CN101680007A

CN101680007A - 使用高活性酮醇酸还原异构酶来发酵生产异丁醇

Info

Publication number: CN101680007A
Application number: CN200880012258A
Authority: CN
Inventors: 廖德瑛; M·J·奈尔逊; M·G·布拉穆奇
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2010-03-24
Also published as: CA2683898C; US9284612B2; EP2134849A2; JP2014176386A; US20110250610A1; ES2426070T3; AU2008242978B2; US7910342B2; CA2683898A1; KR101573775B1; JP5582576B2; JP2010524470A; MX2009011192A; KR20100016602A; WO2008130995A3; ZA200906811B; BRPI0808600A2; JP5908026B2; WO2008130995A2; AU2008242978A1

Abstract

本发明提供发酵生产异丁醇的方法，所述方法是通过发酵法培养除了用于将葡萄糖转化为异丁醇所需的其他酶之外还表达高活性酮醇酸还原异构酶的重组微生物。

Description

使用高活性酮醇酸还原异构酶来发酵生产异丁醇

发明领域

本发明涉及工业微生物和醇生产领域。更具体地讲，通过使用特殊的酮醇酸还原异构酶(KARI)以高转换数工业发酵重组微生物来生产异丁醇。本发明还涉及从自然微生物中发现高活性KARI酶的方法。

发明背景

丁醇是一种重要的工业化学品，其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级萃取剂。每年，通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求可能还会增加。

用于化学合成异丁醇的方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳催化氢化(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)和甲醇与正丁醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A：Chem.220，215-220，2004)。这些工艺利用衍生自石油化学品的起始材料并通常昂贵，并且对环境不友好。用衍生自植物的原材料生产异丁醇将会使温室气体排放达到最低程度并将代表本领域的进步。

异丁醇在生物学上作为酵母发酵的副产物产生。它是“杂醇油”的一种组分，杂醇油由这群真菌氨基酸的不完全代谢形成。异丁醇具体地讲由L-缬氨酸的分解代谢而产生。在L-缬氨酸的胺基作为氮源被利用后，所得的α-酮酸被酶脱羧并还原成异丁醇，这就是所谓的Ehrlich途径(Dickinson等人，J.Biol.Chem.273，25752-25756，1998)。饮料发酵过程中获得的杂醇油和/或其组分的收率通常很低。例如，据报道在啤酒发酵中产生的异丁醇的浓度小于16ppm(Garcia等人，ProcessBiochemistry 29，303-309，1994)。发酵中加入外源L-缬氨酸可提高异丁醇的收率，如Dickinson等人所述，同上，其中据报道通过在发酵中提供浓度为20g/L的L-缬氨酸能获得3g/L的异丁醇收率。此外，海藻酸钙固定化的运动发酵单胞菌细胞已经显示能产生正丙醇、异丁醇和异戊醇。使用了补充有L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、α-酮异己酸(α-KCA)、α-酮丁酸(α-KBA)或α-酮异戊酸(α-KVA)的10％含葡萄糖培养基(Oaxaca，等人，Acta Biotechnol.；11，523-532，1991)。α-KCA提高了异丁醇含量。氨基酸提供了对应的醇，但其数量少于酮酸。当将亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸作为氮源加入培养基时，来自碳水化合物的C3-C5醇的收率显示增加(WO 2005040392)。

虽然上述方法显示了经由生物方法生产异丁醇的潜力，但是这些方法当用于工业规模的异丁醇生产时受到成本的制约。从糖直接生物合成异丁醇将是经济上可行的并将代表本领域的进步。然而，该生产受到低速酮醇酸还原异构酶(KARI)的严重阻碍，所述酶催化将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的异丁醇途径中的第二步。因为所述酶已经是高水平表达的(S.Epelbaum等人J.Bacteriol.，180，4056-4067，1998)，需要在不增加蛋白质数量的情况下提高KARI酶的活性，即，提高酶比活。

申请人已经通过发现一种具有高比活的KARI酶解决了所述问题，所述酶可被用于提高异丁醇的生物性生产。

发明概述

本发明涉及表达高活性KARI酶的重组生物体。工程化微生物具有高含量的短型KARI酶，所述酶具有显著更高的比活(大肠杆菌中的KARI酶的6-8倍)并可用于异丁醇的商业生产。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，该方法包括：

a)提供包含编码多肽的基因构建体的微生物宿主细胞，所述多肽具有大于大肠杆菌的酮醇酸还原异构酶比活的酮醇酸还原异构酶比活；以及

b)使所述(a)的宿主细胞接触乙酰乳酸，其中产生2，3-二羟基异戊酸。

在一个优选的实施方案中，基因构建体编码具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的酮醇酸还原异构酶比活的多肽，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

a)约7.5的pH值；

b)约22.5℃的温度；和

c)大于约10mM的钾。

在另一个实施方案中，本发明提供了生产异丁醇的方法，该方法包括：

a)提供包括下列基因构建体的重组微生物宿主细胞：

1)至少一种编码乙酰乳酸合酶的基因构建体，所述乙酰乳酸合酶将丙酮酸转化为乙酰乳酸(途径步骤a)；

2)至少一种编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体，所述酮醇酸还原异构酶的比活基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

i)约7.5的pH值；

ii)约22.5℃的温度；和

iii)大于约10mM的钾，所述钾用于将(S)-乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸，(途径步骤b)；

3)至少一种编码乙酰羟酸脱水酶的基因构建体，所述乙酰羟酸脱水酶用于将2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸，(途径步骤c)；

4)至少一种编码支链酮酸脱羧酶的基因构建体，所述支链酮酸脱羧酶用于将α-酮异戊酸转化为异丁醛，(途径步骤d)；

5)至少一种编码支链醇脱氢酶的基因构建体，所述支链醇脱氢酶用于将异丁醛转化为异丁醇(途径步骤e)；以及

b)使(a)的宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。

在另一个实施方案中，本发明提供包括酮醇酸还原异构酶的重组宿主细胞，所述酶具有的比活大于大肠杆菌酮醇酸还原异构酶的比活。

在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体的方法，所述酶具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的比活，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

i)约7.5的pH值；

ii)约22.5℃的温度；和

iii)大于约10mM的钾；

该方法包括以下步骤：

a)鉴定当在M9基本培养基中生长时倍增时间短于大肠杆菌的倍增时间的菌种；

b)筛选(a)的菌种的酮醇酸还原异构酶活性以鉴定活性菌种；

c)使用与已知编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体具有同源性的核酸序列来探测(b)活性菌种的基因组DNA，以从所述活性菌种中鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及

d)从所述活性菌种中扩增并表达编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及

e)从步骤(d)的表达的基因构建体中筛选具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的比活的酮醇酸还原异构酶的基因构建体，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

i)约7.5的pH值；

ii)约22.5℃的温度；和

iii)大于约10mM的钾。

附图说明和本发明的序列

通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。

图1显示了四种不同的异丁醇生物合成途径。标记有“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”、“I”、“j”和“k”的步骤代表下述的底物到产物的转化。

下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”(对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则))，并且符合WorldIntellectual Property Organization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列清单要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及Administrative Instructions(行政指令)的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的规则。

表1

优选的异丁醇途径的基因和蛋白质SEQ ID NO：的总结

描述	SEQ ID NO：核酸	SEQ IDNO：肽
描述	SEQ ID NO：核酸	SEQ IDNO：肽	肺炎克雷伯氏菌budB(乙酰乳酸合酶)	1	2
大肠杆菌ilvC(乙酰羟酸还原异构酶)	3	4	肺炎克雷伯氏菌budB(乙酰乳酸合酶)	1	2
大肠杆菌ilvC(乙酰羟酸还原异构酶)	3	4	大肠杆菌ilvD(乙酰羟酸脱水酶)	5	6
乳酸乳球菌kivD(支链α-酮酸脱羧酶)，经密码子最优化的	7	8	大肠杆菌ilvD(乙酰羟酸脱水酶)	5	6
乳酸乳球菌kivD(支链α-酮酸脱羧酶)，经密码子最优化的	7	8	大肠杆菌yqhD(支链醇脱氢酶)	9	10

SEQ ID NO：11-22是用于生成实施例1中构建体的寡核苷酸引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23-30是用于生成实施例2中构建体的寡核苷酸引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11和12是实施例1中用于ilvC基因的PCR扩增的引物的DNA序列

SEQ ID NO：13是用于克隆大肠杆菌pBAD载体中的KARI基因的正向引物DNA序列

SEQ ID NO：14是用于克隆大肠杆菌pBAD载体中的KARI基因的反向引物DNA序列

SEQ ID NO：15是用于扩增KARI基因的ilvC-trc-SacI-F的正向DNA序列

SEQ ID NO：16是用于扩增KARI基因的ilvC-trc-HindIII-R的反向DNA序列

SEQ ID NO：17至22是用于通过SacI消化和DNA测序确认大肠杆菌ilvC插入序列存在的寡核苷酸引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17-ilvC-trc-F3

SEQ ID NO：18-ilvC-trc-F5

SEQ ID NO：19-ilvC-trc-R2

SEQ ID NO：20-ilvC-trc-R4

SEQ ID NO：21-pBAD-eF1

SEQ ID NO：22-PALPK-R1

SEQ ID NO：23至26是用于通过PCR从铜绿假单胞菌(PAO1)和荧光假单胞菌(PF5)的基因组DNA中正向和反向扩增ilvC基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。

SEQ ID #23-PAO1-C-F1

SEQ ID NO：24-PAO1-C-R1

SEQ ID NO：25-PF5-C-F1

SEQ ID NO：26-PF5-C-R1

SEQ ID NO：21、22、27和28是用于验证包含假单胞菌属ilvC基因的阳性克隆DNA序列的寡核苷酸引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27-PF5-S-F2

SEQ ID NO：28-PF5-S-R2

以下SEQ ID NO对应于本发明中使用的KARI基因的DNA序列：

SEQ ID NO：29-大肠杆菌K12-ilvC

SEQ ID NO：30-经密码子最优化的KARI，来自弧菌，用于大肠杆菌表达

SEQ ID NO：31-铜绿假单胞菌-PAO1-ilvC

SEQ ID NO：32-荧光假单胞菌-PF5-ilvC

以下SEQ ID NO是分别对应于SEQ ID NO29-32的氨基酸序列：

SEQ ID NO：33-大肠杆菌K12-ilvC-[KARI来自大肠杆菌K12]

SEQ ID NO：34-KARI，来自霍乱弧菌

SEQ ID NO：35-PAO1-ilvC(1aa-338aa)

SEQ ID NO：36-PF5-ilvC(1aa-338aa)

SEQ ID NO：37是正向引物PAL-F1

SEQ ID NO：38是反向引物(PAL-R1)

SEQ ID NO：39是正向引物(PAL-EcoR1-F1)

SEQ ID NO：40是反向引物(PAL-EcoR1-R1)

发明详述

本发明涉及一种使用包含高活性KARI酶的微生物宿主细胞将乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸的方法。由此形成的2，3-二羟基异戊酸经由图1显示的步骤被进一步转化为异丁醇。本发明还公开了用于在它们的天然宿主微生物中寻找快速KARI酶的方法和可用于进一步改善它们的催化活性的此类酶的分子进化。

本发明满足多种商业需求和工业需求。丁醇是一种具有多种应用的重要工业日用化学品，其中其作为燃料或燃料添加剂的潜力尤为重要。尽管丁醇仅仅是一种四碳醇，但是其具有与汽油相似的能含量，并且可以与任何化石燃料共混。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成CO₂并且几乎不产生或根本不产生SO_X或NO_X。另外，丁醇的腐蚀性不及乙醇，是目前为止最优选的燃料添加剂。

丁醇除了可用作生物燃料或燃料添加剂之外，在新兴的燃料电池工业中还具有影响氢分配问题的潜力。如今，由于氢的运输和分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。

以下定义和缩写用于权利要求和说明书的判读。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”一般应用于如权利要求中所述的本发明所有实施方案，或如说明书中提供的或后经修正或补充的所有实施方案。

术语“异丁醇生物合成途径”是指用以生产异丁醇的酶途径。优选的异丁醇生物合成途径在图1中示出并如本文所述。

术语“NADPH消耗测定法”是指用于确定KARI酶比活的酶测定法，涉及测量酶反应中KARI辅因子NADPH的消耗，如下文所述(Aulabaugh等人；Biochemistry，29，2824-2830，1990)。

“KARI”是酮醇酸还原异构酶的缩写。

术语“乙酰羟酸还原异构酶”和“酮醇酸还原异构酶”可互换使用，是指EC编号为EC1.1.1.86(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)的酶。酮醇酸还原异构酶催化(S)-乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸的反应，这将在下文中详述。这些酶可得自多个来源，包括但不限于：大肠杆菌基因库保藏编号(GenBank Accession Number)NC_000913区域：3955993..3957468、霍乱弧菌基因库保藏编号NC_002505区域：157441..158925、铜绿假单胞菌基因库保藏编号NC-002516区域：5272455..5273471和荧光假单胞菌基因库保藏编号NC_004129区域：6017379..6018395。

术语“乙酰乳酸合酶”是指催化丙酮酸转化为乙酰乳酸和CO₂的酶。乙酰乳酸具有(R)-和(S)-两种立体异构体，所述酶优选通过生物体系制备的(S)-异构体。优选的乙酰乳酸合酶已知其EC编号为EC2.2.1.6 9(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)。这些酶可得自多种来源，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(基因库编号(GenBank No)：CAB15618，Z99122，分别是NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列)、肺炎克雷伯氏菌(基因库编号：AAA25079(SEQ ID NO：2)、M73842(SEQ ID NO：1))和乳酸乳球菌(基因库编号：AAA25161，L16975)。

术语“乙酰羟酸脱水酶”是指催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的酶。优选的乙酰羟酸脱水酶已知其EC编号为EC4.2.1.9。这些酶可得自多种微生物，包括但不限于：大肠杆菌(基因库编号：YP_026248(SEQ ID NO：6)、NC_000913(SEQ ID NO：5))、啤酒糖酵母(基因库编号：NP_012550，NC_001142)、海沼甲烷球菌(基因库编号：CAF29874，BX957219)和菌株枯草芽孢杆菌(基因库编号：CAB14105，Z99115)。

术语“支链α-酮酸脱羧酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和CO₂的酶。优选的支链α-酮酸脱羧酶已知其EC编号为EC4.1.1.72，并可得自多种来源，包括但不限于：乳酸乳球菌(基因库编号：AAS49166，AY548760；CAG34226(SEQ ID NO：8)，AJ746364、鼠伤寒沙门氏菌(基因库编号：NP_461346，NC_003197)和丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_149189，NC_001988)。

