性的方法，包括：
(i)提供培养基，所述培养基包含可发酵碳底物；
(ii)提供生产丁醇的酵母细胞培养物，所述酵母细胞培养物具有至少约0.5克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率；以及
(iii)使所述酵母培养物与所述可发酵碳底物接触，从而将所述葡萄糖利用速率保持一段适宜的时间并且从而生产丁醇。
21.用于发酵生产丁醇的生产培养物，包含：
(i)培养基，其包含可发酵碳底物；
(ii)酵母细胞培养物，其具有至少约2.4克/克细胞干重/小时的葡萄糖利用速率；和
(iii)丁醇，其在培养基中的浓度为至少约1％(w/v)。
22.根据权利要求21所述的生产培养物，其中所述细胞的密度为至少约2.7克细胞干重/升。
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