术语“支链醇脱氢酶”是指催化异丁醛转化为异丁醇的酶。优选的支链醇脱氢酶已知其EC编号为EC1.1.1.265，但也可以将其归类为其他醇脱氢酶(具体地讲，EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体并可得自多种来源，包括但不限于：啤酒糖酵母(基因库编号：NP_010656，NC_001136；NP_014051，NC_001145)、大肠杆菌(基因库编号：NP_417484(SEQ IDNO：10)，NC_000913(SEQ ID NO：9))和丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_349892，NC_003030)。

术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶，使用NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。优选的支链酮酸脱氢酶已知其EC编号为EC1.2.4.4。这些支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于：菌株枯草芽孢杆菌(基因库编号：CAB14336，Z99116；CAB14335，Z99116；CAB14334，Z99116；和CAB14337，Z99116)和恶臭假单胞菌(基因库编号：AAA65614，M57613；AAA65615，M57613；AAA65617，M57613；和AAA65618，M57613)。

术语“碳底物”或“可发酵碳底物”指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源，并且特别是选自由下列的碳源：单糖、低聚糖、多糖和一碳底物或它们的混合物。

术语“k_cat”和“K_m”是本领域的技术人员已知的，并被描述于EnzymeStructure and Mechanism，第2版(Ferst；W.H.Freeman：NY，1985；pp98-120)。术语“k_cat”，也常称之为“转换数”，定义为每个活性位点每单位时间内将底物分子转化为产物的最大数目，或每单位时间内的酶转换次数。k_cat＝V_max/[E]，其中[E]是酶浓度(Ferst，同上)。术语“总转换”和“总转换数”本文用于指KARI酶与底物反应形成的产物的量。

术语“催化效率”定义为酶的k_cat/K_M。“催化效率”用于测定酶对底物的特异性。

术语“比活”是指酶单位/mg蛋白，其中酶单位定义为在特定温度、pH、[S]等条件下的形成的产物的摩尔数/分钟。

术语“慢速”或“快速”当用于指酶活性时涉及与标准品比较的酶转换数。

术语“分离的核酸分子”、“分离的核酸片段”和“基因构建体”可以互换使用，并将指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或者翻译。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“转化盒”指包含外来基因并且除该外来基因外还具有有利于特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时特定宿主细胞显示出的“密码子偏倚性”。因此，在合成基因以改善其在宿主细胞中的表达时，希望设计基因以使得其密码子使用频率接近宿主细胞中优选的密码子使用频率。

术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。

本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于以下文献中：Sambrook等人(Sambrook、Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)(在下文中“Maniatis”)；和Silhavy等人(Silhavy等人，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor，NY，1984)；以及Ausubel，F.M.等人，(Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，1987)。

本发明从源自植物的碳源来生产异丁醇，避免了与丁醇生产的标准石油化学工艺相关的负面的环境影响。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定具有高催化效率的KARI酶的方法，所述酶的高效率将使其不再是碳水化合物至异丁醇的转化过程中的限速步骤。该方法包括鉴定合适的KARI酶以及使用本领域熟知的方法对它们进行诱变以提高酶的比活，这些过程将在下文中详述。

酮酸还原异构酶(KARI)

乙酰羟酸还原异构酶或酮醇酸还原异构酶(KARI；EC 1.1.1.86)催化支链氨基酸生物合成的2个步骤，是它们的生物合成中的关键酶。KARI存在于多种生物体中，跨物种的氨基酸序列比较已经揭示所述酶具有两种类型：短型(I类)存在于真菌和大多数细菌中，长型(II类)一般存在于植物中。

短型KARI通常具有330-340个氨基酸残基。长型KARI具有约490个氨基酸残基。然而，一些细菌如大肠杆菌具有长型酶，其中的氨基酸序列略微不同于存在于植物中的氨基酸序列。KARI由ilvC基因编码，是基本培养基中大肠杆菌和其他细菌生长的必需酶。KARI使用NADPH作为辅因子并且其活性需要二价阳离子如Mg++。除了在缬氨酸途径中利用乙酰乳酸之外，KARI还在异亮氨酸生产途径中将乙酰羟基丁酸转化为二羟基甲基戊酸。

大肠杆菌KARI酶在

分辨率下的晶体结构已经被解决(Tyagi等人，Protein Science，14，3089-3100，2005)。所述酶由2个结构域组成，一个结构域具有混合α/β结构，它类似于存在于其他吡啶核苷酸依赖型脱氢酶中的结构域。第2个结构域主要是α-螺旋状结构，并且有有力证据显示其具有内部重复。比较大肠杆菌、铜绿假单胞菌和菠菜的KARI活性位点显示酶活性位点的大多数残基占据保守位点。当把大肠杆菌KARI晶体化成四聚体时，该四聚体可能是合适的生物活性单位，铜绿假单胞菌KARI(Ahn等人，J.Mol.Biol.，328，505-515，2003)形成十二聚体，而来自菠菜的KARI酶形成二聚体。已知的KARI是慢速酶，报道的转换数为(k_cat)2s^-1(Aulabaugh等人；Biochemistry，29，2824-2830，1990)或0.12s^-1(Rane等人，Arch.Biochem.Biophys.338，83-89，1997)乙酰乳酸。已有研究证明大肠杆菌中的异亮氨酸-缬氨酸生物合成的基因操纵不同于铜绿假单胞菌的基因操纵(Marinus等人，Genetics，63，547-56，1969)。

高活性KARI酶的鉴定和分离。

回顾了具有比大肠杆菌更高的倍增速率的生物。鉴定了当在M9基本培养基中生长时倍增时间比大肠杆菌更快的三种微生物，它们是铜绿假单胞菌(PAO1)、荧光假单胞菌(PF5)和霍乱弧菌(N16961)。从这些微生物的每个中分离编码KARI酶的基因并且表达和部分纯化所编码的蛋白。将从高倍增速率生物中分离的酶的比活与大肠杆菌的酶比活进行了比较。KARI使用NADPH消耗测定法进行检测，该方法在340nm处测量辅因子NADPH在酶将乙酰乳酸转化为α，β-二羟基异戊酸过程中的消耗。使用NADPH的6220M^-1cm^-1摩尔消光系数来计算活性并报告为细胞提取物中每mg总蛋白每分钟消耗的NADPH的μmole数(参见Aulabaugh和Schloss，Biochemistry，29，2824-2830，1990)。

本发明的一个目标是提供具有比活大于1.1μmol/min/mg KARI的KARI酶，该比活根据本文所述的NADPH消耗测定法使用纯化蛋白来测量。大肠杆菌KARI是一种慢速酶，它在支链氨基酸合成途径中是必需的。编码KARI(ilvC)的基因当细胞在丰富培养基中生长时不表达，但当在基本培养基中生长时以高水平(约10％的可溶性蛋白)表达(S.Epelbaum等人，同上)。

选择合适KARI酶的方法涉及两个步骤。第一步是搜索在自然界中的新KARI。此类搜索涉及使用本领域熟知的技术广泛地从其他生物中分离可用的酶的同源物。基于生物的倍增时间，通过假定某种生物最可能具有合适的KARI进行该搜索。第二步涉及通过构建强表达载体、诱变并进化KARI编码序列、并且最后选择具有改善KARI活性的变异体来制造并搜索人造差异酶。

使用上述方法从荧光假单胞菌属(SEQ ID NO：35[PAO1-ilvC]SEQID NO：36[PF5-ilvC])和霍乱弧菌(SEQ ID NO：34)中分离KARI酶，所述酶具有比分离自大肠杆菌(SEQ ID NO：33[大肠杆菌K12-ilvC]的KARI酶更高的比活。本发明中优选的是比活大于约1.1μmol/min/mg的KARI酶。其中约5-40μmol/min/mg的比活是尤其合适的。优选使用纯化蛋白结合NADPH消耗测定法(Aulabaugh，同上)来测量KARI的比活，测量温度在20℃和25℃之间，其中优选约22.5℃，测量在pH值介于7.0和8.0之间，其中优选约7.5的pH值，并且在具有约10mM钾的缓冲液中进行，其中至少约10mM至约50mM的钾是合适的。本发明中使用的一些具体酶在下表2中列出。

表2

本发明的KARI酶

基因	基因库引用
基因	基因库引用	大肠杆菌K12ilvC	基因库保藏编号NC_000913区域：3955993..3957468
经密码子最优化的大肠杆菌表达来自霍乱弧菌的KARI	基因库保藏编号NC_002505区域：157441..158925	大肠杆菌K12ilvC	基因库保藏编号NC_000913区域：3955993..3957468
经密码子最优化的大肠杆菌表达来自霍乱弧菌的KARI	基因库保藏编号NC_002505区域：157441..158925	铜绿假单胞菌PAO1 ilvC	基因库保藏编号NC_002516区域：5272455..5273471
荧光假单胞菌PF5 ilvC	基因库保藏编号NC_004129区域：6017379..6018395	铜绿假单胞菌PAO1 ilvC	基因库保藏编号NC_002516区域：5272455..5273471

本发明不限于本文所述的特定假单胞菌和弧菌酶。例如，这些多肽可用作寻找具有相似活性的同源物的基础，或作为诱变和蛋白进化的模板。

KARI同源物分离

本发明的核酸片段可用于分离编码来自相同或其他微生物物种的同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程来分离同源KARI基因是本领域熟知的。序列依赖型规程的实例包括但不限于核酸杂交方法、DNA和RNA扩增方法例如核酸扩增技术的多种应用，例如聚合酶链反应(PCR)(Mullis等人，美国专利公开4,683,202)、连接酶链反应(LCR)、(Tabor等人，Proc.Acad.Sci.USA 82，1074，1985)或链置换扩增反应(SDA)(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，392，1992)。

例如，编码与本发明的那些蛋白或多肽相似的蛋白或多肽的基因可通过使用所有或部分本发明的核酸片段作为DNA杂交探针，使用本领域的技术人员熟知的方法来筛选来自任何所需细菌的文库而得以直接分离。基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分或全长的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应之后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。

通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以便提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的，例如Thein和Wallace等人，“The use of oligonucleotide as specifichybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，in HumanGenetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis编辑，1986，第33-50页，IRL Press，Herndon，Virginia)；和Rychlik(Rychlik，1993，In White，B.A.(编辑)，Methods in Molecular Biology，Vol.15，第31-39页，PCRProtocols：Current Methods and Applications.Humana Press，Inc.，Totowa，NJ)。

通常，可以将本发明序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。

作为另外一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998，1988)，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来生成cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE体系(LifeTechnologies，Rockville，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，5673，1989)；和(Loh等人，Science，243，217-2201989)。

作为另外一种选择，可使用本发明的序列作为杂交试剂用于鉴定同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。本发明的探针通常是与待检测的核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，这将取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的某些碱基没有与正确的互补碱基配对。

杂交方法是非常确实的。通常探针和样本必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样本接触。探针和样本核酸必须接触足够长的时间，使探针和样本核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或靶标的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，离液剂允许短寡核苷酸探针在室温下的敏感和严格杂交(Van Ness等人，Nucl.Acids Res.19，5143-5151，1991)。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。通常，离液剂的终浓度将为约3M。如果需要，人们可以加入甲酰胺至杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。

可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液使用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1.0M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM EDTA，FICOLL(Pharmacia Inc.)(约498-830zg(300-500千道尔顿))、聚乙烯吡咯烷酮(约415-830zg(250-500千道尔顿))和血清白蛋白。典型的杂交溶液中还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核DNA例如小牛胸腺或鲑精DNA、或酵母RNA、以及任选地约0.5至2％w/v甘氨酸。还可以包含其他添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂如聚乙二醇、阴离子聚合物如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯和阴离子糖类聚合物如硫酸葡聚糖在内的体积排阻剂。

核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的方法形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。

异丁醇生物合成途径

本发明的高活性KARI酶的其中一个主要用途将是作为用于生成异丁醇的代谢途径中的元件。已经阐明并描述了多个这些途径。

利用碳水化合物的微生物将糖酵解(EMP)途径、恩-杜二氏糖解途径和戊糖磷酸循环用作中心代谢途径以便为生长和维持提供能量和细胞前体。这些途径均有中间体3-磷酸甘油醛，而且最终会直接形成丙酮酸或与EMP途径结合形成丙酮酸。随后，经由多种方法将丙酮酸转化为乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)。乙酰-CoA是关键中间体，例如在生成脂肪酸、氨基酸和次级代谢物的途径中它是关键中间产物。糖转化为丙酮酸的组合反应产生能量(如5’-三磷酸腺苷，ATP)和还原型等价物(如，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐NADPH)。NADH和NADPH必须被循环以形成其氧化形式(分别为NAD⁺和NADP⁺)。在存在无机电子受体(如，O₂、NO₃ ^-和SO₄ ^2-)的情况下，所述还原型等价物可以用于增加能量池；作为另外一种选择，可能形成还原型碳副产物。

如图1所示，用重组微生物有四种潜在的途径从碳水化合物生成异丁醇。在共有的美国专利申请11/586315中已经描述了从碳水化合物转化为异丁醇的所有潜在途径，该专利申请以引用方式并入本文。

将丙酮酸转化为异丁醇的优选途径由酶催化步骤“a”、“b”、“c”、“d”和“e”(图1)组成，并且包括以下底物到产物的转化：

a)丙酮酸到乙酰乳酸，由例如乙酰乳酸合酶催化，

b)(S)-乙酰乳酸到2，3-二羟基异戊酸，由例如乙酰羟酸还原异构酶催化，

c)2，3-二羟基异戊酸到α-酮异戊酸，由例如乙酰羟酸脱水酶催化，

d)α-酮异戊酸到异丁醛，由例如支链酮酸脱羧酶催化，以及

e)异丁醛到异丁醇，由例如支链醇脱氢酶催化。

该途径结合了在详述的缬氨酸生物合成(丙酮酸到α-酮异戊酸)和缬氨酸分解代谢(α-酮异戊酸到异丁醇)途径中涉及的酶。因为许多缬氨酸生物合成酶还催化异亮氨酸生物合成途径中的类似反应，所以底物特异性是选择基因来源时的主要考虑因素。因此，乙酰乳酸合酶受关注的主要基因是那些来自芽孢杆菌属(alsS)和克雷白氏杆菌属(budB)的基因。已知这些特定乙酰乳酸合酶参与这些生物中的丁二醇发酵并显示出对比对酮丁酸更高的丙酮酸亲和力(Gollop等人，J.Bacterio1.172，3444-3449，1990)；和(Holtzclaw等人，J.Bacteriol.121，917-922，1975)。途径的第二个和第三个步骤分别由乙酰羟酸还原异构酶和脱水酶催化。已知这些酶有多个来源，例如大肠杆菌(Chunduru等人，Biochemistry 28，486-493，1989)；和(Flint等人，J.Biol.Chem.268，14732-14742，1993)。优选的异丁醇途径的最后两步已知发生在酵母中，酵母能利用缬氨酸作为氮源并在该过程中分泌异丁醇。α-酮异戊酸能被多个酮酸脱羧酶如丙酮酸脱羧酶转化为异丁醛。为了防止异丁醇生产中的丙酮酸错用，需要一种对丙酮酸亲和力较低的脱羧酶。迄今为止，本领域已知两种此类酶(Smit等人，Appl.Environ.Microbiol.71，303-311，2005)；和(de la Plaza等人，FEMS Microbiol.Lett.238，367-374，2004)。两种酶都来自乳酸乳球菌菌株并优选酮异戊酸，对酮异戊酸的亲和力高于丙酮酸50至200倍。最后，已经鉴定了酵母中的多个醛还原酶，许多醛还原酶具有重叠的底物特异性。那些已知的相比乙醛更优选支链底物的酶包括但不限于醇脱氢酶VI(ADH6)和Ypr1p(Larroy等人，Biochem.J.361，163-172，2002)；和(Ford等人，Yeast 19，1087-1096，2002)，二者都使用NADPH作为电子供体。NADPH依赖型还原酶YqhD对支链底物有活性，它最近也在大肠杆菌中被鉴定(Sulzenbacher等人，J.Mol.Biol.342，489-502，2004)。

其他两种潜在的异丁醇生产途径还包含最初的三步“a”、“b”和“c”。一种途径由酶催化步骤“a”、“b”、“c”、“f”、“g”、“e”组成。步骤“f”包含“支链酮酸脱氢酶”，所述酶EC编号为EC1.2.4.4。步骤“g”包含“酰化醛脱氢酶”，所述酶EC编号为EC1.2.1.10和1.2.1.57，此外步骤“e”包含“支链醇脱氢酶”。另一种潜在途径由步骤“a”、“b”、“c”、“h”、“I”、“j”、“e”组成。术语“转氨酶”(步骤“h”)EC编号为EC2.6.1.42和2.6.1.66。步骤“h”或由“缬氨酸脱氢酶”组成，EC编号为EC1.4.1.8和1.4.1.9，或由步骤“i”“缬氨酸脱羧酶”组成，EC编号为EC4.1.1.14。最终步骤“j”将利用EC编号为EC2.6.1.18的“Ω转氨酶”生成异丁醛，步骤“e”将其还原生成异丁醇。所有将丙酮酸转化为异丁醇的潜在途径均在图1中进行了描述。

此外，已知多个生物体经由丁酰-CoA中间体产生丁酸盐和/或丁醇(Dürre等人，FEMS Microbiol.Rev.17，251-262，1995)；和(Abbad-Andaloussi等人，Microbiology 142，1149-1158，1996)。因此在这些生物体中利用图1所示的步骤“k”、“g”和“e”将生成异丁醇。步骤“k”将使用EC编号为EC5.4.99.13的“异丁酰-CoA变位酶”。嵌套步骤将涉及使用EC编号为EC1.2.1.10和1.2.1.57的“酰化醛脱氢酶”来制备异丁醛，随后由酶催化步骤“e”来制备异丁醇。在共有美国专利申请11/586315中详述了所有这些步骤，该专利申请全文以引用方式并入本文。

用于异丁醇生产的微生物宿主

用于生产异丁醇的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。用于生产异丁醇的微生物宿主将是异丁醇耐受性的，以便收率不受丁醇毒性的限制。在高滴度水平的异丁醇下代谢活跃的微生物是不为本领域所熟知的。尽管已从产溶剂梭菌(solventogenic Clostridia)中分离了丁醇耐受性突变体，但有关其他潜在可用的细菌菌株的丁醇耐受性方面的信息几乎没有。关于细菌中醇耐受性的比较的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(de Cavalho等人，Microsc.Res.Tech.64，215-22，2004)，并且(Kabelitz等人，FEMS Microbiol.Lett.220，223-227，2003，Tomas等人J.Bacteriol.186，2006-2018，2004)报道了在丙酮丁醇梭菌发酵期间1-丁醇的收率可能受1-丁醇毒性的限制。1-丁醇对丙酮丁醇梭菌的主要影响是破坏膜功能(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.50，1238-1243，1985)。

选择用于生产异丁醇的微生物宿主应该是异丁醇耐受性的，并应能将碳水化合物转化为异丁醇。选择合适微生物宿主的标准包括如下：对异丁醇的固有耐受性、对葡萄糖的高利用率、用于基因操纵的遗传工具的可用性、以及产生稳定的染色体变异的能力。

具有异丁醇耐受性的合适宿主菌株可以通过基于菌株的固有耐受性进行筛选而鉴定。微生物对异丁醇的固有耐受性可以通过测定在基本培养基中培养时造成生长率50％抑制的异丁醇浓度(IC₅₀)来测量。IC₅₀值可以利用本领域已知的方法来确定。例如，可让所关注的微生物在含有多种量的异丁醇的情况下生长，通过测量600纳米(OD₆₀₀)下的光密度来监测生长率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生长率的量度。产生50％生长抑制的异丁醇的浓度可以从生长抑制百分比对异丁醇浓度的曲线图来测定。优选地，宿主菌株将具有大于约0.5％的异丁醇IC₅₀。

用于生产异丁醇的微生物宿主还应以高速率利用葡萄糖。大多数微生物都能够利用碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效利用碳水化合物，因此它们将不是合适的宿主。

在遗传上修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标记。基于可在宿主中产生作用的抗生素抗性标记的性质，针对该宿主生物体来定制克隆载体。

还必须操纵微生物宿主以便通过删除多种基因而使竞争碳流的途径失活。这就需要存在转座子或染色体整合载体用以引导失活。此外，生产宿主应能受到化学诱变以便得到改善的异丁醇固有耐受性的突变体。

基于上述标准，用于生产异丁醇的合适微生物宿主包括但不限于：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弧菌属(Vibrio)、乳酸菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)。优选的宿主包括：大肠杆菌、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。

生产宿主的构建

可以采用本领域已知的技术来构建含有必需基因的重组生物体，所述必需基因将编码用于将可发酵碳底物转化为异丁醇的酶途径。如上所述，在本发明中，编码本发明其中一种异丁醇生物合成途径的酶的基因可从多个来源分离获得，所述酶例如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、乙酰羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶和支链的醇脱氢酶。

从细菌基因组中获得所需基因的方法是分子生物学领域中常用并且为人所熟知的。例如，如果基因的序列已知，则可以通过限制性内切酶消化来产生合适的基因组文库并且可以用与所需基因序列互补的探针来筛选。分离了序列之后，即可以用标准的引物引导的扩增方法如聚合酶链反应(美国专利4,683,202)来扩增DNA，以获得适于使用合适载体转化的量的DNA。用于优化密码子以在异源宿主细胞内表达的工具很容易得到。一些密码子优化工具可基于宿主生物体的GC含量获得。

鉴定并分离了相关途径的基因之后，即可将它们通过本领域中已知的方法转化到合适的表达宿主内。可用于转化多种宿主细胞的载体或试剂盒是常见的并且可以从一些公司商购获得，例如(Madison，WI)、Invitrogen Ltd.(Carlsbad，CA)、Stratagene(LaJolla，CA)和New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。这两种控制区均可来源于与转化的宿主细胞同源的基因，但是应当理解，这种控制区也可能来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。

可用于驱动相关途径编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上，任何能够驱动这些遗传元件的启动子均适用于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、ara、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac、以及trc(用于在大肠杆菌属、产碱杆菌属和假单胞菌属中表达)以及amy、apr、npr启动子和多个噬菌体启动子，用于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌中表达。

终止控制区也可以源于对优选宿主天然的多种基因。任选地，终止位点可能是不必要的，然而，如果含有终止位点则是最优选的。

某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。可利用完全并注解的序列pRK404和三个相关载体-pRK437、pRK442和pRK442(H)。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid50(1)：74-79(2003)。广宿主范围的IncP4质粒RSF 1010的几种衍生质粒也可获得，其具有在一系列革兰氏阴性菌中发挥功能的启动子。质粒pAYC36和pAYC37具有连同多个克隆位点一起的活性启动子，使得在革兰氏阴性菌中的异源基因能够表达。

染色体基因置换工具也可广泛获得。例如，将广宿主范围的复制子pWV101的热敏性变体进行改良以构建可用于在一系列革兰氏阳性菌内实现基因置换的质粒pVE6002(Maguin等人，J.Bacteriol.174，5633-5638，1992)。此外，体外转座体可得自商业来源(例如

)，用以在各种基因组中产生随机突变。

异丁醇生物合成途径在多种优选的微生物宿主中的表达在下面进行了更详细的描述。

异丁醇生物合成途径在大肠杆菌中的表达

可用于转化大肠杆菌的载体或试剂盒是很普遍的并且可以从上述公司中商购获得。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多个来源分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进大肠杆菌NM522中。

异丁醇生物合成途径在红串红球菌中的表达

一系列大肠杆菌-红球菌穿梭载体可用于在红串红球菌中表达，所述穿梭载体包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.62，61-68，2003)。此外，一系列启动子可用于异源基因在红串红球菌中表达(Nakashima等人，Appl.Environ.Microbiol.70，5557-5568，2004和Tao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.68，346-354，2005)。红平红球菌染色体基因中的靶向基因中断可以利用Tao等人(同上)和Brans等人(Appl.Environ.Microbiol.66，2029-2036，2000)描述的方法予以生成。

最初可以将如上所述的产生异丁醇所需的异源基因克隆至pDA71或pRhBR71内，并转化进大肠杆菌中。然后，可以通过电穿孔将载体转化进红串红球菌中，如Kostichka等人(同上)所述。重组体可在含有葡萄糖的合成培养基中生长，并随后可利用本领域已知的方法来产生异丁醇。

异丁醇生物合成途径在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌中基因表达及突变产生的方法也是本领域所熟知的。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多个来源分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进枯草芽孢杆菌BE1010中。此外，可将异丁醇生物合成途径的五个基因分裂成两个操纵子用于表达。可将该途径的三个基因(bubB、ilvD和kivD)整合进枯草芽孢杆菌BE1010的染色体中(Payne等人，J.Bacteriol.173，2278-2282，1991)。可将剩余的两个基因(ilvC和bdhB)克隆到表达载体中并转化进携带整合的异丁醇基因的芽孢杆菌菌株中。

异丁醇生物合成途径在地衣芽孢杆菌中的表达

在枯草芽孢杆菌中复制的大多数质粒和穿梭载体可用于通过原生质体转化或电穿孔来转化地衣芽孢杆菌。可将异丁醇生产所需的基因克隆在质粒pBE20或pBE60衍生物中(Nagarajan等人，Gene 114，121-126，1992)。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(Fleming等人，Appl.Environ.Microbiol.，61，3775-3780，1995)。所构建的用于在枯草芽孢杆菌中表达的质粒可以被转化进地衣芽孢杆菌内以产生可生产异丁醇的重组微生物宿主。

异丁醇生物合成途径在浸麻类芽孢杆菌中的表达

可按照上面关于在枯草芽孢杆菌中表达的描述来构建质粒，并通过原生质体转化法将该质粒用于转化浸麻类芽孢杆菌，以产生可生产异丁醇的重组微生物宿主。

异丁醇生物合成途径在真养产碱杆菌中的表达

用于在真养产碱杆菌中进行基因表达和产生突变的方法是本领域内已知的(Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.，60，3585-3591，1994)。可以将异丁醇生物合成途径的基因克隆进上述任何广宿主范围的载体中，并通过电穿孔以形成生产异丁醇的重组体。产碱杆菌属中的聚羟基丁酸酯途径已经有详细描述，多种改良真养产碱杆菌基因组的遗传技术是已知的，并且这些工具可以应用于工程化异丁醇生物合成途径。

异丁醇生物合成途径在恶臭假单胞菌中的表达

在恶臭假单胞菌中表达基因的方法是本领域内已知的(参见例如Ben-Bassat等人，美国专利6,586,229，该文献以引用方式并入本文)。可将丁醇途径基因插入pPCU18中，并且该连接DNA可通过电穿孔进入电穿孔感受态恶臭假单胞菌DOT-T1 C5aAR1细胞中以形成能生产异丁醇的重组体。

异丁醇生物合成途径在啤酒糖酵母中的表达

用于啤酒糖酵母中基因表达的方法是本领域已知的(例如，Enzymology，Volume 194，Guide to Yeast Genetics and Molecular and CellBiology，Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink，编辑，ElsevierAcademic Press，San Diego，CA中的方法)。酵母中的基因表达通常需要在受关注的基因前的启动子和转录终止子。可使用多个酵母启动子来构建编码异丁醇生物合成途径的基因的表达盒，包括但不限于组成型启动子FBA、GPD、ADH1和GPM，和诱导型启动子GAL1、GAL10和CUP1。合适的转录终止子包括但不限于：FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1和ADH1。例如，可将合适的启动子、转录终止子和异丁醇生物合成途径基因克隆到大肠杆菌-酵母穿梭载体中。

异丁醇生物合成途径在植物乳杆菌中的表达

乳杆菌属属于乳杆菌科(Lactobacillales)，并且用于转化枯草芽孢杆菌和链球菌的许多质粒及载体可用于转化乳杆菌属。合适载体的非限制性实例包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183，175-182，1996)；和(O’Sullivan等人，Gene 137，227-231，1993)；pMBB1和pHW800，pMBB1的衍生物(Wyckoff等人App1.Environ.Microbiol.62，1481-1486，1996)；pMG1，接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184，5800-5804，2002)；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63，4581-4584，1997)；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67，1262-1267，2001)；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38，1899-1903，1994)。也已经报道了几种来源于植物乳杆菌的质粒(vanKranenburg等人，Appl.Environ.Microbiol.71，1223-1230，2005)。

异丁醇生物合成途径在多个肠球菌菌种中的表达(屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和粪肠球菌)

肠球菌属属于乳杆菌科，上述用于转化乳酸杆菌、杆菌和链球菌种的多种质粒和载体也可用于肠球菌种。合适载体的非限制性实例包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183，175-182，1996)；和(O’Sullivan等人，Gene 137，227-231，1993)；pMBB1和pHW800，pMBB1的衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62，1481-1486，1996)；pMG1，接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184，5800-5804，2002)；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63，4581-4584，1997)；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67，1262-1267，2001)；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38，1899-1903，1994)。还可使用采用来自乳球菌属(Lactococcus)的nisA基因的用于粪肠球菌的表达载体(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.64，2763-2769，1998)。另外，可使用用于在屎肠球菌染色体中进行基因置换的载体(Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72，334-345，2006))。

发酵培养基

本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于：单糖，例如葡萄糖和果糖；低聚糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽。另外，碳底物也可以为已证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的诸如二氧化碳之类的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32.(eds)：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153，485-489，1990)。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。

尽管预期所有上述碳底物及它们的混合物均适用于本发明，但优选的碳底物为葡萄糖、果糖和蔗糖。

除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域技术人员已知的适于培养物生长并促进生产异丁醇所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其他组分。

培养条件

通常，使细胞在约25℃至约40℃的温度范围下在合适的培养基中生长。本发明中合适的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)肉汤、Sabouraud Dextrose(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其他确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷酸2′，3′-单磷酸(cAMP)，也可以掺入发酵培养基中。

适于发酵的pH范围在pH5.0到pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0优选作为起始条件。

发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，厌氧或微氧条件是优选的。

工业分批发酵和连续发酵

本发明的工艺采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。

标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素(例如pH、溶解的氧以及废气例如CO₂的分压)进行评估。分批发酵和补料分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：ThomasD.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.或Deshpande，Mukund(Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，1992)，该文献以引用方式并入本文。

尽管本发明是以分批模式进行，但预期该方法将可适用于连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。

连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的，并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。

预期可以或者采用分批发酵、补料分批发酵或者采用连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产异丁醇。

用于从发酵培养基中分离异丁醇的方法

可使用丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵领域已知的方法从发酵培养基中分离生物生产的异丁醇(参见例如Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49，639-648，1998)，和(Groot等人，Process.Biochem.27，61-75，1992以及本文参考)。例如，可通过离心、过滤、滗析从发酵培养基中移除固体，可使用蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发方法从发酵培养基中分离异丁醇。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。

一般方法

实施例中所用的标准重组DNA技术和分子克隆技术在领域内是众所周知的，并且在下列文献中有所描述：Sambrook等人(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989，本文称为Maniatis)和Maniatis(同上)以及Silhavy等人，(Silhavy等人，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.1984)和Ausubel等人，(Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，pub.Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience，1987)。

适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内是众所周知的。以下实施例中适用的技术描述可在下列文献中查到：Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp etal，eds.，American Society forMicrobiology，Washington，DC.，1994)或Thomas D.Brock in(Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、LifeTechnologies(Rockville，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另外指明。

表3给出了以下实施例中使用的寡核苷酸引物。

表3

本发明中使用的寡核苷酸引物

SEQUENCEID NO：	序列	描述
SEQUENCEID NO：	序列	描述	11	GAGCTCCTTAAGAAGGAGGTAATCACCATGGCTAACTACTTCAA	ilvC扩增引物
12	GGATCCGATCGAGCTAGCGCGGCCGCTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTC	ilvC扩增引物	11	GAGCTCCTTAAGAAGGAGGTAATCACCATGGCTAACTACTTCAA	ilvC扩增引物
12	GGATCCGATCGAGCTAGCGCGGCCGCTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTC	ilvC扩增引物	13	GCTAACAGGAGGAAGAGCTCATGGCACCCTCGCTC	正向pBAD-SAC1-F
14	GAGCGAGGGTGCCATGAGCTCTTCCTCCTGTTAGC	反向pBAD-SAC1-R	13	GCTAACAGGAGGAAGAGCTCATGGCACCCTCGCTC	正向pBAD-SAC1-F
14	GAGCGAGGGTGCCATGAGCTCTTCCTCCTGTTAGC	反向pBAD-SAC1-R	15	ATCACCGAGCTCATGGCTAACTACTTCAATACACTGAATCTGCG	正向ilvC-trc-Sac1-F
16	GGCCGCAAGCTTTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTCATATCTGTC	反向ilvC-trc-HindIII-R	15	ATCACCGAGCTCATGGCTAACTACTTCAATACACTGAATCTGCG	正向ilvC-trc-Sac1-F
16	GGCCGCAAGCTTTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTCATATCTGTC	反向ilvC-trc-HindIII-R	17	CCGTAAAGATATCACCGTAG	ilvC-trc-F3
18	CAGTATGAAGGCAAAATCGG	ilvC-trc-F5	17	CCGTAAAGATATCACCGTAG	ilvC-trc-F3
18	CAGTATGAAGGCAAAATCGG	ilvC-trc-F5	19	CGTACTCAGCGGTATCAGAG	ilvC-trc-R2
20	CAGATTTCACTTCCGCAACG	ilvC-trc-R4	19	CGTACTCAGCGGTATCAGAG	ilvC-trc-R2
20	CAGATTTCACTTCCGCAACG	ilvC-trc-R4	21	CGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG	pBAD-e-F1

22	ACCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATC	PALPK-R1
22	ACCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATC	PALPK-R1	23	CAAAACAGCCAAGCTTTTAGTTCTTGCTCTTGTCGACGATCTTG	PAO1-C-F1
24	CAGGAGGAAGAGCTCATGCGCGTTTTCTACGATAAAGACTGTG	PAO1-C-R1	23	CAAAACAGCCAAGCTTTTAGTTCTTGCTCTTGTCGACGATCTTG	PAO1-C-F1
24	CAGGAGGAAGAGCTCATGCGCGTTTTCTACGATAAAGACTGTG	PAO1-C-R1	25	CAAAACAGCCAAGCTTTTAGTTCTTGGCTTTGTCGACGATTTTG	PF5-C-F1
26	CAGGAGGAAGAGCTCATGAAAGTTTTCTACGATAAAGACTGCGAC	PF5-C-R1	25	CAAAACAGCCAAGCTTTTAGTTCTTGGCTTTGTCGACGATTTTG	PF5-C-F1
26	CAGGAGGAAGAGCTCATGAAAGTTTTCTACGATAAAGACTGCGAC	PF5-C-R1	27	GATCATGATCGCGCCGAAGG	PF5-S-F2
28	CTGCTCACCGAACAGGTCGG	PF5-S-R2	27	GATCATGATCGCGCCGAAGG	PF5-S-F2
28	CTGCTCACCGAACAGGTCGG	PF5-S-R2	37	CTGCAGCACATGAAGACTCCATGGCACCCTCGCTCGACTCGATCTCGCACTCGTTCGCAAACG	正向PAL-F1
38	TCTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTTCTAAGCGAGCATCT	反向PAL-R1	37		正向PAL-F1
38	TCTCTCATCCGCCAAAACAGAAGCTTCTAAGCGAGCATCT	反向PAL-R1	39	GGGCTAACAGGAGGAAGAATTCATGGCACCCTCGCTCGACTCG	正向PAL-EcoR1-F1
40	CGAGTCGAGCGAGGGTGCCATGAATTCTTCCTCCTGTAGCCC	反向PAL-Eco-R1-R1	39	GGGCTAACAGGAGGAAGAATTCATGGCACCCTCGCTCGACTCG	正向PAL-EcoR1-F1

缩写的含义如下：“sec”是指秒，“min”是指分钟，“h”是指小时，“nm”是指纳米，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“mg/mL”是指毫克每毫升，“L”是指升，“nm”是指纳米，“mM”是指毫摩尔，“M”是指摩尔，“mmol”是指毫摩尔，“μmole”是指微摩尔，“kg”是指千克，“g”是指克，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“PCR”是指聚合酶链反应，“OD”是指光密度，“OD₆₀₀”是指在600nm波长下测量的光密度，“kDa”是指千道尔顿，“g”是指引力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基对，“kb”是指千碱基，“％”是指百分比，“％ w/v”是指重量/体积百分比，“％v/v”是指体积/体积百分比，“HPLC”是指高效液相色谱，“g/L”是指克每升，“μg/L”是指微克每升，“ng/μL”是指纳克每微升，“pmol/μL”是指皮摩尔每微升，“RPM”是指每分钟转数，“μmol/min/mg”是指微摩尔每分钟每毫克，“w/v”是指每单位体积重量，“v/v”是指每单位体积体积。

实施例1(比较)

KARI酶活性分析

该实施例描述制备ilvC基因过表达构建体以及使用乙酰乳酸依赖型KARI酶氧化NADPH来测量酶活性，KARI酶由大肠杆菌的ilvC基因编码。

构建pBAD-ilvC表达质粒--从大肠杆菌中分离ilvC基因

ilvC基因编码区使用RCR从大肠杆菌菌株FM5(ATCC 53911)基因组DNA扩增得到。细胞在包含4mL Luria Bertani(LB)培养基(Mediatech Inc.，Herndon，VA)的50mL培养管中生长过夜(37℃，300RPM振荡培养)。然后通过在1000xg下离心3分钟来收获细胞，并使用Gentra Puregene试剂盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；目录号D-5000A)，按照制造商说明书来制备所述细胞的基因组DNA。使用大肠杆菌DNA作为模板及引物SEQ ID NO：11和12，通过PCR来制备ilvC编码区DNA片段。

使用Finnzymes Phusion^TM High-Fidelity PCR Master Mix(NewEngland Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-531)，按照制造商规程进行PCR。扩增在DNA热循环仪GeneAmp 9700(PE Applied Biosystems，Foster city，CA)中进行。将未经进一步纯化的PCR产物(0.5μL)连接到pCR4Blunt TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录号#45-0031)中，并转化进入到化学法感受态TOP10细胞(Invitrogen 44-0301)中。将连接产物划线接种到包含加入100μg/mL氨苄青霉素(Teknova Inc，Hollister，CA，目录号#L1004)的LB培养基的平板上。通过SacI/BamHI限制消化来确认包含ilvC插入序列的克隆。消化后4个质粒中的三个应具有预料的1.5kbp条带。将所得的克隆命名为pCR4Blunt TOPO-ilvC。

通过SacI/BamHI消化释放出来自pCR4Blunt TOPO-ilvC克隆载体的ilvC片段，并使用T4DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)将其连接到经SacI/BamHI消化的pTrc99A(Amann，等人，Gene，69，301-315，1988)中。将该构建体通过电穿孔转入电穿孔感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen 44-0035)中，并划线接种到如上所述的LB/氨苄青霉素平板上。将包含1.5kb插入序列的载体命名为pTrc99A-ilvC。

制备pBAD载体用于克隆

使用SacI/HindIII限制位点，构建在基因5′末端包含SacI位点的pBAD.HisA(Invitrogen)载体的衍生物，以用于将ilvC基因克隆到pBAD中。制造该构建体需要三个步骤。第一步，将来自粘红酵母的苯基丙氨酸氨裂合酶(PAL；EC 4.3.1.5)编码区克隆到pBAD-HisA载体中以制备pBAD-PAL。第二步，将EcoRI位点添加到紧接着pBAD-PAL构建体的起始密码子之前的基因5′末端，以制备pBAD-PAL-EcoRI。第三步，用SacI位点置换EcoRI位点，并用SacI/HindIII消化所得的载体以制备用于ilvC基因克隆的pBAD-SacI载体。首先从pKK223-PAL载体中PCR扩增PAL基因(US Patent#6521748)，使用的是正向引物(PAL-F1)(SEQ ID NO：37)和反向引物(PAL-R1)(SEQ ID NO：38)。

在Perkin Elmer PCR9700热循环仪(PE Applied Biosystems，Fostercity，CA)中使用TakaRa Taq DNA聚合酶预混物(TAKARA Bio USA，Madison，WI，目录号#TAK_R004A)按照制造商规程进行PCR。使用QIAQuik PCR纯化试剂盒(Qiagen cat#28106)部分地纯化PCR产物，并用BbsI和HindIII消化产物。这生成了在5′末端包含NcoI突出的片段。然后将消化产物连接到pBAD.HisA(Invitrogen)载体中，该载体已经用NcoI/HindIII消化过。使用T4DNA连接酶(Promega)按照制造商提供的标准规程进行连接反应。按照制造商说明书利用Bio-RAD Gene PulserII(Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA)，使用两μL连接产物来转化TOP10电穿孔感受态细胞(Invitrogen)。将转化过的细胞划线接种在包含加入100μg/mL氨苄青霉素(Teknova Inc，Hollister，CA，目录号#L1004)的LB培养基的琼脂板上，在37℃下培养过夜。通过NcoI/HindIII限制消化来确认包含PAL插入序列的克隆。将此构建体命名为pBAD-PAL。然后使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla CA，Catalogue#200524)将EcoRI位点添加到上述构建体中的PAL基因5′末端上。设计正向引物(PAL-EcoRI-F1)(SEQ ID NO：39)和反向引物(PAL-EcoR1-R1)(SEQ ID NO：40)并按照制造商的说明书来制备反应混合物。上文制备的pBAD-PAL构建体在下文反应中用作模板。

50μL反应混合物包含1.0μL 50ng/μL的模板质粒、1.0μL 10pmol/μL的各种引物、5μL 10x反应缓冲液、1.0μL dNTP混合物和3μL Quik溶液，30μL水以及1.0μL pfu-ultra高保真DNA聚合酶，置于200μL薄壁管中。在上文的QuikChange II XL试剂盒中提供该反应中使用的所有试剂和聚合酶。反应在DNA Thermocycler GeneAmp 2400(PE Applied Biosystems，Foster city，CA)中进行，使用的是以下条件。起始温度为96℃ 2分钟，随后进行18个加热/冷却循环。每个循环由96℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 160秒组成。在温度循环完成后，将样本保持在72℃下600秒或更长，然后在4℃下复性。

反应完成后，加入1.0μL限制性酶DpnI(来自上述试剂盒)到反应中，然后在37℃下孵育3小时以消化反应中的模板质粒。

然后用Bio RAD Gene Pulser II(Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA)按照制造商说明书将2.0μL DpnI消化反应产物转化到50μL大肠杆菌TOP10电穿孔感受态细胞(Invitrogen)中。将不同体积的(2.0μL，5.0μL和20μL)转化细胞划线接种在包含LB培养基和100μg/mL氨苄青霉素的10cm琼脂平板上，并将平板在37℃下孵育过夜。从包含分离良好的菌落的平板上采集三个克隆。使用Qiaprep spin小量制备试剂盒(Qiagen，Valencia CA，目录号#27106)，按照制造商的说明书来纯化来自三个克隆的质粒。使用限制性酶EcoRI和Hind III(Promega，Madison，WI)通过限制性消化分析来鉴定阳性克隆，酶消化通过将1.0μL10x反应缓冲液(Promega缓冲液)，1.0μL纯化质粒和1.0μL各种限制性酶置于6.0μL去离子水中进行。将反应混合物在37℃下孵育60分钟。每个克隆的消化产物在0.8％琼脂糖E凝胶(Invitrogen，目录号#G5018-08)上分离。一个2.1kbp和一个4.0kbp的DNA片段在凝胶上被发现存在于样本中，该样本在构建体中存在EcoRI和HindIII限制性位点。然后使用质粒模板pBAD-PAL-EcoRI和引物SEQ ID NO：13按照上述相同规程用SacI位点来置换该构建体中的EcoRI位点。

使用限制性酶SacI和Hind III(Promega，Madison，WI)进行限制性消化分析以确认阳性克隆。一旦鉴定了阳性克隆，就建立更大规模(50μL)的上述限制性消化反应。使用1％琼脂糖凝胶和QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia CA，目录号#28704)，按照制造商规程从混合物中纯化包含消化载体凝胶的4kbp片段。将该构建体命名为pBAD-SacI。

用于过表达KARI的宿主菌株

使用宿主菌株大肠杆菌Bw25113(ΔilvC)即ilvC基因敲除菌株来制备过表达KARI酶的构建体。在该菌株中，大肠杆菌染色体中的完整ilvC基因被卡那霉素盒置换，该置换使用的是Lambda red同源重组技术(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad Sci.USA.97，6640-6645，2000)。所有使用该技术制备基因敲除菌株所需的菌株和载体均从Prof.BarryWanner(Purdue University，West Lafayette，IN)处获得。

制备用于克隆的ilvC编码区

用高保真pfu-ultra聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)来扩增ilvC编码区，将SacI位点添加到正向引物ATG之前的5’末端，将HindIII位点添加到反向引物终止密码子之后的5’末端。该反应使用具有SEQ IDNO：15(正向：ilvc-trc-SacI-F)的引物和具有SEQ ID NO：16(反向：ilvc-trc-HindIII-R)的引物。PCR反应中使用的模板是上述ptrc99A-ilvC构建体。

50μL反应混合物包含5.0μL 10x反应缓冲液、pfu-ultra聚合酶(Stratagene)、1.0μL 50ng/μL模板、1.0μL每个10pmol/μL的正向和反向引物、1.0μL 40mM dNTP混合物(Clonetech，Mountain View，CA)、1.0μL pfu-ultra DNA聚合酶(Stratagene)和39μL水。将该反应混合物置于薄壁200μL管中用于在DNA Thermocycler GeneAmp 2400(PEApplied Biosystems，Foster city，CA)中的PCR反应。PCR反应条件如下：起始温度为94℃ 2分钟。随后进行30个加热/冷却循环。每个循环由94℃ 30秒，58℃ 30秒，68℃ 1分钟40秒组成。在温度循环完成后，将样本保持在60℃下10分钟或更长，然后在4℃下复性。

用QIAquik PCR纯化试剂盒(Qiagen，cat#28106)部分地纯化PCR产物，并用HindIII和SacI进行消化，然后通过如上所述的规程来纯化凝胶。将消化的PCR片段连接到用同样的酶消化的pBAD-SacI载体中。20μL连接反应包含1.0μL T4 DNA连接酶(Promega)，与T4 DNA连接酶一起的2.0μL 10x反应缓冲液，45ng载体和45ng插入序列以及去离子水。反应在Eppendorf热循环仪(Eppendorf North America，Westbury，NY)中在16℃下孵育过夜。

使用Bio-RAD Gene Pulser II(Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA)将两μL连接产物转化到大肠杆菌TOP10电穿孔感受态细胞(Invitrogen)中。在包含LB培养基和100μg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上选择转化过的克隆。通过SacI消化和DNA测序来确认克隆中大肠杆菌ilvC基因插入序列的存在，DNA测序使用引物SEQ ID NO：17至22。将具有ilvC基因插入序列的构建体命名为pBAD-K12-ilvC

制备用于KARI表达分析的菌株

上文的pBAD-K12-ilvC构建体和pTrc99A-ilvC的质粒均在TOP10宿主菌株中，它们使用Qiaprep spin小量制备试剂盒(Qiagen，ValenciaCA，catalogue#27106)按照制造商说明书，从在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中的3mL过夜培养物中制备。使用Bio RAD GenePulser II(Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA)按照制造商说明书，将一μL pBAD-K12-ilvC和一μL pTrc99A-ilvC分别转化到大肠杆菌Bw25113(ΔilvC)电穿孔感受态细胞中。将转化过的细胞划线接种在包含加入100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的琼脂板上，在37℃下培养过夜。使用来自这些平板的菌落来制备细胞游离提取物。

制备细胞游离提取物

使包含pBAD-K12-ilvC和pTrc99A-ilvC的细胞在3.0mL LB培养基中生长，该培养基包含100μg/mL氨苄青霉素以及诱导剂0.02％(w/v)阿拉伯糖和1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养条件分别为37℃，在250rpm下振荡。通过在6000xg下离心5分钟来收获细胞，离心温度为22.5℃，将细胞沉淀物重悬于1.5mL微量离心管中的300μL100mM HEPES缓冲液中(pH7.5)，用40％水和60％冰(按体积计)进行水浴，并超声处理2-3分钟(3.0秒脉冲，强度1.0档，随后是3.0秒停顿)，超声处理使用的是Misonix 300超声波破碎仪(Misonix，Farmingdale NY)。通过离心来移除细胞碎片(Eppendorf微型离心机，型号5415D，在9300xg下处理5分钟，温度为22.5℃)。

作为另外一种选择，使用基于去污剂的蛋白提取试剂BugBuster主混合物(Novagen，目录号#71456)来制备细胞提取物。将来自3.0mL培养物的细胞沉淀物重悬在300μL BugBuster主混合物中并室温培养20分钟。通过离心移除细胞碎片(Eppendorff微型离心机，型号5415D)，在9300xg，22.5℃下离心5分钟。

蛋白质量化

通过Bradford Coomassie测定法(BCA)使用Coomassie Plus(Pierce#23238，Rockford，IL)来测量样本中的总蛋白浓度。按照制造商规程在96孔微板中制备样本和蛋白标准品(Bovine Serum Albumin，BSA)。蛋白质浓度根据在595nm处的吸光度使用SpectraMax板阅读器(MolecularDevices Corporation，Sunnyvale，CA)进行测量。

KARI酶测定规程

按照以下文献中所述的方法来合成测定底物(R，S)-乙酰乳酸：Aulabaugh和Schloss(Aulabaugh和Schloss，Biochemistry，29，2824-2830，1990)：将1.0g 2-乙酰氧基-2-甲基-3-氧代丁酸乙酯(Aldrich，Milwaukee，WI)与10mL 1.0M NaOH混合并在室温下搅拌。当溶液pH变为中性时，缓慢加入NaOH以维持约8.0的pH值。测定法中使用的所有其他化学药品均购自Sigma。

用KARI将乙酰乳酸酶转化为2，3-二羟基异戊酸，然后使用分光光度计(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)测量在340nm处辅因子NADPH在反应中的消耗。使用NADPH的6220M^-1cm^-1摩尔消光系数来计算活性。使用的原液是：100mM HEPES-钾盐，用HCl/KOH调节至pH7.5；1.0M MgCl₂；20mM NADPH和90mM乙酰乳酸。40mL反应缓冲液混合原液包含100mM HEPES原液和400μL MgCl₂原液。

将反应缓冲液(194μL)与NADPH(2.0μL)原液和细胞提取物(2.0μL)在一次性塑料管(Eppendorf UVette，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)中混合，并且记录在340nm处22.5℃下的吸光度20秒。最初的A₃₄₀通常为约0.9-1.0。然后将乙酰乳酸(2.0μL)加入管中开始反应。测定法中的成分终浓度为：pH值为7.5的100mM钾HEPES、10mMMgCl₂、200uM NADPH和900uM乙酰乳酸。完全混合该溶液，并且额外记录在340nm处的吸光度80秒。将该处报告的KARI活性定义为每mg细胞提取物中的总蛋白每分钟消耗的NADPHμmole数。表4显示了细胞提取物中的蛋白浓度和KARI活性的结果，该细胞提取物从用pBAD-K12-ilvC质粒和ptrc99A-ilvC质粒转化过的大肠杆菌Bw25113(ΔilvC)细胞中制备。制备两个细胞提取物样本用于pBAD-K12-ilvC构建体，一个通过超声波降解，另一个使用BugBuster。使用BugBuster制备用于pTrc99A-ilvC构建体的细胞提取物样本。这些分析显示KARI蛋白在包含pBAD-K12-ilvC质粒的细胞中的表达水平高于在那些包含pTrc99A-ilvC质粒的细胞中的表达水平，然而，通过两种不同方法制备的细胞提取物样本中的酶比活并无显著差异。使用由pBAD-HisB(Invitrogen)转化过的大肠杆菌菌株Bw25113作阴性对照。阴性对照中的NADPH消耗速率是极低的(测得的消耗速率为那些包含pBAD-K12-ilvC基因的菌株的约1％至2％)。

表4

KARI和在包含ilvC基因的克隆中的总蛋白浓度

克隆	总蛋白(μg/mL)	KARI活性μmol/min/mg总蛋白
克隆	总蛋白(μg/mL)	KARI活性μmol/min/mg总蛋白	BW25113(ΔilvC)-ptrc99A-ilvC-Bugbuster	8007	0.16
BW25113(ΔilvC)-pBAD-K12-ilvC-超声波降解	9707	0.83	BW25113(ΔilvC)-ptrc99A-ilvC-Bugbuster	8007	0.16
BW25113(ΔilvC)-pBAD-K12-ilvC-超声波降解	9707	0.83	BW25113(ΔilvC)-pBAD-K12-ilvC-BugBuster	4595	0.78

实施例2

鉴定夹自多种微生物的高比活KARI酶

该实施例的目的是为了描述如何鉴定包含具有高比活的KARI酶的微生物。

那些包含KARI的生物当在基本培养基中生长时具有比大肠杆菌更快的倍增时间，假设它们包含高活性KARI酶。鉴定了当在M9基本培养基中生长时具有比大肠杆菌更快的倍增时间的三种微生物，它们是铜绿假单胞菌(PAO1)、荧光假单胞菌(PF5)和霍乱弧菌(N16961)(参见下文)。这些生物的基因组DNA制备可商购获得。表5显示了这些生物当在M9基本培养基中生长时与大肠杆菌相比的倍增时间。

表5

在M9培养基中生长期间的受试菌株倍增时间

生物	在M9培养基中的倍增时间	参照序列
生物	在M9培养基中的倍增时间	参照序列	大肠杆菌	55-60分钟	1
霍乱弧菌(N16961)	45分钟	3	大肠杆菌	55-60分钟	1
霍乱弧菌(N16961)	45分钟	3	铜绿假单胞菌(PAO1)	42分钟	2
荧光假单胞菌(PF5)	38分钟	2	铜绿假单胞菌(PAO1)	42分钟	2

参考

1.Neidhardt，FC，等人，J，Bacteriol.119，736-747，1974。

2.Brinkman FSL，等人，J.Bacteriol.181，4746-4754，1999。

3.Silva AJ和Benitez JA，J.Bacteriol.188，794-800，2006。

如上所述，已经将KARI酶分成不同类别。假单胞菌属PF5和PAO1酶属于I类KARI，它是家族中最大的一类，而大肠杆菌和霍乱弧菌酶属于II类细菌KARI。

铜绿假单胞菌(PAO1，ATCC 47085)和荧光假单胞菌(PF5，ATCCBAA-477)的纯化基因组DNA购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd，Manassas，VA)。来自每个生物的基因组DNA(每个10μg)在100μL 10mM Tris-HCl，pH8.5中进行再水合以用于PCR反应。以下引物对具有连接到正向引物(SEQ ID NO：23和25)的SacI位点和连结到反向引物(SEQ ID NO：24和26)的HindIII位点，使用它们通过PCR利用高保真pfu-ultra DNA聚合酶(Stratagene)从PAO1和PF5的基因组DNA扩增ilvC基因编码区。基于这些生物的公用(GeneBank)序列PF5和PAO1 ilvC基因来设计引物。

每个50μL PCR反应包含1.0μL基因组DNA和每个基因的1.0μL，每个10pmol/μL的正向和反向引物。

PCR反应在Eppendorf主循环梯度(Eppendorf North America，Westbury，NY)下进行，使用以下反应条件。起始温度为95℃ 2分钟。随后进行5个加热/冷却循环。每个循环由95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃1分钟30秒组成。然后再进行25个加热/冷却循环。每个这些循环由95℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 1.0分钟30秒组成。在这些温度循环完成后，将样本保持在72℃下10分钟或更长，然后在4℃下复性。

使用实施例I中所述的规程将所得的PCR片段用HindIII和SacI消化并克隆到pBAD-SacI表达载体中，然后转化进入ilvC敲除菌株BW25113(ΔilvC)中。通过限制性酶消化来鉴定阳性克隆并通过全长DNA测序进行确认，测序使用的是引物，SEQ ID NO：21(pBAD-eFl)、SEQ ID NO：22(PALPK-R1)、SEQ ID NO：27(PF5-S-F2)和SEQ IDNO：28(PF5-S-R2)。将所得的菌株命名为BW25113(ΔilvC)-PAO1-ilvC和BW25113(ΔilvC)-PF5-ilvC。

霍乱弧菌VC0162基因编码区经密码子最优化以用于大肠杆菌表达，该优化基于已知蛋白序列(Accession NP 229819.1)并通过委托基因合成(DNA 2.0，Inc.Menlo Park，CA)来制备。它用粘附到基因末端的SacI和HindIII位点来制备。也使用SacI和HindIII限制位点将该DNA片段克隆到pBAD-SacI表达载体中并转化进ilvC敲除菌株BW25113(ΔilvC)中。将所得的菌株命名为BW25113(ΔilvC)-VCopt-VC0162。给予经密码子最优化的VC0162序列以SEQ ID NO：30。

来自K12、PAO1、PF5和VC菌株的蛋白质和KARI活性测定

通过BugBuster如实施例1中所述来制备均表达KARI酶的菌株BW25113(ΔilvC)-K12-ilvC、BW25113(ΔilvC)-PAO1-ilvC.BW25113(ΔilvC)-PF5-ilvC和BW25113(ΔilvC)-VCopt-VC0162的细胞游离提取物。通过使用188μL反应缓冲液、2.0μL 20mM的NADPH原液、稀释在测定缓冲液中的5.0μL 20％细胞提取物和5.0μL 90mM乙酰乳酸来进行KARI测定。因此该实施例中的测定的最终溶液由酶、100mM的钾-HEPES、10mM的MgCl₂、200uM的NADPH和2.25mM的乙酰乳酸组成。

表6显示了四种不同生物的KARI比活，所述生物在存在0.02％(w/v)阿拉伯糖作诱导剂的情况下生长过夜。如上所述来测量细胞提取物中的总蛋白量和KARI活性。如表6所列出的那样，来自经鉴定当在基本培养基(表5)中生长时具有更快倍增时间的生物的KARI酶均具有比来自大肠杆菌的KARI酶更高的比活。根据SDS-PAGE(未显示数据)的评估，每个提取物具有大约相等的KARI蛋白表达水平。这些结果支持这一假设：可将在基本培养基中生长期间的倍增时间用作鉴定具有更高比活的KARI酶的方法。

表6

比较来自不同生物的KARI比活

菌株	分子量(KDa)	KARI类	细胞提取物中的总蛋白μg/mL	KARI比活μmol/min/mg总蛋白
菌株	分子量(KDa)	KARI类	细胞提取物中的总蛋白μg/mL	KARI比活μmol/min/mg总蛋白	BW25113(ΔilvC)-K12-ilvC	54	II	6693	0.72
BW25113(ΔilvC)-VC-opt-VC0162	54	II	6730	1.1	BW25113(ΔilvC)-K12-ilvC	54	II	6693	0.72
BW25113(ΔilvC)-VC-opt-VC0162	54	II	6730	1.1	BW25113(ΔilvC)-PAO1-ilvC	36	I	4988	1.2
BW25113(ΔilvC)-PF5-ilvC	36	I	7671	1.8	BW25113(ΔilvC)-PAO1-ilvC	36	I	4988	1.2

实施例3

分析纯化的K12-KARI和PF5-KARI的比活

为了更好地确定观察到的实施例2中的粗细胞提取物KARI比活的提高，将K12-KARI和PF5-KARI纯化到同质以允许精确定量单个蛋白的浓度并测定纯化的KARI酶的比活。

纯化K12-KARI和PF5-KARI

K12-KARI和PF5-KARI使用弱阴离子交换离心柱Vivapure IEX D，miniH(Vivascience AG，Hannover，Germany)进行纯化，然后在Microcon装置中使用100KDa分子量截止电压(YM100，Millpore，Bedford，MA)进行浓缩。纯化程序在室温(22.5℃)下进行。

阴离子交换离心柱中使用的原液是：pH7.0的100mM钾-HEPES、1.0M MgCl₂、250mM EDTA、10％ Brij35和2M KCl。洗涤缓冲液(BufferA)通过以下方法制备：将5.0mL 100mM HEPES原液加入到15mL水中，另外加入50μL MgCl₂原液、20μL EDTA原液和10μL 10％Brij35。洗脱缓冲液#1(缓冲液B)通过以下方法制备：将5.0mL 100mMHEPES、2.0mL KCl原液加入到13mL水中，另外加入50μL MgCl₂原液、20μL EDTA原液和10μL 10％ Brij35。洗脱缓冲液#2(缓冲液C)通过以下方法制备：将5mL 100mM HEPES原液、5.0mL KCl原液加入到10mL水中，另外加入50μL MgCl₂原液、20μL EDTA原液和10μL 10％ Brij35。缓冲液B中的KCl终浓度为约200mM，缓冲液C中为约500mM。

菌株BW25113(ΔilvC)-K12-ilvC和BW25113(ΔilvC)-PF5-ilvC的细胞游离提取物通过BugBuster如实施例1中所述进行制备。为了制备载入Vivapure IEX D柱的稀释细胞提取物，将600μL双重去离子水加入到200μL的提取物中。

Vivapure IEX D柱首先用400μL缓冲液A洗涤，洗涤通过在2000xg下离心(Eppendorf微型离心机型号5415D)5分钟。在整个Vivapure IEXD纯化程序中使用相同设备和方法。将稀释细胞提取物(如上所述)加载到柱上，分两批离心，每批400μL。然后用400μL缓冲液A洗涤(x2)。就PF5-KARI样本而言，将400μL缓冲液B上样以将所述酶从柱中洗脱到收集管中。就K12-KARI样本而言，改为使用400μL缓冲液C。

Microcon YM100装置首先用400μL去离子水洗涤，洗涤通过在13800xg下离心(Eppendorf微型离心机型号5415D)5分钟。然后将从Vivapure IEX D纯化中收集的样本进样并在13800xg下离心4分钟。弃去流通液并将400μL缓冲液B加入到样本室中，在13800xg下离心4分钟。在加入200μL缓冲液B到样本室前重复洗涤程序(x2)。将样本室中的样本倒入洁净管中并在5000xg下离心2分钟以收集纯化的样本。

通过毛细管电泳(Agilent 2100 Bioanalyzer，Agilent Technology，Santa Clara，CA)验证每个纯化KARI样本的纯度。使用Protein 230试剂盒制备样本，并按照制造商说明书施用到Protein Labchip(与试剂盒一起提供)，用Bioanalyzer进行分析。在电描记图上能观察到每个纯化样本极低背景的单峰。

纯化的KARI样本的蛋白质量化

使用分光光度计(Agilent Technology，Santa Clara，CA)和1cm路径长度的一次性塑料管(UVette，eppendorf，Hamburg，Germany)对KARI纯化样本进行在280nm处的UV吸收测定，以定量纯化样本中的KARI。PF5-KARI(0.73，1mg/mL)和K12-KARI(0.98，1mg/mL)在280nm处的消光系数通过程序Protparam进行预测，该程序来自ExPASy网站(Pace，C.N.等人，Protein Sci.11，2411-2423，1995)。将纯化样本在缓冲液B中稀释成20％(v/v)用于UV吸收测定。稀释的PF5-KARI样本的A₂₈₀为0.41，稀释的K12-KARI的A₂₈₀为0.36。

纯化的KARI的活性测定

该实施例中使用的测定条件与实施例2中相同，不同的是使用5μL20％(v/v)纯化样本代替细胞提取物。纯化样本的蛋白浓度以及它们的比活在表7中示出。测得的最快生长生物的纯化PF5-KARI的比活是K12-KARI的两倍。这些结果与实施例2中使用这两种酶的粗制备物获得的数据一致，因此为以下假设提供了进一步支持：在基本培养基中生长期间的倍增时间可用作鉴别具有比大肠杆菌酶更高比活的KARI酶的方法。

表7

大肠杆菌和假单胞菌属菌株中的KARI浓度和比活

样本	KARI浓度(mg/mL)	比活μmol/min/mg KARI
样本	KARI浓度(mg/mL)	比活μmol/min/mg KARI	K12-KARI	1.85	1.1
PF5-KARI	2.80	2.2	K12-KARI	1.85	1.1

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.

<120>使用高活性酮醇酸还原异构酶来发酵生产异丁醇

<130>CL3761

<160>40

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>1680

<212>DNA

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>1

atggacaaac agtatccggt acgccagtgg gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagtcag 60

ctggaagctc agggagtacg ccaggtgttc ggcatccccg gcgccaaaat cgacaaggtc 120

tttgattcac tgctggattc ctccattcgc attattccgg tacgccacga agccaacgcc 180

gcatttatgg ccgccgccgt cggacgcatt accggcaaag cgggcgtggc gctggtcacc 240

tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc ggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgac 300

ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtaaaa cgcgccgata aagcgaagca ggtccaccag 360

agtatggata cggtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccatcga ggtgacggcg 420

ccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaac gccttccgcg ccgccgagca gggccggccg 480

ggcagcgcgt tcgttagcct gccgcaggat gtggtcgatg gcccggtcag cggcaaagtg 540

ctgccggcca gcggggcccc gcagatgggc gccgcgccgg atgatgccat cgaccaggtg 600

gcgaagctta tcgcccaggc gaagaacccg atcttcctgc tcggcctgat ggccagccag 660

ccggaaaaca gcaaggcgct gcgccgtttg ctggagacca gccatattcc agtcaccagc 720

acctatcagg ccgccggagc ggtgaatcag gataacttct ctcgcttcgc cggccgggtt 780

gggctgttta acaaccaggc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840

atcggctaca gcccggtgga atacgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900

gtgcacatcg acgtgctgcc cgcctatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960

gtgggcgata tcgccggcac tctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca tcggctggtg 1020

ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080

cgccgcggcg cgcagctcaa ccagtttgcc ctgcatcccc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140

caggatatcg tcaacagcga cgtcacgttg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200

attgcccgct acctgtacac gttccgcgcc cgtcaggtga tgatctccaa cggccagcag 1260

accatgggcg tcgccctgcc ctgggctatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgcaaa 1320

gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380

gtccgcctga aagccaacgt gctgcatctt atctgggtcg ataacggcta caacatggtc 1440

gctatccagg aagagaaaaa atatcagcgc ctgtccggcg tcgagtttgg gccgatggat 1500

tttaaagcct atgccgaatc cttcggcgcg aaagggtttg ccgtggaaag cgccgaggcg 1560

ctggagccga ccctgcgcgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtagt ggccatcccg 1620

gtggattatc gcgataaccc gctgctgatg ggccagctgc atctgagtca gattctgtaa 1680

<210>2

<211>559

<212>PRT

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>2

Met Asp Lys Gln Tyr Pro Val Arg Gln Trp Ala His Gly Ala Asp Leu

1 5 10 15

Val Val Ser Gln Leu Glu Ala Gln Gly Val Arg Gln Val Phe Gly Ile

20 25 30

Pro Gly Ala Lys Ile Asp Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asp Ser Ser

35 40 45

Ile Arg Ile Ile Pro Val Arg His Glu Ala Asn Ala Ala Phe Met Ala

50 55 60

Ala Ala Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Ala Gly Val Ala Leu Val Thr

65 70 75 80

Ser Gly Pro Gly Cys Ser Asn Leu Ile Thr Gly Met Ala Thr Ala Asn

85 90 95

Ser Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Gly Gly Ala Val Lys Arg Ala

100 105 110

Asp Lys Ala Lys Gln Val His Gln Ser Met Asp Thr Val Ala Met Phe

115 120 125

Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Ile Glu Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu

130 135 140

Ala Glu Val Val Ser Asn Ala Phe Arg Ala Ala Glu Gln Gly Arg Pro

145 150 155 160

Gly Ser Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Val Val Asp Gly Pro Val

165 170 175

Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Gly Ala Pro Gln Met Gly Ala Ala

180 185 190

Pro Asp Asp Ala Ile Asp Gln Val Ala Lys Leu Ile Ala Gln Ala Lys

195 200 205

Asn Pro Ile Phe Leu Leu Gly Leu Met Ala Ser Gln Pro Glu Asn Ser

210 215 220

Lys Ala Leu Arg Arg Leu Leu Glu Thr Ser His Ile Pro Val Thr Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Ala Val Asn Gln Asp Asn Phe Ser Arg Phe

245 250 255

Ala Gly Arg Val Gly Leu Phe Asn Asn Gln Ala Gly Asp Arg Leu Leu

260 265 270

Gln Leu Ala Asp Leu Val Ile Cys Ile Gly Tyr Ser Pro Val Glu Tyr

275 280 285

Glu Pro Ala Met Trp Asn Ser Gly Asn Ala Thr Leu Val His Ile Asp

290 295 300

Val Leu Pro Ala Tyr Glu Glu Arg Asn Tyr Thr Pro Asp Val Glu Leu

305 310 315 320

Val Gly Asp Ile Ala Gly Thr Leu Asn Lys Leu Ala Gln Asn Ile Asp

325 330 335

His Arg Leu Val Leu Ser Pro Gln Ala Ala Glu Ile Leu Arg Asp Arg

340 345 350

Gln His Gln Arg Glu Leu Leu Asp Arg Arg Gly Ala Gln Leu Asn Gln

355 360 365

Phe Ala Leu His Pro Leu Arg Ile Val Arg Ala Met Gln Asp Ile Val

370 375 380

Asn Ser Asp Val Thr Leu Thr Val Asp Met Gly Ser Phe His Ile Trp

385 390 395 400

Ile Ala Arg Tyr Leu Tyr Thr Phe Arg Ala Arg Gln Val Met Ile Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Gln Thr Met Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Gly Ala

420 425 430

Trp Leu Val Asn Pro Glu Arg Lys Val Val Ser Val Ser Gly Asp Gly

435 440 445

Gly Phe Leu Gln Ser Ser Met Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu Lys

450 455 460

Ala Asn Val Leu His Leu Ile Trp Val Asp Asn Gly Tyr Asn Met Val

465 470 475 480

Ala Ile Gln Glu Glu Lys Lys Tyr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Phe

485 490 495

Gly Pro Met Asp Phe Lys Ala Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly

500 505 510

Phe Ala Val Glu Ser Ala Glu Ala Leu Glu Pro Thr Leu Arg Ala Ala

515 520 525

Met Asp Val Asp Gly Pro Ala Val Val Ala Ile Pro Val Asp Tyr Arg

530 535 540

Asp Asn Pro Leu Leu Met Gly Gln Leu His Leu Ser Gln Ile Leu

545 550 555

<210>3

<211>1476

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>3

atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60

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ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240

aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300

ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360

ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420

gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480

gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540

aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600

caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660

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gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900

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atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140

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aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320

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<210>4

<211>491

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>4

Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln

1 5 10 15

Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala

20 25 30

Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln

35 40 45

Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser

50 55 60

Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg

65 70 75 80

Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile

85 90 95

Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser

100 105 110

Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu

115 120 125

Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg

130 135 140

Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu

145 150 155 160

Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala

165 170 175

Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys

180 185 190

Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser

195 200 205

Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile

210 215 220

Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu

225 230 235 240

Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe

245 250 255

Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu

260 265 270

Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu

275 280 285

Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met

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Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp

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Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys

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Thr Ala Phe Glu Thr Ala Pro Gln Tyr Glu Gly Lys Ile Gly Glu Gln

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Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly

355 360 365

Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu

370 375 380

Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr

385 390 395 400

Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr

405 410 415

Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu

420 425 430

Lys Pro Phe Met Ala Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile

435 440 445

Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala

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Ile Arg Ser His Ala Ile Glu Gln Val Gly Lys Lys Leu Arg Gly Tyr

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Met Thr Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Gly

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<210>5

<211>1851

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>5

atgcctaagt accgttccgc caccaccact catggtcgta atatggcggg tgctcgtgcg 60

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gatgggattg ccatgggcca cggggggatg ctttattcac tgccatctcg cgaactgatc 300

gctgattccg ttgagtatat ggtcaacgcc cactgcgccg acgccatggt ctgcatctct 360

aactgcgaca aaatcacccc ggggatgctg atggcttccc tgcgcctgaa tattccggtg 420

atctttgttt ccggcggccc gatggaggcc gggaaaacca aactttccga tcagatcatc 480

aagctcgatc tggttgatgc gatgatccag ggcgcagacc cgaaagtatc tgactcccag 540

agcgatcagg ttgaacgttc cgcgtgtccg acctgcggtt cctgctccgg gatgtttacc 600

gctaactcaa tgaactgcct gaccgaagcg ctgggcctgt cgcagccggg caacggctcg 660

ctgctggcaa cccacgccga ccgtaagcag ctgttcctta atgctggtaa acgcattgtt 720

gaattgacca aacgttatta cgagcaaaac gacgaaagtg cactgccgcg taatatcgcc 780

agtaaggcgg cgtttgaaaa cgccatgacg ctggatatcg cgatgggtgg atcgactaac 840

accgtacttc acctgctggc ggcggcgcag gaagcggaaa tcgacttcac catgagtgat 900

atcgataagc tttcccgcaa ggttccacag ctgtgtaaag ttgcgccgag cacccagaaa 960

taccatatgg aagatgttca ccgtgctggt ggtgttatcg gtattctcgg cgaactggat 1020

cgcgcggggt tactgaaccg tgatgtgaaa aacgtacttg gcctgacgtt gccgcaaacg 1080

ctggaacaat acgacgttat gctgacccag gatgacgcgg taaaaaatat gttccgcgca 1140

ggtcctgcag gcattcgtac cacacaggca ttctcgcaag attgccgttg ggatacgctg 1200

gacgacgatc gcgccaatgg ctgtatccgc tcgctggaac acgcctacag caaagacggc 1260

ggcctggcgg tgctctacgg taactttgcg gaaaacggct gcatcgtgaa aacggcaggc 1320

gtcgatgaca gcatcctcaa attcaccggc ccggcgaaag tgtacgaaag ccaggacgat 1380

gcggtagaag cgattctcgg cggtaaagtt gtcgccggag atgtggtagt aattcgctat 1440

gaaggcccga aaggcggtcc ggggatgcag gaaatgctct acccaaccag cttcctgaaa 1500

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<210>6

<211>616

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>6

Met Pro Lys Tyr Arg Ser Ala Thr Thr Thr His Gly Arg Asn Met Ala

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Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Met Thr Asp Ala Asp Phe

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Gly Lys Pro Ile Ile Ala Val Val Asn Ser Phe Thr Gln Phe Val Pro

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Gly His Val His Leu Arg Asp Leu Gly Lys Leu Val Ala Glu Gln Ile

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Glu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Glu Phe Asn Thr Ile Ala Val Asp

65 70 75 80

Asp Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Arg Glu Leu Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Cys

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Ala Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly

115 120 125

Met Leu Met Ala Ser Leu Arg Leu Asn Ile Pro Val Ile Phe Val Ser

130 135 140

Gly Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Thr Lys Leu Ser Asp Gln Ile Ile

145 150 155 160

Lys Leu Asp Leu Val Asp Ala Met Ile Gln Gly Ala Asp Pro Lys Val

165 170 175

Ser Asp Ser Gln Ser Asp Gln Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr Cys

180 185 190

Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Thr

195 200 205

Glu Ala Leu Gly Leu Ser Gln Pro Gly Asn Gly Ser Leu Leu Ala Thr

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His Ala Asp Arg Lys Gln Leu Phe Leu Asn Ala Gly Lys Arg Ile Val

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Glu Leu Thr Lys Arg Tyr Tyr Glu Gln Asn Asp Glu Ser Ala Leu Pro

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Arg Asn Ile Ala Ser Lys Ala Ala Phe Glu Asn Ala Met Thr Leu Asp

260 265 270

Ile Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Val Leu His Leu Leu Ala Ala

275 280 285

Ala Gln Glu Ala Glu Ile Asp Phe Thr Met Ser Asp Ile Asp Lys Leu

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Ser Arg Lys Val Pro Gln Leu Cys Lys Val Ala Pro Ser Thr Gln Lys

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Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Gly Val Ile Gly Ile Leu

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Gly Glu Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Asn Arg Asp Val Lys Asn Val

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Leu Gly Leu Thr Leu Pro Gln Thr Leu Glu Gln Tyr Asp Val Met Leu

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Thr Gln Asp Asp Ala Val Lys Asn Met Phe Arg Ala Gly Pro Ala Gly

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Ile Arg Thr Thr Gln Ala Phe Ser Gln Asp Cys Arg Trp Asp Thr Leu

385 390 395 400

Asp Asp Asp Arg Ala Asn Gly Cys Ile Arg Ser Leu Glu His Ala Tyr

405 410 415

Ser Lys Asp Gly Gly Leu Ala Val Leu Tyr Gly Asn Phe Ala Glu Asn

420 425 430

Gly Cys Ile Val Lys Thr Ala Gly Val Asp Asp Ser Ile Leu Lys Phe

435 440 445

Thr Gly Pro Ala Lys Val Tyr Glu Ser Gln Asp Asp Ala Val Glu Ala

450 455 460

Ile Leu Gly Gly Lys Val Val Ala Gly Asp Val Val Val Ile Arg Tyr

465 470 475 480

Glu Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu Tyr Pro Thr

485 490 495

Ser Phe Leu Lys Ser Met Gly Leu Gly Lys Ala Cys Ala Leu Ile Thr

500 505 510

Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ser Ile Gly His Val

515 520 525

Ser Pro Glu Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ile Gly Leu Ile Glu Asp Gly

530 535 540

Asp Leu Ile Ala Ile Asp Ile Pro Asn Arg Gly Ile Gln Leu Gln Val

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Ser Asp Ala Glu Leu Ala Ala Arg Arg Glu Ala Gln Asp Ala Arg Gly

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Asp Lys Ala Trp Thr Pro Lys Asn Arg Glu Arg Gln Val Ser Phe Ala

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Leu Arg Ala Tyr Ala Ser Leu Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val

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<210>7

<211>1662

<212>DNA

<213>乳酸乳球菌

<400>7

tctagacata tgtatactgt gggggattac ctgctggatc gcctgcacga actggggatt 60

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cacaaagata tgaagtgggt cggtaacgcc aacgaactga acgcgagcta tatggcagat 180

ggttatgccc gtaccaaaaa agctgctgcg tttctgacga cctttggcgt tggcgaactg 240

agcgccgtca acggactggc aggaagctac gccgagaacc tgccagttgt cgaaattgtt 300

gggtcgccta cttctaaggt tcagaatgaa ggcaaatttg tgcaccatac tctggctgat 360

ggggatttta aacattttat gaaaatgcat gaaccggtta ctgcggcccg cacgctgctg 420

acagcagaga atgctacggt tgagatcgac cgcgtcctgt ctgcgctgct gaaagagcgc 480

aagccggtat atatcaatct gcctgtcgat gttgccgcag cgaaagccga aaagccgtcg 540

ctgccactga aaaaagaaaa cagcacctcc aatacatcgg accaggaaat tctgaataaa 600

atccaggaat cactgaagaa tgcgaagaaa ccgatcgtca tcaccggaca tgagatcatc 660

tcttttggcc tggaaaaaac ggtcacgcag ttcatttcta agaccaaact gcctatcacc 720

accctgaact tcggcaaatc tagcgtcgat gaagcgctgc cgagttttct gggtatctat 780

aatggtaccc tgtccgaacc gaacctgaaa gaattcgtcg aaagcgcgga ctttatcctg 840

atgctgggcg tgaaactgac ggatagctcc acaggcgcat ttacccacca tctgaacgag 900

aataaaatga tttccctgaa tatcgacgaa ggcaaaatct ttaacgagcg catccagaac 960

ttcgattttg aatctctgat tagttcgctg ctggatctgt ccgaaattga gtataaaggt 1020

aaatatattg ataaaaaaca ggaggatttt gtgccgtcta atgcgctgct gagtcaggat 1080

cgtctgtggc aagccgtaga aaacctgaca cagtctaatg aaacgattgt tgcggaacag 1140

ggaacttcat ttttcggcgc ctcatccatt tttctgaaat ccaaaagcca tttcattggc 1200

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ggctacaccg tcgaacgcga aattcatgga ccgaatcaaa gttacaatga catcccgatg 1440

tggaactata gcaaactgcc ggaatccttt ggcgcgacag aggatcgcgt ggtgagtaaa 1500

attgtgcgta cggaaaacga atttgtgtcg gttatgaaag aagcgcaggc tgacccgaat 1560

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<210>8

<211>548

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌

<400>8

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Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val

65 70 75 80

Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile

85 90 95

Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His

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Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val

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Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro

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Ser Leu Pro Leu Lys Lys Glu Asn Ser Thr Ser Asn Thr Ser Asp Gln

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Glu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Glu Ser Leu Lys Asn Ala Lys Lys Pro

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Ile Val Ile Thr Gly His Glu Ile Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr

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Val Thr Gln Phe Ile Ser Lys Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn

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Phe Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu Ala Leu Pro Ser Phe Leu Gly Ile

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Ala Asp Phe Ile Leu Met Leu Gly Val Lys Leu Thr Asp Ser Ser Thr

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Ile Asp Glu Gly Lys Ile Phe Asn Glu Arg Ile Gln Asn Phe Asp Phe

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Glu Ser Leu Ile Ser Ser Leu Leu Asp Leu Ser Glu Ile Glu Tyr Lys

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Gly Lys Tyr Ile Asp Lys Lys Gln Glu Asp Phe Val Pro Ser Asn Ala

340 345 350

Leu Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Thr Gln

355 360 365

Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly Ala

370 375 380

Ser Ser Ile Phe Leu Lys Ser Lys Ser His Phe Ile Gly Gln Pro Leu

385 390 395 400

Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln Ile

405 410 415

Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu

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Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ala Ile Arg Glu Lys Ile Asn

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Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg Glu

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Ile His Gly Pro Asn Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr

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Ser Lys Leu Pro Glu Ser Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val Ser

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Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala

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Gln Ala Asp Pro Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Ile Leu Ala Lys

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<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>9

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

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caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540

tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720

cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900

cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140

cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164

<210>10

<211>387

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>10

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val

20 25 30

Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp

35 40 45

Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly

50 55 60

Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu

65 70 75 80

Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser

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Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu

100 105 110

Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys

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Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser

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Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys

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Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp

165 170 175

Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val

180 185 190

Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val

195 200 205

Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu

210 215 220

Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val

225 230 235 240

Arg Ala Asn Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile

245 250 255

Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu

260 265 270

Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val

275 280 285

Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu

290 295 300

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp

305 310 315 320

Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln

325 330 335

Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser

340 345 350

Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu

355 360 365

Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu

370 375 380

Ala Ala Arg

385

<210>11

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

gagctcctta agaaggaggt aatcaccatg gctaactact tcaa 44

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

ggatccgatc gagctagcgc ggccgcttaa cccgcaacag caatacgttt c 51

<210>13

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

gctaacagga ggaagagctc atggcaccct cgctc 35

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gagcgagggt gccatgagct cttcctcctg ttagc 35

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

atcaccgagc tcatggctaa ctacttcaat acactgaatc tgcg 44

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

ggccgcaagc ttttaacccg caacagcaat acgtttcata tctgtc 46

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

ccgtaaagat atcaccgtag 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

cagtatgaag gcaaaatcgg 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

cgtactcagc ggtatcagag 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

cagatttcac ttccgcaacg 20

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

cgcaactctc tactgtttct ccatacccg 29

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

accgcttctg cgttctgatt taatc 25

<210>23

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

caaaacagcc aagcttttag ttcttgctct tgtcgacgat cttg 44

<210>24

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

caggaggaag agctcatgcg cgttttctac gataaagact gtg 43

<210>25

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

caaaacagcc aagcttttag ttcttggctt tgtcgacgat tttg 44

<210>26

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

caggaggaag agctcatgaa agttttctac gataaagact gcgac 45

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

gatcatgatc gcgccgaagg 20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

ctgctcaccg aacaggtcgg 20

<210>29

<211>1476

<212>DNA

<213>基因组序列

<400>29

atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60

cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120

gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180

ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240

aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300

ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360

ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420

gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480

gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540

aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600

caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660

gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720

gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780

atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840

gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900

cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960

gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020

accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080

atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140

atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200

atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260

aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320

ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380

gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440

atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476

<210>30

<211>1485

<212>DNA

<213>弧菌

<400>30

atggctaact attttaacac tctgaatctg cgcgaacagc tggatcagct gggtcgttgt 60

cgcttcatgg cgcgcgagga attcgcaact gaagcggact acctgaaggg taagaaagtg 120

gtcatcgtag gctgtggcgc gcagggcctg aaccagggtc tgaatatgcg tgatagcggc 180

ctggacgtgt cttacgcact gcgtcaagcg gccatcgatg aacagcgtca gtctttcaaa 240

aatgctaaga acaacggttt caatgtaggt tcttacgaac agctgattcc gacggcggac 300

ctggttatca atctgacccc ggataaacag cacaccagcg tggttaacgc ggttatgccg 360

ctgatgaaac agggcgctgc tctgggctat agccatggtt ttaacatcgt ggaagagggc 420

atgcagattc gtaaagacat cacggtagta atggtggcgc cgaaatgccc aggtactgag 480

gttcgtgagg aatacaagcg tggttttggc gttcctaccc tgattgcagt gcacccggaa 540

aacgatccgc agggcgaagg ttgggaaatc gctaaggcat gggctgcagc cactggtggc 600

caccgcgctg gttgcctggc ctctagcttc gtcgcagaag taaaaagcga cctgatgggc 660

gaacagacca tcctgtgtgg tatgctgcag gccggtagca tcgtttgcta cgaaaagatg 720

gttgctgatg gtatcgaccc gggctacgcg ggcaaactgc tgcagtttgg ttgggaaact 780

attaccgagg ctctgaaatt cggtggcatc acccacatga tggaccgtct gagcaacccg 840

gcaaagatca aagcattcga actgtctgaa gagctgaaag acctgatgcg tccgctgtac 900

aacaagcaca tggacgacat tatttccggc cacttttctt ctaccatgat ggcggactgg 960

gccaacgacg acaaggatct gttcggctgg cgtgcggaga ccgctgaaac cgcatttgaa 1020

aactatccga ccactgacgt taagatcgcg gagcaggaat actttgacaa cggtatcctg 1080

atgattgcaa tggttcgcgc gggcgttgaa ctggcgtttg aagcgatgac cgcttctggt 1140

atcatcgatg aatctgcata ctatgagtcc ctgcacgagc tgccgctgat cgctaacacg 1200

gtggcccgca aacgtctgta tgaaatgaat gtcgtaatct ctgacacggc tgaatatggt 1260

aattatctgt tcgccaatgt ggcagttcct ctgctgcgtg agaaattcat gccgaaagtg 1320

ggtaccgatg ttattggtaa aggtctgggt gtcgtttcta accaggtaga taacgcgact 1380

ctgatcgaag tgaactccat catccgtaac cacccggtgg aatacattgg tgaagaactg 1440

cgtggttata tgaaggacat gaagcgtatc gccgttggtg attaa 1485

<210>31

<211>1014

<212>DNA

<213>假单胞菌

<400>31

atgcgcgttt tctacgataa agactgtgac ctctcgatca tccagggcaa gaaagttgcc 60

atcatcggct acggctccca gggccacgcc catgcctgca acctgaagga ctccggcgtc 120

gacgtcaccg tgggcctgcg tagcggctcc gccaccgtgg ccaaggccga agcgcacggt 180

ctgaaggttg ccgacgtgaa gaccgccgtc gccgcagccg acgtggtcat gatcctcacc 240

ccggacgagt tccagggccg cctgtacaag gaagagatcg agccgaacct gaagaagggc 300

gccaccctgg ccttcgctca cggcttctcc atccactaca accaggtcgt cccgcgcgcc 360

gacctcgacg tgatcatgat cgcgccgaag gcaccgggtc acaccgtgcg ttccgagttc 420

gtcaagggcg gtggcatccc tgacctgatc gccatctacc aggacgcttc cggcaacgcc 480

aagaacgtcg ccctgtccta cgcctgcggc gtcggcggcg gtcgtaccgg tatcatcgaa 540

accaccttca aggacgagac cgaaaccgac ctgttcggtg agcaggccgt tctctgcggt 600

ggttgcgtcg agctggtcaa ggccggtttc gaaaccctgg tcgaagccgg ttacgcgccg 660

gaaatggcct acttcgagtg cctgcacgag ctgaagctga tcgtcgacct gatgtacgaa 720

ggcggcatcg ccaacatgaa ctactccatc tccaacaatg ccgaatacgg tgagtacgta 780

accggtccgg aggtgatcaa cgccgagtcc cgtgctgcca tgcgcaacgc cctgaagcgc 840

atccaggacg gcgagtacgc gaaaatgttc attaccgaag gtgcggccaa ctacccgtcg 900

atgactgcct accgccgcaa caacgccgct cacccgatcg agcagatcgg cgagaagctg 960

cgcgcgatga tgccgtggat cgcagccaac aagatcgtcg acaagagcaa gaac 1014

<210>32

<211>1014

<212>DNA

<213>萤光假单胞菌

<400>32

atgaaagttt tctacgataa agactgcgac ctgtcgatca tccaaggtaa gaaagttgcc 60

atcatcggct acggttccca gggccacgct caagcatgca acctgaagga ttccggcgta 120

gacgtgactg ttggcctgcg taaaggctcg gctaccgttg ccaaggctga agcccacggc 180

ttgaaagtga ccgacgttgc tgcagccgtt gccggtgccg acttggtcat gatcctgacc 240

ccggacgagt tccagtccca gctgtacaag aacgaaatcg agccgaacat caagaagggc 300

gccactctgg ccttctccca cggcttcgcg atccactaca accaggttgt gcctcgtgcc 360

gacctcgacg tgatcatgat cgcgccgaag gctccaggcc acaccgtacg ttccgagttc 420

gtcaagggcg gtggtattcc tgacctgatc gcgatctacc aggacgcttc cggcaacgcc 480

aagaacgttg ccctgtccta cgccgcaggc gtgggcggcg gccgtaccgg catcatcgaa 540

accaccttca aggacgagac tgaaaccgac ctgttcggtg agcaggctgt tctgtgtggc 600

ggtaccgtcg agctggtcaa agccggtttc gaaaccctgg ttgaagctgg ctacgctcca 660

gaaatggcct acttcgagtg cctgcacgaa ctgaagctga tcgttgacct catgtacgaa 720

ggcggtatcg ccaacatgaa ctactcgatc tccaacaacg ctgaatacgg cgagtacgtg 780

actggtccag aagtcatcaa cgccgaatcc cgtcaggcca tgcgcaatgc tctgaagcgc 840

atccaggacg gcgaatacgc gaagatgttc atcagcgaag gcgctaccgg ctacccatcg 900

atgaccgcca agcgtcgtaa caacgctgct cacggtatcg aaatcatcgg cgagcaactg 960

cgctcgatga tgccttggat cggtgccaac aaaatcgtcg acaaagccaa gaac 1014

<210>33

<211>491

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>33

Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln

1 5 10 15

Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala

20 25 30

Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln

35 40 45

Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser

50 55 60

Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg

65 70 75 80

Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile

85 90 95

Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser

100 105 110

Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu

115 120 125

Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg

130 135 140

Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu

145 150 155 160

Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala

165 170 175

Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys

180 185 190

Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser

195 200 205

Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile

210 215 220

Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu

225 230 235 240

Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe

245 250 255

Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu

260 265 270

Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu

275 280 285

Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met

290 295 300

Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp

305 310 315 320

Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys

325 330 335

Thr Ala Phe Glu Thr Ala Pro Gln Tyr Glu Gly Lys Ile Gly Glu Gln

340 345 350

Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly

355 360 365

Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu

370 375 380

Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr

385 390 395 400

Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr

405 410 415

Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu

420 425 430

Lys Pro Phe Met Ala Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile

435 440 445

Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala

450 455 460

Ile Arg Ser His Ala Ile Glu Gln Val Gly Lys Lys Leu Arg Gly Tyr

465 470 475 480

Met Thr Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Gly

485 490

<210>34

<211>494

<212>PRT

<213>弧菌

<400>34

Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Glu Gln Leu Asp Gln

1 5 10 15

Leu Gly Arg Cys Arg Phe Met Ala Arg Glu Glu Phe Ala Thr Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Leu Lys Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln

35 40 45

Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Val Ser

50 55 60

Tyr Ala Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp Glu Gln Arg Gln Ser Phe Lys

65 70 75 80

Asn Ala Lys Asn Asn Gly Phe Asn Val Gly Ser Tyr Glu Gln Leu Ile

85 90 95

Pro Thr Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Thr

100 105 110

Ser Val Val Asn Ala Val Met Pro Leu Met Lys Gln Gly Ala Ala Leu

115 120 125

Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Glu Gly Met Gln Ile Arg

130 135 140

Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu

145 150 155 160

Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala

165 170 175

Val His Pro Glu Asn Asp Pro Gln Gly Glu Gly Trp Glu Ile Ala Lys

180 185 190

Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Cys Leu Ala Ser

195 200 205

Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile

210 215 220

Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Ile Val Cys Tyr Glu Lys Met

225 230 235 240

Val Ala Asp Gly Ile Asp Pro Gly Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Gln Phe

245 250 255

Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Phe Gly Gly Ile Thr His

260 265 270

Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Ile Lys Ala Phe Glu Leu

275 280 285

Ser Glu Glu Leu Lys Asp Leu Met Arg Pro Leu Tyr Asn Lys His Met

290 295 300

Asp Asp Ile Ile Ser Gly His Phe Ser Ser Thr Met Met Ala Asp Trp

305 310 315 320

Ala Asn Asp Asp Lys Asp Leu Phe Gly Trp Arg Ala Glu Thr Ala Glu

325 330 335

Thr Ala Phe Glu Asn Tyr Pro Thr Thr Asp Val Lys Ile Ala Glu Gln

340 345 350

Glu Tyr Phe Asp Asn Gly Ile Leu Met Ile Ala Met Val Arg Ala Gly

355 360 365

Val Glu Leu Ala Phe Glu Ala Met Thr Ala Ser Gly Ile Ile Asp Glu

370 375 380

Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr

385 390 395 400

Val Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr

405 410 415

Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ala Asn Val Ala Val Pro Leu Leu

420 425 430

Arg Glu Lys Phe Met Pro Lys Val Gly Thr Asp Val Ile Gly Lys Gly

435 440 445

Leu Gly Val Val Ser Asn Gln Val Asp Asn Ala Thr Leu Ile Glu Val

450 455 460

Asn Ser Ile Ile Arg Asn His Pro Val Glu Tyr Ile Gly Glu Glu Leu

465 470 475 480

Arg Gly Tyr Met Lys Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Gly Asp

485 490

<210>35

<211>338

<212>PRT

<213>假单胞菌

<400>35

Met Arg Val Phe Tyr Asp Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ile Ile Gln Gly

1 5 10 15

Lys Lys Val Ala Ile Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala His Ala

20 25 30

Cys Asn Leu Lys Asp Ser Gly Val Asp Val Thr Val Gly Leu Arg Ser

35 40 45

Gly Ser Ala Thr Val Ala Lys Ala Glu Ala His Gly Leu Lys Val Ala

50 55 60

Asp Val Lys Thr Ala Val Ala Ala Ala Asp Val Val Met Ile Leu Thr

65 70 75 80

Pro Asp Glu Phe Gln Gly Arg Leu Tyr Lys Glu Glu Ile Glu Pro Asn

85 90 95

Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Ala Phe Ala His Gly Phe Ser Ile His

100 105 110

Tyr Asn Gln Val Val Pro Arg Ala Asp Leu Asp Val Ile Met Ile Ala

115 120 125

Pro Lys Ala Pro Gly His Thr Val Arg Ser Glu Phe Val Lys Gly Gly

130 135 140

Gly Ile Pro Asp Leu Ile Ala Ile Tyr Gln Asp Ala Ser Gly Asn Ala

145 150 155 160

Lys Asn Val Ala Leu Ser Tyr Ala Cys Gly Val Gly Gly Gly Arg Thr

165 170 175

Gly Ile Ile Glu Thr Thr Phe Lys Asp Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe

180 185 190

Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Cys Val Glu Leu Val Lys Ala

195 200 205

Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Glu Met Ala Tyr

210 215 220

Phe Glu Cys Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Gly Ile Ala Asn Met Asn Tyr Ser Ile Ser Asn Asn Ala Glu Tyr

245 250 255

Gly Glu Tyr Val Thr Gly Pro Glu Val Ile Asn Ala Glu Ser Arg Ala

260 265 270

Ala Met Arg Asn Ala Leu Lys Arg Ile Gln Asp Gly Glu Tyr Ala Lys

275 280 285

Met Phe Ile Thr Glu Gly Ala Ala Asn Tyr Pro Ser Met Thr Ala Tyr

290 295 300

Arg Arg Asn Asn Ala Ala His Pro Ile Glu Gln Ile Gly Glu Lys Leu

305 310 315 320

Arg Ala Met Met Pro Trp Ile Ala Ala Asn Lys Ile Val Asp Lys Ser

325 330 335

Lys Asn

<210>36

<211>338

<212>PRT

<213>假单胞菌

<400>36

Met Lys Val Phe Tyr Asp Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ile Ile Gln Gly

1 5 10 15

Lys Lys Val Ala Ile Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala Gln Ala

20 25 30

Cys Asn Leu Lys Asp Ser Gly Val Asp Val Thr Val Gly Leu Arg Lys

35 40 45

Gly Ser Ala Thr Val Ala Lys Ala Glu Ala His Gly Leu Lys Val Thr

50 55 60

Asp Val Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala Asp Leu Val Met Ile Leu Thr

65 70 75 80

Pro Asp Glu Phe Gln Ser Gln Leu Tyr Lys Asn Glu Ile Glu Pro Asn

85 90 95

Ile Lys Lys Gly Ala Thr Leu Ala Phe Ser His Gly Phe Ala Ile His

100 105 110

Tyr Asn Gln Val Val Pro Arg Ala Asp Leu Asp Val Ile Met Ile Ala

115 120 125

Pro Lys Ala Pro Gly His Thr Val Arg Ser Glu Phe Val Lys Gly Gly

130 135 140

Gly Ile Pro Asp Leu Ile Ala Ile Tyr Gln Asp Ala Ser Gly Asn Ala

145 150 155 160

Lys Asn Val Ala Leu Ser Tyr Ala Ala Gly Val Gly Gly Gly Arg Thr

165 170 175

Gly Ile Ile Glu Thr Thr Phe Lys Asp Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe

180 185 190

Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Thr Val Glu Leu Val Lys Ala

195 200 205

Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Glu Met Ala Tyr

210 215 220

Phe Glu Cys Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Gly Ile Ala Asn Met Asn Tyr Ser Ile Ser Asn Asn Ala Glu Tyr

245 250 255

Gly Glu Tyr Val Thr Gly Pro Glu Val Ile Asn Ala Glu Ser Arg Gln

260 265 270

Ala Met Arg Asn Ala Leu Lys Arg Ile Gln Asp Gly Glu Tyr Ala Lys

275 280 285

Met Phe Ile Ser Glu Gly Ala Thr Gly Tyr Pro Ser Met Thr Ala Lys

290 295 300

Arg Arg Asn Asn Ala Ala His Gly Ile Glu Ile Ile Gly Glu Gln Leu

305 310 315 320

Arg Ser Met Met Pro Trp Ile Gly Ala Asn Lys Ile Val Asp Lys Ala

325 330 335

Lys Asn

<210>37

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物PAL-F1

<400>37

ctgcagcaca tgaagactcc atggcaccct cgctcgactc gatctcgcac tcgttcgcaa 60

acg 63

<210>38

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物PAL-R1

<400>38

tctctcatcc gccaaaacag aagcttctaa gcgagcatct 40

<210>39

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物PAL-EcoRI-F1

<400>39

gggctaacag gaggaagaat tcatggcacc ctcgctcgac tcg 43

<210>40

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物PAL-EcoRI-R1

<400>40

cgagtcgagc gagggtgcca tgaattcttc ctcctgtagc cc 42

Claims

1.用于将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，所述方法包括：

a)提供包含编码多肽的基因构建体的微生物宿主细胞，所述多肽具有大于大肠杆菌酮醇酸还原异构酶比活的酮醇酸还原异构酶比活；以及

2.根据权利要求1的方法，其中所述基因构建体编码具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的酮醇酸还原异构酶比活的多肽，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

a)约7.5的pH值；

b)约22.5℃的温度；和

c)大于约10mM的钾。

3.用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供包括下列基因构建体的重组微生物宿主细胞：

i)约7.5的pH值；

ii)约22.5℃的温度；和

4)至少一种编码支链酮酸脱羧酶的基因构建体，所述酮酸脱羧酶用于将α-酮异戊酸转化为异丁醛，(途径步骤d)；

5)至少一种编码支链醇脱氢酶的基因构建体，所述醇脱氢酶用于将异丁醛转化为异丁醇(途径步骤e)；以及

b)使(a)的宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述至少一种编码具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽的基因构建体分离自假单胞菌属。

5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自：细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。

6.根据权利要求4的方法，其中所述宿主细胞是选自下组的属的成员：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽胞杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、弧菌属和糖酵母属。

7.根据权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

8.根据权利要求6的方法，其中所述细胞是植物乳杆菌。

9.权利要求6的方法，其中所述细胞是啤酒糖酵母。

10.根据权利要求3的方法，其中所述乙酰乳酸合酶具有如SEQ IDNO：2所示出的氨基酸序列。

11.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽具有选自SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQID NO：36的氨基酸序列。

12.根据权利要求3的方法，其中所述乙酰羟酸脱水酶活性具有如SEQ ID NO：6所示出的氨基酸序列。

13.根据权利要求3的方法，其中所述支链醇脱氢酶具有如SEQ IDNO：10所示出的氨基酸序列。

14.根据权利要求3的方法，其中所述支链α-酮酸脱羧酶具有如SEQ ID NO：8所示出的氨基酸序列。

15.包含酮醇酸还原异构酶的重组宿主细胞，所述酮醇酸还原异构酶具有的比活大于大肠杆菌酮醇酸还原异构酶的比活。

16.权利要求15的重组宿主细胞，其中所述酮醇酸还原异构酶具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的比活，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

a)约7.5的pH值；

b)约22.5℃的温度；和

c)大于约10mM的钾。

17.用于鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体的方法，所述酮醇酸还原异构酶具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的比活，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

i)约7.5的pH值；

ii)约22.5℃的温度；和

iii)大于约10mM的钾；

所述方法包括以下步骤：

a)鉴定当在M9基本培养基中生长时倍增时间短于大肠杆菌倍增时间的菌种；

b)筛选(a)的菌种的酮醇酸还原异构酶活性以鉴定活性菌种；

c)使用与已知编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体具有同源性的核酸序列来探测(b)的活性菌种的基因组DNA，以从所述活性菌种中鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及

e)从步骤(d)的表达的基因构建体中筛选具有基于纯化蛋白大于1.1μmol/min/mg的比活的基因构建体，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量：

i)约7.5的pH值；

ii)约22.5℃的温度；和

iii)大于约10mM的钾。

18.根据权利要求17的方法，其中所述活性菌种选自梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽胞杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属。

19.根据权利要求17的方法，其中当在M9基本培养基中生长时步骤(a)的倍增时间等于或小于大肠杆菌的倍增时间的80％。